Sazan Yemlerine (Cyprinus carpio L., 1758) Farklı Oranlarda Zeolit (Klinoptilolit) Katkısının Bağırsak Mukoza Morfolojisi Üzerine Etkileri Mahir Kanyılmaz 1 Nazmi Tekelioğlu 2 1 Akdeniz Su Ürünleri Araştırma Üretim ve Eğitim Enstitüsü Müdürlüğü 2 Çukurova Üniversitesi mahirkan@yahoo.com Özet Bu çalışmada, sazan yemlerine (Cyprinus carpio L., 1758) farklı oranlarda zeolit (klinoptilolit) katkısının, bağırsak mukoza morfolojisi üzerine etkileri incelenmiştir. Çalışmada, ticari sazan yemine, % 0 (kontrol) 1, 2, 3 ve 4 oranında zeolit (klinoptilolit) ilave edilmiş ve günde iki kez 12 hafta boyunca, başlangıç ağırlığı 15,09 ± 0,02 g olan pullu sazanlara verilmiştir. Deneme sonunda ince ve kalın bağırsaklardan alınan kesitlerde yapılan histolojik muayenede, ince bağırsak villus yüzey alanlarının, 64,7±4,9 ile 76,6±4,7 µm 2 arasında değiştiği, kalın bağırsak villus yüzey alanlarının, 75,6±9,1 ile 94,8±12,6 µm 2 arasında değiştiği bulunmuştur. Sindirim kanalı uzunlukları da, 24,24±3,4 ile 28,80±1,58 cm arasında bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara göre, zeolitin sazan balıklarında bağırsak yüzey alanını arttırmadığı ve sindirim kanalı uzunluğu üzerine bir etkisinin olmadığı görülmüştür (P>0,05). Anahtar Kelimeler: Sazan, zeolit, bağırsak morfolojisi Influence of Supplementation of various Levels of NaturalZeolite on Intestinal Mucosa Morphology of Common Carp (Cyprinus carpio l., 1758) Abstract This study aimed to investigate the effects of fish feed containing varying levels of dietary zeolite on the intestinal mucosa morphology of common carp (Cyprinus carpio L., 1758). The fish were fed twice a day with diets containing dietary zeolit at 0 (control), 1, 2, 3 and 4%, respectively. Each diet was fed to triplicated groups of fish with 15.09 ± 0.02 g of initial weight over 12 weeks. End of the study histologic cros sections from anterior and posterior intestine were investigated. Apparent microvillus surface area of the anterior intestine changed 1
between 64,7±4,9 and 76,6±4,7 µm 2, and 75,6±9,1 and 94,8±12,6 µm 2 in posterior intestine. Digestive tract length was found to be between 24,24±3,4 and 28,80±1,58 cm. According to results, microvillus area of the intestines and digestive tract length were not effected by zeolite levels (P>0,05). Key Words: Common Carp, Zeolite, Intestinal morphology Giriş Zeolitler ağ şeklinde kristal kafes yapısıyla geniş bir yüzeye sahiptir (Anonim, 2007). Doğal olarak elde edildiği gibi diğer kil minerallerinden de sentezlenebilmektedir (Slapajarn ve ark., 2006). Alkali ve toprak alkali metallerin kristal yapıya sahip sulu alümina silikatları olup çerçeve silikatlar grubundadır. İskelet yapılarındaki Si/Al oranlarındaki ve içerdikleri katyon cinsi ve miktarlarındaki bazı farklılıklara rağmen; (M +, M +2 ) O.Al 2 O 3.9SiO 2.nH 2 O) genel formülü ile ifade edilebilirler (Anonim, 2008a). Zeolit minerallerinin en önemli özelliği, boşluklu yapısı dolayısıyla boşluklara kolayca girebilen ve yer değiştirebilen, sıvı, gaz molekülleri ile toprak alkali iyonlardan ileri gelen "moleküler elek" olmasıdır (Anonim, 2008a) Bu özellikleri nedeniyle; kirlilik kontrolü, enerji sektörü, madencilik ve metalurji, tarım ve kağıt endüstrisi, inşaat sektörü, sağlık sektörü, deterjan sektörü, meyve ve sebzelerin depolanması, taşınması ve buzlanmanın önlenmesinde kullanılmaktadır (Mumpton, 1999; DPT, 2001; Karaca, 2008; Anonim, 2008a; Anonim, 2008b). Besicilik yemlerine zeolit ilave edilen tavuk, domuz ve geviş getiren hayvanların alabalık, sazan ve tilapya balıklarının normal yemlerle beslenenlere oranla sağlıkları bozulmaksızın daha fazla ağırlık artışı sağladığı ve ya ağırlık artışı olmasa da sağlıkları üzerinde olumsuz etkilerinin olmadığı belirlenmiştir (Mumpton, 1999; Aybal, 2001; DPT, 2001; Töre, 2006; Karaca, 2008; Anonim, 2008a; Anonim, 2008b; Kanyılmaz ve Tekelioğlu, 2008; Danabaş, 2009). Zeolitlerle ilgili birçok çalışma yapılmasına rağmen yem katkı maddesi olarak kullanıldıklarında bağırsak mukoza morfolojisi üzerine etkileri araştırılmamıştır. Bu çalışmada klinoptilolitin, villus yüzey alanı ve sindirim kanalı uzunluğu üzerine etksinin araştırılması amaçlanmıştır. 2
Materyal ve Metot Materyal Denemede yem katkısı olarak kullanılan klinoptilolit, Manisa ili Gördes bölgesinden yüzey madenciliği yoluyla üretilen zeolitlerden olup, Rota Madencilik Dış Ticaret A.Ş. tarafından sağlanmıştır. Zeolitlerin fiziksel kompozisyonu Çizelge 1 de, kimyasal kompozisyonu Çizelge 2 de verilmiştir. Kullanılan zeolit materyali balıkların alabileceği boyuttan büyük olduğu için, partikül boyutunun küçültülmesi amacıyla el değirmeninde öğütülmüştür. Öğütmeden sonra zeolitlerin su tutuculuğu, yüksek olması nedeniyle absorbe ettiği suyun uzaklaştırılması için kurutma dolabında kurutulmuştur. Çizelge 1. Kullanılan Klinoptilolitin Fiziksel Yapısı (Anonymous, 2008a) Özellik Durum Özellik Durum Görünüm, Koku Fildişi, Kokusuz Su emme % 46,5 Spesifik Ağırlık 2000 2400 kg/m 3 Katyon değişim 1,5 1,8 meq/g Gözeneklilik % 49,3 Çizelge 2. Denemede Kullanılan Klinoptilolitin Kimyasal Yapısı (Anonymous, 2008a) Bileşik Oranı(%) Bileşik Oranı(%) SiO 2 71,0 K 2 O 2,4 CaO 3,4 MgO 1,4 Fe 2 O 3 1,7 Na 2 O 0,4 Al 2 O 3 11,8 TiO 2 0,10 Denemede kullanılan sazan balıkları (Cyprinus carpio), Akdeniz Su Ürünleri Araştırma Üretim ve Eğitim Enstitüsü Müdürlüğü nden, ticari sazan yemi ise Pınar Yem A.Ş. den temin edilmiştir. Yem, önce çekiçli değirmende öğütülerek % 0 4 arasında zeolit ilave edilmiştir. Hiç zeolit içermeyen kontrol grubuna, % 4 düzeyinde alfa selüloz ilave edilmiştir. Kısaca, beş deneme grubunun selüloz: zeolit düzeyleri şu şekilde olmuştur; 4:0 (kontrol), 3:1 (Grup 1), 2:2 (Grup 2), 1:3 (Grup 3) ve 0:4 (Grup 4). Tüm ilaveler yapıldıktan sonra, yemler el mikseri ve küçük kürekle homojenize edilmiştir. Homojenize edilen karışım, araştırma amaçlı bir pelet makinesinde 2 mm çapında kuru olarak preslenerek soğutulduktan sonra yem torbalarına 3
alınmıştır. Daha sonra yemler 4 o C deki buzdolabında bekletilmiş, kullanılacak yemler haftalık olarak çıkarılmıştır. Hazırlanan yemin besin madde içeriği Çizelge 3 de sunulmuştur. Çezelge 3.Denemede kullanılan yemlerin besin madde içerikleri(kuru madde üzerinden, %) Besin Maddeleri Kontrol Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 Kuru Madde 95,10 94,88 94,89 94,80 94,64 Kül 10,97 11,90 12,73 13,60 14,53 Protein 46,14 46,96 46,19 46,32 46,15 Yağ 10,66 10,59 10,41 10,76 10,84 Karbonhidrat 27,33 25,43 25,56 24,12 23,12 Enerji (Kcal/kg) 4762 4722 4667 4647 4603 Metot Başlangıç ağırlığı yaklaşık 15,09± 0.02 g olan sazanlar, her birinde 20 şer adet olmak üzere 15 akvaryuma (170 l) rastgele dağıtılmıştır. Deneme başlamadan önce iki haftalık adaptasyon döneminde Kontrol Yemi ile günlük vücut ağırlıklarının yaklaşık % 4 ü düzeyinde sabah ve akşam yemlenmiştir. Deneme başında, her tanktaki balık sayısı 15 e düşürülmüştür. Deneme tesadüf parselleri deneme desenine göre 5 grup ve her grup 3 tekrardan ibaret olacak şekilde planlanmıştır. Her bir akvaryuma havalandırma ve filtrasyon için iki adet hava hortumlu düzenek konulmuştur. Grupların deneme başı ağırlıklarının eşit olup olmadığı ve deneme sonu verileri ANOVA ile test edilmiştir. Balıklar denemenin ilk 8 haftasında canlı ağırlığının % 4 ü oranında, son 4 haftasında ise % 3 ü oranında, elle ve günde iki kez (8:30 ve 15:00 saatlerinde) olmak üzere toplam 12 hafta boyunca yemlenmiştir. Verilen yem düzeyi, iki hafta da bir yapılan tartımlarda belirlenen ağırlığa göre yeniden düzenlenmiştir. Akvaryumların suyunun % 80 i, 1 4. haftalarda 3 günde bir, 5 8. haftalarda iki günde bir, 8 12. haftalarda ise her gün sifonlanarak, 2 adet 1 m 3 lük su tankında bekletilen ve akvaryumların sıcaklığıyla yaklaşık aynı dereye getirilen su ile değiştirilmiştir. Filtreler 1 8. haftalarda gün aşırı, 9 12. haftalarda ise her gün değiştirilmiştir. Deneme boyunca su sıcaklığı, çözünmüş oksijen YSI 55 12 FT model oksijen metre ile ph değeri de YSI 63 12 FT model ph metre ile üç günde bir ölçülmüştür. Deneme süresinde yapılan ölçümlerden elde edilen ortalama sıcaklık, çözünmüş oksijen ve ph değerleri Tekelioğlu (2000) tarafından sazan yetiştiriciliği için önerilen değerler içinde olup, deneme süresince ölüm görülmemiştir. 4
Histolojik Analiz Doku Preparasyonu Deneme sonunda balıklar aşırı doz fenoksietanol ile öldürülmüştür. Sindirim kanalına ait barsak dokusundan histolojik inceleme yapmak için balıkların sindirim kanalı çıkartılarak ölçülmüştür. Ölçüm sonunda sindirim kanalının ilk ve arka bölümünün tam 1/3 lük kısımlarına karşılık gelen kısımlardan 1 er cm lik kesit alınarak histolojik işlemlere tabi tutulmuştur. Çalışmada, balığın sindirim kanalının ön ve arka kısmından alınan doku örneği materyal olarak kullanılmıştır. Alınan doku örnekleri bouin solusyonu (18 24 saat) ve % 10 formaldehit (36 48 saat) (Carson, 1997) içinde tespit edilmiştir. Tespit edilen doku örnekleri gece boyu akan suda yıkanarak ve dereceli alkol serilerinden (% 70, 80, 90, 100, 100, 100 alkol) geçirilerek doku örneklerinden suyun uzaklaştırılması sağlanmıştır. Doku örneklerinden suyun uzaklaştırılmasının ardından doku örneklerine ksilol ile muamele edilerek şeffaflaştırılması sağlanarak parafine gömülmüştür. Parafine gömülü doku örneklerinden 6 7 µm kalınlığında kesitler alınarak, bu kesitlere genel histolojik yapının belirlenmesi için Masson Trichrome yöntemi (Bancroft ve ark., 1996) uygulanmıştır. Bağırsak Mukozasının Morfolojik Değerlendirilmesi Genel histolojik yapının belirlenmesi için hazırlanan preparatlar, Olympus BX40 mikroskobunda 40 kat büyütülerek incelenmiştir. Preparatların resimleri dijital kamera ile kaydedilerek, bağırsak villus yüzey alanları ön ve arka kısımlar ayrı ayrı Iji ve ark., (2001) a göre Şekil 1 de gösterildiği gibi ve imagej Bilgisayar Programı kullanılarak hesaplanmıştır. 5
Şekil 1. Bağırsak Mukozasının Morfometrik Değerlendirilmesinde Dikkate Alınacak Değişkenler; a: villus yüksekliği, b: kript derinliği, c: villus bazali genişliği, d: villus apikali genişliği (Iji ve ark., 2001) Buna göre; Villus yüzey alanı= (c + d)/2 x a Bulgular Deneme gruplarında yapılan villus yüzey alanı hesaplamalarında ince bağırsakların villus yüzey alanları 64,7±4,9 µm 2 ile en az, % 1 klinoptilolit katkısı ilave edilen grupta, en fazla yüzey alanı da 76,6±4,7 µm 2 ile % 4 klinoptilolit katkısı ilave edilen grupta görülmüştür. Kalınbağırsaklarda ise en az 75,6±9,1 µm 2 ile % 3 klinoptilolit katkısı ilave edilen grupta, en fazla yüzey alanı da 94,8±12,6 µm 2 ile % 4 klinoptilolit katkısı ilave edilen grupta görülmüştür. En kısa sindirim kanalı 24,24±3,48 cm ile % 3 klinoptilolit katkısı ilave edilen 3. grupta, en uzun sindirim kanalıda 28,80±1,58 cm ile % 2 klinoptilolit katkısı ilave edilen 2. grupta bulunmuştur. Deneme gruplarına ait villus yüzey alanları ve sindirim kanalı uzunlukları Çizelge 4 de, villuslara ait görüntülerde Şekil 1 de verilmiş olup, yemlere klinoptilolit ilave edilmesinin bağırsak yüzey alanlarına ve sindirim kanalı uzunluğuna rakamsal olarak etki etmesine rağmen istatiksel olarak etkisinin olmadığı sonucuna ulaşılmıştır (P>0,05). 6
Çizelge 4. Deneme Gruplarının İnce ve Kalın Bağırsak Villus Yüzey Alanları ile Sindirim Kanalı Uzunluğu Ortalamaları Bağırsak Morfolojisi Kontrol Grubu Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 İnce bağırsak yüzey alanı (µm 2 ) Kalınbağırsak yüzey alanı (µm 2 ) Sindirim kanalı uzunluğu (cm) 71,4±9,8 a 64,7±4,9 a 70,3±7,0 a 69,6±8,3 a 76,6±4,7 a 91,3±0,9 a 80,6±4,4 a 78,3±5,3 a 75,6±9,1 a 94,8±12,6 a 25,96±1,19 a 28,80±1,58 a 24,62±1,13 a 24,24±3,4 a 26,18±0,7 a Tartışma Stevens ve Devlin (2000) tarafından, büyüme hormonu geni transfer edilmiş coho salmonlarla (Oncorhynchus kisutch), normal coho salmonların sindirim kanalı ve büyüme özelliklerinin incelendiği çalışmada, büyüme hormonu geni transfer edilmiş coho salmonların sindirim kanalının yüzey alanının kontrol grubuna göre 2,2 kat, büyüme oranının da iki kat daha yüksek bulunduğunu bildirmişlerdir. 7
Şekil 4.3 Villus Görüntüleri. A: İnce Bağırsak, B: Kalın Bağırsak Araştırıcılar bağırsak yüzey alanının artmasının büyümeye etkili olduğu sonucuna ulaşmışlardır. Yan ve Zhou (2006), Jian carp yemlerine % 0,0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 ve 2,0 oranında glutamin ilave edilmesinin, ağırlık artışı, yem tüketimi, FCR, bağırsak ağırlığı ve bağırsak kıvrımlarını arttırdığı sonucuna ulaşmışlardır. Bonaldo ve ark. (2006), Mısır dil balığı (Solea aegyptiaca), yemlerine farklı oranlarda soya küspesi ilave ederek yaptıkları besleme çalışmasında, büyüme ve bağırsak morfolojisinde farklılık olmadığını bildirmişlerdir. Escaffre ve ark. (2007), gökkuşağı alabalıklarında balık unu ve konsantre soya proteini ile beslemenin mikrovillus yüzey alanına etkisinin olmadığını bildirmiştir. Levrek balığı yemlerine % 20 zeolit ilavesi yemlerin bağırsak geçiş zamanını uzatmıştır (Dias ve Diğ., 1998). Kanyılmaz ve Tekelioğlu (2008), yaptıkları çalışmada sazan yemlerine klinoptilolit ilavesinin büyüme ve vücut parametrelerine etkisinin olmadığını bildirmişlerdir. Çalışmalardan elde edilen verilere göre bağırsak yüzey alanının artması büyüme üzerine etkilidir. Çalışmamızda zeolit ilavesinin bağırsak yüzey alanı ve uzunluğuna etkili olmaması büyümeye etkili olmamasının nedenlerinden biri olarak açıklanabilir. Kaynaklar Anonim, 2007.Klinoptilolit nedir. 14 Mart 2007. Anonim, 2008a. Zeolitin kullanım alanları. 20 Mayıs 2008. http://www.zeoliteproducer.com/zeolit.html Anonim, 2008b. Zeolitin kullanım alanları. 20 Mayıs 2008 http://www.teknomin.com.tr/turkce/zeolit_b.html Aybal, Ö., N., 2001. Clinoptilolite in Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhychus mykiss) Yemlerinde Yem Katkı Maddesi Olarak Kullanılması. Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi, Isparta, 67s Bancroft, J. D., Steven, A. and Turner, D. R., 1996. Theory and Practice of Histological Techniques. 129s Churchill Livingstone. New York, London, Edinburg, Madrid, Melbourne, San Francisco, Tokyo. Bonaldo, A., Roem, A. J., Pecchını, A., Grıllı, E., and Gatta, P. P., 2006. Influence of dietary soybean meal levels on growth, feed utilization and gut histology of Egyptian sole (Solea aegyptiaca) juveniles. Aquaculture, 261 : 580 586 8
Carson, F. L., 1997. Histotechnology, A Self Instructional Text. 304s American Society for Clinical Pathology Press Hong Kong Danabaş, 2009. Farklı Oranlardaki Zeolit (Klinoptilolit) İn Bazı Su Parametreleri İle Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus Mykiss Walbaum, 1792) Nın Gelişimi Ve Vücut Kompozisyonuna Etkileri. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Anabilim Dalı, Doktora Tezi, Adana, 82s. Dias, J., Huelvan, C., Dinis, M. T., and Metailler, R., 1998. Infulence of Dietary Bulk Agents (Silica, Cellulose And Naturel Zeolite) On Protein Digestibility, Growth, Feed Intake And Trasit Time in European Seabass (Dicentrarchus Labrax) Juveniles. Aquatic Living Resource, 11 (4): 219 226. DPT., 2001. Madencilik özel ihtisas komisyonu raporu endüstriyel hammaddeler alt komisyonu genel endüstri mineralleri II (mika zeolit lületaşı) çalışma grubu raporu. ANKARA Escaffre, A., M., Kaushik, S., and Mambrini, M., 2007. Morphometric Valuation Of Changes İn The Digestive Tract Of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Due To Fish Meal Replacement With Soy Protein Concentrate. Aquaculture, 273; 127 138 Kanyılmaz, M. ve Tekelioğlu, N. 2008. Sazan Yemlerine (Cyprinus carpio L., 1758) Farklı Oranlarda Zeolit (Klinoptilolit) Katkısının Büyüme ve Vücut Kompozisyonu Üzerine Etkileri, Çukurova üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 19 (3), 116 124. Karaca, 2008. Zeolit. 20 Mart 2008. http://mkaraca365.blogcu.com/ Mumpton, F. A., 1999. La Roca Magica: Uses of natural zeolites in agriculture and ındustry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96 (7): 3463 3470 Slapajarn, O., Slapajarn, K., and Boyd, C.E., 2006. Evaluation of Zeolite Products Used for Aquaculture in Thailand. Journal Of The World Aquaculture Socıety, Vol. 37, No. 1 Tekelioğlu, N., 2000. İç su balıkları yetiştiriciliği. Çukurova Üniversitesi Su ürünleri Yüksek Okulu Yayınları No:2, Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Basımevi, Adana Töre, Y., 2006. Doğal Zeolit Ve Nisastanın Tilapya Balıkları Yeminde Dolgu Maddesi Olarak Kullanımının Bazı Vücut ve Kan Kompozisyonu İle Su Kalitesi Parametreleri Üzerine Etkileri. Mustafa Kemal Üniversitesi. Hatay, Yüksek Lisans Tezi, 48s 9
Yan, L., and Qıu Zhou, X. 2006. Dietary Glutamine Supplementation İmproves Structure And Function Of İntestine Of Juvenile Jian Carp (Cyprinus carpio var. Jian). Aquaculture, 256: 389 394 10