6.1 Meristem,sürgün ucu ve tomurcuk kültürünün bitki yetiştirme ve ıslahındaki kullanım alanları

Transkript

1 6. MERİSTEM,SÜRGÜN UCU VE TOMURCUK KÜLTÜRÜ Meristem kültürü: Bitkilerin büyüme konileri veya büyüme konilerinin yanında birkaç yaprak primordiasının steril koşullarda yapay besi ortamında kültüre alınarak tam bir bitki elde edilmesi. Sürgün ucu kültürü: Büyümekte olan sürgünlerin 2 cm veya daha kısa uç kısımlarının steril koşullarda yapay besi ortamında kültüre alınarak tam bir bitki elde edilmesi. Tomurcuk kültürü: Büyümekte olan veya dormant durumda ki sürgünlerden izole edilen tepe veya koltuk altı tomurcuklarının steril koşullarda yapay besi ortamında kültüre alınarak tam bir bitki elde edilmesi. 6.1 Meristem,sürgün ucu ve tomurcuk kültürünün bitki yetiştirme ve ıslahındaki kullanım alanları Mikro Çoğaltım Virüssüz Bitki Elde Edilmesi Germplasm Muhafazası Mikro Çoğaltım Klonal çoğaltma aracı olarak in vitro kültür tekniklerini ilk uygulayan araştırıcı Georges MOREL olmuştur. Morel sürgün uçlarının in vitro kültürü yoluyla orkideleri hızlı bir şekilde çoğaltmıştır. İn vitro çoğaltmanın bilinen aseksüel çoğaltma yöntemlerine göre avantajları. İn vitro çoğaltmada milyonlarca klon bitkinin bir yılda elde edilmesi için çok az bir bitki dokusuna ihtiyaç duyulur. Aynı sayıdaki bitkinin bilinen çoğaltma yöntemleriyle çoğaltılması için uzun yıllara ihtiyaç duyulur. Birçok bitkinin bilinen konvensiyonel çoğaltma yöntemleriyle çoğaltılması oldukça güçtür. İn vitro kültür yoluyla çoğaltılan bitkiler steril koşullarda çoğaltıldıkları için hastalık ve zararlılarla bulaşık değillerdir. Bu durum ülkeler arasında bitki giriş çıkışında hastalık ve zararlıların taşınma riskini azaltır ve ülkeler arasında bitki giriş çıkışında karantina süresi azaltılır veya tamamen kaldırılarak bitki materyali değişimi daha hızlı olur. Bilinen konvensiyonel yüntemlerle bitkilerin çoğaltılması mevsime bağlıdır. İn vitro çoğaltmada eksplantlar depolanarak istenilen her mevsimde çoğaltma yapılabilir.

2 İn vitro çoğaltmada tomurcuklar ve sürgün uçları eksplant olarak kullanılır. Çünkü büyük eksplantların izolasyonu mersitem gibi küçük eksplantların izolasyonuna göre daha kolaydır ve büyük eksplantlar in vitro kültürde daha hızlı büyür Virüssüz Bitki Elde Edilmesi Bakteri, mantar, mikoplazma, virüs ve nematodların neden olduğu hastalıklar bitkilerde büyük verim kayıplarına neden olur. Virüs ve mikoplazmalar dışındaki hastalık etmenlerine karşı etkin mücadele yöntemleri mevcuttur. Virüs ve mikoplazmalar için etkin bir mücadele yöntemi mevcut değildir. Bitkiler virüs ile enfekte olduklarında patojen generasyondan generasyona verim ve kalitenin azalmasına neden olur Virüssüz Bitki Elde Etme Yöntemleri Sıcaklık uygulaması Meristem kültürü Sıcaklık uygulamasından sonra meristem kültürü Kimyasal uygulama ile birlikte meristem kültürü Adventif sürgün oluşumundan sonra meristem kültürü Meristemlerin virüssüz anaçlara aşılanması

3 SORULAR 1-Meristem kültürü nedir? Bitkilerin büyüme konileri veya büyüme konilerinin yanında birkaç yaprak primordiasının steril koşullarda yapay besi ortamında kültüre alınarak tam bir bitki elde 2-Meristem,sürgün ucu ve tomurcuk kültürünün bitki yetiştirme ve ıslahındaki kullanım alanları nelerdir? a. Mikro Çoğaltım b. Virüssüz Bitki Elde Edilmesi c. Germplasm Muhafazası d. Mikro Çoğaltım 3- İn vitro çoğaltmanın bilinen aseksüel çoğaltma yöntemlerine göre avantajları nelerdir? İn vitro çoğaltmada milyonlarca klon bitkinin bir yılda elde edilmesi için çok az bir bitki dokusuna ihtiyaç duyulur. Aynı sayıdaki bitkinin bilinen çoğaltma yöntemleriyle çoğaltılması için uzun yıllara ihtiyaç duyulur. Birçok bitkinin bilinen konvensiyonel çoğaltma yöntemleriyle çoğaltılması oldukça güçtür. İn vitro kültür yoluyla çoğaltılan bitkiler steril koşullarda çoğaltıldıkları için hastalık ve zararlılarla bulaşık değillerdir. Bu durum ülkeler arasında bitki giriş çıkışında hastalık ve zararlıların taşınma riskini azaltır ve ülkeler arasında bitki giriş çıkışında karantina süresi azaltılır veya tamamen kaldırılarak bitki materyali değişimi daha hızlı olur. Bilinen konvensiyonel yüntemlerle bitkilerin çoğaltılması mevsime bağlıdır. İn vitro çoğaltmada eksplantlar depolanarak istenilen her mevsimde çoğaltma yapılabilir. 4-Virüssüz bitki elde etme yöntemleri nelerdir? Sıcaklık uygulaması Meristem kültürü Sıcaklık uygulamasından sonra meristem kültürü Kimyasal uygulama ile birlikte meristem kültürü Adventif sürgün oluşumundan sonra meristem kültürü Meristemlerin virüssüz anaçlara aşılanması

4 5-İn vitro çoğaltmada tomurcuklar ve sürgün uçları eksplant olarak kullanılır. Çünkü büyük eksplantların izolasyonu mersitem gibi küçük eksplantların izolasyonuna göre daha kolaydır ve büyük eksplantlar in vitro kültürde daha hızlı büyür. Hazırlayan: Büşra ÇEVİK Sayfa; 55-57

5 1. SICAKLIK UYGULAMASI Bazı virüslerin inaktif hale getirilmesinde sıcaklık uygulaması etkin bir yöntem olmaktadır. Ancak, bazı durumlarda bitkinin sıcaklığa karşı hassas olması veya virüsün sıcaktan etkilenmemesi nedeniyle sıcaklık uygulaması virüs eleminasyonunda etkisiz kalmaktadır. Sıcaklık uygulanmasında, bitkinin yaşayabildiği ve virüsün inaktif hale geldiği sıcaklık derecesi ve uygulama zamanı seçilmelidir. Sıcaklık uygulaması özellikle meyve ağaçları, şeker kamışı ve kassava bitkilerinde bulunan virüs ve mykoplasmalara karşı etkindir. 2. MERİSTEM KÜLTÜRÜ Virüssüz bitki elde edilmesinde en sık kullanılan yöntem meristem kültürüdür. Virüsler bitkinin kök ve sürgünlerinde farklı yoğunlukta dağılım göstermektedir. Bitkinin farklı kısımlarımda virüslerin neden farklı yoğunlukta dağılım gösterdiği sorusunu ortaya çıkarmıştır. Meristemde virüs partiküllerinin oluşumu hücre ile çoğalması arasında bir rekabet vardır. Hücre bölünmesi sırasında nükleik asit üretimi kapasitesi hücre bölünmesi sırasında kullanılarak virüslerin çoğalmasını engellemektedir. Genellikle meristem kültürümüzü yapmadan önce, meristemleri alınacağı sürgünlere sıcaklık uygulaması yaparız ve böylece virüs konsantrasyonumuzu azaltıp virüssüz bölgemizi çoğaltırız. 4. KİMYASAL UYGULAMASINDAN SONRA MERİSTEM KÜLTÜRÜ Virüs ile enfekte olmuş bitkimizi meristem kültürü ortamında antivirüs bileşiği olan Ribavirin ilave ederek virüsden arındırılmış bitki elde ederiz. Tek başına kullandığımız antivürüs kimyasallar toksik etki yaptığını gözlemlemiş virüs eleminasyonuna etki olmadığını fark etmişizdir. 5. ADVENTİF SÜRGÜN OLUŞUMUNDAN SONRA MERİSTEM KÜLTÜRÜ Bitimizden aldığımız pulcukları in vitro koşullarda soğancıklar oluşturup ve bu soğancıklarımızın meristemleri 1 mm iken meristem kültürü ortamına aktarırız ve meristemden rejenere olan bitkimiz virüssüz olmaktadır. 6. MERİSTEMLERİN VİRÜSSÜZ ANAÇLARA AŞILANMASI Meristemlerimizi in vitro koşullarda büyütülemediği veya meristemden oluşan sürgünlerin kök oluşturmadığı durumlarda, meristemleri virüssüz anaca aşılarız ve in vitro koşullarda büyütüp çoğaltırız.

6 SORULAR 1.Virüssüz bitki elde etmede meristem kültüründe virüsler bitkinin kök ve sürgünlerin de neden farklı dağılım göstermektedir? 2. Meristem kültüründe en çok hangi kimyasal tercih edilir ve neden tek başına kullanımında toksik etki yapmaktadır? 3. Meristemlerin virüssüz anaçlara aşılanmasını kısaca açıklayınız. Hazırlayan: Kübra IŞIK Sayfa: 58-61

7 3. Germplasm Muhafazası Genetik materyalin in vitro teknikler ile başarılı bir şekilde muhafaza edilmesi dört faktöre bağlıdır. Bunlar; a) Muhafaza tekniği genetik materyalde herhangi bir genetik değişikliğe neden olmamalıdır. b) Muhafaza tekniği genetik materyal üzerinde seleksiyon etkisi yapmamalıdır. c) Muhafaza edilen materyal, muhafaza süresi sonunda normal büyüme ve gelişmesine devam edebilmedir. d) Muhafaza yöntemi farklı koşullarda ve farklı bitki türleri için uygulanabilir olmalıdır. A)Genetik Materyalin Meristem, Sürgün Ucu Ve Tomurcuk Kültürleri Şeklinde Muhafazasında Kullanılan Yöntemler 1) Meristem, Sürgün Ucu ve Tomurcuk Kültürlerinde Büyümenin Yavaşlatılması İn vitro koşullarda meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürlerinin büyümesinin yavaşlatılması için: a) Bitki materyalini mineral yağ ile kaplama b) Düşük basınç ve düşük oksijen koşullarında muhafaza c) Şeker içermeyen besi ortamında kültür d) Dehidratasyon e) Düşük sıcaklıkta muhafaza gibi tekniklerden yararlanılmaktadır. 2) Çok Düşük Sıcaklıklarda Sıvı Azot İçinde Muhafaza(Cryopreservation) Cryopreservation, biyolojik materyalin canlı olarak dondurulması ve daha sonra sıvı azot içinde çok düşük sıcaklıklarda muhafaza edilmesidir. Bitki genetik kaynaklarının cryopreservation tekniği ile muhafazasında şu bitki materyalleri kullanılmaktadır: a) Sürgün uçları ve meristemler b) Kültür edilmiş hücreler ve somatik embriyolar

8 c) Protoplastlar d)embriyo, endosperm, ovul, çekirdek, anter, polen ve tohum gibi bitki organ ve organelleri Cryopreservation Tekniğinin Uygulanması 1) Steril Koşullarda Meristemlerin İzolasyonu ve Ön Kültürü Meristemler, çimlenmiş tohumlardan veya in vitro koşullarında, sera koşullarında muhafaza edilen bitkilerden izole edilir. 2) Dona Karşı Koruyucu Kimyasalların Uygulanması Meristemlerin cryopreservation tekniği ile muhafaza edilebilmesi için, hücreleri dona karşı koruyan ve bu sürede oluşan buzun erimesi sırasında hücrelerin zarar görmemesini sağlayan koruyucu kimyasallarla muamele edilmeleri gerekir. Bu amaçla DMSO, gliserol, şeker gibi birçok kimyasal kullanılır. Bunlardan en sık kullanılanı DMSO dir. 3) Meristemlerin Dondurulması Dondurma işlemi üç şekilde yapılır. a) Yavaş Dondurma Bu yöntemde meristemler dondurucular içine yerleştirilir ve meristemlerin sıcaklığı, C\dakika olacak şekilde yavaş yavaş -30, -40 C ye kadar soğutulur. Yavaş dondurma yöntemi fazla miktarda su içeren bitki materyalinin dondurulmasında kullanılır. b) Hızlı Dondurma Hızlı dondurma işlemi, dona karşı koruyucu maddelerle işlenmiş meristemlerin sıvı azot içine daldırılması ile yapılır. Hızlı dondurma sırasında hücreler arasında kristallerinin oluşması engellenir ve böylece meristemlerin canlı kalması sağlanır. c) Damla Halinde Dondurma Bu teknik kassava meristemlerinin dondurulması için geliştirilmiştir. Bu tekniği yavaş dondurma tekniğinden ayıran nokta, kültürlerin dondurulmadan önce dona karşı koruyucu kimyasallarla ön kültürüne gerek duyulmamasıdır. 4) Meristemlerin Depolanması Dondurulmuş olan meristemler sıvı azot içinde depolanır.

9 5) Buzun Çözülmesi ve Meristemlerin Yeniden Kültürü Genellikle sıvı azot içerisinden çıkarılan meristemler C deki su banyolarına daldırılır ve buz çözülür. Buzun erimesinden sonra, meristemler koruyucu maddelerden arındırılır ve uygun besi ortamlarında kültüre alınır. Genetik Transformasyon Dikotiledon ve monokotiledon bitkilerde bir DNA parçasının bir hücreden diğerine aktarılmasında çok değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemler arasında yer alan Agrobacterium bakterisi araclığıyla gen transferi dikotiledon bitkilerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemde genellikle yaprak disklerine gen transformasyonu yapılmaktadır.

10 SORULAR 1. İn vitro koşullarda meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürlerinin büyümesinin yavaşlatılması için hangi tekniklerden yararlanılmaktadır? a) Bitki materyalini mineral yağ ile kaplama b) Düşük basınç ve düşük oksijen koşullarında muhafaza c) Şeker içermeyen besi ortamında kültür d) Dehidratasyon e) Düşük sıcaklıkta muhafaza 2. Cryopreservation ne demektir? Tanımlayınız. Biyolojik materyalin canlı olarak dondurulması ve daha sonra sıvı azot içinde çok düşük sıcaklıklarda muhafaza edilmesidir. 3. DMSO, gliserol, şeker gibi kimyasallar cryopreservation tekniğinde hangi amaçla kullanılırlar? Meristemlerin cryopreservation tekniği ile muhafaza edilebilmesi için, hücreleri dona karşı koruyan ve bu sürede oluşan buzun erimesi sırasında hücrelerin zarar görmemesini sağlayan koruyucu kimyasallarla muamele edilmeleri gerekir. DMSO, gliserol, şeker gibi kimyasallar bu amaçlarla kullanılırlar. Hazırlayan: Melike AKMAN Sayfa:62-70

11 6.2.Meristem, Sürgün Ucu ve Tomurcuk Kültürünün Uygulanması Meristem,sürgün ucu ve tomurcuk kültürlerinin prensipleri benzerlik gösterir.bitki tür ve kullanılan organa bağlı olarak uygulamalarında farklılıklar olabilir. 6.3.Meristem, Sürgün Ucu ve Tomurcuk Kültüründe Başarıyı Etkileyen Faktörler Meristem, sürgün ucu ve tomurcukların in vitro koşullarda hayatlarını devam ettirmeleri, çoğalmaları ve tam bir bitki oluşturmalarını bir çok faktörler etkiler. Bunlar şu şekildedir; Bitki Materyali Bitki materyali ise kendi arasında 3 e ayrılır; Eksplantatın Büyüklüğü Çok küçük eksplantatlar kullanıldığında. Eksplantat da yaprak primordiasının bulunup bulunmaması, eksplantatın in vitro koşullarda gelişmesini etkilememektedir. Eksplantat büyüdükçe eksplantatın in vitro kültürde yaşama şansı artmaktadır. Bazı çalışmalar ise uzun meristemlerin yaşama şanslarının fazla olduğunu göstermiştir. Fakat virüssüz bitki elde etmek istiyorsak, mümkün oldukça küçük meristem kullanmamız gerekmektedir Tomurcuğun Bitki Üzerine Etkisi Sürgün uçlarından alınan eksplantatlar, tabandan alınanlara göre daha genç durumdadırlar. Bazı çalışmalara göre sürgün ucundaki gözlerden alınan meristemlerin yan gözlerden alınan meristemlere göre in vitro kültürde yaşamlarına devam etme oranları daha fazladır. Bu nedenle uç sürgünlerden alınan meristemler, yan gözlerden alınanlara göre daha çok tercih edilmektedir Mevsim Tüm çoğaltma yöntemlerinde eksplantatın alındığı mevsim çok önemlidir. Mesela dormansi periyoduna sahip bitkilerden, bu periyodun sonunda eksplantlar alındığında yaşama oranları daha fazladır Besi Ortamı

12 Meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürlerinde halen genel bir ortam mevcut değildir. MS ortamı en başarılı sonuçlar veren besi ortamıdır. Bitkiye göre besi ortamında kullanılan bitki büyüme düzenleyicileri değişmektedir. Meristem,sürgün ucu ve tomurcuk kültürlerinde kültür dönemlerine göre büyüme düzenleyicisi ve mineral madde gereksinimleri ile kültür koşulları şu şekilde özetlenebilir; A)Eksplantat Gelişmesi(1.Dönem) Bu aşamada eksplantatlardan çoklu sürgün yada köklü bitkiler oluşur. Bu dönemde bitkiler sitokinin içermezler. Çünkü sitokinin sentez bölgesi kültür ve bitkilerin bu evrede kökleri bulunmamaktadır. Bundan dolayı en çok kullanılan stokinin BA (benziladenin) dir. Sürgün büyümesi için ise auxin gereklidir. Genç sürgün uçları auxin in sentez bölgesi olduğundan buna ihtiyaç yoktur fakat küçük meristemler ve dormant tomurcuklarının bulunduğu kültürlere ilave edilmesi gelişimi olumlu etkileyecekltir. En önemli auxin (en çok kullanılan) NAA dır. B)Sürgün Çoğaltma Dönemi(2.Dönem) Bu aşamada amaç olduça fazla sayıda sürgün elde etmektir. Bunun için besi ortamına sitokinin ilave etmek gerekir. Sitokinin çok fazla yan sürgün oluşumunu sağlar. Ortama auxin ilavesi sürgün oluşumunu etkilemez, ilave edilmesi gerekli değildir. Fakat ilavesi halinde sürgün gelişim iyi yönde etkilemektedir. C)Köklendirme Dönemi(3.Dönem) Bu dönemde amaç sürgünlerden kök oluşturmaktır. Bunun için kültüre auxin ilave edilmelidir. En çok kullanılan ise NAA dır. Sitokinin ilavesine gerek yoktur Genotip Bitki doku kültürlerinde belirli koşullarında iki farklı genotipin benzer fonksiyonu göstermediği bilinmektedir. Bununla beraber, belirli bir türün bir genotipi için geliştirilen meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürü tekniği, söz konusu türün diğer bir çok genotipi için de kullanılır. Örneğin; yapılan bir çalışmada 11 ticari şeftali türünün sadece 3 tanesinden %50 başarı göstermiştir. Bunun sebebi ise meristemlerin büyüme ve gelişmelerinin genotipe bağlı olduğu ve farklı genotiplerin kültürde farklı büyüme düzenleyicilerine farklı konsantrasyonlarda ihtiyaç duyduğu saptanmıştır.

13 SORULAR 1. Aşağıdakilerden hangisi meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültüründe başarıyı etkileyen faktörlerden değildir? a) Eksplantat büyüklüğü b) Besi Ortamı c) Mevsim d) Işık 2. Meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültüründe en çok kullanılan bitki büyüme düzenleyicilerini yazınız. Sitokinin- BA Auxin NAA 3. Meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültüründe eksplantatın büyüklüğünün önemi nedir? Çok büyük eksplantatların in vitro kültürde yaşama şansı daha yüksektir. Fakat virüssüz bitki elde etmek istiyorsak mümkün oldukça küçük eksplantatlar kullanmalıyız. Hazırlayan: Havvanur SAĞDIÇ Sayfa: 71-77