attomol apo B-100 quicktype

Transkript

1 attomol apo B-100 quicktype İnsan apolipoprotein B-100 (apo B-3500 mutasyonu) gen inde 10708G>A geçiş tespitine yönelik kit Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir! 20 tespit sipariş numarası: Giriş Kan plazmasında artırılmış LDL konsantrasyonları LDL reseptör ligandlarının mutasyonuna veya değiştirilen bir LDL reseptör yapısına ("Klasik" aileye ait hiperkolesterolemi [FH]) sebep olmuş olabilir. Apolipoprotein B-100 (apo B-100) ekstrahepatik dokularda ve karaciğerde reseptör-aracı olan LDL tutma sürecinde bir ligand olarak hizmet eder ve LDL'in bir bileşenidir. Spesifik apo B-100 mutasyonlarıyla birlikte, apo B-100 plazmada apo B- 100'un birikmesine neden olan LDL reseptörüne daha düşük bir ilgisi vardır. Bu metabolik rahatsızlığa Apo B-100'ün ailesel kusuru (FDB) denir ve batılı ülkelerde hiperkolesterolemi ve koroner kalp hastalıkları için bir risk faktörü olarak görülür.(rauh et al., 1992, Clin Investig 70: 77-84). Bu kusura neden olan en önemli mutasyonlardan biri apo B-100'ün (R3500Q) protein temel konumunda 3500'de glutamine karşı (mutant) argininin (wild type) bir aminoasit yer değiştirmesine neden olan apo B geninin, exon-26 da nucleotit konumunda 10708'de bir adenin(a) için bir guanin (G) değişimidir. Bu mutasyonun görülme oranı Avrupa ve Kuzey Amerika'da 1:500 ve 1:700 aralık arasında bulunmaktadır. Bir kardiyovasküler hastalığın artma risk apo 3500 Arg-Gln mutasyonun heterozigot taşıyıcıları için oldukça artar (Tybjaerg-Hansen and Humphries, 1992, Atherosclerosis 96: ). Ailesel olan kolesterol düzeyleri veya kardiyovasküler hastalıkları olan hastalar LDL reseptör gen mutasyonuna ek olarak apo 3500 Arg-Gln mutasyonu için de taranabilir (Hansen, 1998, Dan Med Bull 45: ). 2. Genel Açıklamalar Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalı. Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat ediniz. Test uygulamasının tüm adımlarında eldiven giyiniz. Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara göre hareket edilmelidir. PCR* a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın.

2 3. Dahil olan malzemeler Sipariş numarası Reaktif Hacim Saklama Isısı 38 deiyonize PCR-H 2 O 0.2 ml -20 C 83 PCR-buffer I 0.5 ml -20 C 93 Primer apo B-100 (sarı renkli tüpler) Liyofilize primerler içeren 2 tüp, tüp başına 225 μl PCRbuffer I (#83) ile çözündürme -20 C Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır. 4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler Hastaların DNA numuneleri ( genomik DNA kullanın, konsantrasyonu yaklaşık 20 ng/μl, distile suyla veya TE-buffer çözündürme) Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz Kontrol template (apo B-100 heterozigot DNA) Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml) Mikropipetler (hacim aralığı μl) ve steril filtre uçları Thermocycler Agoroz jel elektroforez ve sarf malzemeleri için ekipman (agoroz veya % 3 prekastlanmış agoroz jelleri, elektrot buffer, örnek buffer, DNA-boya, UV-transilluminator) 5. Test Prensibi Quicktype genotipleme işlemi sırasında belirli bir genin her iki allelleri özellikle amplifiye edilmiş olur. Amplifikasyon ürünlerinin denemesi agoroz jel elektroforezle yapılabilir. Her iki allel de Wild tip dizisi taşırsa (homozigot wild tip), agoroz jeli yalnızca 187 bp te specifik bir bant içerir. Eğer bir allel Wild tip dizisi ve diğeri mutasyon dizisi(heterozigot) taşırsa, sırasıyla 187 bp ve 226 bp te iki bant olacaktır. DNA numunesi homozigot olarak mutasyona uğramışsa jelde 226 bp te sadece tek bir bant gözükür. Jeldeki bantların kalibrasyonunda sonuçları daha iyi doğrulamak için referans olarak bir heterozigot DNA numunesi kullanmalısınız (Fig. 1'i gör).

3 Tek başına bir diagnostik metodun sonuçlarından klinik tanıya gidilmemelidir. Doktor mevcut tüm laboratuar ve klinik sonuçları dikkate almalıdır. 6. Manuel Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki kontrolleri eklemeniz önerilir: 1. Negatif kontrol (PCR-blank) 2. Pozitif kontrol (bir heterozigot kontrol template kullanın [genotiplendirilmiş, genomik DNA]) Kontrol template ayrı olarak üreticisinden de sipariş edilebilir(sipariş numarası 94). Doğru şekilde genotiplendirilmiş olan hasta numuneleri kullanıcı tarafından kontrol template olarak da kullanılabilir. Protokol: Standart prosedürlere göre hasta kanından DNA-hazırlama Tüp başına 225μl PCR-buffer I kullanarak (sipariş numarası 83) primerleri çözündürün, PCR Premix içinde pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dk. İnkübe edin. Dikkat: 225 μl den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı -20 C de saklayabilirsiniz. PCR premix e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama: Bir reaksiyon için kullanılacak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (20 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim eklenmelidir (8 reaksiyon için örnek: 8 x 20 μl + 10 μl fazladan hacim = 170 μl PCR premix). Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 170 μl PCR premix + 1,7 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi, PCR mix iyice karıştırılmalıdır. PCR mixi 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma: Negatif kontrol: Pozitif Kontrol: Hasta numuneleri: 20 μl PCR mix 20 μl PCR mix 20 μl PCR mix + 5 μl PCR-H2O + 5 μl kontrol template + 5 μl DNA (ca. 20 ng/μl) (ca. 20 ng/μl) PCR thermocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır: İlk denatürasyon: 15 dak. 95 C

4 5 döngü: 1 dak. 94 C 1 dak. 63 C 1 dak.72 C 30 döngü: 30 s 94 C 30 s 63 C 30 s 72 C Final sentezi: 2 dak. 72 C Durdurma: 4 C zaman sınırı yok PCR ürünlerinin analizleri uygun laboratuvar şartlarında bir agoroz jel üzerine (2,5 % 3) 10 μl PCR ürünü ilavesi ve sonra elektroforez ile gerçekleştirilir. Hasta numunelerinin genotiplemesi kontroller ile numunelerin bant modeli kıyaslanarak yapılır(fig. 1'i gör). Genotipler: WT= homozigot Wild Tipi HZ=HeteroZigot MU=homozigot Mutasyon Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta tereddüt etmeyin. EK 1 Kit etiketlerinde kullanılan sembollere genel bakış Sembollerin açıklaması Üretici Lot numarası Son kullanma tarihi 2 C ve 6 C arasında saklayın

5 Max. -20 C de saklayın Katalog numarası In vitro diagnostik medikal ürünler <n> determinations için yeterli içerik Kullanım talimatına bakınız