Bornova- ZM R EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS TEZ )

Transkript

1 EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS TEZ ) BAZI DR S (Prunus mahaleb L.) T PLER N N N V TRO ÇO ALTMA KO ULLARININ OPT M ZASYONU AL A. ZA NAL Bahçe Bitkileri Anabilim Dal Bilim Dal Kodu: Sunu Tarihi: Tez Dan man : Prof. Dr. Serra HEPAKSOY Bornova- ZM R

2

3 III Ali A. ZA NAL taraf ndan YÜKSEK L SANS tezi olarak sunulan BAZI DR S (Prunus mahaleb L.) T PLER N N N V TRO ÇO ALTMA KO ULLARININ OPT M ZASYONU ba l kl bu çal ma E.Ü. Lisansüstü E itim ve Ö retim Yönetmeli i ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü E itim ve Ö retim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyar nca taraf m zdan de erlendirilerek savunmaya de er bulunmu ve tarihinde yap lan tez savunma s nav nda aday oy birli i ile ba ar l bulunmu tur. Jüri Üyeleri: Jüri Ba kan : Prof. Dr. Serra HEPAKSOY Raportör Üye: Prof. Dr. Ali TANRISEVER mza.... Üye : Prof. Dr. Burçin ÇOKUYSAL..

4 IV

5 V ÖZET BAZI DR S (Prunus mahaleb L.) T PLER N N N V TRO ÇO ALTMA KO ULLARININ OPT M ZASYONU ZA NAL, Ali A. Yüksek Lisans Tezi, Bahçe Bitkileri Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Serra HEPAKSOY Kas m 2008, 64 sayfa Bu çal ma Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Doku Kültürü Laboratuar nda yürütülmü tür. Dört farkl idris tipine ait sürgün uçlar eksplant olarak kullan lm t r. Temel besin ortam olarak MS kullan lm, 30 g L -1 sakkaroz, 7 g L -1 agar eklenmi ; ph 5,6 olarak ayarlanm t r. Dikimden sonra s cakl 24 ± 1 C, klanma süresi 16 saat ve 8 saat karanl k olan kültür odas na konulmu tur. Örnekler 1 ay aral klarla alt kültüre al nm t r. Her 20 günde bitki boyu, yaprak say s ve karde lenme say s gözlenmi tir. Ço altma a amas nda,hormon tipi ve konsantrasyonlar farkl olan 10 farkl MS besin ortam denenmi tir ve bunlardan en iyi 3 ortam seçilip ço altmaya devam edilmi tir. En iyi ço alma MS ortam na 4,4 µm BAP + 0,49 µm IBA + 0,29 µm GA 3 ilave edilmemsi durumunda elde edilmi tir. Köklenme a amas nda ise yine hormon tipi ve konsantrasyonlar farkl olan 10 besin ortam denenmi tir, en iyi köklenme 0,3 mg L -l NAA içeren MS besin ortam nda elde edilmi tir. Anahtar kelimeler: dris, Prunus mahaleb L., in vitro ço altma, optimizasyon.

6 VI

7 VII ABSTRACT OPTIMIZATION IN VITRO CONDITIONS OF SOME Prunus mahaleb L. TYPIES ZA NAL, Ali A. MSc in Horticultural Department Supervisor: Prof. Dr. Serra HEPAKSOY November 2008, 64 pages This experiment was carried out in the tissue culture laboratory of the Department of Horticulture, Faculty of Agriculture- Ege University. Shoot tips of annual shoots were used as explants materials. MS medium was used as base nutrient with 30 g L -l sucrose, and 7 g L -l agar. ph was adjusted to 5,6. The explants were transferred onto MS medium after the culture. The explants were exposed to 16 h light and 8 h dark period at 24 ± 1 C, temperature in growth chamber. The explants were subcultured every 30 days. Explant length, number of leaves and multiplication was observed every 20 days. In multiplication stages, different in type and concentrations 10 mediums was tested and from these mediums 3 ones was selected and continued in experiment. The optimum medium of multiplication was obtained when used MS media supplemented with 4, 4 µm BAP+0, 49 µm IBA+0, 29 µm GA 3. In rooting stage such as was used different in type and concentrations 10 mediums and the optimum rooting was obtained when used 0, 3 mg L -l NAA. Key words: Mahalep, Prunus mahaleb L., in vitro propagation, optimization.

8 VIII

9 IX TE EKKÜR Bu konuda çal ma yap lmas önerisinde bulundu u, çal man n gerçekle tirilmesi için gerekli ortam sa lad ve tez metnini inceleyerek biçim ve içerik bak m ndan son eklini almas na katk da bulundu u için dan man hocam Say n Prof. Dr..Serra HEPAKSOY a,te ekkür ederim. Ayr ca çal ma ve çeviri s ras nda bana yard mc olan Ara t rma Görevlisi ebnem KAVAKLI ve ara t rma Görevlisi Deniz ERO UL a ükranlar m borç bilirim. Bu çal man n yap lmas için maddi destek sa layan Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Ara t rma Kurumu (TÜB TAK) a te ekkür ederim.

10 X

11 XI Ç NDEK LER Sayfa No ÖZET...V ABSTRACT... VII TE EKKÜR... IX Ç NDEK LER... XI Ç ZELGE D Z N...XIII EK LLER D Z N...XV 1. G R ÖNCEK ÇALI MALAR MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem Besin ortam n n haz rlanmas ve sterilizasyonu Bitkisel materyalin al nmas, dikime haz rlanmas ve sterilizasyonu n vitro kültür ko ullar Verilerin de erlendirilmesi BULGULAR VE TARTI MA Ba lang ç ve Ço alma A amas Köklendirme ve D Ortama Al t rma Çal malar SONUÇ KAYNAKLAR D Z N ÖZGEÇM

12 XII

13 XIII Ç ZELGE D Z N Sayfa No Çizelge 3.1. MS (Murashige Skoog) besin ortam n n içeri i.. 20 Çizelge 3.2. Geli me ve ço alma a amalar nda kullan lan MS besin ortamlar n n hormon içerikleri ve verilen numaralar 21 Çizelge 3.3. Köklenme ortamlar n n hormon içerikleri ve verilen numaralar Çizelge 4.1. dris tiplerinin, hromon ve konsantrasyonlar farkl olan 10 MS besin ortam ndaki canl l k oranlar (%) 27 Çizelge 4.2. dris tiplerinin, hromon ve konsantrasyonlar farkl olan 10 besin ortamdaki ortalama ço alma durumlar ve yeni sürgünlerin boylar na göre grupland r lmas (adet/eksplant) Çizelge 4.3. dris tiplerinin, hromon ve konsantrasyonlar farkl olan 10 köklendirme ortamlar nda ortalama köklenme oranlar (%)... 44

14 XIV

15 XV EK LLER D Z N Sayfa No ekil 3.1. Bahçeden al nan eksplant (sürgün ucu) görünümü. 23 ekil 3.2. Bitkisel materyalin sterilizasyon i lemi ekil 4.1. lk dikimden sonra kültürlerde meydana gelen enfeksiyonlar ekil 4.2. Kp 1 (1) (a), Kp 27 (3) (b) ve Af 4 (c) tipinin MS 10 ortam ndaki 5 hafta sonundaki geli imi ekil 4.3. Kp 27 (3) tipinin MS 8 ortam ndaki 5 hafta sonundaki geli imi ekil 4.4. Af 4 tipine ait sürgünlerin 60 gün boyunca gösterdikleri sürgün boyu geli imleri (mm) ekil 4.5. Af 4 tipine ait sürgünlerde 60 gün boyunca meydana gelen yaprak say s (adet) ekil 4.6. Kp 27 (3) tipine ait sürgünlerin 60 gün boyunca gösterdikleri sürgün boyu geli imleri (mm) ekil 4.7. Kp 27 (3) tipine ait sürgünlerde 60 gün boyunca meydana gelen yaprak say s (adet) ekil 4.8. T 34 (3) tipine ait sürgünlerin 60 gün boyunca gösterdikleri sürgün boyu geli imleri (mm) ekil 4.9. T 34 (3) tipine ait sürgünlerde 60 gün boyunca meydana gelen yaprak say s (adet) EK LLER D Z N (devam)

16 XVI ekil K1 köklendirme ortam na yeni dikilen Af 4 tipine ait sürgünler ekil Af 4 tipinin K1ortam ndaki köklenme durumu ekil Af 4 tipinin K 2ortam ndaki köklenme durumu ekil Af 4 tipinin K 6 ortam ndaki köklenme durumu ekil Torf bulunan viyollere aktar lan köklü in vitro bitkicikler... 49

17 1. G R Prunus mahaleb L. mahlep ve idris isimleriyle tan nmaktad r. Anavatan Avrupa ve Bat Asya olup, Anadolu nun birçok bölgesine yay lm t r. Ülkemizde yayg n olarak Tokat Merkez, Erbaa ve Niksar ilçeleri ile Amasya, Gümü hane, Mardin, U ak ve Van illerinde bulunmaktad r (Davis, 1972; Anonim, 1985). dris 8-10 m boylanan, k n yapra n döken bir türdür. Genç sürgünleri tüylü, yapraklar 3-6 cm boyunda, dairemsi veya yumurta eklinde, kenarlar di lidir. Beyaz renkli güzel kokulu çiçekler açar. Küçük ve takriben 5-6 mm büyüklü ündeki meyveler, olgunlukta siyah veya sar renk al rlar. drisin, kurutulmu olgun tohumlar kullan l r. Tohum olgun meyvelerin s yr lmas yla elde edilir, sabit ya ve kumarin içerir. Ayr ca eleosteain asidi içermesi nedeni ile boya sanayiinde kullan l r. A ac n kabuklar n n ho kokulu olmas, kumarin içermesinden ileri gelmektedir. dris tohumu ihraç ürünlerimizdendir. T bbi olarak da yararlan lan idris tohumlar n n, kuvvet verici, balgam söktürücü, idrar artt r c özelli i olup, nefes darl na ve eker hastal na kar kullan l r. Tohumlar toz haline getirilip balla kar t r larak da kullan lmaktad r (Tanker vd., 2007).

18 2 Meyvecilik aç s ndan önemi ise, anaç olarak kullan m d r. Genel olarak kiraz ve vi ne yeti ticili inde Pnunus avium (ku kiraz ) ile Prunus mahaleb (idirs) anaçlar kullan lmaktad r. dris, ku kiraz na nazaran daha zay f geli me göstermekle (Brase, 1945) birlikte, geli me kuvvetleri aç s ndan, idris tipleri aras nda farkl l klar bulunmaktad r. Anaçlar, çö ür (generatif) ve klon (vegetatif) olmak üzere iki grupta toplan rlar. Çö ür anaçlar, genetik varyasyonlar nedeniyle, üzerlerine a lanan çe itlerin farkl verim ve geli me göstermelerine, a uyu mas ile ilgili sorunlar n ortaya ç kmas na neden olmaktad r. Bu sak ncalardan dolay çö ür anaçlar yerine, bir örnek geli me ve verimlili i sa layan, üzerlerine a lanan çe itlerin farkl iklim ve toprak ko ullar na uyum gösteren klon anaçlar n n kullan lmas gereklidir (Köksal, 1979). Birçok ülkede meyvecili i geli tirerek, kaliteyi artt rmak amac ile slah çal malar sonucunda, çe itli özellikleri yönünden üstünlükleri olan klon anaçlar elde edilmi tir. Meyvecili i geli mi olan ülkeler, uzun y llardan beri de i ik toprak, iklim artlar na elveri li, topraktan ve havadan bula abilen hastal k ve zararl lara dayan kl, kolay ço alt labilen, s k dikime uygun, meyve bahçesinin kurulmas n n ikinci y l ndan itibaren bol ve kaliteli ürün veren, budama, hasat, ilaçlama gibi kültürel i lemlerin kolayl kla yap lmas na olanak sa layan, bodur klonal anaçlarla fidan üretimi yapmaktad rlar.

19 3 Dünyada klonal bodur anaç kullan larak fidan üretimi y ldan y la h zla artmaktad r. Ülkemizde son y llarda özel sektör taraf ndan çe itli türlere ait klon anaç dam zl klar kurulmaya ba lanm t r. Avrupa ülkelerinde özellikle yumu ak çekirdekli meyve türlerinde, tamamen klon anac kullan l rken, ülkemizde tam tersine üretimin hemen hemen tamam için çö ür anaçlar kullan lmaktad r. Kiraz için de benzer durum söz konusudur. Bu türün ço altma yöntemi a olup, Türkiye'de kiraz fidan üretimi, çö ür anaçlar üzerine istenilen çe idin a lanmas yolu ile yap lmaktad r. Çö ür anac olarak, yabani kiraz (Prunus avium L.) ve idris (Prunus mahaleb L.) kullan lmaktad r. Türkiye de kiraz a açlar n n % ninin idris anac üzerine a l oldu u belirtilmektedir (Özça ran 1976, Gülcan ve Özça ran, 1982, Akça ve Kaya, 2001). Yap lan ara t rmalar idris anac na a l kiraz ve vi nelerin, kiraz üzerine a l olanlara göre daha küçük a aç meydana getirdikleri, daha fazla ürün verdikleri ve erken olgunla t klar n göstermi tir (Özça ran vd., 2003). Ancak ülkemizde kullan lan idris anac çö ür olarak yeti tirilmekte, bu da beraberinde baz sorunlar getirmektedir. Sert, so uk ve k smen kurak iklimlere dayan m iyi olan idris anac, toprak bak m ndan fazla seçici de ildir, kireçli, kumlu, çak ll ve ta l topraklar n bitkisidir (Ronald, 1987). Kökleri derine gitmekle birlikte ana kayan n veya taban suyunun toprak yüzüne yak n oldu u yüzlek topraklarda da köklerini geni li ine

20 4 yaymak suretiyle yeti mesine devam edebilmektedir. Da l k yamaçlarda, kalkerli yerlerde yeti ir (Özbek, 1978). Türkiye, idris tiplerinin do al yay lma alan içinde bulundu undan zengin bir populasyona sahiptir. Yap lan bir seleksiyon çal mas yla farkl geli me gücüne sahip idris tiplerinin varl ortaya konulmu tur (Gülcan ve Özça ran, 1982). dris populasyonu zenginli imiz olmas na kar n bugüne kadar bu populasyon içinden; uyu mazl k göstermeyen, büyük a aç olu umunu engelleyen, verimli, çe itli iklim ve toprak ko ullar na uygun, hastal k ve zararl lara kar dayan kl olan ve klonal olarak ço alabilen tip ya da tipler seçilerek, klon anac elde etmeye yönelik fazla çal ma yap lmam t r. Bu çal mada baz kara ve sar idris tiplerinin vegetatif üretim yöntemlerinden biri olan ve geli mi ülkelerde son y llarda özellikle anaç üretiminde kullan lan doku kültürü yolu ile ço alt lma olanaklar ara t r lm t r.

21 5 2. ÖNCEK ÇALI MALAR Mikroço alt m ya da doku kültürü yöntemi ile bitkilerin ço altmas için ilk olarak Murashige (1974) taraf ndan üç a amal bir protokol önerilmesine kar n, son dönemdeki geli melerle birlikte ba ar l bir mikroço alt m n be a amada gerçekle ebilece i belirtilmektedir (Debergh and Read, 1993). Bunlar; 1. Haz rl k a amas, 2. Kültür ba lang ç a amas, 3. Sürgün ço alt m a amas, 4. Sürgün geli imi ve köklendirme a amas, 5. D ortama al t rma a amas d r. Mikro ço alt m n genel olarak bitki yeti tiricili i ile geneti i yönünden önemi ve avantajlar a a daki gibi s ralanabilir (Debergh and Read, 1993). 1. Hastal k zararlar ndan ar nd r lm bitkisel materyal elde edilmesi, 2. Kitlesel üretim yap labilmesi, 3. Üretilen bitkilerde fenotipik ve genotipik benzerli in (homojenite) sa lanmas, 4. Al lm geleneksel yöntemlerden daha k sa kültür süresinin olmas. 5. Zor üretilen türlerin daha kolay üretiminin sa lanmas. 6. Seçilen belirli / üstün genotiplerin h zl üretimi. 7. Üretimde daha az anaç kullanmak.

22 6 8. Somaklonal varyasyondan dolay yeni çe itlerin / genotiplerin elde edilmesi. Bitkilerin in vitro üretimi, kullan lan eksplant n özelli ine göre (embriyo, meristem, anter, hücre veya protoplast kültürü vb.) adland r l r. Ancak ço unlukla elde bulunan bir bireyin ço alt lmas nda meristem ya da sürgün ucu ile bo um kültürü yöntemleri kullan lmaktad r. E er bitkilerin uygun besin maddeleri ihtiyac, hormon ve kültür istekleri yeterince biliniyorsa, mikroço alt m tekni i kullan larak tüm bitki türlerinin üretilmesi mümkün (Hartman and Kester, 1983) olmakla birlikte, odunsu bitkilerde, otsu bitkilere göre ba ar ans daha dü üktür. n vitro ko ullar nda meyve türlerinde genellikle kullan lan birkaç mikroço alt m protokolu vard r, ancak özellikle odunsu türler için ço unun optimize edilmesi gereklidir (Damiano and Palombi, 2000). Prunus cinsine ait türlerin mikroço alt m için sitokinin tipleri ve konsantrasyonlar en önemli faktörlerdir (George 1996; Leontiev Orlov et al., 2000a). Bu türlerin mikro ço alt lmalar nda genel olarak kullan lan en etkili sitokininin Benzil Amino Purin (BAP)' d r (Pérez-Tornero and Burgos, 2000). Oksin ise dü ük oranda kullan lmaktad r. (Wagner-Junior et al., 2003).

23 7 Prunus avium' un in vitro ço alt lmas nda çal an Kitin et al. (2005), al nan sürgünleri önce sitokin içermeyen ortama dikmi ler, alt kültürden bir hafta sonra sürgünlerin hepsinin öldü ünü görmü lerdir. Daha sonra sürgünleri 0,1 ve 1,0 mg L -1 BA içeren ortama dikmi ler ve 0,1 mg L -1 BA bulunan besin ortamlar nda geli me olmazken, en iyi sürgün geli imi ve say s 1,0 mg L -1 BA bulunan ortamdan elde edilmi tir. Bu sonuç, sitokininlerin sürgün geli imi için ortamda bulunmas gereken en önemli madde oldu unu göstermektedir. PR 204/84 (P. persica P. amygdalus) anac n n in vitro ço alt m nda sitokininlerin etkisi incelenmi ve sadece BAP n aksiller sürgün ço almas için yüksek verim sa lad saptanm t r. BAP konsantrasyonunun 0,4 µm'den 8,0 µm ç kar lmas durumunda sürgün büyümesinin azald, oksinlerin ise sürgün ço altmas nda etkin olmad belirlenmi tir (Fotopolous and Sotiropolous, 2005a). urkov (2006)'e göre yabani kiraz n mikro ço alt m nda sürgün regenerasyonu ve uzamas BAP konsantrasyonlar ndan belirgin bir ekilde etkilenmi olmakla birlikte, dü ük NAA veya IBA kombinasyonu ile de sürgün regenerasyonu ve uzamas te vik edilmi tir. BAP konsantrasyonlar ve de i ik Prunus türlerinde genotiplere göre, kullan lan oranlar aras nda önemli farkl l klar oldu u belirtilmi tir (Leontiev Orlov et al., 2000b; Perez- Tornero and Burgos, 2000).

24 8 Prunus türlerinin in vitro ço alt m nda BAP için en etkili konsantrasyonun 1,5 mg L -1 oldu u belirtilmi tir (Silva et al., 2003). Ayn ara t r c lar Prunus capdebosca' da 20 mm'den daha fazla bitki boyunu 0,8 mg L -1 BAP; en yüksek sürgün say s n ise, 1,5 mg L -1 BAP kullanarak elde etmi lerdir. Yap lan ba ka bir çal mada ise, P. avium'un 5/11 genotipinin ço alma oran n n sitokinin içeren tüm ortamlarda yükseldi i, en yüksek sürgün ço alma oran n n 1,0 mg L -1 BA içeren besin ortam nda elde edildi i saptanm t r (Pevalek- Kozlina et al., 1994). Prunus serotina'n n mikro ço alt m nda ise en iyi sürgün geli imi 0,75 mg L -1 BA kullan larak elde edilmi tir. BA miktar n n 1,0 mg L -1 den fazla olmas durumunda sürgün uzamas azalm t r (Tricoli, 2008). Fidanc vd. (2001), kiraz-vi ne anaçlar ndan Gisela 5, Maxma-14 ve Tabel/Edabriz' in doku kültürü yolu ile ço altmas üzerine yapt klar ara t rmada, ½ oran nda seyreltilmi ve tam kuvvette MS besin ortamlar n denemi ler, en yüksek sürgün verimini (9 adet) 1,0 mg L -1 BA içeren MS ortam nda elde etmi lerdir. Ara t rmac lar, karde lenme a amas nda zaman zaman vitrifikasyonun çok önemli sorun oldu unu belirtmi lerdir. Hepaksoy (2004) un yapt bir denemede klonal kiraz anaçlar ndan Gisela 5 ve Gisela 6' n n sürgün ucu metodu ile in vitro ço alt lma olanaklar ara t r lm t r. Çal ma sonunda Gisela

25 9 6 anac n n ço alma e iliminin Gisela 5'den daha yüksek oldu u vurgulanm t r. Genel olarak ço alma ve meydana gelen yeni sürgünlerin geli imi üzerine dü ük konsantrasyonda GA 3 her hangi bir etkide bulunmam, buna kar n konsantrasyonun arttr lmas durumunda ço alma olumsuz yönde etkilenmi tir. En uygun ço alma ortam 1 mg L -1 BA + 0,5 mg L ¹ IBA veya NAA içeren MS besin ortam olarak belirlenmi tir. PR 204/84 (P. persica P. amygdalus) anac n n in vitro ço alt m nda 2 ve 4 µm BAP konsantrasyonlar nda yan sürgün olu umu en yüksek düzeyde gerçekle irken, 2- IP içeren ortamda ise, sadece tek sürgün olu mu tur. BAP seviyesinin 0,4 den 8 µm e yükseltilmesi, sürgün geli iminin te vik edilmesini sa lam t r. IBA ve NAA seviyesinin ise, 0,05 den 5 µm e artt r lmas durumunda ise, bütün BAP konsantrasyonlar nda uzama oran nda azalma gözlenmi tir (Fotopolous and Sotiropolous, 2005a). Prunus cinsine ait türlerin mikro ço alt lmas nda en çok kullan lan oksin IBA (indol bütirik asit) dir (Silveira et al., 2002). Dört farkl Prunus anac nda indol bütirik asidin, naftalen asetik asite göre daha fazla ço alma oran sa lad belirlenmi tir. Prunus serotina'n n 3 genotipinin invitro ko ullarda ço alt lmas için bo um kültürü yap lm ve bu amaçla 4,44 µm BA, 0;49 µm IBA ve 0;29 µm GA 3 eklenen MS besin ortam kullan lm t r. Yaprak eksplantlar, 0; 2,27, 4,54 veya 6,81 µm thidiazuron (TDZ) ile 0; 0,54; 1,07 veya 5,37 µm NAA

26 10 kombinasyonu içeren WPM besin ortam ya da 0; 4,44; 8,88 veya 13,32 µm BA ile birlikte 0; 0,54; 1,07 veya 5,37 µm NAA içeren ortamlarda kültüre al nm lard r. Kültürler ya sürekli 5 hafta ya da 3 hafta karanl kta tutulduktan sonra, 16 saat k fotoperiyoduna al nm lard r. TDZ ve genotip sürgün say s ve regenerasyonunu önemli ekilde etkilemi tir. Eksplant ba na maksimum sürgün say s ( 5.05 ± 1.14) 2;27 µm TDZ + 0,54 µm NAA kullanarak, 3 hafta karanl k denemesinden elde edilmi tir. En yüksek sürgün regenerasyon yüzdesi (% 38,3) ve sürgün say s (4,13 ± 0;97) ortama 6,81 µm TDZ + 1,07 µm NAA ilave edildi inde elde etmi lerdir (Pijut et al., 2006). Yabani kiraz n h zl mikroço alt m üzerinde yap lan bir çal mada, en yüksek sürgün say s 4,4 µm BAP ve 0.49 µm IBA içeren MS besin ortam nda ço alma 5,42 adet/eksplant olurken, IBA yerine, ayn konsantrasyonda NAA kullan ld nda eksplant ba na ortalama 3,37 sürgün elde edilmi tir ( urkov, 2006). Prunus avium'un invitro ko ullarda ço altmas üzerinde çal malar yapan Label et al. (1989), 4,9 µm IBA ve 4,4 BA içeren besin ortam kullanm lard r. Eksplantlar dikimden itibaren, 4. günde büyümeye ba lam ve 4 haftal k kültür süresinden sonra, ço alma oran üç kat na yükselmi tir. MS besin ortam na IBA eklenmedi i zaman ço alma olmad gözlenmi tir. urkov (2006), yabani kiraz n mikro ço alt lmas denemesinde en yüksek oranda sürgün ço almas n 0,5 mg L -1 BAP + 0,05 mg L -1 3 TDZ kullanarak elde etmi tir. TDZ nin tek

27 11 ba na eklenmesi durumunda, TDZ nin eksplant ba na dü en sürgün say s aç s ndan, TDZ+BAP kadar etkili olmad gözlenmi tir. n vitro ko ullarda sürgünlerin köklenme ba ar s, ço almada oldu u gibi genotipe, oksin tipine ve konsantrasyonuna ba l d r (Perez - Tornero and Burgos, 2000). Fouad et al., (1997)'a göre farkl konsantrasyonlarda oksin içeren 1/2 oran nda seyreltilen MS ortam nda, Prunus anaçlar ndan Nemaguard ve Meet-Ghamre'de köklenme yüzdesi yüksek olmu tur. 2,5-7 µm aral ktaki IBA konsantasyonlar n n Prunuslar n invitro kültürde yeterli düzeyde köklenmesini sa lad tespit edilmi tir (Dimassi Theriou and Economou, 1993; Dimassi Theriou, 1998). Yabani kiraz n alt kültüründe köklenme ortam nda büyüme düzenleyici maddelerden oksinlerin bulunmas durumunda köklenmenin daha kolay oldu u görülmü tür (Hammatt and Grant, 1993; Hammatt, 1994). Maynard, (1994), Prunus serotina'n n mikro ço alt m nda eksplant olarak dormant sürgünleri kullanm t r. 1,5 ile 4,0 cm uzunlu undaki sürgünler, 5 µm IBA içeren ortamda, iki hafta sonra köklenmenin gerçekle ti i bitkiciklerin ortalama 0,5-1 cm uzunlu unda 3-5 kök olu turdu u bildirilmi tir.

28 12 Zilkah et al. (1992), M X M kiraz anac n n 0,5 mg L -1 NAA içeren 1/2 MS ortam nda en iyi köklenmeyi verdi ini saptam t r. Öte yandan baz ara t rmac lar, köklendirme ortam na IBA ilave edilmesinin köklenmeyi art rd n belirtmi ler; 0,5-2 mg L -1 dozunun köklenme için uygun oldu unu savunmu lard r (Sülü o lu ve Çelik, 2001; Litw iczuk, 2004). Demiral ve Ülger (2008), Gisela 5 kiraz anac n n doku kültüründe köklenmesinde 4 ayr NAA dozunun (1, 2, 4 ve 6 ppm) etkisi incelemi lerdir. Kontrol olarak hormonsuz MS ortam kullan lm t r. Çal mada, NAA miktar n n artmas köklenmeyi olumlu etkilerken, sürgün boyunu olumsuz etkiledi i ortaya konulmu tur. En erken ve en yüksek köklenme oran (% 92,93) ve kök say s 6 ppm NAA kullan lan besin ortamlar nda elde edilmi tir. Bunu % 74,08 köklenme oran ile 4 ppm NAA takip ederken, en dü ük köklenme oran % 37,03 ile 2 ppm NAA kullan ld nda elde edilmi tir. Ayn çal mada, en iyi ve uzun sürgün boyu geli imi 1 ppm NAA ilave edilerek elde edilmi tir. En k sa sürgün boyu, 4 ppm NAA içeren MS besin ortam nda bulunan kültürlerde elde edilmi tir. Nemaguard eftali (Prunus persica) anac n n in vitro köklendirme a amas nda, agarla kat la t r lm modifiye MS besin ortam na ilave edilen vitaminler, farkl konsantrasyonlardaki BA ve NAA' n n köklenme üzerine etkileri incelenmi tir. BA içeren besin ortamlar nda köklenme oran azalm, buna kar l k en

29 13 yüksek köklenme oran 0,1 mg L -1 NAA içeren besin ortam nda elde edilmi tir (Miller et al., 1982). Prunus avium' un mikroço alt m nda BA içermeyen 4,9 µm IBA eklenen MS besin ortam nda, eksplantlar alt kültürden 4 hafta sonra yakla k %65 oran nda köklenmi lerdir. Kültür ortam na IBA eklenmemesi durumunda ise, eksplanlar n %3'ü üçüncü haftada köklenmeye ba lam lard r (Label et al., 1989). Pozagaca erik çe idinde yap lan in vitro köklendirme çal malar nda en yüksek köklenme oranlar (% ) 2,0 mg L -1 IBA ve 0,1 mg L -1 GA 3 içeren besin ortam nda elde edilmi tir (Ruzic, 1982). Ayn çe it üzerinde yap lan ba ka bir çal mada, köklendirme a amas nda en iyi ve yüksek köklenme oran (%90) 1,0 mg L -1 NAA içeren ortamda elde edilmi tir. Bunu 0,5 mg L -1 NAA (%80) ve 2,0 mg L -1 NAA (%75) içeren ortamlar izlemi tir. D ortama adaptasyonu a amas nda köklü bitkiciklerin % 92,5 'i canl l klar n devam ettirmi lerdir (Ruzic and Cerovic, 1985). Al Sabbagh et al. (2000), mahaleb, maxma ve weiroot kiraz anaçlar n 0,5 mg L -1 IBA içeren s v ortam kullanarak % oran nda ba ar ile köklendirmi lerdir. Köklenen bitkicikler 3:1 oran nda torf : perlit içeren ortama al narak %60 ba ar yla d ko ullara al t r lm t r. Kiraz-vi ne anaçlar ndan Gisela 5, Maxma-14 ve Tabel/Edabriz'in in vitro köklenmesinde çal an Fidanc vd. (2001), 1/2 MS makro, MS mikro elementleri ve 1,0 mg L -1 IBA

30 14 içeren ortamda %95-%100 köklenme elde etmi lerdir. 0,5 mg L -1 IBA içeren ortamda bitkicik ba na ortalama 10 adet kök, 1,0 mg L -1 IBA içeren ortamda ise, 12 adet kök olu mu tur. Ortalama kök uzunlu u 0,5 mg L -1 IBA içeren besin ortam nda 3,26 cm, 1,0 mg L -1 IBA içeren besin ortam nda ise 3,8 cm olarak belirlenmi tir. Yap lan bu çal mada IBA miktar n n art r lmas sonucunda kök say s ve uzunlu unun artt görülmü tür. Bitkiler peat : most : perlit (1:1:1) ortam nda d ko ullara ç kar lm lard r. Sekiz eftali çe idinde yap lan in vitro köklendirme çal mas nda 1/2 oran nda seyreltilen MS ortam nda köklenmenin daha iyi oldu u gözlenmi tir. Ayn ortamda oksin olarak NAA kullan lmas durumunda, IBA ve IAA' ya göre daha iyi sonuçlar al nm t r (Hammerschalg et al., 1987). Feucht and Dausend (1979), Prunuslarda kök olu umu için önce yüksek konsantrasyonda, daha sonra dü ük konsantrasyonda oksin içeren besin ortam na transferi önermi lerdir. Sumadinka (P. persica L) eftali çe idinde yap lan mikroço alt m çal mas nda, mikrosürgünler ilk 10 gün için 1,0 mg L -1 IBA içeren MS besin ortam na dikildikten sonra, oksin içermeyen ortama transfer edilmi tir. Sonuçta % 88 oran nda köklenme elde edilmi, köklü bitkiciklerin d ortama al t rma a amas nda bitkilerin %90' canl l klar n korumu lard r (Cerovic and Ruzic, 1987).

31 15 Prunus dacl s Prunus persica melez anac n n köklendirme denemesinde 0,5; 1,0 ve 1,5 mg L -1 konsantrasyonlar ndaki NAA ve IBA n n etkileri incelenmi tir. En iyi köklenme oran olan % 80, 0,5 mg L -1 IBA içeren besin ortam nda elde edilmi tir (Vaez- Livari and Salehi-Soghadi, 2006). Harada and Murai (1996) n n yapt bir çal mada Prunus mume'nin aksiller sürgünler ile mikroço alt m ve elde edilen sürgünlerin köklendirilmesi denenmi tir. En iyi köklenme yüzdesi WPM besin ortam na 1 mg L -1 NAA ilave edilmesi durumunda elde edilmi tir. Köklenen bitkiler d ortama aktar ld nda ise, ba ar dü ük olmu, ancak % 20-30'u hayatta kalabilmi lerdir. GF 677 eftali klon anac n n in vitro sürgünlerinin köklenmesi üzerine yap lan bir çal mada, 2.5 M IBA içeren, 1/2 oran nda seyreltilmi MS besin ortam n n yüksek oranda köklenmeyi sa lad ; kök uzamas n te vik etti i ortaya konulmu tur (Fotopoulos and Sotiropoulos, 2005b). Kültür ortam ndaki mineral madde miktar köklenmeye etki eder ve baz ara t rmac lar mineral madde miktar n n normalin yar s oran nda azalt lmas n n kök geli imini art rd n bildirmi lerdir (Dimassi - Theriou and Economou, 1993). P. persica ve P. amygdalus melezi bir anaç olan GF 677 nin in vitro ko ullarda, köklenme ortam n n mineral maddelerinin konsantrasyonlar n n yar ya dü ürülmesi ve 2,5 µm IBA eklenmesi durumunda köklenme yüzdesinde, IBA miktar n n 2,5

32 µm olmas durumunda da kök say s nda art meydana gelmi tir (Fotopoulos and Sotiropoulos, 2005b). PR 204/84 anac n n in vitro köklenmesinde MS besin ortam n n yar kuvvette kullan lmas ve IBA konsantrasyonunun 2,5 µm olmas durumunda köklenme yüzdesinin; 2,5 ve 5 µm olmas durumunda da ortalama kök say s n n artt saptanm t r. Kök uzunlu u, IBA konsantrasyonu ile etkilenmemi, bütün IBA seviyelerinde hem yar kuvvette hem de tam kuvvetteki MS besin ortam nda art meydana gelmi tir (Fotopoulos and Sotiropoulos, 2005b). Prunus türlerinde invitro ko ullarda köklenme üzerine aktif kömür, phloroglucinol (PG) gibi farkl maddeler ve karanl n etkisi de ara t r lm t r. Yüksek miktarlarda besin ortam na ilave edilen aktif kömür bazen köklenme üzerine engelleyici etkide bulunabilir. Nemeth (1986), köklenme ortam na 500 mg L -1 PG ilave edildi inde ayva ve erik mikro sürgünlerinin köklenme oranlar n n ve kök say s n n azald n ; aktif kömürün besin ortam ndaki toksik maddeleri abserbe etti ini belirtmi tir. Rosati et al. (1980) ve Snir (1982, 1983); aktif kömürün kiraz ve erik in vitro sürgünlerinin sararmas na neden oldu unu saptam lard r. Hepaksoy ve Tanr sever (2004) in yapt baz kiraz anaçlar n n mikroço alt m üzerinde köklenme ve d ortama al t rma çal mas nda, Gisela 5 ve Gisela 6 kiraz anaçlar n n

33 17 köklenmesi amac yla farkl konsantrasyonda IBA ve NAA içeren ortamlar denenmi tir. Gisela 6 anac Gisela 5'e göre daha yüksek oranda köklenme oran göstermi tir. Çal mada 0, 4 ve 8 µm IBA veya NAA ile 0, 4,96 µm BA içeren 1/2 MS ortamlar nda % 8,33 33,33 oran nda köklenme geçekle irken, ayn ortamlara 2 g L -1 aktif kömür eklendi inde % oran nda köklenme olmu tur. Hammatt and Grant (1997), iki P.avium tipinin (F 12/1 ve Charger) in vitro köklenmesinde, phloroglucinol olumlu ya da olumsuz etkide bulunmay p, her iki durumda da köklenme gözlenmi tir. Anaçlar n n in vitro sürgünlerinin köklenme a amas nda alt kültürlerden sonra, 0,49 µm IBA bulunan, ancak PG eklenmeyen köklenme ortamlar nda köklenme daha kolay olmu tur. Prunus serotina'n n in vitro köklenmesi a amas nda, kökler sürgünlerin dikilmesinden 2 hafta sonra meydana gelmi, ço u sürgün 4. haftada köklenmi tir. Çal ma üç genotipte (A, D ve F) yap lm olup, en iyi köklenme oran %70 ile A genotipi ile, 2;5 µm IBA içeren ortamda 4 gün karanl kta tutuldu u zaman elde edilmi tir (Pijut et al., 2006). PR 204/84 anac n n in vitro köklenmesinde 12 gün karanl k periyodunun ard ndan 12 gün standart büyüme odas klanma ko ullar nda tutuldu unda köklenme yüzdesi, 24 gün standart büyüme odas klanma ko ullar nda b rak lan bitkilere göre art göstermi tir (Fotopoulos and Sotiropoulos, 2005b).

34 18 Prunus ve Malus cinslerine ait türlerde, sürgünlerin mikro ço alt m nda köklenme a amas nda bitkilerin köklenmesinde, karanl n olumlu etkisi oldu u bildirilmektedir (Moncousin,1988; George,1996).

35 19 3. MATERYAL VE YÖNTEM Çal ma, y llar aras nda Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ne ait Doku Kültürü laboratuvar nda yürütülmü tür Materyal Afyon (Af), Kemalpa a ( zmir) (Kp) ile Tokat (T) dan toplanan ve Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümüne ait deneme uygulama bahçesinde bulunan 4 idris tipi materyal olarak kullan lm t r. Bunlardan Af 4, Kp 1 (1) ve Kp 27 (3) kara idris, T 34 (3) ise sar idristir. 3.2.Yöntem Besin ortam n n haz rlanmas ve sterilizasyonu Çal mada esas olarak MS (Murashige-Skoog, 1962) besin ortam kullan lm t r. Ba lang ç, geli me, ço alma ve köklenme olmak üzere de i ik a amalarda, farkl hormon çe idi ve konsantrasyonlar denenmi tir. Hormon olarak, oksin grubundan, indol butirik asit (IBA) ve naftalen asetik asit (NAA); gibberellin grubundan gibberellik asit (GA 3 ), sitokinin grubundan da 6- benzilaminopürin (BAP) kullan lm t r. MS besin ortam n n içeri i Çizelge 3.1 de görülmektedir. Besin ortamlar na 30 g L -l sakkaroz ve 7 g L -l agar ilave edilmi tir.

36 20 Çizelge 3.1. MS (Murashige Skoog) besin ortam n n içeri i Maddeler Makro ve Mikro Besin Elementleri Konsantrasyon (mg L -1 ) KNO ,0 NH 4 NO ,0 CaCl 2. 5 H 2 O 440,0 MgSO 4. 7 H 2 O 370,0 MnSO 4. H 2 O 16,9 ZnSO 4. 7 H 2 O 8,6 KH 2 PO 4 170,0 Na 2 MoO 4. 2 H 2 O 0,25 KI 0,83 CuSO 4. 5 H 2 O 0,025 H 3 BO 3 6,2 NaFeEDTA 37,5 Vitaminler Myo- nosit 100,0 Thiamin 0,1 Nicotinic Acid 0,5 Pyridoxin-HCl 0,5 Glycine 2,0 Besin ortamlar n n ph de erleri, ph-metre yard m ile NaOH ve HCl kullan larak 5,6 ya ayarlanm t r. Steril saf su ile haz rlanan besin ortamlar, daha önce steril hale getirilen tüp veya kavanozlara konulduktan sonra, 121 C de 1,2 atmosfer bas nçtaki otoklavda 20 dakika tutularak sterilizasyonu yap lm t r. Denemede geli me ve ço alma a amalar nda kullan lan MS besin ortamlar n n hormon içerikleri ve bu ortamlara verilen numaralar Çizelge 3.2 de görülmektedir.

37 21 Çizelge 3.2. Geli me ve ço alma a amalar nda kullan lan MS Ortam No besin ortamlar n n hormon içerikleri ve verilen numaralar Hormon çeri i MS mg L -l BAP+ 0, 1 mg L -l NAA MS 2 1 mg L -l BAP MS 3 1 mg L -l BAP + 0, 1 mg L -l NAA MS 4 1 mg L -l BAP + 0,1mg L -l NAA + 0,1 mg L -l GA 3 MS 5 2 mg L -l BAP + 0,1 mg L -l NAA MS 6 1 mg L -l BAP + 0,5 mg L -l IBA + 0,25 mg L -l GA 3 MS 7 2 mg L -l BAP +0,1 mg L -l IBA + 0,25 mg L -l GA 3 MS 8 1 mg L -l BAP + 0,25 mg L -l NAA MS 9 1 mg L -l BAP + 0, 1mg L -l IBA MS 10 4, 4 µm BA + 0,49 µm IBA+ 0,29 µm GA 3 Köklenme a amas nda kullan lan besin ortamlar da çizelge 3.3 de verilmi tir. Köklendirme ortamlar na 30 g L -1 sakkaroz, 6 g L -1 agar ilave edilmi tir. Çizelge 3.3. Köklenme ortamlar n n hormon içerikleri ve verilen numaralar Ortam No K 1 K 2 K 3 K 4 K 5 K 6 K 7 K 8 K 9 K10 Hormon çeri i 0,3 mg L -l NAA 0,5 mg L -l NAA 1,0 mg L -l NAA 2,0 ml L -l NAA 3,0 mg L -l NAA 0,3 mg L -l IBA 0,5 mg L -l IBA 1,0 mg L -l IBA 2,0 ml L -l IBA 3,0 mg L -l IBA

38 Bitkisel materyalin al nmas, dikime haz rlanmas ve sterilizasyonu dris a açlar ndan sabah erken saatte sürgün uçlar toplanarak laboratuvara getirilmi tir. Örneklerin küçük yapraklar n n bir k sm kopar larak, boylar k salt ld ktan sonra ( ekil 3.1.), tek tek çe me suyu ile y kanarak materyal üzerindeki kaba kirin uzakla t r lmas sa lanm, daha sonra sabunlu suya konulmu tur. Burada ara s ra kar t r larak 20 dakika bekletildikten sonra, akan çe me suyu alt nda, 20 dakika kadar y kanarak ön sterilizasyon i lemi tamamlanm t r. Daha sonra steril kabinde, örnekler 20 dakika süre ile % 4 sodyum hipoklorit içeren 1/2 oran nda seyreltilmi çama r suyunda tutularak sterilizasyon gerçekle tirilmi tir ( ekil 3.2.). Buradan ç kar lan örnekler, üç kez be er dakika süre ile steril saf suda tutularak dikime haz r duruma getirilmi tir (Muriithi, et al., 1982; Ranjit and Kestler, 1988) In vitro kültür ko ullar n vitro kültürler hem ço altma hem de köklendirme a amalar nda 24 ±1 C ve 16 saat k, 8 saat karanl k ko ullarda kültür odas nda tutulmu lard r.

39 23 ekil 3.1. Bahçeden al nan eksplantlar n (sürgün ucu) görünümü. ekil 3.2. Bitkisel materyalin sterilizasyon i lemi Verilerin De erlendirilmesi Deneme tesadüf parselleri deneme desenine göre üç tekerrürlü olarak yürütülmü ve ortalamalar n kar la t r lmas nda LSD testi kullan lm t r. Yüzde olarak hesaplanan kriterlerde aç

40 24 transformasyonu uygulanm ve buna ait LSD de erleri verilmi tir.

41 25 4. BULGULAR ve TARTI MA 4.1. Ba lang ç ve Ço alma A amas Af 4, Kp 1 (1) ve Kp 27 (3) kara ile T 34 (3) sar idris tiplerinin in vitro ko ullarda ço alma durumlar n belirleyebilmek amac yla, çal man n yap ld y llarda nisan ay sonundan itibaren vegetatif geli menin sona ermesine kadar geçen sürede sürgün ucu örnekleri al nm ; yöntem bölümünde belirtildi i ekilde sterilizasyonlar yap larak, yine ayn bölümde içerikleri verilen MS besin ortamlar na dikimleri yap lm t r. Ba lang ç ortam olarak, literatüre göre belirlenen,hormon tipi ve konsantrasyonlar farkl olan 10 MS besin ortam kullan lm t r. Denemede yer alan tiplerin kültüre al nmalar n takiben, baz lar nda enfeksiyon meydana gelmi ( ekil 4.1.) ve kay plar olmu tur. Ancak, enfeksiyon az miktarda meydana gelmi olup, örneklerin kontrolsüz ko ullardaki a açlardan sa land göz önüne al nd nda bunun do al oldu u dü ünülmektedir. Bilindi i gibi, doku kültürü çal malar nda ba ar oran n yükseltebilmek için, mümkünse ana kaynak olarak kullan lan bitkilerin seralarda muhafaza edilmeleri önerilmektedir (de Fossard, 1986). Bu nedenle, sterilizasyon yönteminde bir de i iklik yapmaya gerek duyulmam ve tüm de erlendirmeler, enfeksiyonlu kültürlerin at lmas ndan sonra geriye kalanlar üzerinden yap lm t r.

42 26 Sürgün uçlar nda, besin ortamlar na dikimlerinden sonra kararmalar meydana gelerek, baz lar canl l klar n koruyamam lard r. dris tiplerinin canl l k oranlar nda (%) farkl l klar olmu ve bu farkl l k istatistiki anlamda önemli bulunmu tur. Denenen besin ortamlar ile tip*ortam interaksiyonu da istatistiksel olarak önemlidir (p<0.01). ekil 4.1. lk dikimden sonra kültürlerde meydana gelen enfeksiyonlar. Tiplerin ortalama canl l k oranlar % 62,69 [T 34 (3)] ile 70,53 [Kp 27 (3)] aras nda gerçekle mi tir. Bu aç dan tipler iki gruba ayr lm ve Kp 27 (3) ile Af 4 ilk grupta yer al rken, Kp 1 (1) ile T 34 (3) ikinci grupta yer alm lard r. Genel olarak T 34 (3) tipinin canl l k oran, di er tiplere göre daha dü ük olmu tur (Çizelge 4.1.).

43 27 Çizelge 4.1. dris tiplerinin,hormon ve konsantrasyonlar farkl olan10 MS besin ortam ndaki canl l k oranlar (%) Tip Besin Ortam Canl l k Oran (%) Tip Besin Ortam Canl l k Oran (%) Af 4 MS 1 51,28 Kp 27 (3) MS 1 74,24 MS 2 55,56 MS 2 58,33 MS 3 71,21 MS 3 72,86 MS 4 87,18 MS 4 87,18 MS 5 82,39 MS 5 79,49 MS 6 62,40 MS 6 57,51 MS 7 62,18 MS 7 59,62 MS 8 80,55 MS 8 63,89 MS 9 63,69 MS 9 60,10 MS 10 82,32 MS 10 92,10 Ortalama 69,88 Ortalama 70,53 Kp 1 (1) MS 1 64,10 T 34 (3) MS 1 34,73 MS 2 48,93 MS 2 48,51 MS 3 80,05 MS 3 60,69 MS 4 75,85 MS 4 82,05 MS 5 74,36 MS 5 76,28 MS 6 57,91 MS 6 54,95 MS 7 43,59 MS 7 52,57 MS 8 67,74 MS 8 68,94 MS 9 56,06 MS 9 62,10 MS 10 80,30 MS 10 86,11 Ortalama 64,89 Ortalama LSD 0.05 tip 0,040** LSD 0.05 ortam 0,063** LSD 0.05 tip*ortam 0,126** ** % 1 düzeyinde önemli 62,69 Denenen 10 farkl besin ortam n n canl l k üzerine etkilerine bak ld nda, genel olarak MS 10 ve 4 ortamlar n n di erlerine

44 28 göre daha iyi sonuç vererek, istatistiki olarak ayn grupta yer ald görülmü tür. Bu iki ortam MS 5 izlemektedir. MS 1, 7 ve 2 ortamlar nda ise, tiplerin ortalama canl l k oranlar oldukça dü ük gerçekle mi tir. Af 4 tipi d nda, di erlerinde en yüksek oran MS 10 ortam nda (4,4 µm BA + 0,49 µm IBA+ 0,29 µm GA 3 içeren) elde edilmi tir. Bu ortamda Kp 1 (1) tipinde, % 80,30, Kp 27 (3) tipinde % 92,10 ve T 34 (3) tipinde de % 86,11 canl l k elde edilmi tir. Af 4 idris tipinde ise, en yüksek canl l k oran MS 4 ortam nda gerçekle mi, MS 5 ve 10 ortamlar bunu izlemi tir. Söz konusu ortamlarda canl l k oranlar s ras yla, % 87,18; 82,39 ve 83,32 dir. Af 4 tipinin en dü ük canl l k oranlar % 51,28 ile dü ük oranda (0,5 mg L -l ) BAP ve ek olarak 0,1 mg L -l NAA içeren MS 1 ve % 55,56 ile sadece 1 mg L -l BAP içeren MS 2 ortamlar nda gerçekle mi tir (Çizelge 4.1.). Kültüre al n tan 5 hafta sonra, eksplantlarda ço alma miktar belirlenmi tir. De erlendirme yap l rken, her bir eksplanttan meydana gelen toplam karde say s n n saptanmas yan s ra, meydana gelen yeni sürgünler büyüklük aç s ndan da üç gruba ayr larak s n fland r lm t r. S n flama, 1 cm den küçük, 1-2,5 cm ve 2,5 cm den büyük olanlar eklinde yap lm t r. dris tiplerinin ortalama ço alma say lar na bak ld nda, istatistiki olarak T 34 (3) tipi di er üç tipten farkl bulunmu tur. En yüksek ço alma 1,93 ile Af 4 tipinde gerçekle mi tir. Bu tipi 1,87 ile Kp 27 (3), 1,70 ile Kp 1 (1) tipleri izlemi tir T 34 (3) sar

45 29 idris tipi ise, 1,07 ortalama ço alma katsay s ile son s rada yer alm t r (Çizelge 4.2.). Kullan lan besin ortamlar n n ço alma üzerine etkileri de istatistiki olarak önemli bulunmu tur (p<0.01). MS 10 ve 5 ortamlar ço alma üzerine benzer etkiyi göstererek, ilk iki s rada yer alm lard r. Bu ortamlarda ortalama ço alma miktar s ras yla, 4,00 ve 3,34 adet/eksplant olarak gerçekle irken, bu iki ortam 2,67 adet/eksplant ile MS 4 nolu ortam izlemi tir. Tiplerin ço almalar üzerine di er ortamlar n etkileri benzer olmu tur. Genellikle MS 7, 8 ve 9 besin ortamlar nda ço alma hemen hemen hiç gerçekle memi tir. ekil 4.2 de Kp 1 (1), Kp 27 (3) ve Af 4 tiplerinin MS 10 besin ortam nda, ekil 4.3 de ise, Kp 27 (3) tipinin MS 8 ortam ndaki 5. hafta sonundaki geli imleri görülmektedir. Label et al., (1989), 0,49 µm IBA ve 4,4 µm BAP içeren besin ortam nda Prunus avium un dört haftal k sürede ço alma oran n n üç kat na ç kt n, ortama IBA eklenmemesi durumunda ise ço alma olmad n belirtmi lerdir. Bu ortam çal mada kullan lan MS 10 ortam yla benzerlik göstermektedir. Gerek bu çal mada gerekse, baz ara t r c lar n yapt klar ara t rmalarda besin ortamlar nda oksin (özellikle IBA) bulunmamas durumunda ço alma olmad belirtilmekle birlikte, baz ara t r c lar n farkl yönde bulgular oldu u görülmektedir. Pevalek-Kozlina et al. (1994), P. avium da en yüksek sürgün ço almas n n 1,0 mg L -1 BAP içeren besin ortam nda gerçekle ti ini bildirmi tir.

46 30 Çizelge 4.2. dris tiplerinin hormon ve konsantrasyonlar farkl olan 10 besin ortam ndaki ortalama ço alma durumlar ve yeni sürgünlerin boylar na göre grupland r lmas (adet/eksplant) Tipler Besin Ortam Ço alma Miktar (adet/eksplant) Sürgün Say s (<1 cm) Sürgün Say s (1-2,5 cm) Sürgün Say s (>2,5 cm) Af 4 MS 1 1,00 0,67 0,33 0,00 MS 2 0,33 0,00 0,33 0,00 MS 3 0,67 0,67 0,00 0,00 MS 4 3,00 0,33 1,33 1,33 MS 5 4,00 1,33 2,33 0,33 MS 6 2,33 0,67 1,33 0,33 MS 7 0,67 0,67 0,00 0,00 MS 8 2,00 1,00 0,67 0,33 MS 9 1,33 0,33 1,00 0,00 MS 10 4,00 1,00 1,67 1,33 Ortalama 1,93 0,67 0,90 0,37 Kp 1 (1) MS 1 1,00 0,33 0,67 0,00 MS 2 0,67 0,33 0,33 0,00 MS 3 0,67 0,33 0,33 0,00 MS 4 3,00 0,33 2,00 0,33 MS 5 4,00 0,67 1,67 1,67 MS 6 1,67 0,67 1,00 0,00 MS 7 0,33 0,00 0,33 0,00 MS 8 1,00 1,00 0,00 0,00 MS 9 0,33 0,33 0,00 0,00 MS 10 4,33 2,33 1,67 0,33 Ortalama 1,70 0,63 0,80 0,23

47 31 Tipler Besin Ortam Ço alma Miktar (adet/eksplant) Sürgün Say s (<1 cm) Sürgün Say s (1-2,5 cm) Sürgün Say s (>2,5 cm) Kp 27 (3) MS 1 1,00 1,00 0,00 0,00 MS 2 1,00 0,00 0,67 0,33 MS 3 0,67 0,33 0,33 0,00 MS 4 3,33 1,00 2,33 0,00 MS 5 3,33 2,67 0,67 0,00 MS 6 1,33 1,00 0,33 0,00 MS 7 0,67 0,33 0,33 0,00 MS 8 0,67 0,67 0,00 0,00 MS 9 1,33 0,67 0,67 0,00 MS 10 5,33 1,67 1,67 2,00 Ortalama 1,87 0,93 0,70 0,23 T 34 (3) MS 1 1,00 0,67 0,33 0,00 MS 2 0,67 0,67 0,00 0,00 MS 3 0,33 0,33 0,00 0,00 MS 4 1,33 0,67 0,67 0,00 MS 5 2,33 0,00 2,00 0,33 MS 6 0,67 0,33 0,33 0,00 MS 7 0,33 0,33 0,00 0,00 MS 8 1,00 0,67 0,33 0,00 MS 9 0,67 0,67 0,00 0,00 MS 10 2,33 1,67 0,67 0,00 Ortalama 1,07 0,60 0,43 0,03 LSD 0.05 tip 0,455** ö.d. ö.d. 0,188 LSD 0.05 ortam 0,685** 0,522** ö.d. 0,297 LSD 0.05 tip*ortam ö.d. ö.d. ö.d. 0,593 ö.d. Önemli de il ** % 1 düzeyinde önemli

48 32 Oysa bizim çal mam zda, söz konusu içerikteki besin ortam nda ba ar oldukça dü ük olmu tur. A B C ekil 4.2. Kp 1 (1) (a) Kp 27 (3) (b) ve Af 4 (c) tiplerinin MS 10 ortam nda 5. hafta sonundaki geli imi.

49 33 ekil 4.3 Kp 27 (3) tipinin MS 8 ortam nda 5. hafta sonundaki geli imi. Meydana gelen yeni sürgünler genellikle 1 cm den küçük olmu lard r. kinci s rada 1-2,5 cm aras nda boya sahip olan sürgünler yer al rken, 2,5 cm den büyük sürgün say s bütün tiplerde ve besin ortamlar nda çok dü ük olmu, baz tiplerde ise, bu boyda 5 hafta sonunda hiç sürgün elde edilememi tir. 1 cm den küçük sürgünler aç s ndan sadece besin ortamlar aras nda farkl l k önemli bulunurken, 1-2,5 cm boyunda sürgünlerin olu umu aç s ndan hiç bir farkl l k bulunamam t r. 2,5 cm den büyük sürgünlerin olu umu aç s ndan, tip, ortam ve tip * ortam interaksiyonu önemlidir. 1 cm den daha küçük sürgün olu umu, s ras yla MS 5, 10 ve 4 ortamlar nda daha fazla bulunurken, di er ortamlar daha sonra gelmi ve bunlar aras nda farkl l k bulunmam t r. 2,5 cm den büyük sürgünlerin meydana geli i aç s ndan incelendi inde, T 34 (3) tipinde bu boyda sürgün hemen

50 34 hemen hiç meydana gelmemi tir. Meydana gelen sürgünlerin boylar aç s ndan da ço almaya benzer durum söz konusudur. Genel ortalamada 2,5 cm den büyük sürgün hiç olu mam gibi görünmekle birlikte, ba ar l ortamlardaki (MS 4, 5 ve 10) durum incelendi inde, bu boyda sürgünün bir miktar meydana geldi i görülmektedir (Çizelge 4.2.). Olu an yeni sürgünler genellikle 1 cm den küçük olmu lard r. kinci s rada 1-2,5 cm aras nda boya sahip olan sürgünler yer al rken, 2,5 cm den büyük sürgün say s bütün tiplerde ve besin ortamlar nda çok dü ük olmu, baz tiplerde ise, bu boyda 5 hafta sonunda hiç sürgün elde edilememi tir. Bu da, ço alman n ilk haftalarda de il, daha sonra ba lad n göstermektedir. Nitekim kültürlerin be haftadan fazla tutulmas ya da bitkicikler ayr lmadan do rudan taze besin ortam na aktar lmalar durumunda, sürgünlerin boylar n n uzad gözlenmi tir. MS 4, 5 ve 10 no lu besin ortamlar nda geli me di er ortamlara göre daha iyi olmas nedeni ile bu besin ortamlar na yakla k ayn geli me durumunda olan eksplantlar n dikiminden itibaren 20 gün aral kla boy uzunluklar (mm) ve yaprak say lar belirlenerek iki ay sonunda meydana gelen in vitro bitkilerin geli me durumlar saptanm t r. Ancak, baz kültürlerde çok say da küçük yapraklar meydana geldi i için bunlar n say lmas mümkün olmam t r. Bu nedenle, istatistiki de erlendirme sadece sürgün boyu için yap lm t r.

51 35 Tiplere ait sürgünlerin boylar n n geli imi üzerine tipler ve ortamlar aras nda farkl l klar istatistiksel anlamda önemli bulunmu tur (p<0,01). Sürgünlerin uzamas aç s ndan T 34 (3) tipi ilk s rada yer al rken, bu tipi Kp 1 (1) izlemi tir. Kp 27 (3) ve Af 4 tipleri ise, daha sonra gelmi tir. Besin ortamlar aç s ndan duruma bak ld nda, MS 4 ve 10 ortamlar nda benzer bir geli me gerçekle irken, MS 5 ortam nda geli me daha az olmu tur. T 34 (3) tipine ait sürgünler 60 gün boyunca MS 4 ve 5 besin ortamlar nda daha fazla uzarken, MS 10 besin ortam nda, Kp 1 (1) ve Kp 27 (3) tipleri daha fazla uzam t r. Af 4 tipinin, 60 gün süresince her üç besin ortam nda da geli imleri, di er tiplere göre daha yava gerçekle mi tir. ekil da 60 gün süresince tiplere ait in vitro sürgünlerin üç besin ortam ndaki boy ve yaprak geli imlerinin durumu görülmektedir. ekillerden de izlendi i gibi, baz idris tipleri ve besin ortamlar nda özellikle 40. günden itibaren sürgün boyu ve yaprak say lar nda azalmalar olmu tur. Bu durum, baz kültürlerde ölümlerin olmas ya da sürgünlerde geli menin gerilemesinden kaynaklanmaktad r.

52 Sürgün Boyu (mm) Gün MS MS MS ekil 4.4. Af 4 tipine ait sürgünlerin 60 gün boyunca gösterdikleri sürgün boyu geli imleri (mm).

53 Yaprak Say s (Adet) Gün MS MS MS ekil 4.5. Af 4 tipine ait sürgünlerde 60 gün boyunca meydana gelen yaprak say s (adet).

54 Sürgün Boyu (mm) 10 5 Gün MS MS MS ekil 4.6. Kp 27 (3) tipine ait sürgünlerin 60 gün boyunca gösterdikleri sürgün boyu geli imleri (mm).

55 Yaprak Say s (Adet) Gün MS MS MS ekil 4.7. Kp 27 (3) tipine ait sürgünlerde 60 gün boyunca meydana gelen yaprak say s (adet).

56 Sürgün Boyu (mm) Gün MS MS MS ekil 4.8. T 34 (3) tipine ait sürgünlerin 60 gün boyunca gösterdikleri sürgün boyu geli imleri (mm).

57 Yaprak Say s (Adet) Gün MS MS MS ekil 4.9. T 34 (3) tipine ait sürgünlerde 60 gün boyunca meydana gelen yaprak say s (adet).

58 42 Gerek ba lang ç a amas nda, gerekse ço alma a amas nda, besin ortamlar aras nda farkl l klar meydana gelmi ve MS 4, MS 5 ve MS 10 olarak kodland r lan ortamlarda ba ar belirgin ekilde yüksek olmu tur. MS 4 ve MS 10 ortamlar nda, sitokinin, oksin ve gibberellin grubundan bitki büyüme düzenleyici maddeler bulunurken, MS 5 ortam nda ise, gibberellin grubu bulunmamakla birlikte sitokinin (BAP) daha yüksek miktarda eklenmi tir. Besin ortamlar de erlendirilecek olursa, sitokinin miktar n n dü ük olmas durumunda, ba ar sa lanamam t r. Ancak, dü ük miktarda sitokin bulunan ortama gibberellin eklenmesi durumunda ba ar n n artt gözlenmi tir. George (1996) ve Leont ev-orlov et al., (2000a) Prunus cinsine ait türlerin mikroço alt m için sitokinin tipleri ve konsantrasyonlar n n en önemli faktörler oldu unu belirtmi lerdir. Bu türlerin mikro ço alt lmalar nda genel olarak kullan lan en etkili sitokininin, Benzil Amino Purin (BAP) oldu u ve Prunus türlerinde genotiplere göre, kullan lan BAP konsantrasyonlar aras nda önemli farkl l klar görüldü ü bildirilmi tir (Perez- Tornero and Burgos, 2000; Perez-Tornero, 2000; Leontiev Orlov et al., 2000b) Köklendirme ve D Ortama Al t rma Çal malar n vitro sürgünlerin köklendirilmesi amac yla, 10 farkl hormon içeri ine sahip olan Murashige Skoog (MS) besin ortamlar kullan lm t r (Çizelge 3.3.). Köklendirme ortamlar na dikilen sürgünlerin büyüklüklerinin (10-15 mm) ve geli me durumlar n n mümkün oldu u kadar ayn olmas na dikkat edilmi tir ( ekil 4.10).

59 43 Böylece, köklenme durumunun sadece besin ortam ndan ve genotipten etkilenmesi sa lanmaya çal lm t r. Köklenme oran, idris tipleri ve köklendirme ortamlar na göre istatistiki olarak farkl l klar gösterirken, tip * ortam interaksiyonu önemsiz bulunmu tur. Dört idris tipinin ortalama köklenme oranlar % 16,67 ile %3 2,82 aras nda de i mi tir. Tipler aras ndaki bu farkl l k istatistiki olarak önemli bulunmu tur (Çizelge 4.3). ekil K1 köklendirme ortam na yeni dikilen Af 4 tipine ait sürgünler.

60 44 Çizelge 4.3. dris tiplerinin, hormon ve konsantrasyonu farkl olan Tip 10 köklendirme ortamlar nda ortalama köklenme oranlar (%) Ortam No Köklenme Oran (%) Tip Ortam No Köklenme Oran (%) Af (4) K 1 60,00 Kp 27 (3) K 1 53,33 K 2 38,89 K 2 38,89 K 3 33,33 K 3 33,33 K 4 16,67 K 4 20,00 K K 5 20,00 K 6 50,00 K 6 44,44 K 7 38,89 K 7 38,89 K 8 22,22 K 8 22,22 K 9 16,67 K 9 20,00 K 10 16,67 K 10 20,00 Ortalama 31,83 Ortalama 31,11 Kp 1 (1) K 1 38,89 T 34 (3) K 1 55,56 K 2 16,67 K 2 38,89 K 3 27,77 K 3 22,22 K 4 25,00 K 4 22,22 K 5 16,67 K 5 27,78 K 6 26,67 K 6 50,00 K 7 22,22 K 7 27,78 K 8 16,67 K 8 33,33 K 9 0,00 K 9 22,22 K 10 16,67 K 10 16,67 Ortalama 20,72 Ortalama 31,67 LSD 0.05tip 6,454* LSD 0.05ortam 8,537** LSD 0.05tip*ortam ö.d. önemli de il ö.d. * %5 seviyesinde önemli ** %1 seviyesinde önemli

61 45 En yüksek köklenme Af 4 tipinde elde edilirken, bunu T 34 (3) ve Kp 27 (3) izlemi tir. En dü ük köklenme oran ise, Kp 1 (1) tipinde gerçekle mi tir. Köklenme üzerine besin ortamlar n n etkisi incelendi inde, 1 nolu ortamda % 51,95 ile en yüksek köklenme oran elde edilmi tir. Bunu, % 42,78 ile 6 nolu oram izlemi tir. Her iki ortam da istatistiki olarak farkl gruplarda yer alm t r. Daha sonra ise, K 2, K 7 ve K 3 besin ortamlar gelmi tir. Bu ortamlarda s ras ile % 33,34, 31,95 ve 29,16 oran nda köklenme gerçekle mi tir. Di er besin ortamlar nda ise, dü ük oranlarda köklenme meydana gelmi tir. ekil de Af 4 tipinin K 1, K 2 ve K 6 ortamlar nda köklenen bitkileri görülmektedir. Köklenmenin en yüksek oranda gerçekle ti i ortam 0,3 mg L -1 NAA içeren ortam (K 1) olmu tur. Bunu ayn miktarda IBA (K 6) ve daha sonra da 0,5 mg L -1 NAA içeren besin ortamlar (K 2) izlemi tir. Genellikle yüksek miktarda, IBA bulunan besin ortamlar nda, ortalama köklenme oran dü ük olmu tur (Çizelge 4.3). Bu konuda da bugüne kadar çe itli ara t r c lar taraf ndan farkl sonuçlar rapor edilmi tir. Örne in Miller et al., (1982) yapt klar çal mada 0,1 mg L -1 NAA bulunan köklendirme ortam nda yüksek bir köklenme elde ederken, Ruzic (1984), köklendirme ortam na 2,0 mg L -1 IBA eklenmesi durumunda % köklenme sa land n belirtmi tir. Genel olarak köklenme üzerine, ço almada oldu u gibi, kullan lan oksin tipi ve konsantrasyonun yan s ra, tür, genotip etkili olmaktad r.

62 46 Ayr ca, eksplant n al nd bitkinin durumu da son derece etkilidir. Doku kültürü ile üretimin en son ve en önemli a amas, elde edilen köklü bitkiciklerin d ko ullara aktarma ile al t rma a amas d r. n vitro ko ullarda geli en köklü bitkiciklerin yakla k %100 oransal nem içeren ortamdan al narak, yine oransal nemi yüksek olan yerlerde d ko ullara aktar larak, al t r lmas gereklidir. Bu amaçla, s cakl k ve nemi kontrol edilen seralar ya da iklim odalar kullan labilir. Al t rma s ras nda, köklü bitkicikler torf, perlit, curuf ya da harç gibi de i ik yeti tirme ortamlar na dikilebilirler. Çal mada köklenen in vitro bitkicikler, köklenme ortamlar ndan, köklere zarar vermeden dikkatlice ç kar larak, geli imlerinin engellenmemesi için köklerdeki agar akan su alt nda iyice y kanarak temizlenmi tir. Daha sonra, her hangi bir fungal bula may engellemek amac yla, bitkicikler % 80 thiram (Pomarsol) eri i ile muamele edilerek, önceden sterilize edilmi olan de i ik ortamlarla doldurulan viyollere a rt lm t r ( ekil 4.14.). Sulama yap ld ktan sonra, nemin korunabilmesi için üzerleri naylon örtü ile kapat lm ve iklim odas na yerle tirilmi tir. Ortam olarak, perlit, torf, e it oranda kar t r lan perlit-torf, yine e it oranda kar t r lan kum, bahçe topra ile gübre kar m ndan olu an harç kullan lm t r. Bitkilerin dikili oldu u viyollerin konuldu u iklim odas n n s cakl k ve k kontrolü olmakla

63 47 birlikte, nem kontrolü bulunmamaktad r. Bu nedenle, naylon ile örtme bitkiciklerin canl l n korumada yeterli kalmam t r. Bitkiciklerin d ar ya al nmas ndan itibaren genellikle gün geli me iyi olmakla birlikte, ard ndan h zl ölümler meydana gelmi tir. Birçok defa de i ik ortamlarda denenmi olmakla birlikte, in vitro köklü bitkiciklerin canl tutulmas ba ar lamam t r. Nem kontrolünün büyük ölçüde sa land serada da s cakl k d ko ullara ba l olarak de i ti i için, burada da ba ar sa lanamam t r. De i ik tiplerden çok say da köklü in vitro bitkicik elde edilmesine kar n, al t rma ko ullar uygun olmad için, çal ma sonunda d ko ullara adapte olmu, canl bitki elde edilememi tir.

64 48 ekil Af 4 tipinin K 1 ortam ndaki köklenme durumu. ekil Af 4 tipinin K 2 ortam ndaki köklenme durumu.

65 49 ekil Af 4 tipinin K 6 ortam ndaki köklenme durumu. ekil Torf bulunan viyollere aktar lan köklü in vitro bitkicikler.