KimyaKongreleri.org YÜKSEK AYIRICCLI KÜTLE SPEKTROMETRİSİ İLE BAZI

Transkript

1 YÜKSEK AYIRICCLI KÜTLE SPEKTROMETRİSİ İLE BAZI ANABOLİK STEROİDLERİN TAYİNİ Aytekin Temizer Hacettepe Üniversitesi ANKARA Kütle spektrometresi ile ilk çalışmalar 1913 yılında J.J.Thomson un kütle spektrometresinin yüklü parçacıklann elektriksel ve magnetik alanda hareketleri ile kararlı izotopların varlığını göstermesi ile başlamıştır de Aston, 1926 da Smythe ve Mattauch, kütle spektrometresi terimini,,., l o p l a îuo^v -fctfemas( C T ( d ') kulanmışlardır. i t J Kütle spektrumu gaz fazındaki iyonların belirli kütle/yük (m/z) oranlarına göre kaydedilmesi ile elde edilir. İyonlar pozif ve negatif olarak seçilen yönteme göre kaydedilebilir. Genellikle pozitif iyonların incelenmesi daha yaygındır. Kütle spektrometrisi tek başına kimyasal yapı aydınlatıcı bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bununla beraber, gaz kromatografisi ile uygun şekilde bağlanarak dedektör olarak da kullanılabilmektedir. Kütle spektrometresinin gaz kromatografisinin dedektörü olarak kullanılmasının nedeni toplanabilecek bilgilerin çokluğudur. Bütün organik bileşik sınıflarına ve tüm organik bileşiklerde ortak bir fiziksel özellik olan kütleye cevap verebilmesi en büyük özelliğidir. Kütle spektrometresinin ana analizörü ve 3. Dedektör olarak sıralanabilir. nedenleri: kısınılan 1 İyon kaynağı, 2.Kütle Kütle spektrometresi'de vakum sistemi bulunmaktadır ve bunun 330

2 Flaman yüksek basınçtaki oksijen altında ısıtılırsa yükseltgenip yanabilir, Basmç arttıkça kütledeki çoğaltıcı, kaynak ve analizörde yüksek voltaj kırılmaları olabilir, Kütle spektrometresinin iyon kaynağında varolan gaz, spektral geri zemine katılabilir (örn; su, azot ve oksijenden gelebilecek m/z 18, 28 ve 32), * Kütle spektrometresinde düşük basınç sağlamanın en önemli nedeni, analiz edilen iyonlar arasındaki çarpışmayı en aza indirmektir. İyon sürekli diğer moleküller ve yüzeyler ile çarpışıyorsa, iyonları belli bir yolda yönlendirmek için kullanılan güçler yararsız olacaktır. Kütle spektrometresi içindeki basıncı 10"^ torr civarında tutmak için değişik pompalar kullanılır. En çok kullanılan pompalar, türbo moleküler ve difîizyon pompalandır. Bir molekül, atom veya iyondan bir elektron uzaklaşması olayına iyonizasyon denir. Vakum altında molekül iyonize olduğu zaman farklı kütlelerde karakteristik iyon gruplan oluşur. İyon kaynaklan olarak en çok elektron iyonizasyon, kimyasal iyonizasyon, foton iyonizasyon, iyon bombardımanı ile iyonizasyon, spark kaynaklı iyonizasyon, nötral parçacıklarla bombardıman, elektrospray iyonizasyon, termal iyonizasyon, alan iyonizasyon ve termospray iyonizasyon tipleri kullanılmaktadır. Bunlar içerisinden de en yaygın olarak kullanılan iki tip bulunmaktadır: a) Elektron iyonizasyon (El): El kısaca analat molekülünün eneıjili elektronlarla bombardıman edildiği iyonizasyon yöntemi olarak tanımlanır. Sıcak bir flamandan çıkan elektronlar bölme boyunca odaklanacaklar ve 70 evluk bir potansiyele sahip bir elektrod tarafından çekileceklerdir. Böylece herbir elektron 70 ev'luk bir eneği kazanır ve ortama giren numune ile çarpışarak bir seri parçalanma tepkimeleri oluşur. Moleküldeki bağların 331

3 kırılmasından tüm pozitif ve negatif iyonların oluşmasını sağlayabilecektir. Çoğu organik molekül için pozitif iyon oluşumu eneıji açısından daha çok tercih edilir. Elektronun sahip olduğu enerji bütün bağlan kırmak için yeterli eneıjidir. 70 ev lıık eneğinin kullanılması kararlı, tekrarlanabilir ve moleküle özgü kütle spektrumlanmn oluşmasını sağlar. Elektron bombardımanı ile oluşan iyonlann bağıl büyüklükleri, iyonize edici elektronlann eneıjileri ve iyonizasyonun oluştuğu sıcaklığa bağlıdır. b) Kimyasal iyonizasyon (CI): Genellikle düz zincirli alkan, alken veya alkoller gibi homolog bileşikler El ile kararlı moleküler iyonlara sahip pozitif tanımlama yapılamayacak kadar küçük bağıl çokluğa sahiptirler. Cl'nm esası iyon-molekül tepkimelerine dayanır. Yüksek eneıjili iyonlar çarpıştıklan moleküle ya proton aktanrlar ya da ondan hidrür ve elektron kopanrlar. Kimyasal iyonlaşmalı kütle spektrometresinde, iyon kaynağına reaktif gaz verilerek yüksek basınç elde edilmektedir. Reaktif gaz numune molekülleri ile iç etkileşime girecek reaktan iyonlannı oluşturmak üzere elektron demeti tarafından iyonize edilmektedir. Ortamdaki yüksek basıncın etkisiyle reaktan iyon ile numune iç etkileşime girer. El'ya göre eneıji daha düşüktür. Değişik reaktif gazlar kullanılarak hem pozitif hem de negatif iyonlaşma sağlanmaktadır. İyon kaynağından çıkan analat iyonlannı ayırmak ve herbirinin kütlesini ölçmek için kütle analizörleri kullanılır. İstenilen herbir moleküler parçanın kütlesi olsa da ölçülen kütle/yük (m/z) oranıdır. Bugün en çok kullanılan kütle analizörleri aşağıda kısaca açıklanmıştır: a) Kuadropol kütle analizörü: İyon ayınmı, iyon demetinin potansiyel uygulanan dört paralel çubuğun merkezinden geçirilmesiyle sağlanır. Kuadropol kütle analizöründe kütlelerin ayınmı, çubuklara hem doğru akım (dc), hem de radyo frekansı (rf) alternatif akım (ac) uygulamak suretiyle gerçekleştirilir dc/rf oranı değiştirilerek farklı m/z oranına sahip iyonlann 332

4 tayini sağlanır. Kuadropol kütle spektrometresi, yüksek duyarlılığa ve milisaniye aralıklar ile hızlı tarama özelliğine sahiptirler. b) Magnetik sektörlü kütle analizörü: Elektronlar hızlandırıcı kullanılarak plakalardan ayrılıp, kütle ayırıcıya gelirler. Hızlandırma potansiyeli çok fazla olduğu için elektronlar aşağı yukarı eşit kinetik enerjiye sahip olurlar. İyonlar magnetik alana girince doğrusal yönden saparak, iyonların m/z oranlarına bağlı olarak dairesel hareket ederler. c) Uçuş zamanlı kütle analizörü: İyonlar uçuş tüpü adı verilen tüpün içinden geçerler ve bu sırada hızlandırıcının etkisiyle eşit momentuma sahip olurlar. B öylece kütleleri birbirinden farklı olan iyonların hızlan da farklı olarak belirlenir. Kütle analizörlerinden geçen iyonlar elektron çoğaltıcı dedektöre ulaşır. Elektron çoğaltıcıda çarpışmadan dolayı oluşan akım önce analog voltaja, sonra da dijital sinyale dönüşür. En çok kullanılan dedektörler dizi diyot elektron çoğaltıcı ve devamlı diyot elektron çoğaltıcılardır. Bunlar sinyali 10^ değerine kadar artırabilirler. Bu da femtoamper gibi çok düşük iyon akımlarının kaydedilmesini sağlar. Kütle spektrometresinden gelen milisaniye düzeyindeki verilerin hızla kaydedilmesi ve depolanması gereklidir ki bu da bir bilgisayarla kolayca sağlanır. Gaz kromatografisi-kütle spektrometresi sistemi, ara bağlantı ve veri toplama basamaklarındaki problemlerin çözülmesinden sonra, daha yaygın kullanılmaya başlanmıştır. Bunlardan başka aletin kalibrasyonun otomatik yapılıp, sonuçlarının alınabilmesi, analiz koşullarının kolayca girilmesi, aletin kontrolünün yapılıp verilerin alınabilmesi, analiz sonrası veri değerlendirmelerinin yapılabilmesini bilgisayar sağlamaktadır. Analize başlamadan önce ve periyodik aralıklarla kütle spektrometresindeki İyonlaştırıcı, kütle analizörü ve dedektör kısımlarının, uçuculuğu yüksek ve kararlı organik bileşikler kullanılarak ayarlanması 333

5 gerekmektedir. Sistemde bu işlem "AUTOTUNE" denilen donanım kullanılarak yapılır. Ayarlama için iyon kaynağının basıncı uygun olmalıdır. Standart olarak kullanılan bileşik çalışılan kütle aralığını kapsamalı ve pik şiddeti yüksek olmalıdır. Kuadropol sistemlerinde standart olarak en çok tercih edilen perflorotributilamin kullanılmakta olup bu maddeye özgü olan 69, 219 ve 502 m/z pikleri temel alınmaktadır. Ayrıca mlz= 18 ve 28 (su ve hava) pikleri, m/z= 69 pikinin %10'undan az olmalıdır. Fazla olduğunda sistemde kaçak olabileceği olasılığı vardır. m/z= 502 pikinin bağıl çokluğu azaldığında ise, iyon kaynağının kirlendiği söylenebilir. Kütle spektrometresi ile analizlerde 3 tip iyon tarama şekli vardır: 1. Toplam iyon taraması (TIC): Bir analiz sırasında ayrım yapmadan tüm iyonların amu aralığında taratılması ile gerçekleştirilir. 2. Seçici iyon taraması (SİM) ve çoklu iyon kaydedilmesi (MID) : Öncelikle bir kütle taraması yapılıp aranılan bileşik için en karakteristik olan, kararlı ve çokluğu fazla olan m/z değerleri seçilir. Seçilen iyonlar ile yapılan kütle spektrometrik çalışmalarda seçilen iyonların tarama süresi (dwell time) analizci tarafından seçilir. 3.Tek iyon taraması: Seçilen tek bir iyonla kütle spektrometrik çalışmalar yapılabilir. Çok hassas olan bu çalışma ile kesin bir tanımlama yapılamaz. Kütle spektrometrelerinde en çok kullanılan kütle analizör tiplerini magnetik sektörlü, uçuş zamanlı, siklotron rezonans (omegatron ve fourier transform siklotron rezonans), kuadropol, çift odaklı kütle spektrometresi olup kütle analizörlerinde en fazla magnetik sektörlü ve kuadrapol kütle spektrometreleri kullanılmaktadır. Kuadrapol kütle analizörü, eksenlere simetrik olarak yerletmit 4 adet krom-molibden çelik çubuktan oluşmaktadır. Bu çubuklara hem radyo 334

6 frekansı (rf) hem de doğru akım (dc) gerilimi uygulanır. Rf ve dc gerilimleri milisaniye düzeyinde değiştirilerek seçici iyon taraması yapılmaktadır. Radyo frekansı seçiciliği, doğru akım da ayıncılığı gösterir. Yüksek kütleden, düşük kütleye doğru tarama yapılır. Magnetik sektörlü cihazlarda iyonlaşarak belirli kütle/yük oranlarına sahip olan parçacıklar bir magnetik alan içerisinde buna göre hareket ederek dedektöre ulaşırlar. Bu şekilde m/z değerlerine göre ayrılmış olur. Tandem kütle spektrometresi (MS-MS) kütlenin kendisi kadar eski bir cihaz olup basit bir modelle açıklanacak olursa; kütle spektrometresi 1 - Çarpışma hücresini - kütle spektrometresi 2 şeklinde bir düzenleme içerisindedir. İlk önce yavru parçalanmalar verebilecek iyon seçilir. Bu ilk analizör olan kütle spektrometresi 1 de olur. Bundan oluşan iyonlar çarpışma hücresinden ikinci analizör olan kütle spektrometresi 2 ye geçerek tayin edilirler. Bu sisteme ürün iyon taraması adı verilir. İyon tuzaklı (lon trap) cihazlar ise, seçilen iyon elektriksel alandan etkin veya yeterli bir zaman ikincil deneylere olanak sağlamak için tutulur. Yüksek ayıncılı kütle spektrometresinde (HRMS), kuadropol sistemlerinden farklı olarak magnetik sektör (B) ve elektrostatik analizör (E) çift odaklamalı sistemler bulunmaktadır. Bu iki sistem BE, EB ve EBE geometrileri şeklinde düzenlenebilmektedir. Burada EB geometrisi düz ve BE geometrisi ise ters geometri olarak isimlendirilir. Ayıncılık R=m/Am olarak gösterilir ve aşağıda verilen iki molekülü ayırabilmek için gerekli olan minumum ayıncılık: R=58.05/( )=2439 olarak hesaplanabilir. 335

7 Molekül Nominal Kütle Tam kütle C3IV CsHgN" Kimyasal zemin gürültüsünün düşük, duyarlığın yüksek olması istendiğinden analizlerde sadece gerektiği kadar ayıncılık kullanılır. HRMS analizlerinde genellikle arasında ayıncılık kullanılır. Yapı aydınlatma analizlerinde ayıncılık 20 OOO in üzerinde tutulur. Maksimum ayıncılık e kadar çıkabilir. Kuadropol MS için ayıncılık; m/z 69±0.5 amu ve m/z 502±0.5 amu olarak gösterilebilir. Örnek olarak m/z nominal kütlle değeri 86 olan iyonlar ; H2CNHC(CH3)3+, C3H8NCO+, CeHı/, C5H10O+, C2li}NNCS+ olup kuadropol kütle spektrometresi ile bu moleküllerin ayınmda problemler bulunmaktadır. Çift odaklamalı MS de ise R: 1000 ayıncılık; m/z 69± amu ve m/z 502±0.250 amu olup R: 5000 için ayıncılık; m/z amu ve m/z amu olarak verilebilir. HRMS de tam kütle kullanılır. Artık gözlenen iyon piki 86 nominal kütle değerini içeren olası yapılardan değil, m/z tam kütle değerine sahip H2CNHC(CH3)3+ iyonu olduğu bildirilerek gözlenen yapı hakkında kesin bir karar verilebilir. Magnetik analizör, iyonlan farklı yük/kütle oranlanna ve onların farklı momentumlanna göre ayınr. BE geometrisindeki bir çift odaklı MS de farklı momentumdaki iyonlann magnetik alanda ayrılması; m/z= 4.82xl0'5 BV/V eşitliği ile verilmektedir. Burada. B: magnetik alan şiddeti (Gauss), nyançap (35 cm) ve V voltaj (5 kv) (hızlandıncı). 336

8 Elektrik sektör ise eneıji analizörüdür. Belirli kinetik eneıjideki iyonlann geçmesine ve detektöre ulaşmasına izin verir. Böylece kütle ve eneıji ayınmı ile yüklü parçacıkların ayırımı sağlanır. Magnetik ve elektrik alan taraması ile HRMS de seçici iyon taraması yapılabilmektedir. Magnetik tarama hızlı bir şekilde yapılacak kütle taraması için uygun değildir. Özellikle GC den gelen piklerin çok kısa bir zaman birimi içerisinde tam kütle değerinin (exact mass) spektrometresine geldiği göz önüne alınırsa MS in bu sinyalleri aynı hızla algılayabilmesi gerekmektedir. Elektriksel alan hızlı bir şekilde bu tam kütleyi tarayacak hızdadır. Bu nedenle HRMS de bilgisayar ile yüksek hızda elektriksel alan değiştirilebilmektedir. Bu sırada bilinen bir referans maddesi de (örn: erflurofenentren, perflorotribütilamin) analiz edilerek cihaz çalışma süresince otomatik olarak kalibrasyon yapılabilmektedir. Pratikte magnetik alan belirli bir kütledeki bir iyona ayarlanıp elektriksel alan azaltılarak ilgilenilen yüksek kütle birimlerindeki iyonlann analizi sağlanır. Azaltılmış elektriksel alandan (Vı) ve yüksek kütleli iyon un (Mı) elektriksel ve magnetik alandan geçişi ile ilişkili bağıntı Mı = M / (V/Vı) teklinde gösterilebilir. Ancak elektriksel alan azaltıldığında iyon geçişi de azalacaktır. Sinyal kaybı iyon kaynağının temizliğine ve ayarlama parametrelerine bağlıdır. % 33 kadar azaltılmış elektriksel alanda % 30 kadar kayıp en iyi ayarlama koşullarında kabul edilebilmektedir. Bazı durumlarda kayıp % 10 dan da az olabilir. Birden fazla iyonun aynı zamanda tayin edilebilmesi elektriksel alan şiddetinin birden fazla adımlarla değiştirilebilmesi ile yapılabilmektedir. Bunun için seçilen bir ayıncılık değerinde elektriksel alan seçilen iki kütle yardımı ile ayarlanır. Bu iki kütleden birisi kaîibrasyonda diğeri sabitleştirmede kullanılır. Analiz başladığında ilk önce magnet sabitleştirme 337

9 kütlesinin biraz altında bir değere ayarlanır. Elektriksel alan dar bir aralıkta tarama yapılarak pik genişliği ve maksimum belirlenir. Bundan sonra belirli zamanda taranacak iyon gruplan belirlenerek çoklu iyon analizi gerçekleştirilir. HRMS ile yapılabilecek çalışmalara örnek olarak: Anabolik steroid özellikteki stanazolol ve metabolitlerinin analizi için HRMS gerekmektedir. Bunun nedeni: idrar ile vucuttan serbest olarak yani glukoronik ve/veya sülfonik asit konjugatlan halinde olmayan bir şekilde atılan stanazolol ana molekülüne karşı metaboltleri yani vücutta değişikliğe uğrayan moleküller glukoronik ve/veya sülfonik asit konjugatlan şeklinde atılmaktadır. Kuadrapol MS ile gözlenemiyen stanazolol metabolitleri m/z ve değerleri izlenerek HRMS ile analiz edilebilir. HRMS e 4 pikogram enjekte edilerek m/z , m/z değerlerinde epimetendiol gözlenebilmekteyken, kuadrapol kütle spektrometresi ile epimetendiolün en düşük gözlenebilme sının 12 pikogram dır. Klenbuterol, vitamin E metaboliti ve nandrolon m/z 420 değerine sahiptirler. Kuadropol MS ile aynlamayan bu maddeler, HRMS ile klenbuterol için ; vitamin E metaboliti için ve nandrolon için m/z değerleri ile aynlabilmektedir. Norandrosteron eklenmiş idrar analizleri yapılırken , , m/z değerleri ile 3000 ayıncılık ile 4 pikogram, 1500 ayırıcılık ile 40 pikogram norandrosreron gözlenebilmektedir. 338

10 HIGH RESOLUTION MASS SPECTROMETRIC DETERMINATION OF SOME ANABOLIC STEROIDS ABSTRACT High resolution mass spectrometry coupled with gas chromatography (GC-HRMS) is a powerful analytical technique. Sample molecules and their fragments can be separated on the basis of their different mass to charge ratios by using mass spectrometry. Magnetic sector and quadropole are the most common forms of mass analyzer. HRMS is double focusing instrument. A double-focusing mass spectrometer employs magnetic and electric sectors to separate and focus ions. The magnetic analyzer (B) separates species with different mass to charge (m/z) ratios based on their different momenta. The electric sector (E) is an energy analyzer and only allows ions with a given kinetic energy to pass and reach the dedector. BE, EB and EBE geometries can be used. The EB geometry is forward and BE geometry is reversed. The sector field mass spectrometer can be used to monitor selected ions by scanning either the magnet or the electric field. The electric field is continuously calibrated during the analysis using ions with known masses (for example; by using tuning compounds, perfluorophenanthrene or perfluorotributilamine). Calibration compound is leahed into the ion source during the analysis. Multiple ion dedection by electric field scanning is a multiple step process. The resolution is adjusted and the electric field is calibrate during two masses from the reference compound (lock and calibration masses). When an analysis is started the magnet is first set slightly below the mass of 339

11 the lock mass and the electric field is swept over a narrow range to find the peak maximum and the peak boundaries. Multiple ion dedection analysis can be acquired in a time group. Several steroids and their metabolites can be analyze by using HRMS. The analysis of norandrosterone bis-tms (M+ m/z , , ) extracted from urine. 4 pg and 40 fg of norandrosteron-bis TMS was dedected by HRMS with the 3000 resolution. Metabolites of stanazolol can not be dedected by using quadrapol instruments but it can be analyzed by HRMS by using m/z and m/z values. 340