ENSTRÜMENTAL ANALİZ-2 Kromatografi : Bir karışımdaki bileşenlerin birbirinden ayrılmasını ve tanımlanmasını gerçekleştiren yöntemlerin genel adıdır. Kromatografi yöntemi, ayrılacak bileşenlerin iki faz arasında dağılması esasına dayanır Bunlar: 1) hareketli faz 2) Sabit faz 1) Sabit faz-durgun faz (Stationary phase): Bir kolon içinde veya düz bir yüzeye tutturulmuş faz. Geniş bir yüzey alana yayılmış sabit bir yatak oluşturur. Sabit faz sıvı veya katı olabilmektedir, 2) Hareketli faz (Mobile phase): Durgun fazın üzerinden veya arasından geçen faz. Örneklerin ayrılmasını sağlayan fazdır. Hareketli faz sıvı veya gaz olabilir. 1 2 Ince Tabaka Kromatografisi (İTK) Thin layer Chromatography (TLC) Adsorpsiyon: bir karışımda bulunan sıvı veya gaz halindeki maddelerin katı faz üzerine tutunmasıdır. Partisyon: Bileşenlerin iki sıvı arasında dağılması İnce tabaka kromatografisi, bir "katı sıvı adsorpsiyon kromatografisidir." sabit faz : bir plaka üzerine ince bir tabaka halinde sıvanmıs katı adsorbant maddedir. Hareketli faz: sıvı Bu yöntemde hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyisi, asağıdan yukarı doğru olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine daldırılan ince tabaka plakası üzerinde yürür. 3 4 İTK de ayırmada genel kural: örneği oluşturan bileşenlerin polarlık derecelerine uygun polarlıkta çözücü seçmektir. Çoğu kez apolar bileşikler için kuvvetli aktif adsorbantlar; Polar bileşikler için ise zayıf aktif adsorbantlar seçilir. Adsorban madde olarak kolon kromatografisinde kullanılan tüm katılar (alumina,silika jel, sellüloz vb.) kullanılabilir. İTK de dolgu maddeleri cam veya plastik plaka üzerine 1 mm den daha az kalınlıkta yayılarak kaplanır. Plakalar genellikle 20x20 cm boyutundadır. Yürüme hızı: ayrılacak bileşenin, katı fazın ve çözücünün polaritesine bağlıdır. 5 6 1
İTK sinin KK sine üstünlükleri 2) ITK de developman süresi daha kısadır. 1) İTK de silikajel, celite, alüminyum oksit, gibi inorganik ve selüloz, poliamid gibi organik adsorbantlarla ince tabakalar oluşturularak ayırma gerçekleştirilebileceği halde, KK de selüloza bağlı kalınır. İTK de ayrılacak maddeye göre uygun adsorbant seçme kolaylığı vardır. 3) benekler İTK de daha belirgindir 4) İTK de daha az örnek miktarı ile çalışılabilir. 5) beneklerin gözlenebilmesi için H 2 S0 4 gibi gözleme ajanlarının kullanılması mümkündür 6) İTK de kullanılan adsorbantta KK kağıdındaki gibi liflerin olmayışından dolayı difüzyonla benek büyümesi çok fazla değildir. 7) İTK daha duyarlıdır. 7 8 İTK de kullanılan kaplama maddeleri 1) silikajel (silika, silisilik asit) Özel bir ayırım için en iyi adsorbant seçimi ayırılacak bileşiklerin özelliklerine bağlıdır. Bunun için: Bileşenlerin hidrofobik veya hidrofilik olduğunun bilinmesi gerekir Asidik, bazik veya nötr mü olduğunun bilinmesi gerekir Silikajel, silikat (Na2SiO3) çözeltilerinin asitlendirilmesiyle oluşan jelin yıkanıp kurutulması sonucu elde edilir. Silikajel çok büyük aktif yüzeye sahiptir (yaklaşık 500 m 2 /g) Yüzey yaklaşık 5 A aralıklarda bulunan Si-OH gruplarından oluşmuştur. Bu gruplar aktif bölgelerdir. Yüzeyi oldukça polardır ve ayırılacak bileşenlerle H bağları oluşturur Adsorbantla örnek ve developman çözeltisi arasında bir reaksiyon olup olmadığının bilinmesi gerekir 9 10 Aktif bölgeler hidrojen bağları yardımı ile polar bileşiklerle ve ayrıca elektron verici bileşiklerle etkileşirler. 2) Alümina (Alüminyum oksit-al 2 O 3 ) Silikajeller 150-200 C sıcaklıklarda ısıtılarak aktifleştirilirler. Yani yüzeyde adsorblanmış su uzaklaştırılarak aktif maddeler maskelenmiş olmaktan kurtulur. Asidik, bazik ve nötr tipleri vardır Nötral bir çözücüde kuvvetli asidi bağlama noktasında tutar. Asidik ve nötr maddelerin ayırımında kullanılır. Alkaloidler gibi bazik maddelerin analizinde de kullanılabilir. Kr saflıktaki alümina 150 m 2 /g aktif yüzeye sahiptir. Aktifleştirmek için alüminayı 400 C de bir gece tutmak gerekir. Böylece yüksek aktiflikte alümina elde edilmiş olur. Alümina partiküllerinin birbirlerine yapışmasını sağlamak için Gibs(CaSO4 1/2H2O) veya % 5 oranında nişasta katılabilir. 11 12 2
3) Selüloz Selüloz genellikle pamuktan elde edilen doğal bir üründür. Çok sayıda OH grubu içerir. İTK de mikrogranül yapıda olanı kullanılır 4) Kieselguhr (diatome toprağı) Kuvvetli hidrofilik maddelerin ayırımı için kullanılır. Selüloz tabakasının kapasitesi, madde moleküllerinin derinlere nüfuz etmesini sağladığından diğer adsorbantlara göre daha yüksektir. Bu daha yavaş ayırma demektir. 13 14 1) Plakaların adsorbantla kaplanması Çeşitli yollar vardır: En yaygın olanı adsorbant bulamacını özel ekipmanlarıyla plakaların üzerine yaymaktır. Plakalar bulamaca daldırılarak da kaplanabilir. İnce süspansiyon halinde adsorbant bulamacı plakaya püskürtülerek de kaplama yapılabilir. Adsorbant bulamacı plaka üzerine dökülerek ve üzerine baskı uygulayarak kalınlığın ayarlandığı elle işlem de söz konusudur. Bunlar içinde en çok tavsiye edileni plakaların özel ekipmanlar ile kaplanmasıdır. 15 16 Plakaların adsorbantla kaplanması Kaplanmış plakalar bozulmamaları için 10 dak olduğu yerde bırakılır. Bu süre içinde parlak ve nemli yüzey kurur ve matlaşır. Daha sonra plakalar etüvde 100 0 C nin üzerinde tutulup suyu uçurularak aktifleştirilir. Aktifleştirilmiş plakalar desikatörde soğutulur ve orada muhafaza edilir. 2) Örnek ve Standartın Plakaya Damlatılması Plaka kenarlarından 3 cm kadar uzaklıkta bir hat belirlenerek örnek ve standartlar bu hattın üstüne damlatılır. Damlalar arasında 3 er cm boşluk bırakılmalıdır. Damlatma çapının mümkün olduğu kadar küçük olmasına (0,5 cm kadar) ve damlatıcının plakadaki adsorbantı çizip, parçalamamasına dikkat edilmelidir. Her damlatmadan sonra çözücü mutlaka kurutulmalıdır. 17 18 3
3) Plakaların Geliştirilmesi (developmanı) Kromatografi tankının dibine çözücü veya çözücü karışımı konulur. Tankın içerisine plaka asılır ve tankın içindeki çözücü ile temas ettirilir. Tankın kapağı kapatılır. Çözücü buharlarının tankın içini tamamen kaplaması için bir süre beklemek gerekmektedir. Çözücü plakanın üstünden 3 cm kalana kadar yürütülür ve işleme son verilir. Ayrılan beneklerin difüzyonla dağılmasını önlemek için plakadan çözücünün hızlı bir şekilde uzaklaştırılması gerekir. 19 4) Beneklerin Gözlenmesi Renkli benekler gözle kolayca görülebilirler. Renksiz beneklerin gözlenmesi için özel veya duyarlı renk reaksiyonlarına veya konjüge grup içeren bileşikler için UV lamba ile ultraviyole ışığına sıklıkla başvurulur. Beneklerin merkezlerinden başlangıç hattına olan uzaklıklar ve çözücünün aldığı yol ölçülür. Rf değerleri hesaplanır. Örneğin ve standartların Rf değerlerinin karşılaştırılmasıyla benekler teşhis edilebilir. 20 ITK nin Gıda Analizlerinde uygulanması Aflatoksinlerin analizinde Yağ asitlerinin ayrılmasında A, B1, B2, B6, B12, C,D,E,K vitaminlerinin ayrılmasında Karbonhidratların ayrılmasında Gıda damıtık ürünlerindeki etil alkolün diğer alkollerden ve ketonlardan ayrılmasında Sentetik boyaların analizlerinde Sakkarin, siklamat, dulsin, gibi sentetik tatlandırıcıların ayrılmasında KOLON KROMATOGRAFİSİ Kolon dolgu maddesi ile doldurulmuş, alttan musluklu basit cam bir boruda gerçekleştirilebilir. Bunun yanında metal ve dayanıklı plastik de kullanılabilir. Genellikle 1-4 cm çapında, 20-100 cm uzunluğunda kolonlar kullanılır. Kolonun alt kısmı, dolgu maddesini (katı adsorbantı) tutmak için gözenekli ya da ince delikli camdan yapılmıştır. Gıda tağşislerinin ortaya konmasında gibi 21 Ayırma mekanizmalarına göre 5 farklı kolon kromatografisi uygulanabilir: Partisyon Adsorbsiyon İyon değişim kromatografisi Jel filtrasyon kr. Affinite kromatografisi 4
Kolonun doldurulması: Kolonun altındaki musluk kapatılarak kolonun ¾ üne kadar çözücü doldurulur. Dolgu maddesi üst taraftan yavaşça dökülür. İyice yerleşmesi beklenir. Sonra kolonun altındaki musluk açılarak çözücünün fazlası akıtılır. Kolon birkaç defa çözücü ile yıkanır. Böylece hem kolon temizlenmiş olur, hem de dolgu maddesi kolona yerleşmiş olur. Ayrıca, ortamda hiç hava kalmamış olur. Daha sonra, dolgu maddesinin üst yüzeyine uygun büyüklükte bir süzgeç kağıdı diski konularak sonraki uygulamalarda destek madde yüzeyinin bozunmaması sağlanır. Kolondaki dolgu maddesi hiçbir zaman kurumamalıdır. Bu durumda tüm özelliğini kaybeder. Kolon dolgu maddeleri Kromatografide kullanılan dolgu maddelerinin genel özellikleri şöyle olmalıdır: 1) Partikülleri aynı boyutta (uniform) olmalıdır 2) Tanecikler kullanılan çözücü içinde çözünmemelidir 3) Ayırımı yapılan bileşiklere karşı inert olmalıdır 4) Çözücünün uygun hızda hareketine engel olmamalıdır Kolonun verimliliğini etkileyen faktörler Dolgu maddesinin partikül boyutu: partikül boyutu küçüldükçe ayırma gücü artar. Ancak, çok küçük partikül boyutlarında yüksek basınç uygulamak gerekir. Kolon boyutu: uzunluğun kolon çapına oranı arttıkça verimlilikte artar. Dolgu maddesinin homojenliği: dolgu maddesi boyutları tekdüze değilse elüsyon çözeltileri düzensiz olarak ilerler ve bantlar gelişigüzel olur. Kolon sıcaklığı: Kolon sıcaklığı arttıkça elüsyon hızı da artar ancak ayırma gücü azalır. Elüsyon çözeltisi: ayırma gücünün etkili olabilmesi için viskozitenin ve uçuculuğunun düşük olması gerek. Solvent akış hızı: sabit ve düşük akış hızında daha iyi ayırma gerçekleşir. Akışın sürekliliği: kesikli akışlar bileşiklerin ayrılmasını engeller Adsorbantın durumu: adsorbant zamanla deaktive olur, bu da ayırımı engeller İyi bir ayırma için, çözücü seçerken adsorbanın türü, örnek miktarı kolon uzunluğu gibi faktörler gözönünde bulundurulur. Örneği oluşturan bileşenler kullanılan çözücüde çözünür olmalıdır. Çözücünün konsantrasyonu: Yüksek konsantrasyonlu çözeltiler daha yavaş ilerler. 5
Adsorbsiyon kolon kromatografisinin yapılışı: Analiz edilecek karışım, hazırlanmış kolunun üzerinden verilir. Bütün örnek hemen adsorbana geçer ve bir bölge meydana gelir. Örnekten hemen sonra eluent (çözücü, hareketli faz) kolondan geçirilir. Çözücünün akış hızı önemlidir. Akış hızı kolonun altındaki musluktan dakikada 3-5 ml olacak şekilde ayarlanmalıdır. Örneğin son kısmı adsorbana değer değmez eluent hemen kolona verilmelidir. Aksi halde, kolona hava girer ve kolonda kanallara neden olur. Bu istenmeyen bir durumdur. Ayırma kapasitesini düşürür. Elüent örnek bandından süzülerek aşağıya doğru inerken, örnek adsorban yüzeyinden çözülerek hareketli çözücüye geçer. Önce örneğin yüksek çözünürlüğe sahip bileşenleri çözünür. Sıvı aşağıya doğru aktığından çözünmüş bileşen kolondan aşağıya doğru biraz iner, orada katı yüzeyle karşılaşınca, bileşen katı tarafından tekrar adsorblanır. Hareketli eluent onu yine çözüp biraz daha aşağıya doğru sürükler. Hareketli sıvıdaki bileşenin tekrar taze çözücüde çözünmesi örnek kolonda ilerlerken devam eder. Daha çok çözünen bir bileşen aşağıya doğru akan sıvıda daha uzun süre çözünmüş olarak kalır ve sıvı sürekli aşağıya doğru aktığından söz konusu bileşen de kolondan aşağıya doğru çok hızlı akarak iner. Elüentte hiç çözünmeyen maddeler kolonun en üstünde bir bant şeklide kalır. Örneğin bileşenlerinin herbiri kolonun farklı yerlerinde bulunacak şekilde saf madde bölgelerine veya bantlarına ayrılması işlemine Kromatogramı geliştirilmesi denir. En az tutulan bileşik kolonun alt kısmından gelmeye başlar. Bu bant alındıktan sonra farklı yöntemlerle kalitatif veya kantitatif analizlere tabi tutulur. Renksiz maddelerle çalışıldığında bileşenlerin bantlara ayrılmaları ve bu bantların kolondan aşağıya inmeleri gözle görülmez. Bu nedenle, her bileşeni tespit etmek için kolondan akan çözücü küçük ve ayrı kısımlar halinde toplanır. Bu işlem için fraksiyon toplayıcılar geliştirilmiştir. Kolon kromatografisinin gıda analizlerinde uygulamaları Kolon kromatografisi, gıdalarda başka yöntemlerle analizden önce hazırlama aşamasında, numunenin temizlenmesi aşamasında çok sık kullanılır. Örneğin, pestisit kalıntılarının analizinde analiz örneğinde girişim yapan maddelerin tutulmasında florisil kolon kullanılarak işlem yapılır. Yaprak pigmentleri, kolon kr. İle ayrılabilirler. Dolgu maddesi olarak aktive edilmiş alümina, çözücü olarak petrol eteri kullanılır. 6
Yer fıstığındaki aflatoksinler de hızlı bir şekilde küçük bir kolonda teşhis edilebilmektedir. Dolgu maddesi olarak silikajel, çözücü olarak da kloroform-metanol karışımı kullanılır. AgNO3 ile muamele edilmiş dolgu maddeleri kullanılarak yağların sabunlaşmayan kısımları ayrılabilir. Yağların oksidasyon derecelerinin belirlenmesinde de kolon kr kullanılmaktadır. Alümina kolon kullanılır. Çözücü olarak benzen, etanol, dietil eter kullanılabilir. Buna benzer bir yolla emülgatörler ve monogliseritler de ayrılabilir. Selüloz esaslı iyon değiştircilerle veya affinite kr ile proteinlerin saflaştırılması yapılabilir. 7