T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TUZLU KOŞULLARDA ÇİMLENDİRİLEN ARPA KÖKLERİNDE HÜCRE DÖNGÜSÜ, MİTOTİK İNDEKS VE KROMOZOM YAPISINA H 2 O 2 ÖN MUAMELESİNİN ETKİLERİ Aslıhan CESUR Danışman: Yrd. Doç. Dr. Selma TABUR YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ISPARTA 2007

2 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER.. i ÖZET... iii ABSTRACT... v TEŞEKKÜR... vii ŞEKİLLER İZİNİ... viii ÇİZELGELER DİZİNİ.. ix 1. GİRİŞ MATERYAL VE YÖNTEM Deneylerde Kullanılan Tohumlar Tuz (NaCl) Çözeltilerinin Hazırlanması Hidrojen Peroksit Çözeltisinin Hazırlanması İlk İşlem Çözeltisinin Hazırlanması Tespit Çözeltisinin Hazırlanması Boyanın Hazırlanması Tohumların Çimlendirilmesi Kök Uçlarının EldeEdilmesi Boyamanın Yapılması Preparatların Hazırlanması Devamlı Preparatların Hazırlanması Veri Analizlerinin ve İstatistiksel Değerlendirmelerin Yapılması Mitotik İndeksin Belirlenmesi Kromozom Anormalliklerinin Belirlenmesi İstatistiksel Değerlendirme Hücre Döngüsü Analizi ARAŞTIRMA BULGULARI Saf Su Ortamında 20 C de H 2 O 2 Ön Uygulamasının Mitotik İndeks Üzerine Etkileri Saf Su Ortamında 20 C de H 2 O 2 Ön Uygulamasının Kromozom Davranışlarına Etkileri i

3 3.3. Saf Su Ortamında 20 C de H 2 O 2 Ön Uygulamasının Hücre Döngüsüne Etkileri Çeşitli Konsantrasyonlardaki NaCl lü Ortamda Çimlendirilen Arpa Tohumlarının Mitotik İndeksine H 2 O 2 Ön uygulamasının Etkileri Çeşitli Konsantrasyonlardaki NaCl lü Ortamda Çimlendirilen Arpa Tohumlarının Kromozom Davranışlarına H 2 O 2 Ön Uygulamasının Etkileri H 2 O 2 Ön Uygulamasının 20 C de Tuzlu Koşullar Altındaki Hücre Döngüsü Üzerine Etkileri TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR.. 32 ÖZGEÇMİŞ ii

4 ÖZET Yüksek Lisans Tezi TUZLU KOŞULLARDA ÇİMLENDİRİLEN ARPA KÖKLERİNDE HÜCRE DÖNGÜSÜ, MİTOTİK İNDEKS VE KROMOZOM YAPISINA H 2 O 2 ÖN MUAMELESİNİN ETKİLERİ Aslıhan CESUR Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Jüri: Prof. Dr. Hüseyin PADEM Yrd. Doç. Dr. Selma TABUR (Danışman) Yrd. Doç. Dr. Hasan GENÇ Bu çalışmada gerek normal gerekse tuzlu koşullar altında çimlendirilen arpa (Hordeum vulgare L. cv. Tokak 157/37) tohumlarının kök uçlarında mitotik indeks, kromozom davranışları ve hücre döngüsü üzerine hidrojen peroksit (H 2 O 2 )'in etkileri araştırılmıştır. A. Mitotik indeks üzerine H 2 O 2 'in etkileri; ºC de saf su ortamında elde edilen sonuçlar Normal koşullar altında çimlendirilen arpa tohumlarının kök uçlarındaki mitotik indeks üzerinde H 2 O 2 ön uygulaması dikkate değer bir etkiye neden olmamıştır ºC de tuzlu koşullar altında elde edilen sonuçlar a. Tuz, arpa tohumlarının kök ucu mitotik indeksini konsantrasyon artışına paralel olarak engellemiştir. b. Çalışılan tüm tuz seviyelerinde H 2 O 2 ön uygulaması, mitotik indeks üzerinde, kendi kontrolleriyle kıyaslandığında olumlu ya da olumsuz bir etkiye neden olmamıştır. B. Kromozom davranışları üzerine H 2 O 2 'in etkileri; ºC de saf su ortamında elde edilen sonuçlar Normal koşullar altında çimlendirilen arpa tohumlarının kök uçlarındaki kromozom davranışları üzerinde H 2 O 2 ön uygulamasının, kontrol grubuna göre çeşitli tiplerde kromozom anormalliklerine sebep olduğu tespit edilmiştir. H 2 O 2 ön uygulaması, kromozom anormallik yüzdesini de kontrole göre arttırmıştır. iii

5 2. 20 ºC de tuzlu koşullar altında elde edilen sonuçlar a. Tuz, konsantrasyon artışına paralel olarak kromozom anormallik yüzdesinde artışa neden olmuştur. b. Çalışılan H 2 O 2 ön uygulaması, 0.35 ve 0.40 m tuzlulukta kromozom anormallik yüzdesini artırıcı bir etki göstermiştir. Tüm tuz seviyeleri dikkate alındığında en olumsuz etkiyi, 0.40 m NaCl de ortaya çıkarmıştır m tuzlulukta ise hücre bölünmesi tamamen engellendiğinden dolayı kromozom anormallikleri incelenememiştir. C. Hücre döngüsü üzerine H 2 O 2 'in etkileri; ºC de saf su ortamında elde edilen sonuçlar H 2 O 2 ön uygulamalı arpa tohumlarındaki hücre döngüsünde G0- G1 safhasının yüzdesi, saf su ön uygulamalı tohumlara göre önemli derecede bir artış gösterirken, S safhasının yüzdesi dikkate değer bir azalma göstermiştir ºC de tuzlu koşullar altında elde edilen sonuçlar a. Saf su ön uygulamasından sonra NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarındaki hücre döngüsünün G0- G1 ve S safhalarının yüzdelerinde, konsantrasyon artışına paralel olarak bir artış olmuştur. G2- M safhasına ait hücre populasyonunu bulunmamıştır b. H 2 O 2 ön uygulamalı arpa tohumlarında ise, tüm tuz konsantrasyonları kendi kontrol gruplarına göre G0- G1 safhalarının yüzdesini arttırırken, S safhalarının yüzdesini düşürmüştür. Tuz konsantrasyonlarında, G2- M safhasına ait hücre populasyonunu bulunmamıştır. Ayrıca H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlarda hücre boyutunu ifade eden CV değerinin, saf su ön uygulamalı tohumlara göre konsantrasyon artışına paralel olarak tüm tuz seviyelerinde arttığı gözlenmiştir Anahtar Kelimeler: Arpa, hidrojen peroksit, hücre döngüsü, kromozom anormallikleri, mitotik indeks, tuz stresi. 2007, 40 sayfa iv

6 ABSTRACT M.Sc. Thesis EFFECTS OF PRE-TREATMENT OF H 2 O 2 ON CELL CYCLE, MITOTIC INDEX AND CHROMOSOME STRUCTURES DURING GERMINATION OF BARLEY SEEDS IN SALINITY CONDITION Aslıhan CESUR Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Department of Biology Thesis Committee: Prof. Dr. Hüseyin PADEM Asst. Prof. Dr. Selma TABUR (Supervisor) Asst. Prof. Dr. Hasan GENÇ In this work the effects of H 2 O 2 on mitotic index, chromosome behaviours and cell cycle in roor tips of barley seeds (Hordeum vulgare L. cv. Tokak 157/37) germinated under both normal (distilled water) and salinity conditions were studied. A. Effects of H 2 O 2 on mitotic index 1. The results obtained at 20 ºC and in the background of distilled water The pre- treatment of H 2 O 2 had no considered effect on mitotic index in root tips of barley seeds germinated under normal conditions. 2. The results obtained at 20 ºC and in salinity conditions a. In parallel with concentration rise, the negative effects of salt were increased on mitotic index in root tips of barley seeds. b. In the comparison to their self- controls, the pre- treatment of H 2 O 2 had no negative or positive effect on mitotic index in all of the salt levels studies. B. Effects of H 2 O 2 on chromosome behaviours 1. The results obtained at 20 ºC and in the background of distilled water. It was determined that H 2 O 2 pre- treatment caused chromosome abnormalities in various types according to control groups on chromosome behaviours in root tips of barley seeds germinated under normal conditions. Also, H 2 O 2 pretreatment were increased chromosome abnormality percentage according to control. v

7 2. The results obtained at 20 ºC and in salinity conditions a. In parallel with concentration rise, salt were increased on chromosome abnormality percentage. b. It was determined that H 2 O 2 pre- treatment studied were increased chromosome abnormality percentage in 0.35 and 0.40 m salinity. When all salt levels were considired, the most positive effect were exhibited by 0.40 m NaCl. Chromosome abnormality could not be investigated because of 0.45 m salinity completely inhibited cell division. C. Effect of H 2 O 2 on cell cycle 1. The results obtained at 20 ºC and in the background of distilled water It was determined that G0- G1 phase percentage of the cell cycle of barley seeds with H 2 O 2 pre- treatment had an important rise according to control group while S phase percentage were decreased. 2. The results obtained at 20 ºC and in salinity conditions a. In parallel with concentration rise, G0- G1 and S phase percentage in cell cycle of barley seeds germinated in NaCl after distilled water pre- treatment were increased. Cell population belonging to G2- M phase weren't discovered. b. G0- G1 phase percentage in barley seeds with H 2 O 2 pre- treatment were increased according to own control groups of all salt concentration while S phase percentage were decreased. In salt concentrations, cell population belonging to G2- M phase weren't obtained. In addition, CV value in seeds with H 2 O 2 pre- treatment were increased according to seeds with distilled water pre- treatment in parallel with concentration rise all of salt levels. Key Words: Barley, hydrogen peroxide, cell cycle, chromosome abnormalities, mitotic index, salt stress. 2007, 40 pages vi

8 TEŞEKKÜR Bu çalışma konusunu belirleyen, fikirlerini, her türlü ilgi ve desteğini esirgemeyen değerli Danışman hocam, Yrd. Doç. Dr. Selma TABUR a teşekkür ederim. Çalışmalarım boyunca laboratuar imkanlarından rahatlıkla faydalanabilmem için yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen değerli hocam, Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölüm Başkanı Prof. Dr. Yusuf AYVAZ a teşekkür ederim. Tezin deneysel ve yazım aşamalarındaki yardımlarından dolayı değerli hocalarım Prof. Dr. Kudret KABAR, Arş. Gör. Dr. Kürşat ÇAVUŞOĞLU, Arş.Gör. Semra KILIÇ ve arkadaşlarım Kıymet DEMİR ve Siğnem ÖNEY e teşekkür ederim. Tezin İstanbul'da yürütülen deneysel aşamalarında desteklerini esirgemeyen güler yüzlü ve öğrenci dostu DÜZEN LABORATUVARI Lab. Müdürü Sayın Dr. Altan YALÇINER ve Sayın Ayşe KAYAALP olmak üzere, tüm lab. çalışanlarına sundukları imkanlardan ve yardımlarından dolayı teşekkür ederim. Tezi 1441-YL-06 No lu Proje ile destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na ve manevi desteğini her zaman hissettiğim aileme teşekkür ederim. Aslıhan CESUR ISPARTA, 2007 vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1. Flouresan analizatörle belirlenen fazlara göre DNA içeriği Şekil Saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarında normal mitoz evreleri Şekil H 2 O 2 ön uygulaması ile saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarındaki kromozom anormallikleri 15 Şekil H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında profaz safhasında görülen kromozom anormallikleri. 18 Şekil H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında metafaz safhasında görülen kromozom anormallikleri. 19 Şekil H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında anafaz safhasında görülen kromozom anormallikleri. 20 Şekil H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında telofaz safhasında görülen kromozom anormallikleri. 21 viii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.4. H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında mitotik indeks değerleri. 17 Çizelge 3.5. H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarındaki kromozom anormallik yüzdeleri Çizelge 3.6. H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında hücre döngüsü değerleri. 24 ix

11 1. GİRİŞ Hücre bölünmesi makromoleküler düzeyde karmaşık bir takım biyokimyasal olayları içeren ve birbirini izleyen çeşitli işlemler sonucu gerçekleşmektedir. Canlıların büyüme ve gelişmesi, bu canlıları oluşturan hücrelerin düzenli büyüme ve çoğalmasına bağlıdır (Berkes ve Kışlalıoğlu, 1990). Mitotik indeks ise, hücre bölünme frekansını yansıtır ve büyüme gelişme oranını belirlemede önemli bir parametre olarak kullanılır. Mitotik indeksteki azalmaya paralel olarak büyüme ve gelişme olayları da yavaşlar (Jiang ve Liu, 2000). Mitotik aktivite, organizma gelişiminin ve büyümesinin temelidir. Her hücre populasyonunda bölünme ve bölündükten sonra kazandıkları özellikler bakımından farklılıklar gösteren üç alt populasyona rastlanmaktadır. Birinci grupta bir mitozdan diğerine kesintisiz devam eden, sürekli bölünen hücreler bulunmaktadır. İkinci grup hücreler stimulasyonla ancak çoğalmaya giren, durağan hücreler (G0) ve üçüncü grup hücreler ise nöronlar gibi asla yeniden bölünmeyen hücrelerdir (Freifelder, 1985; Hartwell, 1978; Günalp vd., 1989; Darnel vd., 1990; Watson vd., 1992; Watson vd., 1987; Alberts vd., 1989). Tek hücreli organizmalarda olabildiğince hızlı bir gelişme ve bölünme isteği vardır. Ökaryotlardaki birçok hücrede nüklear DNA nın replikasyonu interfazda sınırlı bir zamanda gerçekleşmektedir. Replikasyonun gerçekleştiği bu süreç hücre döngüsünün S safhası, mitozun sonuyla DNA sentezinin başlangıcı arasındaki aralık G1 safhası olarak adlandırılmaktadır. G2 safhası olarak nitelendirilen ikinci aralık da DNA sentezi (S safhası) ile bir sonraki mitoz (M fazı) başlangıcını ayırmaktadır. G2 safhası, büyümenin ve sentezin ikinci dönemi olarak mitozun başlamasına öncülük eder. İnterfazı oluşturan G1, S ve G2 safhalarının süreleri türden türe farklılıklar gösterir ve genel olarak interfaz safhası, total hücre döngüsünün %90 ı veya daha fazlasını kapsar (Mitchison, 1989; Murray ve Kirschner, 1989; Lloyd, 1982; Inoue, 1983). 1

12 Daha önceleri hücre döngüsü, replike olan hücrelerin DNA sının yapısına radyoaktif işaretli nükleotitlerin girmesi ve bu oranların ölçülmesi ile belirlenmiştir. Zamanla DNA ve RNA ya uygulanan spesifik flouresan boyalar ve bu boyalara benzer maddeler, hücre döngüsünün tek hücre düzeyinde bile incelenebilmesine imkan tanımıştır (Riley vd., 1993; Çampınar, 1992). Medikal çalışmalar, tek hücre düzeyinde bile selüler analizlere imkan sağlayan flow sitometri (FCM) ve image analiz gibi tekniklere dayanmaktadır. Bu teknikler hücrenin boyutları ve diğer fiziksel özelliklerinin yanı sıra birçok parametrik değerin belirlenmesine de zemin oluşturmuştur (Van Dilla vd., 1969). Flow sitometrik DNA analizi, bir populasyondaki hücrelerin DNA miktarlarının dağılımının çalışılmasıdır. Hücre populasyonları, bölünen ve bölünmeyen safhalardaki hücrelerin karışımından ibarettir. Böyle bir populasyonda DNA, kendine spesifik flouroklamla işaretlenerek binlerce hücredeki DNA miktarının doğru olarak ölçümünü sağlar. Çift zincir DNA veya RNA bazlarının aralarına girebilen Ethidyum Bromide (EB), Propidium Iodit (PI), Acridin Orange (AO),Choromycine A3 (CA3), Hoeschst , Diamadine Phenylindole (DAPI) ve Mithramycin gibi boyalar flouresan özellik göstermektedir. Bunların içinde DNA analizinde en iyi sonucu veren PI ve EB dir (Lawrance, 1992; Frierson, 1991). FCM yönteminde, bir hücre populasyonu, saniyede birkaç bin hücre aktaran ince bir huniden geçirilir ve bu hücrelerin DNA ları flouresan boya ile boyanır. Elde edilen flouresan yoğunluğu doğrudan doğruya hücrenin içerdiği DNA miktarı ile orantılır. En az DNA içeren hücreler G0-G1 safhasında, bunun iki katı olanlar G2-M safhasında yer alırlar. S safhasındaki hücreler ise ikisinin arasında bir DNA muhtevası gösterir. Döngünün G0-G1, S ve G2-M safha uzunlukları bu üç gruptan birindeki hücrelerin fraksiyonundan hesaplanır (Çampınar, 1992; Kalay, 1996). Diploid miktarda DNA taşıyan hücrelerin her birinde yoğunluğun karşılaştırılması, ilgili hücrelerdeki DNA miktarının belirlenmesini kantitatif olarak sağlar. Bu miktar DNA indeksi (DI) olarak belirlenir ve ploidi analizinde, hücre döngüsü analizinin S safha yüzdesini belirlemede kullanılır. Hücre döngüsünün G0-G1, S ve G2-M 2

13 safhasındaki hücrelerin fraksiyonu DNA dağılımına göre matematiksel olarak belirlenir (Riley vd., 1993; Çampınar, 1992; Sahapiro, 1992; Kalay, 1996). Şekil 1.1. Flouresan analizatörle belirlenen fazlara göre DNA içeriği Biyotik ve çevresel streslerin, hücre bölünmesi ve mitotik indeks üzerinde önemli derecede azalmaya ve kromozom anormalliklerine (Avalbaev vd., 2003), ayrıca ekonomik önemi olan tahıllar dahil, tüm bitkilerin normal fizyolojik işlevlerinde değişikliklere yol açtığı bilinmektedir. Tüm bu stresler bitkilerin biyosentetik kapasitelerini azaltır, normal fonksiyonlarını değiştirir ve bitkinin ölümüne yol açabilecek zararlara neden olabilir (Lichtenhaler, 1996). Çevresel streslerin en önemlilerinden biri olan tuzluluk, kurak ve yarı kurak iklim bölgelerinde, tarımsal üretimin başladığı çağlardan beri üreticiler için büyük bir sorun olmuştur. Dünya genelinde yağışların yıldan yıla azalması ve her yıl 10 milyon hektar arazinin tuzlanma nedeni ile elden çıkması, sorunun boyutunu daha iyi gözler önüne sermektedir (Kwiatowski, 1998). Bitkilerde, tuz stresine neden olan suda eriyebilir formdaki tuzlar, kayaların bünyesindeki primer minerallerin fiziksel parçalanma ve kimyasal ayrışımları sonucu açığa çıkmaktadır. Ancak, tuzluluk 3

14 problemi daha ziyade tuzların ayrıştıkları yerlerden sular aracılığı ile taşınıp düz ve alçak yerlerde birikmeleri sonucu oluşmaktadır. Diğer taraftan arazinin jeolojik yapısı da tuzlu toprakların oluşmasında önemli bir faktördür (Tuncay, 1983). Tuzlu topraklar çeşitli tuz tipleri içermektedir ve bunların her biri bitki büyüme ve gelişmesi üzerinde farklı derecede etkili olmaktadır (Younis ve Hatata, 1971; Redmann, 1974; Hardegree ve Emmerich, 1990; Tobe vd., 2003). Ayrıca tuzlu toprakların bileşimi de bölgeler arasında farklılıklar göstermektedir (Tobe vd., 2002). Toprak bünyesinde karbonatlar, sülfatlar, klorürler, nitratlar ve boratlar gibi çeşitli tuz tiplerine rastlamak mümkündür. Sodyum klorür (NaCl) ise en yaygın rastlanılan ve çözünürlüğünün çok yüksek olmasından dolayı toksik etkisi en fazla olan tuz tipidir (Çelik, 2005). Ülkemiz topraklarının büyük bir kısmı ( ha) arzu edildiği şekilde tuzsuzdur, bunu sırasıyla hafif tuzlu topraklar ( ha), orta tuzlu topraklar ( ha) ve çok tuzlu topraklar ( ha) izlemektedir (Haktanır vd., 2000). Halen üzerinde tarım yapılabilen ve verim gücü yüksek olan topraklarımız için de her geçen gün tuzlanma ve dolayısı ile çoraklaşma tehlikesi artmaktadır. Ekonomik potansiyeli daha çok tarıma dayalı olan ülkemizde, daha ekonomik yöntemlerle, tuzlu toprakları da kullanarak ekim alanlarının genişletilmesi ve ekilen sahalardan mümkün olan en yüksek verimin alınması zorunluluğu vardır. Toprağın tuzlanması, bitki gelişimi için hiç de uygun olmayan koşulların doğmasına yol açar. Tuzun, tohum çimlenmesi (Kabar, 1987; Al-Karaki, 2001; Dash ve Panda, 2001), fide büyümesi (Mutlu ve Bozcuk, 2000; Ashraf vd., 2002), enzim aktivasyonu (Sheoran, 1980; Prakash ve Prathapasenan, 1988), DNA, RNA ve protein sentezi (Tal, 1977; Anuradha ve Rao, 2001) ve mitoz bölünmeyi engellemek suretiyle bitki büyüme ve gelişmesi üzerinde olumsuz etki yaptığı bilinmektedir. Tuzların hücre duvarı ve membranların fonksiyonunu etkilediği NaCl ile yapılan deneylerden bilinmektedir (Tobe vd., 2004). NaCl; bitki hücrelerinde plazma membranlarının geçirgenliğini etkiler, dış iyonların içeriye akışını ve sitosolik 4

15 eriyiklerin de dışarıya akışını artırır (Cramer vd., 1985; Kent ve Läuchli, 1985; Zidan vd., 1991; Allen vd., 1995). Ayrıca hücre duvarının sertleşmesine (Neumann, 1993; Neumann vd., 1994; Nabil ve Coudret, 1995) ve plazma membranının su taşıma yeteneğinin düşmesine neden olur (Azaizeh vd., 1992; Cramer, 1992). Tuzların, hücre duvarı ve hücre membranı üzerindeki bu etkilerinin, sitosolün su potansiyelini, hücresel genişlemesini ve dolayısıyla tohumun çimlenmesini etkileyebileceği belirtilmektedir (Tobe vd., 2004). Osmotik stres ve iyon toksisitesi tuz stresinden kaynaklanan problemlerdir ve kimyasal aktivitede meydana gelen azalma, hücrelerde turgor kaybına neden olur. Hücre büyümesi, hücre duvarları gerilimi için turgora ihtiyaç duyar ve turgorun olmayışı hücrenin yaşamını sürdürmesi için tehlike oluşturur (Proft ve Serrano, 1999). Tuzun, hücre genişlemesinin daha yetersiz olmasına neden olabileceği (Volkmar vd., 1998) ve DNA sentezine zarar verebileceği de belirtilmiştir (Waisel, 1972). YI Hui-Ian 2001 de yapmış olduğu; Tuz stresi altında çimlendirilen Hordeum vulgare de hücre bölünmesi ve kromozom davranışları adlı çalışmasında tuz çözeltisinin kardeş kromatit değişimi ve kromozom davranışları üzerine etkilerini araştırmış ve mikronükleus, kromozomlarda fragment oluşumu, anafazda köprü oluşumu ve düzensiz anafaz gibi kromozom anormalliklerinin olduğunu tespit etmiştir. Aynı araştırıcı NaCl ün, konsantrasyon ve uygulama süresine bağlı olarak mitotik indeksi etkilediğini de vurgulamıştır. Tuzluluk, sıcaklık, kuraklık, UV-radyasyon ve yaralanma gibi biyotik ve çevresel streslere maruz kalan bitkilerde H 2 O 2, söz konusu streslere karşı tepki gösteren önemli bir moleküldür. Bir çok araştırıcı (Federico ve Angelini, 1986; Svalheim ve Robertsen, 1993; Laurenzi vd., 1999) bitki hücrelerinde lignin biyosentezinin ve hücre duvarı sertleşmesinin H 2 O 2 e bağlı olduğunu tutarlı bulgularla rapor etmişlerdir. Bitkilerde etki mekanizması bakımından H 2 O 2 in, oksidatif strese karşı koruyucu görev üstlenmesi ve oksidatif stres bileşiği olması şeklinde çift role sahip olduğu ileri sürülmüştür (Prasad vd., 1994). Öncelikle, H 2 O 2 in tohum dormansisini kırdığı (Jann 5

16 ve Amen, 1977) ve doza bağlı olarak tohum çimlenmesini teşvik ettiği (Ogawa ve Iwabuchi, 2001) bildirilmiştir. Diğer taraftan ise H 2 O 2 in konsantrasyon artışına paralel olarak mısırda kök uzamasını engellediği belirtilmiştir (de Marco ve Roubelakis-Angelakis, 1996). Ayrıca Lupinus albus L. (acı bakla) ile yapılan çalışmada H 2 O 2 in tohum çimlenmesi üzerinde, olumlu ya da olumsuz bir etkisinin olmadığı rapor edilmiştir (Cano ve Moral, 1997). Yapılan literatür araştırmalarında H 2 O 2 in mitotik indeks, kromozom davranışı ve hücre döngüsü üzerine etki edip etmediği konusunda yeterli bilgiye rastlanmamıştır. Bu tez çalışmasında; Hidrojen peroksitin, normal koşullarda çimlendirilen arpa tohumlarının kök uçlarında mitotik indeks, kromozom davranışları ve hücre döngüsü üzerine etkilerini gözlemlemek, H 2 O 2 in tuz stresini yenip yenemediğini, hücrelerin mitoz bölünmeye girişini teşvik edip etmediğini, kromozomların yapısında ve davranışında herhangi bir değişikliğe neden olup olmadığını ve hücre döngüsünde safhalar üzerine ne ölçüde etki ettiğini açıklığa kavuşturmak amaçlanmıştır. 6

17 2. MATERYAL VE YÖNTEM 2.1. Deneylerde Kullanılan Tohumlar Deneylerde, Ankara Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü nden sağlanan arpa (Hordeum vulgare L. var. Tokak 157/37) tohumları kullanılmıştır. Arpa tohumları kullanılmadan önce yüzey sterilizasyonuna tabi tutulmuştur. Bunun için tohumlar % 1 lik sodyum hipokloritte 10 dakika tutulduktan sonra beş defa saf su ile yıkanıp filtre kağıtları üzerinde oda sıcaklığında kurutulmuşlardır (Baltepe ve Mert, 1973) Tuz (NaCl) Çözeltilerinin Hazırlanması Deneylerde kullanılan NaCl, Merck firmasından sağlanmıştır. Kullanılan tuz konsantrasyonları molal olarak: m dır Hidrojen Peroksit Çözeltisinin Hazırlanması Deneylerde kullanılan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) stok çözeltisi Merck firmasından sağlanmıştır. Deneylerde 30 mm konsantrasyonda H 2 O 2 kullanılmıştır. H 2 O 2 ve tuz çözeltileri kullanılmadıkları sürece 4 C de buzdolabında saklanmışlardır İlk İşlem Çözeltisinin Hazırlanması İlk işlem çözeltisi olarak, doymuş paradiklorbenzen çözeltisi kullanılmıştır. Çözelti, içerisinde 500 cm 3 distile su bulunan ağzı mantar kapaklı bir şişe içerisine, 10 g paradiklorbenzen kristalinin konularak bu karışımın bir gece 60 C ye ayarlı etüvde bekletilmek suretiyle hazırlanmıştır (Elçi, 1982). 7

18 2.5. Tespit Çözeltisinin Hazırlanması Tespit çözeltisi olarak asetik alkol kullanılmıştır. Çözelti; 1 kısım glasial asetik asitin, 3 kısım absolü alkol ile karıştırılması suretiyle hazırlanmıştır (Elçi, 1982) Boyanın Hazırlanması Mitoz bölünme ve kromozomların iyi bir şekilde görünebilmesini sağlamak amacıyla, yapısında kristal halde fuksin bazik bulunan Feulgen boyası kullanılmıştır. Feulgen boyası, Elçi (1982) nin metoduna göre aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır: 1 g kristal haldeki fuksin bazik alınarak 8 cm çapında bir saat camı içerisinde ezilmiştir. 500 cm 3 lük bir erlenmayere, ezilerek toz haline getirilmiş fuksin bazik kabın etrafına bulaştırmadan konulmuştur. Başka bir erlenmayerde 200 cm 3 distile su kaynatılmıştır. Toz halindeki fuksin bazik üzerine kaynatılmış distile su yavaş yavaş dökülerek bir cam çubuk yardımı ile sürekli karıştırılmıştır. Boya 50 C ye düşürülünceye kadar karıştırılmaya devam edilmiştir. Boyaya 20 cm 3 HCl ilave edilerek filtre kağıdı yardımıyla süzülmüştür. Süzülen boyaya 2 g potasyum metabisülfit (K 2 S 2 O 3 ) eklenerek 2 dakika süresince karıştırılmaya devam edilmiş ve boya kapaklı bir şişeye konularak 24 saat buzdolabında bekletilmiştir. Açık çay rengini alan boya kullanıma hazır hale gelmiştir. Sonraki kullanımlar için boya 4 C de buzdolabında depolanmıştır Tohumlarım Çimlendirilmesi Tohumları çimlendirme işlemleri 20 C sabit sıcaklıkta, sürekli karanlıkta ve etüvde yapılmıştır. 8

19 İlk olarak; yeterli sayıda, dolgun görünüşlü, sağlam ve birbirine benzer olan tohumlar seçilerek beherde, belirli hacimdeki (50 ml) saf su (kontrol, K) ve başka bir beher içerisinde de 50 ml 30 µm H 2 O 2 de 24 saat oda sıcaklığında ön muameleye tabi tutulmuşlardır. Bu ön uygulama sonunda çözeltiler süzülüp tohumlar vakumda kurutulmuştur (Braun ve Khan, 1976). Her uygulamaya ait 25 arpa tohumu, tabanı, etüvde 115 C de sterilize edilmiş iki tabaka filtre kağıdı ile kaplı 7 ml çeşitli konsantrasyonlarda NaCl ( m) çözeltileri içeren, önceden otoklavda sterilize edilmiş 10 cm çaplı petriler içine hilumları altta olacak şekilde düzenli olarak yerleştirilmiştir. Ekimin hemen ardından yukarıda belirtilen sabit sıcaklığa ayarlı etüve çimlenmek üzere yerleştirilmiştir (Çavuşoğlu, 2006) Kök Uçlarının Elde Edilmesi 20 C de etüvde çimlendirilen tohumlardan çıkan ve 1-1,5 cm uzunluğa ulaşan kök uçları kesilerek küçük şişeler içerisine alınıp paradiklorbenzen ile 4 saat süreyle ilk işleme tabi tutulmuştur. Daha sonra kök uçları asetik alkol (1: 3) tespit çözeltisinde 24 saat bekletilmiştir. Tespit işleminden sonra kök uçları preparat hazırlanması ve incelenmesi aşamalarında kullanılmak üzere içerisinde % 70 lik alkol bulunan küçük şişelere alınarak 4 C de buzdolabında depolanmıştır (Elçi, 1982) Boyamanın Yapılması % 70 lik alkolden çıkarılan kök uçları birkaç kez musluk suyu ile yıkanmıştır. Yıkama sonrası kök uçları 1 N HCl içerisinde 60 ºC ye ayarlanmış etüvde, gruplara göre değişen sürelerde (15-18 dk) hidroliz yapılmıştır. Hidroliz işlemi sonrası kök uçları tekrar musluk suyu ile yıkanarak gruplara göre değişen sürelerde (1-1,5 saat) Feulgen içerisinde bekletilmiştir. Daha sonra boyamanın daha iyi olabilmesi için kök uçları 15 dakika kadar musluk suyunda bekletilmiştir (Elçi, 1982). 9

20 2.10. Preparatların Hazırlanması Preparat hazırlamak için; % 45 lik asetik asitten bir damla lam üzerine konulup keskin bir jiletle kök ucunun koyu viole renk almış olan 1-2 mm lik uç kısmı kesilmiştir. % 45 lik asetik asitten ok uçlu iğne yardımıyla bir damla alınarak kesilen kök ucunun üzerine getirilmiş ve sonra kök ucu bu damla içerisinde jilet yardımıyla iyice parçalanmıştır. Bu parçacıkların üzerine lamel kapatılmıştır. Bir elin başparmağı ile lamel oynatmadan tutularak diğer ele alınan kurşun kalemin arka kısmıyla lamele hafif hafif vurulmuştur. Böylece hem hücrelerin daha iyi dağılması sağlanmış hem de hücreler yassılaştırılarak mitotik evrelerin görünümü kolaylaştırılmıştır. Preparatın içinde kalan hava kabarcıklarını gidermek için, lamelin kenarına % 45 lik asetik asit damlatılmış ve bu damla lamelin kenarında dolaştırılarak hava kabarcıkları giderilmiştir. Fazla asit kurutma kağıdı ile çekilmiştir. Daha sonra, preparat kurutma kağıdı arasına konulmuş ve lamelin her tarafına aynı şiddetle temas edecek şekilde başparmak ile kuvvetlice bastırılmıştır. Böylece, parçacıkların tek bir hücre tabakası haline gelmesi sağlanmıştır (Elçi, 1982) Devamlı Preparatların Hazırlanması Hazırlanan preparatların devamlı hale getirilmesinde, hücrelerin olduğu gibi muhafaza edilebilmesi için lam ve lamelin birbirinden ayrılmaması gerektiğinden, alkol buharı değiş-tokuş yöntemi kullanılmıştır. Bunun için şalelerin içi kısmına ve kapağın iç tarafına kurutma kağıdı yerleştirilmiştir. Kapağa ve kabın iç çeperlerine yerleştirilen kurutma kağıdı absolü alkol ile nemlendirilmiş ve kabın dip kısmına 3-4 mm kadar absolü alkol konulmuştur. Alkol buharının uçmasını önlemek için kabın ağzına ve kapağın etrafına vazelin sürülmüştür. Devamlı yapılmak istenen preparatlara, gerekli bilgilerin yazılı olduğu etiketler yapıştırılmıştır. Preparatlar, yukarıda anlatıldığı şekilde hazırlanan şalelere konulmuş ve bir gece 0-4 C de buzdolabında bekletilmiştir. Ertesi gün buradan çıkarılan preparatlar, içine ve kapağına, absolü alkol ile nemlendirilmiş kurutma kağıdı yerleştirilmiş olan petri kutularının içine konulmuştur. Lamelin iki kenarına birer 10

21 damla kanada balsamı damlatılmış ve bu damlalar lamelin üç kenarını kapatacak şekilde yayılmıştır. Petri kutusunun kapağı kapatılarak 4-5 gün oda sıcaklığında bekletilmiştir. Böylece kurutulan preparatlar, devamlı preparat haline getirilmiştir (Elçi, 1982) Veri Analizlerinin ve İstatistiksel Değerlendirmelerin Yapılması Mitotik İndeksin Belirlenmesi Hazırlanan preparatlar mikroskopta 100X büyütmede incelenmiş, her konsantrasyon ve uygulama için 3 tekrar yapılarak yaklaşık 2000 hücre sayılmıştır. Daha sonra mitoz bölünmedeki hücreler sayılıp mitotik indeks; formülü ile belirlenmiştir Kromozom Anormalliklerinin Belirlenmesi Preparatların mikroskopik gözlemleri sırasında, kromozom anormalliklerine dikkat edilerek, anormallik yüzdesi; formülü ile belirlenmiştir. Kromozom anormalliklerinin fotoğrafları, Olimpus CX41 Araştırma mikroskobunda 100X büyütme ile ve C WZ marka fotoğraf makinesi ile çekilmiştir. 11

22 İstatistiksel Değerlendirme Tüm parametrelerle ilgili istatistiksel değerlendirme SPSS 14.0 programı kullanılarak Duncan s multiple range testine göre gerçekleştirilmiştir Hücre Döngüsü Analizi Flow sitometri ile yapılan hücre döngüsü analizi İstanbul Düzen Laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. 15 dk hidroliz işleminden sonra kök uçları, 1-2 ml saf su içerisinde bir jilet yardımıyla olabildiğince küçük olacak şekilde parçalanmıştır. Bir enjektörle saf su içerisindeki kök ucu parçaları önce enjektöre çekilip sonra geri bırakılarak hücrelerin çok iyi şekilde dağılması sağlanmıştır. Sonrasında süspansiyon halindeki sıvı, DNA- mech kullanılarak, bir adet cam tüp içerisine süzülmüştür. Cam tüpe 40 µl LPR ilave edilmiş ve çalkalayıcıda 1-2 dk hücre zarlarının delinmesi amacıyla çalkalanmıştır. 800 µl propidium iodit (PI) boyası cam tüpe ilave edilmiş ve 10 dk boyanmıştır. Son olarak cam tüp flow sitometriye koyularak, hücrelerin sayımı başlamış ve hücre döngüsü belirlenmiştir. 12

23 3. ARAŞTIRMA BULGULARI Materyal ve yöntem bölümünde de belirtildiği gibi, hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ile ön uygulamaya tabi tutulan arpa tohumları 20 C de, saf su ortamında ve tuzlu koşullarda çimlenmeye bırakılmışlardır. Böylece normal ve tuzlu koşullardaki tohum çimlenmesi sırasında, H 2 O 2 in, mitotik indeks, kromozom davranışları ve hücre döngüsü üzerindeki etkilerini incelemek ve bunları birbirleriyle karşılaştırmak amacıyla bu çalışma düzenlenmiştir Saf Su Ortamında 20 C de H 2 O 2 Ön Uygulamasının Mitotik İndeks Üzerine Etkileri Çimlenmiş tohumlardan elde edilen kök uçları ile preparatlar hazırlanmıştır. Bu preparatlarda yapılan hücre sayım işlemleri sonucunda hesaplanan mitotik indeks değerleri Çizelge 3.4 de verilmiştir. Çalışılan H 2 O 2 ön uygulaması, saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarının mitotik indeksi (0.07) üzerinde, kontrolüne (K) (0.06) göre nispeten teşvik edici bir etki göstermiştir. Diğer bir ifadeyle, H 2 O 2 ile ön uygulama yapılan tohumların mitotik indeksi, kontrolü olan grubun değerlerine göre ihmal edilebilir derecede az bir artış gösterdiği tespit edilmiştir Saf Su Ortamında 20 C de H 2 O 2 Ön Uygulamasının Kromozom Davranışlarına Etkileri Yapılan incelemeler sonucunda saf su ortamında çimlendirilen kontrol grubu arpa tohumlarının hücrelerindeki kromozom yapılarında her hangi bir anormalliğe rastlanılmamış ve mitoz bölünmenin tüm evreleri normal şeklinde gözlenmiştir (Şekil 3.2.1) 13

24 a b c d Şekil Saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarında normal mitoz evreleri, a) Profaz; b) Metafaz 2n = 14 kromozom; c) Anafaz; d) Telofaz H 2 O 2 ile ön uygulamaya tabi tutulan ve 20 C de saf su ortamında çimlenen arpa tohumlarından alınan kök uçlarıyla hazırlanan preparatlarda gözlenen kromozom davranışları Şekil de gösterilmiştir. Söz konusu kromozom anormalliklerinin çoğu; profaz safhasında mikronükleus oluşumu, düzensiz metafaz, metafazda kromozomların sarmallanamaması, anafazda kromozom köprüleri şeklindedir. 14

25 a b c d Şekil H 2 O 2 ön uygulaması ile saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarındaki kromozom anormallikleri, a) Profazda mikronükleus oluşumu; b) Düzensiz metafaz; c) Metafazda kromozomların sarmallanamaması; d) Anafazda kromozom köprüsü Kromozom anormalliklerini belirlemek üzere yapılan sitolojik incelemeler sonucunda, saf su ortamında çimlendirilen kontrol grubu arpa tohumlarının kromozom yapılarında herhangi bir anormalliğe rastlanılmamasına karşın, çalışılan H 2 O 2 ön uygulamasında çeşitli tiplerde kromozom anormallikleri tespit edilmiştir. Bu anormalliklerin yüzde oranları ise Çizelge 3.5 de verilmiştir. H 2 O 2 ön uygulaması, saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarının kromozom davranışları üzerine etkisini (1.58), kontrolüne göre (0.0) önemli bir derecede arttırmıştır. 15

26 3.3 Saf Su Ortamında 20 C de H 2 O 2 Ön Uygulamasının Hücre Döngüsüne Etkileri H 2 O 2 ile ön uygulamaya tabi tutulan ve 20 C de saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarında hücre döngüsü değerleri Çizelge 3.6 da verilmiştir. H 2 O 2 ön uygulamalı arpa tohumlarında hücre döngüsünün G0- G1 safhasının yüzdesi, saf su ön uygulamalı tohumlara göre önemli derecede bir artış gösterirken S safhasının yüzdesinde dikkate değer bir azalma olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca hücre boyutu olarak ifade edilen CV değeri de H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlarda, saf su ön uygulamalı tohumlara göre nispeten bir artış göstermiştir Çeşitli Konsantrasyonlardaki NaCl lü Ortamda Çimlendirilen Arpa Tohumlarının Mitotik İndeksine H 2 O 2 Ön Uygulamasının Etkileri Tuzlu koşullar altındaki çimlenme esnasında, mitotik indeks değerine H 2 O 2 in etkinlik derecesini belirlemek amacıyla yapılan bu çalışmadan elde edilen mitotik indeks değerleri Çizelge 3.4 de verilmiştir. Tuz, konsantrasyon artışına paralel olarak, kontrol ve uygulama gruplarında, arpa tohumlarının mitotik indeksini önemli ölçüde azaltmıştır. Örneğin; kontrol grubunda, saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarının mitotik indeksi 0.06 iken, 0.35 m ve 0.40 m da 0.02; 0.45 m da 0.01 olmuştur. Benzer şekilde H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlarda mitotik indeks, tuz konsantrasyonu artışıyla olumsuz bir etki göstermiştir. Diğer bir ifade ile H 2 O 2 ön uygulamalı tohumların saf su ortamındaki mitotik indeks değeri 0.07 iken bu değer tuz konsantrasyonuna bağlı olarak azalmıştır. Genel olarak saf su ve H 2 O 2 ön uygulamalı tohumların, aynı konsantrasyonlardaki tuz çözeltilerinde çimlendirilmesi sonucu elde edilen mitotik indeks değerleri karşılaştırıldığında, H 2 O 2 ön uygulamasının dikkate değer bir etki göstermediği tespit edilmiştir (Çizelge 3.4). 16

27 Çizelge 3.4. H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında mitotik indeks değerleri Mitotik İndeks Ön NaCl (m) Uygulama Kontrol (Saf su) *0.06±0.03 bc 0.02±0.00 a 0.02±0.01 a 0.01±0.01 a H 2 O ±0.02 c 0.02±0.01 a 0.03±0.01 ab 0.00±0.00 a (30 mm) * Her bir parametre sütununda aynı harfle gösterilen değerler arasındaki fark (p < 0,05) düzeyinde önemsizdir. ± Standart sapma 3.5. Çeşitli Konsantrasyonlardaki NaCl lü Ortamda Çimlendirilen Arpa Tohumlarının Kromozom Davranışlarına H 2 O 2 Ön Uygulamasının Etkileri H 2 O 2 ön uygulamasına tabi tutulup çeşitli konsantrasyonlardaki ( m) NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarından elde edilen kök uçlarından hazırlanan preparatlarda gözlenen kromozom anormallikleri Şekil Şekil de verilmiştir. H 2 O 2 ön uygulamasına tabi tutularak çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında en sık rastlanan kromozom anormalliklerinin, profazda mikronükleus (Şekil a- d), metafazda fragment oluşumu (Şekil a, b), ekvatoryal plağın iki parçaya bölünmesi (Şekil c, d), düzensiz metafaz (Şekil e, f) ve yapışık kromozomlar (Şekil g, h), anafazda, geri kalmış kromozomlar (Şekil a, b), kromozom köprüleri (Şekil c, d), düzensiz anafaz (Şekil e, f) ve yanlış kutuplaşma (Şekil g, h), telofazda ise geri kalmış kromozom (Şekil a, b), kromozom köprüsü (Şekil c, d) ve yanlış kutuplaşma (Şekil e, f) olduğu tespit edilmiştir. 17

28 a b c d Şekil H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında profaz safhasında görülen kromozom anormallikleri, a- d) Profazda mikronükleus oluşumu 18

29 a b c d e f g h Şekil H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında metafaz safhasında görülen kromozom anormallikleri, a, b) Fragment oluşumu; c, d) Ekvatoryal plağın iki parçaya bölünmesi; e, f) Düzensiz metafaz; g, h) Yapışık kromozomlar 19

30 a b c d e f g h Şekil H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında anafaz safhasında görülen kromozom anormallikleri, a, b) Geri kalmış kromozom; c, d) Kromozom köprüsü; e, f) Düzensiz anafaz; g, h) Yanlış kutuplaşma 20

31 a b c d e f Şekil H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında telofaz safhasında görülen kromozom anormallikleri, a, b) Geri kalmış kromozom; c, d) Kromozom köprüsü; e, f) Yanlış kutuplaşma 21

32 Tuzlu koşullar altındaki çimlenme esnasında, kromozom anormallik yüzdesine H 2 O 2 in etkinlik derecesini belirlemek amacıyla yapılan bu çalışmada elde edilen kromozom anormallik yüzdeleri Çizelge 3.5 de verilmiştir. Çizelge 3.5. H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarındaki kromozom anormallik yüzdeleri Kromozom Anormallikleri (%) Ön Uygulama NaCl (m) Kontrol (Saf su) *0.0±0.0 a 1.0±1.0 ab 6.26±0.75 c 5.53±0.92 c H 2 O 2 (30 mm) 1.58±0.52 b 5.23±0.40 c 10.0±1 d 0.00±0.00 a *Her bir parametre sütununda aynı harfle gösterilen değerler arasındaki fark (p < 0,05) düzeyinde önemsizdir. ± Standart sapma Tuz, konsantrasyon artışına paralel olarak, kromozom anormallik yüzdesinde artışa neden olmuştur. Saf su ortamında çimlendirilen kontrol tohumlarında herhangi bir kromozom anormalliğine rastlanmazken, 0.35 m da 1.0, 0.40 m da 6.26 ve 0.45 m da 5.53 oranında kromozom anormalliği belirlenmiştir. Diğer bir ifadeyle yüksek konsantrasyonlarda görülen kromozom anormallik yüzdesinin kontrol grubuna göre oldukça yüksek olduğu tespit edilmiştir. Aynı şekilde H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlarda kromozom anormallik yüzdeleri tuz konsantrasyonunun artışıyla önemli derecede artış göstermiştir. Ancak 0.45 m tuzlulukta hücre bölünmesi tamamen engellendiğinden dolayı kromozom anormallikleri incelenememiştir. 22

33 Tüm tuz konsantrasyonları dikkate alındığında en fazla kromozom anormalliğinin H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlardaki 0.40 m tuz konsantrasyonunda (10.0) görüldüğü tespit edilmiştir (Çizelge 3.5) H 2 O 2 Ön Uygulamasının 20 C de Tuzlu Koşullar Altındaki Hücre Döngüsü Üzerine Etkileri Saf su ve H 2 O 2 ön uygulamalarından sonra optimum sıcaklık olan 20 C de çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamlarda çimlendirilen arpa tohumlarında hücre döngüsü değerleri Çizelge 3.6 da verilmiştir. Saf su ön uygulamasından sonra NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarındaki hücre döngüsünün G0- G1 ve S safhalarının yüzdesinde tuz konsantrasyonunun artışına paralel olarak bir artış olduğu gözlenmiştir. Diğer bir ifade ile saf su ön uygulamalı arpa tohumlarının G0-G1 safhasının yüzde oranı, kontrol grubunda iken, 0.35 m tuzlulukta bu oran 64.71, 0.40 m tuzlulukta ve 0.45 m tuzlulukta değerine ulaşmıştır. Aynı şekilde S safhasının yüzde oranı kontrol grubunda olmasına karşın, 0.35 m tuzlulukta 35.29, 0.40 m tuzlulukta ve 0.45 m tuzlulukta olarak tespit edilmiştir. Diğer taraftan G2-M safhasının yüzde oranı kontrol grubunda 8.98 olarak belirlenmesine rağmen, çalışılan tüm tuz konsantrasyonlarında söz konusu parametreye ait hücre populasyonuna rastlanmamıştır. H 2 O 2 ön uygulamalı arpa tohumlarındaki hücre döngüsünün G0- G1 safhasının yüzdesi, tüm tuz konsantrasyonlarında kendi kontrol gruplarına, yani saf su ön uygulamalı tohumlara göre önemli derecede bir artış gösterirken, S safhasının yüzdesinde azalma olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca hücre boyutu olarak ifade edilen CV değerinin de H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlarda, saf su ön uygulamalı tohumlara göre tüm tuz seviyelerinde konsantrasyon artışına paralel olarak arttığı gözlenmiştir (Çizelge 3.6). 23

34 Çizelge 3.6. H 2 O 2 ön uygulamasından sonra çeşitli konsantrasyonlardaki NaCl lü ortamda çimlendirilen arpa tohumlarında hücre döngüsü değerleri NaCl Ön G0-G1 S G2-M CV (m) Uygulama (%) (%) (%) (%) 0.0 Kontrol (Safsu) H 2 O 2 (30 mm) Kontrol (Safsu) H 2 O 2 (30 mm) Kontrol (Safsu) H 2 O 2 (30 mm) Kontrol (Safsu) H 2 O 2 (30 mm)

35 4. TARTIŞMA ve SONUÇ Bu çalışmada H 2 O 2 in gerek normal, gerekse tuz stresi koşullarındaki tohum çimlenmesi esnasında mitotik indeks, kromozom davranışları ve hücre döngüsü üzerine etkileri karşılaştırmalı olarak araştırılmıştır. Kromozomlarla ilgili çalışmalarda, özellikle hücre bölünmesi ve kromozom anormalliklerinin belirlenmesi için çok değişik metotlar geliştirilmiştir. Bu metotların hepsinin ortak yanı hücre bölünmesi sırasında bölünmeyi kontrol edecek ön uygulama çözeltilerinin kullanılmasıdır. Bunun için değişik araştırıcılar tarafından, 8-hidroksikinolin (Rousi,1961), α-monobromonaftalin (Kuta, 1980; Elçi, 1982), paradiklorbenzen (Elçi, 1982; Sharma ve Gupta, 1982; Tabur vd., 2000, 2002), kolkisin (Guidetta Roti- Michelozzi, 1986; Terziiski ve Dimitrov, 1983) ve erimekte olan buz (Ladizinsky ve Hadassa, 1984; Maxted vd., 1991) gibi ön uygulama çözeltileri kullanılmıştır. Çalışmamızda paradiklorbenzenin doymuş çözeltisi ile ön uygulamanın daha iyi sonuç verdiği gözlenmiştir. Böylece çalışmamızda Elçi (1982), Sharma ve Gupta (1982) ve Tabur (2000, 2002) un uyguladığı metot esas alınmıştır. Feulgen ile yapılan boyamalarda kromozomların optimum boyayı almalarının en önemli kurallarından birisi hidroliz süresinin materyale göre doğru belirlenmiş olmasıdır (Elçi, 1982). Bunun için Fox (1969) un belirttiği gibi en uygun hidroliz, 60 o C de 1 N HCl içerisinde materyalin 5 ile 20 dakikaya kadar çeşitli sürelerde bekletilmesiyle yapılmaktadır. Çalışmamızda arpa tohumları için hidroliz süresi 15 dakika olarak bulunmuştur. Ancak yüksek tuz konsantrasyon gruplarında bu süre 18 dakikaya kadar arttırılmıştır. Hidroliz işlemi sonrası kök uçları tekrar musluk suyu ile yıkanarak gruplara göre değişen sürelerde (1-1,5 saat) Feulgen içerisinde boyanmıştır (Elçi, 1982). Yapılan literatür araştırmalarında, H 2 O 2 in mitotik indeks, kromozom davranışları ve hücre döngüsü üzerine etkileri ile ilgili yeterli çalışmaya rastlanmamıştır. Bu nedenle H 2 O 2 in stres koşulları altında bu parametreler üzerindeki etkilerine geçmeden önce 25

36 optimum sıcaklık olan 20 o C de saf su ortamında yani stressiz koşullarda çimlenme esnasındaki etkilerinin karşılaştırılması uygun bulunmuştur. Araştırma bulguları bölümünde 3.1 alt başlığı altında da görüldüğü gibi H 2 O 2 ile ön uygulama yapılmamış (kontrol, K) arpa tohumlarının mitotik indeks değeri 0.06 iken, H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlarda bu değer 0.07 olmuştur. Diğer bir ifade ile H 2 O 2 ön uygulaması, kontrol grubuna göre mitotik indeks üzerinde dikkate değer bir artışa neden olmamıştır (Bkz. Çizelge 3.4). Ancak yapılan sitolojik incelemeler sonucunda, saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarında kromozom anormallikleri gözlenmemesine karşın, H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlarda genellikle çeşitli tiplerde ve yüzdelerde kromozom anormallikleri tespit edilmiştir (Bkz. Çizelge 3.5). H 2 O 2 in, profazda mikronükleus oluşumu, düzensiz metafaz, metafazda kromozomların sarmallanamaması ve anafazda kromozom köprüsü gibi anormalliklerin oluşumuna neden oldukları, ilk defa bu çalışma ile ortaya konulmuştur (Bkz. Şekil 3.2.2). H 2 O 2 ön uygulamasının stressiz koşullarda hücre döngüsü üzerindeki etkilerine bakılacak olursa, G0- G1 safhasının yüzdesi kendi kontrolüne göre bir artış gösterirken, S safhasının yüzdesi azalmıştır. Ayrıca CV değerinde de minimal bir artış gözlenmiştir. Yine kontrol grubu tohumlarının G2- M safhası 8.98 gibi bir değere sahipken, H 2 O 2 ön uygulamalı tohumlarda bu değer sıfırlanmıştır. Bu da H 2 O 2 nin bu safhadaki DNA, RNA ve protein sentezini engelleyerek büyüme ve gelişmeyi engellediği sonucunu ortaya koymaktadır. Bütün bu çalışmaların bir sonucu olarak, H 2 O 2 ön uygulamasının, saf su ortamında çimlendirilen arpa tohumlarında mitotik indeks değeri üzerine ihmal edilebilir bir etkiye sahip olduğu ancak kromozom anormallikleri ve hücre döngüsü üzerinde çeşitli etkilere sebep olduğu söylenebilir. Toprak tuzluluğu, bitki büyüme ve gelişimini olumsuz yönde etkilemektedir. Dünya tarım alanlarının yaklaşık % 20 si tuzlanma tehlikesi altındadır (Zhu, 2001). Bilindiği gibi tuzlu koşullar, halofit bitkilerde bile, genellikle büyüme ve gelişmeyi olumsuz yönde etkilemektedir. Yani tuzlu koşullarda genellikle çimlenme 26

37 engellenmekte, büyüme hızı yavaşlamakta ve verim azalmaktadır. Bazı hallerde ise bitki, hayat devresini tamamlayamadan ölmektedir. Bu konuyla ilgili günümüze kadar pek çok araştırma yapılmış, ancak tuzluluğun etki mekanizması tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır (Gill ve Singh, 1985; Schmidhalter ve Oertli, 1991). Al-Karaki (2001) ve Ghoulam ve Fores (2001) e göre tuzluluğun büyüme ve gelişme üzerindeki etkisi iki yoldan olabilir: 1. Tuzun, ortamda oluşturduğu ozmotik basınçtan dolayı tohumlar çimlenebilmek için gerekli suyu alamazlar (Ozmotik etki). 2. Ortamdaki tuz iyonları, embriyo ya da genç fideler için toksik etki yapabilir (Spesifik etki, iyonik etki) Bu iki mekanizmanın dışında tuzun, büyüme gelişme üzerindeki olumsuz etkilerini daha değişik yollardan da yapması mümkündür. Bunların içinde literatürde en sık rastlanılanlar şunlardır: Tuz, mitoz bölünmeyi engellemek suretiyle çimlenmeye ket vurabilir (Bozcuk, 1978; Yasseen vd., 1987). DNA, RNA ve protein sentezini engelleyerek büyüme ve gelişmeye ket vurabilir (Anuradha ve Rao, 2001; Özdemir vd., 2004). Hücre zarının permeabilitesini etkiler (Ellialtıoğlu vd., 1994; Tiburcio vd., 1994). Bitki hücrelerinde solunumu genellikle engeller (Porath ve Poljakoff- Mayber, 1964), bazen de teşvik eder (Brix, 1962). Bitki hücrelerine giren Na + veya CI - iyonları antagonistik etki nedeniyle hücrenin metabolik faaliyetleri için gerekli olan Ca ++, K + gibi diğer iyonların 27

38 alınmasına engel olur. Tuz iyonları, bitkiye gerekli iyonlarla rekabet ederek de onların alınımını engelleyebilir (Tiwari vd., 1997). Tuz, depo dokularının karbonhidrat ve protein rezervlerini harekete geçiren α- amilaz (Promila ve Kumar, 2000; Ashraf vd., 2002), proteaz (Prisco ve Vieira, 1976) ve RNaz (Gomes ve Sodek, 1988) gibi hidrolitik enzimlerinin aktivitesini engelleyerek çimlenmeye ket vurabilir. Tuz, tohumda prolin içeriğini artırarak, katalaz, peroksidaz ve polifenol oksidaz aktivitelerini azaltarak olumsuz etki yapabilir (Dash ve Panda, 2001). Yaptığımız çalışmada da görüldüğü gibi tuzluluk, konsantrasyona bağlı olarak arpa tohumlarının mitotik indeksinin azaltmasına neden olmuştur (Bkz. Çizelge 3.4). Tuzun mitotik indeksi engelleyici etkisinin herkes tarafından bilinen bir gerçek olduğu bu çalışma ile bir kez daha doğrulanmıştır (Bozcuk, 1978; Huang ve Van Steveninck 1988, 1990; Katsuhara ve Kawasaki, 1996; Lutsenko vd., 2005). Tuz, hücre bölünmesi üzerindeki engelleyici etkisini doğrudan yapabileceği gibi, bu etkiyi arpa tohumlarında yol açtığı içsel absisik asit (ABA) artışı kanalı ile de gerçekleştirebilir (Ungar ve Binet, 1975; Khan, 1978). Öte yandan tuzluluğun artan seviyeleri arpa tohumlarının mitotik indeksi üzerinde olduğu gibi kromozom davranışları üzerinde de olumsuz etki göstermiştir. Tuz seviyesinin kromozom anormalliği üzerindeki olumsuz etkileri çeşitli araştırıcılar tarafından da vurgulanmıştır. Tajbakhsh vd. (2006), arpa tohumları ile yaptıkları çalışmada tuzluluğun artan seviyelerinin anafaz safhasında kromozom anormalliklerine sebep olarak hücre bölünmesini geciktirdiğini belirtmişlerdir. Ayrıca YI Hui-Ian (2001) ın yapmış olduğu çalışmada ise tuz çözeltisinin, çeşitli tiplerde kromozom anormalliklerinin olduğu tespit edilmiştir. Yaptığımız çalışmada da tuzluluğun benzer şekilde anormalliklere neden olduğu tespit edilmiş ve bu anormalliklerin yüzdeleri Çizelge 3.5 de verilmiştir. Buna göre saf su ortamında çimlendirilen kontrol grubu tohumlarda herhangi bir anormalliğe rastlanmazken (0.0), tüm tuz konsantrasyonlarında kromozom anormallik yüzdesi önemli derecede 28

39 artmıştır. Bu durum, tuzluluğun kromozom anormalliklerini artırıcı bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Diğer yandan H 2 O 2 ön uygulamasının, tuzlu koşullarda çimlendirilen tohumların mitotik indeksi üzerindeki etkileriyle ilgili çalışmaya rastlanmamıştır. Yapmış olduğumuz çalışmada ise H 2 O 2 in, tuz stresinin mitotik indeksi üzerinde kendi kontrolleriyle kıyaslandığında istatistiksel açıdan önemli olmayan bir etki gösterdiği tespit edilmiştir. Tüm tuz seviyeleri dikkate alındığında, nispeten en olumlu etkiyi 0.40 m da (0.03) H 2 O 2 ön uygulaması gerçekleştirmiştir (Bkz. Çizelge 3.4). H 2 O 2 ön uygulaması, söz konusu tuz seviyelerinde genellikle profazda; mikronükleus, metafazda; fragment oluşumu, ekvatoryal plağın iki parçaya bölünmesi, düzensiz metafaz ve yapışık kromozom, anafazda; geri kalmış kromozom, kromozom köprüsü, düzensiz anafaz ve yanlış kutuplaşma, telofazda ise geri kalmış kromozom, kromozom köprüsü ve yanlış kutuplaşma şeklindeki kromozom anormalliklerine sebep olmuştur (Bkz. Şekil ). H 2 O 2 ön uygulamasının arpa tohumlarının mitotik indeksi üzerinde ihmal edilebilir bir etkisi olmasına karşın, kromozom anormallik yüzdeleri ve kromozom davranışları üzerinde istatistiksel açıdan önemli etkiler gösterdiği tespit edilmiştir. H 2 O 2, 0.35 m tuzlulukta kendi kontrolüne göre kromozom anormallik yüzdesi üzerinde olumsuz etkiyi arttırıcı bir özellik göstermiş ve anormallik yüzdesinde yaklaşık 5 kat artışa neden olmuştur m tuzlulukta da H 2 O 2 ön uygulaması 0.35 m tuzluluktakine oranla 2 kat artış göstermiştir m tuzlulukta ise hücre bölünmesi tamamen engellendiğinden dolayı kromozom anormallikleri incelenememiştir. Tüm tuz seviyeleri dikkate alındığında kendi kontrolüne kıyasla en fazla kromozom anormallik yüzdesi, 0.35 m NaCl de H 2 O 2 ön uygulamasında gözlenmiştir (Bkz. Çizelge 3.5). Yapılan literatür çalışması sonucunda H 2 O 2 ön uygulamasının, tuzlu koşullar altında çimlendirilen tohumların hücre döngüsü üzerindeki etkileri ile ilgili bilgiye rastlanmamıştır. 29