1 I. PROJENİN TÜRKÇE VE İNGİLİZCE ADI VE ÖZETLERİ Farklı Toxocara vitulorum Antijenlerinin Elde Edilmesi ve Enfeksiyona Spesifik Antikorların Saptanma

ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU FARKLI TOXOCARA VİTULORUM ANTİJENLERİNİN ELDE EDİLMESİ VE ENFEKSİYONA SPESİFİK ANTİKORLARIN SAPTANMASI Proje Yürütücüsü: Prof.Dr. Ayşe BURGU Yardımcı Araştırmacı: Abdalla Fadlalla AZRUG Proje Numarası: BAP. 09B3338009 Başlama Tarihi: 10.11.2009 Bitiş Tarihi: 10.05.2011 Rapor Tarihi: 14.07.2011 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri ANKARA-2011

1 I. PROJENİN TÜRKÇE VE İNGİLİZCE ADI VE ÖZETLERİ Farklı Toxocara vitulorum Antijenlerinin Elde Edilmesi ve Enfeksiyona Spesifik Antikorların Saptanması Özet: Bu çalışmada, Türkiye de şimdiye kadar dışkı, kolostrum/süt ve otopsi bakıları ile bildirilen ve hala bazı yörelerde buzağılarda sorun olabilen T. vitulorum un serodiagnozu amaçlandı. Toxocara vitulorum la doğal enfekte buzağı serumlarında, hazırlanan biri larva (Ex) diğeri olgun (Pe) antijenle humoral immun yanıt araştırıldı. Araştırmanın laboratuar çalışmalarında gerekli materyallerin (dışkı, kan, parazit) sağlanması için önce saha çalışmalarına yoğunlaşıldı ve T. vitulorum ile enfekte hayvanlar arandı. Değişik 22 ilden; yaşları 0-6 aylık; halk elinden, özel ve resmi kurumlardan; yerli, kültür ırkı ve melez; her iki cinsiyetten 2393 buzağıya ait dışkı Fulleborn doymuş tuzlu su flotasyon yöntemi ile kontrol edildi. Yirmi sekiz örnekte (% 1,17) T. vitulorum yumurtalarına rastlandı. Ankara, Düzce ve Erzurum illerine ait dışkılarda enfeksiyona rastlandı, resmi kurumlara ait dışkıların hiç birinde yumurta görülmedi. McMaster tekniği ile gram dışkı yumurta sayısı en fazla 10250 olarak belirlendi. Toxocara vitulorum larva (Ex) antijeni hazırlanmasında; dışkıdan ve olgun parazitlerden elde edilen yumurtalar oda sıcaklığında gelişmeye bırakıldı. Larva gelişimi 17-40 günde tamamlandı. Yumurta kabuğu soyularak, dışarı çıkması sağlanan larvalar 448,4 (452,6-516,6) µm boyda 20,1 (14,7-24,6) µm ende ölçüldü. Toxocara vitulorum olgun (Pe) antijeni hazırlanmasında; kendiliğinden veya ilaç verilerek düşürülen erkek ve dişi parazitler kullanılarak, perienterik sıvı çekildi. Elde edilen larvalardan (Ex), perienterik sıvıdan (Pe) antijenleri seçilen yönteme uygun olarak hazırlandı. Spektrofotometre ile (Ex) antijeni için protein konsantrasyonu 7,5 mg/ml, (Pe) antijen için 20,56 mg/ml olarak belirlendi. SDS-PAGE le elektroforetik separasyonda (Ex) antijeninde moleküler ağırlıkları 14-150 kda, (Pe) antijeninde ise 12-141 kda arasında değişen protein bantları elde edildi.

2 Toxocara vitulorum (Ex) antijenlerinin negatif serumlarla (4 saha, 3 fötal) immunoblotting analizinde hiçbir örnekle reaktif bant saptanmazken, pozitif 6 serumda 14, 35, 56, 63, 68 ve 94 kda molekül ağırlığındaki protein bantlarının immunoreaktif oldukları tespit edildi. 14 kda luk bant bazı örneklerde daha belirgin izlendi. (Pe) antijen ile yapılan immunoblotting çalışmasında negatif serumların (2 saha, 4 fötal) söz konusu antijenlere reaktif olmadıkları, pozitif 6 serumun ise tüm örneklerde 96 ve 110 kda luk 2 proteine benzer yoğunlukta reaktif oldukları tespit edildi. Anahtar Kelimeler : Antijen, Buzağı, SDS-PAGE, Toxocara vitulorum, Western Blot.

Recovery of Different Toxocara vitulorum Antigens and Detection of Specific Antibodies Summary: Toxocara vitulorum causes serious problems among calves in many parts of Turkey. All previous diagnostic approaches for T. vitulorum infections performed based on faeces, colostrum / milk and post-mortem examinations. The aim of this study is to prepare two kinds of antigens, larva extract (Ex) and perienteric (Pe) for serodiagnosis, besides the advantages of clinical and epidemiological aspects of the disease in its diagnosis. This study was initiated by an intensive field work that involved the collection of materials needed for laboratory examinations (faeces, blood and parasites). Faecal samples were collected from a total of 2393 calves of both sexes aged 0-6 months, settled in 22 provinces at public/private and state farms of different breeds. Then the faecal samples examined in the laboratory by Fulleborn Flotation Technique using saturated sodium chloride solution. Twenty eight calves were found positive with T. vitulorum (1,17%) by the presence of the eggs in their faeces. The infected calves were belonged to public/private farms at Ankara, Düzce and Erzurum provinces, while no infection was found in calves at the State farms. McMaster technique was performed to determine the parasite egg count per gram of faeces and the maximum (epg) was found as 10250. Toxocara vitulorum eggs were recovered from both infected faeces and the mature parasites for the purpose of larval (Ex) antigen preparation. The eggs were incubated at room temperature when the larval deveopment was completed within 17-40 days. The egg shells decorticated and the length and width of the obtained larvae was measured as 448,4 (452,6-516,6)µm and 20,1 (14,7-24,6)µm respectively. Toxocara vitulorum perienteric fluid was recovered from both male and female parasites that obtained by either the spontaneous explusion of the parasites or the parasites collected after adminstration of drug. Proper procedures used for preparation of (Ex) antigen from the recovered larvae and (Pe) antigen from the obtained perienteric fluid. Protein 3

4 concentration of both antigens was measured by spectrophometer where it estimated as 7,5 mg/ml for (Ex) and 20,56 mg/ml for (Pe) antigen. Different protein bands of variable molecular weights which was estimated as 14-150 kda for (Ex) and 12-141 kda for (Pe) antigen recovered by SDS-PAGE electrophoretic separation. The negatif serum samples (4 field, 3 fetal) did not show any reaction bands with (Ex) antigen in the immunoblotting analysis, while the 6 positive serum samples showed protein bands within the range of 14, 35, 56, 63, 68 and 94 kda molecular weights. 14kDa moleculer weight band was more prominent in some samples. Negative serum samples ( 2 field, 4 fetal) did not react with (Pe) antigen in the immunoblotting analysis, while all positive 6 serum samples showed protein bands to 96 and 110 kda molecular weights with same reactivity. Key words: Antigen, Calf, SDS-PAGE, Toxocara vitulorum, Western Blot.

5 II. AMAÇ VE KAPSAM Tropikal ve subtropikal iklim bölgelerinde, az gelişmiş veya gelişmekte olan ülkelerde, bu arada Türkiye de zaman zaman ve genellikle 6 aylıktan küçük buzağılarda problem olan T.vitulorum la ilgili hazırlanan bu projede; şimdiye dek daha çok dışkı, süt ve kolostrum yoklamaları veya otopsi bulguları ile Türkiye de varlığı kaydedilen bu parazitin serolojik teşhis olasılığının ortaya konulması amaçlanmıştır. Serolojik testlerde uygulamak için seçilen test, şüphesiz önem taşımakla birlikte, hazırlanan antijenlerin de test sonuçlarında etkili olduğu bilinen gerçektir. Bazı antijenlerin serolojik tanıda üstünlük taşıdığı veya bazı koşullarda uygulandığında üstün olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, biri larva, diğeri olgun parazite ait iki antijen hazırlanması, bunların protein analizlerinin yapılması ve elde edilecek negatif ve pozitif serumlarla bunlardan hangilerinin T.vitulorum tanısında spesifik olduğunu belirlemek hedeflenmiştir. Son yıllarda bu konuyla ilgili bazı ülkelerde çalışmalar yapılmaya başlanmış olmakla birlikte, bunların çok sınırlı olması, bazı sonuçların örtüşmemesi, Türkiye de ise bu parazitle ilgili benzer hiçbir çalışmanın bulunmaması amaçlanan tez projesinin alanında önemli ve Türkiye için orijinal olduğunu göstermektedir. Araştırma sonuçlarının; T.vitulorum için ilaç verilmesi gereken hayvanların ayrımında, ilaç verilme zamanını belirlemede, gereksiz ilaç kullanımını ve bunun sütle atılmasını engellemede, işletmeye yeni hayvan kabulü sırasında potansiyel enfekte hayvanların ayrımında, enfekte olan, sağaltılan veya kendiliğinden parazitleri atan hayvanların kanlarındaki proteinlerin yorumlanabilmesinde, süt/kolostrum örneklerinin incelenmesinde; diğer Toxocara larla antijenik yakınlığı veya insanlardaki visceral larva migrans olaylarında T.vitulorum un payını belirleme konularında yapılacak çalışmalara, yararlı olacağı veya ilk basamağı teşkil edeceği düşünülmüştür. Öte taraftan, antijen hazırlanması amacıyla enfekte hayvanları bulma, materyal temin etme sırasında T.vitulorum un yayılışı ile ilgili yeni bilgilere ulaşmak mümkün olacak, bilgilerimiz güncelleşecektir.

6 III. MATERYAL VE YÖNTEM Bu proje sahada ve laboratuarda yürütüldü. Laboratuar çalışmalarında gerekli materyaller (dışkı, kan, parazit) Ankara Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu nun 2009-44-202 sayılı kararı doğrultusunda sağlandı. Önce saha çalışmalarına yoğunlaşıldı. T.vitulorum la enfekte hayvanlar arandı. I. Saha çalışmaları: Türkiye genelinde 22 ilden, halk elinden, özel ve resmi kurumlardan, yaşları 0-6 aylık, yerli, kültür ırkı ve melez, her iki cinsiyetten 2393 buzağıdan, doğrudan rektumdan 3-5 gr dışkı alındı, protokol bilgileri eklenerek laboratuara ulaşıldı (Şekil 1, Çizelge 1 ve Çizelge 2). Saha çalışmaları sırasında T.vitulorum la enfekte bulunan veya laboratuarda dışkı bakıları sonucu enfekte olduğu belirlenen hayvanlara ilk kayıt bilgileri ile dönülerek laboratuar çalışmaları ile ilgili materyaller bunlardan temin edildi. Laboratuar çalışmaları için gerekli parazitler; enfekte hayvanların 100 mg/kg piperazine hexahydrate (Siropar şurup-adeka) la sağaltımı sonucu veya kendiliğinden atılanların toplanması ile sağlandı. Kan örnekleri ise enfekte ve negatif olduğu kesinleşmiş buzağılardan silikonlu tüplere V. jugularis ten alındı. II. Laboratuar çalışmaları: Dışkı muayenelerinde T.vitulorum yumurtalarının aranması için Fulleborn Doymuş Tuzlu Su Flotasyon Yöntemi, enfekte bulunan dışkılarda (10x10 büyütmede bir mikroskop sahasında 0-1 yumurta gözlenen dışkılar hariç) gram dışkı yumurta sayısını belirlemek için ise modifiye McMaster Yöntemi kullanıldı (Anon, 1971; Kaya, 2003). Laboratuar çalışmaları için gerekli T.vitulorum yumurtaları enfekte dışkılardan (Sedimentasyon+Flotasyon Yöntemleri ile) ve dişi parazitlerden (disseksiyon) toplandı, mantarlaşmayı önlemek için sodyum hipoklorit (%

Kırklareli 108 Aydın 54 Bursa 299 Muğla 167 Düzce 20 Ankara 248 Eskişehir 97 Afyon 39 Burdur 52 Konya 139 Çankırı 9 Kırıkkale 44 Samsun 128 Amasya 101 Kırşehir 49 Nevşehir 30 Kayseri 37 Adana 107 Şanlıurfa 265 Erzurum 99 Iğdır 276 Antakya 25 Şekil 1. Türkiye genelinde dışkı örneği alınan yerler ve örnek sayıları 7

Çizelge.1. Türkiye genelinde dışkı örneği alınan iller ve dışkıların alındığı hayvanların cinsiyet, ırk ve işletme özelliğine göre sayısal dağılımı Materyal Alınan İller Toplam Dışkı Sayısı Dışkıların Sayısal Dağılımı Cinsiyete Göre Irka Göre İşletmeye Göre Siyah Alaca Siyah Alaca melez Esmer Esmer melez Simental Simental melez Yerli Kara Doğu Anadolu Kırmızısı Limousin Jersey Resmi Kurum Özel / Halk eli Adana 107 34 73 107 107 Afyon 39 14 25 12 19 6 2 39 Amasya 101 33 68 101 101 Ankara 248 118 130 202 7 39 248 Antakya 25 16 9 25 25 Aydın 54 23 31 54 54 Burdur 52 26 26 50 2 52 Bursa 299 146 153 151 148 299 Çankırı 9 4 5 6 3 9 Düzce 20 9 11 20 20 Erzurum 99 49 50 80 19 99 Eskişehir 97 16 81 97 97 Iğdır 276 113 163 155 121 276 Kayseri 37 19 18 37 37 Kırıkkale 44 20 24 11 2 10 3 14 1 3 44 Kırklareli 108 32 76 108 108 Kırşehir 49 16 33 49 49 Konya 139 69 70 139 139 Muğla 167 91 76 167 167 Nevşehir 30 8 22 30 30 Samsun 128 48 80 128 128 Şanlıurfa 265 112 153 265 265 TOPLAM 2393 1016 1377 1268 15 493 23 123 156 47 19 121 128 1736 657 8

9 Çizelge.2. Ankara civarında dışkı örneği alınan yerler, dışkıların alındığı hayvanların cinsiyet ve ırk özelliğine göre sayısal dağılımı Materyal Alınan Yerler Toplam Dışkı Sayısı Cinsiyete Göre Dışkıların Sayısal Dağılımı Siyah Alaca AÜ Veteriner Fakültesi Klinikleri * 12 6 6 12 Eskişehir yolu 11 5 6 11 Gölbaşı 10 4 6 10 Gölbaşı (Bezirhane köyü) 45 25 20 45 Irka Göre Siyah Alaca melez Temelli (Çokören köyü) 5 2 3 5 Sincan (Yenikent) 23 6 17 23 Kalecik 23 10 13 12 11 Çubuk (Akkuzular köyü) 15 11 4 15 Çubuk (Sünlü köyü) 14 8 6 14 Altındağ (Tatlar köyü) 17 9 8 17 Mamak (Kutludüğün köyü) 21 12 9 14 7 Güdül (Yeşilöz Güdül köyü) 15 3 12 15 Kalecik (Değirmenkaya köyü) 19 8 11 13 6 Akyurt 7 4 3 7 Kazan (Kılıçlar köyü) 11 6 5 11 Yerli Kara Toplam 248 119 129 202 7 39 * Öğrenci tatbikatları için satın alınan veya muayene için kliniklere getirilen halka ait hayvanlar

10 1) damlatıldıktan sonra buzdolabında saklandı. Gerektiğinde PBS içine alınıp geliştirildi. Kanlar soğutmalı santrifüjde 2000 rpm de 6 dakika santrifüj edilerek serumları çıkarıldı, küçük porsiyonlar halinde -80ºC de saklandı. Bu projede Western Blot uygulamasında (Ex) antijeni için pozitif 6, negatif 7 (4 saha, 3 fötal); (Pe) antijeni için pozitif 6, negatif 6 (2 saha, 4 fötal) serum kullanıldı. Fötal buzağı serumları Viroloji Anabilim Dalından temin edildi. Toxocara vitulorum larva soluble ekstrakt antijeni (Ex) hazırlanmasında Souza ve ark., (2004) nın daha önce Starke-Buzetti ve ark., (2001) inden alarak uyarladıkları yöntem, olgun T.vitulorum perienterik antijeni (Pe) hazırlanmasında Ferreira ve Starke-Buzetti (2005) in, Amerasinghe ve ark., (1992) den uyarladıkları prosedür bazı modifikasyonlarla uygulandı. (Ex) ve (Pe) antijenleri hazırlandıktan sonra 500 µl hacimlerde - 80 o C de saklandı. Antijenlerde protein miktarı spektrofotometre ile ölçüldü. Protein konsentrasyonu (Ex) için 7.5 mg/ml, (Pe) için 20,56 mg/ml olarak belirlendi. SDS-PAGE yötemi ve Western Immunoblot yönteminde uygulama ve uygulama ile ilgili solüsyonlar Sambrook ve ark. (1989) a göre hazırlandı. (Ex) antijeninde 1/1, (Pe) antijende 1/5 sulandırma uygun bulundu. SDS-PAGE de belirlenen proteinlerden immunodominant olanları, Western Immunoblot yöntemi ile belirlendi. Konjugat olarak antibovine IgG (A8 917-Sıgma), protein standardı olarak (SM-1811 Fermantas, Litvanya, Range 10-250 kda) kullanıldı.

11 IV. ANALİZ VE BULGULAR Değişik 22 ilden, yaşları 0-6 aylık, halk elinden, özel ve resmi kurumlardan, yerli, kültür ırkı ve melez, her iki cinsiyetten 2393 buzağı dışkısından 28 inde (% 1,17) T.vitulorum yumurtalarına rastlandı. Ankara, Düzce ve Erzurum illerine ait dışkı örneklerinde yumurta saptandı (Çizelge. 3). Çizelge. 3. Toxocara vitulorum la enfekte buzağıların illere, cinsiyet ve ırka göre sayısal dağılımı Enfekte buzağıların bulunduğu iller Toplam il dışkı sayısı Enfekte buzağı sayısı (%) si Cinsiyete göre Enfekte buzağıların sayısal dağılımı Esmer Esmer melez Irka göre Siyah Alaca Doğu Anadolu Kırmızısı Ankara 248 6 2.41 3 3 - - 6 - Düzce 20 2 10.00-2 - 2 - - Erzurum 99 20 20.20 10 10 16 - - 4 Enfekte dışkıların ortak özelliği yaşları 0-6 aylık, hepsi halk elindeki, özel işletmelerdeki buzağılara ait olmasıdır. Resmi kurumlara ait buzağı dışkılarında enfeksiyona rastlanmadı. Toxocara vitulorum yumurtaları 90.5 (78.7103.3) µm x 76.4 (68.8-89.5) µm boyutlarda ve kaynaklardaki tanıma uygun gözlendi (Şekil. 2). Şekil 2. Toxocara vitulorum yumurtası

12 10x10 büyütmede bir mikroskop sahasında 0-1 yumurta gözlenen 12 dışkı hariç, gram yumurta sayısı 5925 (2650-10250) olarak belirlendi (Çizelge. 4). Çizelge 4. Enfekte buzağıların gram dışkı yumurta (epg) sayıları Enfekte buzağıların bulunduğu iller Enfekte buzağı sayısı McMaster yöntemi uygulanan dışkı sayısı * Gram dışkı yumurta sayısı (epg) ort. (min.-mak.) Ankara 6 4 6075 (3050-9250) Düzce 2 2 9850 (9450-10250) Erzurum 20 10 5080 (2650-8550) 28 16 5925 (2650-10250) *Flotasyon yönteminde 10x10 büyütmede bir mikroskop sahasında 0-1 yumurta görülen dışkılarda sayım yapılmadı. Gerek dışkı, gerekse parazitlerden elde edilen T.vitulorum yumurtalarında larva gelişiminin PBS içeren petri kutularında, oda sıcaklığında 17-40 günde olduğu gözlendi (Şekil.3 ve Şekil.4). A B Şekil 3. A-B Toxocara vitulorum yumurta kültürlerinde eş zamanlı olmayan gelişim Aynı kültürde bile yumurtaların hepsinde larvaların eş zamanlı gelişmediği saptandı (Şekil.3). (Ex) antijeninin hazırlanmasında kabuğu soyulan ve dışarı çıkması sağlanan larvalar 448.4 (452.6-516.6) µm boyda, 20,1 (14.7-24.6) µm ende ölçüldü (Şekil.5 ve Şekil.6).

13 1.gün 17.gün Şekil.4. Oda sıcaklığında Toxocara vitulorum yumurtalarında gelişim

14 C1 C2 C3 D E F G Şekil.5. Toxocara vitulorum yumurtalarından larva çıkışı ve sonikasyon öncesi larvalar. A-B: Kabuğu soyulmuş yumurtalar (Yumurta deformasyonu okla gösterilmiştir.) C1,C2,C3: Yumurtalardan larva çıkışı D: Kabuğu soyulmuş yumurtalar ve larvalar E-F: Larvalar G: Boşalan yumurta

15 Şekil.6. Toxocara vitulorum larvası Saha çalışmaları sırasında toplanan ve (Pe) antijen hazırlanmasında kullanılan T.vitulorum erkekleri 11.0-17.0 cm boyda, 3.5-4.5 mm ende, dişileri 16.0-25.0 cm boyda 4.5-5.0 mm ende ölçüldü (Şekil. 7). Şekil.7. Dişi ve erkek Toxocara vitulorum lar Sonikasyon sonrası spektrofotometre ile T.vitulorum soluble larva ekstrakt (Ex) antijeninin protein konsantrasyonu 7.5 mg/ml, perienterik sıvıdan hazırlanan (Pe) antijenin protein konsantrasyonu ise 20.56 mg/ml olarak belirlendi.

16 SDS-PAGE sonrası (Ex) antijenlerinin, (Pe) antijenlere oranla sayısal anlamda çeşitlilik gösterdiği tespit edildi. (Ex) antijenlerinin elektrik seperasyonu sonrasında 14-150 kda arasında değişen proteinler gözlenirken, (Pe) antijenlerin elektroforetik separasyonu sonrasında 12-14 kda arasında değişen bantlar elde edildi (Şekil. 8). Şekil.8. Toxocara vitulorum antijenlerinin SDS-PAGE analizi. Hat 1. Geniş ölçülü protein marker (Fermentas, Litvanya); Hat 2. Perienterik (Pe) antijen profili; Hat 3. Ekstrakt (Ex) antijeni profili. Toxocara vitulorum (Ex) antijenlerinin nitroselüloz kağıda transfer edilmesinden sonra negatif olduğu bilinen serum örnekleri (4 saha ve 3 fötal) ile immunoblotting analizi sonrası hiçbir örnekte reaktif bant tespit edilmedi.pozitif olarak çalışmaya dahil edilen 6 serum örneği ile yapılan immunoblotting uygulaması sonrasında ise 14, 35, 56, 63, 68 ve 94 kda moleküler ağırlıktaki protein bantlarının immunoreaktif oldukları tespit edildi. Özellikle 14 kda ağırlıktaki proteine ilgili bant 2 örnekte daha güçlü, 1 örnekte ise oldukça zayıf olarak gözlendi. Diğer tüm bantların reaktivite özellikleri identik kaydedildi (Şekil. 9).

17 A B Şekil.9. Toxocara vitulorum (Ex) antijenlerine karşı negatif (A) ve pozitif sığır serumları (B) ile yapılan Western Blot analizi A: Hat 1 marker, Hat 2-5 saha, Hat 6-8 fötal negatif serumlar B: Hat 1 marker, Hat 2-7 pozitif serumlar

18 Toxocara vitulorum (Pe) antijenleri ile yapılan immunoblotting çalışması sonrasında negatif kontrol serumlarının (2 saha, 4 fötal) söz konusu antijenlere reaktif olmadıkları gözlendi. Pozitif serum örnekleri (6 adet) ile yapılan immun boyama sonrasında tüm örneklerde 2 adet protein (96 ve 110 kda) ile benzer yoğunlukta reaktif oldukları tespit edildi (Şekil. 10). A B Şekil.10. Toxocara vitulorum (Pe) antijenlerine karşı negatif (A) ve pozitif sığır serumları (B) ile yapılan Western Blot analizi A: Hat 1 marker, Hat 2-5 fötal, Hat 6-7 saha negatif serumlar B: Hat 1 marker, Hat 2-7 pozitif serumlar

19 V. SONUÇ VE ÖNERİLER Geri kalmış ve gelişmekte olan ülkelerde, bu arada Türkiye de genellikle 6 aylıktan küçük buzağılarda Toxocara vitulorum hala sorun olabilmektedir. Türkiye de şimdiye kadar T.vitulorum dışkı, kolostrum/süt ve otopsi bulgularına dayanarak bildirilmiştir. Bu projede immunodiagnostik yaklaşımların klinik ve epidemiyolojik açıdan önemli avantajları dikkate alınarak T.vitulorum un serolojik diagnoz olasılığını ortaya koymak amaçlandı. Laboratuar çalışmaları için gerekli materyal (dışkı, parazit, kan) temininde önce enfekte hayvanlar arandı. Bu amaçla halk elinden, özel ve resmi kurumlardan; 0-6 aylık yaşta; yerli, kültür ırkı ve melez; her iki cinsiyetten 2393 buzağıdan alınan dışkılar kontrol edildi ve 28 inde (% 1,17) T.vitulorum yumurtalarına rastlandı. Parazitin Türkiye genelindeki yayılışı ile ilgili yeni bilgilere ulaşıldı. Serodiagnoz amacıyla biri larvaya ait (Ex), diğeri olgun parazite ait (Pe) olmak üzere iki antijen hazırlandı ve bunların SDS-PAGE ile elektroforetik separasyonu yapıldı. (Ex) antijeninde 14-150 kda, (Pe) antijende 12-141 kda, arasında moleküler ağırlıkları değişen proteinler saptandı. Pozitif ve negatif (saha ve fötal) olduğu bilinen serum örnekleri ile yapılan immunoblotting analizinde; negatif hiçbir örnekte reaktif bant gözlenmemesine karşın, (Ex) antijeni kullanıldığında 14, 35, 56, 63, 68 ve 94 kda, (Pe) antijen kullanıldığında 96 ve 110 kda molekül ağırlıklı bantlar immunoreaktif olarak kaydedildi. Alınan sonuçlar konuyla ilgili yapılacak çalışmalarda yararlı olacak veya ilk basamağı teşkil edecektir. Özellikle gebe hayvanların inhibe larvalar yönünden kontrolü veya karaciğer, akciğer göçü yapan T.vitulorum larvalarından ileri gelen hastalıkların belirlenebilmesi ileride yapılacak çalışmalarda hedef olarak seçilmelidir. Bu çalışmada serolojik kontrol materyallerinin alınma dönemlerine bağlı olarak örneklerde sorgulanan antikorların antijen bantlarına affinite / immunoreaktivitelerin de değişkenlik arz edebileceği izlendi; bu nedenle deneysel çalışmalarla serolojik tanı olasılıklarının detaylı bir şekilde sorgulanması gerekliliği ortaya konuldu.

20 Türkiye de parazitin mandalardaki yayılış oranının belirlenmesi; koyun ve keçilerde ise bulunup bulunmadığı araştırılması önerilen diğer önemli hususlardır.

21 VI. KAYNAKLAR ADANIR, R. (2004). Ankara yöresi sığırlarında Toxocara vitulorum un prevalansı. Doktora Tezi, Ankara Üniv Sağlık Bilimleri Enstitüsü. AKHTAR, M., HAYAT, C.S., ASHFAQUE, M., AFAG, M., IQBAL, Z. (1993). Assaying of purified colostral immunoglobulins against Toxocara vitulorum as determined by indirect haemagglutination test. Pakistan J Agri Sci., 30: 362-364. AKYOL, C. V. (1993). Epidemiology of Toxocara vitulorum in cattle around Bursa, Turkey. J Helminthol., 67: 73-77. ALTINÖZ, F., GÖKÇEN, A., USLU, U. (2000). Konya yöresi sığırlarında Toxocara vitulorum un yayılışı. Türkiye Parazitol Derg., 24: 405-407. AMERASINGHE, P. H., RAJAPAKSE, R. P., LLOYD, S., FERNANDO, S.T. (1992). Antigen-induced protection against infection with Toxocara vitulorum larvae in mice. Parasitol Res., 78: 643-647. ANON (1971). Manual of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food. 2nd Ed. Technical Bulletin 18. London, Her Majesty s Stationary Office, p.: 5-7. ARSLAN, M.Ö., UMUR, Ş., ÖZCAN, K. (1997). Buzağılarda ölümcül Toxocara vitulorum olgusu. Türkiye Parazitol Derg., 21: 79-81. ARSLAN, M.Ö., SARI, B., TAŞÇI, G.T., AKTAŞ, M.S. (2008). Erzurum yöresinde buzağılarda Toxocara vitulorum yaygınlığı. Kafkas Üniv Vet Fak Derg., 14: 37-40. AVCIOGLU, H., BALKAYA, I. (2011b). Prevalence of Toxocara vitulorum in calves in Erzurum, Turkey. Kafkas Univ Vet Fak Derg., (Article code: KVFD- 2010-3216). AYDENIZÖZ, M., ALDEMİR, O. S., GÜÇLÜ, F. (1999). Dışkı muayenesiyle sığırlarda tespit edilen parazitler ve yayılışları. Türkiye Parazitol Derg., 23: 83-88. AYDIN, A., GÖZ, Y., YÜKSEK, N., AYAZ, E. (2006). Prevalence of Toxocara vitulorum in Hakkari, eastern region of Turkey. Bull Vet Inst Pulawy., 50: 51-54. AYDIN, F., UMUR, Ş., GÖKÇE, G., GENÇ, O., GÜLER, M. A. (2001). Kars yöresindeki ishalli buzağılardan bakteriyel ve paraziter etkenlerin izolasyon ve identifikasyonu. Kafkas Univ Vet Fak Derg., 7: 7-14.

22 BANERJEE, P.S., BHATIA, B.B., GARG, S.K. (1998). Comparative evaluation of IHA and CIEP in the diagnosis of Toxocara vitulorum in pregnant cows and buffaloes. Trop Anim Hlth Prod., 30: 253-256. CELEP, A., AÇICI, M., ÇETİNDAĞ, M., GÜRBÜZ, İ. (1994). Samsun yöresi sığırlarında paraziter epidemiyolojik çalışmalar. Etlik Vet Mikrobiol Derg., 6: 117-130. ECKERT, J., FRİEDHOFF, K. T., ZAHNER, H., DEPLAZES, P. (2005). Lehrbuch der Parasitologie für die Tiermedizin. Stuttgart: Enke Verlag, p.: 291-296. FERREIRA, F. P., STARKE-BUZETTI, W. A. (2005). Detection of antibody to Toxocara vitulorum perienteric fluid antigens (Pe) in the colostrum and serum of buffalo calves and cows by Western Blotting. Vet Parasitol., 129: 119-124. GÖZ, Y., ALTUĞ, N., YÜKSEK, N., ÖZKAN, C. (2006). Parasites detected in neonatal and young calves with diarrhoea. Bull Vet Inst Pulawy, 50: 345-348. GÜNAY, M. (1990). Marmara bölgesi sığırlarının gastro-intestinal nematodları üzerinde sistematik araştırma. Doktora Tezi, İstanbul Üniv Sağlık Bilimleri Enstitüsü. GÜRALP, N., TINAR, R., DOĞANAY, A., COŞKUN, Ş. (1985). Türkiye sığırlarında Toxocara vitulorum un yayılışı. Ankara Üniv Vet Fak Derg., 32: 280-287. HASSAN, S.E., ABDEL AZİZ, M.M. (2010). Detection of antibodies of excretory secretory antigen of Toxocara vitulorum infective larvae in buffalo calves by ELISA. Global Veterinaria., 4: 97-102. KASSAI, T. (1999). Veterinary Helminthology. Oxford: Butterworth- Heinemann, p.: 102. KAYA, G. (2003). Parazitoloji Temel İlkeler ve Laboratuar Teknikleri, Mustafa Kemal Üniv Yayın No: 16, Veteriner Fak Yayın No1, Antakya: MKÜ Basımevi, s.: 146. MERDİVENCİ, A. (1970). Türkiye Parazitleri ve Parazitolojik Yayınları. İstanbul Üniv Cerrahpaşa Tıp Fak Yayın No1610/9. İstanbul: Kutulmuş matbaası. OYTUN, H. Ş. (1961). Genel Parazitoloji ve Helmintoloji. Ankara Üniv Vet Fak Yayın No 55, Ders kitabı No: 26, 3. Baskı. Ankara: Ege matbaası. SACKEY, A. K. B., OJONGMBOH, T. A., NEİLS, J.S., SALE, U. (2007). The possible sources of Toxocara (Neoascaris) vitulorum infection in neonatal zebu calves in northern Nigeria. J Anim Vet Adv., 6: 1314-1316.

23 SAMBROOK, J., FRITSH, E.F., MANNİATİS, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 15 Sections, NewYork: Cold Spring Harbor. p.:18.47-18.76. SCHNİEDER, T. (2006). Helminthosen des Wiederkäuer. Veterinar medizinische Parasitologie. Ed.: T. Schnieder, 6. Auflage. Stuttgart: Parey MVS Medizinverlage, p.:166-234. SOULSBY, E. J. L. (1986). Helminthes, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals.7th Ed., London: Baillere Tindall, p.: 142-158. SOUZA, E.M., STARKE-BUZETTİ, W.A., FERREİRA, F. P., NEVES, M.F., MACHADO, R.Z. (2004). Humoral immune response of water buffalo monitered with three different antigens of Toxocara vitulorum. Vet Parasitol., 122: 67-78. STARKE-BUZETTI, W. A., FERREIRA, F. P. (2004). Characterization of Excretory/Secretory antigen from Toxocara vitulorum larvae. Ann N Y Acad Sci., 1026: 210-218. STARKE-BUZETTI, W.A., FERREIRA, F.P. (2005). Detection of IgG antibodies to Toxocara vitulorum soluble larval extract (Ex) by Western Blotting in the colostrum and serum of buffalo cows and calves. Brazilian J Vet Res Anim Sci., 42: 122-129. STARKE-BUZETTİ, W.A., MACHADO, R.Z., ZOCOLLER-SENO, M.C. (2001). An enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) for detection of antibodies against Toxocara vitulorum in water buffaloes. Vet Parasitol., 97: 55-64. TAYLOR, M. A., COOP, R. L., WALL, R. L. (2007). Veterinary Parasitology. 3rd Ed. London: Blackwell Publishing, p.: 65-66. TİĞİN, Y., BURGU, A., DOĞANAY, A., ÖGE, H., ÖGE, S. (1993). İç Anadolu bölgesinde sığır mide-bağırsak nematodları ve mevsimsel aktiviteleri. Turk J Vet Anim Sci., 17: 341-349. TOPARLAK, M., DEĞER, S., YILMAZ, H. (1989). Van yöresi sığırlarında Toxocara (Neoascaris) vitulorum enfeksiyonun yayılışı. Ankara Üniv Vet Fak Derg., 36: 404-412. TOPARLAK, M., ARSLAN, M. Ö., GARGILI, A., TÜZER, E. (1996). Prevalence of Toxocarosis vitulorum in cattle in Thracia, Turkey. Turk J Vet Anim Sci., 20: 341-342. UMUR, Ş., GICIK, Y. (1995). Kars yöresi sığırlarında Toxocara vitulorum un yayılışı. Ankara Üniv Vet Fak Derg., 42: 25-29.

24 WICKRAMASINGHE, S., YATAWARA, L., RAJAPAKSE, R.P.V.J., AGATSUMA, T. (2009). Toxocara canis and Toxocara vitulorum: molecular characterization, discrimination and phylogenetic analysis based on mitochondrial (ATP synthase subunit 6 and 12S) and nuclear ribosomal (ITS-2 and 28S) genes. Parasitol Res., 104: 1425-1430. YILDIRIM, A., KOZAN, E., KARA, M., ÖGE, H. (2000). Kayseri bölgesinde kapalı sistemde yetiştirilen sığırlarda helmint enfeksiyonlarının durumu. Ankara Üniv Vet Fak Derg., 47: 333-337.

25 VII. EKLER a) Mali Bilanço ve Açıklamaları Proje Bütçesi : 30.615 TL. Proje Süresi : 10.11.2009-10.05.2011 Makine-Donanım Ultrasonikatör 5.593.20 Bilgisayar 1.439.60 7.032.80 Sarf Malzemesi 55 Kalem Malzeme 12.944.66 Kırtasiye 728.44 13.673.10 Hizmet Alımı - - - Yolluklar Urfa-Adana Kars-Kırklareli-Samsun 196.00 856.00 Muğla-Bursa Konya-Amasya-Eskişehir 270.00 292.00 1.614.00 Makine-Techizat Bakım-Onarım Nikon mikroskop tamiri 466.10 466.10 TOPLAM = 22.786.00 ARTAN: 30.615.00-22.786.00 = 7.829.00 TL. b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar - Ultrasonikatör: Laboratuarımızda bulunmayan bu aletin uygun görüldüğü takdirde Demirbaşa kaydedilmesi istenmektedir. - Bilgisayar: Laboratuarımızdaki stereomikroskoba monte edilmiş, sistemi tamamlayan konumu nedeniyle, Anabilim Dalı Demirbaşına kaydedilmiştir. (Monitör No: 25502010101030204-11, Kasa No: 255020101010104-11) c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III de yer almayan analiz ayrıntıları) Toxocara vitulorum larva (ES) antijeni yapımına ilgili not: CO2 li etüvün bozulması Onarım sonrası erken veya geç dönemde yaşanan tekrarlayan mantar kontaminasyonları Proje süresi içinde kullanılan serumlardaki nitelik ve nicelik yönünden olumsuz değişiklikler Alınan ön sonuçların tekrarlanmaması nedeniyle tez önerisindeki (ES) antijeni ile ilgili kısım yoktur. d) Sunumlar -----

26 e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler TEZ: 20.05.2011 tarihinde Parazitoloji Anabilim Dalı Helmintoloji Doktora Programı çerçevesinde Abdalla Fadlalla AZRUG un Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. : Aday tarafından parazitoloji alanındaki iyi bir dergide yayına dönüştürülecektir.