MEMBRANDA PROTEİN KİRLİLİĞİNİN KANTİTATİF ANALİZİ: ETKİN DİFÜZYON KATSAYISININ BULUNMASI Sema SALGIN *, Serpil TAKAÇ **, Tunçer H. ÖZDAMAR ** * Cumuriyet Üniversitesi Müendislik Fakültesi Kimya Müendisliği Bölümü 5840 Sivas ** Ankara Üniversitesi Müendislik Fakültesi Kimya Müendisliği Bölümü 0600 Tandoğan Ankara ÖZET 00 kda polietersülfon membranlarda bovin serum albuminin (BSA) etkin difüzyon katsayısı (D e ); deneysel olarak tasarlanan bir sistemde alınan verilerin, membran içinde alınan bir acim elemanında kurulan kütle korunum temelli model sonuçları ile uyumu ile belirlenerek, farklı ph ve iyonik gerilim değerlerindeki değişimler incelenmiştir. Kirliliğin -adsorpsiyonun- fazla olduğu BSA nın izoelektrik noktasının altındaki ph=3.78 değerinde D e nin düşük, adsorpsiyonun az olduğu izoelektrik noktada (pi=4.78) ise yüksek olduğu ve iyonik gerilimin artması ile arttığı belirlenmiştir. D e nin gözenekli ortamda çözelti ve membran özelliklerine bağlı olarak değişiminin incelenmesi sonucu taşınım olaylarında önemli bir tasarım parametresi bulunarak membran kirliliğinin kantitatif analizi yapılmıştır. Anatar Kelimeler : Bovin serum albümin; Difüzyon katsayısı; İyonik çevre. GİRİŞ Biyoteknolojik proseslerde proteinlerin ayırılması ve deriştirilmesinde, üstünlükleri nedeniyle terci edilen membran ayırma işlemlerinin etkin kullanımındaki sınırlama, membranda meydana gelen kirliliği kontrol eden fizikokimyasal olaylar akkında yeterli bilginin olmamasıdır. Literatürde yer alan çalışmalarda, ayırma işlemleri sırasında çeşitli işletme parametreleri, membran ve çözelti özellikleri araştırılarak kirliliği en aza indiren koşullar önerilmesine rağmen, kirlilik mekanizması akkında genel bir görüş geliştirilememiştir [,]. Bu nedenle proteinlerin membranla moleküler düzeydeki etkileşimleri yansıtan, kirliliği tanımlayarak kantitatif olarak değerini veren yeni bir yaklaşımın yapılması gerekmektedir. Ayrıca kompleks yapılarından dolayı proteinlerin difüzyon katsayılarının belirlenmesi ile ilgili araştırmalar sınırlıdır; özellikle ph, iyonik gerilim gibi ara yüzey ve kolloidal etkileşimleri etkileyen faktörlerin difüzyon katsayısına etkisini inceleyen, membran kirliliğinin kantitatif analizini yapan çalışmalar literatürde yer almamaktadır. Bu çalışmada, biyomoleküllerin membran ile etkileşimlerindeki fizikokimyasal olaylar sonucunda meydana gelen kirliliğin bir göstergesi ve ayırma etkinliğinin belirleyicisi olarak etkin difüzyon katsayısının (D e ) belirlenmesi amaçlanmıştır. Proteinlerin gözenekli membranlarda etkin difüzyon katsayılarının belirlenmesine yönelik olarak bir matematik model kurulmuş ve bu modelin farklı çözelti ph ve iyonik gerilim değerlerinde elde edilen deney verileri kullanılarak yapılan çözümünden D e değerleri bulunmuştur.. KURAMSAL Membranda proteinin etkin difüzyon katsayısının (D e ) belirlenebilmesi için, membran içinde alınan bir acım elemanında proteinin membran yüzeyine ve gözeneklerine adsorplandığı, adsorpsiyon izoterminin lineer olduğu ve etkin difüzyon katsayısının derişimin fonksiyonu
olmadığı, membran gözenekliliğinin ve sıcaklığın sabit olduğu varsayımları ile kütle korunum denklemi kurulmuş (Eşt. ); çözüm için başlangıç ve sınır koşulları belirlenmiştir. C t = D e ε [ ε + K ( ε )] C y () Başlangıç Koşulu : t = 0 C = 0 Sınır Koşulu : y = 0 C = C(t) = C y = C = C(t) = C Eşt. in değişkenlere ayırma yöntemi ile yapılan genel çözümü, Eşt. ile verilmiştir [3]. D ε e n π t y cos( ) + ( ) (, ) = + ( ) + C nπ C nπy ε K ε C t y C C C sin exp π n= n () Eşt. de yer alan C ve C, membranın y=0 ve y= sınırlarındaki derişim değerlerini, K adsorpsiyon denge sabitini ve membran kalınlığını göstermektedir. Tasarlanan deney sisteminde -şematik olarak Şekil de verilen- difüzyon ücresinin sağ deposunda sıvı yığınındaki protein derişiminin (C ) zamanla değişimi ölçüldüğü için. Eşt. de membran yüzeyindeki derişim değerlerinden (C ve C ) sıvı yığını protein derişim değerlerine (C ve C ) geçilebilmesi için gerekli düzenlemeler yapılmış ve çözülmesi gereken denklem Eşt.3 e dönüşmüştür. dc dt ADe = V K D ε e n π t ε + K( ε) ( C C ) + ( C cos( nπ ) C )exp (3) n= Eşt. 3 de C ' sıvı faz protein derişimi difüzyon ücresinin depoları arasında protein için kütle korunum dengesi kurularak bulunmuştur [4,5]. Bu şekilde teorik olarak proteinin difüzlendiği depoda sıvı faz protein derişiminin (C ) zamanla değişim profili elde edilerek D e ayarlanabilir parametre olmak üzere deneysel ve kuramsal verilerin uyumuna göre -ayar parametresi- D e seçimi yapılabilmektedir. Bu basamaktan sonra denklemin çözümü, Matlab ortamında yazılan bir program ile yapılmıştır. 3. DENEYSEL 3.. Materyal Çalışmada model protein olarak izoelektrik noktası pi = 4.7-4 9 ve molekül ağırlığı 67 kda olan bovin serum albumin (BSA, Sigma A9647) kullanılmıştır. Ayrıca difüzyon deneylerinde etkin membran alanı A=0.785 cm, ortalama membran kalınlığı () SEM fotoğrafından 00 µm olan 00 kda PES membranlar (Biomax PBHK050) kullanılmıştır. 3.. BSA Etkin Difüzyon Katsayısının Belirlenmesi
Proteinlerin UF membranlarda etkin difüzyon katsayısının bulunması için tasarlanarak imal ettirilen difüzyon ücresi ve deney sistemi [6] Şekil de gösterilmiştir. Teflon malzemeden yaptırılan sistem eşit acimli silindirik iki depoya saiptir. Membran, depoların arasına sızdırmazlık sağlayacak şekilde yerleştirilmiştir. Soldaki depoya protein, sağdaki depoya ise tuz çözeltisi konulmuş ve difüzyon ücresine ait iki depoda da tam karışma sağlanmıştır. Yapılan tam karışma varsayımı ile sıvı yığın faz ile membran yüzeyindeki protein derişimlerinin eşit olduğu kabul edilmiş ve yığın çözeltiden zamanla alınan örneklerin derişimi, modelden elde edilen (Eşt.3) derişim-zaman verilerinin karşılaştırılmasında kullanılmıştır. Model ve deney sonuçlarının uyumuna göre farklı koşullar için proteinlerin etkin difüzyon katsayısı belirlenmiştir. Membrandan geçerek tuz çözeltisinin olduğu depoya difüzlenen proteinlerin 5 dakikalık zaman dilimlerinde 8 saat süresince on-line olarak λ=80 nm dalga boyunda bir filtrenin takılı olduğu bir akış ücresine saip UV/VIS absorbans dedektörden (UA 6 UV/VIS ISCO) belirlenmiştir. Membranın iki yüzü arasındaki basınç farkı elimine edilerek konveksiyon ile kütle aktarımının imal edildiği koşullar sağlanmıştır. Bu şekilde membrandan protein aktarımı, sadece difüzyon mekanizması ile gerçekleşmiştir. 4 3 5 6 7 Şekil. Etkin Difüzyon Katsayısının Bulunması için Deney Sistemi;. Protein Çözelti Tankı,. Tuz Çözelti Tankı, 3. Peristaltik Pompa, 4. Difüzyon Hücresi, 5. U-manometre, 6. Akış Hücresi, 7. Kaydedici 4. SONUÇLAR Model protein BSA nın üç farklı ph (3.78, 4.78 ve 6.80) ve iki farklı iyonik gerilim (0. M ve 0.0 M) değerlerinde, lineer adsorpsiyon izotermi gösterdiği [6] C o =0.5 g/l başlangıç derişiminde deneyler yapılarak, 00 kda PES membranlardaki etkin difüzyon katsayıları (D e ) belirlenmiştir. Bu amaçla model ve deney sisteminde elde edilen veriler birlikte kullanılmıştır. Modelde (Eşt.3) yer alan K denge değeri, farklı ph ve iyonik gerilimlerde yapılan adsorpsiyon deneyleri sonucu belirlenen değerlerdir [6]. 00 kda PES membran gözenekliliği ε=0.5 olarak alınmıştır. Şekil de, BSA nın etkin difüzyon katsayısının bulunması için yapılan çözüme örnek olarak, ph=4.78 değerinde 0.0 M KCl çözeltisi ile sağlanan iyonik gerilimde Co=0.5 g/l başlangıç BSA derişiminde 00 kda PES membrandaki difüzyon sonucu elde edilen deneysel veriler ve modelden elde edilen veriler karşılaştırılmalı olarak gösterilmiştir. Bu koşullarda deney verileri ile model sonuçlarının en iyi uyum sağladığı D e değeri 3.8x0 - m /s olarak belirlenmiştir. Deneysel olarak ve modelden elde edilen er bir nokta arasındaki fark değerleri esaplanarak ortalama % 0.7 olarak bulunmuştur.
Şekil. Co=0.5 g/l BSA, ph=4.78, I=0.0 M Koşullarında 00 kda PES Membranda BSA Difüzyonu Sırasında Sıvı Faz Derişiminin Zamanla Değişimi: Deney ve Model Verileri Çizelge de, farklı ph ve iyonik gerilim değerlerinde yapılan deneyler sonucunda belirlenen BSA nın etkin difüzyon katsayıları yer almaktadır. İncelenen ph değerlerinde, iyonik gerilimin artması ile difüzyon katsayısı artmış, ph ın artması ise er iki iyonik gerilim değerinde de D e yi önce artırmış, sonra azaltmıştır. İyonik gerilimin artması ile BSA-membran ara yüzey etkileşimleri azaldığı için yüksek iyonik gerilimde kirlilik azalmış, etkin difüzyon katsayısı artmıştır. İyonik gerilimdeki artış gözenek içindeki çift tabaka kalınlığı azaltmış ve bunun sonucunda etkin gözenek çapının artması ile proteinin gözenek içinde areket kısıtlaması azalmıştır. İzoelektrik noktanın altındaki ph (ph=4.78) değerinde proteinin-membran arasındaki etkileşimler -dolayısıyla adsorplanan protein miktarı fazla olduğu için- etkin difüzyon katsayısı azalmış, kirliliğin en az olduğu izoelektrik noktada (pi=4.78) ise artmıştır. Çizelge. Farklı İyonik Çevrelerde C o =0.5 g/l Derişiminde BSA nın 00 kda PES Membranlarda Etkin Difüzyon Katsayıları ph 0.0M KCl D e, m /s 0. M KCl D e, m /s 3.78.9x0 -.6x0-4.78 3.8x0-4.4x0-6.80 3.x0-3.8x0 - TEŞEKKÜR Bu çalışma TÜBİTAK (MİSAG-5) ve Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (00-07-05-06) tarafından desteklenmiştir. SEMBOLLER
A C i C o D e I Etkin membran alanı Membran BSA derişimi Başlangıç BSA derişimi Etkin difüzyon katsayısı Membran kalınlığı İyonik gerilim K pi ε Adsorpsiyon denge sabiti İzoelektrik nokta Membran gözenekliliği KAYNAKLAR. Huisman, I.H., Prádanos, P. and Hernández, A., Te Effect of Protein-Protein And Protein-Membrane Interactions on Membrane Fouling in Ultrafiltration, Journal of Membrane Science, 79,79-90, 000.. Xu, T., Rongqiang, F., Lifeng,Y., A New Insigt into te Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Porous Polyetylene Membrane by Zeta Potential Measurements, FTIR Analyses, and AFM Observations, J Colloid Interface Sci., 6, 34-350, 003. 3. Crank, J., Te Matematics of Diffusion, Oxford University Press, London, 956. 4. Groβ, A., Heintz A., Diffusion Coefficient of Aromatics in Nonporous PEBA Membranes, Journal of Membrane Science, 33-4, 000. 5. Clark M.M and Lucas P., Diffusion and Partitioning of Humic acid in a Porous Ultrafiltration Membrane, Journal of Membrane Science, 43, 3-5, 998. 6. Salgın S. Protein-membran Etkileşimleri ve Proteinlerin Membran Sistemlerle Ayırılması, Ankara Üniversitesi, Ankara, 004.