T.C. TÜRKİYE BİLİMSEL VE TEKNOLOJİK ARAŞTIRMA KURUMU BAŞKANLIĞI Araştırma Destek Programları Başkanlığı

Transkript

1 T.C. TÜRKİYE BİLİMSEL VE TEKNOLOJİK ARAŞTIRMA KURUMU BAŞKANLIĞI Araştırma Destek Programları Başkanlığı Sayı : /161.10/E /11/2016 Konu : 114Z599 Numaralı Proje - Sonuç Raporu Sayın Hüsniye Tansel YALÇIN Yürütücülüğünü yaptığınız 114Z599 numaralı ve "Türkiye'deki Bazı Amfibi Türlerinin Deri Sekresyonlarının Biyolojik Aktivitelerinin Belirlenmesi" başlıklı projenizin Sonuç Raporu, Grup Yürütme Komitemizin tarih ve 41 sayılı toplantısında görüşülmüş ve ilgili raporun kabulüne karar verilmiştir. Bu proje kapsamında yapacağınız çıktılarınıza ilişkin bilgilerin ardeb-pts.tubitak.gov.tr adresinden erişebileceğiniz çıktı ekleme bölümüne girilmesi ve ilgili dosyaların bu bölüme yüklenmesi önem taşımaktadır. Bilgilerinizi saygılarımla rica eder, çalışmalarınızda başarılar dilerim. Dr. Demet DAŞKIN KİMYA, BİYOLOJİ ARAŞTIRMA DESTEK GRUBU Grup Yürütme Komitesi Sekreteri Bilgi Notu: Bu belge, 5070 sayılı Elektronik İmza Kanununa göre Güvenli Elektronik İmza ile imzalanmış ve proje yürütücüsünün (HÜSNİYE TANSEL YALÇIN) TÜBİTAK ARDEB PROJE TAKİP SİSTEMİ hesabına yüklenmiştir. Evrak doğrulaması talepleri, ebys@tubitak.gov.tr adresine e-posta yollanılarak yapılabilir. Atatürk Bulvarı No: Kavaklıdere/ANKARA Telefon No: (0312) Fax No: (0312) e-posta: iletisim@tubitak.gov.tr İnternet Adresi: Bilgi için: Giray BULUT Ünvanı: Bil.Prog.Uzmanı Tel:

2 - TÜBİTAK tarafından kabul edilebilir geçerli bir mazeret bildirilmeksizin; proje gelişme raporlarının sözleşmede belirtilen tarihlerde, proje sonuç raporlarının ise, sözleşmede belirtilen proje bitiş tarihinden itibaren 2 (iki) ay içinde gönderilmemesi halinde, ilgili rapor dönemine ait Proje Teşvik İkramiyeleri (PTİ) ödenmeyecektir. - Proje ekibi tarafından, TÜBİTAK desteği ile yürütülmekte/sonuçlandırılmış olan projeler kapsamında yapılan yayınlarda [makale, kitap, bildiri (sözlü sunum/poster sunum), tez, yayılım vb.] proje sözleşmesi ve TÜBİTAK Araştırma ve Yayın Etiği Kurulu Yönetmeliği (AYEK) gereğince ilgili proje numarası ile birlikte TÜBİTAK desteği belirtilmelidir. - Proje sözleşmeniz gereği, proje kapsamında yapacağınız hiçbir yayın, iş ve işlemde TÜBİTAK logosu kullanılamaz. - 03/11/2012 tarihinden sonra sonuçlanan projelerde, projelerin yürütücü ve araştırmacılarını ödüllendirmek amacıyla Proje Performans Ödülü (PPÖ; ppo.tubitak.gov.tr) uygulamasına başlanmıştır. Bu uygulamaya paralel olarak proje çıktılarının değerlendirilmesi de ARDEB Proje Takip Sistemi (ardeb-pts.tubitak.gov.tr) üzerinden yapılmaktadır. Bu kapsamda projenize ait çıktıların PTS'ye yüklenmesi önem taşımaktadır. Bu belge, 5070 sayılı Elektronik İmza Kanununa göre Güvenli Elektronik İmza ile imzalanmış ve proje yürütücüsünün (HÜSNİYE TANSEL YALÇIN) TÜBİTAK ARDEB PROJE TAKİP SİSTEMİ hesabına yüklenmiştir. Evrak doğrulaması talepleri, ebys@tubitak.gov.tr adresine e-posta yollanılarak yapılabilir. Atatürk Bulvarı No: Kavaklıdere/ANKARA Telefon No: (0312) Fax No: (0312) e-posta: iletisim@tubitak.gov.tr İnternet Adresi: Bilgi için: Giray BULUT Ünvanı: Bil.Prog.Uzmanı Tel:

3 Türkiye'deki Bazı Amfibi Türlerinin Deri Sekresyonlarının Biyolojik Aktivitelerinin Belirlenmesi Program Kodu: 3001 Proje No: 114Z599 Proje Yürütücüsü: Doç. Dr. Hüsniye Tansel YALÇIN Araştırmacılar Prof. Dr. Bayram GÖÇMEN Doç.Dr. Ayşe NALBANTSOY Bursiyer Uzm. Mert KARIŞ AĞUSTOS 2016 İZMİR

4 İÇİNDEKİLER DİZİNİ ÖNSÖZ... I ŞEKİLLER DİZİNİ... VI ÖZET... VIII ABSTRACT... IX 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Türkiye de Genel Dağılış Gösteren Amfibiler ve Genel Dağılış Alanları Amfibi Deri Sekresyonlarının Genel Özellikleri Antimikrobiyal Peptidler Anyonik Antimikrobiyal Peptidler Katyonik Antimikrobiyal Peptidler Amfibi Deri Salgılarının Biyoteknolojik Kullanımı ve Terapötik Potansiyeli Amfibi Deri Sekresyonlarının Antimikrobiyal ve Sitotoksik (Kanser ve Normal Hücrelerde) Etkileri MATERYAL VE METOD Arazi Çalışmaları Salgı Sağımı Liyofilizasyon Total Protein Miktarları Tayini Protein Profillerinin Belirlenmesi (SDS PAGE) Antimikrobiyal Aktivite Broth Mikrodilusyon Yöntemi Sitotoksisite Hücre Hatları ve Kültürlerin Devamlılığı Sitotoksisite ve Hücre Canlılık Testleri Hemolitik Aktivite BULGULAR Arazi Çalışmaları...32 III

5 4.2. Liyofilizasyon Protein Miktar Tayini Protein Profillerinin Belirlenmesi (SDS-PAGE) Antimikrobiyal Aktivite Sonuçları In Vitro Sitotoksisite Sonuçları Hemolitik Aktivite Sonuçları TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR...73 IV

6 ÖZET Amfibi deri sekresyonları geleneksel olarak bazı yaraların ve hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Türden türe farklılık gösteren biyolojik olarak aktif içerik özellikle peptidler/proteinler, steroidler ve alkaloidler açısından oldukça zengindir. Bu nedenle amfibi deri sekresyonlarının peptid/protein bazlı ilaç geliştirme çalışmalarının doğal kaynaklarından biri olabileceği düşüncesi bu alandaki ilgili çalışmaların son zamanlarda artmasına neden olmuştur. Amfibi deri sekresyonları üzerine yapılan çalışmalar son yıllarda yurtdışında artış göstermesine karşın Türkiye de bu konu ile ilgili kapsamlı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu projede, Burdur, Antalya ve Muğla illerinde dağılış gösteren Likya semenderleri ile İzmir ili de dahil edilerek bulunan diğer bazı amfibi türlerinin deri sekresyonları ile çalışılmıştır. Bu kapsamda detaylı iki arazi çalışması düzenlenmiş ve saha çalışmaları sırasında Likya semenderlerine ait yeni bir endemik alttür (L. billae eikeae) ülkemiz amfibi faunasına kazandırılmıştır. Ayrıca L. antalyana antalyana, L. a. gocmeni, L. flavimembris flavimembris ve L. f. ilgazi alttürleri için yeni lokaliteler kaydedilmiştir. Bireysel farklılıkları standardize etmek amacıyla aynı türün farklı bireylerinden çok küçük elektriksel uyarı verilerek toplanan sekresyon örnekleri örnekleme havuzunda bir araya getirilmiş denemelerde kullanılmak üzere liyofilize edilmiştir. Farklı türlerden alınan sekresyonlar için protein miktarı, SDS-PAGE protein profili, antimikrobial aktivite ve normal ve kanserli hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkileri belirlenmiştir. Ayrıca, amfibi salgıları hemolitik etkilerinin varlığı açısından da araştırılmıştır. Sonuç olarak, taranan 19 farklı deri salgısı örneğinin tamamının az veya çok biyoaktivite gösterdiği ortaya konmuştur. Projenin hedef grubu Likya semenderlerinden özellikle L. l. luschani deri sekresyonu en yüksek sitotoksik etkiyi (A-549 ve MPanc-96 üzerinde) gösterirken, çalışılan diğer amfibi türlerinden Bufo bufo deri/parotoid sekresyonu en yüksek sitotoksik etkiyi (çalışılan hücre hatlarının tamamında) göstermiştir. Çalışılan deri sekresyonları arasından en yüksek antimikrobiyal aktiviteyi Pelophylax bedriagae deri sekresyonu göstermiştir. Hemolitik aktivite sonuçlarına bakıldığında Likya semenderleri ve Bufo bufo deri salgılarının hemolitik aktivitesinin olmadığı, diğer türlerin deri salgılarının ise çok düşük hemolitik etkiye sahip olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Amfibi, deri sekresyonu, antimikrobiyal aktivite, sitotoksisite, hemolitik aktivite, SDS-PAGE VIII

7 ABSTRACT Amphibian skin secretions have traditionally been used in the treatment of some wounds and diseases. Biologically active content that differs from species to species is quite rich especially in terms of peptides / proteins, steroids and alkaloids. Therefore, the idea of amphibian skin secretion as one of the natural sources of peptide/protein-based drug development has recently been increased the relevant studies in this field. Although studies carried out on amphibian skin secretions have increased in other countries in recent years, there are no comprehensive studies on this subject conducted in Turkey. Within the scope of this project, skin secretions of Lycia salamanders and some other amphibian species distributed in the provinces of Burdur, Antalya, Mugla and Izmir were studied. Therefore, two detailed fieldworks were arranged and during the fieldworks, a new endemic subspecies (L. billae eikeae) belonging to the Lycian salamanders was determined and added to Turkey s amphibian fauna. In addition, new localities were discovered and recorded for the subspecies L. antalyana antalyana, L. a. gocmeni, L. flavimembris flavimembris and L. f. ilgazi. In order to standardize individual differences, the secretion samples collected from various individuals of the same species via very mild electrical stimulation were gathered in the sampling pool and lyophilized to use in the experiments. The amount of protein (Bradford method), SDS - PAGE protein profile, antimicrobial activity, on normal and cancer cell lines were determined for secretions obtained from different species. In addition, amphibian secretions were investigated in terms of the presence of hemolytic effects. Consequently, all of the 19 different skin secretion samples showed a greater or lesser bioactivity. Of the Lycian salamanders, the target group of the project, especially the skin secretion of L. l. luschani showed the highest cytotoxic effect (over A-549 and MPanc-96) whereas of the other amphibian species studied, the skin / parotoid secretion of Bufo bufo showed the highest cytotoxic effect (in all the cell lines studied). Of the skin secretions studied, the skin secretion of pelophylax bedriagae demonstrated the highest antimicrobial activity. The hemolytic activity results revealed that while the skin secretions of Lycian salamanders and Bufo bufo did not have hemolytic activity, skin secretions of the other species had very low hemolytic effect. Keywords: Amphibian, skin secretion, antimicrobial activity, cytotoxicity, hemolytic activity, SDS-PAGE. IX