Poly A Kuyruğu Turns over (recycles) in cytoplasm Poli A-bağlayan protein: PAB1 sitoplazmada, PAB2 nukleusta bulunur. Bitkiler 2 PAB geninden daha fazla gen içerirler; bazıları dokuya özgün anlatım gösterir. mrna stabilitesini uyarır. polya çok kısa ise, mrna yıkılır. Translasyonu arttırır. Cap ile sinergistik etki gösterir.
Ateş böceği luciferaz mrna (bitki 5 ve 3 UTR leri ile) protoplastlara elektroporasyonla verilmiştir.
Bitkiler için ortak reporter genler 1. GUS - E. coli $-glucuronidaz - enzimatik assay (fluoresan ürün) ve histokimyasal assay (in situ), sentetik subsratlar ile 2. Luc - luciferaz Photinus (ateş böceği), Vibrio (bacterium), Renilla (soft coral) - luminescence assay(light emisyonu) in vitro veya in vivo 3. GFP - yeşil fluoresan protein, fluoresan in vivo izleme - YFP ve diğer değiştirilmiş renkler
Nukleus RNA Kırpılması Nukleusta iki tip intron var: 1. nuklear mrna intronları 2. nuclear trna intronları Kırpılma mekanizmaları farklı, fakat her ikisi de proteinlere gereksinim gösterirler. mrna kırpılması RNA-tarafından katalizlenebilir.
Nuklear mrna (NmRNA) Kırpılması Hemen hemen tüm NmRNA intronları GU ile başlar ve AG ile sonlanır. Mayalar ve memelilerde, NmRNA kırpılması bir spliceosom ile olur, bunlar küçük snrnplerden oluşan dinamik (RNP)ler ve premrna içerirler. Bir snrnp küçük U-zengin RNA (U1,U2,U4,U5 veya U6) ve >7 proteinden oluşur çoğu ortak proteinlerdir.
Spliceosom çalışması ATP Splicing reaksiyonları Eski haline dönüş Fig. 6.41, Buchanan et al.
Spliceosomal ve Group II intronlarında benzer aktif bölgeler? (both models after first splicing reaction)
Bitki NmRNA kırpılması 1. Bitki mrna intronları GU/AG kuralını uygularlar, fakat daha küçüktür (< 300 bp) ve dikotillerde A-U zengindir. A-U zengin diziler dikotillerde kırpılma için gereklidir ve monokotillerde de kırpılmayı uyarırlar. 2. Monokotil ve dikotil snrnpler farklıdırlar ve monokotil intronları dikotillerde zayıf biçimde kırpılırlar. 3. Bitkiler snrnaların homologlarını içerirler, mayalardakine benzer kırpılma mekanizmaları vardır, fakat A-U bölgeleri tanıyan faktörlere gereksinim gösterirler.
Alternatif kırpılma: fotosentez regulasyonu Ayni genden iki veya daha fazla mrna ve iki farklı protein oluşturabilir. Bitkilerdeki ilk gözlem: RuBPCase Aktivaz (Werneke et al. 1989. Plant Cell 1: 815) RuBPCaz i aktive eder ATPaz aktivitesi gösterir bir şaperon (protein-özgün?)
Aktivaz RuBPCaz aktivasyonu 1974 e kadar sadece yarı-islevsel RuBPCaz izole edilebilmiştir: inaktik RuBPCaz de katlanmalar oluşturur. Aktif bölgedeki bir lisin karbamata dönüşür (positif yükü negatif yke değişir) Mg 2+ karboksili koordine eder. RuBPCaz ın ECM formu asıl işlevsel birimdir. H R-C-N-H + + CO 2 H 2H + O - R-C-N-C = O
RuBPCaz Aktivaz Alternatif Kırpılma Alternatif 5' kırpılma bölgeleri son intronda (intron 6) 2 farklı mrna oluşturur ve bunlardan 2 farklı farklı karboksil terminal amino asidli enzim formu (41 ve 43 kda) oluşur. Sadece uzun form sissteinler (S-S) arasındaki disülfit bağları ile redoks ile düzenlenir. RuBPCaz aktivasyonuna redoks regülasyonu sağlar.
Alternatif kırpılma: Büyüme düzenlenmesi Alternatif kırpılma FCA geninde ççiçeklenmeyi düzenler. FCA çiçeklenmeyi uyarır. has RNA-binding domain. Gengden 4 transkript oluşur sadece 21 intronu kırpılmış transkript işlevseldir. Belli zamanlarda belli dokularda bulunur.).
Arabidopsis Genome Project: Genleri yaklaşık~ % 11 i alternatif kırpılma gösterir. İnsan genlerinin (~ % 40 ı).
Bitki mrna stabilitesinin düzenlenmesi mrna yarı ömrü değişiklikler gösterir; büyük olasılıkla düzenlenmektedir. Bitki hücreleri çok sayıda RNaz (özellikle vakuolde) içerir bu Rnaz potansiyel olarak mrna aları yıkabilir 3' UTRs ve polya kuyrukları çok sayıda mrna nın stabilitesi için önemlidir, fakat 5 UTR nin de bir işlevi olabilir. Bir kaç tane instabilite elementi bulunmuştur; ( Bazı stabil olmayan mrna ların 3 UTR lerinde AU-zengin elementler gibi)
Translasyonal regülasyon 1. Total translasyon değişimleri 2. Özgün mrna ların farklı translasyonu 3. Bitkilerde in vivo mekanizmalar iyi anlaşılamamıştır; translasyonyun in vitro bioyokimyası wheat germ de iyi çalışılmıştır. Regülasyon genelde inisiyasyon aşamasındadır. Initiation mechanism differs from prokaryotes and the chloroplast (no S-D sequences, more factors) Triticum aestivum
Translasyonun üç aşaması Initiation Elongation Termination Fig. 9.10, Buchanan
İnisiyasyon tarama modeli M. Kozak tarafından önerilmiştir; Küçük ribosomal altunite (+ inisiyasyon faktörleri,gtp, trnai Met ) 5 Cap a bağlanır, sonra ilk AUG ye ulaşana kadar mrna yı tarar. Translasyon ilk AUG de başlar. Translasyon başlama bölgesi ve etkinliği RNA yapısından da etkilenir.
Fig. 9.12
eif4g Cap ve polya kuyrukları arasındaki sinergistik etkide eif4e ve Pab1p ile etkileşerek iş görür. Cap ve polya kuyruğu neden etkileşir?
İnisiyasyon faktörleri(eif-4 hariç) eif1&1a: taramayı uyarır. eif2: trnai Met ile 40S subunit bağlar, GTP gerektirir. - eif2b: GTP:GDP değişimini sağlar eif3: 40S subunit bağlanır, 60S bağlanmadan korur. eif4: mrna 5 ucuna bağlanır, baz-çiftleri eşleşmiş RNA yapısını açar, IF3 ve PAB a bağlanır. eif5: 60S subunit ile 40S pre-inisiyasyon kompleksi bağlanmasını sağlar. eif6: 60S subunit e bağlanır, 40S bağlanmayı engeller
eif4 çok işlevlidir. eif4f: Cap-bağlama kompleksi, 3 subuniteden (eif4e, eif4a ve eif4g) oluşur. (eif4e direkt olarak cap' Cap) eif4a: RNA helikaz w/dead motif eif4b: RNA ya bağlanır, eif4a yı uyarır. eif4g: versatil adaptördür, eif4e, eif3 ve polya bağlama proteini ile (Pab1p)ile ilişkiye geçer
Mısır olgun yaprak hücreleri Meristem hücreleri