T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KEFİR DANESİNDEN ÜRETİLEN KEFİR TÜKETİMİNİN ANNE SÜTÜNDEKİ PROBİYOTİK MİKROORGANİZMALARA ETKİSİ Rabia Tuğçe TUNAY Danışman Doç. Dr. Tuğba KÖK TAŞ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ISPARTA

2 2018 [Rabia Tuğçe TUNAY]

3

4

5 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... i ÖZET... ii ABSTRACT... iv TEŞEKKÜR... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... viii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Anne Sütü Anne sütünün bileşimi Anne sütü mikrobiyal içeriği Anne sütünün bileşimini etkileyen faktörler Anne Sütü İle İlgili Araştırmalar Kefir Kefir danesi Kefir aanesi ve kefirin mikrobiyolojik özellikleri MATERYAL VE YÖNTEM Kefir Temini Anne Sütlerinin Temini ve Muhafazası Etik Kurul Onayı Kimyasal Analizler Mikrobiyolojik Analizler Standart Kültürlerin Hazırlanması DNA İzolasyonu Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin DNA izolasyonu Standart kültürlerin DNA izolasyonu Anne sütlerinin DNA izolasyonu Real-Time PCR Analizi Primer seçimi Real-Time PCR koşullarının optimizayonu İstatistiksel Analizler ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Kimyasal Analiz Sonuçları Anne Sütü Mikrobiyolojik Analiz Sonuçları DNA İzolasyon Sonuçları Real-Time PCR Analiz Sonuçları SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR EKLER EK A. Etik Kurul Kararı EK B. Örnek Onam ÖZGEÇMİŞ i

6 ÖZET Yüksek Lisans Tezi KEFİR DANESİNDEN ÜRETİLEN KEFİR TÜKETİMİNİN ANNE SÜTÜNDEKİ PROBİYOTİK MİKROORGANİZMALARA ETKİSİ Rabia Tuğçe TUNAY Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Tuğba KÖK TAŞ Anne sütü; yenidoğanların büyümesi ve gelişmesi için gerekli olan tüm sıvı, enerji ve besin ögelerini içeren, biyoyararlılığı yüksek, sindirimi kolay doğal bir besindir. Anne sütü, bebeğin ilk 6 ay ihtiyacı olan karbonhidrat, yağ, protein, vitamin ve mineraller gibi temel besin maddelerini tek başına karşılayabilmektedir. Anne sütü bileşimi ve miktarı; doğum şekli, psikolojik stres, hormonal değişimler ve beslenme şeklinden etkilenmektedir. Anne sütü bileşiminin değişimi mikrobiyal bileşimi de etkilemektedir. Kefir, kefir danesinden üretilen probiyotik mikroorganizalar bakımından zengin fermente bir süt ürünüdür. Yapılan çalışmalar anne sütünün, annenin beslenmesi ile doğrudan ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada, kefir danesine özgü bazı probiyotik bakterilerin ve yararlı diğer bakterilerin kefirle beslenen annelerin sütlerine geçişi kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qpcr) ile kalitatif ve kantitatif olarak araştırılmıştır. Çalışmaya yeni doğum yapan sağlıklı 15 gönüllü anne katılmıştır. Gönüllü 10 anne; 30 gün boyunca 500 ml/gün normal beslenmelerinin yanı sıra kefirle beslenmiş, gönüllü 5 anne ise kontrol grubu olarak normal beslenmelerine devam etmişlerdir. Tüm annelerden 10., 20. ve 30. günlerde sütleri alınarak kimyasal bileşenleri, mikrobiyolojik içerikleri ve moleküler tekniklerle mikrobiyotaları incelenmiştir. Anne sütleri ve annelerin tüketimine sunulan kefirlerin moleküler tekniklerle mikrobiotalarının belirlenmesi için DNA izolasyonları yapılmış, kefirdeki yararlı probiyotik bakterilerin seçici primerleri kullanılarak optimizasyon çalışmaları gerçekleştirilerek Real-Time PCR ile kalitatif ve kantitatif olarak analiz edilmiştir. Kimyasal bileşenlerde, anne sütlerinin yağ oranları %3,5-4,0; kuru maddeleri %9,3-10; yoğunlukları %31,8-34,1; protein miktarları %3,4-3,6; laktoz miktarları %4,9-5,4; tuz miktarları %0,7-0,8 arasında bulunmuştur. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Lactobacillus spp. içerikleri karşılaştırıldığında; 10. gün örneklerinde kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Lactobacillus spp. içeriği kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinden yüksek iken, 20. gün ve 30. gün süt örneklerinde kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Lactobacillus spp. içeriği istatistiksel olarak yüksek bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin ii

7 kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinden Streptococcus spp., Lactobacillus acidophilus ve Bifidobacterium spp. içeriği açısından yüksek bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin L. kefiranofaciens içerikleri 10. gün, 2,05 log kob/ml; 20. gün, 2,03 log kob/ml; 30. gün, 2,27 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinde L. kefiri tespit edilememiştir. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinde L. kefiri içerikleri 10. gün, 2,11 log kob/ml; 20. gün, 1,72 log kob/ml; 30. gün, 1,64 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin L. parakefiri içerikleri 10. gün, 5,28 log kob/ml; 20. gün, 5,03 log kob/ml; 30. gün, 4,94 log kob/ml olarak bulunmuştur. Ayrıca bu tez çalışmasında kefirde bulunan probiyotik özellikli L. acidophilus, L. casei, L. helveticus, L. bulgaricus ve B. bifidum bakterilerinin kefir tüketimi ile günlere göre değişimleri değerlendirilmiştir. Tüm bu bakteriler tür düzeyinde anne sütü doğasında da olduğu bu tez çalışmasında ilk kez bulunmuştur. Sonuç olarak, annelerin beslenmesine ek olarak probiyotik mikroorganizmalarca zengin içeriğe sahip olan kefirin dahil edilmesinin, tüm mikroorganizma profilini arttırdığı sonucuna varılmıştır. Normalde anne sütünde bulunmayan, doğal kefir danesinden üretilen kefire özgü probiyotik mikroorganizmalardan L. kefiranofaciens, L. kefiri ve L. parakefiri nin kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerine transfer edildiği tespit edilmiştir. Özellikle bağışıklık ve sindirim sistemi üzerine olumlu etkileri olduğu bilinen, probiyotik mikroorganizmalarca zengin bir besin olan kefirin tüketilmesiyle anne sütünün probiyotik mikroorganizma içeriğinin zenginleştiği belirlenmiştir. Bu geçişin daha net belirlenmesi için anne gaitası, bebek gaitası ve anne sütünde yapılan klinik çalışmaların artırılması faydalı olacaktır. Anahtar Kelimeler: anne sütü, kefir, probiyotik mikroorganizma, qpcr, mikrobiyota 2018, 89 iii

8 ABSTRACT M.Sc. Thesis EFFECT OF CONSUMPTION OF KEFIR PRODUCED WITH KEFIR GRAIN ON PROBIOTIC MICROORGANISMS OF HUMAN MILK Rabia Tuğçe TUNAY Süleyman Demirel University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Tuğba KÖK TAŞ Human milk is a natural, an easy-to-digest food with high-bioavailability that contains all the liquid, energy and nutritional elements required for the infant growth and development. Breastmilk alone can meet basic nutrients such as carbohydrates, fat, protein, vitamins and minerals that babies need for the first 6 months. Breast milk composition and quantity are affected by the baby delivery method, psychological stress, hormonal changes and the way of nutrition. A change in the composition of breast milk may also affect the microbial composition. Kefir is a fermented milk product rich in probiotic microorganisms produced from kefir bacteria. Studies show that breast milk is directly associated with the mother's nutritional intake. In this study, the transition of some probiotic bacteria and other useful bacteria specific to kefir yeast to the human milk who consume kefir were investigated quantitatively and quantitatively by quantitative polymerase chain reaction (qpcr). 15 healthy volunteer mothers who were newly given birth participated in the study. Ten volunteer mothers were fed with kefir as well as normal feedings for 500 ml/day during 30 days, while 5 volunteers continued to eat normally as a control group. The presence of viable microbial contents and chemical components in human milk was also evaluated, and Real Time PCR revealed a large diversity of the human milk microbiota on the 10th, 20th and 30th days. In order to determine the microbiota of breast milk and the kefir which is presented to the consumption of mothers using molecular techniques, DNA isolations were made, and qualitative and quantitative analyses were carried out by real-time PCR by performing optimization studies using selective primers of probiotic bacteria in kefir. In chemical components, the fat ratios of human milk were specified as %; dry matter as 9,3-10%; densities as %; protein contents as %; lactose amounts %; the amount of salt as between %. When Lactobacillus spp. contents of milk of mothers who consume kefir and are in control groups were compared; Lactobacillus spp. content of the milk samples of the control mothers in the 10th day samples was higher than that of the mothers in the kefir consuming group whereas milk samples of the mothers in the kefir iv

9 consuming group of 20th and 30th days were determined to contain statistically higher Lactobacillus spp. content than others. The milk samples of the mothers of the kefir consuming group were determined to be higher in terms of Streptococcus spp., Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. contents compared to the milk samples of the control mothers. L. kefiranofaciens contents of milk samples of the mothers of the kefir consuming group were specified as 2,05 log cfu/ml on day 10; on the 20. day, 2.03 log cfu/ml; on day 30, it was determined to be 2,27 log cfu/ml. In the milk samples of the control group's mothers L. kefir could not be detected. L. kefir contents in milk samples of mothers consuming kefir were determined 2,11 log cfu/ml on 10. day; 1.72 log cfu/ml on 20. day; 1.64 log cfu/ml on 30. day. L. parakefiri contents of the milk samples of the mothers of the kefir consuming group were 5.28 log cfu/ml on 10th day; 5.03 log cfu/ml on 20th day; and 4.94 log cfu/ml on 30th day. In addition, in this thesis study, daily changes of probiotic bacteria L. acidophilus, L. casei, L. helveticus, L. bulgaricus and B. bifidum in kefir were evaluated according to daily consumption of kefir. It has been discovered for the first time in this thesis that all these bacteria exist also in the nature of breast milk at the species level. As a result, the inclusion of kefir, which has a rich content of probiotic microorganisms, as a supplement to the nutrition of mothers, has resulted in an increase in the entire microorganism profile. It has been determined that L. kefiranofaciens L. kefir, and L. parakefiri, which are not normally found in human milk and are kefir specific probiotic microorganisms produced from natural kefir yeast, are transferred to the breast milk of kefir consuming group. It was determined that consumption of kefir, which is rich in probiotic microorganisms and known to have positive effects on the immune and digestive system in particular, enrich the breast milk in terms of probiotic microorganisms content. It would be beneficial to increase the number of clinical studies carried out on the maternal stools, baby stools, and human milk for a more certain determination of this transfer. Keywords: human milk, kefir, probiotic microorganisms, qpcr, microbiota 2018, 89 pages v

10 TEŞEKKÜR Tez çalışmam süresince bilgisini ve desteğini esirgemeyen, her konuda yanımda olan, gönüllü anne bulabilmek adına benimle birlikte mücadele eden danışman hocam Doç. Dr. Tuğba KÖK TAŞ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarımı devam ettirebilmem için desteklerini esirgemeyen, güleryüzleriyle motivasyonumu arttıran sayın hocalarım Prof. Dr. Zeynep Banu GÜZEL-SEYDİM, Prof. Dr. Atıf Can SEYDİM, Doç. Dr. Havva Nilgün BUDAK a, ayrıca çalışmama gönüllü anne olarak da katılan bölümümüz araştırma görevlilerinden Yrd. Doç. Dr. Bilge FİLİZ ERTEKİN e teşekkür ederim. Çalışmamın moleküler tanımlama kısımlarında Real-Time PCR analizlerini yapabilmem için gerekli olan cihazları ve sarf malzemelerini temin ederek Ar-Ge laboratuvarlarını açan, araştırmam süresince burs imkanı sağlayan, gönüllü annelere ücretsiz kefir temini sağlayarak çalışmama finansal yönden destek veren Danem Şirketi ne ve tüm şirket personeline teşekkürlerimi sunarım. Laboratuvar çalışmalarım süresince desteklerini ve yardımlarını esirgemeyen meslektaşlarımdan doktora çalışmalarına devam eden Seda ÖZARSLAN ve Duygu ALP e, yüksek lisans çalışmalarına devam eden Sevgi ATILGAN, Merve ÖZEN ve Rahime ÖZDEMİR e, Dr. Didem KANKAYA ya teşekkür ederim. Tez çalışmam süresince beni yüreklendiren, her zaman yanımda olduklarını hissettiren sevgili annem İsmahan TUNAY a, babam H. Ahmet TUNAY a, abim Altunay TUNAY a ve sevgili eşi Merve GÜVENBAŞ TUNAY a teşekkür ederim. Tez çalışmam süresince yanlarında kaldığım teyzem Havva AVANOĞLU, eniştem Eşref AVANOĞLU ve kuzenlerime teşekkür ederim. Çalışmama gönüllü olarak katılan bebekleri için en değerli ve mucizevi besinin bir miktarını bilime katkı sağlamak adına bizimle paylaşan, örnek almaya gittiğimde her daim beni güler yüzle karşılayan, kıymetli annelere teşekkür ederim YL2-16 No lu proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na teşekkür ederim. Rabia Tuğçe TUNAY ISPARTA, 2018 vi

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Kefir danesi dış görünüşü Şekil 3.1. Ultrasonik Milk Analyzer Şekil 3.2. Kültürlerin aktifleştirilme aşamaları Şekil 3.3. Aktifleştirilen kültürlerin ekim sonucu elde edilen kolonileri Şekil 4.1. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Lactobacillus spp. içeriği Şekil 4.2. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Streptococcus spp. içeriği Şekil 4.3. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Lactobacillus acidophilus içeriği Şekil 4.4. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Bifidobacterium spp. içeriği Şekil 4.5. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Enterococcus spp. içeriği Şekil 4.6. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin toplam mezofilik mikroorganizma içeriği Şekil 4.7. Lactobacillus kefiranofaciens e ait standart kurve Şekil 4.8. Lactobacillus parakefiri ye ait standart kurve Şekil 4.9. Lactobacillus kefiri ye ait standart kurve Şekil Kefir tüken grubundaki annelerin sütlerinin L. kefiranofaciens, L. kefiri ve L. parakefiri içeriği Şekil Lactobacillus acidophilus a ait standart kurve Şekil Lactobacillus casei ye ait standart kurve Şekil Lactobacillus bulgaricus a ait standart kurve Şekil Lactobacillus helveticus a ait standart kurve Şekil Bifidobacterium bifidum a ait standart kurve Şekil Streptococcus thermophilus a ait standart kurve Şekil Lactobacillus spp. ye ait standart kurve Şekil Streptococcus spp. ye ait standart kurve Şekil Bifidobacterium spp. ye ait standart kurve Şekil Kefir tüketen anne grubuna ait süt örneklerinin mikrobiyotası Şekil Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin mikrobiyotası Şekil A.1. Etik kurul kararı Şekil B.1. Örnek onam vii

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Anne sütü ve inek sütünün içerikleri... 5 Çizelge 2.2. Anne sütü mikrobiyal içeriği... 7 Çizelge 2.3. Farklı kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan standart kültürler Çizelge 3.2. Kültürlerin gelişme koşulları Çizelge 3.3. Primerlerin özellikleri Çizelge 3.4. Bileşen miktarları ve çalışma koşulları Çizelge 4.1. Anne sütlerinin kimyasal kompozisyonları Çizelge 4.2. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus kefiranofaciens içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.3. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus parakefiri içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.4. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus kefiri içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.5. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus acidophilus içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.6. Annelerin tüketimine sunulan kefirin ve anne sütlerinin Lactobacillus casei içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.7. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus bulgaricus içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.8. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus helveticus içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.9. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Bifidobacterium bifidum içerikleri ve Cq değerleri Çizelge Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Streptococcus thermophilus içerikleri ve Cq değerleri Çizelge Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus spp. içerikleri ve Cq değerleri Çizelge Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Streptococcus spp. içerikleri ve Cq değerleri Çizelge Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Bifidobacterium spp. içerikleri ve Cq değerleri viii

13 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ATCC American Type Culture Collections B Bifidobacterium BMI Body Mass İndex (Vücut Kitle İndeksi) C Candida CFU Colony-formıng unit DNA Deoksiribonükleik Asit DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen E Enterococcus EDTA Etilen Diamin Tetra Asetik Asit EPS Ekzopolisakkarit g (RCF) Gravite (Relative Centrifugal Force) Ig İmmünoglobulin IgA İmmünglobulin A IgG İmmünglobulin G IgM İmmünglobulin M K Kluyveromyces KOB Koloni Oluşturma Birimi L Litre L Lactobacillus LAB Laktik asit bakterileri Lc Lactococcus Leuc Leuconostoc MAC MacConkey Agar µl Mikrolitre mg Miligram MRS De Man, Rogosa and Sharpe NK Natural Killer PBS Fosfat Tamponlu Salin PCA Plate Count Agar PCR Polimerase Chain Reaction(Polimeraz Zincir Reaksiyonu) PDA Potato Dextrose Agar ph Power of Hydrogen PK Proteinaz K Prop Propionibacterium RAPD Random Amplified Polymorphic Real-Time PCR Gerçek Zamanlı PCR RNA Ribonükleik Asit rpm Rounds Per Minute (dakikadaki devir sayısı) S Saccharomyces Str Streptococcus Th T helper UNICEF Birleşmiş Milletler Çocuklara Yardım Fonu WHO Dünya Sağlık Örgütü ix

14 1. GİRİŞ Anne sütü, bebekler için optimal beslenmenin yanısıra, temel besinler ve geniş bir biyoaktif bileşen yelpazesi, zengin mikroorganizma içeriğiyle oluşmaktadır. Bununla birlikte, bu bileşenler arasındaki etkileşim ve süt mikroorganizmalarının biyolojik rolü hala netlik kazanmamıştır (Boix-Amorós vd., 2016). Bazı çalışmalarda amniyotik sıvıda bazı mikroorganizmaların saptanmasına rağmen bebeklerin doğumda steril olduğuna inanılmaktadır (Markowitz ve Bengmark, 2002). Doğumla birlikte bağırsaklardaki mikroorganizma sayısı artmaya başlamakta, bebeğin ilk gaitasında mikroorganizmalar tespit edilmekte, ikinci günden itibaren ise Bifidobakterler, Clostridium ve Bacteriodes eklenek birinci haftanın sonunda 10 9 log kob/g koloni mikroorganizma miktarına ulaşılmaktadır. İlk haftada aerobik mikroorganizmalar floraya hakimken daha sonra anaerobik mikroorganizma hakimiyeti artmaktadır. Doğumdan sonraki ilk iki yılda intestinal mikrobiyota değişmekte, iki yaşından sonra erişkin tip floraya dönüşmeye başlamaktadır (Floch ve Montrose, 2005; Ötles, Çağındı ve Akçiçek, 2003). Annenin mikrobiyotası, gestasyonel yaşı, doğum şekli, doğumun gerçekleştiği yer, bebeğin beslenme şekli, annenin beslenme tarzı, antibiyotik kullanıp kullanmaması gibi faktörler bebeğin intestinal mikrobiyotasını etkilemektedir (Floch ve Montrose, 2005; Isolauri, 2004; Ötles, Çağındı ve Akçiçek, 2003). Vajinal yolla doğan, mama veya anne sütü ile beslenen bebeklerin mikroflorası 48. saate kadar benzerlik göstermektedir. Yedinci güne doğru mama ile beslenen bebeklerin 2/3 nde Bacteriodes fragilis hakim olurken anne sütüyle beslenen bebeklerde bu oran %22 yi bulmaktadır (Floch ve Montrose, 2005). Anne sütü, yenidoğan bağırsak mikroflorasının başlangıcı, gelişimi ve kompozisyonunda önemli bir faktördür. Bu biyolojik sıvıdan yaygın olarak izole edilen bakteriler, sadece kontaminant bakterilerden ziyade anne sütünün doğal mikroflorası olarak düşünülmesi gereken stafilokok, streptokok, mikrokoklar, 1

15 laktobasil ve enterokoklardır. Bu bakteriyel gruplar, bakteriyoterapötik veya probiyotik ajanlar olarak kullanılma potansiyeli olan suşları içermektedir. Probiyotiklerin klinik etkilere nasıl aracılık ettiğinin çözülmesi gerekmektedir. Mikroorganizmaların anneden bebeğe geçişi evrimsel olarak korunmuş bir olgudur ve ortaya çıkan kanıtlar bakteriyel transferin insanlarda uteroda başladığını göstermektedir. Anne sütünde bulunan bakterilerin kökeni tartışılmakta ve bazı türlerin anne bağırsağından meme bezine geçtiği öne sürülmektedir (Martin vd., 2003; Funkhouser ve Bordenstein, 2013; West vd., 2015). Probiyotik yalnızca anneye verildiğinde, probiyotiğin anneden fetüse veya anneden bebeğine anne sütü ile aktarıldığı teoridir. Bugüne kadar, anne probiyotik alımının bağırsak mikroorganizma kompozisyonu ve çeşitliliği üzerindeki etkisini; tüketilen probiyotiğin çocuk gaitasında da bulunup bulunmadığını inceleyen az sayıda çalışma bulunmaktadır Bu hipotez doğrulanırsa, annelerin bağırsak mikroflorasının modülasyonunun, bebeklerin sağlığı üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olabileceği ve bu nedenle bakteriyoterapi ve probiyotikler için yeni perspektifler açabileceği anlamına gelmektedir (Ismail vd., 2012). Anne sütü, beyin gelişimi icin gerekli olan tüm besin ögelerini içerdiğinden nörolojik fonksiyonların mükemmel ve hızlı gelişimini de sağlamaktadır. Anne sütünün yapısındaki çoklu doymamış yağ asitleri (özellikle DHA ve AA) nörolojik gelişimi için son derece önemlidir. Beynin %60 ı lipitlerden oluşmuştur. Beyin yapısını oluşturan en önemli lipit bileşenleri DHA ve AA dır. Sanders ve Naismith (1979), yaptıkları bir calışmada anne sütüyle beslenen bebeklerin kan DHA konsantrasyonlarının mamayla beslenenlere göre daha yüksek olduğunu saptarken, Makrides vd., (1995), yaptıkları çalışmada, anne sütü alma süresinin uzamasıyla beyin korteksi DHA içeriğinin önemli düzeyde arttığı sonucuna varmışlardır. Yapılan diğer çalışmalar da anne sütünde bulunan besin ögelerinin normal zamanda doğan ve erken doğan bebeklerin nörolojik gelişimleri üzerinde önemli etkilere sahip olduğu sonucunu doğrulamaktadır (Anderson, Johnstone ve Remly, 1999). 2

16 Annelerin kendi sütleri, neredeyse tüm bebekler için en iyi beslenme kaynağıdır. Somatik büyümenin ötesinde, biyolojik bir sıvı olarak anne sütünün, postnatal bağırsak fonksiyonunun modülasyonu, immün ontogenezi ve beyin gelişimi de dahil olmak üzere çeşitli başka faydaları da bulunmaktadır (Martin vd., 2016). Bu çalışmanın amacı; doğal kefir danesi kullanılarak üretilen kefirle beslenmenin anne sütünün probiyotik mikroorganizmalarına etkisini araştırmak ve kefire özgü probiyotik mikroorganizmaların anne sütüne geçişini incelemektir. 3

17 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Anne Sütü Anne sütü büyümekte olan bebeğe mükemmel bir besin kaynağı olmasının yanında büyüme faktörleri, antikorlar, sitokinler, antimikrobiyal maddeler ve özgün bağışıklık hücreleri de içeren yaşayan, canlı ve bebeğe göre değişen bir gıdadır. Anne sütü, bebeğin bağışıklık sistemi olgunlaşana kadar, enfeksiyonlardan bebeği korur (Paramasium vd., 2006). Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Birleşmiş Milletler Çocuklara Yardım Fonu (UNICEF) bebeklerin ilk 6 ay sadece anne sütü almalarını, 6 aydan sonra 2 yaşına kadar da ek gıdayla birlikte anne sütüne devam etmelerini önermektedir (Kramer ve Kakuna, 2001). Anne sütü bağırsak, solunum sistemi ve idrar yolu enfeksiyonlarına karşı birincil koruma yaparken, yenidoğan bebeğin bağışıklık sisteminin gelişimini de artırmaktadır. Anne sütü proteinlerinin bir kısmı (serum proteinleri) bağışıklık sisteminin gelişiminde rol oynamakta, diğer bir kısmı da (laktoferrin) immünolojik olmayan savunma sistemlerinde görev almaktadır. Ayrıca memelilerin sütündeki düşük miktarlardaki oligosakkaritler (prebiyotik), epitel yüzeylere bakteri yapışmasını engelleyerek yenidoğan döneminde bebeklerin enfeksiyonlardan korunmasında görev almaktadır. Yenidoğan bebeklerin idrarlarında saptanan oligosakkaritlerin bebeği idrar yolu enfeksiyonlarından koruduğu düşünülmektedir (Köksal vd., 2005). Ayrıca anne sütünde bulunan prebiyotikler bağırsakta Lactobacillus spp. ve Bifidobacterium spp. gibi faydalı bakterilerin gelişimini desteklemekte ve bağırsak ph değerini düşürerek patojen bakterilerin gelişimini engellemektedir. Anne sütünün üstün özellikleri; antiviral özellikleri (laktoferrin, yağ sindirim ürünleri), bakterisidal aktivitesi (laktoferrin, lizozim), antiprotozoal aktivitesi (anne sütü yağının mide ve barsaklarda sindirimi) ve bağlanmayı engelleme özelliği (kappa kazein yardımı ile Helicobacter pylori nin mide mukozasına yapışmasını engelleme) ve IgA, IgG ve IgM içermesi olarak sayılabilmektedir. Anne sütündeki çesitli enzimler de bakterisidal etkinlik gösteren bileşikler oluşturarak (safra tuzu bağımlı lipaz, peroksidaz), inflamatuvar yanıtları engelleyerek (trombosit aktive edici asetil 4

18 hidrolaz) veya süt proteinlerinin bütünlüğünü koruyarak (antiproteaz) bağısıklık sistemini güçlendirmektedir (Gür, 2007) Anne sütünün bileşimi Anne sütü içinde çok sayıda bileşen bulunduran biyolojik olarak aktif bir sıvıdır. Başlıca sıvı faz %87, kazein moleküllerinin bulunduğu kolloid faz (%3), yağ globülleri (%4), yağ globül membranları ve canlı hücrelerden oluşmaktadır. Anne sütü ve inek sütü içeriklerinin karşılaştırılması Çizelge 2.1 de gösterilmiştir. Çizelge 2.1. Anne sütü ve inek sütünün içerikleri (100 ml) (Thomas, 1994) Anne Sütü İnek Sütü Enerji (kcal) Protein (g) 0,9 3,4 Kazein/Serum Proteini 40/60 80/20 Beta-laktoglobulin (g) Yok 0,57 Lizozim (g) 0,08 Eser İmmunoglobulin A (g) 0,16 0,005 İmmunoglobulin G (g) 0,005 0,096 İmmunoglobulin M (g) 0,003 0,005 Yağ (g) 4,1 3,9 Esansiyel yağ asitleri (linoleik/linolenik) 5/1 1/1 Karbonhidrat (g) 7,2 4,6 Kalsiyum (mg) Fosfor (mg) Kalsiyum/Fosfor 2,3/1 1,3/1 Sodyum (mg) Potasyum (mg) Klor (mg) Demir (mikrogram) Böbrek solüt yükü (mosm/l) Anne sütü mikrobiyal içeriği Anne sütü, bebekler için optimal beslenmenin yanında onların bağırsak florası içinde bakteri kaynağı olarak gösterilmektedir. Anne sütü mikrobiyotası farklı annelerin sütlerinde değişkenlik gösterdiği gibi aynı annelerin sütünde laktasyon süresince de değişkenlik göstermektedir. 5

19 Collado vd., (2009) 50 anne sütü örneğinden (qrti-pcr) kullanarak yaptıkları çalışmada Staphylococcus, Streptococcus, Bifidobacterium ve Lactobacillus baskın gruplar olduğunu ve tüm örneklerde tespit etmişlerdir. Bacteroides ve Clostridium küme IV gruplarının aksine, örneklerin çoğunda Clostridium XIVa XIVb ve Enterococcus tespit etmişlerdir. Zacarias vd., (2011) anne sütünden Bifidobacterium animalis subsp. lactis in farklı suşlarını izole etmişlerdir. Cabrera-Rubio vd. (2012) anne sütünde kantitatif polimera zincir reaksiyonu kullanarak yaptıkları çalışmada kolostrum örneklerinde Weisella spp., Leuconostoc spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. ve Lactococcus spp. baskın olduğunu, 1 ve 6. ay süt örneklerinde ise Veillonella spp., Leptotrichia spp. ve Prevotella spp. nin önemli ölçüde arttığını gözlemlemişlerdir. Mehanna vd., (2013) anne sütü mikrobiyotasını gözlemlemek için qpcr ile yaptıkları çalışmada, Laktik asit kokları arasında Enterococcus facium (3 suşu) un baskın olduğu ve bunu Lactococcus lactis (2 suş) izlediği; Laktobasiller arasında ise L. plantarum ve L. rhamonusus (her biri için 4 suş) en yaygın tür olduğu, onu L. casei ve L. fermentum (her biri için 2 suş) ve daha sonra da L. acidophilus (1 suş) un izolatlarının izlediği sonucuna varmışlardır. LaTuga vd. (2014) yaptıkları çalışmada 32 anne sütünü incelemişler ve yaygın olarak Stafilokok, Streptokok, Veillonella, Gemella, Enterokok, Clostridia, Bifidobakteri, Laktobasil, Propioni bakteri, Actinomyces, Corynebacterium, Pseudomonas, Sphingomonas, Serratia, Escherichia, Enterobakter, Ralstonia, Bradyrhizobium ve Prevotella bakterilerinin bulunduğunu tespit etmişlerdir. Boix-Amorós vd., (2016) yaptıkları araştırmada anne sütü mikrobiyotasında baskın olan mikroorganizmaları; Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp. ve Acinetobacter spp. olarak bulmuştur. 6

20 Sallam vd., (2016) çalışmalarında anne sütünden elde ettikleri Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp. ve Bifidobacterium spp. cinslerine ait 415 izolat arasında probiyotik bakteri aranması amaçlamışlardır. Anne sütünden bakteriyel izolasyon ve DNA izolasyonuyla elde edilen mikroorganizmalar Çizelge 2.2. de gösterilmiştir. Çizelge 2.2. Anne sütü mikrobiyal içeriği (Fernandez vd., 2013) Metod Mikroorganizma Türleri Referans L. acidophilus Gavin ve Ostovar, 1977 L. fermentum S. epidermidis S. mitis S. salivarius L. plantarum West vd., 1979 S. epidermidis Streptococcus spp. E. faecium Martin vd., 2003 L. fermentum L. gasseri E. faecalis Heikilla ve Saris, 2003; L. rhamnosus Beasley ve Saris, 2004 Lc. lactis Leuc. mesenteroides S. aureus S. capitis S. epidermidis Str. parasanguis Str. salivarius L. salivarius Martin vd., 2006 Corynebacterium spp. Langa vd., 2012 Enterococcus spp. Lactobacillus spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. L. reuteri Sinkiewicz vd., 2008 Bakteriyel izolasyon 7

21 Çizelge 2.2. Anne sütü mikrobiyal içeriği (Fernandez vd., 2013) Bakteriyel İzolasyon DNA İzolasyonu S. epidermidis Jimenez vd., 2008a; Jimenez vd., 2008b B. adolescentis Martin vd., 2009 B. bifidum B. breve B. breve Martin vd., 2011; B. longum Martin vd., 2012 L. casei L. fermentum L. gasseri L. plantarum L. reuteri L. salivarius S. aureus S. epidermidis Str. lactarius Str. mitis Str. parasanguis Str. Salivarius E. durans Albesharat vd., 2011 E. faecalis E. faecium E. hirae L. animalis L. brevis L. fermentum L. gasseri L. helveticus B. longum Makino vd., 2011 E. faecalis E. faecium L. fermentum L. gasseri L. rhamnosus Lc. lactis Leuc. citreum Prop. acnes S. epidermidis Str. Salivarius B. longum Clostridium spp. Lactobacillus spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Martin vd., 2007a; Martin vd., 2007b Perez vd.,

22 Çizelge 2.2. Anne sütü mikrobiyal içeriği (Fernandez vd., 2013) DNA İzolasyonu B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. catenolatum B. longum Bifidobacterium spp. Clostridium spp. Enterococcus spp. Lactobacillus spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. B. adolescentis B. bifidum B. breve B. longum Bradyrhizobiaceae spp. Corynebacterium spp. Propionibacterium spp. Pseudomonas spp. Ralstonia spp. Serratia spp. Sphingomonas spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Gueimonde vd., 2007 Collado vd., 2009 Martin vd., 2009 Hunt vd., Anne sütünün bileşimini etkileyen faktörler Anne sütünün içeriği doğumdan sonra bebeğin gereksinimlerine göre değişikliler göstermektedir. Zamanından önce doğum yapan annelerin sütleri ile zamanında doğum yapan annelerin sütleri birbirinden farklı olmaktadır (Atıcı vd., 1996; Yılmaz vd., 1996). Bebek büyüdükçe artan ve değişen gereksinimlerini karşılayabilmek için anne sütünün içeriği de değişmektedir (Kunz vd., 1999). Anne sütünün içeriği, diğer memelilerde olduğu gibi emzirme evresine göre de değişenlik göstermektedir. Emzirmenin başlangıcında ilk gelen süt sıvı ve elektrolitler yönünden zengin iken, emzirmenin sonuna doğru gelen süt yağ bakımından zengin olmaktadır. 9

23 2.2. Anne Sütü İle İlgili Araştırmalar Anne sütü; beslenmenin de ötesinde mikroorganizmalar, oligosakkaritler ve bebek sağlığında önemli rol oynayan çeşitli biyoaktif bileşikler içermektedir. Yeni teknikler, süt mikrobiyota bileşimi konusundaki anlayışı arttırmaktadır, ancak biyoaktif bileşiklerin aktivitesi ve bebeklerde biyolojik rolleri hakkında çok az veri bulunmaktadır. Anne sütü mikrobiyomu; anne sağlığı ve beslenme, genetik doğum şekli, emzirme, laktasyon evresi ve coğrafi konum dahil olmak üzere spesifik faktörlerden etkilenebilirken, bu faktörlerin bebek mikrobiyomuna etkisi henüz bilinmemektedir (Gomez-Gallego vd., 2016). Martin vd., (2003) yaptıkları çalışmada anne sütünün, potansiyel probiyotik olan laktik asit bakterilerini içerip içermediğini ve simbiyotik bir gıda olarak kabul edilip edilemeyeceğini araştırmak amacıyla; sekiz sağlıklı annenin sütünden, meme areolasından, göğüs derisinden, kendi annelerinin sütüyle beslenen bebeklerin gaitalarından ve annelerin gaitalarından laktik asit bakterilerini izole etmişlerdir. Kültüre bağlı olarak, bazı izolatlar (her anne ve yenidoğan çiftinden 178) rastgele seçmiş ve rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA (RAPD) polimeraz zincir reaksiyonu analizine tabi tutulmuşlardır ve aynı RAPD modellerini gösterenleri 16S rdna dizilemesi ile tanımlamışlardır. Her anne ve yenidoğan çiftinde; memeli areolasından, anne sütünden, bebek oral swablarından ve gaitalarından izole edilen bazı çubuk şekilli laktik asit bakterilerinin aynı RAPD profilleri sergilediğini gözlemlemişlerdir. Benzer şekilde, bu farklı kaynaklardan izole edilen kok şekilli laktik asit bakterileri arasında, bazıları aynı RAPD modeli paylaşmış ve bu kok şekilli laktik asit bakterileri Enterococcus faecium olarak tanımlanmıştır. Buna karşılık, meme derisinden izole edilen laktik asit bakterilerinin hiçbirinin diğer kaynaklardan izole edilen laktik asit bakterileri ile aynı RAPD profilleri paylaşmadığını gözlemlemişlerdir. Çalışmanın sonucunda; anne sütünün, bebek bağırsağında önemli bir laktik asit bakterisi kaynağı olabileceğini ve sütte bulunan laktik asit bakterilerinin endojen kökenli olabileceğini bildirmişleridir (Martin vd., 2003). 10

24 Serafini vd., (2003) de Brezilya nın Goias eyaletindeki süt bankasından toplanan üç yüz otuz sekiz (338) anne sütü örneğinde; hijyen ve sağlık koşullarını göstergesi olan potansiyel patojenik mikroorganizmaların prevalansını (yaygınlık oranını) belirlemek için sütlerde mikrobiyolojik analizler yapmışlardır. Bakteri türüne uygun olarak MacConkey agarda ekim yapılmıştır. Toplanan örneklerin, 194 ünü çiğ süt ve kalan 144 ünü pastörize süt oluşturmaktadır. Çiğ süt örneklerinde Staphylococcus spp., Streptococcus spp. türleri, mayalar ve küfler ve Enterobacteriaceae spp. varlığı doğrulanmıştır. 10 örnekten (%5,2) Staphylococcus aureus, 28 örnekten (%14,4) Staphylococcus epidermidis, 3 örnekten (%1,6) Streptococcus spp., 43 örnekten (%22,2) maya ve küf, 49 örnekten (%25,3) Enterobacteriaceae spp. izole edilmiştir. Isıl işlem uygulanan yüz kırk dört (144) örneğin beşinde (%3,5) Staphylococcus aureus, on beşinde (%10,4) Staphylococcus epidermidis, ikisinde (%1,4) Staphylococcus lugdenensis, dördünde (%2,8) Streptococcus spp., otuz yedisinde (%25,7) maya ve küf, dokuzunda (%6,3) ise Enterobacteriaceae bulunmuştur. Analiz, çiğ anne sütünde yüksek derecede kirlilik olduğunu ve pastörize edilmiş sütte potansiyel olarak patojenik mikroorganizmaların büyük çoğunluğunun ortadan kaldırılmasına rağmen, maya ve küflerin yüzdesinin çiğ sütte olduğundan daha yüksek olduğunu, pastörizasyonun mikrobiyolojik kontrolün etkili bir yolu olması için daha düşük bir başlangıç kontaminasyon derecesinin gerekli olduğunu ortaya koymaktadır. Bağırsak mikrobiyotalarının oluşturulması bağışıklık sisteminin gelişmesine ve olgunlaşmasına katkıda bulunan aşamalı bir süreçtir. Erken yaşlarda ortaya çıkan anormal bağırsak mikrobiyotaları, yaşamın ilerleyen dönemlerinde hastalığa yatkınlığa neden olabilmektedirler. Anne sütüyle beslenen bebekler, Bifidobakterlerin hâkim olduğu karakteristik bağırsak mikrobiyolarını barındırmaktadırlar (Gueimonde vd., 2007). Gueimonde vd., (2007) de; anne sütünün Bifidobakterileri içerip içermediğini ve Bifidobakteriyel türlerin mevcut olup olmadığını değerlendirmek amacıyla moleküler teknikleri (PCR) kullanarak yaptıkları çalışmada 20 tane anne sütü örneğinde Bifidobakterilerin varlığını sırasıyla, PCR ve Real-Time PCR 11

25 kullanılarak niteliksel ve niceliksel olarak belirlemişlerdir. Anne sütü örneklerinin Bifidobakter içerdiğini, en yaygın türünün Bifidobacterium longum olduğunu ve Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum ve Bifidobacterium catenulatum un onu takip ettiğini bildirmişlerdir. Anne sütünün, sağlıklı mikrobiyota gelişimini destekleyen Bifidobakter ve spesifik Bifidobacterium türlerini içerdiği sonucuna varmışlardır. Nötr kısa zincirli galaktooligosakkarit ve uzun zincirli fruktooligosakkarit (scgos/lcfos) karışımının, anne sütü oligosakkaritleriyle karşılaştırılabilir prebiyotik ve immünomodülatör etkilere sahip olduğu düşünülmektedir. Bu etkinin klinik uygulamalarda olası alerji ve enfeksiyonları önleme potansiyeli gösterebileceği tahmin edilmektedir. Arslanoğlu vd., (2007) yaptıkları çalışmada spesifik prebiyotik karışımın, yaşamın ilk 6 ayı boyunca enfeksiyonlara karşı önleyici bir etkiye sahip olabileceği hipotezini ortaya atmışlardır. Prospektif, randomize, çift kör, plasebo kontrollü yapılan çalışmada yaşamlarının ilk 6 ayı boyunca; atopi öyküsü olan sağlıklı bebekler ya prebiyotik takviyeli (8 g/l scgos/lcfos) ya da plasebo takviyeli (8 g/l maltodekstrin) hipoalerjenik formülle beslenmişlerdir. Ölçü olarak; enfeksiyöz bölümler, antibiyotik gerektiren enfeksiyonların sayısı ve enfeksiyonların insidansını baz almışlardır. Çalışma süresince, scgos/lcfos grubundaki bebekler her türden daha az atak geçirmişlerdir. Aynı zamanda daha az üst solunum yolu enfeksiyonu ataklarına ve daha az antibiyotik tedavisi gerektiren enfeksiyona sahip olma eğilimi göstermişlerdir. Benzer şekilde, tekrarlayan enfeksiyonların kümülatif insidansı scgos/lcfos grubunda önemli ölçüde daha düşük bulunmuştur. Tekrarlayan enfeksiyon ve tekrarlayan solunumun kümülatif insidansı enfeksiyonları scgos/lcfos grubunda %3,9 ve plasebo grubunda sırasıyla %13,5 ve %9,6 şeklinde bulunmuştur (P<0,05). Oligosakkarit prebiyotikler, ilk 6 ay boyunca enfeksiyöz atak sayısını ve özellikle tekrarlayan solunum yolu enfeksiyonlarının insidansını azaltmıştır. Prebiyotiklerin etki mekanizması araştırılacak olsa da, bu prebiyotik karışımın intestinal flora modifikasyonu yoluyla bağışıklık düzenleyici rolünün, yaşamın erken dönemlerinde gözlenen enfeksiyonları önlemek için temel mekanizma olmasının muhtemel olabileceğini bildirmişlerdir (Arslanoğlu vd., 2007). 12

26 Abrahamsson vd., (2009) da Lactobacillus reuteri ile oral takviye sonrası anne sütündeki, anne ve bebek gaitalarındaki L. reuteri nin prevalansını etkileyen faktörleri belirlemek ve mikrobiyal ekolojideki etkisini değerlendirmek (Clostridium difficile ve Bifidobacterium spp. kolonizasyonu gibi) amacıyla çift kör randomize bir çalışma yapmışlardır. Yapılan çalışmada, atopik hastalık öyküsü olan 232 anne, hamileliğinin son 4 haftası boyunca ya L. reuteri Amerika Kültür Koleksiyonu (ATCC) (1x10 8 koloni oluşturan ünite [CFU]) nin oral takviyesi ya da plaseboya günlük olarak randomize edilmiştir. Doğumdan sonra da bebekler 12 aya kadar aynı çalışmanın ürününü kullanmaya devam etmişlerdir. Anne sütünde ve gaitasında ve bebek gaitasında bakteriyel sayım ve prevalans geleneksel kültür yöntemleri kullanılarak değerlendirilmiştir. L. reuteri prevalansı, yaşamın ilk yıllarında oral takviye alanların gaitalarında plasebo uygulanların gaitalarına göre daha yüksek bulunmuştur. En yüksek prevalans 5 ile 6 günlükken kaydedilmiştir (tedavi grubunda %82; plasebo grubunda %20, P<0,001). Kolostrum örneklerinde Lactobacillus reuteri sırasıyla %12 ve %2'den izole edilmiştir (P<0,05). Antibiyotikler L. reuteri seviyelerini etkilemese de, anne sütüyle beslenmenin gaitadaki L. reuteri sayılarını azalttığı görülmüştür. L. reuteri uygulanması Bifidobakterleri veya C. difficile kolonizasyonunu etkilememiştir. Sonuç olarak, annenin oral takviyesininin ardından anne sütünde ve yaşamın ilk yıllarında hemen hemen tüm bebeklerde oral takviyeden sonra, tedavi edilmeyen birçok bebekte de Lactobacillus reuteri tespit edilebilmiştir (Abrahamsson vd., 2008). Anne sütü, bebek bağırsak mikrobiyotalarının gelişimini etkileyen bakteri kaynağı olarak tanımlanmıştır. Collado vd., (2009) da sağlıklı kadınların anne sütü mikrobiyotalarını karakterize etmek için 50 anne sütü örneğinde kantitatif gerçek zamanlı PCR tekniğini (qrti-pcr) kullanarak; Bifidobacterium, Lactobacillus, Staphylococcus, Bacteroides, Enterococcus, Streptococcus, Clostridium cluster IV ve Clostridium cluster XIVa XIVb grupları dahil olmak üzere farklı bakteri türlerinin veya kümelerinin varlığını değerlendirmişlerdir. Staphylococcus, Streptococcus, Bifidobacterium ve Lactobacillus baskın gruplardır ve tüm örneklerde tespit edilmiştir. Bacteroides ve Clostridium küme IV gruplarının aksine, örneklerin çoğunda Clostridium XIVa XIVb ve Enterococcus 13

27 tespit etmişlerdir. Çalışmanın sonucu, anne sütü örneklerinde bakteri DNA'sının çeşitliliğini doğrulamakta ve qrti-pcr tekniğinin anne sütünün mikrobiyolojik analizinde büyük bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir (Collado vd., 2009). Anne sütü mikrobiyomunu daha ayrıntılı bir şekilde araştırmak için Hunt vd., (2011) de, 16S ribozomal RNA geninin piro-sekresyonuna dayanan mikrobiyal tanımlama tekniklerini kullanmışlardır. Spesifik olarak, 16 anneden dört hafta boyunca üç zaman noktasında alınan süt örneklerinde bulunan bakteriyel toplulukları karakterize etmişlerdir. Yaptıkları çalışmanın sonucu, süt bakteriyel topluluklarının farklı çeşitlilikte olduğunu göstermiştir. Birkaç cinsin, topluluk içinde %5'inden fazlasını temsil etse bile, bireylerde zaman içinde değişkenlik gösterdiğini, her zaman istikrarlı olmadığını bildirmişlerdir. Sonuçlar, hemen hemen tüm sağlıklı bebekler için optimal beslenme kaynağı olarak önerilen anne sütünün, daha önce bildirilmiş olandan daha farklı bir bakteri koleksiyonu içerdiği sonucunu desteklemektedir. Basavanna ve Propulla, (2013) de sağlıklı bebek gaitalarından izole edilen Lactobacillus fermentum CFR 2195'in fonksiyonel özellikleri değerlendirmişlerdir. L. fermentumun HT-29 ve Caco-2 hücre dizilerine yapışması, sırasıyla 100 hücre başına 197,66±15,62 ve 100,33±15,69 olarak bulunmuştur. L. fermentum ve FOS (fruktooligosakkarit) içeren simbiyotik preparat, test edilen birkaç gıda kaynaklı patojene karşı belirgin antimikrobiyal aktivite göstermiştir. L. fermentumun proteolitik aktivitesi önemliydi ve L.fermentum ile fermente edilen sütteki toplam amino asit içeriği 555 mg/l olarak bulunmuştur. Zacarias vd., (2011) anne sütünde doğal olarak bulunan Bifidobacterium animalis subsp. lactis in probiyotik potansiyelini ve süt ürünlerinde probiyotik olarak kullanılıp kullanılamayacağını araştırmışlardır. Yaptıkları çalışmada; 16 anne sütü örneğinden Bifidobacterium animalis subsp. lactis in 6 izolatını, elde etmişlerdir (1,4-2,8 log cfu ml -1 düzeylerinde). İzolatlar; laktik asit-asitleştirilmiş sütte (ph=4,5), donmuş depolamada (-20 C ve -70 C, 6 ay) ve soğutulmuş 14

28 depolamada (5 C, 4 hafta) stabil kalabilmişlerdir. Ayrıca izolatlar, yağsız sütte maya özütüyle büyüyebilmişler ve %20 (w/v) yağsız sütte püskürtmeyle kurutmaya karşı kararlılık göstermişlerdir. Püskürterek kurutulmuş kültürler, 6 ay boyunca 5 C'de saklandığında yüksek miktarda canlı hücreyi muhafaza etmiş ve 50 C'ye kadar su içinde yeniden hidrasyona karşı stabil kalmışlardır. B. animalis subsp. lactis INL1 farelere verildiğinde, küçük ve kalın bağırsaklarında IgA lerin sayısını arttırmıştır. Sonuçlar, B. animalis subsp. lactis INL1 in, süt ürünlerine dahil edilebilmek için teknolojik ve probiyotik potansiyeli gösterdiğini ortaya koymaktadır. Rautava vd., (2012) de gebelik ve emzirme döneminde egzama gelişme riski yüksek bebeklerin annelerine probiyotik desteği verilmesinin bu riske olan etkisini araştırmışlardır. Çalışmada; 241 anne-bebek çifti kullanılmıştır. Atopik duyarlılığı ve allerjik hastalığı olan anneler rastgele seçilmiştir. (1) Lactobacillus rhamnosus LPR ve Bifidobacterium longum BL999 (LPR1BL999), (2) Lactobacillus paracasei ST11 ve Bifidobacterium longum BL999 (ST111BL999) veya (3) plasebo şeklinde 3 grupla çalışma yapılmış ve probiyotik takviyeler doğumdan 2 ay önce ve emzirmenin ilk 2 ayında verilmiştir. Bebekler 24 aylık olana kadar takip edilmiş ve deri Prick testleri 6, 12 ve 24. aylarda yapılmıştır. Toplam 205 bebeğin analizleri tamamlanmıştır. LPR1BL999 (odds oranı [OR], 0,17; %95 CI, 0,08-0,35; P<.001) ve ST111BL999 (OR, 0,16; %95 CI, 0,08-0,35; P<.001) alan annelerin bebeklerinde yaşamın ilk 24 ayında egzama gelişme riski önemli ölçüde azalmıştır. Kronik kalıcı egzamada istatistiki oranlar sırasıyla OR 0,30 (%95 CI, 0,12-0,80; P=.016) ve 0.17 (%95 CI, 0,05-0,56; P=.003) şeklinde bulunmuştur. Probiyotiklerin bebeklerdeki atopik duyarlılık riski üzerine etkisi olmamıştır. Anne sütü doğum sonrası bebek sağlığı için metabolik ve immünolojik programlama elemanlarının en önemli unsuru olarak kabul edilmektedir. Süt mikrobiyomunu etkileyen faktörler ve bu mikroorganizmaların bebek sağlığı üzerindeki potansiyel etkisi henüz ortaya çıkarılmamıştır (Cabrera-Rubio vd., 2012). 15

29 Cabrera-Rubio vd. (2012) yaptıkları çalışmada; 3 farklı zaman noktasında, Body Mass Index (BMI), kilo alımı ve doğum şeklinin değiştiği annelerde (n=18) anne sütü mikrobiyal topluluğunu dizileme ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qpcr) ile karakterize etmişlerdir. Çalışmaya dahil olan 18 anneden; BIM (kg/m 2 )>30 olan 10 obez anne ve BMI 25 olan 8 normal kilolu anne (kontrol olarak) kullanılmıştır. Annelerin emzirme süresinin yanı sıra bebek besleme uygulamaları hakkındaki veriler görüşme ile elde edilmiş ve her ziyarette kaydedilmiştir. Anne sütü mikrobiyomunun laktasyon süresince değiştiğini görmüşlerdir. Kolostrum örneklerinde Weisella spp., Leuconostoc spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. ve Lactococcus spp. baskınken, 1 ve 6. ay süt örneklerinde oral kavitenin tipik öncüleri (örn., Veillonella spp., Leptotrichia spp. ve Prevotella spp.) önemli ölçüde artmıştır. Cabrera-Rubio vd. (2012) obez annelerin süt örneklerini ve normal kilolu annelerin süt örneklerini karşılaştırmışlardır. Obez annelerden alınan süt örneklerinin, normal kilolu annelerden alınan süt örneklerine göre farklı ve daha az çeşitlilikte bakteri topluluğunu barındırmaya meyilli olduğunu gözlemlemişlerdir. Obez annelerden alınan kolostrum ve 1 aylık süt örnekleri, normal kilolu annelerden alınan süt örneklerine göre daha az çeşitlilik göstermiş, ancak 6. ayda alınan süt örneklerinde farklılık ortadan kalkmıştır. qpcr verileri ayrıca, obezitenin süt mikrobiyomunu etkilediği kavramını destekleyerek, BMI'ne ve gebelik sırasında kilo alımına bağlı olarak spesifik bakteriyel cinslerin varlığında önemli farklılıklar olduğunu göstermiştir. Cabrera-Rubio vd., (2012) sezaryen ile doğum yapan annelerden alınan süt örnekleri ve vajinal doğumla doğum yapan annelerden alınan süt örneklerini karşılaştırmışlardır. Sezeryanla doğum yapanların farklı bir bakteri topluluğu içermekte olduğunu gözlemlemişlerdir. Bu durum operasyonun kendisinden değil, fizyolojik stresin veya hormonal sinyallerin yokluğundan kaynaklandığını düşündürmektedir. Çalışmanın sonucu, süt bakterilerinin bulaşıcı olmadığını ve süt mikrobiyomunun bileşimini önemli ölçüde etkileyen birçok faktörün olduğunu göstermektedir. 16

30 Mehanna vd., (2013) de Sina nın farklı bölgelerinden gelen Mısırlı annelerin sütlerinden izole edilen Lactococcus spp., Lactobacillus spp. ve Enterococcus spp. cinsinden toplam iki yüz elli laktik asit bakterisini, fizyolojik özellikler kullanarak cins düzeyinde tanımlamışlardır. Probiyotik bakterilere özgü fonksiyonel özelliklere sahip onsekiz izolatı, hem klasik fenotipik hem de API 50 CHL kitleri ve API 20 STRP ile tür ve alt türlerde tanımlamışlardır. Bunlardan 5'inin Lactococcus spp., ye diğerlerinin ise Lactobacillus spp. cinsine ait olduğunu bildirmişlerdir. Laktik asit kokları arasında Enterococcus facium (3 suşu) un baskın olduğu ve bunu Lactococcus lactis (2 suş) izlediği; Laktobasiller arasında ise L. plantarum ve L. rhamonusus (her biri için 4 suş) en yaygın tür olduğu, onu L. casei ve L. fermentum (her biri için 2 suş) ve daha sonra da L. acidophilus (1 suş) un izolatlarının izlediği sonucuna varmışlardır. Alerjinin önlenmesinde birincil korunma anahtarı, hamilelik ve/veya bebeklik döneminde probiyotik bakterilerin uygulanması da dahil erken bağırsak kolonizasyonunu olumlu yönde değiştirecek stratejileri içermektedir. Metaanalizlerde, anneye hamilelikte ve emzirme döneminde ve doğum sonrası çocuğa verilen kombine perinatal müdahale, egzamaya karşı en tutarlı koruyucu etki göstermiş, ancak diğer alerjik reaksiyonlar için olumlu etki göstermemiştir (Fiocchi vd., 2015). Genel olarak uzmanlar tarafından, alerjiyi önleme için probiyotikler önerilmektedir. Dünya Alerji Organizasyonu (WAO) da yeni başlatılan kılavuzlarında; hamile ve emziren annelerde, alerjik hastalık geliştirme riski yüksek olan bebeklerde, alerji riski yüksek olan çocuklarda alerji önleme için probiyotiklerin kullanılmasını önermektedir. (ebeveynlerde veya kardeşlerde alerjik hastalık öyküsüne dayanarak). WAO kılavuzda, tavsiyenin şartlı ve düşük kaliteli kanıtlara dayandığının altını çizmiştir. Ancak, tüm kritik sonuçları dikkate aldıklarında, egzamanın önlenmesi için probiyotiklerin yararlı olabileceğini bildirmişlerdir (Fiocchi vd., 2015). Perinatal dönemde anneler tarafından probiyotik kullanımının mikrobiyota dengesini düzenleyerek hem anne hem de bebek için yararlı olabileceği 17

31 düşünülmektedir. Rutten vd., (2016) yaptıkları çalışmada; gebelikte probiyotik kullanan annelerin özellikleri ve (sağlık) davranış örüntüleri ve bebekleri üzerindeki sağlık etkilerini, gebelikte probiyotik kullanan anneler ile kullanmayanlar arasındaki farkları araştırmışlardır. Yaptıkları araştırmada, toplamda 2491 hastanın (%13,7) 341'i hamilelik sırasında probiyotik kullanmıştır. Maternal özellikler açısından (Gestasyon, yaş, etnik köken, eğitim) kullananlar ve kullanmayanlar arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. Lojistik regresyan analizi, homeopatik ürünlerin kullanımının [odds oranı (OR) 1,65, % 95 güven aralığı (CI) 1,17 2,33, p=0,005], anne sigara içme öyküsünün (OR 1,72, %95) CI 1,25 2,37, p=0,001 ve baba sigara içme öyküsünün OR 1,39, %95 CI 1,01-1,89, p = 0,05) probiyotik tüketiminiyle anlamlı bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir. Çocuğun yaşamının ilk yılındaki yaygın hastalık belirtileri her iki grup arasında farklılık göstermemiştir. Hamilelik sırasında doktor reçetesi olmaksızın probiyotiklerin veya sağlıkla ilgili diğer ürünlerin kullanılmasının, daha az elverişli davranış türleri için telafi anlamına gelebileceğini bildirmişlerdir. Hamilelik sırasında probiyotik kullanımın, seçilmemiş bir popülasyonun bebeklerinde olumlu sağlık etkileri oluşturduğu görünmemektedir. Boix-Amorós vd., (2016) da emzirme sırasında süt mikrobiota bileşimi, bakteri yükü, makrobesinler ve insan hücreleri arasındaki ilişkiyi tanımlamak için çalışma yapmışlardır. 21 sağlıklı anneden laktasyon süresi boyunca alınan süt örneklerindeki bakteriyel yük, hedeflenen bakteriye özgü tek-kopya fusa geni qpcr ile tahmin edilmiştir. Süt mikrobiyom bileşimi ve çeşitliliği 16S RNA ile belirlenmiştir. Ayrıca bu bakterilerin yapısı; akış sitometrisi, qpcr ve mikroskopi ile incelenmiştir. Süt bakteriyel topluluklarının genellikle karmaşık olduğunu ve kişiye özgü profilleri gösterdiğini gözlemlemişlerdir. Süt mikrobiyotasında baskın olan mikroorganizmalar; Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp. ve Acinetobacter spp. olarak bulunmuştur. Sağlıklı annelerden alınan örneklerin hiçbirinde Staphylococcus aureus saptanmamıştır. Annelerde, anneler arasında ve hatta bazı durumlarda annelerde bile farklı zaman noktalarında bileşim ve sayı bakımından bakteri sayısı farklı bulunmuştur. 18

32 Bakteri yükü, zaman içinde 10 6 bakteri hücresi/ml idi, 16S RNA geni PCR ve kültür yöntemleri ile bildirilen sayılardan daha yüksek bulunmuştur. Anne sütünün, bebek bağırsağı için bir bakteri kaynağı olduğu varsayılmıştır. Yapılan çalışmada, 50 emziren annenin anne sütünden elde edilen Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp. ve Bifidobacterium spp. cinslerine ait 415 izolat arasında probiyotik bakteri aranması amaçlanmıştır ve bunların gaita düzeylerinin farklı emzirme modalitelere göre farklılık gösterip göstermediği araştırılmıştır. İzolatların olası probiyotik olduğunu kanıtlamak için, düşük ph'a karşı direnç, safra tuzlarına karşı tolerans ve antimikrobiyal aktiviteleri için testler şeklinde üç ana seçim kriteri kullanılarak tarama yapılmıştır. Üç kriter; annelerin anne sütü ve bebeklerinin gaita örneklerinden elde edilen izolatların sırasıyla 31.7 ve 31'ini karşılamıştır. Süt ve bebeklerin gaitalarından izole edilen probiyotik suşların çoğunluğu fenotipik olarak aynı bulunmuştur. Bu da anne sütünü olası probiyotik kaynağı olarak düşündürmüştür. Ayrıca, anne sütü ile bebeklerin anne sütüyle beslenmesi arasında ve bebeklerin gaitalarındaki probiyotik sayısı arasında pozitif bir ilişki bulunmuştur (Sallam vd., 2016). Yapılan bir başka çalışmada, anne sütü ve maternal periferik mononükleer hücreler arasında benzer bakteriyel DNA saptanmış ve bakterilerin intraselüler olarak bağırsaktan meme bezine taşındığı gösterilmiştir (Perez vd., 2007). Spesifik bakteri türlerinin izolasyonu ile yaptıkları kültür bağımsız çalışmalarda Makino vd., (2011) maternal bağırsak ve bebek bağırsağı arasında Bifidobacterium transferinin olduğunu; Jimenez vd., (2008c) ise anneye oral olarak verilen Lactobacillus spp. bakterilerin anne sütüne geçtiğini bildirmişlerdir Kefir Kesin bir tarih olmamasına rağmen yoğurdun 6000 yıldan beri bilindiği belirtilmektedir (Tunail ve Köşker, 1986; Özer, 2006). Kımızın 13. yüzyıl, kefirin ise 18. yüzyıldan beri üretildiği tahmin edilmektedir (Yaygın, 1994). Kefir danesi ya da kefirin ilk olarak ne zaman bulunduğu bilinmemektedir. Ancak kefir 19

33 daneleri ilk olarak keçi tulumu içinde inek sütünün şirden ile pıhtılaştırılarak tulumun iç yüzeyinde birkaç hafta içinde süngerimsi bir yapının oluşması, bu yapının o bölgeden alınarak kullanıldığı ve daha sonra inkübasyon için bu yapının kullanılması ile kefir elde edildiği bildirilmiştir (Koroleva, 1988; Stepaniak ve Fetlinski, 2002). Geleneksel kefir yüzyıllardır evlerde üretilmektedir. Dr. W. Podwyssotzki nin Kefyr isimli kitabı kefir üzerine bilinen en eski çalışmadır yılında Moritz Schulz tarafından tercüme edilerek kefir tarihçesi, çeşitleri, nitelikleri ve Kuzey Avrupa ya ve diğer bölgelere nasıl yayıldığı belirtilmektedir. Bu kitapta kefirin ilk defa Kafkasya da Elbe nehri kıyısındaki 2500 m yükseklikteki Karatscajeff dağ köyünden yayıldığı belirtilmiştir (Schulz, 1968; Sezer, 2003). Geleneksel kefir yaygın olarak Karadeniz ve Hazar Denizi arasında Kafkasya daki kuzey Kafkas Dağlarında yaşayan insanlar tarafından üretilmiştir. Kafkasya dan Doğu Avrupa ülkeleri ve İskandinav ülkelerine yayılmıştır. En eski fermente süt ürünlerinden yoğurt, ayran ve kımız Türk dilinden köken aldığı gibi (Gerhard, 1976; Kurman, 1984) kefir, ismini Türkçe de içildikten sonra rahatlatıcı anlamında olan Keyif sözcüğünden ve Kafkas dilinde en iyi kalite anlamına gelen Kef sözcüklerinden aldığı tahmin edilmektedir (Novil, 1998). Ayrıca Kephir, Kiaphur, Kefyr, Kepher, Knapon, Kepi ve Kippe gibi pek çok ismi kullanılmaktadır (Koroleva vd., 1988). Doğu ve Orta Avrupa ülkelerinde kefir, sağlık üzerine olumlu etkilerinin belirlenmesi ile fonsiyonel özelliklerinden dolayı beğenilen bir ürün olarak tüketilmektedir (Güzel-Seydim vd., 2010) Kefir danesi Kefir daneleri, küçük karnabahar veya mısır patlağı görünümündedir. Yuvarlak, beyaz-krem renginde, ortalama çapları 1-3 cm, elastik ve sıkı bir tekstüre sahiptir (La Rivie`re vd., 1967; Kosikowski ve Mistry, 1997; Güzel-Seydim, 2000; Gorsek ve Tramsek, 2007). Kefir danesi, laktik asit bakterilerini, asetik asit bakterilerini, mayaları ve kefiran polisakkaritini içeren ağ yapısıyla oluşmaktadır. 20

34 Şekil 2.1. Kefir danesi dış görünüşü Rusya, Yugoslavya ve Bulgaristan orjinli kefir danelerinde yaklaşık %90 su, %3,2 protein, %0,3 yağ, %5,8 azot içermeyen maddeler ve %0,7 kül bulunmaktadır. (Otogalli vd., 1973). Benzer değerler İsviçre orjinli kefir danelerinde de tespit edilmiştir (Bottazzi vd., 1994). Arjantin kökenli kefir danesinde %83 su, %9-10 polisakkarit ve %4,5 protein bulunmuştur (Abraham ve De Antoni, 1999). Kefir danelerinin mikrobiyal içeriğiyle ilgili ilk çalışmalarda ışık mikroskobundan faydalanılmış, ilerleyen teknolojiyle yapılan araştırmalarda elektron mikroskobu kullanılmıştır (Ottogalli vd., 1973; Bottazzi ve Bianchi, 1980; Molska vd., 1980; Marshall vd., 1984; Duitschaever vd., 1988b; Toba vd., 1990; Neve, 1992; Bottazzi vd., 1994; Rea vd., 1996, Güzel-Seydim vd., 2005). Kefir danesinin mikrobiyal kompozisyonunu görüntülemek amacıyla tarayıcı Elektron Mikroskobu (SEM) tekniği pek çok araştırmada kullanılmıştır. Yapılan bazı araştırma sonuçlarının kefir danesinin dış kısmı ile iç bölümü karşılaştırıldığında uyumlu olmadığı tespit edilmiştir (Duitschaever vd., 1988b; Toba vd., 1990; Rea vd., 1996; Güzel-Seydim vd., 2005). Bottazzi ve Bianchi (1980) SEM kullanarak kefir danesindeki mikroorganizmaları, ince tabakalı bir matriks içinde, süngerimsi lifli yapı biçiminde bulunduğunu belirtmiştir. Marshall vd. (1984) Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) ve SEM kullanılarak kefir danesinin mikroorganizma topluluğunu gözlemlemişlerdir. Toba vd. (1990) kefir danesinde mikroorganizmaların yayılımlarına SEM ile bakmıştır. Sonuç olarak; dane yüzeyinde kısa, uzun laktobasiller ve mayalar tespit edilmiştir. Dane içinde süngerimsi matriksde laktobasil ve maya kolonileri ayrı ayrı kolonize olmuşlardır. Dane merkezinde bulunan bakteriler ince iplikçik görünümündeki yapılarla matriks yapı içinde tutunmaktadırlar. 21

35 Kefir danesi ve kefirin mikrobiyolojik özellikleri Kefir danesi, doğal olarak geniş bakteri grubu ve mayaları kapsayan çok özel bir yapıdır. Laktik asit bakterileri, asetik asit bakterileri ve mayalardan oluşan bu mikroflora, bu bakterilerin ürettikleri kefiran polisakkariti içinde simbiyotik bir topluluk halinde bulunmaktadır (Margulis, 1996; Seydim vd., 2001). Vedamuthu (1977) kefir danelerinlerinde maya ve LAB arasında simbiyotik bir ilişki olduğunu belirtmiştir. Araştırma sonuçlarına göre kefir danesinde pek çok homofermantetif ve heterofermentetif Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc ve asetik asit bakterileri tespit edilmiştir. Kefir üretiminde kullanılan kefir danesi; bakteriler (L. kefiri, Leuconostoc, Lactococci ve diğerleri), mayalar (S. kefir ve Torula spp. ya da C. kefir) ve polisakkaritler içerir (Tamime ve Marshall, 1997). Arjantin orjinli dört farklı kefir danesi kullanılarak üretilen kefir örneklerinin mikrobiyolojik analizler sonuçlarında L. plantarum, L. kefir, L. plantarum, L. parakefir, Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Ln. mesenteroides, Acetobacter bakterileri ve Saccharomyces ile K. marxianus mayaları tespit edilmiştir (Garrote vd., 2001). Simova vd. (2002) kefir danesini (A), kefir danesinden yapılan kefiri (B) ve kefir kültüründen üretilen kefiri (C) mikrobiyolojik ve kimyasal özellikler açısından karşılaştırmışlardır. Araştırma sonucuna göre A, B ve C örneklerinde sırasıyla streptokoklarda %26-30 artış, laktobasillerde %13-23 azalış ve mayalarda da %10-17 azalış olduğunu tespit etmişlerdir. Kefir üretimi için kefir danesi kullanılmasının gerektiğini belirtmiştir. Neve (1992) ve Duitschaever vd. (1988a) araştırmalarında S. lactis türünü az sayıda tespit etmiştir. Ayrıca Hosono vd. (1990), Rossi ve Gobbetti, (1991) S. lactis kefir danesi mikroflorasında önemli olduğunu belirtmiştir. Yüksekdağ vd. (2004) Türkiye de bulunan kefir danesinden biyokimyasal ve morfolojik yöntemlerle Lc. cremoris (11 alt türü; Z6S, Z9S, Z10S, Z11S, Z14S, Z16S, Z17S, Z18S, Z19S, Z20S, Z21S), Lc. lactis (4 alt türü; Z1S, Z2S, Z3S, Z13S), S. 22

36 thermophilus (3 alt türü; Z4S, Z5S, Z12S) ve S. durans (3 alt türü; Z7S, Z8S, Z15S) tespit etmişlerdir. Kojic vd. (2007) geleneksel olarak üretilen kefirden L. lactis subsp. lactis izole etmişlerdir ve farklı plazmit profilleri; BGKF8, BGKF17, BGKF26, BGKF49 ve BGKF55 tespit etmişlerdir. BGKF26 izolatı nisinin antimikrobiyal aktivitesine karşı direnç gösterdiği bulunmuştur. Bakteriyosinlerin üretimi besiyerindeki tripton ve kasiton konsantrasyonuna bağlı olduğunu belirtmiştir. Witthuhn vd. (2005) kefir danesinden ürettikleri kefir içerisinde bulunan bakterileri morfolojik ve biyokimyasal karakterlerini temel alan yedi farklı seçici besiyeri kullanarak mikrobiyal populasyonu belirlenmişdir. Kefir üretiminin fermantasyon süresince alınan örneklerdeki mikrobiyal değişimin 4,6x10 3 ve 2,6x10 8 olduğunu tespit etmişlerdir. Direkt kefir danesi ve daneden yapılan kefir için yapılan araştırmada %45,9-%98,4 oranında tanımlanan Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc ve Cryptococcus türlerini tespit etmişlerdir. Çizelge 2.3 de kefir ve kefir danelerinden tanımlanmış bakteriler ve mayalar gösterilmektedir. Moleküler teknikler kullanılmadan önce, mikroorganizmaların morfolojik ve biyokimyasal karakteri seçici kültür besiyerlerinde geliştirerek tanımlanmıştır (Pintado vd., 1996; Takizawa vd., 1998; Wouters vd., 2002). LAB uygulamalarında bu yöntemlerle tanımlamaların güvenli olmadığı düşünülmektedir. L. acidophilus türünün çok kompleks olduğu ve filogenetik temelde geleneksel olarak tanımlanamadığı bulunmuştur (Hammes ve Vogel, 1995). Ayrıca kültür besiyerleri türe spesifik olmadığından kefir danesi içinde mevcut olan bakterilerin hepsinin gelişmediği düşünülmektedir (Witthuhn vd., 2004). Moleküler yaklaşımlar örneğin seçici kültürlerde geliştirmeksizin direkt olarak uygulanmasıyla dikkat çekmektedir. Bu metotlar arasında 16S rdna geni temel alınarak türlerin karakterizasyonlarının yapıldığı 16S rdna tekniği yaygın olarak kullanılmaktadır. 16S rdna filogenetik çalışmaların temelini oluşturur (Woese, 1987) ve polifazik taksanominin modern sınıflandırılmasını sağlar (Vandamme, 1996). Son yıllarda moleküler teknikler kullanılarak yapılan araştırmalarda farklı kefir mikroflorasında tür seviyesinde tanımlamalara göre L. 23

37 acidophilus tespit edilmiştir (Ninane vd., 2007; Delfederico vd., 2006; Garbers vd., 2004). Fakat B. bifidum türü tanımlanmamıştır. Ülkemizde moleküler teknik ile kefir danesinin mikroflorasının tanımlanması ile ilgili çalışmaya rastlanmamıştır. Türk orjinli kefir danesinde bakteri tanımlanmasını APILAB Plus kullanılarak tür seviyesinde sınıflandırma ile tespit edilmiştir (Yüksekdag vd., 2004). Ninane vd. (2007) PZR sonrası 16S rrna gen dizilimini kullanarak kefir dane mikroflorasını tanımlamıştır. DNA izolasyonu sonrası 16S rdna V1 ve V2 bölgeleri çoğaltılmıştır. V1 bölgesinde L. kefiranofaciens, L. kefir, L. parakefir ve L. lactis tanımlamıştır. Bu bölgede leukonostok tür seviyesinde tanımlanmamıştır. V2 bölgesinde L. mesenteroides tanımlamıştır. Arjantin kökenli kefir danelerinden elde edilen laktobasil izolatlarından L. kefir in üç alt türü RAPD (Rastgele arttırılmış polimorfik DNA)-PZR kombine yöntemi ile tanımlanmıştır (Delfederico vd., 2006). Garbers vd. (2004) Güney Afrika orjinli kefir danesinde PZR ve Denatüre Gradiyent Jel Elektroforez (DGJE) metotlarını kombine edilerek mikroflora tanımlamıştır. Danede bulunan laktobasil ile ilgili filogenetik akraba ilişkileri belirlenmiştir. Kefir danelerinde daha önceki çalışmalarda belirtilmemiş olan L. crispatus ve L. gallinarum bulunduğu tespit etmiştir. Mayaların dizi analizi sonrasında Candida ve Saccharomyces yakın akrabaları tespit edilmiştir. Aynı filogenetik grupta 16S rrna homoloji %90,8-99,3 arasında L. delbrueckii, L. helveticus ve L. acidophilus fermente süt ürünlerinde yaygın olarak bulunmaktadır (Andrighetto vd., 1998; Giraffa, 1998). Kefir danesinde bulunan L. acidophilus biyokimyasal ve fizyolojik testlerle belirlenmiş olsa da tür seviyesindeki farklılıklar açık bir genomik heterojenliği sağlamaktadır. L. crispatus ve L. gallinarum basit fizyolojik testler ile ayırt edilememektedir (Du Plessis ve Dicks, 1995). L. crispatus ve L. acidophilus un belli türleri laktik dehidrogenaz (LDH) elektroforetik profilleriyle de tanımlanamamaktadır (Du Plessis ve Dicks, 1995). 24

38 Chen vd. (2009) kültüre bağlı olarak PCR-DGGE yöntemi sonrası DNA dizi analizi yapılan farklı orjinli kefir daneleri içinde L. kefiranofaciens, L. kefiri ve Lc. lactis türlerini tespit etmiştir. Latorre-Garcia vd. (2007) farklı ticari ve yerli 10 çeşit kefir danesi içinde bulunan maya izolasyonları rrna genlerinin kopyalanan aralığı (ITS) temel alarak taksonomik olarak sınıflandırılmasını yapmıştır. Farklı 10 türde, 18 maya suşu tanımlanırken, üç çeşit ticari kefir örneğinin ikisinde K. lactis bulunmuş diğerlerinde bu tür tespit edilememiştir. K. lactis, Issatchenkia orientalis, S. unisporus, S. exiguus ve S. humaticus mayaları tanımlanmıştır. Wang vd. (2008a) çalışmasında kefir danesinde bulunan mayaları klasik mikrobiyolojik yöntemler ve PCR-DGJE kombine yöntemini kullanarak tanımlamıştır. Tayvan kökenli kefir danesinde K. marxianus, S. turicensis ve P. fermentans PCR-DGJE yöntemi ile tanımlayıp, dane içinde sayılarını mikrobiyolojik yöntemlerle belirlemiştir. Kefir danesi içinde K. marxianus, S. turicensis ve P. fermentans mayaları sırasıyla; %76, 22 ve 2 oranında olduğunu tespit etmiştir. Kim vd. (2015a) çalışmalarında kefir üretimi için indikatör mikroorganizma olan, kefir danesi ve kefiran üretiminde önemli bir faktör olan Lactobacillus kefiranofaciens in hızlı tespitini sağlamak için yeni bir Realtime-PCR primer ve prob seti, LKF_KU504 tasarlamışlardır. Yapılan testlerde; 61 mikroorganizma arasından 14 tane L. kefiranofaciens suşu pozitif, %100 duyarlılık ve özgüllüğe sahip olarak belirlenmiştir. Kefirdeki ve kefir danesindeki L. kefiranofaciens düzeyleri anlamlı olarak farklı bulunmuştur. L. kefiranofaciens in kefir danesinde kefirden daha fazla yoğunlaştığını belirlemişlerdir. Kim vd. (2016) kefir sütündeki temel fonksiyonel laktik asit bakterilerinden biri olan Lactobacillus kefiri nin hızlı tanımlanması ve sayımı için reca genini hedefleyen yeni bir realtime PCR primer/prob seti olan LK_508'i tasarlamışlardır. Standart suşları ve kefir izolatlarını kapsayan kapsayıcılık ve ayrıcalıklılık testinde, test edilen suşlardan sadece 9 tane L. kefiri suşu pozitif, geriye kalan 38 yakından ilgili mikroorganizma negatif olarak tespit etmişlerdir. Bu da testin %100 duyarlılığını ve özgüllüğünü göstermektedir. %5 dane-süt 25

39 oranı ile 25 C'de fermente edilen kefir sütünün L. kefiri popülasyonu sırasıyla, 12; 24; 36 ve 48 saat için 3,77; 4,30; 4,79 ve 5,63 log cfu ml -1 olarak belirlemişlerdir. Yeni geliştirilen qpcr testi, fermantasyon sürecinde kefir mikrobiyotasının kantitatif ilişkisini araştırmak için uygulanabilir. Kefir, laktik asit bakterileri, asetik asit bakterileri ve maya karışımı ile üretilen eşsiz bir fermente süt ürünüdür. Kim vd. (2015b) kültür-bağımsız kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniği kullanarak yaptıkları çalışmada; laktik asit bakterileri, asetik asit bakterileri ve mayayı kefir danesinde ve kefir sütünde gruba özgü primerleri kullanarak numaralandırmak için kullanmışlardır. Hem kefir danesinde hem de kefirde en fazla bulunan mikrobiyal grup laktik asit bakterileri ve asetik asit bakterileri olup, bunu mayalar (P<0,05) izlemektedir. Laktik asit bakterilerinin ve mayaların en önde gelen cinslerini sırasıyla; Lactobacillus, Lactococcus (P<0,05) ve Candida olarak belirlenmiştir. Tüm mikrobiyal gruplar; kefirde, Enterococcus ve Saccharomyces grupları hariç, kefir danesine göre daha az sayıda (P<0,05) bulunmuştur. Bu çalışma, kefir danesi ve kefirdeki spesifik mikrobiyal popülasyonların miktarının kantitatif Realtime-PCR kullanılarak karakterize edildiği ilk rapordur. Realtime-PCR kullanarak kefir denesinde ve kefir sütünde bulunan mikroorganizmaların spesifik gruplarınının niceliksel olarak elde edilmesine ve kefirin kalite kontrolüne yönelik yöntemler geliştirmişlerdir. Çizelge 2.3. Farklı kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar Lactobacillus/Lactococcus Türleri Lactobacillus kefiri Lactobacillus kefiranofaciens Lactobacillus kefirgranum Ülke/Bölge Arjantin, Brezilya, Yunanistan, Tibet Türkiye Brezilya, Belçika, İtalya, Tibet, Belçika, İtalya Kaynaklar Kandler ve Kunath 1983; Pintado vd., 1996; Güzel-Seydim vd., 2005; Chen vd., 2008; Güzel-Seydim vd., 2011; Hamet vd., 2013; Garofalo vd., 2015 Fujisawa vd.,1988; Pintado vd., 1996; Chen vd., 2008; Magalhaes vd., 2010; Kök-Taş vd., 2012; Hamet vd., 2013; Garofalo vd., 2015 Takizawa vd., 1994; Chen vd., 2008; Magalhaes vd., 2010; Garofalovd., 2015 Lactobacillus parakefiri Arjantin Takizawa vd., 1994; Hamet vd., 2013; Vardjan vd.,

40 Çizelge 2.3. Farklı kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar Lactobacillus acidophilus Lactobacillus amylovorus Arjantin, İspanya, Türkiye Brezilya, Danimarka 27 Chen vd., 2008; Chen vd., 2012; Kök-Taş vd., 2012 Fujisawa vd., 1988; Leite vd., 2012 Lactobacillus brevis İspanya Wang vd., 2008 Lactobacillus buchneri - Kim vd., 2016 Lactobacillus casei İspanya, Tibet Wang vd., 2008; Zhou vd., 2009; Gulitz vd., 2011; Dick vd., 2015 Lactobacillus crispatus Arjantin, Güney Afrika, Türkiye Garbers vd., 2004; Zhou vd., 2009; Kök-Taş vd., 2012 Lactobacillus delbrueckii Güney Afrika Koroleva vd., 1991; Santos vd., 2003; Witthuhn vd., 2004; Dick vd., 2015 Lactobacillus fermentum Güney Afrika, Witthuhn vd., 2004; Wang vd., 2008 İspanya Lactobacillus gasseri İspanya Wang vd., 2008 Lactobacillus gallinarum Güney Afrika Garbers vd., 2004 Lactobacillus helveticus Arjantin, Tibet, Türkiye Zhou vd., 2009; Kök-Taş vd., 2012 Lactobacillus jensenii - Kim vd., 2016 Lactobacillus johnsonii - Kim vd., 2016 Lactobacillus otakiensis Arjantin, Zhou vd., 2009; Garofalo vd., 2015 İtalya Lactobacillus parabuchneri - Kim vd., 2016 Lactobacillus paracasei Arjantin Hamet vd., 2013 Lactobacillus plantarum Tibet Hsieh vd., 2012; Zanirati vd., 2015 Lactobacillus reuteri Türkiye Kök-Taş vd., 2012 Lactobacillus rhamnosus İspanya Koroleva vd., 1991; Wang vd., 2008 Lactobacillus viridescens İspanya Wang vd., 2008 Lactococcus cremoris - Kim vd., 2016 Lactococcus lactis Arjantin, Brezilya, Tibet Pintado vd., 1996; Chen vd., 2008; Zhou vd., 2009; Leite vd., 2012 Leuconostoc lactis Güney Afrika Witthuhn vd., 2004 Leuconostoc mesenteroides Güney Afrika, Witthuhn vd., 2004; Chen vd., 2008 Tibet Streptococcus thermophilus Türkiye Kök-Taş vd., 2012 Asetik asit Bakterileri Acetobacter lovaniensis Belçika Magalhaes vd., 2010 Acetobacter pasteurianus Arjantin Garrote vd., 2001 Acetobacter syzygii Brezilya Miguel vd., 2010 Mayalar Candida albicans İspanya Wang vd., 2008

41 Çizelge 2.3. Farklı kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar Candida friedricchi İspanya Wang vd., 2008 Candida holmii İspanya Wang vd., 2008 Candida kefir İspanya Wang vd., 2008 Candida lambica Güney Afrika Garbers vd., 2004 Kazachstania aerobia İtalya Garofalo vd., 2015 Kazachstania servazzii İtalya Garofalo vd., 2015 Kazachstania solicola İtalya Garofalo vd., 2015 Kazachstania unispora Brezilya, İtalya Leite vd., 2012; Garofalo vd., 2015 Kluyveromyces dobzhanskii Türkiye Kök-Taş vd., 2012 Kluyveromyces lactis - Kim vd., 2016 Kluyveromyces marxianus Brezilya, Zhou vd., 2009; Magalhaes vd., 2010; Tibet Vardjan vd., 2013 Pichia fermentas Tayvan Wang vd., 2008 Saccaromyces unisporus Saccaromyces cerevisiae Portekiz, Tayvan Brezilya, Güney Afrika, İtalya, Tibet Saccaromyces turicensis Tayvan Wang vd., 2008 Torulospora delbrueckii İspanya Wang vd., 2008 Pintado vd., 1996; Wang vd., 2008 Garbers vd., 2004; Witthuhn vd., 2004; Zhou vd., 2009; Garofalo vd.,

42 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Kefir Temini Doğal kefir danesi kullanılarak kefir üretimi yapan Danem Süt ve Süt Ürünl. Gıda Amb. Eğt. Dan. Tic. ve San. Ltd. Şti den (Teknokent Binası, Isparta) Kefirzadem marka (250mL) kefir ücretsiz olarak temin edilmiştir. Çalışmaya katılan gönüllü annelere kefirin muhafaza koşulları anlatılarak, 30 gün boyunca tüketmeleri gereken miktarda kefir, ambalajlı olarak tarafımızca teslim edilmiştir Anne Sütlerinin Temini ve Muhafazası Bu çalışmada Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesinde yeni doğum yapan 15 tane sağlıklı anneden elde edilen anne sütü kullanılmıştır. Çalışmada; 10 tane annenin doğumdan hemen sonra başlanmak üzere, rutin beslenmelerine ek olarak 30 gün boyunca 250 şer ml sabah ve akşam olmak üzere toplam 500 ml kefirle beslenmesi sağlanmış, diğer 5 annenin ise kontrol grubu olarak rutin beslenmelerine devam etmeleri sağlanmıştır. Her iki gruptaki anneden; 10. gün (ilk süt-kolostrum), 20. gün (olgun süt) ve 30. gün sütleri soğuk zincir sağlanarak alınmıştır. Annelere yazılı ve sözlü olarak örnek toplama talimatı anlatılmıştır. Örnek alım günlerinde sütlerini (tarafımızca kendilerine verilen) steril numune kaplarına sağmadan önce, meme ve göğüs uçlarını steril su ve sabunla temizlemeleri istenmiştir. Süt örnekleri, +4 C ve -20 C de gerekli analizler için depolanmıştır Etik Kurul Onayı Çalışma öncesinde Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu tarafından tarih ve 185 sayılı kararla Etik Kurul Onayı alınmıştır (Ek A). Çalışmaya katılmayı kabul eden yeni doğum yapmış gönüllü annelere gerekli bilgiler verilerek, hazırlanan protokol imzalatılmıştır. Gönüllü anne onam formları Ek B de sunulmuştur. 29

43 3.4. Kimyasal Analizler Anne sütlerinde süt kompozisyonunu belirlemek için Ultrasonik Milk Analyser (Milkotester, Bulgaristan) kullanılmıştır. Şekil 3.1. de Ultrasonik Milk Analyzer cihazı gösterilmiştir. Cihazın örnek koyma kabının maksimum çizgisine kadar anne sütleri konularak yüzde kuru madde, yağ, yoğunluk, protein, laktoz ve tuz miktarları hesaplanmıştır. Şekil 3.1. Ultrasonik Milk Analyzer 3.5. Mikrobiyolojik Analizler Anne sütü örneklerinden 1mL alınarak 9 ml peptonlu su içerisinde dilüsyonları hazırlanmıştır. Ön çalışmalarda belirlenen dilüsyonlardan, steril petrilere 1mL örnekler aktarılmıştır. Lactobacillus spp. İçeriği: Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek steril petri kutularına pipetlendikten sonra, 45 C ye kadar soğutulmuş 15 ml Rogosa Agar (Merck) petri kutusuna ilave edilerek, inkübasyon 37 C de 3 gün %6 lik CO2 inkübatörde (CO-150, New Brunswick Scientific, ABD) inkübe edilerek, koloni bulunduran petrilerde sayım yapılmıştır. Lactococcus spp. İçeriği: Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek petri kutularına pipetlendikten sonra, 45 C ye kadar soğutulmuş 15 ml M17 Agar (Merck) petri kutusuna ilave edilerek, inkübasyon 37 C de 3 gün %6 lik CO2 inkübatörde gerçekleştirilerek, koloni bulunduran petrilerde sayım yapılmıştır. Lactobacillus acidophilus İçeriği: Anne sütü örneklerinde, L. acidophilus kolonilerini saymak amacıyla MRS-salisin (Sigma) agar kullanılmıştır. %10 luk 30

44 hazırlanan sorbitol 0,43 µm olan steril filtreden geçirilerek ve 50 C ye kadar soğutularak MRS agar içerisine ilave edilip karıştırılmıştır. Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek, steril petri kutularına alınarak üzerine 15 ml MRSsorbitol agar petri kutusuna ilave edilerek, inkübasyon 37 C de 3 gün %6 lık CO2 inkübatörde gerçekleştirilerek, koloni bulunduran petrilerde sayımlar yapılmıştır. Bifidobacterium spp. İçeriği: Anne sütü örneklerinde, Bifidobacterium spp. kolonilerini saymak amacıyla MRS-NNLP agar seçici besiyeri kullanılmıştır. NNLP karışımı; Neomisin sülfat (Merck) (100 mg/l), nalidisik asit (Merck) (50 mg/l), lityum klorit (Merck) (3000 mg/l), paronomisin sülfat (Merck) (200 mg/l) tartılarak, üzerine 100 ml saf su ilave edilerek ve 35 C karıştırıcıda çözündürülerek, steril filtreden 0,43 µm geçirilmiş, %20 oranında MRS agar içerisine ilave edilmiştir. Hazırlanan örnek dilüsyonlarından 1 ml steril petri kutularına alınarak ve 45 C ye kadar soğutularak, 15 ml MRS-NNLP agara inoküle edildi. İnokülasyon 37 C de 3 gün %6 lık CO2 inkübatörde gerçekleştirilerek koloni bulunduran petrilerde sayım yapılmıştır (Tharmaraj ve Shah, 2003). Enterococcus spp. İçeriği: Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek petri kutularına pipetlendikten sonra, 45 C ye kadar soğutulmuş 15 ml MacConkey Agar (Merck) petri kutusuna ilave edilerek, inkübasyon 37 C de 3 gün %6 lık CO2 inkübatörde gerçekleştirilerek, koloni bulunduran petrilerde sayım yapılmıştır. Toplam Mezofilik Mikroorganizma İçeriği : Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek petri kutularına pipetlendikten sonra, 45 C ye kadar soğutulmuş 15 ml PCA (Merck) petri kutusuna ilave edilerek, inkübasyon 37 C de 3 gün inkübatörde gerçekleştirilerek, koloni bulunduran petrilerde sayım yapılmıştır. Maya-Küf İçeriği: Anne sütü örneklerinde, toplam maya küf miktarını tespit etmek amacıyla Patato Dextrose Agar (LAB) besiyeri kullanılmıştır. PDA, 39 g/l 31

45 olacak şekilde distile su kullanılarak hazırlanan besiyeri 121ᵒC de 15 dk otoklavda sterilize edilmiştir. 45ᵒC ye soğutulan besiyerine %10 luk steril laktik asit çözeltisinden %1.4 ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Hazırlanan dilisyonlardan 1mL steril petri kutularına ilave edilerek, 45ᵒC ye soğutulan besiyerinden 15 ml inoküle edilmiştir. 30ᵒC de saat inkübasyona bırakılmış ve arası gelişme gösteren kolonilerde sayım yapılmıştır. Koliform Grubu Mikroorganizma İçeriği: Anne sütü örneklerinde koliform grubu bakterilerin bulunup bulunmadığını tesbit etmek amacıyla VRB agar (Merck) kullanılmıştır. Dehidre besiyeri olacak şekilde distile su içinde karıştırılarak manyetik karıştırıcıda kaynatılmıştır ve kaynama sıcaklığında 2 dakika bekletilerek 45 C ye soğutulmuştur. Hazırlanan dilisyonlardan 1mL steril petri kutularına ilave edilerek, dökme sıcaklığına soğutulan besiyerinden ilave edilmiştir. 24 saat 37 C de inkübasyona bırakılarak gelişme gösteren kolonilerde sayım yapılmıştır Standart Kültürlerin Hazırlanması Standart kültüler liyofilize olarak DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Almanya) dan temin edilmiştir. Kültür kodları Çizelge 3.1. de sunulmuştur. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan standart kültürler (DSZM, Almanya) Mikroorganizma İzolasyon Gelişme Ortamı DSM No Diğer Koleksiyon No.-WDCM No. Referans Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens Kefir danesi Medium 456, anaerobic, 28ᵒC Medium 1253, anaerobic, 30ᵒC 5016, tip suşu ATCC 43761, JCM 6985 Fujisawa vd., 1988 Lactobacillus parakefiri Kefir danesi Medium 775, anaerobic, 30ᵒC 10551, tip suşu IFO 15890, JCM 8573, NBRC15890 Takizawa vd.,

46 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan standart kültürler (DSZM, Almanya) Lactobacillus kefiri Bifidobacterium bifidum Kefir danesi Emzirilen bebek gaitası Medium 11, 30ᵒC Medium 58, anaerobic, 37ᵒC 20587,tip suşu 20456,tip suşu ATCC 35411, VKM B-2244 ATCC 29521, JCM 1255 Kandler ve Kunath, 1983 Orla- Jensen, 1924 Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Lactobcillus helveticus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus İnsan Medium 232,anaerobic, 37ᵒC 20079, tip suşu Peynir Medium 11, 30ᵒC 20011,tip suşu Emmantel Peyniri Bulgar Yoğurdu Medium 11, mikroaerofilikanaerobic, 37ᵒC Medium 11, mikroaerofilikanaerobic, 37ᵒC 20075, tip suşu 20081, tip suşu ATCC 4356, NCDO1748, NCIB 8690, WDCM ATCC 393, NCDO 161, WDCM ATCC ATCC 11842, NCDO 1489, WDCM Hasen ve Mocquot, 1970 Hansen ve Lessel, 1971 Bergey vd., 1925 Weiss vd., 1983 Liyofilize kültürlerin aktifleştirilme aşamaları aşağıdaki gibidir. Steril kabinde bunzen beki alevi açılarak oksijensiz ortam sağlanmıştır. Kırma işleminde kullanılacak malzemeler steril edilmiştir (1). Kültürlerin bulunduğu cam tüpler hafifçe alevden geçirilmiş (2) ve üzerine steril su damlatılarak tüpün çatlaması sağlanmıştır (3). Çatlayan camın üst kısmı steril cımbızla kırılmıştır (4). Tüplerin içerisindeki pamuk çıkarılarak içerisine 0,5 ml Nutrient Broth eklenmiştir ve çıkarılan pamuk tekrar tüpün içerisine konulmuştur. Kültürler, aktifleştirme için 30 dk inkübasyona bırakılmıştır (5). Kültürlerin tüm aşamaları ilgili numaralarla Şekil 3.2. de sunulmuştur. Her mikroorganizma kültürü için hem katı besiyeri hem de sıvı besiyeri hazırlanarak uygun koşullarda inkübasyon gerçekleştirilmiştir (Çizelge 3.2.). 33

47 (1) (2) (3) (4) (5) Şekil 3.2. Kültürlerin aktifleştirilme aşamaları Çizelge 3.2. Kültürlerin gelişme koşulları Mikroorganizma Besiyeri ph Sıcaklık İnkübasyon O 2 İstekleri Süresi L. kefiranofaciens MRS 6,2-6,5 30ᵒC saat Anaerob L. parakefiri MRS 6,2-6,5 37ᵒC saat Anaerob L. kefiri MRS 6,2-6,5 30ᵒC saat Aerob L. helveticus MRS 6,2-6,5 37ᵒC saat Anaerob L. bulgaricus MRS 6,2-6,5 37ᵒC saat Anaerob L. acidophilus MRS 6,2-6,5 37ᵒC saat Anaerob L. casei MRS 6,2-6,5 30ᵒC saat Aerob B. bifidum MRS 6,2-6,5 37ᵒC saat Anaerob Şekil 3.3. te Farklı besiyerleri kullanılarak ekimleri yapılan kültürlerinin inkübasyondan sonraki koloni görüntüleri verilmiştir. 34

48 Şekil 3.3. Aktifleştirilen kültürlerin ekim sonucu elde edilen kolonileri 3.7. DNA İzolasyonu Real-Time PCR da kullanılmak üzere anne sütlerinden, kefirden ve kültürlerden DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Örneklerden DNA izolasyonu için Qiagen DNA izolasyon kitleri (Qiagen, Almanya) kullanılmıştır. Elde edilen izolatların konsntrasyonları NanoDrop cihazı (Thermo, ABD) ile belirlenmiştir Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin DNA izolasyonu Kefirden DNA izolasyonu için Mericon Food Kit (Qiagen, Almanya) protokolü uygulanmıştır. Mericon Food Kit (Qiagen, Almanya) Protokol 1)200 µl örnek tüpe konulmuştur. 1 ml Food Lizis tamponu ve 2.5 µl Proteinaz K solüsyonu eklenerek vortekslenmiştir. 2)Mix, termomikserde 30 dk 60ᵒC de ve sabit çalkalamada 1000 rpm de inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda elde edilen mix buz üzerine alınarak oda sıcaklığına (15-25ᵒC) soğutulmuştur. 3)5 dk 2.500xg de santrifüj edilmiştir. 35

49 4)500 µl Kloroform 2 ml lik mikrosantrifüj tüpüne pipetlenmiştir. 5)Tüpün dibindeki çözeltiyi bozmadan basamak 3 teki herbir lizis tüpünden maksimum süpernatant alınmıştır. 6) Kloroform içeren mikrosantrifüj tüpüne 700 µl süpernatant transfer edilmiştir. 7)Basamak 6 dan gelen mikrosantrifüj tüpü 15 s vortekslenmiştir. Vortekslenen tüp xg de 15 dk santrifüj edilmiştir. 8)350 µl PB tamponu temiz bir mikrosantrifüj tüpüne pipetlenmiş ve basamak 7 nin üst fazından 350 µl bu tüpe eklenerek vortekslenmiştir. 9)2 ml lik toplama tüpü içindeki QIAguick spin kolona basamak 8 den solüsyon eklenerek xg de 1 dk santrifüj edilmiştir. İçindeki fitre atılarak toplama tüpü basamak 10 da tekrar kullanılmıştır. 10)500 µl AW2 tamponu QIAguick spin kolona eklenerek xg de 1 dk santrifüj edilmiştir. Membranı kurutmak için xg de 1 dk santrifüj edilmiştir. 11)QIAguick spin kolonun altına temiz bir 2 ml lik mikrosantrifüj tüpü takılmıştır. QIAguick spin kolonun membranına 150 µl EB tamponu eklenerek 1 dk oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda eluate elde etmek için xg de 1 dk santrifüj edilmiştir. Elde edilen DNA izolatları Real-Time PCR analizi için -20ᵒC de muhafaza edilmiştir Standart kültürlerin DNA izolasyonu Standart kültürlerden DNA izolasyonu için DNeasy Blood&Tissue Kit (Qıagen, Almanya) kullanılmıştır. Gram pozitif mikroorganizmalar için uygun olan protokol uygulanmıştır. DNeasy Blood&Tissue Kit (Qıagen, Almanya) Protokol 1)Standart kültürler max 2x10 9 hücre içerecek şekilde McFarland (Biosan) ayarlanmıştır. Ayarlanan kültürler 2 ml lik mikrosantrifüj tüpünde 10 dk 5000xg (7500 rpm) de santrifüj edilerek süpernatantı atılmıştır. 36

50 2)Pellete 180 µl enzimatik lizis tamponu eklenmiştir. 3)Elde edilen mix 37ᵒC de 30 dk su banyosunda inkübasyona bırakılmıştır. 4)Mixe 25 µl Proteinaz K ve 200 µl AL tamponu eklenerek vortekslenmiştir. 5)Elde edilen mix 56ᵒC de 30 dk su banyosunda inkübasyona bırakılmıştır. 6)Mixe 200 µl etanol (%96-100) eklenerek vortekslenmiştir. 7)Mix spin kolona yüklenerek 6000xg (8000 rpm) de 1 dk vortekslenmiştir. 8)Yeni bir toplama tüpü takılarak 500 µl AW1 pipetlenerek 1 dk 6000xg (8000 rpm) de 1 dk vortekslenmiştir. Filtrat atılmıştır. 9)Yeni bir toplama tüpü takılarak 500 µl AW2 pipetlenerek 3 dk 20000xg de santrifüj edilmiştir. Filtrat atılmıştır. 10)2 ml lik mikrosantrifüj tüpü spin kolonun altına takılarak 200 µl AE tamponu eklenerek oda sıcaklığında 1 dk inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda tüpün ağzı kapatılarak 6000xg (8000 rpm) de 1 dk santrifüj edilmiştir. Elde edilen DNA izolatlar Real-Time PCR analizi için -20ᵒC de muhafaza edilmiştir. Protokolde belirtilen enzimatik lizis tamponunun hazırlanması 20 mm Tris-Cl, ph=8.0 2 mm sodium EDTA 1.2 % Triton X-100 Lizozim (20 mg/ml) (Kullanmadan önce çözeltiye eklenmiştir.) Anne sütlerinin DNA izolasyonu 200 µl anne sütü örnekleri 2 ml lik mikrosantrifüj tüpüne alınarak içerisine 1 adet stainless steel beads (5 mm) (paslanmaz çelik boncuk) (Qiagen, Almanya) kullanılmıştır. Tüplerin kapakları kapatılarak TissueLyser Lt (Qiagen, Almanya) nin kuyucuklarına yerleştilerek ve 50 Hz de 15 dk homojenize edilmişlerdir. Anne sütü örneklerinin içerisindeki paslanmaz çelik boncuklar çıkarılarak, QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen, Almanya) protokolü uygulanarak DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Anne sütü izolasyonu için farklı kitler ve yöntemler denenmiş, uygun DNA izolatı oldukça zor sağlanmıştır. Anne sütü profili ve DNA yapının kazanımını çok zor sağlamıştır. 37

51 Aşağıda belirtilen QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen, Almanya) Protokolü uygulanmıştır. 1)2 ml lik mikrosantrifüj tüpüne 20 µl proteinaz K ilave edilmiştir. 2)200µl anne sütü örneği, proteinaz K içeren tüpe ilave edilmiştir. 200µL PBS ilave edilmiştir. 3)100µl VXL tamponu ilave edilmiştir. 4)20-25 C de 15 dk inkübasyona bırakılmıştır. 5)Kapaktaki damlaları indirmek için kısa süreli santrifüj yapılmıştır. 6)Karışıma 350 µl ACB tamponu ilave edilerek tam hızda vorteksleme yapılmıştır. 7)Kapaktaki damlaları indirmek için kısa süreli santrifüj yapılmıştır. 8)Lisat, 2 ml lik toplama tüpü takılı olan QIAamp Mini kolon a transfer edilmiştir, kolonun kapağı kapatılarak 6000xg (8000 rpm) de 1 dk santrifüj edilmiştir. Toplama tüpüne biriken filtrat atılarak, QIAamp mini kolona 2 ml lik yeni bir toplama tüpü takılmıştır. 9)600 µl AW1 tamponu ilave edilerek 6000xg (8000 rpm) de 1dk santrifüj edilmiştir. QIAamp mini kolona temiz bir 2mL lik toplama tüpü takılarak, filtrat atılmıştır. 10)600 µl AW2 tamponu ilave edilerek 6000xg (8000 rpm) de 1dk santrifüj edilmiştir. QIAamp mini kolona temiz bir 2 ml lik toplama tüpü takılarak, filtrat atılmıştır. 11)QIAamp mini kolona yeni bir toplama tüpü takılarak xg ( rpm) de 2 dk santrifüj edilmiştir. Toplama tüpünde biriken filtrat atılmıştır. 12)QIAamp mini kolona temiz 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpü takılarak, µl AVE tamponu membrana ilave edilerek oda sıcaklığında 1 dk inkübasyona bırakılmıştır. 13)20,000xg (14,000 rpm) de santrifüj edilmiştir. Elde edilen DNA izolatlarının kapakları parafilmle sarılmış ve Real-Time PCR analizi için -20 C de muhafaza edilmiştir Real-Time PCR Analizi Mikroorganizmanın Real Time PCR ile deteksiyonu için CFX Connect System, Bio- Rad (Hercules, California, ABD) taqman probları ve bu probların içine alan 38

52 spesifik primerler (Oligomer, Turkey) kullanıldı (Bölüm ). Real-Time PCR için kullanılan miks ve PCR koşulları (Bölüm ) tüm organizmalar için ortak dizayn edildi. Sonuçlar Real-Time PCR çalışmasının yapıldığı CFX Connect System Bio-Rad (Hercules, California, ABD) cihazının analiz programı CFX Manager software (Win 8 PDF Reader, Microsoft Office Suite 2003/2007/2010/2013) ile Cq değeri ve log değeri olarak hesaplandı. Bu analiz için cihaz ve kullanılan enzim gibi sarflar Danem Süt ve Süt Ürünleri Ar-Ge Laboratuvarı ndan sağlanmıştır Primer seçimi Çalışmada kullanılan primerler, standart suşlar ve baz dizileri kaynakları ile birlikte ayrıntılı olarak Çizelge 3.3. te verilmiştir. Çizelge 3.3. Primerlerin özellikleri Hedef Mikroorganizma Primerler Baz Dizisi (5'-3') Standart Suşlar Laktik asit bakterileri WLAB1 TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA Lactobacillus WLAB2 TCGAATTAAACCACATGCTCCA acidophilus ATCC4357 Bifidobacterium spp g-bifid-f CTCCTGGAAACGGGTGG Bifidobacterium g-bifid-r GGTGTTCTTCCCGATATCTACA bifidum ATCC29521 DSMno:20456 Streptococcus spp Str1 GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC Streptococcus Str2 ACGTTCGATTTCATCACGTTG thermophilus L. kefiranofaciens LKF_KU504F CAGTTCGCATGAACAGCTTTTAA L. LKF_KU504R GCACCGCGGGTCCAT kefiranofaciens ATCC43761 (DSM no:5016) L. parakefiri LK_508F GGAGATGCCCACGTTGGC L. parakefiri LK_508R TCTCAAGCGCTCCGGAAACTC IFO15890 (DSMno:10551) Referans Lopez vd., 2003 Kök Taş vd., 2012 Picard vd., 2004 Kim vd Kim vd

53 Çizelge 3.3. Primerlerin özellikleri L. kefiri LK_508F GGGAGATGCCCATGTTGGT L. kefiri Kim vd LK_508R AAGCTTTCGAAGTGCCTGTGA ATCC35411 (DSMno:20587) L. acidophilus La1 GATCGCATGATCAGCTTATA L. acidophilus Furet vd., La2 AGTCTCTCAACTCGGCTATG ATCC (DSMno:20079) L. casei Lc1 GTGCTTGCACTGAGATTCGACTTA L. casei Furet vd., Lc2 TGCGGTTCTTGGATCTATGCG ATCC (DSMno:20011) L. helveticus KP GGTGATGCTCATGTAGGT L. helveticus Kim vd KP AAGCTTACGTAAAGCTTGACT ATCC15009 (DSMno:20075) S. thermophilus St1 St2 L. bulgaricus Ld1 Ld2 TTATTTGAAAGGGGCAATTGCT GTGAACTTTCCACTCTCACAC ACATGAATCGCATGATTCAAG AACTCGGCTACGCATCATTG S. thermophilus Furet vd., 2004 L. bulgaricus Furet vd., ATCC (DSMno:20081) B. bifidum BiBIF-1 CCACATGATCGCATGTGATGT B.bifidum Garbers vd., BiBIF-2 CCGAAGGCTTGCTCCCAAA ATCC ; (DSMno:20456) Muyzer, Real-Time PCR koşullarının optimizasyonu Tüm standart kültürler için ayrı ayrı optimizasyon çalışması yapılmıştır. Aşağıda her kültür için analizde kullanılan bileşen miktarları ve cihazın çalışma koşulları sunulmuştur (Çizelge 3.4). Çalışmada Sybr Green Supermix (Bio-Rad, ABD) enzimi kullanılmıştır. Çizelge 3.4. Bileşen miktarları ve çalışma koşulları Lactobacillus kefiranofaciens (0,5 konsantrasyon) Lactobacillus parakefiri (0,5 konsantrasyon) Lactobacillus kefiri (0,5 konsantrasyon) Lactobacillus bulgaricus (0,5 konsantrasyon) 1x 2x Lactobacillus helveticus (0,5 konsantrasyon) Bifidobacterium spp. (0,5 konsantrasyon) Bifidobacterium bifidum (0,5 konsantrasyon) Streptococcus spp. (0,5 konsantrasyon) Distile su 5,5 µl - Primers (F * +R * ) 2 µl 1 µl Master mix 10 µl 20 µl Örnek 2,5 µl - Toplam 20 µl - F * :Forward primer R * :Reverce primer (Her iki primerdende eşit miktarda kullanılmıştır. 40

54 Çizelge 3.4. Bileşen miktarları ve çalışma koşulları Lactobacillus spp. (0,3 konsantrasyon) Lactobacillus acidophilus (0,3 konsantrasyon) 1x 2x Lactobacillus casei (0,3 konsantrasyon) Distile su 6,3 µl - Primers(F+R) 1,2 µl 0,6 µl Master mix 10 µl 20 µl Örnek 2,5µL - Toplam 20 µl - F * :Forward primer R * :Reverce primer (Her iki primerdende eşit miktarda kullanılmıştır.) Lactobacillus kefiranofaciens ın çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 3 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 60 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye Lactobacillus parakefiri nin çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 10 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 62 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye Lactobacillus kefiri nin çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 10 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 60 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye Lactobacillus spp. nin çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 10 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 64 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye Lactobacillus bulgaricus un çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 10 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 59 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye 41

55 Çizelge 3.4. Bileşen miktarları ve çalışma koşulları Lactobacillus acidophilus un çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 10 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 54 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye Lactobacillus helveticus un çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 10 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 57 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye Lactobacillus casei in çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 10 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 63 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye Bifidobacterium spp.ve Bifidobacterium bifidum Streptococcus spp. ve Streptococcus thermophilus un çalışma aşamaları İnkübasyon için 95 C 10 dakika Denatürasyon için 95 C 15 saniye 40 kez Annealing için 60 C 60 saniye Uzatma için 65 C 1 saniye 3.9. İstatistiksel Analizler Tüm istatistiksel analizler IBM SPSS v (Statistical Packages for Social Sciences) bilgisayar programı kullanılarak yapılmıştır. Veriler kefir tüketen anneler grubu ve kontrol grubu göre karşılaştırılmıştır. Gruplar arası fark analizlerinde, parametrik koşullarda One-Way ANOVA testi, nonparametrik koşullarda ise Kruskal Wallis testi uygulanmıştır ve p<0,05 anlamlı kabul edilmiştir. 42

56 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Kimyasal Analiz Sonuçları Kefir tüketen grubunda ve kontrol grubunda anne sütlerinin günlere göre kimyasal kompozisyonlarının değişimi Çizelge 4.1. de verilmiştir. Çizelge 4.1. Anne sütlerinin kimyasal kompozisyonları Sütun1 Gün Yağ YKM Yoğunluk Protein Laktoz Tuz (%) (%) (%) (%) (%) (%) Kefir Tüketen Grup 10 4,0 9,8 33,2 3,6 5,4 0,8 20 3,7 9,9 33,3 3,6 5,4 0,8 30 4,1 9,7 32,6 3,5 5,3 0,7 Kontrol Grubu 10 4,0 9,3 31,2 3,4 4,9 0,7 20 3,4 10,0 34,1 3,6 5,4 0,8 30 3,5 9,3 31,8 3,4 5,1 0,7 Anne sütlerinin günlere göre yağ, kuru madde (%), yoğunluk (%), protein (%), laktoz (%) ve tuz miktarları (%) her iki gruptada benzer değerlerde bulunmuştur. Anne sütlerinin yağ oranları %3,5-4,0; kuru maddeleri %9,3-10; yoğunlukları %31,8-34,1; protein miktarları %3,4-3,6; laktoz miktarları %4,9-5,4; tuz miktarları %0,7-0,8 arasında bulunmuştur. Her iki grubun anne sütü örneklerininlerinin kimyasal kompozisyonlarında anlamlı bir fark görülmemiştir. Yağ oranı kontrol grubunda azalarak devam etmişken, kefir tüketen grupta 10. ve 30. günde istatistiksel farklılık görünmemektedir. Aynı benzerlik protein değerlerinde de belirlenmiştir. Ayrıca laktoz içeriği kefir tüketen grupta stabil iken kontrol grubunda günler arasında farklılıklar devam etmiştir Anne Sütü Mikrobiyolojik Analiz Sonuçları Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Lactobacillus spp. nin log kob/ml içeriği Şekil 4.1. de gösterilmiştir. 43

57 Lactobacillus spp. log kob/ml Kefir Tüketen Grup Kontrol Grup 3,64 3,62 3,52 2,62 3,58 2, Gün Şekil 4.1. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki Lactobacillus spp. içeriği annelerin sütlerinin Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Lactobacillus spp. içerikleri karşılaştırıldığında; 10. gün örneklerinde kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Lactobacillus spp. içeriği kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinden yüksek iken, 20. gün ve 30. gün süt örneklerinde kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Lacatobacillus spp. içeriği istatistiksel olarak yüksek bulunmuştur (P<0,05). Kefir tüketen anne grubuna ait süt örneklerinin Lactobacillus spp. içeriği 10. gün 3,62 log kob/ml, 20. gün 3,52 log kob/ml, 30. gün 3,58 log kob/ml; kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Lactobacillus spp. içeriği 10. gün 3,64 log kob/ml, 20. gün 2,62 log kob/ml, 30. gün 2,74 log kob/ml olarak bulunmuştur (P<0,05). Solis vd. (2010) yaptıkları çalışmada anne sütü ile beslenen sağlıklı bebeklerin anne sütü ile birlikte Staphylococcus, Streptococcus, Bifidobacterium ve Lactobacillus türü bakterileri de aldığını bildirmişlerdir. Yaptığımız çalışmada anne sütlerinin hepsinde günlere göre değişen miktarlarda Lactobacillus spp. içeriği belirlenmiştir. Kefir tüketen anne grubunun süt örneklerinde Lactobacillus spp. içeriğinin yüksek olmasının sebebinin annelerin probiyotik içerikli beslenmesi ve kefir tüketimin olumlu etkisinin olduğunu düşündürmektedir. 44

58 Streptococcus spp. log kob/ml Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Streptococcus spp. nin log kob/ml içeriği Şekil 4.2. de gösterilmiştir. Kefir Tüketen Grup Kontrol Grup 4,27 4,03 3,90 2,87 2,72 2, Gün Şekil 4.2. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki Streptococcus spp. içeriği annelerin sütlerinin Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Streptococcus spp. içerikleri karşılaştırıldığında; kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinden Streptococcus spp. içeriğinden yüksek bulunmuştur (P<0,05). Kefir tüketen anne grubuna ait süt örneklerinin Streptococcus spp. içeriği 10. gün 4,27 log kob/ml, 20. gün 4,03 log kob/ml, 30. gün 3,90 log kob/ml; kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Streptococcus spp. içeriği 10. gün 2,87 log kob/ml, 20. gün 2,72 log kob/ml, 30. gün 2,61 log kob/ml olarak bulunmuş, kontrol grubunun günlere göre değişimi anlamlı bulunmamıştır (P>0,05). Mehanna vd., (2013) yaptıkları çalışmada Mısır da yaşayan annelerin sütlerinden; Streptococcus spp., Lactobacillus spp. ve Enterococcus spp. gibi laktik asit bakterilerinin izolasyonu gerçekleştirerek cins düzeyinde tanımlama yapmışlardır. Laktik asit kokları arasında en baskın türün Enterococcus facium (3 suşu) un olduğunu ve bunu Lactococcus lactis (2 suş) izlediğini bildirmişlerdir. Yaptığımız çalışmada her iki anne grubunun süt örneklerinde de Streptococcus spp. izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Streptococcus spp. içeriğinin kefir tüketen anne grubunun süt örneklerinde, kontrol grubu annelerin süt örneklerine göre 45

59 Lactobacillus acidophilus kob log/ml yüksek bulunmasının sebebinin kefir tüketimiyle probiyotik mikroorganizma içeriğinin artması olarak yorumlanmıştır. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Lactobacillus acidophilus spp. nin log kob/ml içeriği Şekil 4.3. te gösterilmiştir. Kefir Tüketen Grup Kontrol Grup 3,65 3,53 3,62 3,60 2,70 2, Gün Şekil 4.3. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Lactobacillus acidophilus içeriği Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Lactobacillus acidophilus içeriği kontrol grubundaki annelerin süt örneklerine göre yüksek bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Lactobacillus acidophilus içeriği 10. gün 3,65 log kob/ml, 20. gün 3,62 log kob/ml, 30.gün 3,60 log kob/ml; kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Lactobacillus acidophilus içeriği 10. gün 3,53 log kob/ml, 20. Gün 2,70 log kob/ml, 30. gün 2,78 log kob/ml olarak bulunmuştur. 10. gün iki gruptaki süt Lactobacillus acidophilus içeriği önemli farklılık göstermezken (P>0,05), ilerleyen günlerde kontrol grubunda bulunan azalma kefir içen annelerde içeriği koruduğu gözlemlenmiştir. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Bifidobacterium spp. un log kob/ml içeriği Şekil 4.4. te gösterilmiştir. 46

60 Bifidobacterium spp. kob log/ml Kefir Tüketen Grup Kontrol Grup 2,52 2,28 2,87 3,15 2,67 1, Gün Şekil 4.4. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki Bifidobacterium spp. içeriği annelerin sütlerinin Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Bifidobacterium spp. içeriği, kontrol grubundaki annelerin süt örneklerine göre yüksek bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Bifidobacterium spp. içeriği 10. gün 2,52 log kob/ml, 20. gün 2,87 log kob/ml, 30. gün 3,15 log kob/ml; kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Bifidobacterium spp. içeriği 10. gün 2,28 log kob/ml, 20. gün 1,00 log kob/ml, 30. gün 2,67 log kob/ml olarak bulunmuştur. Martin vd., (2009) yaptıkları araştırmada anne sütlerinde Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve bulunduğunu bildirmişlerdir. Gueimonde vd., (2007) anne sütü örneklerinin Bifidobacterium spp. içerdiğini, en yaygın türünün Bifidobacterium longum olduğunu ve Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum ve Bifidobacterium catenulatum un onu takip ettiğini bildirmişlerdir. Yaptığımız çalışmada her iki grubun anne sütü örneğinde Bifidobacterium spp. içeriği belirlenmiş ve çalışmamız yapılan diğer araştırmalarla paralelik göstermiştir. 47

61 Enterococcus spp.log kob/ml Kefir tüketen grubundaki ve kontrol grubundaki annelerin sütlerinin Enterococcus spp. log kob/ml içeriği Şekil 4.5. te gösterilmiştir. 2,74 2,83 2,19 Kefir Tüketen Grup Kontrol Grup 3,11 2,75 2, Gün Şekil 4.5. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Enterococcus spp. içeriği Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Enterococcus spp. içeriği kontrol grubundaki annelerin süt örneklerine göre yüksek bulunmuştur. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinin Enterococcus spp. içeriği 10. gün 2,74 log kob/ml, 20. gün 2,83 log kob/ml, 30. gün 3,11 log kob/ml; kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Enterococcus spp. içeriği 10. gün 2,19 log kob/ml, 20. gün 2,75 log kob/ml, 30. gün 2,49 log kob/ml olarak bulunmuştur. Bazı annelerin süt örneklerinde koliform grubu bakteri içeriği 7 log kob/ml düzeyinde bulunmuş ve özellikle annelerin kefir tüketimine devam etmeleri belirtilerek 4 log kob/ml değerlerine azaldığı tespit edilmiştir. Anne sütü kalitesinin artırılması için doğal probiyotik desteği olan kefir bu anlamda etkili olmuştur. Martin vd., (2003) yaptıkları çalışmada anne sütünün, potansiyel probiyotik özellikli mikroorganizmaları incelemişler kok şekilli laktik asit bakterilerini Enterococcus faecium olarak tanımlamışlardır. Yaptığımız çalışmada anne sütü 48

62 Toplam Mezofilik M.O log kob/ml örneklerinin her iki grubundada Enterococcus spp. içeriği belirlenmiştir. Cins düzeyinde tanımlama yapılmamıştır Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Toplam Mezofilik Mikroorganizma içeriği Şekil 4.6. da verilmiştir. 4,57 Kefir Tüketen Grup Kontrol Grup 4,09 2,65 2,78 4,56 2, Gün Şekil 4.6. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin toplam mezofilik mikroorganizma içeriği Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Toplam Mezofilik Mikroorganizma içeriği, kontrol grubundaki annelerin süt örneklerine göre yüksek bulunmuştur. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinin toplam mezofilik mikroorganizma içeriği 10. gün 4,57 log kob/ml, 20. gün 4,09 log kob/ml, 30. gün 4,56 log kob/ml; kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin toplam mezofilik mikroorganizma içeriği 10. gün 2,65 log kob/ml, 20. gün 2,78 log kob/ml, 30. gün 2,70 log kob/ml olarak bulunmuştur. LaTuga vd. (2014) anne sütünde en yaygın olarak Stapylacoccus spp., Streptococcus spp., Veillonella spp., Gemella spp., Enterococcus spp., Clostridia spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Propionibacterium spp., Actinomyces spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas spp., Sphingomonas spp., Serratia spp., Escherichia spp., Enterobacter spp., Ralstonia spp., Bradyrhizobium spp. ve Prevotella spp. gibi mikroorganizmaların saptandığını ifade etmektedir. Yaptığımız çalışmada her iki gruptaki anne sütü örneklerinden toplam mezofilik mikroorganizma izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Kefir tüketen anne sütü 49

63 örneklerinin toplam mezofilik mikroorganizma içeriği, kontrol grubu anne sütü örneklerine göre yüksek bulunmuştur. Annelerin beslenmesine ek olarak probiyotik mikroorganizmalarca zengin içeriğe sahip olan kefirin dahil edilmesinin, toplam mezofilik mikroorganzima sayısını arttırdığı sonucunu desteklemektedir. Yapılan araştırmalar anne sütü mikrobiyotasının yapısını etkileyen en önemli etmenlerin; yaşanılan çevre, annenin sağlık durumu, obezite, atopi, diyet, immünolojik durum, doğum şekli, gestasyonel yaş, antibiyotik kullanımı ve laktasyon aşaması olduğunu ortaya koymaktadır (Cabrera-Rubio vd., 2012; LaTuga vd., 2014; Khodayar-Pardo vd., 2014; Mueller vd.,2015; Boix-Amorós vd. 2016). Yaptığımız çalışmada genel olarak kefir tüketen anne grubunun süt örneklerinin mikroorganizma içeriğinin, kontrol grubu annelerin süt içeriğine göre yüksek bulunması anne sütü mikrobiyotasının beslenme şeklinden etkilendiğini doğrulamaktadır DNA İzolasyon Sonuçları Elde edilen DNA örnekleri -20 de saklanmıştır ve PCR analizi için çözdürülerek kullanılmışlardır. İzolatların DNA konsantrasyonları 55,1-15,5 ng/µl aralığında A(260/280) 1,80-2,00 saflıkta elde edilmiştir Real-Time PCR Analiz Sonuçları Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens a ait spesifik primerler kullanılarak analiz edilmiştir. Standart kurve Şekil 4.7. de sunulmuştur. Şekil 4.7. Lactobacillus kefiranofaciens e ait standart kurve 50

64 Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Lactobacillus kefiranofaciens içeriği ve Cq değeri Çizelge 4.2 de verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin L. kefiranofaciens içerikleri 3,55 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinde L. kefiranofaciens tespit edilememiştir. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin L. kefiranofaciens içerikleri 10. gün, 2,05 log kob/ml; 20. gün, 2,03 log kob/ml; 30. gün, 2,27 log kob/ml olarak bulunmuştur (P>0,05). Çizelge 4.2. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus kefiranofaciens içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Lactobacillus kefiranofaciens Günler Cq log kob/ml Kefir - 31,20 3,55±0,69 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 33,78 2,05±0, ,82 2,03±0, ,08 2,27±0, Kefire özgü probiyotik mikroorganizmaların kontrol grubunun süt örneklerinde bulunmayıp kefir tüketen grubun süt örneklerinde bulunması, annenin beslenmesine bağlı olarak bu önemli probiyotik mikroorganizmaların anne sütüne transfer edildiğini göstermektedir. Lactobacillus parakefiri ye ait spesifik primer kullanılarak analiz edilmiştir. Standart kurve Şekil 4.8. de sunulmuştur. 51

65 Şekil 4.8. Lactobacillus parakefiri ye ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Lactobacillus parakefiri içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.3. te verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin L. parakefiri içerikleri 5,78 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefire özgü bakterilerden L. parakefiri içerik olarak en yüksek bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinde L. parakefiri tespit edilememiştir. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin L. parakefiri içerikleri 10. gün, 5,28 log kob/ml; 20. gün, 5,03 log kob/ml; 30. gün, 4,94 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge 4.3. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus parakefiri içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Lactobacillus parakefiri Günler Cq log kob/ml Kefir - 33,46 5,78±0,19 Kefir tüketen grup 10 33,40 5,28±0, ,50 5,03±0, ,88 4,94±0, Kontrol grup Kefire özgü probiyotik mikroorganizmaların kontrol grubunun süt örneklerinde bulunmayıp kefir tüketen grubun süt örneklerinde bulunması, anne 52

66 beslenmesiyle probiyotik mikroorganizmaların anne sütüne transfer edildiğini göstermektedir. Lactobacillus kefiri ye ait spesifik primer kullanılarak analiz edilmiştir. Standart kurve Şekil 4.9. da sunulmuştur. Şekil 4.9. Lactobacillus kefiri ye ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Lactobacillus kefiri içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.4. te verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin L. kefiri içerikleri 3,25 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinde L. kefiri tespit edilememiştir. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinde L. kefiri içerikleri 10. gün, 2,11 log kob/ml; 20. gün, 1,72 log kob/ml; 30. gün, 1,64 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge 4.4. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus kefiri içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Lactobacillus kefiri Günler Cq log kob/ml Kefir - 32,26 3,25±0,20 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 34,55 2,11±0, ,93 1,72±0, ,22 1,64±0,

67 log kob/ml Kefire özgü probiyotik mikroorganizmaların kontrol grubunun süt örneklerinde bulunmayıp kefir tüketen grubun süt örneklerinde bulunması, annenin beslenmesiyle bu önemli probiyotik mikroorganizmaların anne sütüne transfer edildiğini göstermektedir. Abrahamsson vd., (2008) probiyotik özelliklere sahip Lactobacillus reuteri ile oral takviye sonrası anne sütündeki, anne ve bebek gaitalarındaki L. reuteri nin prevalansını etkileyen faktörleri incelemişlerdir. L. reuteri prevalansı, yaşamın ilk yıllarında oral takviye alanların gaitalarında plasebo uygulanların gaitalarına göre daha yüksek bulunmuştur. En yüksek prevalans 5 ile 6 günlükken kaydedilmiştir (tedavi grubunda %82; plasebo grubunda %20, P<0,001). Kolostrum örneklerinde Lactobacillus reuteri sırasıyla %12 ve %2'den izole edilmiştir (P<0,05). Yapılan çalışmalar anne sütüne bakteri transferini doğrulamakta ve yaptığımız araştırma da onlarla paralellik göstermektedir. Kefir tüken grubundaki annelerin sütlerinin L. kefiranofaciens, L. kefiri ve L. parakefiri içeriğinin günlere göre değişimi Şekil da verilmiştir. 120% L. kefiranofaciens L. kefiri L. parakefiri 100% 80% 60% 40% 20% 0% Gün Şekil Kefir tüken grubundaki annelerin sütlerinin L. kefiranofaciens, L. kefiri ve L. parakefiri içeriği Perez vd., (2007) yaptıkları çalışmada anne sütü ve maternal periferik mononükleer hücreler arasında benzer bakteriyel DNA saptamışlar ve 54

68 bakterilerin intraselüler olarak bağırsaktan meme bezine taşındığı tespit etmişlerdir. Makino vd., (2011) spesifik bakteri türlerinin izolasyonu ile yaptıkları kültür bağımsız çalışmalarda maternal bağırsak ve bebek bağırsağı arasında Bifidobacterium spp. transferinin olduğunu gözlemlerken, Jimenez vd., (2008c) anneye oral olarak verilen Lactobacillus spp. nin anne sütüne geçtiğini bildirmişlerdir. Yaptığımız çalışmada, doğal kefir danesinden üretilen kefire özgü mikroorganizmalar olan L. kefiranofaciens, L. kefiri ve L. parakefiri nin kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerine geçtiği tespit edilmiştir. Normalde anne sütünde bulunmayan, kefirin doğal mikroflorasında yer alan probiyotik özellikli, spesifik mikroorganizmaların kefir tüketimiyle birlikte anne sütlerine geçtiği gözlenmiştir. Kefir tüketmeyen kontrol grubu anne sütü örneklerinde bu mikroorganizmalara rastlanmamıştır. Yaptığımız çalışma, anne sütüne mikroorganizma transferinin olduğunu doğrulayan araştırmalarla paralellik göstermektedir. Lactobacillus acidophilus a ait spesifik primer kullanılarak analiz edilmiştir. Standart kurve Şekil de sunulmuştur. Şekil Lactobacillus acidophilus a ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Lactobacillus acidophilus içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.5. te verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerdeki L. acidophilus içeriği 1,56 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin L. acidophilus içerikleri 10. gün, 0,98 log 55

69 kob/ml; 20. gün, 1,06 log kob/ml; 30. gün, 1,02 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin L. acidophilus içerikleri 10. gün, 1,25 log kob/ml; 20. gün, 0,87 log kob/ml; 30. gün, 1,04 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge 4.5. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus acidophilus içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Lactobacillus acidophilus Günler Cq log kob/ml Kefir - 36,31 1,56±0,22 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 38,52 0,98±0, ,89 1,06±0, ,64 1,02±0, ,59 1,25±0, ,78 0,87±0, ,34 1,04±0,35 Simpson vd., (2017) yaptıkları çalışmada doğumdan 4 hafta önce ve doğumdan sonra 3 ay annelere Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus La-5 ve Bifidobacterium animalis ssp. lactis Bb-12 içeren probiyotik takviye vermişlerdir. Anneye verilen takviyelerin emzirme sırasında aktarımının anne sütü mikrobiyotasının genel bileşimini önemli ölçüde etkilemediğini gözlemlemişlerdir. Yaptığımız çalışmada L. acidophilus miktarının iki gruptaki anne sütü örneğinde de benzer şekilde bulunması Simpson vd. (2017) çalışmasıyla paralellik göstermiştir. Bu da annelerin beslenmesine dahil edilen kefirden annes sütüne L. acidophilus geçişinin çok fazla olmadığını düşündürmektedir. Lactobacillus casei ye ait spesifik primerler kullanılarak analiz edilmiştir. Standart kurve Şekil de sunulmuştur. 56

70 Şekil Lactobacillus casei ye ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Lactobacillus casei içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.6. da verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin L. casei içeriği 0,99 kob log/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin L. casei içerikleri 10. gün, 1,15 log kob/ml; 20. gün, 0,73 log kob/ml olarak bulunmuştur. Bu gruptaki anne sütlerinin 30. gününde L. casei tespit edilememiştir. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin L. casei içeriği sadece 10. gün, 1,61 log kob/ml olarak bulunmuştur ve bu gruptaki anne sütü örneklerinin 20. ve 30. günlerinde L. casei ye rastlanmamıştır. Çizelge 4.6. Annelerin tüketimine sunulan kefirin ve anne sütlerinin Lactobacillus casei içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Lactobacillus casei Günler Cq log kob/ml Kefir - 39,24 0,99±0,26 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 38,77 1,15±0, ,00 0,73±0, ,43 1,61±0,

71 Daha önce yapılan randomize maternal çalışmalarda, anne sütünden Lactobacillus türleri, anne sütü ile takviye edildikten sonra kadınların %12-53'ünde geri kazanılmıştır (Abrahamsson vd., 2009; Arroyo vd., 2010; Nasiraii vd., 2011; Hurtado vd., 2017). Yaptığımız çalışmada kefirlerde ve anne sütlerinde önemli düzeyde L. casei izolasyonu gerçekleştirilememiştir. Anne sütüne mikroorganizmaların trasferinin farklı mikroorganizmalar için değişkenlik gösterdiğini düşündürmektedir. Lactobacillus delburueckii spp. bulgaricus a ait spesifik primerler kullanılarak analiz yapılmıştır. Standart kurve Şekil te sunulmuştur. Şekil Lactobacillus bulgaricus a ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerdeki süt örneklerinin Lactobacillus bulgaricus içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.7. de verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin L. bulgaricus içerikleri 2,54 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinin L. bulgaricus içerikleri 10. gün, 0,87 log kob/ml; 20. gün, 0,92 log kob/ml; 30. gün, 1,05 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinde L. bulgaricus 10. gün, 1,12 log kob/ml; 20. gün, 1,07 log kob/ml; 30. gün, 1,65 log kob/ml olarak bulunmuştur. 58

72 Çizelge 4.7. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus bulgaricus içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Lactobacillus bulgaricus Günler Cq log kob/ml Kefir - 25,73 2,54±0,25 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 31,99 0,87±0, ,79 0,92±0, ,31 1,05±0, ,03 1,12±0, ,23 1,07±0, ,03 1,65±0,45 Yapılan çalışmalarda kefir danesinden ve kefirden probiyotik özelliklere sahip olan Lactobacillus delbrueckii bulgaricus izole edilmiştir (Koroleva vd., 1991; Santos vd., 2003; Witthuhn vd., 2004; Dick vd., 2015). Yaptığımız çalışmada kefir tüketen grubundaki anne sütü örneklerinde günlere göre L. bulgaricus miktarı artış gösterirken, kontrol grubu anne sütü örneklerinde 20. günde L. bulgaricus un miktarı bir miktar azalsa da 30. günde tekrar artış göstermiştir. Anne sütlerinde zamanla mikroorganizma içerikleri değişkenlik gösterebilmektedir. Bu değişkenliğe beslenme, çevresel faktörler, süt sağım zamanı, antibiyotik kullanımı gibi etmenler de sebep olabilmektedir. Lactobacillus helveticus a ait spesifik primerler kullanılarak analiz edilmiştir. Standart kurve Şekil te sunulmuştur. Şekil Lactobacillus helveticus a ait standart kurve 59

73 Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerdeki süt örneklerinin Lactobacillus helveticus içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.8. de verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin L. helveticus içerikleri 3,22 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinin L. helveticus içerikleri 10. gün, 1,05 log kob/ml; 20. gün, 0,85 log kob/ml; 30. gün, 1,03 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin L. helveticus içerikleri 10. gün, 1,21 log kob/ml; 20. gün, 0,85 log kob/ml; 30. gün, 1,38 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge 4.8. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus helveticus içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Lactobacillus helveticus Günler Cq log kob/ml Kefir - 24,29 3,22±0, ,39 1,05±0,37 Kefir tüketen grup 20 32,12 0,85±0, ,60 1,03±0, ,01 1,21±0,70 Kontrol grup 20 32,22 0,85±0, ,46 1,38±0,80 Yapılan çalışmalar kefir danesinde (Zhou vd., 2009; Kök-Taş vd., 2012) ve anne sütünde (Albesharat vd., 2011) doğal olarak Lactobacillus helveticus bulunduğunu göstermektedir. Yaptığımız çalışmada her iki grubun anne sütü örneğinde de 20. günlerdeki L. helveticus miktarı eşit bulunurken, 20. ve 30. günlerde kontrol grubundaki anne sütü örneklerinde L. helveticus miktarı diğer gruba göre fazla bulunmuştur. Bu değişkenliğin sebebinin yalnızca beslenmeden kaynaklanmadığı düşünülmektedir. Bifidobacterium bifidum a ait spesifik primerler kullanılarak analiz edilmiştir. Standart kurve Şekil te sunulmuştur. 60

74 Şekil Bifidobacterium bifidum a ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Bifidobacterium bifidum içerikleri ve Cq değerleri Çizelge 4.9. da verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin B. bifidum içeriği 1,69 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinin B. bifidum içerikleri 10. gün, 1,44 log kob/ml; 20. gün, 1,62 log kob/ml; 30. gün, 1,48 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin B. bifidum içerikleri 10. gün, 1,21 log kob/ml; 20. gün, 1,08 log kob/ml; 30. gün, 1,66 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge 4.9. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Bifidobacterium bifidum içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Bifidobacterium bifidum Günler Cq log kob/ml Kefir - 36,02 1,69±0,26 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 36,75 1,44±0, ,59 1,62±0, ,00 1,48±0, ,24 1,21±0, ,25 1,08±0, ,08 1,66±0,24 Yapılan çalışmalar Lactobacillus rhamnosus LC705 (Nasiraii vd., 2011), Lactobacillus reuteri (Abrahamsson vd., 2009) ve Lactobacillus fermentum CECT5716 ve Lactobacillus salivarius CECT5713 (Arroyo vd., 2010), bazı 61

75 bakteriler ile uygulanan maternal desteğin anne sütü içinde daha fazla varlığına olduğunu göstermektedir. Simpson vd., (2017) yılında yaptıkları çalışma dışında anne sütüne L. acidophilus veya Bifidobacterium türlerinin anne takviyesi sonrası anne sütüne geçişini araştıran başka bir çalışma bulunamamıştır. Probiyotik özellikleri sebebiyle bilinen L. acidophilus, L. casei ve B. bifidum un kefir bakterilerine oranla bulunurluklarının oldukça düşük olduğu tespit edilmiştir. Transfer olarak log düzeyinde daha düşük oldukları probiyotik potansiyellerinin kefire özgü bakterilerine oranla daha düşük olabileceği düşünülmüştür. Yaptığımız çalışmada kefir tüketen grubun anne sütü örneklerinin B. bifidum içeriği kontrol grubu anne sütü örneklerine göre fazla bulunmuştur. Ancak bunun kefir tüketiminden mi yoksa anne sütünün kendi bileşiminden mi kaynaklandığı net olarak bilinememektedir. Streptococcus thermophilus a ait spesifik primerler kullanılarak analiz edilmiştir. Standart kurve Şekil da sunulmuştur. Şekil Streptococcus thermophilus a ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Streptococcus thermophilus içerikleri ve Cq değerleri Çizelge da verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin S. thermophilus içeriği 2,98 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen 62

76 grubundaki annelerin süt örneklerinin S. thermophilus içerikleri 10. gün, 2,00 log kob/ml; 20. gün, 1,96 log kob/ml; 30. gün, 1,93 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin S. thermophilus içerikleri 10. gün, 1,94 log kob/ml; 20. gün, 1,94 log kob/ml; 30. gün, 1,88 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Streptococcus thermophilus içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Streptococcus thermophilus Günler Cq log kob/ml Kefir - 19,51 2,98±0,30 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 22,41 2,00±0, ,51 1,96±0, ,61 1,93±0, ,57 1,94±0, ,59 1,94±0, ,73 1,88±0,53 Kültür bağımlı ve kültür bağımsız teknikler, anne sütünde Staphylococcus, Streptococcus ve Propionibacterium cinslerine ait bakterilerle birlikte laktik asit bakterilerinin ve Bifidobakterilerin baskın olduğunu göstermiştir (Fitzstevens vd., 2017). Yaptığımız çalışmada her iki gruptaki anne sütü örneklerinde S. thermophilus izolasyonu gerçekleştirilmiş ve iki gruptaki mikroorganizma miktarları yakın değerlerde bulunmuştur. Lactobacillus spp. ye ait spesifik primerler kullanılarak analiz yapılmıştır. Standart kurve Şekil de sunulmuştur. 63

77 Şekil Lactobacillus spp. ye ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Lactobacillus spp. içerikleri ve Cq değerleri Çizelge de verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin Lactobacillus spp. içerikleri 7,52 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinin Lactobacillus spp. içerikleri 10. gün, 2,42 log kob/ml; 20. gün, 2,17 log kob/ml; 30. gün, 2,09 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinde Lactobacillus spp. 10. gün, 2,15 log kob/ml; 20. gün, 2,34 log kob/ml; 30. gün, 2,74 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Lactobacillus spp. içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Lactobacillus spp. (Laktik Asit Grubu) Günler Cq log kob/ml Kefir - 9,18 7,52±0,48 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 25,21 2,42±0, ,01 2,17±0, ,25 2,09±0, ,08 2,15±0, ,49 2,34±0, ,46 2,74±0,62 Kwak vd. (1996) yaptıkları çalışmada kefir danelerinde L. helveticus, L. caucasicus, L. bulgaricus, L. casei, L. cellobiosus, L. plantarum, L. acidophilus, L. kefiranofaciens ve L. lactis olduğunu bildirmişlerdir. Yaman (2004) Polonya kefir danesinden 64

78 izole edilen 5 laktobasil izolatını biyokimyasal testler kullanarak L. kefir, L. confusus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. kefiranofaciens, L. paracasei ssp. casei olarak tanımlamıştır. Yaptığımız çalışmada her iki grubun süt örneklerinde de Real-Time PCR kullanılarak Lactobacillus spp. miktarları belirlenmiştir. Hem anne sütünde hem de kefirde doğal olarak bulunan bu mikroorganizmanın miktarı anne sütü örneklerinde laktasyon süresince farklılık göstermektedir. 10. gün anne sütü örneklerinde Lactobacillus spp. içeriği kefir tüketen anne grubunda fazla bulunurken, 20. ve 30. günlerde kontrol grubununun süt örneklerinde fazla bulunmuştur. Diğer probiyotik mikroorganizmaların anne sütündeki artışı bu mikroorganzimanın gelişimini baskılamış olabileceği düşünülmektedir. Streptococcus spp. ye ait spesifik primerler kullanılarak analiz yapılmıştır. Standart kurve Şekil de sunulmuştur. Şekil Streptococcus spp. ye ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Streptococcus spp. içerikleri ve Cq değerleri Çizelge de verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin Streptococcus spp. içeriği 7,41 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Streptococcus spp. içerikleri 10. gün, 5,31 log kob/ml; 20. gün, 3,68 log kob/ml; 30. gün, 3,65 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol 65

79 grubundaki annelerin süt örneklerinin Bifidobacterium spp. içerikleri 10. gün, 3,05 log kob/ml; 20. gün, 4,39 log kob/ml; 30. gün, 1,20 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Streptococcus spp. içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Streptococcus spp. Günler Cq log kob/ml Kefir - 25,80 7,41±0,91 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 26,42 5,31±0, ,21 3,86±0, ,32 3,65±0, ,64 3,05±1, ,92 4,39±1, ,64 1,20±0,63 Collado vd., (2009) yaptıkları çalışmada anne sütlerinde Staphylococcus, Streptococcus, Bifidobacterium ve Lactobacillus un baskın gruplar olduğunu ve tüm anne sütü örneklerinden elde edildiğini bildirmişlerdir. Yaptığımız çalışmada kefir tüketen grubun anne sütü örneklerinde Streptococcus spp. içeriği günlere göre değişmekle birlikte, kontrol grubu anne sütü örneklerinden fazla bulunmuştur. Probiyotik özelliklere sahip bu mikroorganzimaların kefir tüketen grubun örneklerinde daha fazla olmasının sebebinin probiyotiklerce zengir bir içecek olan kefirden kaynaklandığı düşünülmektedir. Bifidobacterium spp. ye ait spesifik primerler kullanılarak analiz yapılmıştır. Standart kurve Şekil da verilmiştir. 66

80 Şekil Bifidobacterium spp. ye ait standart kurve Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve gönüllü annelerin 10., 20. ve 30. günlerindeki süt örneklerinin Bifidobacterium spp. içerikleri ve Cq değerleri Çizelge te verilmiştir. Annelerin tüketimine sunulan kefirin Bifidobacterium spp. içeriği 4,42 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Bifidobacterium spp. içerikleri 10. gün, 2,52 log kob/ml; 20. gün, 2,73 log kob/ml; 30. gün, 2,58 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Bifidobacterium spp. içerikleri 10. gün, 1,93 log kob/ml; 20. gün, 1,97 log kob/ml; 30. gün, 2,25 log kob/ml olarak bulunmuştur. Çizelge Annelerin tüketimine sunulan kefirlerin ve anne sütlerinin Bifidobacterium spp. içerikleri ve Cq değerleri Gruplar Bifidobacterium spp. Günler Cq log kob/ml Kefir - 26,45 4,42±0,25 Kefir tüketen grup Kontrol grup 10 33,83 2,52±0, ,46 2,73±0, ,80 2,58±0, ,27 1,93±0, ,17 1,97±0, ,91 2,25±0,63 67

81 log kob/ml Gueimonde vd., (2007) de yaptıkları çalışmada anne sütü örneklerinin Bifidobakter içerdiğini, en yaygın türünün Bifidobacterium longum olduğunu ve Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum ve Bifidobacterium catenulatum un onu takip ettiğini bildirmişlerdir. Yaptığımız çalışmada her iki gruptaki anne sütü örneklerinde Bifidobacterium spp. izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Bifidobacterium spp. içeriğinin kontrol grubu anne sütü örneklerine göre kefir tüketen grubun anne sütü örneklerinde yüksek olmasının sebebinin annelerin probiyotik içeriği yüksek olan kefir tüketiminden kaynaklandığını düşündürmektedir. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Gün L. helveticus S. thermophilus Streptococcus spp. Bifidabacterium spp. Lactobacillus spp. L. bulgaricus B. bifidum L. casei L. acidophilus L. parakefiri L. kefiri L. kefiranofaciens Şekil Kefir tüketen anne grubuna ait süt örneklerinin mikrobiyotası Real-Time PCR analiziyle kefir tüketen annelerin süt örneklerinde tespit edilen mikroorganizmalardan L. parakefiri, Streptococcus spp. ve Bifidobacterium spp. diğer mikroorganizmalara göre daha yüksek oranda bulunmuştur (Şekil 4.20.). Kefir tüketen annelerin sütlerinde 10. gün ve 20. gün L. casei tespit edilirken, 30. gün anne sütlerinde L. casei tespit edilmemiştir. 68

82 Yapılan araştırmalar kefir danesinde pek çok homofermantatif ve heterofermentatif Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc ve asetik asit bakterilerinin olduğunu göstermektedir. Ninane vd. (2007) PZR sonrası 16S rrna gen dizilimini kullanarak kefir dane mikroflorasında L. kefiranofaciens, L. kefir, L. parakefir ve L. lactis tespit etmişlerdir. Tamime ve Marshall, (1997) kefir üretiminde kullanılan kefir danesinin; bakteriler (L. kefiri, Leuconostoc, Lactococci ve diğerleri), mayalar (S. kefir ve Torula spp. ya da C. kefir) ve polisakkaritler içerdiğini bildirmiştir. Araştırmamızda laktasyon süresince değişmekle birlikte kefir tüketen anne grubunun süt örneklerinde L. parakefiri ye rastlanması kefire özgü probiyotik mikroorganizmaların anne sütüne transfer edildiğini doğrulamaktadır. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin mikrobiyotası Şekil de verilmiştir. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% L. helveticus S. thermophilus Streptococcus spp. Bifidabacterium spp. Lactobacillus spp. L. bulgaricus B. bifidum L. casei L. acidophilus Şekil Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin mikrobiyotası Real-Time PCR analizi sonucunda kontrol grubu anne sütü örneklerinde 10. ve 20. günlerde Streptococcus spp. fazla iken (P<0,05), 30. gün süt örneklerinde Lactobacillus spp. nin diğer mikroorganizmalara göre baskın olduğu tespit 69

83 edilmiştir (P<0,05). Bu grupta L. casei sadece 10. gün anne sütlerinde tespit edilmiştir. Collado vd., (2009) da yaptıkları çalışmada Bifidobacterium, Lactobacillus, Staphylococcus, Bacteroides, Enterococcus, Streptococcus, Clostridium cluster IV ve Clostridium cluster XIVa XIVb grupları dahil olmak üzere farklı bakteri türlerinin veya kümelerinin varlığını qpcr ile değerlendirmişlerdir. Staphylococcus, Streptococcus, Bifidobacterium ve Lactobacillus baskın gruplar olduğunu ve tüm örneklerden elde edildiğini bildirmişlerdir. Yaptığımız çalışmada kontrol grubu annelerin sütlerinde, günlere göre değişkenlik göstermekle birlikte Streptococcus spp. ve Lactobacillus spp. tespit edilen diğer mikroorganizmalara göre baskın bulunmuştur. Laktasyon süresince mikroorganizma içeriği değişen anne sütlerinde L. casei nin sadece 10. gün süt örneklerinde tespit edilmesi, diğer mikroorganizmaların artarak L. casei gelişiminin baskılandığını düşündürmektedir. 70

84 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Doğadaki en mucizevi besin olan anne sütü, bebeğinin ihtiyacı olan tüm bileşenleri içerisinde bulundurmaktadır. Bu bileşenler doğum şekli, psikolojik stres, çevresel etkiler, antibiyotik kullanımı ve beslenme gibi faktörlerle değişebilmektedir. Ayrıca her annenin sütü, kendi bebeğinin ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde de değişim göstermektedir. Anne sütlerinin kimyasal bileşenleri değerlendirilmiş ve yağ oranları %3,5-4,0; kuru maddeleri %9,3-10; yoğunlukları %31,8-34,1; protein miktarları %3,4-3,6; laktoz miktarları %4,9-5,4; tuz miktarları %0,7-0,8 arasında bulunmuştur. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Lactobacillus spp. içerikleri karşılaştırıldığında; 10. gün örneklerinde kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinin Lactobacillus spp. içeriği kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinden yüksek iken, 20. gün ve 30. gün süt örneklerinde kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Lacatobacillus spp. içeriği istatistiksel olarak yüksek bulunmuştur. Kefir tüketen ve kontrol gruplarındaki annelerin sütlerinin Streptococcus spp. içerikleri karşılaştırıldığında; kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinden Streptococcus spp. içeriğinden yüksek bulunmuştur. Her iki grupta 10. gün sütlerinde Lactobacillus acidophilus içeriği önemli farklılık göstermezken, ilerleyen günlerde kontrol grubunda azalma gözlenmiş, kefir içen annelerde ise içeriğin korunduğu gözlemlenmiştir. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin Bifidobacterium spp. içeriği, kontrol grubundaki annelerin süt örneklerine göre yüksek bulunmuştur. Annelerin beslenmesine ek olarak probiyotik mikroorganizmalarca zengin içeriğe sahip olan kefirin dahil edilmesinin, tüm mikroorganizma profilini arttırdığı sonucuna varılmıştır. Yaptığımız çalışmada genel olarak kefir tüketen anne grubunun süt örneklerinin mikroorganizma içeriğinin, kontrol grubu annelerin süt içeriğine göre yüksek bulunması anne sütü mikrobiyotasının beslenme şeklinden etkilendiğini doğrulamaktadır. 71

85 Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin L. kefiranofaciens içerikleri 10. gün, 2,05 log kob/ml; 20. gün, 2,03 log kob/ml; 30. gün, 2,27 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinde L. kefiri tespit edilememiştir. Kefir tüketen annelerin süt örneklerinde L. kefiri içerikleri 10. gün, 2,11 log kob/ml; 20. gün, 1,72 log kob/ml; 30. gün, 1,64 log kob/ml olarak bulunmuştur. Kontrol grubundaki annelerin süt örneklerinde L. parakefiri tespit edilememiştir. Kefir tüketen grubundaki annelerin süt örneklerinin L. parakefiri içerikleri 10. gün, 5,28 log kob/ml; 20. gün, 5,03 log kob/ml; 30. gün, 4,94 log kob/ml olarak bulunmuştur. Yaptığımız çalışma, doğal kefir danesinden üretilen kefire özgü mikroorganizmalardan L. kefiranofaciens, L. kefiri ve L. parakefiri nin kefir tüketen annelerin süt örneklerine transfer edildiğini göstermektedir. Normalde anne sütünde bulunmayan, kefirin doğal mikroflorasında yer alan probiyotik özellikli, spesifik mikroorganizmaların kefir tüketimiyle birlikte anne sütlerine geçtiği gözlenmiştir. Kefir tüketmeyen kontrol grubu anne sütü örneklerinde bu mikroorganizmalara rastlanmamıştır. Yaptığımız çalışma, anne sütüne mikroorganizma transferinin olduğunu doğrulayan araştırmalarla paralellik göstermektedir. Ayrıca bu tez çalışmasında kefirde bulunan probiyotik özellikli L. acidophilus, L. casei, L. helveticus, L. bulgaricus ve B. bifidum bakterilerinin kefir tüketimi ile günlere göre değişimleri değerlendirilmiştir. Tüm bu bakteriler suş düzeyinde anne sütü doğasında da olduğu bu tez çalışmasında ilk kez bulunmuştur. Probiyotik özellikleri sebebiyle bilinen L. acidophilus, L. casei ve B. bifidum un kefir bakterilerine oranla bulunurluklarının oldukça düşük olduğu tespit edilmiştir. Transfer olarak log düzeyinde daha düşük oldukları probiyotik potansiyellerinin kefire özgü bakterilerine oranla daha düşük olabileceği düşünülmüştür. Yaptığımız çalışmada, bu bakterilerin içeriği kefir tüketen grubun anne sütü örneklerinde kontrol grubu anne sütü örneklerine göre fazla bulunmuştur. Ancak 72

86 bunun kefir tüketiminden kaynaklanıp kaynaklanmadığı net olarak belirlenememiştir. Doğumla birlikte intestinal flora oluşmaya başlamakta ve yaşamın ilk dönemlerinde beslenmeyle yerleşik hale geçmektedir. Bağışıklık sistemi üzerine olumlu etkileri olduğu bilinen, probiyotik mikroorganizmalarca zengin bir besin olan kefirin tüketilmesiyle anne sütünün probiyotik mikroorganizma içeriğinin zenginleştiği belirlenmiştir. Doğal kefir danesinden üretilen kefirde bulunan, kefire özgü probiyotik mikroorganizmaların anne sütüne geçtiği tespit edilmiştir. Bu geçişin daha net ortaya konulabilmesi için anne gaitası, bebek gaitası ve anne sütünde yapılan klinik çalışmaların artırılması faydalı olacaktır. 73

87 KAYNAKLAR Abraham, A.G., De Antoni, G.L., Characterization of kefir grains grown in cows milk and in soya milk. Journal of Dairy Research, 66, Abrahamson, T.R., Sinkiewicz, G., Jakobsson, T., Fredrikson, M., Björksten, B., Probiotic Lactobacilli in breast milk and infant stool in relation to oral intake during the first year of life. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nurtition, 49(3), Albesharat, R., Ehrmann, M.A., Korakli, M., Yazaji, S., Vogel, R.F., Phenotypic and genotypic analyses of lactic acid bacteria in local fermented food, breast milk and faeces of mothers and their babies. Systematic and Applied Microbiology, 34, Anderson, J.W., Johnstone, M.B., Remly, D.T., Breastfeeding and cognitive development: a meta analaysis. American Journal of Clinical Nutrition, 70, Andrighetto, C., De Dea, P., Lombardi, A., Neviani, E., Rossetti, L., Giraffa, G., 1998 Molecular identification and cluster analysis of homofermentative thermophylic lactobacilli isolated from dairy products. Research in Microbiology, 149, Arroyo, R., Martin, V., Maldonado, A., Jimenez, E., Fernandez, L. and Rodriguez, J.M., Treatment of infectious mastitis during lactation: Antibiotics versus oral administration of Lactobacilli isolated from breast milk. Clin. Infect. Dis., 50, Arslanoğlu, S., Moro, G.E., Boehm, G., Early supplementation of prebiotic oligosaccharides protects formula-fed infants against infections during the first 6 months of life. The Journal of Nutrition, 137, Atıcı, A., Yılmaz M., Satar M., Tamer L., Prematür ve matür bebek anne sütünün mineral ve eser element içeriği. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 39, Basavanna, G., Propulla, S.G., Evaluation of functional aspects of Lactobacillus fermentum CFR 2195 isolated from breast fed healthy infants fecal matter. The Journal of Food Science and Technology, 50(2), Beasley, S.S., Saris, P.E.J., Nisin-producing Lactococcus lactis strains isolated from human milk. Applied and Environment Microbiology, 70, Bergey, D.H., Harrison, F.C., Breed, R.S., Hammer, B.W., Huntoon, F.M. (eds) Bergey's manual of determinati ve bacteriology, 2nd ed. The Williams and Wilkins Co., Baltimore

88 Boix-Amorós, A., Collado, M.C., Mira, A., Relationship between milk microbiota, bacterial load, macronutrients,and human cells during lactation. Frontiers in Microbiology, 20(7), 492. Bottazzi, V., Bianchi, F., A note on scanning electronmicroscopy of microorganisms associated with the kefir granule. Journal of Applied Bacteriology, 48, Bottazzi, V., Zacconi, C., Sarra, P.G., Dallavalle, P., Parisi, M.G., Kefir microbiologia, chimica, e tecnologia. L industria Latte, 30, Cabrera-Rubio, R., Collado, M.C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A., The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. The American Journal Clinical Nutrition, 96, Chen, H.C., Wang, S.Y., Chen, M.J., Microbiological study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent methods. Food Microbiology, 25, Chen, T.H., Wang, K.N., Chen, J.R., Chen, M.J., Microbiological and chemical properties of kefir manufactured by entrapped microorganisms isolated from kefir grains. Journal of Dairy Science, 92, Chen, Y.P., Hsiao, P.J., Hong, W.S., T. Y. Dai, T.Y., Chen, M.J., Lactobacillus kefiranofaciens M1 isolated from milk kefir grains ameliorates experimental colitis in vitro and in vivo. Journal of Dairy Science, 95, Collado, M.C., Delgado, S., Maldonado, A., Rodriguez, J.M., Assessment of the bacterial diversity of breast milk of healthy women by quantitative realtime PCR. Letters in Applied Microbiology, 48(5), Delfederico, L., Hollmann, A., Martínez, M., Iglesias, N.G., De Antoni, G., Semorile, L., Molecular identification and typing of lactobacilli isolated from kefir grains. Journal of Dairy Research, 73, (1), Dick, M., Costa, T., Gomaa, A., Subirade, M., Rios, Ade, O., Flôres, S.H., Edible film production from chia seed mucilage: Effect of glycerol concentration on its physicochemical and mechanical properties. Carbohydrate Polymers, 130, Du Plessis, E.M., Dicks, L.M., Evaluation of random amplified polymorphic DNA RAPD-PCR as a method to differentiate Lactobacillus acidophilus, Lb. crispatus, Lb. amylovorus, Lb. gallinarum, Lb. gasseri, and Lb. johnsonii. Current Microbiology, 31, Duitschaever, C.L., Kemp, N., Emmons, D., 1988a. Comparative evaluation of five procedures for making kefir. Milchwissenschaft, 43,

89 Duitschaever, C.L., Kemp, N., Smith, A.K., 1988b. Microscopic studies of the microflora of kefir grains and of kefir made by different methods. Milchwissenschaft, 43, Fernandez, L., Langaa, S., Martína, V., Maldonado, A., Jiménez, E., Martín, R., Rodrígueza, J.M., The human milk microbiota: Origin and potential roles in health and disease. Pharmacological Research, 69, Fiocchi, A., Pawankar, R., Cuello-Garcia, C., Ahn, K., Al-Hammadi, S., Agarwal, A., Beyer, K., Burks, W., Canonica, G.W., Ebisawa, M., Gandhi, S., Kamenwa, R., Lee, B. W., Li, H., Prescott, S., Riva, J.J., Rosenwasser, L., Sampson, H., Spigler, M., Terracciano, L., Ortiz, A.V., Waserman, S., Yepes-Nuñez, J.J., Brożek, J.L., and Schünemann, H.J., World Allergy Organization- McMaster University Guidelines for Allergic Disease Prevention (GLAD-P): Probiotics. World Allergy Organization Journal, 8, 4. Fitzstevens, J.L., Smith, K.C., Hagadorn, J.I., Caimano, M.J., Matson, A.P., Brownell, E.A., Systematic review of the human milk microbiota.nutrition in Clinical Practice,32(3), Floch, M.H., Montrose, D.C., Use of probiotics in humans: An analysis of the literature. Gastroenterology Clinics of North America, 34, Fujisawa, T., Adachi, S., Toba, T., Arihara, K., Mitsuoka, T., Lactobacillus kefiranofaciens spp. nov. isolated from kefir grains. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 38, Funkhouser, L.J., Bordenstein, S.R., Mom knows best: the universality of maternal microbial transmission. PLoS Biol, 11, e Furet, J.P., Quenee, P., Tailliez, P., Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using realtime quantitative PCR. International Journal of Food Microbiology, 97, Garbers, I., Britz, T., Witthuhn, R., PCR-based denaturing gradient gel electrophoretictypification and identification of the microbial consortium present in kefir grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 20, Garofalo, C., Osimani, A., Milanovic, V., Aquilanti, L., De Filippis, F., Stellato, G., Bacteria and yeast microbiota in milk kefir grains from different Italian regions. Food Microbiology, 49, Garrote, G.L., Abraham, A.G., De Antoni, G.L., Chemical and microbiological characterisation of kefir grains. Journal of Dairy Research, 68, Gavin, A., Ostovar, K., Microbiological characterization of human milk. Journal of Food Protection, 40 (9),

90 Gerhard, J.H., Alcoholic beverages and fermented foods. In industrial microbiology Giraffa, G., De Vecchi, P., Rossetti, L., Identification of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus and subspecies lactis dairy isolates by amplified rdna restriction analysis. Journal of Applied Microbiology, 85, Gomez-Gallego, C., Garcia-Mantrana, I., Salminen, S., Collado, M.C., The human milk microbiome and factors influencing its composition and activity. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine, 21(6), Gorsek, A., Tramsek, M., Quantitative examination of process parameters during kefir grain biomass production. International Journal of Chemical Reactor Engineering, 5, 8. Gueimonde, M., Laitinen, K., Salminen S., Isolauri E., Breast Milk: A Source of bifidobacteria for infant gut development and maturation? Neonatology, 92, Gulitz, A., Stadie, J., Wenning, M., Ehrmann, M.A., Vogel, R.F., The microbial diversity of water kefir. International Journal of Food Microbiology, 151, Gür, E., Anne sütü ile beslenme. Türk Pediatri Arşivi Dergisi, 42, 1-5. Güzel-Seydim Z.B., Wyffels, J., Seydim, A.C., Greene, A.K., Turkish kefir and kefir grains: Microbial enumeration and electron microscopic observation. International Journal Dairy Technology, 58, 25. Güzel-Seydim, Z., Kök-Tas, T., Ertekin-Filiz, B., Seydim, A.C., Effect of different growth conditions on biomass increase in kefir grains. Journal of Dairy Science, 94(3), Güzel-Seydim, Z., Kök-Taş, T., Greene, A.K., Kefir and koumiss: Microbiology and Technology. In:"Development and Manufacture of Yogurt and Other Functional Dairy Products" ISBN Güzel-Seydim, Z.B., Seydim, A.C., Greene, A.K., Bodine, A.B., Determination of organic acids and volatile flavor substances in kefir during fermentation. Journal of Food Composition and Analysis, 13, Hamet, M.F., Londero, A., Medrano, M., Vercammen, E., Van Hoorde, K., Garrote, G.L., Application of culture-dependent and culture-independent methods for the identification of Lactobacillus kefiranofaciens in microbial consortia present in kefir grains. Food Microbiology, 36,

91 Hammes, W.P., Vogel, R.F., The genus Lactobacillus spp In, B.J.B. Wood and W.H. Holzapfel (eds). The Genera of Lactic Acid Bacteria. Chapman & Hall, London. Hansen, P.A., Lessel, E.F., Lactobacillus casei (Orla- Jensen) comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 21(1), Hansen, P. A., and G. Mocquot Lactobacillus acidophilus (Moro) comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 20, Heikkilä, M.P., Saris, P.E.J., Inhibition of Staphylococcus aureus by the commensal bacteria of human milk. Journal of Applied Microbiology, 95, Hosono, A., Tanabe, T., Otani, H., Binding properties of lactic asid bacteria ısolated from kefir milk with mutagenic amino asid pyrolyzates. Milchwissenschaft, 45, Hsieh, H.H., Wang, S.Y., Chen, T.L., Huang, Y.L., Chen, M.J., Effects of cow s and goat s milk as fermentation media on the microbial ecology of sugary kefir grains. International Journal of Food Microbiology, 157, Hunt, K.M., Foster, J.A., Forney, L.J., Schütte, U.M.E., Beck, D.L., Abdo, Z., Fox, L.K., Williams, J.E., McGuire, M.K., McGuire, M.A., Characterization of the diversity and temporal stability of bacterial communities in human milk. PLoS ONE, 6(6), e Hurtado, J. A., Maldonado-Lobon, J.A., Diaz-Ropero, M.P., Flores-Rojas, K., Uberos, J., Leante, J.L., Affumicato, L., Couce, M.L., Garrido, J.M., Olivares, M., and Fonolla, J., Oral administration to nursing women of Lactobacillus fermentum CECT5716 prevents lactational mastitis development: A randomized controlled trial, Breastfeed. Med., 12, Ismail, I.H., Oppedisano, F., Joseph, S.J., et al., Prenatal administration of Lactobacillus rhamnosus has no effect on the diversity of the early infant gut microbiota. Pediatric Allergy Immunology, 23, Isolauri, E., The role of probiotics in paediatrics. Current Pediatrics, 14, Jiménez, E., Delgado, S., Maldonado, A., Arroyo, R., Albújar, M., García, N., et al. 2008a. Staphylococcus epidermidis: a differential trait of the fecal microbiota of breast-fed infants. BMC Microbiology, 8, 143. Jiménez, E., Fernández, L., Delgado, S., García, N., Albújar, M., Gómez, A., et al. 2008b. Assessment of the bacterial diversity of human colostrum by cultural-based techniques. Analysis of the staphylococcal and enterococcal populations. Research in Microbiology, 159,

92 Jimenez, E., Fernandez, L., Maldonado, A., et al., 2008c. Oral administration of Lactobacillus strains isolated from breast milk as an alternative for the treatment of infectious mastitis during lactation. Appl Environ Microbiology, 74, Kandler, O., Kunath, P., Lactobacillus kefir sp.nov., a component of the microflora of kefir. Systematic and Applied Microbiology, 4, Kim, D.H., Chon., J.W., Kim, H.S., Yim, J.H., Kim, H., Seo, K.H., 2015a. Rapid detection of Lactobacillus kefiranofaciens in kefir grain and kefir milk using newly developed Real-Time PCR, Journal of Food Protection, 78(4), Kim, D.H., Chon, J.W., Kim, H., Kim, H.S., Choı, D., Hwang, D.G., Seo, K.H. 2015b. Detection and enumeration of lactic acid bacteria, acetic acid bacteria and yeast in kefir grain and milk using quantitative Real-Time PCR, Journal of Food Safety, 35, Kim, D.H., Kang, I.B., Jeong, D., Kim, H.S., Lee, S.K., Song, K.Y., Seo, K.H., Development of rapid and highly specific TaqMan probe-based real-time PCR assay for the identification and enumeration of Lactobacillus kefiri in kefir milk, İnternational Dairy Journal, 61, Kojic, M., Lozo, J., Begovic, J., Jovcic, B., Topisirovic, L., Characterisation of lactoccoci isolated from homemade kefir. Archives of Biological Sciences, 59, Koroleva, N., Robinson, R., Products prepared with lactic acid bacteria and yeasts. Therapeutic Properties of Fermented Milks, Koroleva, N.S., Starters for fermented milks, section 4: Kefir and kumys starters. Bulletin of the International Dairy Federation, 227, Kosikowski, F.V., Mistry, V.V., Cheese and fermented milk foods. F.V. Kosikowski LLC, Wesport, Connecticut, USA. Köksal, N., Aydoğdu, H., Şentürk, E., Perçin, K., Özkan, H., Anne sütünün immünolojik özellikleri. Güncel Pediatri Dergisi, 3, Kök-Taş, T., Ekinci, Y., Guzel-Seydim, Z.B., Identification of microbial flora in kefır grains produced in Turkey using PCR. International Journal of Dairy Technology, 65(1), Khodayar-Pardo, P., Mira-Pascual, L., Collado, M.C., Martinez-Costa, C., Impact of lactation stage, gestational age and mode of delivery on breast milk microbiota. Journal of Perinatology., 34(8),

93 Kramer, M.S., Kakuma R., The optimal duration of exclusive breastfeeding. Results of a systematic review. Geneva, World Health Organization, Department of Nutrition for Health and Development and Department of Child and Adolescent Health and Development. Protected İnfants throught human Milk, Kwak, H.S, Park, S.K., Kim, D.S., Biostabilization of kefir with a nonlactosefermenting yeast. J Dairy Sci., 79 (6), Kunz, C., Rodriguez-Palmero M., Koletzko B., Jensen R., Nutritional and biochemical properties of human milk, Part 1: General aspects, proteins and carbohydrates. Clin Perinatal, 26, Kurmann, J.A., the production of fermented milks in world. II. Aspects of the production of fermented milks. IDF Bulletin. 179, La Rivie re, J.W.M., Kooiman, P., Schmidt, K., Kefiran, a novel polysaccharide produced in the kefir grain by Lactobacillus brevis. Archiv fur Mikrobiologie, 59, Langa, S., Maldonado, A., Delgado, S., Martín, R., Martín, V., Jiménez, E., et al., Characterization of Lactobacillus salivarius CECT 5713, a strain isolated from human milk: from genotype to phenotype. Applied Microbiology and Biotechnology, 94, Latorre-Garcia, L., Del Castillo-Agudo, L., Polaina, J., Taxonomical classifi cation of yeasts isolated from kefir based on the sequence of their ribosomal RNA genes, World Journal Microbiology Biotechnology, 23, 785. LaTuga, M.S., Stuebe, A., Seed, P.C., A review of the source and function of microbiota in breast milk. Seminars in Reproductive Medicine, 32(01), Leite, A.M.O., Mayoa, B., Rachid, C.T., Peixoto, R.S., Silva, J.T., Paschoalin, V.M., Assessment of the microbial diversity of Brazilian kefir grains by PCR-DGGE and pyrosequencing analysis. Food Microbiology, 31, Lopez, I., Ruiz-Larrea, F., Cocolin, L., Orr, E., Phister, T., Marshall, M., VanderGheynst, J. and Mills, D.A., Design and evaluation of PCR primers for analysis of bacterial populations in wine by denaturing gradient gel electrophoresis. Applied Environmental Microbiology., 69(11), Magalhaes, K.T., de M Pereira, G.V., Dias, D.R., Schwan, R.F., Microbial communities and chemical changes during fermentation of sugary Brazilian kefir. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 26,

94 Makino, H., Kushiro, A., Ishikawa, E., Muylaert, D., Kubota, H., Sakai, T., et al., Transmission of intestinal Bifidobacterium longum subsp. longum strains from mother to infant, determined by multilocus sequencing typing and amplified fragment length polymorphism. Applied and Environment Microbiology, 77, Makrides, M., Neuman, M., Simmer, K., Pater, J., Gibson, R., Are long-chain polyunsaturated fatty acids essential nutrients in infancy? Lancet, 345, Margulis L., From kefir to death. In: How Things Are. J. Brockman and K. Matson, Eds. William Morrow and Co. New York, Markowitz, J.E., Bengmark, S., Probiotics in health and disease in the pediatric patient. Pediatric Clinics of North America, 49, Marshall, V., Cole, W.M., Brooker, B.E., Observations on the structure of kefir grains and the distribution of the microflora. Journal of Applied Bacteriology, 57, Martin, C.R., Ling, P.R., Blackburn, G.L., Review of infant feeding: Key features of breast milk and infant formula. Nutrients, 8(5), 279. Martín, R., Heilig, H.G., Zoetendal, E.G., Jiménez, E., Fernández, L., Smidt, H., et al., 2007a. Cultivation-independent assessment of the bacterial diversity of breast milk among healthy women. Research in Microbiology, 158, Martín, R., Heilig, H.G., Zoetendal, E.G., Smidt, H., Rodríguez, J.M., 2007b. Diversity of the Lactobacillus group in breast milk and vagina of healthy women and potential role in the colonization of the infant gut. Journal of Applied Microbiology, 103, Martín, R., Jiménez, E., Heilig, H.G., Fernández, L., Marín, M.L., Zoetendal, E.G., et al., Isolation of bifidobacteria from breast milk and assessment of the bifidobacterial population by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis and quantitative real time PCR. Applied and Environment Microbiology, 75, Martín, R., Jiménez, E., Olivares, M., Marín, M.L., Fernández, L., Xaus, J., et al., Lactobacillus salivarius CECT 5713, a potential probiotic strain isolated from infant feces and breast milk of a mother child pair. International Journal of Food Microbiology, 112, Martín, R., Langa, S., Reviriego, C., Jiménez, E., Marín, M.L., Xaus, J., Fernández, L., Rodríguez, J.M., Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut. The Journal of Pediatrics, 143,

95 Martín, V., Maldonado, A., Moles, L., Rodríguez-Bãnos, M., Del Campo, R., Fernández, L., et al., Sharing of bacterial strains between breast milk and infant feces. Journal of Human Lactation, 28, Martín, V., Mãnés-Lázaro, R., Rodríguez, J.M., Maldonado, A., Streptococcus lactarius sp. nov., isolated from breast milk of healthy women. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 61, Mehanna, N.S.H, Tawfik, N.F., Salem, M.M.E., Effat, B.A.M., Gad El-Rab, D.A., Assessment of Potential Probiotic Bacteria Isolated from Breast Milk. Middle-East Journal of Scientific Research, 14 (3), Miguel, M.G.C.P., Cardoso, P.G., Lago, L.A., Schwan, R.F Diversity of bacteria present in milk kefir grains using culture-dependent and cultureindependent methods. Food Res. Int., 43, Molska, I., Kocon, J., Zmarlicki, S., Electron microscopic studies on structure and microflora of kefir grains. Acta Alimentaria Polonica, 6, Mueller, N.T., Bakacs, E., Combellick, J., Grigoryan, Z., Dominguez-Bello, M.G., The infant microbiome development: mom matters. Trends in Molecular Medicine, 21(2), Muyzer, G., De Waal, E.C., Uitterlinden, A.G., Profiling of complex microbial populations by denaturing gradyan gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rrna. Applied and. Environmental Microbiology, 59, Neve, H., Analysis of kefir grain starter cultures by scanning electron microscopy. Milchwissenschaft, 47, Ninane, V., Mukandayambaje, E., Berben G., Identification of Lactic Acid Bacteria within the Consortium of a Kefir Grain by Sequencing 16S rdna Variable Regions. Journal of AOAC International. 90, (4), Nasiraii, L. R., Tabatabaie, F., Aleaeddini, B., Noorbakhsh, R., Heravi, R.M. and Afsharian, S., Investigation of lactobacilli from mother s breast milk who were placed on probiotic diet. Afr. J. Microbiol. Res. 5, Novil, S., Kefir, lifeway Foods. Inc, 7625 N. Austin Ave. Skokie, IL USA. Orla-Jensen, S., La classification des bactéries lactiques. Le Lait, INRA Editions, 4 (36), Ottogalli, G., Galli, A., Resmini, P., Volonterio, G., Composizione microbiologia, chimica ed ultrastruttura dei ganuli di kefir. Annali di Microbiolgia, 23,

96 Ozer, B., Yoğurt Bilimi ve Teknolojisi. ISBN NO: Ötles, S., Çağındı, Ö., Akçiçek, E., Probiotics and health. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention,4, Paramasium, K., Michie, C., Opara, E., Jewell, A.P., Human breast milk immunology. A review. International Journal of Fertility and Women's Medicine, 51, Perez, P.F., Doré, J., Leclerc, M., Levenez, F., Benyacoub, J., Serrant, P., et al., Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells. Pediatrics, 119, e Picard, F.J., Ke, D., Boudreau, D.K., Boissinot, M., Huletsky, A., Richard, D., Ouellette, M., Roy, P.H., and Bergeron, M.G., Use of tuf sequences for genusspecific PCR detection and phylogenetic analysis of 28 Streptococcal species. Journal of Clinical Microbiology, 42(8), Pintado, M.E., Da Silva, J.A., Fernandes, P.B., Malcata, F.X., Hogg, T.A., Microbiological and rheological studies on Portuguese kefir grains. International Journal of Food Science Technology, 31, Rautava, M., Kainonen, E., Salminen, S., Isolauri, E., Maternal probiotic supplementation during pregnancy and breast-feeding reduces the risk of eczema in the infant. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 130, Rea, M.C., Lennartsson, T., Dillon, P., Drinan, F.D., Reville, W.J., Heapes, M. and Cogan, T.M Irish kefir-like grains: their structure, microbial composition and fermentation kinetics. Journal of Applied Bacteriology, 81, Rossi, J., Gobbetti, M., Impiego di un multistarter per la produzione in continuo di kefir. Annals of Microbiology, 41, Rutten, N., Gugten, A., Uiterwaal, C., Vlieger, A., Rijkers, G., Ent, K., Maternal use of probiotics during pregnancy and effects on their offspring s health in an unselected population. The European Journal of Pediatrics, 175, Sallam, M., Wali, I., Attia, A.E.F., Lotfy, W., Taweel, A.E., Mehenna, N.S., Relation between probiotic properties of isolates isolated from breast milk and infants stools. Nutrition & Food Science, 46(3), Sanders, T.A.B., Naismith D.J., A comparison of the influence of breastfeeding and bottle feeding on the fatty acid composition of the erythrocytes. British Journal of Nutrition, 41,

97 Santos, A., San Mauro, M., Sanchez, A., Torres, J.M., Marquina, D., The antimicrobial properties of different strains of Lactobacillus spp. isolated from kefir. Systematic and Applied Microbiology, 26, Schulz, M.E., Jahre Kefir in Nordeuropa und Die Heutige Bedeutung Der Kefir-Sauermilch. Deutsche Molkerei-Zeitung. 13, Serafini, Á.B., André, M.C., Rodrigues, M.A., Kipnis, A., Carvalho, C.O., Campos, M.R., Monteiro, É.C., Martins, F., Jubé, T.F., Microbiological quality of human milk from a Brazilian milk bank. Revista de Saúde Pública, 37(6), Seydim, Z.B., Studies on fermentative, microbiological and biochemical properties of kefir and kefir grains. Ph.D. Dissertation, Clemson University, Clemson, SC. Sezer, Ç., Kefirde Laktik Asit Bakterilerinin Tür Düzeyinde Araştırılması. Kafkas Üniverisitesi. Y. L. Tezi. Kars. Simova, E., Beshkova, D., Angelov, A., Hristozova, T., Frengova, G., Spasov, Z., Lactic acid bacteria and yeasts in kefir grains and kefir made from them. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 28, 1-6. Simpson, M.R., Avershina., E., Storro., O., Johnsen, R., Rudi, K., and Øien, T., Breastfeeding-associated microbiota in human milk following supplementation with Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus La-5, and Bifidobacterium animalis ssp. lactis Bb-12 J. Dairy Sci., 101, Sinkiewicz, G., Ljunggren, L., Occurrence of Lactobacillus reuteri in human breast milk. Microbial Ecology in Health and Disease, 20, Stepaniak, L., Fetlinski, A., Fermented Milks/Kefir. Encyclopedialopedia of Dairy Sciences. Elsevier Science Ltd., Solís, G., De Los Reyes-Gavilan, C.G., Fernández, N., Margolles, A., Gueimonde, M.,2010. Establishment and development of lactic acid bacteria and bifidobacteria microbiota in breast-milk and the infant gut. Anaerobe. 16, Takizawa, S., Kojıma, S., Tamura, S., Fujinaga, S., Benno, Y., Nakase, T., The composition of the lactobacillus flora in kefir grains. Systematic and Applied Microbiology, 21, Takizawa, S., Kojima, S., Tamura, S., Fujinaga, S., Benno, Y., Nakase T., Lactobacillus kefirgranum sp. nov. and Lactobacillus parakefir sp. nov., two new species from kefir grains. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 44,

98 Tamime, A., Marshall, V.M., Microbiology and technology of fermented milks. In: BA LAW, Editor, Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk, Blackie Academic & Professional, London. 57, 152. Tharmaraj, N., Shah, N.P., Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and Propionibacteria. Journal of Dairy Science, 86, Thomas, B., (Ed) Manual of Dietetic Practice. Oxford: Blackwell Science, 250. Toba, T., Arihara, K. and Adachi, S Distribution of microorganisms with particular reference to encapsulated bacteria in kefir grains. International Journal of Food Microbiology, 10, Tunail, N., Köşker, O., Süt Mikrobiyolojisi. Ankara Üniversitesi. Ziraat Fakültesi Yayınları. Ankara. 1116, 138. Vandamme, M., Pot, B., Gillis, M., De Vos, P., Kersters, K., Swings, J., Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiological Reviews, 60, Vardjan, T., Lorbeg, P.M., Rogelj, I., Majhenic, A.C., Characterization and stability of Lactobacilli and yeast microbiota in kefir grains. Journal of Dairy Science, 96, Vedamuthu, E.R., Exotic Fermented Foods. Journal Food Protection, 40, Wang, S.Y., Chen, H.C., Liu, J.R., Lin, Y.C., Chen, M.J., 2008a. Identification of yeasts and evaluation of their distribution in Taiwanese kefir and viili starters. Journal of Dairy Science, 91, Wang, Y., Ahmeda, Z., Fenga, W., Lia, C., Songa, S., Physicochemical properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated from Tibet kefir. International Journal of Biological Macromolecules, 43, 283. Weiss, N., Schillinger, U., Kandler, 0., Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii and Lactobacillus bulgaricus, subjective synonyms of Lactobacillus delbrueckii, and description of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis comb. nov. and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus comb. nov. Systematic and Applied Microbiology, 4, West, C.E., Jenmalm, M.C., Prescott, S.L., The gut microbiota and its role in the development of allergic disease: a wider perspective. Clinical&Experimental Allergy, 45,

99 West, P.A., Hewitt, J.H., Murphy, O.M., The influence of methods of collection and storage on the bacteriology of human milk. Journal of Applied Bacteriology, 46, Witthuhn, R.C., Schoeman, T., Britz, T.J., Isolation and characterization of the microbial population of different South African kefir grains. International Journal of Dairy Technology, 57, Witthuhn, R., Schoeman, T., Britz, T.J., Characterisation of the microbial population at different stages of Kefir production and kefir grain mass cultivation. International Journal of Dairy Technology, 15, Woese, C.R., Bacterial evolution. Microbiology Review, 51, Wouters, J.T.M., Ayad, E.H.E., Hugenholtz, J., Smit, G., Microbes from raw milk for fermented dairy products. Intertional Dairy Journal. 12, Yaman, H., Bir ticari Polonya kefir tanesinden laktobasilerin izolasyonu. Kafkas Unv. Vet. Fak. Der. 10 (1), Yaygın, H., Kefir ve Özellikleri, III. Milli Süt ve Süt Ürünleri Sempozyumu. İstanbul, MPM, Yayın No: 548, Yılmaz, M., Satar, M., Atıcı, A., Hazır, M., Konar A., Prematür ve matür bebek anne sütünün protein, whey proteini, yağ, laktoz, enerji içeriği. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 39, Yüksekdağ, Z.N., Beyatlı, Y., Aslim, B., Metabolic activities of Lactobacillus spp. strains isolated from kefir. Nahrung/ Food, 48, Zacarias, M.F., Binetti, A., Laco, M., Reinheimer, J., Vinderola, G., Preliminary technological and potential probiotic characterisation of bifidobacteria isolated from breast milk for use in dairy products. İnternational Dairy Journal, 21(8), Zanirati, D.F., Abatemarco, M., Cicco Sandesb, S.H., Nicolia, J.R., Nunes, A.C., Neumanna, E Selection of lactic acid bacteria from Brazilian kefir grains for potential use as starter or probiotic cultures. Anarobe, 32, Zhou, J., Liu, X., Jiang, H., Dong, M., Analysis of the microflora in Tibetan kefir grains using denaturing gradient gel electrophoresis. Food Microbiology, 26(8),

100 EKLER EK A. Etik Kurul Kararı Şekil A.1. Etik kurul kararı 87

101 EK B. Örnek Onam Şekil B.1. Örnek onam 88