Kimya ö rencilerinde, kimyasallar n genotoksik etkisinin kromozom aberasyon testiyle belirlenmesi

Transkript

1 217 Kimya ö rencilerinde, kimyasallar n genotoksik etkisinin kromozom aberasyon testiyle belirlenmesi Bilge EROL 1, *Songül BUDAK D LER 2 1 Ni de Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, N DE 2 Ni de Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, N DE Anahtar Kelimeler Kimyasal madde, genotoksik etki, lenfosit kültürü, kromozom aberasyonu. ÖZET Üniversitelerin kimya bölümünde okuyan ö renciler, laboratuar çal malar esnas nda çe itli kimyasallara maruz kal rlar. Bu kimyasallar n ö rencilerde genotoksik risk olu turup olu turmad, in vitro lenfosit kültüründe, kromozom aberasyonu (KA) testiyle belirlendi. Bu çal mada, Ni de Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü ö rencileri ile kimyasala maruz kalmayan ö rencilerden periferal kan örnekleri al nd. Deney ve kontrol grubundan elde edilen preparatlar n incelenmesi ile kromozom anormallikleri ve mitotik indeks belirlendi. Bu iki gruptan elde edilen veriler, t-testi ile kar la ld ve laboratuar çal malar n ö rencilerde kromozom anormalliklerini kontrole göre artt rmad ve mitotik indeksi de önemli derecede de tirmedi i saptand (p>0.05). Determination of chemically nduced genotoxicity by chromosomal aberration test in chemistry students ABSTRACT Keywords Chemical substance, genotoxic effect, lymphocyte culture, chromosomal aberration. University students studying chemistry at degree level are exposed to various chemicals during their laboratory works. To determine if this exposure constitutes a genotoxic risk factor, lymphocytes from exposed subjects were examined in vitro by employing the chromosomal aberration (CA) test. Peripheral blood samples were taken from the subjects who were students at the Chemistry Division of the Faculty of Literature and Sciences, University of Nigde. Controls consisted of unexposed students. Chromosomal anomalies and mitotic index of peripheral blood cells from all subjects were determined. The results from the two groups were compared by the t-test. There were no significant differences between the two groups in terms of CA and mitotic index (p>0.05). * Sorumlu yazar (Corresponding author) e-posta: budakdiler@gmail.com

2 Giri Günümüzde geli en dünyada her geçen gün kimyasal madde miktar ve kullan artmaktad r. Kimyasal maddelerin insanda neden oldu u mutajenezisi, kantitatif olarak de erlendirmek çok güçtür. nsanlar n mutajenlere maruz kalmas ile etkileri aras nda uzun bir süre vard r. Çevrede bulunan ve mesleksel olarak maruz kal nan birçok kimyasal maddenin mutajenik potansiyele sahip oldu u, hayvan ve bakteri testleri ile gösterilmi tir [1-5]. Kimyasal maddelerin endüstrideki kullan n insanda olu turdu u genotoksik etkiler, genetik toksikolojide kullan lan tarama testleri ile ara labilmektedir. Bu testler, kromozom düzeyinde kromozom aberasyonu testi (KA), mikronukleus testi (MN) ve karde kromatid de imi testi (KKD) ile gen düzeyinde ames testi ve moleküler düzeyde tek hücre jel elektroforez testidir (COMET Assay) [1]. Kimyasal maddelerin insanlar üzerindeki mesleki maruziyetini belirlemek için maden çileri ile boya sanayisinde çal an i çilerde kromozom aberasyon testi yap lm ve maruz kalma süresine ba olarak bu i çilerde kontrole göre kromozom aberasyonlar n art belirlenmi tir [6,7]. Pestisit endüstrisinde çal an ve yo un bir ekilde pestisit kar na (atrozine, alakloaranazin, 2,4-diklorofenol asetik asit ve malation) maruz kalan tar m i çilerinde, KA ile KKD miktar n artt ve MN s kl n çok yüksek oldu u bulunmu tur [8]. Ayn ekilde kimyasallara en çok maruz kalan araba tamircileri, trafik polisleri, petrol istasyonunda çal an i çiler ve taksicilerden bukkal epitel hücresi al narak, MN testi yap lm ve i çilerde MN düzeyinin kontrole göre yüksek oldu u tespit edilmi tir [9-11]. Gübre (fosfat) fabrikas nda çal an i çilerin lenfosit hücrelerinde KA ile MN testi yap lm ve ara rma sonucunda 10 y ldan fazla çal an i çilerde, maruz kalmaya ba olarak KA ve MN nin artt gözlenmi tir [12]. Ayr ca polisiklik aromatik hidrokarbonlarla (PAH) yap lan çal malarda, bu maddelerin insan ve hayvanlarda kanseri indükledi i belirlenmi tir [13]. Kimyasal maddelerin insan üzerindeki etkilerini de erlendirirken, çevrede do al olarak olu an fiziksel ve kimyasal mutajenleri de de erlendirmek gerekir [1]. Fiziksel mutajenlerden olan güne en önemli radyasyon kayna r. Yap lan bir çal mada, insan sperm hücreleri radyasyona tabi tutulmu ve radyasyon alan sperm hücrelerinde kromozom aberasyonunu artt rd rapor edilmi tir [14]. Ayn ekilde ozona maruz kalan sa kl genç bireylerin bukkal epitel ve periferal lenfositlerindeki sitogenetik hasarlar toplam 126 üniversite ö rencisinde incelenmi ve O 3 miktar yüksek bölgede bulunan rencilerdeki MN miktar n her iki hücre tipinde de artt, özellikle de bukkal epitelyum hücrelerinde bu art n %39 oran nda gerçekle ti i bildirilmi tir [15]. Baz kimyasal maddelerin (etilen oksid, etanol, nitric oksid, v.b) genotoksik etkileri ara lm ve risk ta p ta mad klar na dair bilgiler rapor edilmi tir [16-22]. Bu maddelerden özellikle etilen oksidin genotoksik oldu u [16], n-hekzan ve formaldehid gibi organik çözücülerin de, bukkal epitelyum hücrelerinde hasarlar olu turdu u bildirilmi tir [23]. Yap lan birçok ara rmada, pek çok kimyasal maddenin insanlar üzerinde genotoksik risk olu turdu u bildirilmektedir. Bu çal mada da, Ni de Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya bölümünde okuyan ö rencilerin maruz kald klar kimyasal maddelerin periferik kan lenfosit hücrelerinde genotoksik etki olu turup olu turmad n kromozom aberasyonu testi ile belirlenmesi amaçlanm r. 2. Materyal Metot Deney ve Kontrol Gruplar n Belirlenmesi Bu çal mada Ni de Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya bölümünde ö renim gören ve ya lar aras nda de en (ya ortalamas ±S.H; 24.64±0.33) 25 ö renci deney grubu olarak, sözel bölümlerde ö renim gören ve ya lar aras nda de en (ya ortalamas ±S.H; 25.32±0.34) 25 renci de kontrol grubu olarak belirlendi. Bu ekilde belirlenen toplam 50 ki iden, etik kurulu raporu do rultusunda, heparinize edilmi steril enjektörle periferal kan örnekleri al nd. Deney grubu ö rencileri, birinci s fta, genel kimya (haftada 4 saat) laboratuar nda daha çok seyreltik anorganik bazl kimyasallarla, ikinci s fta, analitik (haftada 4 saat) ve anorganik kimya (haftada 3 saat) laboratuarlar nda deri ik organik ve anorganik kimyasallarla yap lan deneylere kat lm lard. Üçüncü s fta, organik kimya (haftada 4 saat) ve fiziko kimya (haftada 3 saat) laboratuarlar nda genellikle organik kimyasallar, dördüncü s fta, biyokimya (haftada 3 saat) ve endüstriyel kimya (haftada 4 saat) laboratuarlar nda, deri ik organik ve anorganik kimyasallara temas edilmesi ve solunmas eklinde maruz kalm lard r. renciler deneyler esnas nda koruyucu maske, gözlük, eldiven, vs. kullanmay p, laboratuarlar do al yollarla havaland lmaktad r. Lenfosit Kültürünün Yap lmas ve Preparatlar n Haz rlanmas Ki ilerden al nan ve 1/10 oran nda heparinize edilen periferal kan örnekleri, kromozom medyumlar na steril artlarda ekilerek, inkübatörde 37 C de 72 saat inkübe edildi. Kültür süresinin 70. saatinde, her tüpe haz rlanan kol isin eriyi inden 35 µl (0.06 µg kol isin/ml ) ilave edildi ve 72.saate kültür tüpleri etüvden al narak, 1200 rpm de (170 x g) 15 dak. santrifüj edildi. Sonra süpernatant at ld ve her tüpe 5 ml hipotonik eriyik ilave edilerek, 37 C de, 15 dak. bekletildi. Daha sonra 1200 rpm de santrifüj yap larak, tekrar süpernatant at ld ve her tüpe 5 ml so uk fiksatif eklenerek, oda s cakl nda 20 dak. fiksatif ile muamele edildi. Muamele sonunda tüpler, 1200 rpm de 15 dak. santrifüj edilerek, süpernatant at ld. Bu i lem 3 kez tekrarland. Son santrifüjde, dipte kalan ml s dan preparatlar yap ld. Bu ekilde haz rlanan preperatlar kurutularak, %5 lik Giemsa eriyi i ile boyand. Boyal preperatlar entellan ile kapat larak, mikroskobik incelemeler yap ld.

3 Kromozom Aberasyonu (KA) De erlendirmesi Deney ve kontrol grubu ö rencilerdeki kromozom yap ve say anormalliklerini (KA) y, belirlemek için her ki iden haz rlanan, iyi da lm kromozomlara sahip 100 hücre (25 i deney grubu, 25 i kontrol grubu olmak üzere toplam 50 ki iden 5000 hücre) incelendi. nceleme s ras nda, bu hücrelerde gözlenen kromatid k, kromozom k, fragment, kromatid de imi, disentrik kromozom, karde kromatid birle mesi, halka kromozom gibi yap sal (kromozom tipi ve kromatid tipi anormallikler) ve say sal kromozom anormallikleri Paz-y-Miño ve ark. na göre kaydedildi [24]. Saptanm olan kromozom aberasyonlar ndan hücre ba na dü en yap sal kromozom anormalli i yüzdesi hesapland. Gap lar anormallik olarak de erlendirilmedi. Gap lar ile kromatid ve kromozom tipi klar aras ndaki farklar, Kauderer ve ark. n n bildirdi ine göre Preston a uygun olarak ay rt edildi [25]. Mitotik ndeks (M )De erlendirmesi hesaplamak için her ki iden 3 bin hücre incelendi ve bunlar aras nda mitoz bölünme geçiren hücrelerin say kaydedilerek, 3 bin hücre içinde mitoz bölünme geçiren hücrelerin oran yüzde (%) cinsinden hesapland. statistiksel De erlendirme Mikroskobik inceleme sonucunda deney ve kontrol gruplar ndan elde edilen KA ve M de erleri aras ndaki fark n önemli olup olmad, SPSS 10.0 program ndaki t- testi metodu kullan larak kar la ld. 3. Bulgular Kimya bölümünde laboratuar derslerine kat p, kimyasala maruz kald dü ünülen ki ilerin, periferal lenfositlerindeki kromozom anormallikleri, kontrol grubu ki ilerinden elde edilen hücrelerdeki kromozom anormallikleri ile kar la ld. Yap lan istatistiksel kar la rmada, iki grup aras nda yap sal kromozom anormallikleri bak ndan önemli bir fark bulunamad (p>0.05) (Tablo 1). ncelenen anormal hücre yüzdesinin kontrole nazaran önemli derecede yüksek olmad saptand (Tablo 1). Ayr ca yap lan incelemelerde say sal kromozomal anormalli ine rastlanmad. Tablo 1. Deney grubu ile kontrol grubunun periferal lenfosit hücrelerinden elde edilen ortalama yap sal kromozomal anormallik (KA) de erlerinin istatistiksel kar la rmas. Grup N Yap sal KA /Hücre (%) Ortalama±SH Kontrol grubu ±0.002 Deney Grubu ±0.003 SH: Standart hata, N: Birey say, p>0.05 p Mitoz bölünmede de iklik olup olmad saptamak için deney ve kontrol grublar nda Mitotik indeks (M ) de erleri belirlendi. Yap lan istatistiksel kar la rma sonucunda, 219 deney grubu M de erleri ile kontrol grubu M de erleri aras nda önemli bir fark bulunamad (p>0.05) (Tablo 2). Tablo 2. Deney grubu ile kontrol grubundan elde edilen ortalama % Mitotik ndeks (M ) de erlerinin istatistiksel kar la rmas. Gruplar Deney grubu ±0.182 SH: Standart hata, N: Birey say, p>0.05 N 4. Tart ma ve sonuç (%) Ortalama±SH Kontrol grubu ±0.126 Kimyasal maddelerin canl lar üzerindeki zararl etkilerinin incelenmesi için çe itli testlerden yararlan lmaktad r. Genotoksik hasar n belirlenmesinde, kromozom aberasyonu (KA), mikronükleus (MN), karde kromatid de imi (KKD), AMES ve COMET olu umu gibi sitogenetik testler kullan r [1]. Önceki çal malarda, bu testlerle çe itli kimyasallar n genotoksik etkileri ara lm, fakat üniversitelerin kimya bölümünde okuyan ve laboratuar çal malar esnas nda kimyasala maruz kald dü ünülen rencilerin, maruz kal nan kimyasallardan etkilenip etkilenmediklerine dair her hangi bir çal maya rastlan lamam r. Biz bu çal mam zda, kimya rencilerinin, deneyler esnas nda maruz kald klar kimyasallardan etkilenip etkilenmediklerini, kromozom aberasyonu testi ile belirleyerek, mitotik indeksi saptad k. Laboratuarlarda kullan lan, asitler (Asetik asit, hidroklorik asit, sülfürik asit, sitrik asit, H 2 S) ve organik çözücülerle (Metanol, etanol, aseton, n-hekzan, dietil eter, kloroform, v.b) ilgili çe itli çal malar yap lm ve bu maddelerin canl lar üzerindeki genotoksik etkileri de erlendirilmi tir [16-22]. Bu kimyasal maddeler, tar m, g da, boya sanayi ve kozmetiklerde kullan lan ilaçlar n etken maddesini olu turarak, do al çevre ve insan sa tehdit etmektedir [26-29]. Kimya ve biyoloji laboratuar nda görev yapan ki ilerle yap lan çal mada, bu ki ilerin çal klar laboratuarlarda maruz kald klar kimyasal ve biyolojik zararlardan ki isel olarak etkilendikleri, kromozom aberasyonu testi ile belirlenmi tir [30]. Bu çal mada özellikle genetik laboratuar nda çal an bireylerde genotoksik etkinin yüksek ç kmas n sebebi, görüntüleme sistemleri (elektron mikroskobu gibi) ve kimyasal maddelerle (hidroklorik asit, metanol, asetik asit, formaldehit, ethidiyum bromid vb.) yo un olarak çal lmalar r [30]. Ayn çal mada kimya laboratuar çal anlar nda kimyasal maddelerin etkisinin az olmas n sebebi ise, kimya laboratuarlar n fiziki artlar n iyi olmas ve çal an ki ilerin eldiven, gözlük, maske vb. gibi koruyucu malzemeler kullanmaya özen göstermeleridir [30]. Benzer ekilde, ayakkab imalathane ve tamirhaneleri ile patoloji ve anotomi laboratuar nda çal anlarla yap lan çal mada, bu ki ilerin özellikle n-hekzan ve formaldehid gibi organik çözücülere maruz kalmalar nedeniyle bukkal epitelyum hücrelerindeki hasarlar n kontrol grubuna göre art gösterdi i belirlenmi tir [23]. Biz de çal mam zda, p 0.926

4 220 kimya bölümünde ö renim gören ve ö renimleri süresince kimya laboratuarlar nda deney yapan ö rencilerin, bu laboratuarlarda kullan lan kimyasal maddelerden etkilenmediklerini kromozom aberasyonu testi ile belirledik. Yapt z bu çal maya göre ö rencilerin kimyasallardan etkilenmemelerinin en önemli sebebi, kimyasallara maruz kalma sürelerinin az olmas ve maruz kal nan sürenin zamana yay lmas r. Ayr ca, ö rencilerin kimyasal maddelerle temas n azalt lmas, deneyler esnas nda laboratuarlar n iyi havaland lmas, çeker ocak kullan lmas gibi tedbirlerin al nmas da önemlidir. Daha önce de ifade edildi i gibi, çal ma ko ullar, çal lan yerin fiziki özellikleri ve maruz kal nma süresi, maruziyetten etkilenme derecesini önemli ölçüde de tirmektedir. Ö rencilerimizin kimyasal tehditlerden en az etkilenmeleri için gerekli tedbirlerin al nd na ve gelecekte de al naca na inan yoruz. Bu çal ma kimya laboratuar dersine kat lan ö renciler üzerinde yap lan ilk deneysel çal ma olmas ve gelecekte yap lacak çal malara kaynak olu turmas bak ndan önemlidir. Kaynaklar 1. Vural, N., Toksikoloji. Pestisitler, Ankara üniversitesi Eczac k Fakültesi Yay nlar No:73 sayfa; 344, Ankara Hynes, G.M., Torous, D.K., Tometsko, C.R., Burlinson, B. and Gatehouse, D.G. The single laser flow cytometric micronucleus test: a time course study using colchicine and urethane in rat and mouse peripheral blood and acetaldehyde in rat peripheral blood. Mutagenesis. 17(1), 15-23, Derelanko, M.J., Rinehart, W.E., Dean, E. and Rodwell, D.E. Developmental toxicity studies of methyl ethyl ketoxime (MEKO) in rats and rabbits. Drug Chem Toxicol. 26 (3), , Boyac lu, M. ve Parlak, H. zmir Körfezine Akan Dere Sedimentlerinin Mutajenitesi E.U. Journal of Fisheries & Aquatic Sciences. 18 (3-4), , Mercangöz, A. ve Ayaz Tüylü B. 2, 4, 5 Tri (Sübstitüe) Fenil Imidazol ve Türevlerinin Mutajenik Etkilerinin Ames/Salmonella Test Sisteminde Saptanmas. Turk J Biol. 24, 57 64, Madhavi D., Devi, K.R. and Sowjanya BL. Increased frequency of chromosomal aberrations in industrial painters exposed to lead-based paints. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 27(1), 53-9, Santa Maria, S,.R., Arana, M., and Ramirez, O. Chromosomal aberrations in peripheral lymphocytes from male native miners working in the Peruvian Andes. Genet. Mol. Biol. 30(4), , Hoyos,L.S., Carvajal, S., Solano, L., Rodriguez, J., Orozco, L., Lopez, Y. and Au, W.W. Cytogenic monitoring of farmers exposed to pesticides in Colombia. Environ. Health Perspect. 104(3), , Çelik, A., Çava, T., and Ergene Gözükara, S. Cytogenetic biomonitoring in Petrol sation Attendants: Micronukleus Test in exfoliated buccal cells. Mutagenesis18(5), , Besaratinia, A., Van Straaten, H.W., Godschalk, R.W., Van Zandwijk, N., Balm, A.J, Kleinjans, J.C. and Van Schooten, F.J. Immunoperoxidase detection of polycyclicaromatic hydrocarbon-dna adducts in mouth floor and buccal mucosa cells of smokers and nonsmokers. Environ Mol Mutagen. 36(2), , Martino-Roth, M.G., Viegas, J. and Roth, D.M. Occupational genotoxicity risk evaluation through the comet assay and the micronucleus test. Genet Mol. Res. 2(4), , Meng, Z. and Zhang, B. Chromosomal Aberations and Micronuclei in Lymphocytes of Workers at a Phosphate Fertilizer Factory. Mutation Research. 393, , Karahalil, B., Karakaya, A.E. and Burgaz, S. The micronucleus assay in exfoliated buccal cells application to occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons.mutation research. Genetic toxicology and environmental mutagenesis. Mut. res., Genet. toxicol. environ. Mutagen. 442, 29-35, Kamiguchi, Y. and Tateno, H. Radition and Chemical nduced Structural Chromosome Aberrations in Human Spermatozoa. Mutation research/ Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 504 (1), , Chen, C., Arjomandi, M., Qin, H., Balmes, J., Tager, I. and Holland, N. Cytogenetic damage in buccal epithelia and peripheral lymphocytes of young healthy individuals exposed to ozone. Mutagenesis. 21(2), , Yager, J.W, Hines, C.J. and Spear, R.C. Exposure to ethylene oxide at work increases sister chromatid exchanges in human peripheral lymphocytes. Science. 219, , Mustonen, R., Kangas, J., Vuojolahti, P. and Linnainmaa, K. Effects of phenoxyacetic acids on the induction of chromosome aberrations in vitro and in vivo. Mutagenesis. 1(4), , Luhr, O.R., Frostell, C.G., Heywood, R., Riley, S. and Lönnqvist, P.A. Induction of chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes after short time inhalation of nitric oxide. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 414(1-3), , 1998.

5 Sera, N., Fukuhara, K., Miyata, N. and Tokiwa, H. Micronucleus induction and chromosomal aberration of 26. Nair, B. and Elmore, A.R. Final report on the safety assessment of sodium sulfite, potassium sulfite, 1-and 3-nitroazabenzo(a)pyrene and their N-oxides. ammonium sulfite, sodium bisulfite, ammonium Mutagenesis. 16(3), , bisulfite, sodium metabisulfite and potassium 20. Almeida Reis, S.R., Espírito Santo, A.R., Andrade, M.G.S. and Sadigursky, M. Cytologic alterations in the oral mucosa after chronic exposure to ethanol. Braz. oral res. 20(2), , Biondi, O., Motta, S. and Mosesso, P. Low molecular weight polyethylene glycol induces chromosome metabisulfite. Int J Toxicol. 2, 63-88, Ieradi, L.A., Zima, J., Allegra, F., Kotlanova, E., Campanella, L., Grossi, R. and Cristaldi, M. Evaluation of genotoxic damage in wild rodents from a polluted area in the Czech Republic. Folia Zool. 52(1), 57 66, aberrations in Chinese hamster cells cultured in vitro. 28. adoková, E., M klov ova, M., Dúhová, V., Mutagenesis. 17(3), , Beddowes, E.J, Faux, S.P., Chipman, J.K. Chloroform, carbon tetrachloride and glutathione depletion induce secondary genotoxicity in liver cells via oxidative stress. Toxicology. 3;187(2-3),101-15, Burgaz, S., Erdem, O., Cakmak, G., Erdem, N., Karakaya, A. and Karakaya, A.E. Cytogenetic analysis of buccal cells from shoe-workers and pathology and anatomy laboratory workers exposed to n-hexane, toluene, methyl ethyl ketone and formaldehyde. Biomarkers. 7 (2), , Paz-Y-M ño, C., Bustamante, G., Sánchez, M.E. and Leone, P.E. Cytogenetic Monitoring in a Population Occupationally Exposed to Pesticides in Ecuador. Garajová, L., Böhmová, B., Podstavková, S. and Vl ek, D. Effects of The Insecticide Pyrethroid II in the Ames Test, and on Hordeum vulgare and Vicia faba. Biologia Plantarum (PRAHA). 33 (2), , Pastor, S., Gutierrez, S., Creus, A., Xamena, N., Piperakis, S. and Marcos, R. Cytogenetic analysis of Greek farmers using the micronucleus assay in peripheral lymphocytes and buccal cells. Mutagenesis. 16, , Almeida Santos, M.F.M., Ferrari, I. and Luna, H. Chromosomal aberration analysis in workers exposed to chemical and biological hazards in research laboratories. Environmental Research. 97(3), , Environ. Health. Perspect. 110 (11), , Kauderer, B., Zam th, H., Paumgarten, F.J. and Spe t, G. Evaluation of the Mutagenicity of Beta-Myrcene in Mammalian Cells In Vitro. Environ. Mol. Mutagen. 18 (1), 28-34, 1991.