S NAR T (Dentex dentex, L.) LARVALARINDA ZLENEN PROTEAZ AKT V TES NDEK

Transkript

1 EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS TEZ ) S NAR T (Dentex dentex, L.) LARVALARINDA ZLENEN PROTEAZ AKT V TES NDEK DE MLER Gözde KÜÇÜK Tez Dan man : Doç. Dr. Cüneyt SUZER Su Ürünleri Yeti tiricili i Anabilim Dal Bilim Dal Kodu: Sunu Tarihi: Bornova- ZM R 2010

2 v ÖZET Sinarit (Dentex dentex, L.) Larvalar nda zlenen Proteaz Aktivitesindeki De i imler KÜÇÜK, Gözde Yüksek Lisans Tezi, Su Ürünleri Yeti tiricili i Bölümü Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Cüneyt SUZER A ustos 2010, 58 sayfa Son on y ld r, Akdeniz ülkelerinde akuakültür üretimi daha çok çipura (Sparus aurata) ve levrek (Dicentrarchus labrax) üzerinde yo unla m durumdad r. Bu durum, ekonomik de eri yüksek potansiyel alternatif türlerin üretimini gündeme getirmi tir. Bu çal mada, son y llarda alternatif türler aras nda de erlendirilen sinarit (Dentex dentex) bal n n larva kültüründe (0-40 gün) önemli yere sahip olan sindirim enzimlerinden proteaz grubu enzimlerin aktivitesindeki de i imler incelenmi tir. Yumurtadan ç kan larvalarda 3. günde a z ve anüs aç l m gözlenmi ve d ar dan yem giri i yap lm t r. Alkalin proteaz aktivitesi, eksojen besin al m ile birlikte tespit edilmi ve larval geli ime ba l olarak spesifik aktivitesi yükselmi tir. Bununla birlikte, asit proteaz aktivitesi, 28. günden itibaren fonksiyonel mide olu umu ile tespit edilmi, ayn ekilde spesifik aktivitesi deneme sonuna kadar de i im göstermi tir. Larval üretim sonunda, total boy ve a rl k geli imi s ras ile 19.83±2.6 mm ve 42.12±4.3 mg olarak tespit edilmi tir. Ayr ca spesifik büyüme oran (SBO) ve ya ama oran ise s ras ile 9.35±1.9 %/gün ve %18.6±3.7 olarak hesaplanm t r. Sonuç olarak, sinarit larvalar n n proteaz grubu enzimlere ait aktivite de i imleri, alternatif türler kapsam nda yer alan fangri (Pagrus pagrus), k rma mercan (Pagellus erythrinus) ve sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo) gibi di er Sparidae türleri ile yak n benzerlikler göstermi tir. Anahtar Sözcükler: Enzim aktivitesi, sindirim fizyolojisi, sinarit (Dentex dentex), larval geli im, alkalin proteaz, asit proteaz, protein.

3 vii ABSTRACT Variations of digestive protease activity in Common dentex (Dentex dentex, L.) larvae KÜÇÜK, Gözde MSc in Aquaculture Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Cüneyt SUZER August 2010, 58 pages During the last decade, Mediterranean aquaculture mainly based on gilthead sea bream, Sparus aurata, and European sea bass, Dicentrarchus labrax, and this situation caused production of promising candidate species. In this study, changes of alkaline and acid protease enzymes activity in recent candidate species common dentex larvae (between 0 and 40 days) were investigated. Mouth and anus were opened on day 3 and also exogenous feeding started. The specific activity of alkaline protease was firstly detected on day 3 concurrently with starting of exogenous feeding and also relatively increased by larval age and size. However, the specific activity of acid protease was firstly measured at 28 days after hatching concurrently with formation of functional stomach. At the end of the larval rearing, total length and weight development was determined as 19.83±2.6 mm and 42.12±4.3 mg, respectively. Additionally, specific growth rate (SGR) and survival rate were calculated as 9.35±1.9 %/day and 18.6±3.7%, respectively. As a result, ontogenic development and enzymatic profile in common dentex larvae were demonstrated similar profile as abserved in the other promising candidate Sparid species such as red porgy (Pagrus pagrus), common pandora (Pagellus erythrinus) and sharpsnout (Diplodus puntazzo) sea bream larvae. Keywords: Enzyme activity, digestive physiology, common dentex (Dentex dentex), larval devolepment, alkaline protease, acid protease, protein.

4 ix TE EKKÜR Biyoloji mezunu olmama ra men beni ko ulsuzca ö rencisi olarak kabul eden, tez konumun belirlenmesinden tezimin bitimine kadar olan süreçte beni yönlendiren, her türlü katk ve yard mlar n esirgemeyen k ymetli hocam say n Doç. Dr. Cüneyt SUZER e, Yüksek lisans e itimim boyunca ve tezimin haz rlanmas nda tecrübelerini ve manevi desteklerini eksik etmeyen de erli hocalar m say n Prof. Dr. M. Kür at FIRAT, Prof. Dr. ahin SAKA, Doç. Dr. Deniz ÇOBAN a, ve kendisini her zaman sayg, minnet ve rahmetle anaca m hocam Dr. H. Okan KAMACI ya te ekkürü bir borç bilirim. Çal mam n yürütülmesinde sahip olduklar teknik imkânlar s n rs zca kullanmam sa layan i letme müdürü Salih KÖSELER nezdinde tüm Çaml Yem Besicilik San. Tic. A.. P nar Deniz Ürünleri letmesi Ild r Kuluçkahane Tesisi çal anlar na, Çal mam süresince bana katlanan, pratik bilgisi ile hiçbir sorumu yan ts z b rakmayan arkada m Su Ürünleri Müh. Burak ÇET NSÖZ e ve Su Ürünleri Müh. Murat DE ERL ye, Her konuda oldu u gibi tezimin haz rlanmas esnas nda da desteklerini her zaman yan mda hissetti im arkada lar m Uzm. Biyolog. Serdar UZAR ve Uzm. Biyolog Hale GÜNER e te ekkür ederim. S cakl klar n bir an olsun eksiltmeyip bana olan güvenlerini hiç kaybetmeyen, bugünlerimin mimar k ymetli A LEME sonsuz te ekkürler. Gözde KÜÇÜK A ustos, 2010

5 xi Ç NDEK LER Sayfa ÖZET v ABSTRACT... vii TE EKKÜR... ix Ç NDEK LER xi EK LLER D Z N... xvii Ç ZELGELER D Z N... xxi 1. G R ÖNCEK ÇALI MALAR Sinarit Bal n n Biyolojisi Sinarit Larvalar n n Fizyolojik Geli imi Prelarval Dönem Postlarval Dönem Sindirim Sistemi Fizyolojisi Enzimler Enzimin Tan m Enzimlerin Yap s ve Özellikleri.. 13

6 Ç NDEK LER (devam) Sayfa Enzimlerin Aktivitesini Etkileyen Faktörler Sindirim Enzimleri MATERYAL VE YÖNTEM Anaç Yönetimi ve Yumurta nkübasyonu Larval Üretim ve Deneme Düzeni Enzim Analizleri Alkalin Proteaz Asit Proteaz Protein statistik BULGULAR Anaç Yönetimi ve Yumurta nkübasyonu Larval Geli im Enzim Aktiviteleri Alkalin Proteaz Asit Proteaz TARTI MA VE SONUÇ 37

7 Ç NDEK LER (devam) Sayfa KAYNAKLAR D Z N ÖZGEÇM. 58

8 xvii EK LLER D Z N ekil Sayfa 1.1 Türkiye de y llar nda üretilen alternatif türlere ait yavru bal k miktar Sinarit bal n n genel görünü ü Sinarit bal n n da l m alanlar Yumurtadan yeni ç km sinarit prelarvas günlük sinarit larvas n n enine kesiti Larvalarda sindirim tüpü geli imi günlük sinarit larvas n n enine kesiti günlük sinarit larvas Enzimlerin genel çal ma prensibi Enzim-substrat mekanizmas P nar Deniz Ürünleri letmesi Ild r Kuluçkahane Tesisleri Denemede kullan lan anaç bal klar Larval üretimde kullan lan deneme tanklar günlük sinarit larvas nda a z aç l m Denemede kullan lan canl yemler... 23

9 EK LLER D Z N (devam) ekil Sayfa 4.1 Farkl safhalardaki sinarit bal yumurtas Larvalarda vitellüs ve ya damlas durumu Deneme süresince larvalarda gözlenen total boy-a rl k de i imi günlük sinarit larvas günlük sinarit larvas günlük sinarit larvas günlük sinarit larvas günlük sinarit larvas günlük sinarit larvas günlük sinarit larvas Deneme süresince larvalarda gözlenen alkalin proteaz aktivitesindeki de i imler Deneme süresince larvalarda gözlenen asit proteaz aktivitesindeki de i imler.. 36

10 xxi Ç ZELGELER D Z N Çizelge Sayfa 1.1 Türkiye de kültür bal üretimi Mide ve pankreastan proenzim halinde sentezlenen ba l ca proteolitik enzimler Denemede kullan lan mikropartikül yemin besin madde içeri i Sinarit larva üretim protokolü Baz türler ile yap lan çal malarda alkalin proteaz aktivitesinin tespit edildi i günler Baz türler ile yap lan çal malarda fonksiyonel mide olu umunun gözlendi i günler.. 45

11 1 1. G R Ya am n devaml l n sa lamak için en önemli gereksinim ku kusuz beslenmedir. Artan dünya nüfusu ile ortaya ç kan besin k tl insano lunun ya ad problemlerin ba nda gelmektedir. Bitkisel besin kaynaklar n n azalmas ile hayvansal protein kaynaklar na yönelim, bu beslenme probleminin yeterli ve dengeli hâle getirilebilmesi için mevcut karasal ve denizel kaynaklar n olabildi ince etkin kullan m n gündeme getirmi tir. Bu ba lamda, insano lu deniz ve iç sulara yönelmi tir. Yüzy llardan beri iç su ve denizlerden avc l k yolu ile yararlanan insano lu, geçen yüzy l n ikinci yar s ndan sonra yapay yollar ile su ürünleri üretimine yo unla m ve özellikle bu yüzy l n sonlar nda teknolojik geli imlere paralel olarak akuakültür, insan eli alt nda su ürünleri üretimi, ba l ba na bir sektör hâlini alm t r. Çizelge 1.1 de, Türkiye statistik Kurumu (TÜ K) nun 2008 verilerine göre Türkiye de yap lan toplam kültür bal üretimi de erleri verilmi tir. Günümüzde, dünya üzerinde elde edilen y ll k su ürünleri üretiminin 92 milyon tonu avc l k yoluyla, yakla k 52 milyon tonu ise yeti tiricilik yoluyla elde edilmektedir (FAO, 2008). Çizelge 1.1 Türkiye de kültür bal üretimi (TÜ K, 2008). Kültür Bal klar Üretimi (Ton) Tür ç su Bal klar Alabal k A. Sazan Toplam Deniz Bal klar Alabal k Çipura Levrek Toplam

12 2 Su ürünleri yeti tirme teknolojisinin geli imine paralel olarak et kalitesi ve ekonomik de eri yüksek bal k türlerinin kültür çal malar artm t r. Bugüne kadar ülkemizde üreticilerin tercih etti i türlerin ba nda gelen çipura (Sparus aurata) ve levrek (Dicentrarchus labrax) pazar nda son y llarda ya anan baz darbo azlar ve üretim maliyetlerinin artmas, giri imcileri alternatif türlerin üretimine yönlendirmi tir. Yeni türlerin pazara girmesi ile birlikte, sektörde ekonomik canlanman n yan s ra üreticilerin s k nt lar n n da a labilece i beklenmektedir. Günümüzde alternatif olarak üretime al nan türler; sinarit (Dentex dentex), k rma mercan (Pagellus erythrinus), fangri (Pagrus pagrus), sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo), m rm r (Lithognathus mormyrus), lahos (Epinephelus auneus), kalkan (Scophthalmus maximus) sargos (Diplodus sargus) gibi oldukça geni bir yelpazeye yay lm t r. ekil 1.1 de, TÜ K in 2008 verilerine göre Türkiye de y llar aras nda üretilen alternatif türlere ait yavru bal k miktarlar gösterilmi tir. Türkiye'de y llar nda üretilen alternatif türlere ait yavru bal k miktar (milyon adet) 0,2 1,7 1,7 K rma mercan Sar a z Kalkan 0,5 1 1,2 0,1 1 E kine Sinagrit Fangri Sivriburun karagöz Sargos ekil 1.1 Türkiye de y llar nda üretilen alternatif türlere ait yavru bal k miktar (TÜ K, 2008).

13 3 Akdeniz ülkelerinde akuakültür sektörü, toplam deniz bal üretiminin %60 n kapsayan levrek ve çipura türlerinin üretimine dayan r (SIPAM, 2004). Son y llarda, üretimde izlenen büyük art n ayn oranda tüketime yans mamas, akuakültür sektörüne yeni bir ivme kazand rabilmek amac ile ekonomik de eri yüksek alternatif türlerin üretimini gündeme getirmi tir (Shields, 2001; Kaiser and Stead, 2002). Bu ba lamda, h zl bir büyüme gösteren sinarit, son y llarda akuakültür sektöründe alternatif türler aras nda de erlendirilen ekonomik de eri yüksek bir Sparidae türüdür (Riera et al., 1993; Pastor et al., 1995; Koumoundouros et al., 1999a; Pavlidis et al., 2000; Rueda and Martínez, 2001). Son y llarda, akuakültür alan nda üretim miktar n n ve ürün kalitesinin artt r lmas na yönelik çal malar yo unla m t r. Bu çal malar aras nda özellikle biyoteknoloji alan nda (enzimoloji, genetik, histoloji, vb.) yap lan ara t rmalar önemli bir yere sahiptir. Bu konulardaki bilimsel ara t rmalar sonucunda ortaya ç kan larva ve yavru bal k kalitesinin artt r lmas, ya ama oran n n yükseltilmesi, yemin de erlendirilmesi ve spesifik büyüme oran n n artt r lmas, hastal klara kar ba kl k sisteminin güçlendirilmesi ve de i en ko ullarda optimal besleme stratejilerinin geli tirilmesine yönelik olumlu veriler, kaliteli larval üretim üzerinde do rudan etkili olan konulard r. Deniz bal klar yeti tiricili inde yavru bal k kalitesini do rudan etkileyen fizyolojik de i imler genellikle larval dönemde meydana gelmektedir. Larval dönemde biyotik ya da abiyotik faktörlerden kaynaklanan ölümlerin en aza indirilmesi bilim adamlar n n ve üreticilerin ilk s radaki hedeflerinden biri olmu tur. Birçok fizyolojik de i imin ya and larval dönem sürecinde meydana gelen olaylar n ayr nt l biçimde tan mlanmas ve sindirim enzimleri aktivitesindeki de i imlerin bilinmesi, ya ama oran n n ve üretilen yavru bal k kalitesinin artt r lmas nda büyük önem ta maktad r. Akuakültür alan nda, sindirim enzimleri ile ilgili çal malar daha çok levrek ve çipura türleri üzerinde yo unla m durumda olsa da alternatif tür kapsam nda de erlendirilen türlerin kültüre al nma çal malar için yürütülen öncelikli çal malar n konusunu da yine sindirim enzimleri aktivitesinin bilinmesi olu turmaktad r.

14 4 Çal mada, alternatif tür kapsam nda de erlendirilen sinarit türünün larval dönem süresince (0-40 gün) geli imi ve sindirim enzimlerinden proteaz grubu enzimlerin aktivitesindeki de i imleri incelenmi tir. Bu ba lamda, sinarit bal n n larval üretim süreci boyunca zaman zaman üreticilerin kar kar ya kald yetersiz beslenme ve özellikle de metamorfoza ba l besinsel de i imlerin fizyolojik olarak tan mlamas nda meydana gelen de i iklikler enzimatik aç dan yak ndan izlenmi tir. Çal mada, sinarit türünde proteaz grubuna ait sindirim enzimlerinin ba lang ç ve geli imini tan mlamak, bu türün yumurta ç k ndan juvenil evreye kadar olan sindirim fizyolojisini kavramak ve sinarit larva kültürünün kritik evreleri ile bu veriler aras nda ba lant kurmak amaçlanm t r.

15 5 2. ÖNCEK ÇALI MALAR 2.1 Sinarit Bal n n Biyolojisi Sinarit bal n n sistematikteki yeri a a da verilmi tir. Kingdom : Animalia Phylum : Chordata Subphylum : Vertebrata Superclassis : Osteichthyes Classis : Actinopterygii Ordo : Perciformes Familia : Sparidae Genus : Dentex Species : Dentex dentex (Linnaeus, 1758) Yabanc dillerdeki adland r lmas ise Common dentex ( ng.), Zahnbrassen (Alm.), Denté (Fra), Dentón ( sp.), Dentice ( tal.), Synagrida (Yun.) eklindedir. ekil 2.1 Sinarit bal n n genel görünü ü.

16 6 Oval vücut yap s na sahip olan sinarit bal n n gövdesi yüksek ve lateralden yass la m t r. Bal k, gümü gri üzerine ye il, pembe, alt n sar s ve parlak mavi renk tonlar nda olup canl yken bunlar üzerinde koyu renkli benekler ta r. Yüzgeç nlar DXI+12-15, AIII+7-9, AIII olarak formüle edilir. Kaudal yüzgeç homoserktir. Ba büyüktür, a z kal n dudakl d r ve keskin bir çenesi vard r. Ba n üst k sm genç bireylerde konveks bir yap da iken ergin bireylerde düz, ya l bireylerde kambur eklindedir. Sinarit bal n n genel görünü ü, ekil 2.1 de gösterilmi tir. Boyu maksimum 1.5 m, ortalama cm civar ndad r. A rl ortalama 1.5 kg, maksimum 13 kg olabilir (Bauchot and Hureau, 1986; Ramos-Esplá and Bayle-Sempere, 1991). Demersal bir tür olan sinarit, s cakl k ve tuzlulu a tolerans nedeniyle fazla derin olmayan k y sular nda, lagünlerde ve nehir a zlar nda bulunur. Bütün Akdeniz de, Do u Atlantik te, ngiliz Adalar ndan Biscay Körfezi ne kadar olan bölgede yay l m gösterir. ekil 2.2 de sinarit bal n n da l m alanlar gösterilmi tir. 200 m derinlikten daha s sularda, sert dip yap s na sahip kayal k bölgelerde ya ar. Ergin bireyler tek, genç bireyler sürü hâlinde dola r. Karnivor olup kemikli bal klar, yumu akçalar, eklem bacakl lar ve kafadan bacakl lar ile beslenir. Sinarit, di er Sparidae üyelerinin aksine gonokoristik hermafrodit özellik göstermektedir (Loir et al., 2001). ki ya nda cinsel olgunlu a ula r (17 cm) ve Nisan-Haziran aylar aras nda yumurtlar. Bu aylarda üreme amac ile derin sulara do ru göç eder. leri telolesital tipteki yumurtalar pelajik ve effaf özellikte olup tek ya damlas içerir (Saka ve di., 2004). ekil 2.2 Sinarit bal n n da l m alanlar.

17 7 Sinarit larva üretimi ile ilgili çal malar a rl kl olarak embriyolojik geli im, erken dönem fizyolojik özellikler, morfolojik ve osteolojik geli im ve beslenme konular üzerinde yap lm t r (Koumoundouros et al., 1999b; F rat ve di., 2003; Espinós et al., 2002; Saka ve di., 2004; F rat ve di., 2005). Sinarit, son y llarda alternatif türler kapsam nda s kl kla ele al nmas na ra men özellikle larval dönemde ya anan yüksek oranda iskelet deformasyonlar, dü ük ya ama oran de erleri, besinsel gereksinimlerinin tam olarak tan mlanmamas gibi sorunlar bu türün yo un üretime geçirilmesindeki önemli engeller olarak görülmektedir (Rueda and Martinez, 2001; Koumoundouros et al., 2004; Bermejo-Nogales et al., 2007). 2.2 Sinarit Larvalar n n Fizyolojik Geli imi Prelarval Dönem (0-2. gün) Bu evrede, sinarit larvalar n a z ve anüsleri kapal d r. Larvalar pasif durumda olup ya damlas ve vitellin rezervleri içeren besin kesesinden sa lanan enerji ile hayatlar n sürdürürler. A z ve anüs kapal oldu undan eksojen beslenme söz konusu de ildir. Vitellüs kesesi, vücudun anteriyöründe yer al r. Ya damlas ise vitellüs kesesinin posteriyöründedir. ekil 2.3 te, yumurtadan henüz ç km sinarit prelarvas gösterilmi tir. Su s cakl, vitellüs kesesinin tüketiminde ve a z ve anüs aç l m nda en önemli faktördür. Larvada, larvan n tüm vücudunu saran bir primordial yüzgeç bulunur. I ns z bir deri k vr m eklinde olan bu yüzgeç, ba n hemen arka k sm ndan ba lay p tüm vücudu geçer ve besin kesesinde son bulur. Bu sayede larva, hem suda yüzebilir hem de gerek duydu u oksijeni sa lar (F rat ve di., 2005). Ba, a a ya do ru e iktir, gözlerde retinal renklenme yoktur. Yumurtadan henüz ç km larvada sindirim tüpü düz bir boru eklindedir. Sindirim tüpünün dorsalinde pankreas, ventralinde ise karaci er farkl la mam küçük tomurcuksu yap daki hücrelerden olu ur. Mide bu dönemde bir bo um ile belirlenir. Ba rsak çeperi yumurta ç k ndan itibaren düz bir yap dad r. Daha

18 8 sonraki günlerde meydana gelen yo un mitoz ile tek tabaka olan hücreler 2-3 tabakal bir hâl al r. Karaci erdeki hepatik hücreler ilk gün ile birlikte görülmeye ba lar. Bu dönemde pankreasta geli im proksimal, karaci erde ise distal yöndedir. 2. günde sindirim tüpü 50 lik bir aç ile dönme hareketi yapar. Bununla beraber karaci er sol laterale kayarken, pankreas da sa laterale yerle ir. Sindirim tüpünün dorsalinde ise hava kesesinin ilk olu umu ba lar (Santamaria et al., 2004). Pigmentasyon; burunda, a z bölgesinde, besin kesesinin ön k sm nda, kuyru un ventralinde, ba rsa n üstü boyunca ve anüsün üst k sm nda belirginle meye ba lar. Hareket su debisiyle gerçekle ir. ekil 2.3 Yumurtadan yeni ç km sinarit prelarvas Postlarval Dönem (3-40. gün) Larvan n a z ve anüsünün aç lmas ile postlarval evre ba lar. Do al olarak bu dönemde larvan n canl yemler ile eksojen beslenmesi gerekir. Vitellüs kesesinin ço u absorbe olmas na ra men az miktarda ya damlas mevcuttur. Salg bezleri tam olu mad ndan sindirim mekanizmas mükemmel de ildir. ekil 2.4 te, 3 günlük sinarit larvas n n enine kesiti verilmi tir.

19 9 ekil günlük sinarit larvas n n enine kesiti. K: karaci er, st: sindirim tüpü, p: pankreas, v: vitellüs (Santamaria et al., 2004). Hava kesesi olu umu ve geli imi, sinarit larvalar n n ya ama yüzdesini s n rlay c temel fizyolojik yap d r. Sinarit larvalar nda hava kesesi ve sindirim tüpü birbirine ba l oldu undan sinarit, fizoglist türler içinde yer al r. Sinarit bal klar nda hava kesesi, sindirim tüpünün dorsal divertikülünden köken al r. Fizoglist türlerde genellikle hava kesesinin ilk olarak i mesi ve hidrostatik fonksiyonunun kullan lmas a z aç l m ve eksojen ilk besleme sonras nda gerçekle mektedir (Doroshev et al., 1981). Hava kesesinin geli imi esnas nda vitellüs ve ya damlas hacminde küçülme olur. Sinarit larvalar n n 6-8. günler aras nda hava kesesini i irdi i tespit edilmi tir (F rat ve di., 2005).

20 Sindirim Sistemi Fizyolojisi Yavru bal k kalitesini do rudan etkileyen fizyolojik de i imler (embriyonik ve ontogenik geli im) genel olarak larval dönemde meydana geldi inden bu süreç oldukça önemlidir. Bal k larvalar ndaki sindirim kanal morfolojik, histolojik ve fizyolojik aç dan erginlerinkine nazaran daha basit yap dad r. Vitellüs kesesi ve ya damlas n n emiliminden önce ilkel bir sindirim tüpü mevcuttur. Sindirim kanal, larval dönem boyunca de i mezken juvenil dönemin sona ermesi ile eri kin yap ya do ru h zl bir de i im ba lar. Bunun en büyük nedeni, larvan n ald besinin de i mesidir. Larva, öncelikle küçük boyutlu fitoplankton ve zooplankton ile beslenir ve geli tikçe daha büyük boyuttaki canl yemleri almaya ba lar. Bu de i im, canl yemin miktar ve toz yemlere olan fizyolojik adaptasyona paralel olarak geli mektedir. ekil 2.5 te, metamorfoz süresince larvalarda sindirim tüpü geli imi gösterilmi tir. ekil 2.5 Larvalarda sindirim tüpü geli imi. fg: Ön ba rsak, mg: Orta ba rsak, hg: Arka ba rsak. nkübasyon s ras nda sindirim kanal, vitellüs kesesinin dorsalinde düz bir tüp eklindedir ve histolojik olarak fark edilmemektedir. Bu esnada a z ve anüs kapal d r. Vitellüs kesesi ve ya damlas emiliminin tamamlanmas ile bukkofarinks, sindirim sisteminin ön, orta ve arka k s mlar n olu turmaya ba lar. ekil 2.6 da, 8 günlük sinarit larvas n n enine kesiti gösterilmi tir.

21 11 ekil günlük sinarit larvas n n enine kesiti. FG: Ön ba rsak, MG: Orta ba rsak, N: Notokorda, Oe: Özafagus, L: karaci er, HG: Arka ba rsak, P: Pankreas, sb: Hava kesesi, o: Operkulum, e: Göz, E: Beyin, *: Mesane (Santamaria et al., 2004). Ön k sm n posteriyöründe mide ve pilorik çekan n geli mesi ile sindirim kanal n n en büyük de i imi gerçekle mi olur. ekil 2.7 de, 40 günlük sinarit larvas ndaki geli mi sindirim sistemi ve mide gösterilmi tir. Lipid emilimi orta k s mda gerçekle irken, proteinlerin aminoasitlere hidrolizi ise orta ve son k s mdaki tripsin, kimotripsin ve aminopeptidaz aktivitesi ile meydana gelmektedir (Zambonino Infante and Cahu, 2001). A ekil günlük sinarit larvas. A: Gastrointestinal sistem, B: Geli mi mide öb: Ön ba rsak, M: Mide, oklar: Gastrik bezler (Santamaria et al., 2004). B

22 Enzimler Enzimin Tan m Biyolojik sistemlerdeki reaksiyonlar n, canl ya zarar vermeyecek ekilde uygun ko ullarda gerçekle mesini sa layan protein yap s ndaki katalizörlere enzim ad verilir. Bilindi i gibi katalizör, kimyasal tepkimeye girerek tepkimeyi h zland ran ve tepkime sonunda hiçbir de i ikli e u ramadan ç kan maddedir (Dinçkaya, 1997b). Yaln zca canl lar taraf ndan sentezlenen enzimler, canl metabolizmas ndaki binlerce tepkimenin h z n ve özgüllü ünü düzenler. Solunum, büyüme, kas kas lmas, sinirsel iletim, sindirim vs. gibi ya amsal olaylar n temelini olu turur. E N E R J Reaksiyona girecek olan moleküller Enzim olmad nda aktivasyon enerjisi Enzim varl nda aktivasyon enerjisi Reaksiyon sonucu olu an ürün R E A K S Y O N ekil 2.8 Enzimlerin genel çal ma prensibi (Gözükara, 1997). Canl organizmalardaki ya amsal faaliyetlerin sürdürülebilmesi için birçok metabolik reaksiyonun gerçekle mesi gerekir. Bu kimyasal tepkimelerin ço u hücre içinde olu ur. Tepkimeler s ras nda aç a ç kacak yüksek s, proteinlerin yap s n bozaca ndan organizmaya da zarar verecektir. Hücredeki bu kimyasal tepkimelerin canl ya zarar vermeyecek ko ullarda, dü ük enerji kullan m ile ve

23 13 vücut s s nda gerçekle ebilmesi ancak enzimlerin varl ile mümkündür (Trevor Palmer, 1985; Gözükara, 1997). Enzimlerin genel çal ma prensibi, ekil 2.8 de gösterilmi tir Enzimlerin Yap s ve Özellikleri Tüm enzimlerin proteinleri genler taraf ndan ifrelendi inden aminoasit dizilimi kendine özgüdür. Enzimlerin aktivite göstermeleri için gereksinim duyduklar kompleks organik moleküllere koenzim, protein yap s nda olmayan genellikle metal iyonlar n n meydana getirdi i yan gruplar na ise kofaktör denilmektedir. Baz durumlarda enzimler aktivite gösterebilmeleri için hem koenzime hem de kofaktöre gereksinim duyar ve enzime gev ek ya da kovalent olarak s k ba lanm t r. Enzim yüzeyine s k ca ba lanm ve protein yap s nda olmayan bu gruplara prostetik grup denilmektedir (Dinçkaya, 1997b). Koenzimlerin yap s nda genellikle vitaminler bulunmaktad r. Bu ba lamda vitaminler, metabolik olaylar n enzimler taraf ndan çok kolay ve h zl biçimde gerçekle ebilmesi için organizmalar aç s ndan oldukça önemli olan bile iklerdir. Enzim, koenzimi ya da kofaktörü ile birlikte ve katalitik aç dan tamamen aktif durumda ise enzimin bu haline holoenzim ad verilmektedir. Ayr ca, kofaktörün ve koenzimin enzimden ayr lmas sonucu enzimin aktivitesini yitirip inaktif konuma geçmesi sonras nda sadece protein k s mdan olu an inaktif ekline ise apoenzim denilmektedir (Trevor Palmer, 1985; Uslan, 1997). Organik Molekül (Koenzim) naktif Protein (Apoenzim)+Kofaktör Enzim Holoenzim Metal yonu Aktif protein

24 14 Uluslararas Enzim Komisyonu nun çal malar do rultusunda enzimlerin adland r lmas nda üç temel ilke dikkate al nm t r. Bunlar; a) Enzim isimleri, sonuna az eki al r. Bu ilke sadece tek bir reaksiyonu katalizleyen enzimler için geçerli kabul edilmi olup birden çok enzimi içeren sistemlere uyarlanamaz. b) Enzimler, katalizledikleri reaksiyona göre isimlendirilir ve s n fland r l r. Bu nedenle herhangi bir enzim, katalizledi i reaksiyon tüm ayr nt lar ile bilininceye kadar sistematik olarak isimlendirilemez. c) Enzim Komisyonunun (E.C.) belirledi i temel ilkeler dikkate al narak yap lan bir isimlendirme, reaksiyonun geri dönü lü oldu u deneysel olarak gösterilmi olsa bile, bütün enzim s n flar nda, reaksiyonun sadece dikkate al nan yönünü ifade eder. Buna kar l k, enzimlerin önerilen isimleri, genellikle ilgili reaksiyonlar n canl ortamdaki yönlerini göz önüne almaktad r y l ndaki Enzim Komisyonu raporuna göre, enzimler katalizledikleri reaksiyon tipine göre 6 ana gruba ayr lm ve bu gruplarda yer alan her enzim E.C. olarak k salt lm ve 4 rakamdan olu an bir kod numaras ile tan mlanm t r. E.C. numaras n n kapsad dört rakamdan birincisi o enzimin 6 ana gruptan hangisinde yer ald n, ikinci rakam alt grubu, üçüncü rakam alt-alt grubu ve dördüncü rakam ise o enzimin alt-alt gruptaki seri numaras n ifade etmektedir. Örne in, tripsin enziminin kod numaras E.C , amilaz enziminin kod numaras E.C ve lipaz enziminin kod numaras ise E.C tür (Dinçkaya, 1997b). Enzimler, canl hücreler taraf ndan biyolojik ko ullarda sentez edilmektedir; ancak, aktivite göstermeleri için hücre içinde bulunmalar gerekmez. Enzimler oldukça özel yap kazanm ve genellikle büyük protein molekülleridir. Proteinlerdeki aminoasitlerin primer dizili i genler taraf ndan belirlenen düzende gerçekle mektedir. Enzim yap s nda bulunan aminoasitlerin özel dizili i, enzimin özgünlük ve kuarterner yap kazanmas nda büyük rol oynar.

25 15 Enzimler bir ya da daha çok substrat etkilerken aktivite göstermek için bazen koenzime, bazen de kofaktöre gereksinim duymaktad r. Bir enzimin ürünü, di er bir enzimin substrat olmakta ve bu kar l kl etkile imler hücre metabolizmas n n düzenlenmesinde etkin rol oynamaktad r (Trevor Palmer, 1985; Karlson, 1992; Gözükara, 1997). Enzimlerin genel özellikleri ve çal ma mekanizmalar sekiz temel madde ile özetlenebilir; 1. Enzimlerin etki etti i maddelere substrat ad verilmektedir. Enzim-substrat ili kisi o enzimin spesifitesini olu turur ve E. Fisher taraf ndan anahtar-kilit mekanizmas esas al narak tan mlanm t r. Yaln z belirli bir anahtar n kilide uydu u gibi substrat da sadece belirli bir enzimin aktif merkezine uymaktad r. Enzim molekülünde aktif bölge ad verilen özel bir bölüm yani reaksiyon merkezi bulunur. Enzim, ilgili substrat na geçici olarak bu aktif bölgeden ba lan r ve enzim-substrat kompleksi meydana gelir. Enzimler, substrata d yüzeyinden etki eder ve bunun ard ndan substrat parçalanarak bir ya da iki ürüne dönü ür. ekil 2.9 da, enzim-substrat mekanizmas gösterilmi tir. S + E SE ( A+B) + E S: Substrat E: Enzim A+B: Ürün ekil 2.9 Enzim-substrat mekanizmas (Gözükara, 1997).

26 16 2. Organizmada ya amsal faaliyetlerin sürdürülmesi için gerçekle en reaksiyon say s kadar enzim çe idi bulunmakta ve her enzim belirli bir reaksiyonu katalizlemektedir. 3. Enzim reaksiyonlar çift yönlü çal maktad r; ancak, sindirim enzimleri bu kural n d nda kal r; çünkü olu an ürünün hemen organizma taraf ndan enerji olarak kullan lmak üzere de erlendirilmesi gerekir. Ço unlulukla sindirim enzimlerinin inaktif ekilde sentezlendikten sonra ba ka bir tepkime ile aktif hâle geçmesi bu kural bozmaktad r. 4. Belirli bir apoenzim çe idi belirli bir koenzim ya da kofaktör ile birlikte çal maktad r; ancak, bir koenzim ve kofaktör, birden fazla enzim ile çal abilmektedir. Bu nedenle, var olan enzim say s ve çe idi, kofaktör ve koenzim say s ndan daha fazlad r. 5. Enzimler, dü ük enerji ve s kullanarak çok h zl çal rlar. Örne in, amilaz enzimi ve kimotripsin enzimi ise molekülü ürüne çevirmektedir. 6. Enzimler, biyolojik katalizör olduklar için girdikleri tepkimelerden de i meden ç kmakta ve ayn reaksiyonu tekrar tekrar katalizlemektedir. Sürekli kullan ma ba l olarak bozulan enzimler parçalanmakta ve ilgili hücre taraf ndan yeniden sentezlenmektedir. 7. Enzimatik reaksiyonlar belirli bir düzen içinde gerçekle mektedir. Herhangi bir reaksiyon sonucu olu an ürün, bir sonraki reaksiyonun substrat olabilmektedir. Örne in; amilaz enzimi ile parçalanan ni astadan ürün olarak maltoz olu makta ve maltoz, maltaz enziminin substrat n olu turmaktad r 8. Enzimler, aktif ya da inaktif ekilde bulunabilirler. naktif konumdaki enzim adland r l rken katalizledi i reaksiyonun sonuna jen eki al r. Tripsinojen, kimotripsinojen ve pepsinojen örnek olarak verilebilir. Enzim aktif konumda ise katalizledi i reaksiyonun sonuna az eki al r. Lipaz, amilaz, proteaz, aminopeptidaz örnek olarak verilebilir (Trevor Palmer, 1985; Gözükara, 1997).

27 Enzimlerin Aktivitesini Etkileyen Faktörler Enzimler, biyolojik sistemlerde genellikle çok küçük miktarda bulunur ve reaksiyona girer. Bu nedenle, enzim aktivitesi tan mlan rken protein miktar ndan çok biyolojik sistemde gösterdi i aktivite miktar ndan söz edilmektedir. Enzimatik reaksiyonlar her ko ulda ayn verimlilikte gerçekle mez. Özellikle enzimlerin protein yap l oldu u dü ünüldü ünde ortam parametrelerinin etkisi aç kça ortaya ç kmaktad r. Enzimlerin aktivitesini etkileyen faktörler be madde ile aç klanabilir; S cakl k: Enzimler protein yap s nda moleküller oldu u için öncelikle ortam s cakl ndan büyük ölçüde etkilenirler. Enzim aktivitesinin en iyi oldu u optimum s cakl k C aras ndad r. Enzimler, optimum noktan n biraz üzerinde etkisiz olmas na kar n, s cakl k dü ünce tekrar etkili hâle geçebilir. Fakat bu s cakl n devam ya da biraz daha yükselmesi enzimlerin etkinli ini geri dönü ümsüz olarak ortadan kald r r, protein yap yüksek s cakl kta denatüre olur. Dü ük s cakl klar enzimin yap s n bozmaz; ancak, inaktif duruma geçmesine neden olur. Enzim preparatlar n n -80 C ile -20 C gibi çok dü ük s cakl klarda saklanmas n n temel nedeni budur ph: ph de i imlerine kar oldukça duyarl olan enzimlerin en iyi aktivite gösterdi i bir ph de eri vard r. Örne in, tripsin ve kimotripsin ph , amilaz ph , lipaz ph 7.0 ve pepsin ph derecesinde etkinlik gösterir. Bu de erin alkali veya bazik ortama do ru de i mesi, enzim reaksiyonunu yava lamaktad r. Bu nedenle, enzim preparatlar haz rlan rken ph derecesini sabit tutabilmek için ortama baz tampon çözeltiler konulmaktad r Enzim/Substrat Konsantrasyonu: ph ve s cakl k sabit tutuldu unda enzim/substrat deri imi aras ndaki orana ba l olarak bir tepkime h z görülür. Substrat ya da enzimin fazla olmas bu h z de i ik ekillerde etkileyebilir. Bol substrat bulunan bir ortama eklenecek enzim, son ürün miktar n da artt racakt r.

28 Zaman: Bir enzim reaksiyonunun h z, belirli bir zamanda üretilen ürünün miktar ile belirlenmektedir. Genellikle enzim aktivite tayinlerinde tespit süresi 5 dakika olarak belirlenmi tir. Bu zaman n a lmas durumunda ortam n ph derecesinde de i imler olabilece i gibi baz durumlarda ürünün ortamda birikmesine ba l olarak enzimin denatüre olmas söz konusu olacakt r Di er Kimyasal Maddeler ve Suyun Etkisi: Enzimatik reaksiyonlar s ras nda ortamda serbest hâlde a r metal iyonlar n n bulunmas aktivite h z n azalt r ve enzim üzerinde inhibitör etkisi gösterir. Özellikle sindirim enzimlerinde oldu u gibi inaktif ekilde sentezlenen enzimlerin aktif hâle geçebilmesi için bir tak m iyonlar ile reaksiyona girmesi gerekmektedir. Enzimlerin büyük bir k sm i levlerini su içerisinde gösterdiklerinden su miktar da enzim aktivitesinde etken bir ko uldur. Genellikle %15 in alt nda su içeren ortamlarda enzimler i lev göstermezler Sindirim Enzimleri Tüm organizmalarda ya amsal faaliyetlerin sürdürülebilmesi için al nan kompleks yap daki besin maddelerinin monomerlerine ayr lmas gerekir. Bu reaksiyonlarda en önemli rolü ku kusuz sindirim enzimleri oynamaktad r. Substrat olarak besin maddesine tutunan enzimler, besini ola an üstü bir h zla kendini olu turan en temel bile enlerine parçalamaktad r. Sindirim enzimlerini genel olarak s n fland r ld nda; karbonhidrat sindiriminden sorumlu olanlara amilaz, ya lar n sindiriminden sorumlu olanlara lipaz ve proteinlerin sindiriminden sorumlu olanlara proteaz ad verilmektedir. Enzim aktivitesi; sindirim kanal boyunca organlara ve ayn organ içinde bölgelere, günün saatine, mevsime, bal n aç ya da tok olu una, ya na ve ald yeme göre de i im gösterir. Sindirimin gerçekle mesi, ortamda bulunan enzimin miktar ndan çok aktivitesine ba l d r.

29 19 Çok say da protein molekülü ile birlikte baz enzimler inaktif ekilde ve bir enzimin öncül molekülü olarak sentezlenmektedir. Bunun ard ndan, bu protein molekülünde bulunan bir ya da daha çok peptid ba n n kopar lmas sonucunda enzim aktif hâle geçmektedir. Aktif protein molekülünün enzim oldu u ko ulda, bu enzimin inaktif öncül ekline proenzim ya da proteolitik enzimlerde oldu u gibi enzimin inaktif öncül ekline Zimojen Granülleri denilmektedir (Trevor Palmer, 1985; Gözükara,1997; Sterchi and Stöcker, 1999). Genellikle proteinleri parçalayan sindirim enzimleri, ba lang çta pankreas ve mideden bir proenzim eklinde sentezlenmektedir. Bu proenzimler bir ya da daha çok peptid ba n n kopar lmas ya da belli uzunlukta bir peptid k sm n n as l zincirden uzakla t r lmas ile aktif duruma gelirler. Çizelge 2.1 de, mide ve pankreastan sentezlenen ba l ca proteolitik enzimler verilmi tir. Çizelge 2.1 Mide ve pankreastan proenzim halinde sentezlenen ba l ca proteolitik enzimler. Proenzim Aktif Enzim Sentezlendi i Yer Tripsinojen Tripsin Pankreas Kimotripsinojen Kimotripsin Pankreas Pepsinojen Pepsin Mide Prokarboksipeptidaz Karboksipeptidaz Pankreas Proelestaz Elestaz Pankreas Mide ve ba rsaklarda aktivite gösteren sindirim enzimleri ba lang çta inaktif olarak sentezlenmektedir. Proteinleri parçalayan enzimleri sentezleyen hücreler, kendilerini korumak için bu enzimleri inaktif formda ve bir proenzim eklinde sentezlemektedir. Aksi hâlde, bu enzimler sentezledikleri hücrenin proteinlerini sindirir ve bunun sonucunda kendi kendini tahrip eder. Bu proenzimlerin aktivasyonu sadece sindirim kanal içinde gerçekle mektedir (Trevor Palmer, 1985; Sterchi and Stöcker, 1999).

30 20 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Anaç Yönetimi ve Yumurta nkübasyonu Çal ma, Nisan-Haziran 2009 tarihleri aras nda, zmir ili, Çe me ilçesi, Ild r mevkiinde bulunan, Çaml Yem Besicilik San. Tic. A.. P nar Deniz Ürünleri letmesi Ild r Kuluçkahane Tesisleri nde yürütülmü tür ( ekil 3.1). ekil 3.1 P nar Deniz Ürünleri letmesi Ild r Kuluçkahane Tesisleri. Çal mada kullan lan anaç bal klar, deneme ba lamadan önce do al ortamdan paragat ile yakalanarak tesise getirilmi tir. Anaç bireyler 20 m³ lük adaptasyon tanklar na al nm t r. Adaptasyon i leminden sonra anaç bireyler 1:1 di i (3.978±0.664 kg)/erkek (3.543±0.837 kg) oran nda ve 5 kg/m³ yo unlukta stoklanm t r.

31 21 Anaçlara do al üreme periyodu, Nisan-May s döneminde, do al deniz suyu s cakl nda ( C) do al fotoperiyot (14 saat ayd nl k:10 saat karanl k) uygulanmas n n yap lmas planlanm t r. Anaçlara herhangi bir hormon uygulamas yap lmam t r. ekil 3.2 de, denemede kullan lan anaç bal klardan biri gösterilmi tir. Anaçlar n beslenmesinde yumurta kalitesini artt rmak amac yla taze ya yem olarak sübye (Sepia officinalis), kalamar (Loligo vulgaris), ahtapot (Octopus vulgaris) kullan lm t r. Bununla birlikte, yüksek oranda doymam ya asitleri içeren Vitalis Repro (Trouvit, Italy) pelet yem kullan lm t r. Ayr ca günde 2 kere ad-libitum besleme yap lm t r. ekil 3.2 Denemede kullan lan anaç bal klar. Anaçlardan do al üreme periyodu olan Nisan-May s aylar süresince temin edilen yumurtalar, kollektörlerde topland ktan sonra ayr bir kapta bekletilmi ve ölü-canl ayr m yap lm t r. Canl yumurta miktar tespit edildikten sonra yumurtalar, 200 litre hacmindeki 375 µm göz aç kl na sahip inkübatörlere 3000 yumurta/lt olacak ekilde yerle tirilmi tir. Yumurtalar n, do al deniz suyu s cakl nda (18.5 C) tutulmas planlanm t r.

32 Larval Üretim ve Deneme Düzeni Denemede, 22 m³ hacimli, çeperleri siyah, zemini gri renkte, silindirik yap daki polyester tanklar kullan lm t r. ( ekil 3.3). ekil 3.3 Larval üretimde kullan lan deneme tanklar. nkübasyon a amas ndan sonra larvalar n 100 adet/lt olacak ekilde tanklara yerle tirilmesi planlanm t r. Su yüzeyinde biriken ya n giderilmesini sa lamak amac ile hava süpürgeleri; ayr ca, sistemde kullan lan suyun saturasyonunu dengelemek için gaz at m kolonlar kullan lmas dü ünülmü tür. Besin kesesi ve ya damlas n n tüketildi i prelarval dönemde karanl k uygulamas yap lmas ve 3. günde, a z aç l m n n ard ndan, klar n aç lmas planlanm t r. Ayd nlatmaya 30 lüx iddetindeki spot k kullan larak ba lanmas dü ünülmü tür. Endojen besin rezervlerinin tüketildi i prelarval dönemde larvalara herhangi bir besleme yap lmamas, eksojen beslemeye a z aç l m n n gözlendi i anda ba lanmas planlanm t r. Larva üretiminin, aç k devre sistemde, ye il su tekni i kullan larak yap lmas öngörülmü tür. Alg türü olarak 20-40x10³ hücre/ml Nannochloropsis oculata kullan lmas planlanm t r. Denemede, alg kullan ld sürece 24 saat ayd nlatma yap lmas, alg kullan m sona erdikten sonra günde 16 saat ayd nl k: 8 saat karanl k rejiminin uygulanmas dü ünülmü tür.

33 23 Larvalarda a z aç l m gözlendikten sonra eksojen beslemeye S-type (küçük boyutlu) olarak adland r lan Brachionus rotundiformis ve L-type (büyük boyutlu) olarak adland r lan Brachionus plicatilis türü rotifer ile ba lanmas planlanm t r. Ba lang ç a amas nda 3. gün için %70 S-type+%30 L-type, 5. gün için %50 S-type+%50 L-type, ve 8. günden itibaren sadece L-type rotifer giri i yap lmas dü ünülmü tür. Canl yem yo unlu unun ortalama 10 adet/ml olmas hedeflenmi tir. ekil 3.4 te, a z aç l m n n gözlendi i 3 günlük sinarit larvas gösterilmi tir. ekil günlük sinarit larvas nda a z aç l m. Rotiferin ard ndan canl yem olarak beslemeye Artemia nauplii ile devam edilmesi planlam t r. Larvalara 10. günden itibaren AF tipi Artemia ve ilerleyen günlerde, larva geli imine ba l olarak 15. günden itibaren, zenginle tirilmi Artemia metanauplii nin verilmesi hedeflenmi tir. Artemia nauplii ve rotiferin zenginle tirilmesinde INVE firmas na ait ticari Selco ürünleri kullan lmas öngörülmü tür. Denemede kullan lan canl yemler, ekil 3.5 te gösterilmi tir. A ekil 3.5 Denemede kullan lan canl yemler. A: Rotifer, B: Artemia metanauplii. B

34 24 Mide olu umunun ard ndan, Artemia metanauplii nin azalt lmaya ba land günlerde, tanklara ilk kez mikropartikül yem giri i yap lmas hedeflenmi ve denemede mikropartikül yem olarak µm boyutundaki yemlerin kullan lmas planlanm t r. Çizelge 3.1 de, denemede kullan lan mikropartikül yemin besin madde içerikleri verilmi tir. Çizelge 3.1 Denemede kullan lan mikropartikül yemin besin madde içeri i (INVE Catalogue, Belgium). Besinsel Madde Kompozisyonu Oran Protein %58 Ya %14 Kül %12 Nitrojensiz Öz Madde %9 Nem %7 Selüloz %1 Fosfor %1.4 A vitamini (IU/kg) D3 vitamini (IU/kg) E vitamini 700 (mg/kg) C vitamini (mg/kg) 3 HUFA 30 (mg/kg) DHA/EPA 2 Antioksidanlar Ethoxyquine Larva tank ndaki tuzlulu un ilk üç gün, a z aç l m na kadar, do al deniz suyu tuzlulu unda tutulmas dü ünülmü tür. Hava kesesi olu umunu kolayla t rmak için tuzlulu un 24. güne kadar kademeli olarak dü ürülmesi ve bunu izleyen günlerde, deneme sonuna kadar, yine kademeli olarak deniz suyu tuzlulu una yükseltilmesi planlanm t r. Denemede uygulanan sinarit larva üretim protokolü, çizelge 3.2 de verilmi tir. Deneme süresince, larval geli imin, örnekleme günlerinde tanktan al nan larvalar n tart lmas ile ve milimetrik oküler yard m ile yap lan total boy ölçümü ile izlenmesi dü ünülmü ve deneme sonunda, her tankta kalan larvalar say larak ya ama oran n n hesaplanmas planlanm t r.

35 25 Denemede, alternatif türlerin ba nda gelen sinarit bal n n larval dönem süresince (0-40 gün) geli iminin, büyüme parametrelerinin ve proteaz grubu sindirim enzimleri aktivitesindeki de i imlerin belirlenmesi hedeflenmi tir. Denemenin, metamorfozun tamamland 40. günde sona erdirilmesi planlanm t r.

36 26 Çizelge 3.2 Sinarit larva üretim protokolü. Ya (Gün) S cakl k ( C) Tuzluluk ( ) Debi (Saat) I k Yo. (lüx) I k Süresi (Saat) Alg Yo. hücre/ml Rotifer (adet/ml) Artemia (adet/ml) Mikropartikül Yem x * ** *** (Ao) (Ao) (Ao) (Ao) (Ao) (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+0.5 (A 1 ) (Ao)+1 (A 1 ) (Ao)+1 (A 1 ) (Ao)+1.5 (A 1 ) (Ao)+1.5 (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) Proton (A 1 ) µ (A 1 ) %10-12 C.A (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) Proton (A 1 ) µ (A 1 ) %8-10 C.A (A 1 ) (A 1 ) (A 1 ) Proton (A 1 ) µ (A1) %6-8 C.A. * : %70 S + %30 L Type Ao : Artemia nauplii ** : %50 S + %50 L Type A 1 : Artemia metanauplii (Zenginle tirilmi ) *** : %100 L Type C.A. : Canl A rl k

37 Enzim Analizleri Üretilen sinarit larvalar n n proteaz grubu sindirim enzim aktivitelerini izleyebilmek için yumurta ç k ndan sonra 0, 2, 3, 5, 7, 8, 10. günlerde ve sonras nda deneme sonuna kadar (40. gün) her 5 günde bir adet larva örneklemesi yap lm t r. Larvalar n, sabah ilk yem giri i yap lmadan önce ve genellikle ayn derinlikten al nmas sa lanm t r. Al nan larvalar homojenizatör yard m yla 15000xg devir, 4 C de 30 dakika süre ile homojenize (1/5: homojenat/so uk saf su) edilmi ve elde edilen homojenata 50 mm, ph 7.5, Tris HCl ile gliserol eklenerek enzim analizleri yap l ncaya dek -20 C de saklanm t r. Her enzim, kendine özgü spesifik aktivite tayin yöntemleri ile tespit edilmi ve spektrofotometre (Jenway 6300-Visible Spectrophotometer) cihaz yard m ile enzim aktiviteleri ölçülmü tür Alkalin Proteaz: Alkalin proteaz aktivitesi, Alarcón et al. (1998) taraf ndan tan mlanan casein substrat analizi ile belirlenmi tir. Aktivite, 37 C de ve ph 8.0 derecesinde belirtilen ko ullar alt nda, spektrofotometre cihaz n n 366 nm dalga boyundaki de eri ölçülerek hesaplanm t r. Kullan lan Reaktifler 50 mm Tris HCl tampon çözeltisi %0.5 lik casein substrat

38 28 Prosedür Al nan örnekler 50 mm Tris HCl çözeltisi ile homojenize edilir. Elde edilen homojenata 37 C de 60 dakika süre ile inkübe edilir. Reaksiyon %20 lik 0.5 ml trichloroacetic acid (TCA) eklenerek durdurulur. Tekrar kar t r l r. Tüpler 10 dakika bekletilir ve kar m filtreden geçirilir. Süzüntünün spektrofotometre cihaz nda 366 nm dalga boyundaki de eri ölçülür Asit Proteaz: Asit proteaz aktivitesi, Anson (1938) taraf ndan tan mlanan hemoglobin substrat analizi ile belirlenmi tir. Aktivite, 37 C de ve ph 2.0 derecesinde belirtilen ko ullar alt nda, spektrofotometre cihaz n n 280 nm dalga boyundaki de eri ölçülerek hesaplanm t r. Kullan lan Reaktifler 0.1 M glisin HCl tampon çözeltisi %0.5 lik hemoglobin substrat Prosedür Al nan örnekler 0.1 M glisin HCl çözeltisi ile homojenize edilir. Elde edilen homojenata 37 C de 60 dakika süre ile inkübe edilir. Reaksiyon %20 lik 0.5 ml trichloroacetic acid (TCA) eklenerek durdurulur. Tüpler 10 dakika bekletilir ve kar m filtreden geçirilir. Süzüntünün spektrofotometre cihaz nda 280 nm dalga boyundaki de eri ölçülür.

39 Protein: Her enzimin özgül spesifik aktivitesini say sal olarak tan mlamak üzere spektrofotometre cihaz ndan okunan göreceli de erlerin, homojenatta bulunan protein de eri ile oranlanmas dü ünülmü tür. Bu ba lamda, Bradford taraf ndan 1976 y l nda yap lan çal mada kullan lan Bradford yöntemi ile elde edilen protein miktar, spektrofotometre cihaz ndan okunan de er ile oranlanarak her enzimin kendine özgü spesifik aktivitesi mu/mg protein - ¹ olarak tespit edilmi tir. Bradford yönteminde substrat olarak s r serum albümini kullan lm t r. Kullan lan Reaktifler 100 mg Coomassie Blue G ml %95 ethanol 100 ml %85 (w/v) Fosforik asit Prosedür S ras yla 0, 2, 4, 6, 10, 15 ve 20 µl BSA (1 mg/ml) substrat küvetlere konulur. 100 mg Coomassie Blue G-250, 50 ml %95 ethanol içinde 100 ml %85 (w/v) fosforik asit eklenerek Bradford solüsyonu haz rlan r. 20 µl ölçümü yap lacak örnekten konulur, üzerine 40 µl Bradford solusyonu ilave edilir ve 200 µl ye kadar su eklenir. Spektrofotometre cihaz nda 595 nm dalga boyundaki de er ölçülür ve Lambert&Mill yasas gere ince oranlama yap larak spesifik enzim aktivitesi tespit edilir.

40 statistik Denemeler 3 kez tekrar edilmi ve veriler ortalaman n standart sapmas (Xort ±sd) olarak gösterilmi tir. Varyanslar aras ndaki homojenite Levene testi ile test edilmi tir. Gruplar aras ndaki farkl l klar tek yönlü varyans analizinin (ANOVA) ard ndan Tukey testi ile tespit edilmi tir (p-0.05). Ya ama oranlar aras ndaki farkl l k ise Fisher in Ki kare testi ile saptanm t r. Verilerin istatistiksel olarak de erlendirilmesinde SPSS 15.0 ve Microsoft Excel 2007 yaz l mlar ndan yararlan lm t r.

41 31 4. BULGULAR 4.1 Anaç Yönetimi ve Yumurta nkübasyonu Anaçlar, do al üreme periyodu içinde su s cakl n n C aras nda de i im gösterdi i dönemde yumurta b rakm lard r. nkübasyon süresince deniz suyu s cakl C aras nda tutulm tur. Elde edilen yumurtalar, 18.5±0.2 C de inkübe edildikten 49 saat sonra çatlam ve larvalar yumurtadan ç km t r. ekil 4.1 de, farkl safhalardaki sinarit bal yumurtalar gösterilmi tir. Yumurta çap 912.8±3.6 µm olarak ölçülmü, yumurta boyutlar aras nda istatistiki aç dan fark tespit edilmemi tir (p>0.05). Vitellüs boyu 749.7±3.8 µm, ya damlas çap ise 199.2±3.6 µm olarak ölçülmü tür. Larvalarda 1. ve 3. gündeki vitellüs ve ya damlas durumu, ekil 4.2 de gösterilmi tir. ekil 4.1 Farkl safhalardaki sinarit bal yumurtas. A ekil 4.2 Larvalarda vitellüs ve ya damlas durumu. A: 1. gün, B: 3. gün. B

42 32 Larval üretim süresince ph aras nda de i mi tir. Nitrit, nitrat, amonyum ve amonyak gibi azotlu bile ikler letal dozun alt nda tespit edilmi tir (NH + 4: > mg/l, NO - 2: > mg/l NO - 3: > mg/l). 4.2 Larval Geli im Larvalar n geli im verileri incelendi inde; denemenin sona erdi i 40. günde total boy 19.83±2.6 mm, a rl k 42.12±4.3 mg, spesifik büyüme oran 9.35±1.9 %/gün ve ya ama oran da %18.6±3.7 olarak tespit edilmi tir. Larvalarda gözlenen total boy-a rl k geli imi, ekil 4.3 te gösterilmi tir. 25 Total boy (mm) 60 Total boy(mm) A rl k (mg) A rl k (mg) Günler ekil 4.3 Deneme süresince larvalarda gözlenen total boy-a rl k de i imi. Sinarit larvalar, total boy geli imi aç s ndan ilk 15 günlük süreçte yava seyreden bir art göstermi tir. Bu günden sonra, denemenin sona erdi i 40. güne kadar daha h zl bir total boy geli imi izlenmi tir.

43 33 Larvalarda izlenen a rl k geli imi ise 10. günden sonra h zl bir art e ilimine girmi tir. Bu h zl art grafi inin deneme sonuna kadar ayn h zda seyretti i tespit edilmi tir. ekiller 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 ve 4.10 da s ras ile 2, 5, 10, 15, 20, 30 ve 40 günlük sinarit larvalar gösterilmi tir. Denemenin 14. gününde tanktaki su giri ve ç k bölgelerinden al nan 50 larva örne inden 48 inde fonksiyonel hava kesesinin olu tu u görülmü ve hava kesesi olu um oran %96 olarak hesaplanm t r.

44 34 ekil günlük sinarit larvas. ekil günlük sinarit larvas. ekil günlük sinarit larvas. ekil günlük sinarit larvas. ekil günlük sinarit larvas. ekil günlük sinarit larvas. ekil günlük sinarit larvas.

45 Enzim Aktiviteleri Alkalin Proteaz Larval dönemde, daha çok alkali ortamlarda (ph ) sindirim aktivitesine kat lan proteaz grubu enzimlere (tripsin, kimotripsin, elastaz, peptidaz) ait spesifik aktivite, 3. günde tespit edilen a z aç l m ve eksojen besin al m ile birlikte art göstermi, ard ndan aktivitede 10. güne kadar yava bir azalma e ilimi tespit edilmi tir. Bu günden sonra, 20. günde, h zl bir art n ard ndan tekrar h zl bir azalma gözlenmi tir. Mikropartikül toz yem giri i ile birlikte aktivitede yeniden art izlenmi tir. Deneme süresince larvalarda gözlenen alkalin proteaz aktivitesindeki de i imler, ekil 4.11 de gösterilmi tir. 120 Spesifik aktivite 0,1 Spesifik aktivite (mu/mg prot) Total aktivite 0,08 0,06 0,04 0,02 Total aktivite (mu/larva) ekil 4.11 Deneme süresince larvalarda gözlenen alkalin proteaz aktivitesindeki de i imler.