SANRAL DOGMA REPLİKASYON Memeli hücre döngüsü. DNA sentezi ve histon sentezi. DNA sentezi için hızlı gelişim. fazı. fazı.

Transkript

1 SANRAL DOGMA 1 2 REPLİKASYON Memeli hücre döngüsü DNA sentezi için hızlı gelişim S fazı DNA sentezi ve histon sentezi G0 Hücreler sessiz G1 fazı M fazı G2 fazı Gelişim ve hücre bölünmesi için hazırlık Mitoz 3 4 1

2 G1 S G2 M DNA sentezi için hücrenin hazırlanması sitokinez Hasarlı DNA tamiri replikasyon Kromatin kondansasyonu Çekirdek zarı parçalanması Sentriol sentezi mitoz DNA REPLİKASYONUNUN BİYOKİMYASAL TEMELİ DNA sentezi için iki anahtar substrat gereklidir: 1.Deoksinukleosid trifosfatlar (dgtp, dctp, datp, dttp): nukleosid trifosfatlar deoksiribozun 5 hidroksil grubuna bağlı üç fosforil grubundan meydana gelir. En içteki fosforil grubu alfa fosfat, diğerleri beta ve gama fosfat olarak isimlendirilir 2. Primer-kalıp eşleşmesi: primer, kalıbın komplementeridir. 5 6 DNA replikasyonu sırasında polimeraz enzimleri dışında 20 den fazla enzim ve protein rol alır. Tümüne DNA replikaz sistemi ya da replizom adı verilir DNA replikasyonu: Başlangıç- replikasyon bir orijinden başlar Replikasyon orijin(leri)nin belirlenmesi Çift sarmal yapının tek iplikli DNA ya denatürasyonu Replikasyon çatalı oluşumu Uzama-yeni DNA dizileri DNA polimerazile çoğaltılır Sonlandırma-replikasyon prokaryotlarda ve ökaryotlarda farklı sonlanır

3 DNA replikasyonu kesintilidir. pol III yeni sentezlenen dizinin sadece 3 ucuna nukleotid ekler. DNA dizileri birbirine göre anti-paraleldir. Prokaryot kromozomunda halkasal DNA bulunur. Replikasyon, replikasyon orijini adı verilen bir bölgeden başlar ve kromozomun her iki yönüne doğru ilerler. Zincir uzaması öncü dizide (leading strand) devamlı (replikasyon çatalı ile aynı yönde) Geciken dizide (lagging strand) kesintili 9 10 REPLİKASYON ÇATALINDAKİ PROTEİN KOMPLEKSLERİ 1. DNA primaz 2. DNA Helikaz 3.ssDNA bağlayan proteinler (Single Stranded DNA Binding Proteins) 4. Sliding Clamp 5. Clamp Loader 6. DNA polimeraz 7.DNA Ligaz DNA primaz DnaB (helikaz) ile birlikte 5-3 yönünde kısa polinukleotid (RNA öncüsü) sentezini gerçekleştirir ve 3 ucu DNA polimeraz için uygun hale getirerek durur. 8. DNA Topoizomeraz

4 Hem öncü (leading) hem de geciken (lagging) dizi DNA sentezi için primaz enzimine gereksinim duyarken bu enzimin iki dizi arasındaki fonksiyonu birbirinden farklıdır. Her bir öncü (leading) dizi sadece tek bir RNA öncüsüne gereksinim duyar. Geciken dizinin kesintili sentezinde binlerce Okazaki fragmanları ve ilişkili RNA öncülerine gereksinim vardır. mrna, rrna ya da trna da rol alan RNA polimerazların tersine, primaz yeni RNA öncüsünü sentezini başlatmak için spesifik DNA dizilerine gereksinim duymaz. Bunun yerine, primaz, DNA helikaz gibi bir başka DNA replikasyon proteini ile ilişkiye girdiği zaman aktive olur. (primozom= primaz + helikaz) Primaz aktive olduğunda, sıraya bakmaksızın RNA öncülerini sentezler. 13 PriA, primazın DNA ya bağlanmasına yardımcı primozom proteini. Primozom, 7 farklı proteinden oluşur: DnaG, primaz, DnaB helikaz, DnaC helikaz asistan, DnaT, PriA, Pri B, ve PriC. Molecular Biology Understanding the Genetic Revolution, DNA helikazdan sonra oluşturulan ssdna, DNA sentezinde kalıp olarak kullanılıncaya kadar baz eşleşmesinden uzak durmalıdır. Ayrılmış dizileri stabilize etmek için single-stranded DNA binding proteinler (SSB ler) buralar bağlanırlar. Bir SSB nin bağlanması bir diğer SSB bağlanmasını beraberinde getirir. Buna kooperatif bağlanma denir ve bu bağlanma ssdna ile SSB lerin etkileşimini büyük ölçüde stabilize eder. ATP ssdna bağlı bir helikaza bağlandığında ssdna üzerinde belirli polaritede hareket ederek sarmalı açar

5 Tüm polimerazlarda geniş bir yarık ve 3 bölgeden oluşan sağ el yapısı yer alır: Avuçiçi: katalitik bölge, proofreading Parmaklar: kalıbın pozisyonunun ayarlanması Başparmak: replikasyonun sürdürülmesi, oluşan DNA ya tutunmak Sliding DNA clamp DNA polimeraz ile ilişkili olarak yeni replike olmuş DNA yı kuşatarak processivity düzeyini arttırır. processivity : DNA polimerazlar tarafından eklenen Doç.Dr.Erdal nukleotidlerin BALCAN ortalama sayısını veren 17bir ölçüdür. Replike olan DNA, DNA polimerazın avuç içi bölgesi ile ilişkilidir. Aktif bölgede, kalıbın tek sarmal bölgesinin ilk bazı çift sarmal DNA için uygun pozisyon alır. 18 DNA POLİMERAZ PRİMER:KALIBI TUTAN BİR ELE BENZER DNA polimeraz deoksinukleosid trifosfatların katılımını katalizleyen tek bir aktif bölgeye sahiptir. Diziye gelen nukleotidlerin A:T ya da G:C baz çifti oluşturmasını denetler. 19 DNA replikasyonunun doğruluğu: 1.Komplementer baz çiftinin doğruluğu 2. proofreading (hata okumadüzeltme) mekanizmaları 3.Dizi aracılığı ile hata tamiri 1. Komplementer Baz Çiftinin Doğruluğu: Doğru nukleotid, polimeraza doğru olmayan nukleotidden daha fazla ilgi gösterir. Çünkü sadece doğru nukleotid kalıpla doğru baz çifti oluşturur. 20 5

6 2. Proofreading (hata okuma-düzeltme) mekanizmaları-ekzonukleolitik Düzeltme (exonucleolytic proofreading):dna polimerazın yeni nukleotid eklemesi için primer dizinin 3 OH ucuna gereksinim vardır. DNA polimeraz, 3 OH ucunda yanlış(uygunsuz-mismatched) primer barındıran DNA dizilerine nukleotid ekleyemez. DNA polimeraz, farklı katalitik bir bölgesi ile 3-5 yönünde ekzonukleaz aktivitesi oluşturarak (primerin uç kısmındaki uygunsuz dizileri keserek) düzenleme yapar. Bu düzenleme DNA sentezini başlatacak uygun 3 uca kadar sürer. DNA replikasyonunun doğruluğu: 1.Komplementer baz çiftinin doğruluğu 2. proofreading (hata okumadüzeltme) mekanizmaları 3.Dizi aracılığı ile hata tamiri 21 AVUÇ İÇİ_PROOFREADING Katalitik aktivitesine ek olarak avuç içi bölgesi, eklenen nukleotidlerin doğru baz çifti oluşturmasını kontrol eder (proofreading). Bu bölge yeni sentezlenen DNA nın küçük oluğundaki baz çiftleri ile yoğun hidrojen bağı köprüleri oluşturur. Bu kontaklar baza-spesifik değildir, ancak sadece doğru baz eşleşmesi sırasında oluşurlar. Bu bölgede yanlış eşleşmiş bir DNA, katalizi ciddi biçimde yavaşlatır. Yavaşlamış kataliz ve yeni sentezlenen DNA ya afinitenin azalması polimerazın aktif sitesinden primer:kalıp çiftinin uzaklaşmasına ve polimerazda proofreading nukleaz aktif bölgeye bağlanmasına neden 22 DNA sentezinde düzeltme uygun olmayan nukleotidlerin uzaklaştılması nukleazlar tarafından gerçekleştirilir. Bu tip nukleazlar. Bu ekzonukleazlar DNA yı 3 ucundan hidrolize (a)uygun olmayan nukleotid ederler. DNA ya polimeraz ile eklendiğinde, DNA sentezinin hızı azalır ve DNA polimerazın primerin 3 OH bölgesine ilgisi azalır. (b)yanlış eşleme (mismatch) gerçekleştiğinde primerin 3 ucu düzeltme için ekzonukleaz aktif bölgesine ilgisi artar. (c)yanlış eşleşen nukleotid uzaklaştırıldığında DNA polimeraz aktivitesi için uygun dizi oluşturulur ve DNA sentezi devam eder. Cell 92; 296, fig 1, 1998 Elsevier Yanlış eşleşme primer:kalıp çiftinin polimerazın aktif sitesinden uzaklaşmasına ve 23 polimerazda proofreading nukleaz aktif bölgeye bağlanmasına neden olur. Replikasyon çatalı oluşurken, kromozom rotasyonuna bağlı olarak süperkatlanmalar negatif ya da pozitif yönde olabilir. DNA replikasyonu sırasında bu tür süperkatlanmaların oluşması DNA topoizomerazlar adı verilen bir grup enzim tarafından önlenmektedir. süperkatlanmalar oluşturan, süperkatlanmaları çözen veya her ikisini de yapan bu enzimlerin 2 türü var vardır. Tip I DNA topoizomerazlar: DNA molekülünün bir zincirini geçici olarak koparan ve diğer zinciri oluşan boşluktan geçirdikten sonra kopuk uçları tekrar birleştiren bu enzimlerin hem nükleaz (zincir koparan) hem de ligaz (zincir bağlayan) aktiviteleri vardır. Tip II DNA topoizomerazlar: DNA çift heliksine sıkıca bağlanarak her iki zincirde geçici kırıklar oluştururlar. Sonra sarmalı ters yönde döndürerek döngü sayısının azalmasını sağlarlar. En sonunda kopuk uçları tekrar birleştirerek hem negatif hem de pozitif sarmalların birikimini önler. 24 6

7 Bir RNA öncüsü bir ucunda uygun bir 3 ucu içerdiği için DNA polimeraz bu uçtan Okazaki fragmanlarını oluşturmak üzere diziyi uzatır. Her bir Okazaki fragmanının sentezi, bu DNA polimerazın bir önceki fragmanın 5 ucuna bağlı RNA primerine diziyi eklemesine kadar devam eder. TRANSKRĐPSĐYON Primaz tarafından yeni RNA öncüsü sentezi Laggingdizi kalıp DNA polimeraz yeni Okazaki fragmanı oluşturmak için yeni RNA öncüsüne bağlanır. Eski RNA öncüsü silinir ve DNA ile doldurulur DNA polimeraz DNA fragmanını sonlandırır Aradaki boşluk DNA ligaz tarafından doldurulur 25 Genetik bilgiyi taşıyan DNA molekülünün hücresel faaliyetlerin gerçekleşmesi için gerekli 26 bilgiyi RNA ya aktarma işlevi. TRANSKRĐPSĐYON DĐZĐLER BĐRBĐRĐNDEN AYRILIR Kalıp dizi (noncodingantisense dizi) coding-sense dizi RNA DĐZĐSĐ YAPILIR Genetik bilgiyi taşıyan DNA molekülünün hücresel faaliyetlerin gerçekleşmesi için gerekli bilgiyi RNA ya aktarma işlevi. Kalıp DNA dizisi (noncoding ya da anti-sense dizi): mrna nın komplementeri olan DNA dizisi. Coding dizi (sense dizi): yeni sentezlenen RNA ya özdeş olan DNA dizisi. 27 TRANSKRĐPSĐYON TERMĐNOLOJĐ Sistron (cistron): bir polipeptid kodlayan bir yapısal gen ya da DNA (ya da RNA) segmenti. Günümüzde sistron ve yapısal gen ifadeleri proteine dönüşmeyen RNA ları (rrna, trna, snrna, v.b.) kodlayan DNA dizileri için de kullanılmaktadır. Monosistronik RNA: tek bir protein kodlayan mrna (ökaryotlarda). Polisistronik RNA: bakterilerde operon olarak bilinen ilişkili gen kümeleri genom üzerinde ardışık olarak yerleşmiştir. Bu kümeler birlikte transkribe olarak tek bir mrna oluştururlar. Bu nedenle bir bakteri mrna sı genellikle birbiri ile ilişkili çeşitli proteinleri (örneğin metabolik bir yolun ardışık adımlarını katalizleyen ilişkili enzimleri) kodlayabilir. 28 7

8 SĐSTRONĐK-POLĐSĐSTRONĐK mrna ÖKARYOT PROKARYOT DNA promotor yapısal gen DNA promotor yapısal genler OPERON Monosistronik mrna TRANSKRĐPSĐYON Polisistronik mrna 29 Bakteriyal mrna molekülünün yapısı. 5 cap yapısına gereksinim duyan ökaryotik ribozomların tersine prokaryotik ribozomlar prokaryotik mrna molekülünün farklı bölgelerinde bulunan özel ribozom bağlama bölgelerine (Shine-Dalgarno) dizilerine gereksinim duyarlar. Bakterilerdeki bu ribozom bağlama özelliği tek bir mrna molekülünden farklı tip protein oluşturmasına olanak sağlar. Figure 6-73 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 30 TERMĐNOLOJĐ Open Reading Frame-Açık Okuma Çerçevesi (ORF): DNA ya da RNA da bir protein kodlayabilen baz dizisi. Stop kodon içermez. Her ORF ucu bir stop kodonla sonlanır. Kalıp DNA dizisi (non-coding ya da anti-sense dizi): mrna nın komplementeri olan DNA dizisi. Coding dizi (sense dizi): yeni sentezlenen RNA ya özdeş olan DNA dizisi. Coding; sense dizi Kalıp;Non-coding; antisense dizi RNA transkripti TERMĐNOLOJĐ OPERON: Birbiri ile benzer işlev gören ürünleri sentezleyen genlerin oluşturduğu kümelerdir (örn. Aynı metabolik yol üzerindeki enzimler). Yapısal genleri ve kontrol elementlerini (operatör, promotor ) içerir. (ilişkili gen kümeleri) YAPISAL GENLER: Enzimlerin birincil yapısını şifrelemek ile görevli olan enzimlerdir. OPERATÖR: komşu genin transkripsiyonunu kontrol eden kısa DNA bölgesi. PROMOTOR: RNA polimerazın bağlanarak transkripsiyonu başlattığı DNA dizisi. Bir genin transkripsiyonunu kolaylaştıran DNA bölgesi. Promotorlar düzenleyecekleri genlerin yakınında yer 31 alırlar. 32 8

9 UPSTREAM ELEMENT: Promotor bölgenin ön kısmında yer alan bölge. 3 ve 5 UTR (Untranslated-Lider) BÖLGE: mrna nın kodlama yapan bölgelerinin her iki tarafında yer alan translasyona girmeyen bölgeler. Transkripsiyon Başlangıç 5 cap 5 UTR Kodlama Bölgesi 3 UTR Start Kodon TERMĐNOLOJĐ Stop Kodon Poly A sinyal Poly (A) kuyruk 33 Upstream bölge DNA Promotor Gen bölge: DNA dan RNA ya ilk transkribe olan baz -10 bölgesi: Bakteriyel promotorda transkripsiyon başlangıcından 10 baz geride bulunan ve RNA polimeraz tarafından tanınan bölge. -35 bölgesi: Bakteriyel promotorda transkripsiyon başlangıcından 35 baz geride bulunan ve RNA polimeraz tarafından tanınan bölge. +1 Transkript başlangıcı Başlangıç ve bitiş bölgeler Downstream bölge Transkript sonu 34 Kimyasal ve enzimatik olarak transkripsiyon, DNA replikasyonuna çok benzer Her iki yolda da DNA kalıbına uygun nukleik asit sentezi yapılır. Bazı farklılıklar bulunmaktadır: 1.Transkripsiyonda yeni dizi deoksiribonukleotidden değil ribonukleotidden oluşur. 2.Transkripsiyonda replikasyona göre çok küçük bir molekül üretilir Transkripsiyonda DNA nın sadece bir ipliği kullanılır. 36 9

10 REPLİKASYON -Tüm DNA kopyalanır TRANSKRİPSİYON -DNA nın belirli bir TRANSKRİPSİYON: 1.BAŞLANGIÇ 2.UZAMA 3.SONLANMA Transkripsi yonun başlaması -Her iki iplik kalıp olarak kısmı kopyalanır kullanılır. -Tek iplik kalıp olarak uzama -Öncüye gereksinim var kullanılır. -Oluşan yeni dizi deoksiribonukleotid -Öncüye gereksinim yok -Oluşan yeni dizi Bağlanma (kapalı kompleks) -Kopyanın işlenmesi söz ribonukleotid konusu değil -Kopyanın işlenmesi gerekir 37 Promotor kaynaşması (açık kompleks) 38 BAŞLANGIÇ: Bir başlatıcı (promoter) olarak DNA dizisi (bir çok başlatıcı faktör ile birlikte) RNA polimeraza bağlanır. Promoter-polimeraz kompleksi yapısal bir değişikliğe uğrar. Replikasyon başlangıcında olduğu gibi DNA transkripsiyon noktasında açılır ve (DNA replikasyonunda olduğu gibi) transkripsiyon 5-3 yönünde başlar. Replikasyondan farklı olarak, sadece bir DNA dizisi kalıp olarak kullanılır. UZAMA: RNA polimeraz yaklaşık 10 bazlık bir RNA sentezledikten sonra, uzama fazına geçer. Bu geçiş polimerazda yapısal bir değişiklik oluşturur ve kalıbı daha sıkı tutar. Uzama, nukleotidlerin fosfodiester bağı ile birbirlerine bağlanması şeklinde devam eder. Sentez 5-3 yönündedir. Uzama sırasında, bu enzim DNA yı önce açar sonra birleştirir. Hareket ettikçe büyüyen RNA yı kalıptan uzaklaştırır. Proofreading fonksiyonu vardır. E. coli de sentez hızı yaklaşık 50 nukelotid/sn dir

11 SONLANMA: Polimeraz geni transkribe ettikten sonra durur ve RNA ürününü salar. Bazı hücrelerde sonlanmayı tetikleyen mekanizmalar iyi belirlenmiştir. Bir çoğunda ise bilinmemektedir. Bakterilerde iki tür sonlanma bulunur: 1.Rho (ρ) faktöründen bağımsız (independent-intrinsic) 2.Rho (ρ) faktörünün gerekli olduğu (dependent) Rho-independent (intrinsic): Prokaryotlarda RNA nın uzaması, RNA polimerazın sonlandırma dizisinerastlamasına kadar devam eder. DNA da en yaygın sonlandırma dizileri AT-zengin dizileri takip eden bir GC-zengin dizinin olduğu bölgelerdir. Böyle dizileri içeren bir DNA bölgesinden sentezlenen RNA daki GC bazları kendi aralarında eşleşerek saç tokası formunu oluşturur. Bu yapı RNA polimeraz için fiziksel bir stres yaratır ve transkripsiyon durur. RNA daki saç tokası formunu 4 ya da daha fazla urasil bazı izler. RNA daki urasil bazları ile kalıp DNA daki Adeninlerin karşılıklı gelmesi ile oluşan zayıf etkileşim RNA nın DNA dan kopmasına 43 RNA daki GC bazları kendi aralarında eşleşerek saç tokası formunu oluşturur. Bu yapı RNA polimeraz için fiziksel bir stres yaratır ve transkripsiyon durur. RNA daki saç tokası formunu 4 ya da daha fazla urasil bazı izler. RNA daki urasil bazları ile kalıp DNA daki Adeninlerin karşılıklı gelmesi ile oluşan zayıf etkileşim RNA nın DNA dan kopmasına neden olur

12 2.Rho-dependent: Ancak bütün sonlandırma bölgeler saç tokası oluşturmayabilir. Bu durumda özel bir sonlandırma proteini olan rho (ρ) devreye girer. Bu protein, uzayan RNA zincirine bağlanarak transkripsiyonun durmasına neden olur. Bu protein aynı zamanda ATPaz aktivitesine sahiptir: bir transkripte bağlandığında RNA yı kalıptan ve RNA polimerazdan zorla kopartır

13 ÖKARYOTLARDA TRANSKRİPSİYON 49 Ökaryot ve prokaryot transkripsiyon mekanizmaları birbirine benzerdir. Ökaryotta çekirdekte gerçekleşen transkripsiyon daha komplikedir. Ökaryotlarda farklı RNA ların sentezi farklı RNA polimerazlar tarafından gerçekleşir. Bakterilerde sadece bir başlatıcı faktöre (σ) gereksinim varken ökaryotlarda transkripsiyonun promotor-spesifik olarak başlaması için farklı başlangıç faktörleri devreye girer. Bunlara genel transkripsiyon faktörleri (GTF) denir. Transkripsiyon faktörleri TFII (Transcription Factor for RNA polymerase II) genel ismine sahiptir (TFIIA, TFIIB, TFIID ). 50 Ökaryotlarda Transkripsiyonun Farkları Ökaryotlarda transkripsiyon çekirdekte, translasyon sitoplazmada birbirinden tamamen ayrılmış olarak gerçekleşir. Enhancer:proteinlere (trans-acting faktörler ve transkripsiyon faktörlerine) bağlanarak transkripsiyon düzeyini arttıran kısa DNA dizileri. Insulator: Enhancerlerin uygun olmayan genleri aktive etmesine engel olan DNA elementleridir. Enhancer ile promotor arasındaki iletişimi bloke eder. Transkripsiyon başlamasının regülasyonu için özgül DNA dizileri ve protein faktörlerin etkileşimi daha komplekstir. Promotorlara ek olarak genin 5 kontrol bölgesinin dışında genin içinde ve 3 aşağı bölgesinde de yer alabilen enhensır diziler bulunur. Sentezlenen ilk RNA kopyası, olgun ökaryotik mrna ya dönüşmek için bir dizi işlenme basamağından geçer. 51 Trans-acting faktörler gen ifadesini kontrol etmek için cis-acting dizilere (elementlere)- bağlanan proteinler. Cis-acting elementler bir genin yakınında bulunan ve gen ekspresyonu için gerekli DNA dizileri (promotor, enhancer ve silencerleri içerir). Silencer: Transkripsiyon faktörlerine Trans-regulatör elementler: transkripsiyon bağlanarak transkripsiyonu baskılayan Doç.Dr.Erdal faktörlerini BALCAN kodlayan DNA dizileri 52 DNA dizileri 13

14 GENEL KAVRAMLAR DNA nın bükülmesi, transkripsiyon faktörlerinin enhancerlere bağlanmasını ve transkripsiyonu başlatıcı kompleksinin etkileşim halinde olmasını sağlar. Enhancere bağlanarak bir genin transkripsiyonunu sağlayan transkripsiyon faktörüne Aktivatör denir. Aktivatörler, enhancere bağalanarak promotor ile RNA polimeraz arasındaki bağlantıyı ve transkripsiyon başlangıç kompleksinin oluşumunu kolaylaştıran proteinlerdir 53 Robert Tjian, "Molecular Machines that Control Genes,"Scientific American. 54 RNA POL II nin transkripsiyonu başlatmasında cis-element dizileri yardımcıdır. BAŞLAMA: En önemli cis-element: Goldberg-Hogness ya da TATA kutusudur. Bir çok RNA polimeraz promotoru, transkripsiyonun başlama noktasının yaklaşık 25 baz çifti solunda (upstream) konsensus dizisi TATAAA olan ve TATA kutusu olarak adlandırılan bir bölgeye sahiptir. Ökaryotik promotorlarda sık rastlanan diğer bir bölge, -80 ya da -70 baz çifti solda yer alan CAAT kutusudur Promotor bölgesinde yer alan diğer bir cis-element, GGGCGG konsensus dizisine sahip ve -110 bölgesinde yer alan GCkutusudur. CAAT ve GC kutuları transkripsiyon faktörlerini kendilerine bağlarlar ve transkripsiyonu güçlendirici etkileri vardır. Ökaryotlarda transkripsiyonun başlama bölgelerinde prokaryotlara benzer biçimde özel baz dizilimleri içeren bölgeler vardır: bölgesinde bulunan TATA kutusu (Goldberg-Hogness kutusu) bölgesinde bulunan CAAT kutusu Upstream elementler bölgesinde yer alan GC kutusu

15 Upstream elementler RNA Pol II nin bağlanma etkinliğini arttırırlar Transkripsiyonun başlamasındaki ilk olay TFIID protein kompleksindeki bir polipeptidin [TBP (TATA binding protein)] TATA kutusuna bağlanmasıdır. TBP DNA ya bağlandığı zaman TATA kutusunun biçimini bozar. Oluşan TBP-DNA kompleksi diğer genel transkripsiyon faktörlerinin ve polimerazın bu bölgeye gelmesine neden olur. In vitro da bu proteinler promotorda TFIIA, TFIIB ve RNA polimeraz II ile kompleks oluşturmuş TFIIFşeklinde bağlanır. Bu bağlanmanın ardından TFIIE, TFIIH ve TFIIJ bağlanır. Bu kompleks en az 40 polipeptid içerir ve TRANSKRİPSİYON BAŞLAMA KOMPLEKSİ olarak adlandırılır. TFIIH ATP hidroliz enerjisini kullanarak iki DNA zincirini transkripsiyonun başlama noktasından ayırır. Aynı zamanda RNA pol II yi fosforile eder ve bu fosforliasyonla bazı TF leri polimeraz üzerinde oturdukları yerden kalkarlar çünkü fosforilasyonla pol biçim değişikliği gerçekleştirir. Üzerindeki fazlalıklardan (TFleri) kurtulan 59 RNA pol senteze başlar. 1. TFIID nin yapısındaki TBP DNA ya küçük oluktan bağlanır. 2. Daha sonra sırasıyla, TFIIA, TFIIB ve RNAPII ile kompleks oluşturmuş TFIIF bağlanır. Bu noktada, RNAPII transkripsiyonu başlatabilir ancak, promotor bölgeden ayrılamaz

16 RNAPII nin promotordan ayrılması ve RNA yı uzatması için TFIIE, TFIIH ve TFIIJ ye gereksinim vardır. TFIIH, hareket etmeden önce RNAPII nın karboksi terminal kuyruğunu (CTD) fosforiller (Ser Transkripsiyon sırasında RNA pol II nin CTD inin fosforilasyonu ve Thr grupları fosforillenir). enzimin DNA boyunca ilerlemesine ve transkripsiyonun CTD, her birinin içinde 3 serin amino asidi içeren 7 amino asitlik (Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser) tekrarlar içerir (C. elegans ta 45, insanlarda ve Drosophila da 61 gerçekleşmesine olanak sağlar. CTD nin fosforilasyonu sadece enzimin transkripsiyon faktörlerinden kurtulmasına olanak sağlamaz, aynı zamanda transkripsiyonunun uzamasını ve uzayan RNA nın işlenmesine olanak sağlayacak bazı proteinlerin bağlanmasına olanak sağlar. Bu proteinlerden bazıları RNA 62 polimerazın kuyruğundan yeni sentezlenmiş RNA ya atlayarak 52). RNA işlenmesinde rol alır. TORPEDO MODEL TRANSKRİPSİYONUN SONLANDIRILMASI 5-3 ekzonukleaz aktivitesine sahip bir RNaz-torpil-(mayalarda Rat1, insanda hxm2) poli(a) bölgesine girerek oluşan RNA yı kırar ve RNA polimerazın DNA dan ayrılmasını sağlar. TORPEDO MODEL ALLOSTERİK MODEL RNA polimeraz elongasyon evresinde aktif formdadır. Poli (A) bölgesini geçtikten sonra yapısal bir değişiklik ya da kovalent bir modifikasyonla düşük aktiviteli bir forma dönüşür ve kademeli olarak ortadan kalkar

17 translasyon mrna dilini protein diline çevirmek için gerekli 4 önemli bileşen: mrna lar trna lar Aminoaçil-tRNA sentetaz Ribozom 4 bazlı alfabe ile yazılı kodu 20 amino asitlik alfabe ile yazılı koda çevirirler Prokaryotlardaki Ribozom Bağlanma Bölgesi Ökaryotlardaki Ribozom Bağlanma Bölgesi Translasyonun başlaması için ribozomun mrna yı yakalaması gerekir. Bir ribozomla bağlanmayı kolaylaştırmak için prokaryotlarda mrna moleküllerinin açık okuma çerçeveleri (open reading frame-orf) başlangıç kodonunun upstreamında(5 kısımda) özel bir dizi içerirler. Bu diziye Ribozom bağlanma bölgesi (ya da Shine- Dalgarno dizisi) adı verilir. Başlangıç kodonunun 5 kısmında bulunan bu bölge 16S ribozomal RNA nın 3 ucundaki bir diziye komplementerdir. Ribozom bağlanma bölgesi bu RNA bileşeni ile baz eşleşmesi oluşturur ve ribozomu (açık okuma çerçevesinin) başlangıcında yerleşmesine olanak sağlar. Ökaryotik mrna 5 cap yapısı ile ribozomu tanır. Ribozom 5 -AUG-3 başlangıç kodonunu buluncaya kadar mrna üzerinde 5-3 yönde diziyi tarar. Shine-Dalgarno dizisi: AGGAGG Ribozom bağlanma b

18 AMĐNO ASĐTLERĐN trna ya BAĞLANMASI Amino asit bağlamamış trna ya yüksüz denir. Her bir trna için spesifik bir enzim (aminoaçil trna sentetaz) amino asiti trna ya bağlar. trna ya amino asit yüklemesi iki adımda gerçekleşir: 1. Amino asit ATP ile etkileşerek aminoaçil-amp yi (aminoaçil- adenilat) oluşturur. 2. Aminoaçil grubu trna nın 3 -ucuna eklenir Amino asit + ATP aminoaçil-amp +Ppi Aminoaçil-AMP AMP + trna aminoaçil-trna +AMP Amino-açil trna sentetaz oldukça spesifiktir. trna yüklenmesi trna ya amino asit yüklemesi iki adımda gerçekleşir: 1. Amino asit ATP ile etkileşerek aminoaçil-amp yi (aminoaçiladenilat) oluşturur. 2. Aminoaçil grubu trna nın 3 - ucuna eklenir. Amino asit + ATP aminoaçil-amp +Ppi Aminoaçil-AMP + trna aminoaçiltrna +AMP PROTEİN SENTEZİNİN BASAMAKLARI RİBOZOM DÖNGÜSÜ Aktif protein sentezi yapılmazken iki ribozom alt ünitesi ayrı ayrı bulunur. Alt üniteler protein sentezi olacağı zaman mrna üzerinde (özellikle 5 uca yakın bölgede) bir araya gelirler. Bu nedenle protein sentezi 5 uçtan başlar. mrna ribozomlara çekilir, kodonlar ribozomun içine girer. mrna, trna yı kullanarak amino asit dizisine dönüşür. Stop kodona gelince iki alt ünite birbirinden ayrılır

19 trna bağlanma bölgeleri Büyük ribozomal alt ünite mrna bağlanma bölgesi küçük ribozomal alt ünite Figure 6-64 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) P: peptidil site (ilk trna nın bağlandığı bölge) A: amino açil site (2. trna nın bağlandığı bölge) E: çıkış bölgesi 73 Figure 6-66 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008) Protein sentezi başladığında amino asitlerin uzayan polipeptid zincirine eklenmesi 4 adımda gerçekleşir: 1.tRNA bağlanması 2.Peptid bağı oluşumu 3.Büyük alt ünitenin yer değiştirmesi 4.Küçük alt ünitenin yer değiştirmesi 74 Adım 1: sonraki amino asidi taşıyan trna, mrna ile baz eşleniği oluşturarak ribozomal A bölgesine bağlanır. Bu durumda P bölgesi ve A bölgesi iki komşu trna içerir. Adım 2: polipeptid zincirinin karboksil ucu P bölgesindeki trna dan salınır ve A bölgesindeki trna ya bağlı bulunan amino asidin serbest amino grubuna bağlanır (peptid bağı oluşumu). Bu reaksiyon peptidil transferaz Adım 2: polipeptid zincirinin karboksil ucu P bölgesindeki trna dan salınır ve A bölgesindeki trna ya bağlı bulunan amino asidin serbest amino grubuna bağlanır (peptid bağı oluşumu). Bu reaksiyon peptidil transferaz tarafından katalizlenir. Adım 3: büyük alt ünite küçük alt üniteya bağlı hareket eder. Böylece iki trna nın akseptör stemleri E- ve P- bölgesine geçer. tarafından katalizlenir. 75 Figure 6-66 (part 1 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 6-66 (part 2 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 76 19

20 Adım 3: büyük alt ünite küçük alt üniteya bağlı hareket eder. Böylece iki trna nın akseptör stemleri E- ve P- bölgesine geçer. Adım 4: Küçük alt ünite hareket eder böylece ribozom yeni aminoaçiltrna almaya hazır hale gelir. Adım 4: Küçük alt ünite hareket eder böylece ribozom yeni aminoaçiltrna almaya hazır hale gelir. Adım 1 yeni aminoaçiltrna gelmesiyle tekrar edilir. Figure 6-66 (part 3 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 77 Figure 6-66 (part 4 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 78 GEN Promotor Ekzon İntron Ekzon İntron Ekzon İntron Ekzon İntron TRANSKRİPSİYON Kuyruk Sinyali RNA işlenmesi Ekzon İntron Ekzon İntron Ekzon İntron Ekzon İntron İŞLENME CAP YAPISININ TAKILMASI, KUYRUK EKLENMESİ, İNTRONLARIN UZAKLAŞTIRILMASI şapka PoliA kuyruk Ekzon Ekzon Ekzon Ekzon AAAAAAAAAA TRANSLASYON

21 1 2 3 kaynaklar 1. 5 uca capping (şapka yapısının takılması) 2. 3 uca Poli A kuyruğunun takılması 3. Splicing Mekanizması 1. Molecular Biology of the Cell Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 5th ed Lehninger Principles of Biochemistry. Nelson DL, Cox MM, 4th ed. W. H. Freeman ed Molecular Biology of the Gene. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R 5th ed