Hücre Transfeksiyonu

Transkript

1 1 Hücre Transfeksiyonu

2 Tanımlar Transformasyon: Bakteri ve bitkilere gene/k materyal aktarılması işlemidir. Transdüksiyon: Ökaryo/k hücrelere gene/k materyallerin viral yöntemlerle aktarılması işlemidir. Transfeksiyon: Ökaryo/k hücrelere gene/k materyallerin viral olmayan yöntemlerle aktarılması işlemidir. 2

3 Tanımlar Stabil Transfeksiyon: Hücreye dışarıdan gönderilen DNA örneğinin hücre genomuna entegre olduğu transfeksiyon şeklidir. Geçici Transfeksiyon: Hücreye dışarıdan gönderilen DNA örneği hücre genomuna entegre olmaz. Gönderilen DNA dan gen ifadesi saat süreyle ifade edilir. 3

4 Tanımlar Plasmid: Bakteri genomundan bağımsız olarak kendini eşleyebilen çim zincirli halkasal DNA dır. Bir gen özellikle bir hücre türünde çok miktarda ifade edilmek isteniyorsa; Gen dizisi plazmid içerisine klonlanır. Plazmid bakteri içerisine aqlarak çoğalqlır. ÇoğalQlan plazmid hücrelere değişik transfeksiyon yöntemleri ile aktarılır. Bu şekilde hedef gen hücrelerin içerisinde çok miktarda ifade edilmiş olur. 4

5 5

6 Moleküler Klonlama 6

7 Moleküler Klonlama Mavi koloni Beyaz Koloni 7

8 Moleküler Klonlama 8

9 Transfeksiyon Ajanları Genler (DNA) ve biyolojik hücre yüzeyleri aynı nega/f şarja sahip/rler. Bu nedenle genlerin vücut hücrelerine girişi kendiliğinden ve etkili olmaz. Genlerin başarılı ve güvenli bir şekilde hücre içerisine aktarılabilmesi için uygun gen transfer ajanlarının varlığına ih/yaç duyulmaktadır. 9

10 Transfeksiyonun Amacı 1. Gen fonksiyonunun çalışılması Fizyolojik Patolojik 2. Protein ifadesinin çalışılması Lokasyon Protein-protein etkileşimi 3. Hücrelerin yeniden programlanması 10

11 Transfeksiyon Çeşitleri Transfeksiyon: Ökaryo/k hücrelere gene/k materyallerin viral olmayan yöntemlerle aktarılması işlemidir. 1. DNA nın direkt hücre içerisine gönderilmesi Elektroporasyon (Elektrik geçici olarak hücre zarında delikler açar) Biolis/k Gen tabancası (DNA tu\urulmuş parçacıkların hücreye ateşlenmesi) Mikroinjeksiyon 2. DNA nın taşıyıcı moleküllerle hücre içerisine gönderilmesi Kalsium Fosfat DEAE Dextran Lipozomlar 11

12 DNA nın direkt hücre içerisine gönderilmesi 1. Elektroporasyon (Elektrik geçici olarak hücre zarında delikler açar) - Fiziksel bir transfeksiyon yöntemidir. - Nanometre büyüklüğünde porlar oluşturulur. - Elektroporasyon yöntemi in vivo da da kullanılabilir. Cilt ya da cilde yakın doku ve organlarda (deri, kas, vb.) elektrotlar yardımıyla gen transferi işlemi yapılabilir. 12

13 DNA nın direkt hücre içerisine gönderilmesi 2. BiolisRk Gen tabancası (DNA tuturulmuş parçacıkların hücreye ateşlenmesi) - Öncelikli olarak bitki transformasyonu için geliş/rilmiş/r. - Metal nanoparçacıklar DNA ile kaplanır. - Su damlacığı içerisinde yüksek basınçlı gaz ya da elektrik potansiyeli yardımıyla nanoparçacıklar yüksek hızda hedef hücreye doğru crlaqlır. 13

14 DNA nın direkt hücre içerisine gönderilmesi 3. Mikroinjeksiyon - Mikroinjeksiyonla bi anda az sayıda hücreye gen transferi yapılabilir. - Oosit, yumurta ve erken embriyonik dönemdeki hücreleri bu yöntemle gen transferi yapılır. - DNA nın direk bir dokuya, ya da kana enjekte edildiği durumlar da vardır. 14

15 DNA nın taşıyıcı moleküllerle hücre içerisine gönderilmesi - Pozi/f yüklü moleküller ya da lipofilik moleküller nega/f yüklü DNA ile karışqrılır ve oluşan karışım besi yerine eklenir. - Taşıyıcı-DNA kompleksi hücre zarına tutunur ve sonrasında hücre içerisine alınır. 15

16 DNA nın taşıyıcı moleküllerle hücre içerisine gönderilmesi 1. Kalsium Fosfat - DNA kalsiyum klorürle karışqrılır. - Sonrasında kontrollü bir şekilde fosfat solüsyonuna eklenerek DNA/Ca +2 çökel/si oluşturulur. - Oluşan çökel/ hücrelerin besi yerine eklenir. - Hücreler endositozla DNA yı içine alır. 16

17 DNA nın taşıyıcı moleküllerle hücre içerisine gönderilmesi 1. Kalsium Fosfat - Oldukça ucuz bir yöntemdir. - Yüksek verimlilikte transfeksiyon işlemi gerçekleşir. - Çok küçük ph değişiklikleri (0.1) transfeksiyon başarısını etkileri - Oluşan çökel/ içerisindeki parçacıkların boyutu ve kalitesi transfeksiyon başarısı için önemlidir. 17

18 DNA nın taşıyıcı moleküllerle hücre içerisine gönderilmesi 2. DEAE Dextran - DEAE Dextran polimetrik bir katyondur. Pozi/f yükü dolayısıyla DNA ya bağlanır. 18

19 DNA nın taşıyıcı moleküllerle hücre içerisine gönderilmesi 2. DEAE Dextran - Sonrasında DNA nın hücre zarına bağlanmasını ve endositozla hücre içerisine alınmasını sağlar. - DEAE Dextran Hücreler için toksik/r. Dolayısıyla yüksek konsantrasyonda ve uzun süreli maruziyet sorun oluşturur. 19

20 DNA nın taşıyıcı moleküllerle hücre içerisine gönderilmesi 3. Lipozomlar - Katyonik lipidlerdir. - Hidrofobik baş ve hidrofilik kuyruk kısımları vardır. - Fosfolipid bilayer yapıları olduğu için lipozomlar hücre zarı ile birleşerek DNA yi hücre içerisine taşırlar. 20

21 DNA nın taşıyıcı moleküllerle hücre içerisine gönderilmesi 3. Lipozomlar 21

22 Transdüksiyon Bazı virüsler yabancı gen taşıyabilme kapasiteleri ve bu genleri yüksek miktarda ifade edebilme potansiyellerinden ötürü gen transferi işlemlerinde kullanılırlar. Rekombinant DNA yı taşıyan virüsler oluşturulur. Aracı hücrelerde bu virüsler çoğalqlır. Virüsler saflaşqrılır ve sayıları belirlenir. Hedef hücreler virüslerle infekte edilir. Virüs türüne göre rekombinant DNA genoma entegre olur. 22

23 Transdüksiyon Virüslerle gen aktarımında gen aktarım verimliliği çok yüksek/r. Adenovirüsler (genoma entegre olmazlar) Retrovirüsler (genoma entegre olurlar) Viral DNA Gene of Interest Virus Target Cell Infected With Viral DNA Containing The Gene of Interest Target Cell Cell s DNA 23

24 24 Transdüksiyon