ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Sabahattin ASLANYAVRUSU BAKIR VE BAKIR+EDTA KOMPLEKSİNİN ETKİSİNE BIRAKILAN OREOCHROMIS NILOTICUS (L.) DA BAKIRIN KAN DOKUSUNDA BİRİKİMİ VE SERUM ENZİM AKTİVİTELERİNE ETKİSİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ. BAKIR VE BAKIR+EDTA KOMPLEKSİNİN ETKİSİNE BIRAKILAN OREOCHROMIS NILOTICUS (l.) DA BAKIRIN KAN DOKUSUNDA BİRİKİMİ VE SERUM ENZİM AKTİVİTELERİNE ETKİSİ Sabahattin ASLANYAVRUSU YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez 18/01/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza:... İmza:.... İmza:... Prof. Dr. Ferit KARGIN Prof. Dr. İskender EMRE Doç. Dr. Fatma Çevik DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2009YL22 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAKIR VE BAKIR+EDTA KOMPLEKSİNİN ETKİSİNE BIRAKILAN OREOCHROMIS NILOTICUS (L.) DA BAKIRIN KAN DOKUSUNDA BİRİKİMİ VE SERUM ENZİM AKTİVİTELERİNE ETKİSİ Sabahattin ASLANYAVRUSU ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Ferit KARGIN Yıl:2009, Sayfa: 44 Jüri: Prof. Dr. Ferit KARGIN Prof. Dr. İskender EMRE Doç. Dr. Fatma Çevik Bu araştırmada bakır ve bakır+edta karışımlarına bırakılan Oreochromis niloticus un bakırın kan dokusunda birikimi ile serum enzim aktivitelerine üzerine etkisi incelenmiştir. Balıklar 7, 14 ve 21 gün sürelerle 0.1 mg/l, 0.5 mg/l ve 1.0 mg/l Cu ve 0.1 mg/l Cu+0.3 mg/l EDTA, 0.5 mg/l Cu+1.5 mg/l EDTA ve 1.0 mg/l Cu+3.0 mg/l EDTA karışımlarına bırakılarak kan dokusunda bakır birikimi ile serum enzimleri belirlenmiştir. Bu çalışmada kan dokusunda bakır birikimi ortamda bakır derişiminin artışı ve etkide kalınan sürenin uzamasıyla artmıştır. Denenen tüm şartlarda Cu+EDTA karışımına bırakılan balıkların kan dokusunda Cu birikimi yalnız bakırın etkisine bırakılan balıklara oranla daha düşük düzeyde olduğu saptanmıştır. Çalışılan tüm koşullarda EDTA O. niloticus un kan dokusunda bakır birikimini önemli ölçüde azaltmıştır. O. niloticus da Cu ve Cu+EDTA karışımı serum enzimlerinde değişikliğe neden olmuştur. Cu ve Cu+EDTA nın etkisinde serum enzim aktivitelerinin (Alanin aminotransferaz, Aspartat aminotrasferaz, Alkalen fosfataz, laktat dehidrojeneaz ve lipaz arttığı gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Bakır, Birikim, EDTA, Oreochromis niloticus, kan parametreleri I

4 ABSTRACT MSc THESIS EFFECTS OF COPPER ON ENZYME ACTIVITY AND ACCUMULATION OF COPPER IN BLOOD TISSUES OF OREOCHROMIS NILOTICUS EXPOSED TO COPPER AND COPPER+EDTA COMPLEX Sabahattin ASLANYAVRUSU DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor: Prof. Dr. Ferit KARGIN Year:2009, Pages: 44 Jury: Prof. Dr. Ferit KARGIN Prof. Dr. İskender EMRE Assoc. Prof Dr.Fatma Çevik In this study, effects of copper on enzyme activity and accumulation in blood tissue of Oreochromis niloticus were investigated in both Cu and Cu+EDTA mixtures. The fish were exposed to 0.1 mg/l, 0.5 mg/l and 1.0 mg/l Cu and 0.1 mg/l Cu+0.3 mg/l EDTA and 0.5 mg/l Cu+3.0 mg/l EDTA and 1.0 mg/l Cu+3.0 mg/l EDTA mixtures for 7, 14 and 21 days to observe copper accumulation and serum enzyme in blood tissue. In this study, copper accumulation in blood tissue increased with increasing concentrations of copper in the medium and exposure period. In all the concentrations tested, copper accumulation in the blood tissue of fish exposed to Cu+EDTA mixtures were lower when compared to those exposed to copper only. In all conditions, EDTA significantly reduced the accumulation of copper in the blood of O. niloticus. In O. niloticus, serum enzymes were altered by exposure Cu and Cu+EDTA mixtures. In the blood tissues of fish exposed to Cu and Cu+EDTA mixtures were observed an increase in the activity of serum enzymes (LP, AST, LDH, ALP ve ALT). Key Words: Copper, Accumulation, EDTA, Oreochromis niloticus, Blood Parameters II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez çalışmamın her aşamasında bilimsel desteğini ve öngörülerini hiç esirgemeyen sayın hocam ve tez danışmanım Prof. Dr. Ferit KARGIN a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım sırasında bana her türlü yardım ve desteğini veren sayın Arş. Gör. Hikmet Yeter ÇOĞUN a çok teşekkür ederim. Yine yardımlarından dolayı sayın Arş. Gör. Tüzin AYTEKİN YÜZEREROĞLU, Arş. Gör. Gülbin GÖK e ve Biyolog Onur MARULDALI ya teşekkür ederim. Bu güne kadar bana her türlü desteği sağlayan ve kararlarımda hep yanımda olan aileme ve Çiğdem ÇAVUŞOĞLU na da teşekkürü bir borç bilirim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.....I ABSTRACT....II TEŞEKKÜR...III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... V ŞEKİLLER DİZİNİ VI 1. GİRİŞ 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD BULGULAR Bakır Düzeyleri Bakır ve Bakır+EDTA karışımının Serum enzim aktiviteleri Üzerine Etkisi LP Aktivitesi AST Aktivitesi LDH Aktivitesi ALP Aktivitesi ALT Aktivitesi TARTIŞMA VE SONUÇLAR...30 KAYNAKLAR...36 ÖZ GEÇMİŞ...44 IV

7 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki bakır düzeyleri (µg/ml Kan). 13 Çizelge 4.2. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki LP aktiviteleri (U/L kan) üzerine bakırın etkisi 16 Çizelge 4.3. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki SGPT(AST) aktivitesi (U/L kan) üzerine bakırın etkisi Çizelge 4.4. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki LDH aktiviteleri (U/L kan) üzerine bakırın etkisi Çizelge 4.5. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki ALP aktiviteleri (U/L kan) üzerine bakırın etkisi 25 Çizelge 4.6. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki SGOT(ALT) aktiviteleri (U/L kan) üzerine bakırın etkisi.. 28 V

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 4.1. Bakır derişimi ve absorbans arasındaki doğrusal ilişki. 11 Şekil 4.2. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda bakır düzeyleri üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (µg/ml Kan) (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün). 15 Şekil 4.3. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda LP aktivitesi(u/l kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün). 18 Şekil 4.4. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda AST aktiviteleri (U/L kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, 21 C:28. gün) Şekil 4.5. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda LDH aktiviteleri (U/L kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün) 24 Şekil 4.6. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda ALP aktiviteleri (U/L kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün) 27 Şekil 4.7. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda ALT aktiviteleri (U/L kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün) 30 VI

9 1. GİRİŞ Sabahattin ASLANYAVRUSU 1. GİRİŞ Akarsular ve göl suları içilebilir suların önemli kaynakları olup, bu doğal suların kirliliği günümüzde çok önemli çevresel sorunlardan birini oluşturmaktadır. Birçok endüstriyel, zirai, evsel atıklar ve diğer birçok çevre kirleticileri ağır metallerin kaynağını oluşturmakta ve bunların su ortamlarına bırakılması sonucu burada yaşayan hedef organizmaları olumsuz yönde etkilemektedir. Ağır metallerin oluşturduğu çevre kirliliği son yıllarda tarım, kimyasal ve endüstriyel işletmelerin bunları yüksek düzeyde kullanmaları nedeniyle artış gösterdiği saptanmıştır (Dethloff ve ark., 1999; Oliveria ve ark., 2004; Hansen ve ark., 2006; Liu ve ark., 2006). Suların kirlenmesine neden olan kontaminantlar arasında ağır metaller önemli bir yer tutmaktadır. Hg, Cd ve Pb gibi gerekli olmayan metaller çok tehlikeli olarak kabul edilirken, Cu, Zn ve Fe gibi gerekli metaller yüksek derişimlerde toksik etki göstermektedirler. Ağır metaller genelde besin zincirini oluşturan organizmalarda birikebilmekte ve balıklara kadar ulaşabilmektedir. Ağır metaller organizma tarafından alındıktan sonra metallothionein (MT) ve ekskresyon olmak üzere iki mekanizmayla bunların toksik etkilerini regüle edebilmektedirler (Oliveria ve ark., 2004). Metabolizmada önemli rolü bulunan bakır canlılarda regüle edilmektedir (Kim ve Kang, 2004). Ağır metallerin birikimi, alınım oranındaki artışa, metalin formuna, boşaltımın azalmasına ve detoksifikasyon sisteminin inhibüsyonuna bağlı olarak değişim göstermektedir (Campana ve ark., 2003). Balıklarda ağır metallerin doku ve organlarda etkisi ve birikimi metalin alınım yoluna, derişimine ve metalin etkisinde kalma süresine bağlı olarak değişim göstermektedir (Campana ve ark., 2003). Balıklar ağır metal kirliliğine karşı direnç kazanmalarında iki mekanizma bulunmaktadır, bunlar; akklimasyon ve adaptasyondur. Akklimasyon metalin etkisinde metale toleransın artışı şeklinde tanımlanmıştır (Hansen ve ark., 2006). Bakır, pestisid imalinde, gübre, elektrik kaplama sanayinde, boya yapımında, demir-çelik ve madencilikte kullanımı sonucu su ortamındaki düzeyi artmıştır. IB gurubuna dahil olan bakır akuatik hayvanlarda toksik etkileri yüksek olan bir elementtir. Bakır kan plazmasında seruloplazmin, 1

10 1. GİRİŞ Sabahattin ASLANYAVRUSU albümin ve transküprein e bağlanarak taşınmaktadır. Bakır hücresel fonksiyonların sürdürülebilmesi ve azot, oksijen, sülfür gruplarına yüksek affinite gösteren birçok enzimin yapısında bulunması nedeniyle canlıların gereksinim duyduğu bir iz elementtir. Yüksek düzeylerde direkt olarak protein denatürasyonuna, indirekt olarak dareaktif oksijen türlerini (ROS) oluşturması nedeniyle toksik etki göstermektedir (Liu ve ark., 2006). Buna ek olarak yüksek derişimlerde kan parametrelerini, büyümeyi, ve enzim aktivitelerini olumsuz yönde etkilemektedir ( Nemcsok ve Hughes, 1988; Singh ve Reddy, 1990; Kim ve Kang, 2004). Çevresel kirleticilerin biomarkırları olarak balıklarda oksidatif stres parametrelerinin kullanımı giderek arttığı belirlenmiştir. Bakır, serbest radikallerin oluşumuna neden olarak oksidatif doku hasarlarını kolaylaştırdığı ileri sürülmektedir (Hansen ve ark., 2006). Reaktif oksijen türlerini (ROS) metabolizma esnasında doğal olarak oluşarak oksidatif strese neden olur. Bunun sonucunda hücre membranlarında hasarlar, enzimlerin inhibüsyonu ve hücrenin diğer kompanentlerinin hasar görmesine neden olur. ROS un glutation, bazı vitaminler ve enzimler gibi bazı antioksidantlar tarafından toksik etkileri engellenir. Bu enzimler kemikli balıkların birçoğunun dokularında bulunduğu saptanmıştır (Basha ve Rani, 2003; Hansen ve ark., 2006). Kan parametreleri balık fizyolojisinin klinik teşhisinde sıklıkla ölçülmekte ve kirleticilerin düşük derişimlerinin etkisinin belirlenmesinde çok sık kullanılmaktadır (Flos ve ark., 1987; Tort ve Torres, 1988). Hematolojik parametreler birçok balık türünün sağlık durumunun bir belirteci olarak kullanılmaktadır. Hematolojik değişiklikler, kirleticilerin, hipoksiya ve hastalık gibi stres koşullarının farklı tiplerinin belirlenmesinde kullanılmaktadır (Cyriac ve ark., 1989). Balıklarda hematolojik değişkenlerin kullanımı kirletilmiş ortamlardaki fizyolojik tepkiyi göstermesi açısından önem taşımaktadır. Balıkların kanı ağır metallerin neden olduğu stres ve hematolojik parametrelere çok hassastır (Gioda ve ark., 2007). Biyokimyasal ve hematolojik parametreler metal etkisiyle değişebilmektedir. Yapılan çalışmalarda hemoglobin, hematokrit, plazma proteinleri, kortizol, glukoz ve kan enzimleri, metal tipine, balık türüne ve etkide kalma süresine bağlı olarak arttığı veya azaldığı belirlenmiştir (Cyriac ve ark., 1989; Dethloff ve ark., 1999). Organizmalar, oksidatif strese neden 2

11 1. GİRİŞ Sabahattin ASLANYAVRUSU olan gerekli ve gereksiz metallerin toksik etkilerine karşı kendilerini korumak için çeşitli mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bu mekanizmalar arasında karaciğer ve böbrek gibi dokular ile antioksidant savunma (katalaz, superoksid dismutaz, glutathione peroxidase, glutathione S-transferase ve xanthine oxsidase) sistemlerine sahip olmaları büyük önem taşır (Basha ve Rani, 2003). Ağır metallerin balıklar üzerindeki etkisinin belirlenmesinde önemli bir yolda enzim biyomarkırlarının ölçülmesidir (Jiminez ve Stegeman, 1990; Bucher ve Hofer, 1990). Alanin aminotransferaz (ALAT), Aspartat aminotrasferaz (ASAT), Alkalen fosfataz (ALP), laktat dehidrojeneaz (LDH) ve lipaz (LP) gibi plazma enzimlerinin ölçülmesi, balıklar üzerindeki ağır metal kirliliğinin etkisinin belirlenmesinde büyük önem taşımaktadır. Solunum ve metabolik enzimler (LDH, CS (citrate syntase)) hücresel solunumda ve glukozdan ATP üretiminde görev almaktadır. Bunlardan LDH aktivitesi hücrelerin anaerobik kapasitesinin bir belirteci olarak kullanılmaktadır (Long ve ark., 2003). Alanin aminotransferaz (ALAT) ve aspartat aminotrasferaz (ASAT) aminoasit metabolizmasına katılan önemli enzimler arasında yer almaktadır (Cowey ve Walton, 1988). Plazmadaki ALAT ve ASAT enzim aktivitelerinin artması karaciğer ve böbrek gibi organların hasar görmesi sonucu oluştuğu belirlenmiştir (Nemcsok ve Hughes, 1988). Alkalen fosfataz (ALP) önemli bir serum enzimidir ve doku hasarlarının bir belirteci olarak kullanılmaktadır (Nemcsok ve Boross, 1982). Lipazlar (LP), yağların sindirimi, alınımı ve lipoprotein metabolizmasında önemli rol oynamaktadır (Sharma ve ark., 2001). Salmo gairdneri de bakırın ASAT ve ALAT gibi plazma enzim aktiviteleri üzerine olumsuz etkiler yaptığı belirlenmiştir (Nemcsok ve Hughes, 1988). Sentetik kompleksanlar metaller için şelat ajan olmaları, metallerle etkileşime girmeleri nedeniyle ağır metal kirliliği çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. EDTA, NTA ve DTPA (Etilen daimin tetra asetik asit, Nitrilo tri asetik asit, Dietilen triamin penta asetik asit) gibi sentetik bileşikler ağır metallerin etkin temizleyicisi olarak bilinmektedir. Bakır birikimi ve toksisitesi EDTA ve NTA gibi maddeler tarafından etkilenmektedir (Muramoto, 1980). Yapılan araştırmalarda ortama EDTA ilave edildiğinde bakır toksisitesinin ve birikiminin azaldığı saptanmıştır (Muramoto, 1980, 1983). 3

12 1. GİRİŞ Sabahattin ASLANYAVRUSU Organizmalarda kirleticilerin neden olduğu hasarların belirlenmesi için plazma enzim düzeylerinin belirlenmesi gerekmektedir. Bu nedenle, bu araştırmada bakırın etkisine bırakılan Oreochromis niloticus da plazma enzim (ALAT, ASAT, LDH, ALP ve LP) aktiviteleri üzerine bakırın etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 4

13 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sabahattin ASLANYAVRUSU 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Muramoto (1980), kurşun ve kurşun-edta karışımlarına bırakılan Cyprinus carpio da doğrudan kurşunun etkisine bırakılan balıklara oranla Pb-EDTA karışımına bırakılan balıkların solungaç ve kas dokularındaki kurşun birikiminin oldukça azaldığını saptamıştır. Muramoto (1983), Cu-kontamine C. carpio balıklarını 90 gün süreyle temiz suya bırakmış ve dokularındaki Cu düzeyinin oldukça azaldığını, solungaçlardaki bakır eliminasyonunun %71 düzeyinde olduğunu belirtmiştir Arilloa ve ark. (1984), S. gairdneri yi 4 ay süreyle 1 ve 10 µg/l Cd ve 30 ve 100 µg/l Cu derişiminin etkisine bıraktıkları çalışmalarında biyokimyasal parametrelerdeki değişimleri incelemişlerdir. Metale duyarlı bazı enzim aktivitelerinde bakırınn düşük ve yüksek; kadmiyumun ise yalnızca yüksek derişimlerinin etkisinde önemli değişikliklerin meydana geldiği saptanmıştır. Hilmy ve ark. (1985), Mugil cephalus un kan, karaciğer, solungaç ve kalp dokularında aspartat aminotransferaz, alanin aminotransferaz, alkalen fosfataz ve laktat dehidrojenaz gibi enzim aktiviteleri üzerine Cd nin toksik etkilerini araştırmışlardır. Plazma ALP ve LDH aktivitelerinin yüksek Cd derişimlerinin etkisinde arttığını göstermişlerdir. Benson ve ark. (1987), tatlı su balığı Notemigonus crysoleucas ı 96 saat süreyle 1.35 ve 2.40 mg/l Cd derişimlerinin etkisine bırakarak kan parametrelerindeki değişimleri incelemişlerdir. Cd nin kan ALT ve AST düzeyinde önemli değişikliklere (P<0.05) neden olduğu saptanmıştır Bettger ve ark. (1987), Cu ve Zn un düşük derişimlerinin etkisine bırakılan S. gairdneri de kanda her iki metalinde önemli miktarda biriktiği, ortama EDTA ilavesiyle balıkların kanında biriken metallerin büyük bir kısmının uzaklaştığını belirtmişlerdir. Flos ve ark. (1987), balıkların sağlık durumlarının belirlenmesinde hematolojik parametrelerin kullanıldığını belirtmişlerdir. Hematolojik parametrelerin üzerine eşey, yaş, besin ve sıcaklık gibi faktörlerin önemli bir rol oynadığını saptamışlardır. Bu nedenle balık hastalıklarının teşhisinde hematolojik değerlerin belirlenmesi gerekmektedir. 5

14 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sabahattin ASLANYAVRUSU Tort ve ark. (1987), Scyliorhninus canicula da hematolojik parametreleri üzerine bakırın etkilerini incelemişlerdir. Çok düşük Cu derişimlerinde hemoglobin düzeyi değişmezken eritrosit ve hematokrit düzeyinde azalma, yüksek Cu derişimlerinde ise incelenen tüm hematolojik parametrelerin düzeylerinde azalmaların olduğu saptanmıştır. Tort ve Torres (1988), Kan parametreleri, çevresel veya fizyolojik değişimlere hemen tepki göstermesine ek olarak kolay ölçülebilmesi ve organizmanın fizyolojik durumunu tam olarak gösterebilmesi açısında önem taşımaktadır. Holwerda ve ark. (1988), Anadonta anatina da EDTA nın metal birikimine etkisini belirlemek üzere yapılan bir araştırmada, EDTA nın dokularda Cd alımını büyük ölçüde engellediğini belirlemişlerdir. Radi ve Matkovics. (1988), CuSO4 un farklı derişimlerinin etkisine bıraktıkları C. carpio nun karaciğer, solungaç ve beyaz kas dokularında, CuSO 4 konsantrasyonu arttıkça total SOD, Mn-SOD ve Cu-Zn SOD aktivitelerinde önemli derecede azalma olduğunu gözlemişlerdir Kargın ve Erdem (1991), 10, 20, 30, 45 ve 60 gün süreyle 0.01, 0.10, 1.00 ve 10 ppm bakır derişimin etkisine bırakılan C. carpio nun çeşitli dokularındaki bakır birikimi incelenmiştir. Tüm ortam derişimlerinde doku ve organlardaki bakır birikimin ortam derişimi ve çözeltide kalma süresi ile orantılı olarak arttığı bulunmuştur. Kargın ve Erdem (1992), 24, 48, 72 ve 96 saat süre ile 60 ppm bakır, 200 ppm çinko ve 30 ppm bakır ppm çinko etkisine bırakılan Tilapia nilotica nın karaciğer, solungaç ve kas dokularındaki metal birikimi araştırılmıştır. Ölüm oranının salt bakır veya çinkoya oranla bakır+çinko karışımında daha yüksek olduğu, en yüksek bakır birikiminin karaciğerde olduğu, dokulardaki bakır birikiminin çinko varlığında azalırken, bakırın çinko birikimini etkilemediği saptanmıştır. Balint ve ark. (1995), İnsektisit olan methidathion ve deltamethrine etkisine bırakılan C. carpio da biyokimyasal ve hücresel düzeyde meydana gelen değişiklikleri incelemişlerdir. 6 saatlik uygulamadan sonra serum glukoz düzeyinin %30 düzeyinde arttığı, 72 saatlik uygulamadan sonra ise serum LDH aktivitesi 2.5 6

15 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sabahattin ASLANYAVRUSU katlık bir artış gösterirken; asetilkolin esteraz (AChE) aktivitesinde ise %20 düzeyinde bir azalma olduğunu belirtmişlerdir. Bainy ve ark. (1996), Billing Barajının (Sao Paulo, Brezilya) kirlenmiş bölgelerinden yakalanan O. niloticus un karaciğer, böbrek, solungaç ve eritrositlerinde oksidatif stresi çalışmışlardır. Eritrositlerde oksidatif stres ve buna bağlı olarak oksidatif zararların meydana geldiği, enzim aktivitelerinin ise değiştiği belirtilmiştir. Dethloff ve ark. (1999), Madencilik, tarım ve endüstrideki aktiviteler sularda metal konsantrasyonlarının yükselmesine neden olmakta buda su organizmalarında zararlı etkiler oluşturmaktadır. Bununla birlikte metallerin organizmalar üzerine yaptığı fizyolojik etkiler sıcaklık, etkileşim ve diğer faktörler tarafından maskelenebilmektedir. Handy ve ark. (1999), Bakırın etkisine bıraktıkları Oncorhynchus mykiss de bakır barsaklarda emildikten sonra portal damarlar yoluyla karaciğere taşındığını saptamışlardır. Bakırın etkisinde kan (serum) protein, trigliserid alyuvar ve hematokrit düzeylerinin yavaş yavaş arttığını belirtmişlerdir. Vaglio ve Landriscina (1999), Sparus aurata da kadmiyum karaciğerde GPT ve GDT enzim aktivitelerini önemli düzeyde azaltırken, serumda ise aynı enzimlerin aktivitelerini arttırdığını saptamışlardır. Araştırıcılar enzim aktivitelerindeki bu azalmanın büyük bir olasılıkla Cd un metal enzimleriyle etkileşmesi sonucu olabileceğini belirtmişlerdir. Chen ve ark. (2000), Carassius auratus da Gd +3, La +3 ve Y +3 ile bunların EDTA komplekslerinin karaciğer SOD ve CAT enzim aktiviteleri üzerine etkisiyle ilgili yaptıkları çalışmada EDTA karaciğerdeki CAT ve SOD aktivitesindeki azalmayı arttırdığını belirtmişlerdir. Varanka ve ark. (2001), 24 ve 48 saat süreyle CuSO4 ün etkisine bırakılan C. carpio karaciğerinde kontrole göre CAT aktivitesinde bir azalma gözlenirken, total SOD aktivitesinde CuSO 4 uygulamasından 1 gün sonra artış, 2 gün sonra ise bir azalma gözlenmiştir. Plazma AlaAT (GPT) aktivitesinde ise artış meydana gelmiştir Campana ve ark.(2003), Pb un etkisine 2 gün süreyle bırakılan Halobatrachus didactylus un kanında ALA-D aktivitesinin inhübüsyonu 7

16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sabahattin ASLANYAVRUSU gözlenmiştir. Bu büyük bir olasılıkla kurşunun etkisinde kaldıktan hemen sonra kandaki kurşun düzeyinin hızlı bir şekilde artışından kaynaklanmaktadır. Gioda ve ark. (2007), Cu ve Zn eser düzeyde birçok enzimde kofaktör olarak hücresel metabolizmada önemli rol alırken, yüksek derişimlerde organizmalara toksik etki yapmaktadır. Cu ve Zn gibi metallerin kronik etkileri altında balıklarda davranış bozuklukları, biyokimyasal ve fizyolojik değişikliklere, büyüme ve mortaliteye neden olmaktadır. 8

17 3.MATERYAL ve METOD Sabahattin ASLANYAVRUSU 3. MATERYAL VE METOD Bu araştırmada kullanılan O.niloticus lar Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi yetiştirme havuzlarından alınarak laboratuara getirilen balıklar iki ay süre ile 40X120X40 cm boyutlarındaki on stok akvaryum içersinde laboratuar koşullarına adaptasyonları sağlanmıştır. O. niloticus lar bu sürenin sonunda ± 0.44 cm boy ve ± 1.19 g ağırlığa ulaşmışlardır. Deneyler 25 ± 1 0 C sıcaklıkta yürütülmüş, akvaryumlar merkezi havalandırma sistemi ile havalandırılmış ve günde sekiz saat aydınlanma (8 saat gündüz / 16 saat gece) periyodu uygulanmıştır. Balıklar, günde iki kez olmak üzere balık ağırlığının % 1 i kadar hazır balık yemi (Pınar Balık Yemi, Türkiye) ile beslenmişlerdir. Deney süresince ortam suyunun bazı fiziksel ve kimyasal özellikleri aşağıda verilmiştir. Toplam sertlik: ±0.21 ppm CaCO 3 ph: 8.22±0.06 Çözünmüş Oksijen: 7.33±0.06 mg/ L Deneyler, bakır ve bakır+edta karışımının ortam derişimleri dikkate alınarak iki seri olarak yürütülmüştür. Balıklar birinci seride bakırın 0.1, 0.5 ve 1.0 mg.l -1 derişimlerine, ikinci seride bakır + EDTA nın 0.1 Cu+0.3 EDTA, 0.5 Cu+1.5 EDTA ve 1.0 Cu+3.0 EDTA mg.l -1 ortam derişimlerinin etkisine 7, 14 ve 28 gün sürelerle bırakılmıştır. Deneylerin her bir serisinde 40X120X40 cm. boyutlarında olan ve her birinin içerisinde 18 balık bulunan 4 cam akvaryum kullanılmıştır. Birinci seride bu akvaryumlardan üçüne 120 şer litre 0.1, 0.5 ve 1.0 mg.l -1 bakır çözeltileri, ikinci seride bakır + EDTA karışımının 0.1 Cu+0.3 EDTA, 0.5 Cu+1.5 EDTA ve 1.0 Cu+3.0 EDTA mgl -1 lik çözeltilerinden 120 şer litre konulmuştur. Her seride dördüncü akvaryum kontrol olarak kullanılmıştır. Deneyler üç tekrarlı olarak yürütülmüştür ve her tekrarda iki balık kullanılmıştır. Deney ortamında bakır derişimlerinde zamana bağlı değişimler olabileceği dikkate alınarak deney süresince akvaryum çözeltileri iki günde bir değiştirilmiştir. 9

18 3.MATERYAL ve METOD Sabahattin ASLANYAVRUSU Deneylerde kullanılan bakır (CuCl 2 2H 2 O) çözeltilerinin akvaryumlarda homojen dağılması ve çökelmeyi önlemek için trisodyumsitrat (C 6 H 5 Na 3 O 7. 2H 2 O Merck) çözeltisi kullanılmıştır. Belirlenen her sürenin sonunda balıklar çeşme suyu ile iyice yıkanmış ve kurutma kâğıdı ile yüzeylerinde bulunan su damlacıkları alınmıştır. Balıklar kuyruk bölgesinden kesilerek dorsal aortadan kanları alınmıştır. Kan örnekleri içinde herhangi bir madde bulunmayan içi boş tüplere alınmıştır. Kan dokusunda bakır düzeylerinin belirlenmesi amacıyla 200 µl taze kan alınarak deney tüplerine aktarılmış ve üzerlerine 0.5 ml (1:1 v/v) %30 luk H 2 O 2 ve HNO 3 (%60; d:1.53) eklenmiş ve su banyosunda 100 o C de bir saat süreyle tutularak tam bir yanmanın gerçekleştiğini gösteren berrak çözelti elde edilinceye kadar yakılmıştır (Ince ve Kunc, 1988). Yakımı tamamlanan örnekler polietilen tüplere alınmış ve üzerleri saf suyla 2.5 ml ye tamamlanarak metal analizine hazır hale getirilmiştir. Hazırlanan kan örneklerindeki bakır absorbans değerleri, Perkin Elmer AS 3100 marka Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresiyle saptanmıştır. Kan dokusunda serum enzim düzeylerinin belirlenmesi amacıyla tüplere alınan kan örnekleri, 3000 rpm de 10 dakika süreyle santrifüj (Hettich EBA 8S) edilmiştir. Elde edilen serum örnekleri eppendorf tüplerine alınmış ve analize hazır hale getirilmiştir. Serum enzim analizleri Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarundaki otoanalizatör cihazlarında yürütülmüştür. Deneylerden elde edilen verilerin istatistik analizleri Regresyon analizi ve Student-Newman Keul s Test (SNK) testleri bilgisayarda SPSS 10.0 paket programı uygulanarak yapılmıştır. 10

19 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU 4. BULGULAR 4.1. Bakır Düzeyleri Oreochromis niloticus balıkların kan dokusunda bakır düzeylerini saptamak amacıyla bakır standartları ve absorbans arasındaki ilişkiyi gösteren regresyon doğrusu kullanılmıştır (Şekil 4.1). Bakır standartlarının absorbans değerlerinden Y=0.088X formülü elde edilmiştir. Burada X bakır derişimini, Y absorbansı göstermektedir. Balıkların kan dokusundaki bakır düzeyleri bu regresyon formülü kullanılarak hesaplanmıştır. 0,26 0,24 0,22 0,20 Absorbans 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 Y=0.088X ,04 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Bakır Derişimi (mg/l) Şekil 4.1. Bakır derişimi ve absorbans arasındaki doğrusal ilişki. Oreochromis niloticus da belirlenen her derişim ve sürede üç tekrarlı olarak saptanan bakır düzeylerinin aritmetik ortalamaları ve standart hataları ile EDTA nın Cu birikimine ve etkide kalma sürelerinin doku birikimine etkisini saptamak amacıyla verilen SNK testi (Student Newman Keul s Test) ile analiz edilmiş ve sonuçlar Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelgede a, b ve c harfleri EDTA nın Cu alınımına etkisini, x, y ve z harfleri ise kan dokusunda Cu birikimine sürenin 11

20 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU etkisini belirtmek için kullanılmıştır. Çizelgede farklı harflerle gösterilen veriler arasında P<0.05 düzeyinde istatistik ayrım vardır. Çizelge 4.1. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki bakır düzeyleri (µg/ml Kan). DERİŞİM (mg/l) SÜRE (GÜN) X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * ± 0.10 ax 1.49 ± 0.10 ax 1.82 ± 0.06 ax 0.1 Cu 2.25 ± 0.13 bx 4.09 ± 0.07 by 4.60 ± 0.13 bz 0.1 Cu+0.3 EDTA 0.88 ± 0.13 cx 2.86 ± 0.20 cy 3.06 ± 0.14 cz ± 0.10 ax 1.49 ± 0.10 ax 1.82 ± 0.06 ax 0.5 Cu 2.53 ± 0.03 bx 4.50 ± 0.80 by 4.97 ± 0.01 bz 0.5 Cu+1.5 EDTA 0.92 ± 0.03 cx 3.04 ± 0.02 cy 3.82 ± 0.05 cz ± 0.10 ax 1.49 ± 0.10 ax 1.69 ± 0.06 ax 1.0 Cu 2.93 ± 0.17 bx 4.70 ± 0.05 by 4.94 ± 0.04 bz 1.0 Cu+3.0 EDTA 1.05 ± 0.09 cx 3.17 ± 0.15 cy 4.22 ± 0.32 cz * : a, b ve c harfleri derişimleri belirlemek; x, y ve z harfleri günler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<0.05). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir ortam derişiminde etkide kalma süresi ile bakır düzeyi arasında pozitif bir ilişki vardır. Sürenin uzamasıyla kandaki bakır düzeyi de artmıştır (Çizelge 4.1. SNK, P<0.05). 28 günlük süre sonunda 7 günlük süreye oranla kan dokusundaki bakır düzeyi 0.1, 0.5 ve 1.0 mgl -1 Cu ortam derişimlerinde sırasıyla %104, %96 ve %69 düzeyinde artış göstermiştir. Denenen tüm süre ve ortam derişimlerinde Cu+EDTA karışımına bırakılan balıkların kan dokusundaki Cu birikimi, doğrudan Cu ın etkisine bırakılan balıklara oranla düşük düzeyde olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.1. SNK, P<0.05). 7. günde 12

21 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU 1.0 mgl -1 Cu+ 3.0 mgl -1 EDTA karışımının etkisindeki balıkların kan dokusundaki Cu düzeylerinde, 1.0 mgl -1 Cu ın etkisindeki balıklara oranla yaklaşık olarak 3 katlık bir azalma olduğu saptanmıştır. Belirli bir süre sonunda Cu ve Cu+EDTA karışımına bırakılan O. niloticus un kan dokusunda bakır düzeyi üzerine ortam derişimlerinin etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistik analizi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.2. A, B ve C de verilmiştir. 7. gün Cu+EDTA karışımı hariç denenen tüm sürelerde Cu ve Cu+EDTA ortam derişimleri arttıkça bakır düzeyi de artmıştır. Bu artış Cu+EDTA karışımına oranla doğrudan Cu un etkisinde kalan balıklarda daha yüksek olmuştur. A 3,5 Bakır Düzeyi (µg/ml Kan) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 1.0 Cu 0.5 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) 13

22 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU B Bakır Düzeyi (µg/ml Kan) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Cu 0.5 Cu 0.1 Cu Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) C 6 Bakır Düzeyi (µg/ml Kan) Cu 1.0 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) Şekil 4.2. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda bakır düzeyleri üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (µg/ml Kan) (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün). 14

23 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU 4.2. Bakır ve Bakır+EDTA karışımının Serum enzim aktiviteleri Üzerine Etkisi LP Aktivitesi Bakır ve Cu+EDTA karışımının derişim ve süreye bağlı olarak O. niloticus un serum LP aktivitesine etkileri Çizelge 4.2 de verilmiştir. Denenen tüm sürelerde hem bakır hem de Cu+EDTA karışımının etkisinde LP aktivitesi kontrole göre artmıştır. Denenen tüm sürelerde enzim aktivitesinde gözlenen bu artışlar Cu ve Cu+EDTA arasında istatistik ayrım göstermemiştir (P<0.05). Cu+EDTA etkisine oranla bakırın doğrudan etkisinde LP aktivitesinin daha fazla arttığı belirlenmiştir. Çizelge 4.2. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki LP aktiviteleri (U/L kan) üzerine bakırın etkisi DERİŞİM (mg/l) SÜRE (GÜN) X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * ± 0.33 ax 4.10 ± 0.01 ax 4.00 ± 0.02 ax 0.1 Cu 5.25 ± 0.33 bx 5.30 ± 0.33 bx 5.55 ± 3.06 bx 0.1 Cu+0.3 EDTA 5.66 ± 0.33 bx 5.33 ± 0.33 bx 5.80 ± 0.01 bx ± 0.33 ax 4.10 ± 0.01 ax 4.00 ± 0.0 ax 0.5 Cu 5.33 ± 0.33 bx 5.40 ± 0.33 bx 5.70 ± 0.0 bx 0.5 Cu+1.5 EDTA 5.66 ± 0.33 bx 5.66 ± 0.33 bx 6.00 ± 0.0 bx ± 0.01 ax 4.10 ± 0.33 ax 4.00 ± 0.02 ax 1.0 Cu 5.40 ± 0.33 bx 5.70 ± 0.01 bx 5.80 ± 0.01 bx 1.0 Cu+3.0 EDTA 5.70 ± 0.39 bx 5.80 ± 0.57 bx 6.33 ± 0.33 bx * : a, b ve c harfleri derişimleri belirlemek; x, y ve z harfleri günler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<0.05). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata 15

24 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU Belirli bir ortam derişiminin etkisinde serum LP aktivitesi süreye bağlı olarak hem Cu hem de Cu+EDTA karışımının etkisinde önemli bir değişim göstermediği saptanmıştır. Belirli bir sürede O. niloticus da serum LP aktivitesi üzerine Cu ve Cu+EDTA karışımlarının derişime bağlı etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistik analizi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.3. A, B ve C de verilmiştir. Ortamda bulunan Cu ve Cu+EDTA derişimi arttıkça LP aktivitesi kontrole göre artmıştır. Enzim aktivitesinde gözlenen bu artışlar Cu ve Cu+EDTA karışımının her birinin ortam derişimleri arasında istatistik ayrım göstermemiştir (P>0.05). 28 günlük süre sonunda yüksek Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisinde LP aktivitesi kontrole göre sırasıyla %58 ve %45 düzeyinde artış göstermiştir. A Kan Dokusundaki LP Düzeyi (U/L) Cu 0.5 Cu 1.0 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) 16

25 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU B 7 Kan Dokusundaki LP Düzeyi (U/L) Cu Cu 0.5 Cu Cu 0.0Cu 0 Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) C Kan Dokusundaki LP Düzeyi (U/L) Cu 1.0 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) Şekil 4.3. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda LP aktivitesi(u/l kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün). 17

26 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU AST Aktivitesi Bakır ve Cu+EDTA karışımının derişim ve süreye bağlı olarak O. niloticus un serum AST aktivitesine etkileri Çizelge 4.3 de verilmiştir. Belirli bir zaman sürecinde hem Cu hem de Cu+EDTA karışımının etkisinde AST aktivitesi kontrole göre artış göstermiştir (P<0.05). 14. günde 0.5 mgl -1 Cu ve 0.5 mgl -1 Cu+ 1.5 mgl -1 EDTA hariç denenen tüm süre ve derişimlerde serum AST aktivitesi, Cu ve Cu+EDTA arasında istatistik ayrım göstermiştir. Denenen tüm ortam derişimlerinde AST aktivitesi bakırın doğrudan etkisine oranla Cu+EDTA karışımının etkisinde daha fazla artış göstermiştir. Çizelge 4.3. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki SGPT(AST) aktivitesi (U/L kan) üzerine bakırın etkisi DERİŞİM (mg/l) SÜRE (GÜN) X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * ± 0.57 ax ± 0.57 ax ± 0.57 ax 0.1 Cu ± 0.57 bx ± 0.57 by ± 0.33 by 0.1 Cu+0.3 EDTA ± 0.57 cx ± 0.57 cy ± 0.57 cz ± 0.33 ax ± 0.88 ax ± 0.88 ax 0.5 Cu ± 0.33 bx ± 0.33 by ± 0.57 bz 0.5 Cu+1.5 EDTA ± 0.57 cx ± 0.33 bxy ± 0.57 cy ± 0.57 ax ± 0.57 ax ± 0.57 ax 1.0 Cu ± 0.33 bx ± 0.33 bx ± 0.57 by 1.0 Cu+3.0 EDTA ± 0.57 cx ± 0.57 cx ± 0.33 cy * : a, b ve c harfleri derişimleri belirlemek; x, y ve z harfleri günler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<0.05). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir ortam derişiminin etkisinde serum AST aktivitesi Cu ve Cu+EDTA karışımının etkisinde yüksek derişimlerde 7 ve 14 gün hariç denenen tüm derişimlerde süreye bağlı olarak artış gösterdiği saptanmıştır (P<0.05). 28 günlük 18

27 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU sürede 7 günlük süreye oranla yüksek Cu ve Cu+EDTA karışımının etkisinde AST aktivitesi %10 ve %7 düzeyinde artış göstermiştir. Belirli bir sürede O. niloticus da serum AST aktivitesi üzerine Cu ve Cu+EDTA karışımlarının derişime bağlı etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistik analizleri yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.4 A, B ve C de verilmiştir. Denenen tüm sürelerde ortamda bulunan Cu ve Cu+EDTA derişimi arttıkça AST aktivitesi kontrole göre artmıştır. Enzim aktivitesinde gözlenen bu artışlar Cu ve Cu+EDTA karışımının her birinin ortam derişimleri arasında istatistik ayrım göstermiştir (P<0.05). 28 günlük süre sonunda yüksek Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisinde AST aktivitesi kontrole göre sırasıyla %71 ve %81 düzeyinde artış göstermiştir. A Kan Dokusundaki AST Düzeyi (U/L) Cu 0.5 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) 19

28 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU B Kan Dokusundaki AST Düzeyi (U/L) Cu Cu 1.0 Cu Cu 0.0Cu 0 Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) C Kan Dokusundaki AST Düzeyi (U/L) Cu 0.1 Cu 0.5 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) Şekil 4.4. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda AST aktiviteleri (U/L kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün). 20

29 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU LDH Aktivitesi Bakır ve Cu+EDTA karışımının derişim ve süreye bağlı olarak O. niloticus un serum LDH aktivitesine etkileri Çizelge 4.4 de verilmiştir. Denenen tüm koşullarda Cu ve Cu+EDTA karışımının etkisinde LDH aktivitesi kontrole göre artış göstermiştir (P<0.05). 14 ve 28 günlük sürelerde yüksek derişimlerde serum LDH aktivitesi, Cu ve Cu+EDTA arasında istatistik ayrım göstermiştir. Denenen tüm ortam derişimlerinde LDH aktivitesi bakırın doğrudan etkisine oranla Cu+EDTA karışımının etkisinde daha fazla artış göstermiştir. Çizelge 4.4. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki LDH aktiviteleri (U/L kan) üzerine bakırın etkisi DERİŞİM (mg/l) SÜRE (GÜN) X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * ± 1.19 ax ± 2.91 ax ± 3.55 ax 0.1 Cu ± 1.33 bx ± 3.07 bx ± 1.42 by 0.1 Cu+0.3 EDTA ± 1.19 bx ± 4.72 by ± 0.45 by ± 1.20 ax ± 1.69 ax ± 2.87 ax 0.5 Cu ± 1.20 bx ± 1.25 by ± 1.39 by 0.5 Cu+1.5 EDTA ± 1.20 cx ± 2.49 cy ± 1.98 cy ± 2.81 ax ± 1.37 ax ± 1.93 ax 1.0 Cu ± 1.45 bx ± 1.92 by ± 1.15 bz 1.0 Cu+3.0 EDTA ± 1.11 bx ± 1.83 cy ± 2.15 cz * : a, b ve c harfleri derişimleri belirlemek; x, y ve z harfleri günler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<0.05). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata 21

30 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU Serum LDH aktivitesi Cu ve Cu+EDTA karışımın etkisinde 0.1 mgl -1 Cu ortam derişimnde 7 ve 14 gün hariç denenen tüm derişimlerde süreye bağlı olarak artış göstermiştir (P<0.05). Belirli bir sürede O. niloticus da serum LDH aktivitesi üzerine Cu ve Cu+EDTA karışımlarının derişime bağlı etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistik analizleri yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.5 A, B ve C de verilmiştir. Denenen tüm sürelerde ortamda bulunan Cu ve Cu+EDTA derişimi arttıkça LDH aktivitesi kontrole göre artmıştır. Enzim aktivitesinde gözlenen bu artışlar Cu ve Cu+EDTA karışımının her birinin ortam derişimleri arasında istatistik ayrım göstermiştir (P<0.05). 28 günlük süre sonunda yüksek Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisinde LDH aktivitesi kontrole göre sırayla %12 ve %14 düzeyinde artış göstermiştir. A Kan Dokusundaki LDH Düzeyi (U/L) Cu 0.5 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) 22

31 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU B Kan Dokusundaki LDH Düzeyi (U/L) Cu 0.5 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) C Kan Dokusundaki LDH Düzeyi (U/L) Cu 0.5 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) Şekil 4.5. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda LDH aktiviteleri (U/L kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün). 23

32 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU ALP Aktivitesi Bakır ve Cu+EDTA karışımının derişim ve süreye bağlı olarak O. niloticus un serum ALP aktivitesine etkileri Çizelge 4.5 de verilmiştir. Cu ve Cu+EDTA karışımının etkisinde ALP aktivitesi kontrole göre artma gösterdiği saptanmıştır (P<0.05). Enzim aktivitesinde gözlenen bu artışlar tüm sürelerde yüksek derişimlerde Cu ve Cu+EDTA arasında istatistik ayrım göstermiştir. Denenen tüm ortam derişimlerinde ALP aktivitesi Cu+EDTA karışımına oranla bakırın doğrudan etkisinde daha fazla artış göstermiştir. Çizelge 4.5. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki ALP aktiviteleri (U/L kan) üzerine bakırın etkisi DERİŞİM (mg/l) SÜRE (GÜN) X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * ± 0.33 ax ± 0.33 ax ± 0.33 ax 0.1 Cu ± 0.66 bx ± 1.45 bx ± 0.66 bx 0.1 Cu+0.3 EDTA ± 1.00 bx ± 0.81 bx ± 0.88 ay ± 0.33 ax ± 0.57 ax ± 0.33 ax 0.5 Cu ± 0.66 bx ± 1.33 bx ± 0.57 by 0.5 Cu+1.5 EDTA ± 0.66 cx ± 1.76 cx ± 0.66 bx ± 0.33 ax ± 0.57 ax ± 0.33 ax 1.0 Cu ± 0.66 bx ± 1.45 bx ± 1.45 by 1.0 Cu+3.0 EDTA ± 1.73 bx ± 0.33 bx ± 1.15 bx * : a, b ve c harfleri derişimleri belirlemek; x, y ve z harfleri günler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<0.05). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir ortam derişiminde serum ALP aktivitesi süreye bağlı olarak Cu+EDTA karışımının etkisinde 0.1 mgl -1 Cu+0.3 mgl -1 EDTA ortam derişiminde 28. günde azalmış, diğer ortam derişimlerinde bir değişim göstermemiştir (P>0.05). 24

33 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU Doğrudan bakırın etkisinde ise 0.5 ve 1.0 mgl -1 Cu ortam derişimlerinde 28. günde bir azalma gösterdiği saptanmıştır. Belirli bir sürede O. niloticus da serum ALP aktivitesi üzerine Cu ve Cu+EDTA karışımlarının derişime bağlı etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistik analizleri yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.6 A, B ve C de verilmiştir. Denenen tüm sürelerde ortamda bulunan Cu ve Cu+EDTA derişimi arttıkça ALP aktivitesi kontrole göre artmıştır. 28 günlük süre sonunda yüksek Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisinde ALP aktivitesi kontrole göre sırayla %45 ve %40 düzeyinde artış göstermiştir. A Kan Dokusundaki ALP Düzeyi (U/L) Cu 0.5 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) 25

34 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU B Cu 1.0 Cu Kan Dokusundaki ALP Düzeyi (U/L) Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) C Kan Dokusundaki ALP Düzeyi (U/L) Cu 0.1 Cu 0.5 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) Şekil 4.6. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda ALP aktiviteleri (U/L kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün). 26

35 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU ALT Aktivitesi Bakır ve Cu+EDTA karışımının derişim ve süreye bağlı olarak O. niloticus un serum ALT aktivitesine etkileri Çizelge 4.6 de verilmiştir. Denenen tüm koşullarda Cu ve Cu+EDTA karışımının etkisinde ALT aktivitesi kontrole göre artış göstermiştir (P<0.05). 7. ve 28. günde yüksek ortam derişiminde serum ALT aktivitesi, Cu ve Cu+EDTA arasında istatistik ayrım göstermiştir. Denenen tüm ortam derişimlerinde ALT aktivitesi Cu+EDTA karışımına oranla bakırın doğrudan etkisinde daha fazla artış göstermiştir. Çizelge 4.6. Bakır ve bakır + EDTA karışımının etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusundaki SGOT(ALT) aktiviteleri (U/L kan) üzerine bakırın etkisi DERİŞİM (mg/l) SÜRE (GÜN) X ± Sx * X ± Sx * X ± Sx * ± 1.92 ax ± 1.15 ax ± 1.20 ax 0.1 Cu ± 1.76 bx ± 1.15 by ± 1.05 bz 0.1 Cu+0.3 EDTA ± 1.15 bx ± 1.45 by ± 2.40 by ± 1.92 ax ± 1.97 ax ± 2.02 ax 0.5 Cu ± 1.15 bx ± 3.84 by ± 0.88 by 0.5 Cu+1.5 EDTA ± 1.85 bx ± 0.88 by ± 3.38 cy ± 0.88 ax ± 2.18 ax ± 1.45 ax 1.0 Cu ± 1.15 bx ± 1.20 by ± 1.33 bz 1.0 Cu+3.0 EDTA ± 0.88 cx ± 0.88 by ± 2.08 cz * : a, b ve c harfleri derişimleri belirlemek; x, y ve z harfleri günler arası ayrımı belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında istatistik ayrım vardır (P<0.05). X ± Sx : Aritmetik ortalama ± Standart hata Belirli bir ortam derişiminin etkisinde serum ALT aktivitesi süreye bağlı olarak hem Cu hem de Cu+EDTA karışımının etkisinde azalma göstermiştir 27

36 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU (P<0.05). Enzim aktivitesinde gözlenen bu azalma diğer sürelere oranla 28. gün sonunda yüksek düzeyde gerçekleştiği saptanmıştır. Belirli bir sürede O. niloticus da serum ALT aktivitesi üzerine Cu ve Cu+EDTA karışımlarının derişime bağlı etkisini saptamak amacıyla verilerin istatistik analizleri yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.7 A, B ve C de verilmiştir. Denenen tüm sürelerde ortamda bulunan Cu ve Cu+EDTA derişimi arttıkça ALT aktivitesi kontrole göre artmıştır. 28 günlük süre sonunda yüksek Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisinde ALT aktivitesi kontrole göre sırayla %26 ve %17 düzeyinde artış göstermiştir. A Kan Dokusundaki ALT Düzeyi (U/L) Cu Cu Cu Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) 28

37 4. BULGULAR Sabahattin ASLANYAVRUSU B Kan Dokusundaki ALT Düzeyi (U/L) Cu 1.0 Cu Cu Cu 0.0Cu 270 Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) C Kan Dokusundaki ALT Düzeyi (U/L) Cu 0.5 Cu 0.1 Cu 0.0 Cu 0.0Cu Cu Cu+EDTA Metal Derişimi (mg/l) Şekil 4.7. Bakır ve bakır+edta karışımların etkisine bırakılan O. niloticus un kan dokusunda ALT aktiviteleri (U/L kan) üzerine Cu ve Cu+EDTA ortam derişimlerinin etkisi (A: 7. gün, B: 14. gün, C:28. gün). 29

38 5. TARTIŞMA Sabahattin ASLANYAVRUSU 5. TARTIŞMA Ağır metaller yer kabuğunun doğal bileşenleridirler ve çok düşük düzeylerde bulunurlar. İz miktarlarda hemen tüm canlıların gereksinim gösterdiği bakır yüksek derişimlerde ise toksik etki yapar. Bu araştırmada 1.0 mg/l Cu ortam derişiminde deneylerin sona erdirildiği 28 günlük süre içersinde balıklarda ölüm gözlenmemiştir. Balıkların ağır metallerin bulunduğu ortamlarda yaşamlarını sürdürebilmeleri detoksifikasyon mekanizmalarının iyi olmasından kaynaklanmaktadır. Ağır metaller hemen tüm organizmalarda vücuda besin, içilen su ve hava yoluyla alınmakta ve çeşitli dokularda birikebilmektedir. Balıklar ağır metalleri solungaçları aracığıyla doğrudan sudan almaktadırlar. Solungaç yüzeyinde bağlanmada oluşan doygunluk sonucu metal intraselüler kompartmanlara geçmektedir. Bakırın büyük bir kısmı solungaçlarla alınmakta ve solungaçların basolateral membranlarındaki Cu-ATP az larla kana taşınırlar (Campbell ve ark., 1999). Oreochromis mossambicus da bakır kan plazmasında albümin ve transküpreine bağlanarak karaciğere taşınır (Pelgrom ve ark., 1995 a). Balık dokularında metal birikimi etkide kalınan süre ve derişime bağlı olduğu gibi sıcaklık, balığın yaşı, suyun kimyasal özelliği, diğer metallerle etkileşim ve balığın metabolik aktivitesi gibi diğer faktörlere bağlı olarak değişim göstermektedir (Heath, 1987). Bu araştırmada O. niloticus un kan dokusunda bakır birikimi etkide kalınan süre ve ortam derişimlerine bağlı olarak arttığı saptanmıştır. Balıklarda yapılan araştırmalarda bakır birikiminin süreye ve derişime bağlı olarak arttığı bir çok araştırıcı tarafından belirtilmiştir (Kargın ve Erdem, 1991; Erdem ve Kargın, 1992; Pelgrom ve ark., 1995 b; Handy ve ark., 1999; Coğun ve Kargın, 2004). Bakır ve çinkonun etkisine bırakılan S. gairdneri de kanda ppm ve ppm Cu biriktiği saptanmıştır (Bettger ve ark., 1987). Bakırın subletal etkisine bırakılan O. mossambicus da kan plazmasında bakır birikiminin arttığı belirlenmiştir (Pelgrom ve ark., 1995 a). O. niloticus un kan dokusunda bakır düzeyinin artması büyük bir olasılıkla solungaçlar tarafından alınan bakırın kan plazması yoluyla iç organlara taşınmasından diğer bir ifadeyle kanın taşıyıcı sistem olmasından kaynaklanmaktadır. Kandaki bakır düzeyi deneylerin sona erdirildiği

39 5. TARTIŞMA Sabahattin ASLANYAVRUSU gün sonunda durağan bir değere ulaşmamıştır. Bunun sudaki bakırın solungaçlar tarafından sürekli olarak alınarak iç organlara kan plazması yoluyla taşınmasına bağlı olabileceği düşünülmektedir. Akuatik organizmalarda EDTA gibi kompleksleştirici bileşiklerin dokularda metal birikimini önemli ölçüde azalttığını belirleyen çok sayıda araştırma yapılmıştır (Muramoto, 1983; O Brien ve ark., 1990; Liu ve ark., 2006). Bu çalışmada denenen tüm koşullarda EDTA O. niloticus un kan dokusunda bakır birikimini önemli düzeyde azalttığı belirlenmiştir. O. mossambicus ile yapılan bir çalışmada bakır bulunan ortama EDTA eklendiğinde, bakırın tek başına etkisinde bulunan hayvanlara göre dokulara bakır alınımı oldukça azalmıştır (James ve ark., 1998). Paracheirodon innesi de Cu+EDTA, Cu+Tartarik asit ve Cu+Oksalik asit ile yapılan bir çalışmada balıklarda Cu alınımının, Cu+EDTA karışımında diğer karışımlara göre daha düşük olduğu saptanmıştır (Tao ve ark., 2002). Kargın (1996) Tilapia zilli de Cd birikimi üzerine EDTA nın etkisi ile ilgili yaptığı bir çalışmada EDTA nın T. zilli nin dokularında Cd birikimini önemli ölçüde azalttığını saptamıştır. Bakırın etkisine bırakılan S. gairdneri de kan dokusunda biriken bakırın ortama EDTA ilavesiyle % 88 nin plazmadan uzaklaştığı saptanmıştır (Bettger ve ark., 1987). Bu araştırmada 28 gün süreyle Cu+EDTA karışımın bırakılan balıkların kan dokusundaki bakır birikimi, bakırın doğrudan etkisine bırakılan balıklara oranla oldukça düşük olduğu belirlenmiştir. 28. günde kan dokusunda bakır birikiminde 0.1 mg/l Cu mg/l EDTA karışımındaki balıklarda 0.1 mg/l Cu un etkisindeki balıklara oranla %33 ve 0.5 mg/l Cu mg/l EDTA karışımındaki balıklarda, 0.5 mg/l Cu etkisindeki balıklara oranla %23 düzeyinde bir azalmanın olduğu saptanmıştır. Akuatik organizmalarda yapılan çalışmalarda EDTA nın dokuda metal birikimini engelleme etkisini, hücre yüzeyi üzerine çökelen metallerle kompleks oluşturarak bunları vücuttan atmalarıyla yaptıkları ileri sürülmektedir (Muramoto, 1982,1983). Son yıllarda biyokimyasal biyomarkırların birçoğu hem doğal ortamlarda hem de laboratuar koşullarında birçok akuatik organizma türlerinde kimyasal kontaminantların etkilerinin belirlenmesinde çok yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Biyokimyasal markırlar toksikoljik, ekotoksikolojik ve farmakoljik araştırmalarda geniş bir şekilde kullanılmakta, organizmaların ksenobiyotiklere tepkilerinin 31