T.C ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ

Transkript

1 T.C ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ İN VİTRO KÜLTÜR ESASLARI Bitki Doku Kültürü Dersi Hazırlayanlar Nazmiye Özdemir Edanur Kandemir Ayla Çelik Şule Küçükhüseyin Emre Demir Süleyman Selçuk Dr. Öğr. Üyesi Yılmaz KAYA SAMSUN

2 İÇİNDEKİLER 1. İn vitro kültür tipleri 2. İn vitro kültür laboratuvarının organizasyonu 3. Bitki hücre ve doku kültürlerinin beslenmesi ve besi ortamları 4. Bitki hücre ve doku kültürlerinde sık kullanılan bazı bitki besin ortamları 5. Besi ortamının hazırlanması 6. Sterilizasyon ve yöntemleri 7. İn vitro doku kültüründe steril koşulların sağlanması 8. İzolasyon inokülasyon ve alt kültüre alma 2

3 Giriş Bitkilerde in vitro kültür denildiğinde, bitki tohum, embriyo, organ doku, hücre ve protoplastların steril koşullarda suni besi ortamında kültürü anlaşılır. İN VİTRO KÜLTÜR AŞAĞIDAKİ ÖZELLİKLERİ İLE KARAKTERİZE EDİLİR ; İn vitro kültür, mikroorganizmalardan ( bakteri, mantar, virüs ) ve diğer bitki zararlılarından arındırılmış ortamlarda yapılır. Çevre koşulları ; fiziksel, besin maddeleri ve hormon faktörleri yönünden optimize edilir. İn vitro kültürde genellikle bitkinin normal gelişim seyri değiştirilir ve izole edilmiş bir bitki dokusundan organize olmamış doku oluşturulur. Organize olmamış bu dokudan da değişik yollarla bitki rejenerasyonu gerçekleştirilir. İn vitro kültürün uygulanmasında bitkilerin bilinen klasik kültür yöntemlerine göre çok daha küçük bir alana gereksinim duyulur. İn vitro kültür, bitki hücre ve protoplastlarının kültür edilebilmelerine ve manipülasyonuna olarak sağlar. 3

4 İN VİTRO KÜLTÜR TİPLERİ İn vitro kültürde kullanılan bitki parçalarına bağlı olarak 6 farklı in vitro kültür tipi ortaya çıkar. 4

5 İNTAKT BİTKİ KÜLTÜRÜ Bitki tohumları in vitro ortamda ekilir ve bu tohumlar çimlenerek bitkiyi oluşturur. EMBRİYO KÜLTÜRÜ Tohum kabuğu ve besi dokudan izole edilmiş embriyoların in vitro koşullarda kültürünü kapsar. ORGAN KÜLTÜRÜ Bitkinin yaprak, sürgün ucu, çiçek durumu, anter gibi organlarının kültürü söz konusudur. KALLUS KÜLTÜRÜ Farklılaşmış bir doku izole edilir ve yeniden farklılaşmasına olanak sağlanırsa, farklılaşmamış doku anlamına gelen kallus oluşur. Bu işleme kallus kültürü denir. 5

6 HÜCRE KÜLTÜRÜ Doku, kallus veya süspansiyon kültürlerinden mekanik veya enzimlerin kullanılması ile elde edilen hücrelerin kültür edilmesidir. PROTOPLAST KÜLTÜRÜ Hücre duvarının enzimlerle parçalanması sonucu elde edilen protoplastların kültürüdür. 6

7 İN VİTRO KÜLTÜR LABORATUVARININ ORGANİZASYONU İn vitro kültürde sterilite çok büyük bir önem taşır. Bu tip besi ortamlarında mikroorganizmalar hızla gelişerek, daha yavaş büyüyen bitki hücre, doku ve organlarını tahrip eder ve ölümlerine neden olurlar. İn vitro kültür laboratuvarı öncelikle steril çalışmaya olanak sağlayacak şekilde organize edilmelidir. Bu koşulun yerine getirilebilmesi için, bir in vitro kültür laboratuvarı 3 ana bölümden oluşmalıdır. ÖN HAZIRLIK ODASI KÜLTÜR HAZIRLAMA ODASI Kabin içine horizantal ( yatay ) olarak steril hava veren kabinler Kabin içine vertikal ( düşey ) olarak steril hava veren kabinler İNKÜBASYON ODASI 7

8 ÖN HAZIRLIK ODASI Besi ortamlarının hazırlandığı, in vitro kültürde kullanılacak bitki parçalarının temizlenip sterilize edilebillir duruma getirildiği, kullanılan kap ve malzemenin yıkanıp temizlendiği bölümdür. 8

9 KÜLTÜR HAZIRLAMA ODASI : İn vitro kültür işleminin yapılacağı kısım, temiz ve hava cereyanının olmadığı bir yer olmalıdır. Bu amaçla, ya tamamen müstakil steril odalar veya steril kabinler kullanılır. Steril kabin kullanmak ucuz ve pratiktir. Steril havanın kabin içine veriliş tarzına göre steril kabinlerin iki tipi vardır KABİN İÇİNE HORİZANTAL ( YATAY ) OLARAK STERİL HAVA VEREN KABİNLER : Oda içindeki hava steril kabinin üst kısmındaki bir filtreden geçerek kabinin arka kısmında bulunan daha hassas filtrelere gelir. Bu filtrelerden geçen hava kabin içine basınçlı bir şekilde yatay olarak verilir. Bu tip kabinler ucuz ve daha basit yapıdadırlar. KABİN İÇİNE VERTİKAL ( DÜŞEY ) OLARAK STERİL HAVA VEREN KABİNLER : Ön filtrasyondan geçen hava kabinin üst kısmında bulunan hassas filtrelerden geçerek basınçlı bir şekilde alt kısma doğru verilir. Steril hava yukarıdan aşağıya doğru aktığı için patojen organizmalarla çalışılması durumunda çalışan kişinin bu patojenlerden etkilenmesi önlenmiş olur. 9

10 İNKÜBASYON ODASI Çoğu bitki türleri, sabit sıcaklık ve ışık içeren ortamlarda daha iyi gelişirler. Sıcaklığı, termostata bağlı bir klima ile istenilen düzeyde tutabilen ve zaman saati ile ışık rejimi ayarlanabilen izole edilmiş bir oda bu amaca hizmet edebilmektedir. Aydınlanma suni olarak floresan lambaları ile sağlanır. Oda içinde kültür kaplarının konulacağı raflar bulunmalıdır. Kontrollü odalar yanında, sıcaklık ve ışık durumu ayarlanabilen iklim dolapları olmalıdır. Eğer süspansiyon kültürleri ile çalışılıyorsa, çalkalama aletinin bulunması gerekir. 10

11 BİTKİ HÜCRE VE DOKU KÜLTÜRLERİNİN BESLENMESİ VE BESİ ORTAMLARI Bir bitkinin in vitro büyüme ve gelişmesi aşağıdaki faktörler tarafından belirlenir. o o o o Bitkinin Genetik Yapısı Besin Maddeleri : Su, Makro ve Mikro besin elementleri, şeker Fiziksel Büyüme Faktörleri : Işık, Sıcaklık, ph Bazı Organik Maddeler : Büyüme regülatörleri, vitaminler 11

12 Besi Ortamının Bileşimi Su İn vitro kültürde kullanılan besi ortamlarının % 95 ini oluşturan suyun inorganik maddeler, mikroorganizmalar ve organik maddelerden arındırılmış olmalıdır. Suyun arındırılması yöntemleri ; a. Absorbsiyon Filtrasyon: Organik maddeleri ve kloru uzaklaştırmak için aktif karbonun kullanılmasıdır. b. Deiyonizasyon : Su sentetik resinlerden geçirilir. c. Destilasyon: Suyun kaynatılıp sıvı fazdan gaz fazına geçirilip tekrar sıvı hale getirilmesi işlemidir. d. Membran Filtrasyon: Suyun filtereden geçirilmesidir e. Ters Osmos Yöntemi: Suyun yarı geçirgen zardan basınç altından geçirilmesidir. 12

13 Agar Yüksek moleküllü bir polisakkarit olan agar, deniz yosunlarından fabrikasyonla saflaştırılıp yıkanarak elde edilir. Besi ortamlarında kullanılan agarın konsantrasyonu %0.6-0,8 kadardır. İn vitroda agar yerine kullanılan alternatif maddeler; Biogel P200 Alginat Gelrit Temiz plastik köpük veya cam elyaf Filtre kağıtları Selüloz kristalit agregatlardan elde edilen bir madde Katılaştırmanın kulllanılmaması 13

14 Şeker Besi ortamlarında en önemli komponentlerden biri olan şeker, in vitro kültürde fotosentezin olmaması veya az olması nedeniyle büyüme ve gelişme için gereklidir. Besi ortamlarında %1-5 konsantrasyonlarında sakkaroz kullanılır. 14

15 İnorganik Tuzlar Bir bitki hücresi N, P, K,Ca,S, Mg gibi inorganik elementere milimol miktarda gereksinim duyar. Bitki hücreleri yalnızca nitrat azotu içeren besi ortamlarında büyiye bilir. Bitki hücreleri üre, glutamin ve kazain hidrolizat gibi diğer azot kaynaklarını içeren besi oratamlarında da iyi gelişebilirler. Potasyum genellikle besi ortamlarında nitrat veya kloid formunda yer alır. P, Mg, Ca, S ün konsatrasyonu 1-3 mm arasında değişir. Fe, Mn, Sn, P, Cu, Mo gibi mikro elementlere mikromol konsatrasyomlarında gereksinim duyulur. 15

16 Vitaminler Doğada bitkiler büyüme ve gelişmeleri için gereksinim duyduğu vitaminleri sentezlerler kültüre alındıklarında ise bazı vitaminler kısıtlayıcı olabilmektedir. B1 vitamini olan thiominin Nikotin asit Pyrodoksin Pantothenik asit ve biotin gibi vitaminleride içermektedir. 16

17 Büyüme Düzenleyicileri İn-vitro kültürde en fazla kullanılan büyüme düzenleyicileri; Auxinler, sitokininler ve giberalinlerdir. Bazı kültürlerde absisik asit ve etilene de ihtiyaç duyulur. Auxinler; Hücre uzamasını ve bölünmesini, dokuların şişmesini ve kök oluşumunu teşvik ederler. Sürgün oluşumunu engellerler. İAA(İndolasetik asit) bilinen doğal auxindir. 17

18 Sitokininler; Sitokininler adenin derivatıdır ve hücre bölünmesini teşvik eder. Yüksek konsantrasyonlarda kullanıldıklarında sürgün oluşumuna neden olur ve genellikle kök oluşumunu engellerler. Kinetin, BAP,IPA, Zeatin ve 2IP en çok kullanılan sitokininlere örnektir. Giberellin; Bitkilerde boğum aralarının uzamsını, meristem ve gözlerin büyümesini teşvik eder. Genellikle adventif kök ve sürgün oluşumunu engellerler. 18

19 Organik Azot Besi ortamlarında organik azot kaynağı olarak kullanılan bileşikler aminoasitler, glutamin, asparagin ve adenindir. Aminoasitler bitki hücre ve doku kültüründe olumsuz etki yapabileceği için bu asitlerin kullanımında dikkatli olmanız gerekir. En sık kullanılan aminoasitler glycin, asparagin L-tyrosin,L-arginin ve Cysteindir. 19

20 Kompleks Maddeler Bitki hücre ve doku kültürlerinde; malt ekstratları, hindistan cevizi sütü,mısır endospermi, portakal ve domates suyu gibi birçok ekstratlar denenmiştir. Bu gibi maddelerin yüksek konsantrasyonlarda kullanıldıklarında hücre büyümesini olumsuz yönde etkilemektedirler. 20

21 Aktif Karbon Bitki hücre ve doku kültürü konsantrasyonalarında kullanılan aktif karbon odunun yüksek sıcaklık ve buhar basıncı altında karbonlaştırılmasıyla elde edilir. Aktif karbonun bazı avantaj ve dezavantajları ; Besi ortamında oluşan toksik fragmentleri ve toksik bileşikleri absorbe eder. Hücre ve dokuları yaralanmalardan koruyabilir. Kültürlerin ışık klimasını değiştirir. Bu durum kök oluşumunu ve büyümeyi etkileyebilir. Aktif karbon ph yı stabilize eder. Aktif karbon ilavresi dışında aşağıdaki uygulamalarda yapılabilir; Besi ortamını bir polimer olan PVP nin(polivinilpyrolidone) ilave edilmesi. 21

22 Besi ortamına sitrik asit,askorbik asit, thiourea ve ya L- sistin gibi antioksidanları ilave edilmesi. Glutamin, argenin ve asparagin aminasitlerinin besi ortamına ilave edilmesi. Sık sık kültürlerin besi ortamını değiştirmek pigment oluşumunu yavaş yavaş önler. Sıvı ortam kullanılması toksik maddelerin hızlı bir şekilde ortamdan seyreltik bir hale gelmesini sağlar. Eksplantların kültür ortamını konulmadan önce steril suya batırılması yara yerlerinden çıkan salgıyı azaltır. Eksplantlarda mümkün olduğunca az yara yeri oluşturulması ile bu yara yerlerinden çıkan salgıların azaltması mümkün olur. 22

23 ph arasında değişen ph derecelerinin invitro büyüme için uygun olduğu kabul edilmektedir. Besi ortamı ph sı çok düşükse bazı olumsuz olaylar ortaya çıkabilir; Agar katılığını kaybeder. Fosfat ve demir tuzları çökelir. Vitamin B1 ve pantothenik asit stabilitesini kaybeder. Amonyum iyonlarının alımı güçleşir. Kültür sırasında ortamın ph sı düşüyorsa besi ortamı hemen yenilenmelidir. 23

24 Bitki Hücre ve Doku Kültürlerinde Sık Kullanılan Bazı Bitki Besin Ortamları

25 MS ve LS ortamlarının mineral madde kompozisyonu, özellikle bitki rejenerasyon ortamlarında çok sık kullanılır. B5 ortamı veya bu ortamın değişik varyasyonları, hücre ve protoplast kültürlerinde yaygın olarak kullanılır. B5 ortamı orijinal olarak süspansiyon ve kallus kültürleri için geliştirilmiştir. Fakat bu ortam bitki rejenerasyon ortamı olarak da kullanılır.

26 MS ortamı ile B5 ortamı arasındaki temel fark, B5 ortamının MS ortamına göre daha düşük nitrat ve amonyum içermesidir. N6 ortamı tahıllarda anter kültürü için geliştirilmiştir. Ancak diğer tip tahıl kültürlerinde de başarı ile kullanılmaktadır. N6 ortamının tahıl doku kültürleri için en uygun ortam olduğu kabul edilmesine karşılık, diğer besi ortamları da tahıl doku kültürlerinde başarıyla kullanılmaktadır. 26

27 Besi Ortamının Hazırlanması Stok Solüsyonların Hazırlanması: Besi ortamı gerekli olduğunda her seferinde bu maddelerin tek tek tartılıp besi ortamı hazırlanması çok vakit kaybına neden olur. Bu nedenle, her labaratuvarda besi ortamının komponentlerinin yoğun konsantrasyondaki stok solüsyonları hazırlanır. 27

28 Büyüme Düzenleyicilerinin Stok Solüsyonlarının Hazırlanması Çoğu büyüme düzenleyicinin suda çözünmesi zor olduğundan genelde auxinler 1N KOH sitokininler ise 1N HCI içerisinde ve ısı etkisi altında kolayca çözülebilir. Bunun için büyüme düzenleyicisinin tartılan miktarı önce birkaç damla 1 N KOH veya 1 N HCI içerisinde magnet karıştırıcı üzerinde çözülür. Daha sonra bidestile su ilave edilerek arzu edilen hacim sağlanır. Hazırlanan büyüme düzenleyicisi stok çözeltileri de pyrex cam şişeler içerisinde buzdolabında muhafaza edilir. 28

29 Makro ve mikro elementlerin stok solüsyonlarının hazırlanması Besi ortamlarında bulunması gereken makro ve mikro elementlerin stok solüsyonlarının hazırlanmasında aşağıdaki işlem sırası izlenir. 1) FeSO4 7H2O ve Na2-EDTA hariç besi ortamının bir litresinde bulunması gerekli makro ve mikro elementlerin miktarlarının 10 ar katı hassas bir terazi ile tartılır. 2) Tartılan makro ve mikro elementler, içerisinde 200 cc bidestile su bulunan ve bir magnetik karıştırıcı üzerine yerleştirilmiş olan 2 litrelik bir erlanmayer kabına sırasıyla ilave edilir. 3) İlave edilen makro ve mikro elementler su içerisinde iyice çözüldükten sonra, karışımın hacmi bir litreye tamamlanır. 4) Bir litrelik karışım 150 şer ml lik 10 adet küçük plastik kaplara 100 er ml paylaştırılır. 29

30 FeSO4, 7H2O ve Na2-EDTA nın ise jelatı hazırlanır. Bu jelatin hazırlanmasında aşağıdaki işlem sırasıyla izlenir: 1)5,57 gr FeSO4, 7H2O ve 7.45 Na2-EDTA hassas terazide tartılır. 2) İçerinde 200 cc bidestile su bulunan ve magnetik karıştırıcı üzerine yerleştirilmiş olan 1 litrelik erlenmayer kabı içine tartılan 7.45 gr Na2-EDTA ilave edilir. Magnetik karıştırıcının karıştırma sistemine ilave olarak ısıtma sistemi çalıştırılır.çözelti 90 C ye geldiğinde çözeltiye tartılmış olan 5.57 gr FeSO4 7H2O ilave edilir ve çözelti yeterince karıştırılır. FeSO4 7H2O yeterli çözündükten sonra, çözelti soğumaya bırakılır. Çözeltinin sıcaklığı oda sıcaklığına düşünce hacim 500 ml ye tamamlanır. Hazırlanmış olan jelat koyu renkli pyrex bir cam şişe içerisinde oda sıcaklığında ve direkt güneş ışığı almayan bir yerde muhafaza edilir. 30

31 Vitamin Stok Çözeltilerinin Hazırlanması Besi ortamında bulunan her vitaminin genellikle 100 mg/100 ml lik stok çözeltileri hazırlanır. Bunun için, söz konusu vitaminin 100 mg ı hassas terazi ile tartılır ve tartılan miktar ml bidestile suda çözüldükten sonra hacim 100 ml ye tamamlanır. Hazırlanan vitamin çözeltileri üzerlerinde hazırlanma tarihleri, hangi vitamin oldukları ve konsantrasyonlarını içeren etiketler bulunan pyrex cam şişelere doldurulur ve buzdolabında muhafaza edilir. 31

32 Sterilizasyon Nedir Bir madde ya da bir cismin birlikte bulunduğu mikroorganizmaların tüm şekillerinin (sporlar dahil) öldürülmesi, tahrip edilmesi veya ortamdan uzaklaştırılmasıdır. 32

33 Sterilizasyon Yöntemleri Fiziksel olarak, gaz buharları, kimyasal ajanlar ile yapılan sterilizasyon olarak üçe ayrılır. 33

34 Fiziksel Yöntemler Fiziksel yöntemlerle yapılan sterilizasyon işlemini genelde üç grup altında toplamak mümkündü Isı ile Sterilizasyon Yapılması kolay ve ucuz olduğundan ve iyi sonuç verdiğinden sterilizasyonda en çok ısı kullanılır İyonize Eden Işılarla Sterilizasyon Suyun ve mikrobiyolojide kullanılan bazı maddelerin sterilizasyonu için, iyonize eden ışınların etkisinden faydalanılı Mekanik Olarak Yapılan Sterilizasyon Yüksek ısıya dayanıksız çeşitli sıvıları steril etmek amacıyla kullanılır. Bu yöntem sıvı bir ortamda bulunan mikroorganizmaların çeşitli filtrelerden geçirilerek tutulması ve süzüntüye geçmesinin engellenmesi esasına dayanır. 34

35 Kimyasal Yöntemi Çeşitli kimyasal maddeler kullanılarak gerçekleştirilir. Daha çok patojen mikroorganizmaların kontrol altına alınması için yapılan bir işlemdir Gazlarla Kimyasal Sterilizasyon Genellikle kullanılan gaz etilen oksittir. Bu gaz mikroorganizmaların bütün türlerine etkilidir. Havalandırma, malzemenin C de, 8 12 saat veya oda ısısında 7 gün bırakılması ile gerçekleştirilir Sıvılarla Kimyasal Sterilizasyon Uygun olarak kullanıldığında bakteri, mantar, tüberküloz basili ve virüslerin tüm şekillerini yok eder. Sterilizasyon solüsyonu olarak genellikle gluteraldehit ve formaldehit kullanılır. 35

36 Sterilizasyonda kullanılan başlıca kimyasal maddeler; Asitler, Alkaliler, Halojenler, Ağır metaller, Kuarter amonyum bileşikleri, Fenolik bileşikler, Aldehitler, Ketonlar, Alkoller, Aminler Peroksitlerdir. 36

37 İn vitro doku kültüründe steril koşulların sağlanması Cam ve Metalik Malzemelerin Sterilizasyonu İn vitro kültür çalışmalarında cam ve metalik maddeler bir fırında kuru sıcaklık uygulaması ile steril hale getirilebilir. Bakterilerin ve özellikle sporların kuru sıcaklığa çok dayanıklı olduğu bilinmektedir. Yapılan çalışmalarda bir bakteri cinsinde bile farklı türleri yok etmek için gerekli olan sıcaklık derecesi ve sıcaklığın uygulama süresinin farklı olduğu saptanmıştır. Bu nedenle, kuru sıcaklık uygulaması ile steril edilecek araç ve gereçlerin öncelikle çok iyi temizlenmiş olması gerekir. Genellikle, in vitro kültürde kullanılan araç ve gereçler kuru sıcaklık uygulaması ile sterilizasyonu; C de 3 saat uygulanmasıyla yapılır. 37

38 Besi ortamının sterilizasyonu Besin ortamları otoklavda 121 C sıcaklıkta yüksek basınç altında (1.05 kg/cm2) belirli bir süre tutularak ya da por genişliği 0.22µ olan filtrelerden geçirilerek steril kaplar içerisine süzme yoluyla mikroorganizmalarından arındırılmaktadır. Besin ortamlarının otoklavda tutulma süreleri hacimleri ile ilişkilidir. Sterilizasyon işlemi başladıktan sonra örneğin ml hacimdeki besin ortamı için 20 dakikalık süre yeterli olabilmektedir. Sıcaklığa Hassas Besi Ortamı Bileşenlerinin Sterilizasyonu Besi ortamında bulunan bileşenlerin bazı kimyasal maddeler yüksek sıcaklıklara dayanıksızdır. Bu maddeler yüksek sıcaklıklarda parçalanabilirler. Bu nedenle yüksek sıcaklıklara dayanıksız olan vitaminler, karbonhidratlar ve büyüme regülatörlerinin sterilizasyonları soğuk filtrasyon yöntemi ile yapılır. Bu yöntemde, sterilize edilecek çözelti genellikle 0.2 µ lük por çapına sahip steril filtrelerden geçer. 38

39 İn Vitro Sterilizasyonunda Kullanılacak Bitki Materyallerinin Sterilizasyonu İn vitro kültürde en önemli enfeksiyon kaynaklarından birisi kültürde kullanılan bitki materyalidir. Tarla koşullarında yetiştirilen bitkiler çok sayıda mikroorganizmaya konakçılık eder. Bu mikroorganizmaları taşıyan eksplantatlar besi ortamına konulduğunda, besi ortamına mikroorganizmalar bulaşır ve eksplantat kısa süre içinde canlılığını kaybeder. Bitki materyalinin sterilizasyonunda değişik kimyasal maddelerden yararlanılır. Bu kimyasallar; % 1 lik sodyum hipoklorit çözeltisi % 7 lik doymuş kalsiyum hipoklorit çözeltisi % 1 lik brominli su çözeltisi % 70 lik alkol % 0.2 lik civa klorit klorit çözeltisi % 10 luk hidrojen peroksit çözeltisi % 1 lik gümüş nitrat çözeltisi 39

40 Kullanılacak bitki eksplantatına bağlı olarak, yapılacak ön sterilizasyon işlemi, kullanılacak sterilizasyon çözeltisi, konsantrasyonu ve sterilizasyon süresi de değişir. 40

41 Bitki materyali iyi bir şekilde sterilize edildiği halde daha sonra kültürlerde enfeksiyon ortaya çıkmış olabilir. Bunlar; Kullanılan bitki materyali iç kısmından enfekte edilmiş olabilir. Çalışan kişi yeterli ölçüde steril çalışmamış olabilir. Steril kabinin bozuk çalışmıyor olması. Steril kabin içerisinde bulunan alet ve ekipmanın steril olmaması. İçerisinde besi ortamı bulunan kapların dış kısmının temiz olmaması. Steril kabinin bulunduğu odanın temiz olmaması kültürlerin enfeksiyonuna neden olabilir. 41

42 İzolasyon İnokülasyon ve Alt Kültüre Alma İzolasyon Bitki materyalinin sterilizasyonu ve steril su ile çalkalanmasından sonra eksplant steril bir pens yardımıyla steril bir kağıt üzerinde veya cam kap içinde bitki parçasından stero mikroskop altında izole edilir. Eksplant olarak tohumlar kullanılıyorsa strelizasyon ve streil su ile çalkalamadan sonra tohumlar direkt olarak besi ortamına inoküle edilirler.

43 İnokülasyon İnokülasyon sırasında içerisinde besi ortamı bulunan test tüpleri ağızları steril kabinin içine bakacak şekilde tutulur.bu uygulama şekli enfeksiyon riskini azaltır. Katı besi ortamına inokulasyon metodu eksplanta bağlı olarak değişir. Tohumlar besi ortamına üzerine yerleştirilir. Eksplantatlar besi ortamına yerleştirildikten sonra kültür kaplarının ağzı steril alüminyum kağıt, steril metal veya polipropilen kapaklarla kapatılır. 43

44 Alt Kültüre Alma Aşağıdaki Durumlarda Alt Kültür Gerekli Olabilir a) Besi ortamının tükenmiş olması b) Besi ortamının kuruması c) Kültürlerin kültür kabını dolduracak kadar büyümüş olması d) Materyalin daha fazla çoğatılmak istenmesi e) Bitki dokularının salgıladıkları toksik maddeler nedeniyle agarın kahverengi/siyah renk alması ve kültürde büyümenin durumu f) Besi ortamında ph ın düşmesi ile besi ortamının sıvı hale gelmesi 44

45 Alt Kültür İşlemi Aşağıdaki İşlem Sırasına Göre Yapılır a) Test tüpleri dış kısımdan %96 lık alkol ile sterilize edilir. b) Kültür kaplarının kapakları açılır. c) Eksplantat veya kallus steril bir pens ile alınarak steril bir petri kutusu içine alınır. d) Eksplantat veya kallusun kahverengileşen kısmları steril bir skalpel ile kesilerek uzaklaştırılır.temizlenmiş olan eksplantat veya kallus yeni besi ortamına yerleştirilir. 45

46 Bitki Materyalinin İn Vitro Büyüme ve Gelişmeye Etkisi Besi ortamı ve fiziksel faktörler gibi kullanılan bitki materyali de in vitro büyüme ve gelişmeye çok önemli derecede etkiler.in vitro büyüme ve gelişmeyi etkileyen bitkisel faktörler aşağıdaki gibi sıralanabilir. Genotip Bazı bitki türlerinde embriyoların in vitro kültürü çok iyi iken bazı türlerde çok güçtür.hatta aynı türlerin genotipleri arasında bu açıdan büyük farklılıklar vardır. Günümüzde in vitro kültür ve diğer biyoteknolojik yöntemlerin ekonomik değeri olan kültür bitkilerinde yaygın olarak kullanabilmesini engelleyen en önemli faktör aynı tür içerisindeki farklı genotiplerin in vitro kültüre farklı reaksiyon göstermeleridir. Bazı araştırıcılar ise, genotiplerin in vitro kültüre farklı reaksiyon göstermelerinin nedeninin genetik olmaktan çok her genotipin farklı yetiştirme koşulları ve farklı besi ortamlarına gereksinim duymaları ile açıklanmaktadır. 46

47 Kullanılan Eksplantatın Yaşı Genç odunlaşmamış dokular in vitro kültüründe daha iyi reaksiyon göstermektedir. Doku ve Organlar yaşlandıkça hücre bölünmesi ve in vitro rejenerasyon kapasitesi azalmaktadır. Donor Bitkilerin Yetişme Koşulları İn Vitro kültürde kullanılacak eksplantatların alındığı donor bitkilerin in vitro kültürde başarıyı etkileyen en önemli faktördür. Donor tarla koşullarında yetiştirilmişse yıldan yıla meydana gelen iklim değişikliklerinden dolayı in vitro kültüre reaksiyonu önemli derecede etkiler. İklim odalarında yetiştirilen donor bitkilerin ışıklanma, sıcaklık ve beslenme bitki materyalinin istediği koşullarda yerine getirilmelidir. 47

48 Donor Bitkilerinin Sağlık Durumları İzolasyon sırasında donor bitkiler sağlıklı ise in vitro kültürde başarı artar. İn vitro kültürde kullanılacak eksplantatların sağlıklı bitkilerden alınması aynı zamanda kültür sırasında enfeksiyon riskini azaltır. Eksplantatın Bitki İçindeki Pozisyonu İn vitro kültürde kullanılan eksplantatın bitkinin genç ve fizyolojik olarak daha iyi durumdaki kısımlarında seçilmesi başarı şansını artırır. Eksplantatın Büyüklüğü Genellikle çok küçük bitki parçacıkları büyük bitki parçacıklarına göre in vitro kültürü daha güçtür. İzole edilmiş bitki parçaları kendi besin maddeleri rezervlerine ve hormonlara sahiptirler.büyük eksplantatların in vitro kültürde büyüme ve rejenerasyonu daha kolaydır. Büyük eksplantatlar kültüre alındığında besi ortamına besin maddeleri ve hormon ilavesinin etkinliği azalır. 48

49 7. KAYNAKLAR 49

50 Beni Dinlediğiniz İçin Teşekkür Ederim 50

51 T.C ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ Hazırlayanlar : İBAHİM AYATA FAHRETTİN YAZAL Sunum : ALİ AYDIN MURAT TAD SAMSUN 2018

52 İÇİNDEKİLER 1) İn Vitro Tozlama ve Dölleme Teknikleri a) Stigma Tozlaması ve Döllemesi b) Plasenta döllemesi c) İzole Edilmiş Yumurtanın İn Vitro Döllenmesi 2) İn Vitro Tozlama ve Dölleme Tekniklerinin Kullanım Alanları a) Kendine Uyuşmazlığın Önlenmesi b) Melez Uyuşmazlığının Önlenmesi c) Haploid Bitkilerin Elde Edilmesi d) Çiçek Yada Yumurtalığın Ana Bitki Üzerinde Olgunlaşmadan Döküldüğü Durumlarda Tohum Elde Edilmesi e) Döllenme Fizyolojisinin İncelenmesi

53 1) İN VİTRO TOZLAMA VE DÖLLEME Bitkilerde normal olarak tozlanmayı takip eden döllenme sonucu bir embriyo oluşur. Daha sonra normal tohum gelişimi izler.

54 Kapalı tohumlu bitkilerin çoğunluğu yabancı döllenen bitkilerdir. Yani bir bitki başka bir bitkiden gelen çiçek tozları tarafından döllenir. Bir çok bitkide kendine döllenme çok sınırlıdır. Türler arası ve cinsler arası melezlemelere doğada çok az rastlanır. Bitki ıslahçıları arzu edilen genotipleri elde edebilmek için kendileme ve melezmele tekniklerini kullanırlar.

55 Bu teknikleri kullanmaları bazı durumlarda güçleşebilir: Polen taneleri dişicik başı(stigma) üzerinde çimlenmez Polen tüpünün dişicik borusu(styl) içindeki büyümesi kısmen veya tamamen durur. Döllenme olmaz

56 Eğer kendine tozlama sonucu döllenme olmuyorsa, bu olaya kendine uyuşmazlık adı verilir. Melezleme sonucu döllenme olmuyorsa, bu olaya da melez uyuşmazlığı denir. İn vitro tozlama ve döllenme teknikleri belirttiğimiz güçlükleri aşmamızda bize yardımcı olur.

57 İn vitro tozlama ve dölleme tekniği ilk defa 1962 yılında Kanta ve arkadaşları tarafından haşaş bitkisinde uygulanmıştır. Daha sonra birçok bitki üzerinde başarılı bir şekilde uygulanmıştır.

58 1) İn Vitro Tozlama ve Dölleme Teknikleri a) Stigma Tozlaması ve Döllemesi Bu yöntem yumurtalığın olgunlaşmadan öldüğü bitkilerde uygulanmaktadır. Bitkinin normal koşullarda tozlanma ve döllenmesine benzeyen bir yöntemdir.

59 Bu yöntemde erkek organları uzaklaştırılmış bir çiçek, bilinen sterilizasyon yöntemleriyle sterilize edilir ve dişi organ izole edilir. Izole edilmiş olan dişi organ besi ortamına yerleştirilir. Sterilize edilmiş olgun bir anterden alınan polen stigma üzerine yerleştirilir.

60 b) Plasenta Döllemesi Bu yöntemde, çiçek sterilize edilir ve döllenmemiş yumurtaları kapsayan plasenta stereomikroskop altında izole edilir. Izole edilen plasenta besi ortamına yerleştirilir. Açılmak üzere olan anterler sterilize edilir ve anterler açılarak içindeki polen daneleri yumurtaların üzerine yerleştirilir.

61 Eğer plasenta iyi gelişmiş ve çok sayıda yumurta hücresi içeriyorsa, plasenta küçük parçalara ayrılır ve herbiri ayrı kültür edilir.

62 c) İzole Edilmiş Yumurtanın İn Vitro Döllenmesi Bu yöntem 2. yönteme benzer. Ancak in vitro döllenmiş yumurtadan embriyonun oluşması çok güç olduğundan bu yöntemin uygulanması çok başarılı değildir. Herşeyden önce, daha kompleks bir besi ortamına gereksinim duyulur.

63 2) İn Vitro Tozlama ve Dölleme Tekniklerinin Kullanım Alanları a) Kendine Uyuşmazlığın Önlenmesi Plesenta tozlaması tekniğiyle bazı durumlarda tamamıyle kendine uyuşmaz olan bitkilerde kendilenmiş döllerin elde edilmesi mümkün olabilmektedir.

64 Kendine uyuşmaz olan Petunia axillaris ve Petunia melezlerinden plasenta tozlaması yöntemiyle kendilenmiş bitkiler elde edilmiştir.

65 b) Melez Uyuşmazlığının Önlenmesi Doğada normal olarak mümkün olmayan türler ve cinsler arası melezlemeler in vitro tozlama tozlama ve dölleme teknikleri ile başarılmıştır. Nicotiana alata türünün yumurtaları Nicotiana tabacum türünün polenleri ile in vitro koşullarda döllenerek melez bitkiler elde edilebilmektedir. Diğer taraftan caryophyllaceae familyasında plasenta dölleme tekniği ile cinsler arası melezler elde edilmiştir.

66 c) Haploid Bitkilerin Elde Edilmesi Bir tür başka bir türün polen tozları ile in vitro koşullarda döllenerek haploid bitkiler elde edilebilmektedir. Mimulus luteus bitkisinin Torenia fournieri ile in vitro olarak melezleme sonucu haploid Mimulus bitkileri elde edilmektedir.

67 d) Çiçek yada Yumurtalığın Ana Bitki Üzerinde Olgunlaşmadan Döküldüğü Durumlarda Tohum Elde Edilmesi Böyle durumlarda stigma tozlama ve döllenmesi ile tohum elde edilebilmektedir.

68 e) Döllenme Fizyolojisinin İncelenmesi In vitro tozlanma ve dölleme tekniği, polen fizyolojisi ve döllenmesinin incelenmesinde kullanılabilmektedir.

69 Başarıyı Etkileyen Faktörler Bu tekniklerin uygulanabilmesi için tekniğin uygulanacağı türü veya türlerin çiçek biyolojisinin iyi bilinmesi gerekir. Polen daneleri ve yumurta hücreleri uygun fizyolojik ve morfolojik durumda olmalıdır. Uygun besi ortamı seçilmelidir.

70 Stigma tozlama ve döllenmesi için kullanılacak çiçeklerin sterilizasyonunda, sterilizasyon çözeltisinin stigmaya temas etmemesi gerekir. Aksi halde stigma zarar görür. Stigma tozlama ve dölleme tekniğinin uygulanmasında, çanak yaprakların çiçekten uzaklaştırılmaması gerekir. Çünkü bu yapraklar yumurtalığın büyümesini teşvik eder.

71 Bitki türüne bağlı olarak, uygun kültür sıcaklığının seçilmesi gerekir. Tüm bu faktörler in vitro tozlanma ve dölleme sonucu oluşacak canlı tohum sayısını etkiler.

72 Beni Dinlediğiniz İçin Teşekkür Ederim

73 BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ EMBRİYO KÜLTÜRÜ HAZIRLAYANLAR: Büşra BAYRAK Serap GEDİK Melike AKBAŞ Şennur BOLAT

74 Embriyo kültürü nedir? Bitkilerin tohum veya tohum taslaklarından embriyoların izole edilerek yapay besi ortamları üzerinde kültüre alındığı in vitro tekniktir.

75 Embriyo kütür uygulamasında genellikle kallus oluşturan değişik hormon konsantrasyonu içeren MS besi ortamı tercih edilir. MS besi ortamına antibiyotik, şeker, katılaştırıcı agar, hangi hormon gerekliyse dökülür. Otoklavlanır steril edildikten sonra petri kutularına dökülür ve katılaşıncaya kadar steril kabin içerisinde bekletilir.

76 İki tip embriyo kültüründen söz edilmektedir. 1) Olgunlaşmış embriyo kültürü 2) Olgunlaşmamış embriyo kültürü

77 1. Olgunlaşmış embriyoların kültürü: Bu kültür oldukça kolaydır. Basit bir kültür ortamı ile başarılı sonuç alınmaktadır. Böylece embriyonik büyümeyi incelemek ve büyüme dönemlerini ortaya koymak, tohumun çimlenmesini engelleyen dormansiyi ortadan kaldırmak amacıyla kültüre alınır.

78 Olgunlaşmış embriyo kültürünün uygulanması Olgunlaşmış buğday embriyolarının kültüre alınmasında tohumlar önce %70 lik alkol içinde 2 dakika bekletilir. Tween 20 ilave edilir. %20 lik sodyum hipoklorit çözeltisi içinde 30 dakika yüzey sterilizasyona tabi tutulur.3-4 kez saf su ile yıkanır. Sorgum veya çeltik bitkisinde olgun embriyolar pens yardımıyla tohumdan ayrılır. İzole edilen olgun embriyolar petri kutusuna yüksek 2,4D li konsantrasyonlu MS ortamına konulur. Daha sonra kallus oluşturulur. Rejenere edilir yeni bitkicikler elde edilir.

79 2.Olgunlaşmamış embriyo kültürü: Olgunlaşmamış embriyo kültürü genellikle normal doğal koşullarda gelişimini tamamlayamayan embriyolardan yaşama gücündeki bitkilerin elde edilmesi amacıyla yapılır.

80 Olgunlaşmamış embriyo kültürünün uygulaması Döllenme gerçekleştikten 10 gün sonra çiçeğin içerisinden embriyo pens yardımıyla alınır, steril edilir. Sonra uygun besi ortamına (kallus oluşturma ortamına, 2,4D li MS ortamına) koyulur. Bu şekilde kültüre alınır. Buna olgunlaşmamış embriyo kültürü denir.

81 Embriyo kültüründe amaç; Çimlenmesi çok daha zor olan tohumların çimlendirilmesi, Genetik çalışmalarda ıslah süresinin kısaltılması, Haploid bitki üretilmesi, Hastalıksız bitki üretimi, Tohumla üretimi zor olan bitkilerin üretimidir.

82 EMBRİYO KÜLTÜRÜNDE BAŞARIYI ETKİLEYEN FAKTÖRLER Bir embriyodan in vitro koşullarında yaşama kabiliyetindeki bir bitkinin oluşabilmesi bir çok faktöre bağlıdır. Bu faktörler aşağıdaki şekilde sıralanabilir.

83 1. Genotip Bazı bitki türlerinde embriyoların in vitro kültürü çok iyi iken bazı türlerde çok güçtür. Hatta aynı türlerin genotipleri arasında bu açıdan büyük farklılıklar vardır.

84 2. Embriyoların İzolasyon Sırasındaki Gelişme Dönemi Çok küçük olgunlaşmamış embriyoların in vitro kültürde geliştirilerek bunlardan bitki elde edilmesi çok zordur. Gelişmeleri ilerlemiş durumdaki embriyoların in vitro kültürü daha kolaydır.

85 3. Ana Bitkilerin Yetişme Koşulları Embriyo kültürü amacıyla kullanılacak donör bitkiler genellikle serada yetiştirilir. Aynı zamanda tarla koşullarında yetiştirilen bitkiler de bu amaçla kullanılabilir. Donör bitkilerin büyüme koşullarının iyileştirilmesi endosperm gelişmesinin daha iyi olmasını, dolayısıyla da embriyoların daha iyi büyümesini sağlar.

86 4. Besi Ortamının Bileşimi Olgunlaşmamış embriyolar olgun embriyolara göre daha kompleks besi ortamlarına gereksinim duyarlar. Aynı zamanda hem olgunlaşmamış hem de olgun embriyoların in vitro kültüründe besi ortamı makro ve mikro elementleri ile şeker içermelidir.

87 Genellikle PH ı 5-6 arasında değişen katı ortamlar kullanılır. Agarın genellikle %0,6-0,8 konsantrasyonları kullanılır. Yüksek agar konsantrasyonları embriyo büyümesini engeller.

88 Embriyo kültüründe şeker kaynağı olarak genellikle sakkaroz kullanılır. Fakat bazı durumlarda fruktoz ve glikoz daha iyi sonuç verebilmektedir.

89 5. Sıcaklık Embriyo kültüründe optimum sıcaklık bitki türüne göre farklılık gösterir. Normal olarak genellikle embriyolar C de kültür edilir. 6. Oksijen Oksijen embriyo kültüründe önemli bir faktördür. Bazı durumlarda oksijen gereksinimi normal havanın oksijen içeriğinden daha fazla olabilir.

90 7. Işık Bazı durumlarda izole edilmiş embriyolar 7-14 gün süre ile karanlık koşullara ihtiyaç duymaktadırlar. Bu karanlık dönemden sonra ışık koşullarında klorofil oluşumu gerçekleşir.

91 EMBRİYO KÜLTÜRÜNÜN PRATİKTE KULLANIM ALANLARI Embriyo kültürü pratikte aşağıdaki amaçlarla kullanılır: 1) Tohumlarının Çimlendirilmesi Mümkün Olmayan Türlerin Tohumlarının Çimlendirilmesi 2) Mutlak Olarak Parazit Halde Yaşayan Bitkilerin Tohumlarının Çimlendirilmesinde 3) Yetiştirme Ve Islah Sürecinin Kısaltılması 4) Uyuşmazlık Nedeniyle Embriyoların Gelişemediği Durumlarda Normal Embriyo Gelişmesini Sağlamak Amacıyla 5) Erken Olgunlaşan Taş Çekirdekli Meyvelerde Zayıf Embriyo Gelişiminin Engellenmesi 6) Haploid Bitkilerin Elde Edilmesi 7) Embriyo Gelişiminin Deneysel Olarak İncelenmesi

92 1) Tohumlarının Çimlendirilmesi Mümkün Olmayan Türlerin Tohumlarının Çimlendirilmesi: Bazı bitkilerin tohumlarını doğal koşullarda çimlendirmek mümkün değildir. Bu durumda bu türlerin tohumlarından embriyolar izole edilerek in vitro koşullarda çimlendirilmesi gerekir.

93 2) Mutlak Olarak Parazit Halde Yaşayan Bitkilerin Tohumlarının Çimlendirilmesi: Mutlak olarak parazit halde yaşayan bitkilerin tohumlarını konukçu bitki olmaksızın çimlendirmek mümkün değildir. Bu durumda embriyo kültürü tekniği ile bu bitkilerin embriyolarından tam teşekküllü bitkiler elde edilebilir.

94 3) Yetiştirme ve Islah Sürecinin Kısaltılması: Tohum dormansisi gösteren birçok bitki vardır. Bu türlerde endospermdeki bazı engelleyiciler, çimlenme için özel ışık ve sıcaklıklara gereksinim duyulması veya embriyonun tam olarak olgunlaşmamış olması nedeniyle tohumlar kısa sürede çimlenemez. Embriyo kültürü tekniği ile bu türlerde çok kısa sürede çimlenme sağlanır ve bu türlerin yetiştirilme süreçleri kısalır.

95 Bu teknik bugün orkidelerin ticari olarak çoğaltılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Çimlenmenin hızlandırılması nedeniyle bu türler üzerinde sürdürülen ıslah çalışmalarında zaman tasarrufu sağlanmış olur.

96 4) Uyuşmazlık Deneni İle Embriyoların Gelişemediği Durumlarda Normal Embriyo Gelişmesini Sağlamak Amacıyla Türler ve cinsler arası melezlemelerde ve farklı poliploidi düzeyindeki bitkilerin melezlenmesinde genellikle endosperm çok zayıf gelişir. Bu durumda embriyo gelişmesini tamamlayamadan ölür. Böyle durumlarda genellikle melezlemeden 2-3 hafta sonra embriyolar izole edilerek in vitro kültür koşullarında kültüre alınır ve bu melez embriyoların normal gelişmeleri sağlanarak melez bitkiler elde edilebilir. Embriyo kültürü tekniği ile fasulye, keten, pamuk, domates, çeltik ve arpada türler arası melez bitkiler elde edilmektedir.

97 Ayrıca yine bu teknik sayesinde arpa x çavdar ve buğday x çavdar cinsleri arası melezlerini elde etmek mümkün olmaktadır. Buğday x çavdar melezlemesi sonucu oluşan embriyonun in vitro koşullarda kültürü ve bu embriyonun çimlenmesi sonucu oluşan bitkilerde kromozom katlaması yapılarak, bugün yeni bir tahıl cinsi olarak bilinin Tritikale elde edilmiştir.

98 5) Erken Olgunlaşan Taş Çekirdekli Meyvelerde Zayıf Embriyo Gelişiminin Engellenmesi Şeftali, kiraz, kayısı ve erik gibi erken olgunlaşan taş çekirdekli meyvelerde, embriyoya su ve besin maddesi taşınması embriyo tam olarak olgunlaşmadan kesintiye uğrar. Bu durumda embriyo tam olarak olgunlaşamaz ve bu nedenle erken olgunlaşan bu tip meyvelerde melez bitki elde edilemez. Böyle durumlarda, embriyo kültürünün kullanılması ile melez bitkiler elde edilebilir. Şeftalide yapılan çalışmalarda, embriyonun mümkün olduğunca uzun bir süre ana bitkide bırakılması ve daha sonra in vitro koşullarda kültüre alınması ile normal embriyo olgunlaşmasının sağlanabildiği saptanmıştır.

99 6) Haploid Bitkilerin Elde Edilmesi Embriyo kültürü tekniğinin en önemli kullanım alanlarından birisi de haploid bitki elde edilmesidir. Maternal haploid tekniği olarak bilinin bu teknik; özellikle buğday ve arpada başarı ile uygulanmakta olan bir tekniktir. Bu yöntemle haploid bitki elde edilmesinde; kültür arpası (Hordeum vulgare ) yumrulu arpa ( hordeum bulbosum) ile melezlenmektedir. Bu melezleme sonucu oluşan zigotta hücre bölünmeleri sırasında yumrulu arpa kromozomları elemine olmaktadır. Bu durumda endospermin gelişmesi tamamıyla durmakta, embriyo gelişimi ise çok yavaşlamaktadır.

100

101 Gelişmesi yavaşlamış olan haploid embriyo karyopsisten izole edilerek, steril koşullarda uygun besi ortamında kültür edilir. Böylelikle, normal doğal koşullarda gelişmesini devam ettiremeyecek olan embriyonun normal gelişmesi sağlanır. Normal gelişmesini sağlayan bu haploid embriyolar çimlenerek, haploid bitkileri oluştururlar. Daha sonra haploid durumdaki bu bitkiler kolhisin ile muamele edilerek kromozom sayıları iki katına çıkarılır ve homozigot bitkiler elde edilir.

102 Bu tekniğin herhangi bir ıslah programında F1 bitkilerine uygulandığı düşünülürse, klasik ıslah yöntemleri ile 4-5 yılda erişilebilecek homozigotluk düzeyine 1 yılda erişilebildiği görülmektedir. Arpada uygulamaya konulan bu teknik, Barclay (1975) tarafından buğdayda da uygulanmış ve başarılı olmuştur. Bu tekniğin yaygın olarak kullanılmasını engelleyen en önemli faktörlerden birisi genotiptir.

103 7) Embriyo Gelişiminin Deneysel Olarak İncelenmesi Embriyo kültürü, yukarıda sayılan pratik kullanım alanları yanında, embriyo gelişmesi için gerekli koşullar, fitohormonlar ve çevre koşullarının incelenmesine de olanak sağlamaktadır.

104 TEŞEKKÜRLER

105 ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ DERSİ MERİSTEM, SÜRGÜN UCU VE TOMURCUK KÜLTÜRÜ Doktor Öğretim Üyesi Yılmaz KAYA HAZIRLAYANLAR Havvanur SAĞDIÇ Melike AKMAN Büşra ÇEVİK Kübra IŞIK

106 Merİstem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürü Meristem kültürü; bitkilerin büyüme konileri veya büyüme konisi yanında birkaç yaprak primordiasının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültür edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesini kapsar. 1

107 Sürgün ucu kültürü denildiğinde; büyümekte olan sürgünlerin 2cm veya daha kısa uç kısımlarının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültüre edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesi anlaşılır. Tomurcuk kültürü ise; büyümekte olan veya dormant durumunda ki sürgünlerden izole edilen tepe veya koltuk altı tomurcuklarının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültür edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesini kapsar.

108 Merİstem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürünün bitki yetiştirme ve IslahIndakİ kullanim AlanlarI 1. Mikro Çoğaltma Klonal çoğaltma aracı olarak in vitro kültür tekniklerini ilk uygulayan araştırıcı Georges Morel olmuştur. Morel 1965 yılında sürgün uçlarının in vitro kültürü yoluyla orkideleri hızlı bir şekilde çoğaltmayı başarmıştır. Bugün birçok sera bitkisinde in vitro çoğaltma yaygın olarak kullanılmaktadır.

109 İn vitro çoğaltmanın bilinen aseksüel çoğaltma yöntemlerine göre avantajları. İn vitro çoğaltmada milyonlarca klon bitkisinin bir yılda elde edilmesi için çok az bitki dokusuna gerek duyulur. Aynı sayıdaki bitkinin bilinen çoğaltma yöntemleriyle elde edilmesi için uzun yıllara gereksinim duyulur. Birçok bitkinin bilinen konvensiyonel çoğaltma yöntemleriyle çoğaltılması oldukça güçtür. İn vitro kültür yoluyla çoğaltılan bitkiler steril koşullarda elde edildiklerinden hastalık ve zararlılarla bulaşık değildirler. Bilinen konveksiyonel yöntemlerle bitkilerin çoğaltılması mevsime bağlıdır. Buna karşılık, in vitro çoğaltmada eksplant olarak kullanılan meristem, sürgün ucu ve tomurcukların depolanması ile her mevsimde çoğaltma yapılabılmektedir 2

110 İn vitro çoğaltma özellikle otsu bahçe bitkilerinde başarıyla uygulanabilmektedir. Bunun nedeni birçok otsu bitkide apikal dormansinin çok şiddetli olmaması ve bu bitkilerin iyi bir kök oluşturma kapasitesine sahip olmalarıdır. Bunun yanında seracılık endüstrisinin maddi desteği de bu bitkilerde in vitro çoğaltma tekniklerinin geliştirilmesinde büyük rol oynamıştır. Otsu bitkilere göre odunsu bitkilerin in vitro çoğaltılması fazla gelişmemiştir. Özellikle bu bitkilerin köklendirilmesinde büyük güçlükler bulunmaktadır. Ayrıca birçok odunsu bitkilerin dokularında büyük miktarlarda polifenolik bileşikler bulunmasıda bu bitkilerin in vitro çoğaltılmasında sorun oluşturmaktadır. İn vitro çoğaltma orman ağaçları için de büyük bir önem taşımaktadır. Çünkü, bu ağaçların sürgünlerinin köklendirilmesi yoluyla çoğaltılması çok güçtür. Bu nedenle birçok orman ağaç türü bulunmaktadır. Son yıllarda orman ağaçlarının in vitro çoğaltılması için yoğun çabalar sarfedilmektedir. Ancak bu konuda çok az gelişme kaydedilebilmiştir. 3

111 2. Virüssüz Bitki Elde Edilmesi Bakteri, mantar, virüs, mikoplazma ve nematodların neden olduğu hastalıklar bitkilerde büyük verim kayıplarına neden olurlar. Virüs ve mikoplazmalar dışındaki hastalık etmenlerinin birçoğu için etkin mücadele yöntemleri geliştirilmiştir. Ancak virüs ve mikoplazmalarla mücadele için etkin bir yüntem mevcut değildir.

112 Bitkiler virüs ile enfekte olduklarında, patojen generasyondan generasyona geçmektedir. Bu durum ürünün verim ve kalitesinin generasyondan generasyona azalmasına neden olmaktadır. Yüksek verim ve kalite ürün elde edebilmek için üreticilere virüssüz tohumluk sağlanması gerekir. Virüssüz tohumluk sağlanmasında kullanılabilecek yöntemlerden birisi, virüslere dayanıklı çeşit geliştirilmesidir. Ancak, virüslere dayanıklı çeşit geliştirilebilmesi için, öncelikle söz konusu virüse dayanıklılığı sağlayan geni taşıyan bir genetik kaynağın bulunması gerekir.

113 Tütünde Lekelİ Solgunluk Vİrüs HastalIğI

114 Kontamİne Olmuş Besİ ortami

115 Virüssüz bitki elde etme yöntemleri a) Sıcaklık uygulaması b) Meristem kültürü c) Sıcaklık uygulamasından sonra meristem kültürü d) Kimyasal uygulaması ile birlikte meristem kültürü e) Adventif sürgün oluşumundan sonra meristem kültürü f) Meristemlerin virüssüz anaçlara aşılanması

116 A.Sıcaklık Uygulaması Bazı virüslerin inaktif hale getirilmesinde sıcaklık uygulaması etkin bir yöntem olmaktadır. Ancak bazı durumlarda bitkinin sıcaklığa karşı çok hassas olması veya virüsün sıcaktan etkilenmemesi nedeniyle sıcaklık uygulaması virüs eleminasyonunda etkisiz kalmaktadır. Sıcaklık uygulaması özellikle meyve ağaçları, şeker kamışı ve kassava bitkilerinde bulunan virüs ve mykoplasmalara karşı etkindir.

117 B. Meristem Kültürü Virüssüz bitki elde edilmesinde en sık kullanılan yöntem meristem kültürüdür. Meristem kültüründe sağlanan başarılar doğal olarak bitkinin farklı kısımlarında virüslerin neden farklı yoğunlukta dağılım gösterdiği sorusunu ortaya çıkarmıştır. Bazı araştırmacılara göre meristemde virüs partıküllerinin oluşumu ile hücre çoğalması arasında bir rekabet söz konusudur. Meristematık dokuda hücre bölünmesi sırasında nükleik asıt üretimi kapasitesi hücre bölünmesi için kullanılmakta ve bu durum virüs çoğalmasını engellemektedir. Buna karşılık meristematik olmayan dokuda hücreler bölünme yerine büyüme göstermektedirler. Bu durum ise virüs çoğalmasına olanak sağlamaktadır. Ayrıca meristemde taşıma sistemlerinin bulunmayışı nedeniyle virüslerin taşınması büyük ölçüde engellenmektedir. Meristem kültürü virüssüz bitkilerin elde edilmesinde kullanıldığı gibi, bakteri ve mantarlardan temizlenmiş bitkilerin elde edilmesinde de kullanılabilmektedir.

118 C. Sıcaklık Uygulamasından Sonra Meristem Kültürü Virüssüz bitki elde edilmesinde başarı şansını arttırmak için genellikle meristem kültürü yapılmadan önce meristemlerin alınacağı sürgünlere sıcaklık uygulaması yapılır. Böylece virüs konsantrasyonu azaltılır veya virüssüz bölge çoğaltılır. D.Kimyasal Uygulaması İle Birlikte Meristem Kültürü Virüs eleminasyonunda meristem kültürü ile kombine edilmiş birçok kimyasalın etkisi uzun yıllardan beri araştırılmaktadır. Bununla beraber bu teknik sınırlı bir başarı sağlamış ve antivirüs kimyasalların virüsler üzerindeki etkisi ile ilgili olarak farklı sonuçlar elde edilmiştir. Casells ve Long salatalık mozaik virüsü ve patetes X virüsü ile enfekte olmuş tütün bitkilerinden meristem kültürü ortamına geniş spektrumlu bir antivirüs bileşiği olan ribavirin ilave ederek virüsten arındırılmış bitkileri elde etmillerdir. Yapılan diğer bir araştırmada ise ribavirinin virüs replikasyonunu %72 oranında azaltmasına karşılık patetes yan gözlerine toksik etki yaptığı saptanmıştır. 5

119 E. Adventif Sürgün Oluşumundan Sonra Meristem Kültürü Bu yöntem zambaklarda başarı ile uygulanmaktadır. Bu bitkilerden alınan pılçuklardan in vitro koşullarda soğancıklar oluşmakta ve soğancıklarda meristem 1mm iken meristem kültürü ortamına aktarılmakta ve meristemden rejenere olan bitkiler virüssüz olmaktadırlar. F.Meristemlerin Virüssüz Anaçlara Aşılanması Meristemlerin in vitro koşullarda büyütülemediği veya meristemden oluşan sürgünün kök oluşturmadığı durumlarda meristem virüssüz anaca aşılanır ve in vitro koşullarda büyütülür veya çoğaltılır. Mikro aşılama olarakta bilinen bu yöntem özellikle odunsu bitkilerde uygulanan bir yöntemdir. 6

120 3. Germplasm Muhafazası Bugün genetik materyalin muhafazasında, sürgün ucu, tomurcuk ve meristemlerin in vitro koşullarda muhafazası üzerinde durulmaktadır. Genetik materyalin in vitro tekniklerinden yararlanılarak başarılı bir şekilde muhafaza edilmesi aşağıdaki faktörlere bağlıdır: a) Muhafaza tekniği genetik materyalde herhangi bir genetik değişikliğe neden olmamalıdır. b) Muhafaza tekniği genetik materyal üzerinde seleksiyon etkisi yapmamalıdır. c) Muhafaza edilen materyal, muhafaza süresi sonunda normal büyüme ve gelişmesine devam edebilmedir. d) Muhafaza yöntemi farklı koşullarda ve farklı bitki türleri için uygulanabilir olmalıdır.

121 A)Genetik Materyalin Meristem, Sürgün Ucu Ve Tomurcuk Kültürleri Şeklinde Muhafazasında Kullanılan Yöntemler 1) Meristem, Sürgün Ucu ve Tomurcuk Kültürlerinde Büyümenin Yavaşlatılması Büyümenin yavaşlaması sonucu hücre bölünmesi azalmakta ve bu durum muhafaza edilen bitki materyalinde genetik varyasyonun ortaya çıkmasını engellemektedir.

122 İn vitro koşullarda meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürlerinin büyümesinin yavaşlatılması için: a) Bitki materyalini mineral yağ ile kaplama b) Düşük basınç ve düşük oksijen koşullarında muhafaza c) Şeker içermeyen besi ortamında kültür d) Dehidratasyon e) Düşük sıcaklıkta muhafaza gibi tekniklerden yararlanılmaktadır.

123 2) Çok Düşük Sıcaklıklarda Sıvı Azot İçinde Muhafaza(Cryopreservation) Cryopreservation, biyolojik materyalin canlı olarak dondurulması ve daha sonra sıvı azot içinde çok düşük sıcaklıklarda muhafaza edilmesi olarak tanımlanır. Bitki genetik kaynaklarının cryopreservation tekniği ile muhafazasında aşağıdaki bitki materyalleri kullanılmaktadır: a) Sürgün uçları ve meristemler b) Kültür edilmiş hücreler ve somatik embriyolar c) Protoplastlar d)embriyo, endosperm, ovul, çekirdek, anter, polen ve tohum gibi bitki organ ve organelleri

124

125 Cryopreservation Tekniğinin Uygulanması Bitki meristem ve sürgün uçlarının cryopreservation tekniği ile muhafazasında aşağıda açıklanan işlemler uygulanır. 1) Steril Koşullarda Meristemlerin İzolasyonu ve Ön Kültürü Meristemler, çimlenmiş tohumlardan veya in vitro koşullarda veya sera koşullarında muhafaza edilen bitkilerden izole edilir. 2) Dona Karşı Koruyucu Kimyasalların Uygulanması Meristemlerin cryopreservation tekniği ile başarılı bir şekilde muhafaza edilebilmesi için, hücreleri dona karşı koruyan ve muhafaza süresi sonunda oluşan buzun erimesi sırasında hücrelerin zarar görmemesini sağlayan koruyucu kimyasallarla muamele edilmeleri gerekir. Bu amaçla DMSO, gliserol, şeker gibi birçok kimyasal kullanılmakla beraber, bunlardan en sık kullanılanı DMSO dir.

126 3) Meristemlerin Dondurulması Dondurma işlemi üç şekilde yapılır. a) Yavaş Dondurma Bu tip dondurma işleminde, meristemler özel olarak imal edilmiş dondurucular içine yerleştirilir ve meristemlerin sıcaklığı, C\dakika olacak şekilde yavaş yavaş -30, -40 C ye kadar soğutulur. Yavaş dondurma yöntemi daha çok fazla miktarda su içeren bitki materyalinin dondurulmasında kullanılır.

127 b) Hızlı Dondurma Hızlı dondurma işlemi, dona karşı koruyucu maddelerle muamele edilmiş meristemlerin sıvı azot içine daldırılması ile yapılır. Hızlı dondurma sırasında hücreler arasında kristallerinin oluşması engellenerek, meristemlerin canlı kalması sağlanır. c) Damla Halinde Dondurma Bu teknik kassava meristemlerinin dondurulması için geliştirilmiştir. Tekniğin esası, yavaş dondurma yöntemine benzer. Ancak bu teknikte kültürlerin dondurulmadan önce dona karşı koruyucu kimyasallarla ön kültürüne gerek duyulmaz.

128 4) Meristemlerin Depolanması Dondurulmuş olan meristemler sıvı azot içinde depolanır. 5) Buzun Çözülmesi ve Meristemlerin Yeniden Kültürü Cryopreservation tekniğinde buzun eritilmesi çok önemli bir aşamadır. Genellikle sıvı azot içerisinden çıkarılan meristemler C deki su banyolarına daldırılır ve buz çözülür. Buzun erimesinden sonra, meristemler koruyucu maddelerden arındırılır ve uygun besi ortamlarında kültüre alınır.

129 Genetik Transformasyon Dikotiledon ve monokotiledon bitkilerde bir DNA parçasının bir hücreden diğerine aktarılmasında çok değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemler arasında yer alan Agrobacterium bakterisi araclığıyla gen transferi dikotiledon bitkilerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemde genellikle yaprak disklerine gen transformasyonu yapılmaktadır.

130 6.2.Meristem, Sürgün Ucu ve Tomurcuk Kültürünün Uygulanması Meristem,sürgün ucu ve tomurcuk kültürlerinin uygulanma prensipleri büyük benzerlik gösterir.bitki türlerine ve kullanılan organa bağlı olarak uygulamada bazı farklılıklar ortaya çıkarır.