Gen İfadesi Belirleme Çalışmaları. Doç. Dr. Feray KÖÇKAR, Balıkesir Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü

Transkript

1 Gen İfadesi Belirleme Çalışmaları Doç. Dr. Feray KÖÇKAR, Balıkesir Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü

2 Özet Gen nedir? Gen Ekspresyonu nedir? Gen ifadesinin düzenlenmesi nedir? Hangi genler? Karbonik Anhidraz ve Kanser?

3 Gen nedir?

4 Gen İfadesi nedir?

5 ???????????????????? gen var!!!!!!! Hepsi her hücrede ifade oluyor mu? Aynı DNA tüm hücrelemizde var. Neden dokularımız farklı?

6 Gen İfadesinin Düzenlenmesi

7 Gen İfadesi Düzenlemesi tüm Genlerde Aynı mıdır? Her genin düzenlenmesi farklıdır. Aynı genin gen ifadesi farklı dokularda farklı şekilde düzenlenir. Aynı genin ifadesi farklı süreçlerde farklıdır. Aynı genin ifadesi farklı organizmalarda

8 Karaciğer Kanseri Kolon kanseri Karbonik Anhidraz 9 geni Karbonik Anhidraz 12 geni ADAMTS1 geni Hangi genler? ADAMTS2 geni URG4 geni NonO/p54 geni CA3 geni

9 KARBONİK ANHİDRAZ VE KANSER İLİŞKİSİ

10 KARBONİK ANHİDRAZ (Karbonat Hidroliyaz E.C ) Karbonik anhidraz (CA), bütün organizmalarda bulunan Zn +2 iyonlu bir metaloenzimdir. Canlılarda CO 2 molekülünün hidratasyonunu ve HCO 3- iyonunun dehidratasyonunu katalizler. CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 HCO 3 + H +

11 Karbonik Anhidraz Gen Ailesi

12 Karbonik Anhidrazların Görevleri Çok farklı dokuda önemli fizyolojik görevleri vardır. Eritrositlerde C0 2 den HCO 3- hidratasyonu, Böbrek tubüllerinde idrar asiditesinin sağlanması, Çok sayıda biyolojik sıvının üretimi ile ilgilidir, Pankresastan HCO 3- salgılanması, Karaciğerdeki epitel hücrelerinden safra için HCO 3- sağlanması, Tükkrük besinde HCO 3- sağlanması vb. Cerebrospinal sıvınının ph ının düzenlenmesi, Gözde ki humor aközün üretimi, Kolonda H + ve HCO 3- salınımı Cl - ve Na absorbsiyonuna yardımcı olur ve sıvı elektrolit dengesinin sağlar.

13 Karbonik Anhidrazların Hücredeki Yerleşimleri

14 Tümör İlişkili CA lar CAIX ve CAXII Bazı tümörlerde aşırı derece ifade olduğu bildirilmiştir. Her ikisininde ekspresyonu hipoksik durumla artar.

15 CAIX Gen Regülasyonu?

16 173bp lık CAIX Promoteru aydınlatılmış CA9 promoteru (-173\+32) 5 bölge içermektedir. (PR1, PR2, PR3, PR4, PR5) PR1 ve PR2 bölgelerine transkripsiyon faktörleri bağlanır ve CA9 aktivasyonu için önemlidir. PR4 susturucu dizi olarak görev yapmaktadır. Hipoksiya ile kontrol edilir.

17 Hipoksiya nedir? Düşük oksijen yoğunluğu Kanser hücrelerinde düşük oksijen Yoğunluğu hızlı metastas yapan hücreler demektir.

18 CAIX un tek kontrol yolu Hipoksiya mıdır? IL6, protein seviyesinde meme kanserinde CA9 ekspresyonunu arttırır. Diğer hücresel düzenleyicilerin CA9 transkripsiyonel regülasyonunda rolü var mıdır?

19 İnsan Hepatoma hücrelerinde (Hep3B) İnsan Karbonik Anhidraz IX Geninin Transkripsiyonel Regülasyonu SİTOKİNLER CA IX

20 0,2 mm L-Glutamine ve % 10 FCS içeren DMEM medyumu içerisinde haftada 1 kez rutin pasaj yapılarak üretildi. Hücreler bulundukları yüzeyi %80-90 oranında kaplayınca pasajlama işlemi yapılmıştır.

21 Sitokinler Sitokinler; immun ve inflamatuvar olaylara katılan hücrelerin etkinliklerinin arttırılması için; uyarılmış lenfositler, monositler ve makrofajlar ile diğer bazı hücrelerde sentezlenenerek salınan peptid veya glikopeptid yapısındaki maddelerdir. Sitokinler normal hücre farklılaşmasında, mitoz bölünmede ve hücre hareketlerinde önemli role sahiptirler. Tümörlere karşı bağışıklık sisteminin aracı molekülleri gibi çalıştıkları gibi, kanser pathogenesinde önemli oldukları bilinmektedir. Bu moleküller özellikle tumor saldırganlığını ve metastasını indükleme yeteneğindedir. Tümör hücre adezyonununda, angiogeneziste etkilidirler ve proteolitik enzimleri indüklerler. Sitokinlerin çoğu hipoksiya tarafından da indüklenmektedir.

22 sitokinler 24 saat sitokin Uygulama 10 Ü IL_1 100 Ü IL_1 500 Ü IL_ Ü IL_1 10 Ü IFN gamma 100 Ü IFN gamma 500 Ü IFN gamma 1000 Ü IFN gamma 10 Ü TNF alpha 100 Ü TNF alpha 500 Ü TNF alpha 1000 Ü TNF alpha 973 bp 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 rlu

23 hcaix Gen Promoterunun Klonlanması Transkripsiyonel Aktivitenin Belirlenmesi hcaix mrna Düzeyinde Ekpresyonunun Belirlenmesi Gen aktarımı Geçici Transfeksiyon Analizleri RT-PCR Deneyleri

24 hca9 promoter klonlanması promoter Forward ATG Reverse PCR pgem-t ye Klonlama Dizi Analizi pgl2-luc içine alt klonlama

25 1251 gcaga attcatctct cttccctcaa tatgatgata ttgacagggt ttaccctcac tcactagatt gtgag---ct gctcagggca ggtagcgttt tttgtttttg tttttgtttt tcttttttga gacagggtct tgctctgtca cccaggccag agtgcaatgg tacagtctca gctcactgca AP gcctcaaccg cctcggctca aaccatcatc ccatttcagc ctcctgagta gctgggacta AP caggcacatg ccattacacc tggctaattt ttttgtattt ctagtagaga cagggtttgg MyoD -946 ccatgttgcc cgggctggtc tcgaactcct ggactcaagc aatccaccca cctcagcctc -886 ccaaaatgag ggaccgtgtc ttattcattt ccatgtccct agtccatagc ccagtgctgg -826 acctatggta gtactaaata aatatttgtt gaatgcaata gtaaatagca tttcagggag C/EBPb -766 caagaactag attaacaaag gtggtaaaag gtttggagaa aaaaataata gtttaatttg -706 gctagagtat gagggagagt agtaggagac aagatggaaa ggtctcttgg gcaaggtttt -646 gaaggaagtt ggaagtcaga agtacacaat gtgcatatcg tggcaggcag tggggagcca -586 atg-aggctt ttgagcagga gagtaatgtg ttgaaaaata aatataggtt aaacctatca C/EBPb -526 gagcccctct gacacataca cttgcttttc attcaagctc aagtttgtct cccacatacc AP1-466 cattacttaa ctcaccctcg ggctccccta gcagcctgcc ctacctcttt acctgcttcc C/EBPb CRE-BP -406 tggtggagtc agggatgtat acatgagctg ctttccctct cagccagagg acatgggggg AP1-346 ccccagctcc cctgcctttc cccttctgtg cctggagctg ggaagcaggc cagggttagc -286 tgaggctggc tggcaagcag ctgggtggtg ccagggagag cctgcatagt gccaggtggt AP4 Myo D -226 gccttgggtt ccaagctagt ccatggcccc gataaccttc tgcctgtgca cacacctgcc Myo D -166 cctcactcca cccccatcct agctttggta tgggggagag ggcacagggc cagacaaacc -106 tgtgagactt tggctccatc tctgcaaaag ggcgctctgt gagtcagcct gctcccctcc AP2 AP1-46 aggcttgctc ctcccccacc cagctctcgt ttccaatgca cgtaca gccc gtacacaccg P53 Inr +11 tgtgctggga caccccacag tcagccgcat g +1

26 Kesilerek oluşturulan promoter parçaları Luc -973 AP1(-60, -394, -610, -1043) +41 Luc CREB (-457) C\EBP ( ) Luc P53 (-84)

27

28 Beta-Gal Ekspresyon Gen Plasmidi Expresyonu hcaix Lusiferaz Ekspresyon Plasmidi KOTRANSFEKSİYON Hep3B cell line Lusiferaz enzim aktivitesi Beta-gal enzim aktivitesi

29 promoters hca9 Promoteru aktif bir promoter 2 ug 303 bp 1 ug 303 bp 0,5 ug 303 bp 2 ug 973 bp 1 ug 973 bp 0,5 ug 973 bp 2 ug 1289 bp 1 ug 1289 bp 0,5 ug 1289 bp 2 ug PGL2 1 ug PGL2 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 rlu

30 TGF-β

31

32 Sitokinlerin Kolon kanseri Modelinde CAIX geninin etkisinin araştırılması

33 Sitokinler ve CAIX Kolon Kanseri Moelinde Sitokinlerin CAIX ekspresyonuna etkisi konusunda literatürde herhangi sınırlı bilgi var Karaciğer hücrelerinde sitokinler CAIX düzeyini arttırmıştır.

34 Amacımız!!! Sitokinler.?? CAIX mrna CAIX protein? Hücre Döngüsü Hücre Canlılığı? HT-29 Kolon Karsinoma Hücre Modeli

35 Çalışmada Kullanılan Sitokinler ve Kombinasyonları TNF-alfa Tumor Nekrozis Faktör -Alfa TNF-TGF 1000U/ml TGF-Beta IL1-alfa Transforme edici Büyüme Faktörü-Beta İnterlökin 1 Alfa TNF-IL1 1000U/ml TGF-IL1 1000U/ml Konsantrasyon Optimizasyonu: 100U/ml,500U/ml,1000U/ml Zaman Optimizasyonu: 24, 48 ve 72 saat

36 Hücre Kültürü ve Sitokin Uygulaması HT-29 Kolon Karsionma Hücre Modeli Deneysel plan CAIX Ekspresyonu Real time PCR (mrna Ekspresyonu) Flow Sitometri (Protein Ekspresyonu)

37 72 Saat TNF-alfa

38 TNF-alfa-RNA Ekspresyonu * *

39 TNF TNF HT29 hücreleri

40 72 Saat TGF-beta I II

41 TGF TGF HT29 hücreleri TGF

42 72 Saat IL1-alfa I II

43 IL1 IL1 HT29 hücreleri IL1 Etki yok

44 Sinerjistik Etki?? Antagonistik Etki?? Sitokin Kombinasyonları

45 72 Saat Sitokin Kombinasyonları I * * II * *

46 Sitokin Kombinasyonları-RNA Ekspresyonu * * * * *

47 TGF TNF TNF HT29 hücreleri Antagonistik etki

48 TNF TNF HT29 hücreleri Sinerjistik etki IL1

49 Semra Işık- Doktora- Maya CA Meltem Aydın- Doktora- hcai Klonlanması ve yönlendirilmiş mutagenez Sümeyye Aydoğan hcaii de yönlendirilmiş mutagenez Prof. Dr. Oktay Arslan BAÜ, FEF, Kimya Bölümü Yrd. Doç. Dr. Özen Özensoy Güler BAÜ, FEF, Kimya Bölümü Prof. Claududia Supuran University of Floronce, İtalia Reader Dr. Dipak Ramji University of Cardiff, UK Rahşan Ilıkçı Sağkan- Doktora - HT29 Kolon kanserinde CAIX expresyonu Hatice Yıldıırım-Doktora- hcaix promoterunun Moleküler Analizi

50 TEŞEKKÜR Bu çalışma Tübitak 105T326 proje ile desteklenmiştir. Çalışmalar BÜTAM Biyoloji Biriminde gerçekleştirilmiştir.

51 Teşekkür ederim