T.C. Bupleurum lancifolium Hornem. TÜRÜNÜN. Zeynep ALATA. Biyoloji Anabilim Dal. Ocak-2011 KONYA

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜN VERS TES FEN B MLER ENST TÜSÜ Bupleurum lancifolium Hornem. TÜRÜNÜN ANT BAKTER YEL ETK LER N BEL RLENMES Zeynep ALATA YÜKSEK L SANS TEZ Biyoloji Anabilim Dal Ocak-2011 KONYA Her Hakk Sakl r

2

3 TEZ B LD Bu tezdeki bütün bilgilerin etik davran ve akademik kurallar çerçevesinde elde edildi ini ve tez yaz m kurallar na uygun olarak haz rlanan bu çal mada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kayna na eksiksiz at f yap ld bildiririm. DECLARATION PAGE I hereby declare that all information in this document has been obtained and presented in accordance with academic rules and ethical conduct. I also declare that, as required by these rules and conduct, I have fully cited and referenced all materials and results that are not original to this work. Zeynep ALATA iii

4 ÖZET YÜKSEK L SANS TEZ Bupleurum lancifolium Hornem. TÜRÜNÜN ANT BAKTER YEL ETK LER N BEL RLENMES Zeynep ALATA Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dal Dan man: Yrd. Doç. Dr. Mehtap AKIN 2011, 65 Sayfa Jüri Yrd. Doç. Dr. Mehtap AKIN Yrd. Doç. Dr. Rüstem DUMAN Yrd. Doç. Dr. Ahmet ÜNVER Bu çal mada Bupleurum lancifolium Hornem. türünün antibakteriyel etkilerinin belirlenmesi amaçlanm r. Ara rmada Bupleurum lancifolium Hornem. bitkisinin kök ve toprak üstü mlar ndan elde edilen kloroform, etil asetat, aseton, etanol ve metanol ekstrelerinin antibakteriyel etkileri Stapylococcus aureus ATCC 6538, Stapylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 3166, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 29988, Proteus mirabilis ATCC 43071, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Pseudomonas aeruginosa ATCC 29853, Bacillus cereus ATCC 11778, Streptococcus salivarius RSHE 606, Stapylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas fluorescens ATCC 49642, Enterobacter sakazakii ATCC bakterileri su lar na kar mikrodilüsyon yöntemi kullan larak test edilmi tir. Ara rma sonuçlar ekstrelerin test bakterilerine kar antibakteriyel bir etkisinin olmad göstermi tir. Anahtar Kelimeler: Antibakteriyel etki, Bakteriler, Bupleurum, Ekstraksiyon, Mikrodilüsyon iv

5 ABSTRACT MS THESIS THE DETERMINATION of ANTIBACTERIAL EFFECTS of Bupleurum lancifolium Hornem. SPECIES Zeynep ALATA THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE IN BIOLOGY Advisor: Asst. Prof. Dr. Mehtap AKIN 2011, 65 Pages Jury Asst. Prof. Dr. Mehtap AKIN Asst. Prof. Dr. Rüstem DUMAN Asst. Prof. Dr. Ahmet ÜNVER This study aimed to determine the antibacterial effect of Bupleurum lancifolium Hornem. species. In this research, the antibacterial effect of chloroform, ethyl acetat, aceton, ethanol and methanol extracts of aerial part and root of Bupleurum lancifolium Hornem., were tested against Stapylococcus aureus ATCC 6538, Stapylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 3166, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 29988, Proteus mirabilis ATCC 43071, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Pseudomonas aeruginosa ATCC 29853, Bacillus cereus ATCC 11778, Streptococcus salivarius RSHE 606, Stapylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas fluorescens ATCC 49642, Enterobacter sakazakii ATCC by using microdilution method. The results showed that the extracts have not antibacterial effect against test bacteria. Keywords: Antibacterial effects, Bacteria, Bupleurum, Extraction, Microdilution v

6 ÖNSÖZ Bu çal ma Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dal nda yüksek lisans tezi olarak haz rlanm r. Ara rmada Bupleurum lancifolum Hornem. bitki türünün 14 adet test mikroorganizmas na kar antibakteriyel etkileri test edilmi tir. Yüksek lisans çal mam boyunca her türlü yard m ve deste ini esirgemeyen, bilgi ve tecrübelerinden faydaland m dan man hocam Say n Yrd. Doç. Dr. Mehtap AKIN a, laboratuar çal malar mdaki yard mlar ve deste i için Say n Ar. Gör. Hatice TANER SARAÇO LU na, su temin etmemde yard mc olan l Kontrol Laboratuar Mikrobiyoloji efi Dr. Emrah TORLAK a, bitkilerin te hisinde yard mc olan Doç. Dr. Tuna UYSAL a, projeye maddi desteklerinden dolay Bilimsel Ara rma Projeleri (BAP) Koordinatörlü üne, yapt m çal malar n her a amas nda maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen e im ve aileme sonsuz te ekkürlerimi sunar m. Zeynep ALATA KONYA, 2011 vi

7 NDEK LER TEZ B LD.. iii ÖZET... iv ABSTRACT... v ÖNSÖZ... vi NDEK LER... vii MGELER VE KISALTMALAR... viii 1. G KAYNAK ARA TIRMASI MATERYAL VE METOT Materyal Ara rma yap lan bitki türü Ara rmada kullan lan bakteriler Ara rmada kullan lan çözücüler Ara rmada kullan lan besiyeri Metot Ekstrelerin haz rlan Mikrodilüsyon yöntemiyle antibakteriyel etkinin belirlenmesi ARA TIRMA BULGULARI VE TARTI MA SONUÇLAR VE ÖNER LER KAYNAKLAR ÖZGEÇM vii

8 MGELER CFU/ml : Milimetredeki koloni olu turan birim veya milimetre ba na koloni olu turan birim olarak ifade edilen bir mikrobiyoloji terimidir.(colony Forming Unit). g : 10-6 gram. PCR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu KISALTMALAR DMSO: Dimetil sülfoksit. K: Minimum nhibisyon Konsantrasyonu. viii

9 1 1. G Hastal k etkenlerinin insanlardan önce dünya üzerinde bulunduklar dü ünülmektedir. Ele geçen eski devirlere ait kemikler ve baz fosiller bu fikri kuvvetlendirmektedir. Bu yüzden ilk insanlar n hastal klara kar bir korunma yöntemi olmal r. Akla gelebilen ilk ihtimal hastal klara kar içgüdüleri ile sava olmalar r. Uzunca bir aradan sonra insanlar yava yava etraflar ndaki su, toprak, bitki gibi tabiat elemanlar tedavi arac olarak kullanmaya ba lam lard r ( Baytop, 1999). Son y llarda, antibiyotiklere kar dirençli olan mikroorganizmalardan kaynaklanan enfeksiyon riskinin art, yeni ve do al antimikrobiyal maddelerin ke fini ilgi oda haline getirmi tir. Bunun da ötesinde, ba ta sentetik yap dakiler olmak üzere, dalara koruyucu amaçlarla eklenen ço u katk maddesinin, konuya kar hassasiyet gösteren tüketicilerde ileriye dönük endi eler olu turmas, organik g da, organik tar m gibi terimleri beraberinde getirmi tir. Bilinçli g da tüketicilerinde olu an bu beklenti, bu alanda hizmet veren kurulu lar do al koruyucular kullanmaya te vik etmenin ötesinde zorlar hale gelmi tir. Konu çiftlik boyutuna ta nd nda, tehlikenin ciddiyeti bir kez daha gözler önüne serilmektedir. Hayvan yemlerine antimikrobiyal ve büyümeyi h zland ajanlar olarak kat lan antibiyotikler, pek çok ülkede yasaklanm olmakla beraber, halk sa tehdit eden önemli bir problem olarak varl sürdürmektedir. Dolay yla bu aç dan bak ld nda, çe itli bitkilerin ara rmac lar taraf ndan incelenip mikroorganizmalara kar etkinliklerinin test edilmesinin gereklili i daha iyi anla lacakt r (Duman Ayd n, 2008). Son y llarda t bbi bitkiler ve bunlardan elde edilen aktif maddeler üzerindeki çal malar ve bunlara kar olan ilginin artmas n ba ca sebepleri unlard r: 1. Yeterli düzeyde bir kimya endüstrisine sahip olmayan geli mekte olan ülkelerin memleketlerindeki bitkilerden yararlanarak kolay ve ucuz bir tedavi olana elde etmek istekleri, 2. Tedavide kullan lan sentetik bile iklerin baz lar nda görülen tehlikeli yan etkiler, 3. Bitkisel droglar n birkaç etkiye birden sahip olmalar, vb. (Baytop, 1999). Bitkisel droglarda selüloz, ni asta, pektin, protein, eker gibi tedavi yönünden etkisiz maddeler yan nda çok az miktarlarda bile farmakolojik etkilere sahip bile ikler de bulunmaktad r. Bu bile iklere etken madde ad verilmektedir. Bunlar, kimyasal özelliklerine göre; glikozitler, organik asitler, tanenler, alkoloitler, sabit ya lar, uçucu ya lar, reçineli bile ikler, vitaminler, antibiyotikler olarak s fland rlar. Bu etkili

10 2 maddeler bitkilerin yaprak, çiçek, meyve, tohum, kök gibi çe itli organlar nda bulunmaktad r (Baytop, 1999). Tüm dünyada oldu u gibi ülkemizde de çe itli bitkiler y llardan beri halk aras nda çay, baharat ve tedavi amaçl olarak kullan lmaktad r. Ancak, bakterilerde antibiyotik dirençlili inin artmas na kar k antimikrobiyal özellik gösteren bitkilere ve bitkisel ürünlere kar direnç kazand görülmemektedir (Toro lu ve Çenet, 2006). Bitkisel droglarda etkili saf bile iklere oranla, effektif doz ile letal doz aras ndaki mesafe oldukça geni tir. Bu nedenle bitkisel droglar ile zehirlenerek ölüm ihtimali saf etkili maddelere oranla çok daha azd r. Bu da halk aras nda bitkilerin tedavi amaçl kullan artt rmaktad r (Baytop, 1999). Bilinen birçok antibiyoti e direnç geli tirmekte olan bakterilerde, ilaç dirençlili i artmakta ve yay lmaktad r. Bu sebepten dolay ilaçlara alternatif olarak t bbi bitkilerin kullan lmas tavsiye edilmekte ve baz geleneksel bitkiler antimikrobiyal olarak kullan lmaktad r (Abaskal ve Yarnell, 2002). Mikroorganizmalar genel anlam ile antibiyotiklere üç yoldan direnç geli tirirler: 1. Antibiyoti in hedef bölgeye ula mas engelleyerek (ya içeri girmesini güçle tirerek ya da d ar at h zland rarak), 2. Hedef noktay de tirerek, 3. Antibiyoti i bir kar madde ile etkisizle tirerek (Vahabo lu, 1998). 20. yüzy n ikinci yar ndan itibaren sentetik ilaçlar n zamanla hastal klar n yeni türlerine kar etkisiz kald, birçok yan ve toksik etkilerinin oldu u anla lm ve yeniden bitkisel kökenli do al ilaçlara olan ilgi artmaya ba lam r. Do al ilaçlar ba ca bitkilerden, hayvanlardan, minerallerden ve fermantasyonla mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Özellikle bitkiler taze olarak, kurutulmu olarak veya etken madde olarak do al ilaç kaynaklar n ba nda yer almaktad rlar. Bugün dünyada kabul görmü ilaçlar n %25 inin etkili maddesi bitkisel kökenlidir (Baydar, 2005). Antimikrobiyal direnç, insan uygulamalar içeren çe itli faktörler taraf ndan güçlendirilebilen ve h zland labilen biyolojik bir olayd r. Her enfeksiyon için, her zaman diliminde, her dozda antibiyotik kullan mikroplar ya adapte olmaya ya da ölmeye zorlar (WHO, 2002). nsanlar n önemli patojenleri ve hastanelerin kapal ortam ndan halka aç k yerlere yay lan bakterilerin artan antimikrobiyal dirençleri halk sa için bir tehdit olarak alg lanmaktad r. nsanlarda, hayvanlarda, bitkilerde veya g da teknolojisinde

11 3 kullan lan her antimikrobiyal kullan bakteriyel dirence sebep olabilir. Ülkeler aras yolculuk, g da ve hayvan ticareti dünya genelinde antimikrobiyal direnç riskini artt r (Acar ve Röstel, 2001). Günümüzde hastane enfeksiyonunun kayna olarak bilinen pek çok bakteri sentetik antibiyotiklere direnç kazanm bulunmaktad r. Bakterilerin kazand klar bu dirençle ilgili günümüzde baz çal malar yap lmaktad r. S rmatel ve ark. (2004) bakterilerdeki dirençle ilgili bir çal ma yapm lard r. Hastanede yatan hastalar n balgam, burun sürüntüsü, idrar ve yara materyali gibi çe itli örneklerinden izole edilen 42 si Staphylococcus aureus ve 33 ü koagulaz negatif stafilokok (KNS) olmak üzere toplam 75 stafilokok su u çal ma kapsam na al nm r. Antibiyotik direnci disk difüzyon ve mikrodilüsyon yöntemleri ile incelenmi tir. S. aureus su lar nda; metisilin direnci % 14 iken KNS larda % 30 olarak saptanm r. M K de erlerine göre metisiline duyarl S. aureus ve KNS su lar n antibiyotik direnci s ras ile penisilin G için % 83 ve % 61; ampisilin-sulbaktam için % 14 ve % 9; sefalotin için % 8 ve % 13 olarak bulunmu tur. Metisiline duyarl ve dirençli su larda s ras ile trimetoprimsulfametoksazol için % 10 ve % 56; eritromisin için % 8 ve % 63; klindamisin için % 12 ve % 50; gentamisin için % 14 ve % 81; ofloksasin için % 7 ve % 38; siprofloksasin için % 7 ve % 25 direnç saptanm r. Sonuç olarak nozokomial enfeksiyonlarda metisiline dirençli stafilokoklar, antibiyotiklere, metisiline duyarl stafilokoklardan daha dirençli bulunmu tur (p<0.05). Bugün dünyada yakla k çiçekli ya da tohumlu bitki türünün kay tl oldu u, bunlardan yakla k inin t bbi amaçlar için kullan ma elveri li oldu u, civar nda bitkisel drogun yo un olarak kullan ld ve özellikle 500 e yak n ekonomik amaçl olarak ticareti yap ld rapor edilmektedir. Türkiye tür çe itlili i ve endemizm bak ndan oldukça ansl ülkeler aras ndad r. Türkiye de do al olarak yeti en in üzerindeki türden yakla k i endemiktir. 500 kadar da ilaç ve koku hammaddesi olarak kullan lmaktad r (Baydar, 2005). Günümüzde pek çok hastal n tedavisinde t bbi bitkilerin destekleyici, önleyici etkisi her geçen gün önem kazanmakta ve bu konuda ara rmalar yap lmaktad r. Bupleurum cinsinin bir çok türü de deneylerle kan tlanan çe itli etkileriyle t bbi bitkiler aras ndaki yerini alm r. Bu çal ma ile, Bupleurum lancifolium Hornem. türünün insan ve hayvanlarda hastal k olu turan baz patojen bakteri türlerine kar antibakteriyel etkilerini belirlemek, antibakteriyel aktivite konusunda yap lan di er çal malara katk da bulunmak amaçlanm r.

12 4 2. KAYNAK ARA TIRMASI Türkiye mevcut bitkisel çe itlili i yönünden oldukça dikkate de er ve zengin bir floraya sahiptir. Ülkemizin mevcut bitki potansiyelinin, çe itli endüstri sahalar nda kullan, dünyada yap lan çal malar genel olarak de erlendirildi inde çok önemli olabilece i görülebilmektedir. Tüm dünyada oldu u gibi, ülkemizde de son y llarda do al zenginliklerin yava yava tükenmesi ve ekonomik olarak girilen ç kmazlar, do al ürünlerin çok amaçl kullan lmalar zorunlu k lm r (Toro lu ve Çenet, 2006). Hammer ve ark. (1999) 52 adet bitkinin uçucu ya ve ekstrakt n çe itli bakterilere kar antimikrobiyal aktivitelerini belirlemek için yapt klar çal mada bitki uçucu ya ve ekstraktlar n farmasötik ve koruyucu bir role sahip olabilecekleri sonucuna varm lard r. Kele ve ark. (2001) Türkiye nin çe itli yörelerinden toplanan 13 bitki türünden elde ettikleri 14 etanol ekstrakt n iki gram (+), be gram (-) bakteri türüne kar disk difüzyon ve dilüsyon yöntemleri ile in vitro antibakteriyel etkisini ara rd klar çal malar nda, disk difüzyon yönteminde olu an inhibisyon zon çap na göre 14 bitki ekstrakt n 12 tanesinin, bakteri türlerine kar de en derecelerde antibakteriyel etkiye sahip oldu u, incelenen bitkilerin ço unun antibakteriyel ajanlar n kayna olabilece i kan na vard lar. Bitkilerin antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesinde uçucu ya veya ekstraktlar kullan lmaktad r. Antimikrobiyal aktivite gösteren bitkiler g dalarda koruyucu madde, t bbi amaçl, anti-helmintik, anti-fungal olarak ve bitki zararl lar na, yabanc otlara kar mücadelede kullan lmaktad r (Toro lu ve Çenet, 2006). Çe itli bitkilerin ekstraktlar ndan elde edilen (Bupleurum, Heteromorpha) saikosaponinlerin baz farmakolojik etkilere sahip olduklar bildirilmi tir. Bunlar n hepatitde, nefritte, kas gev etici, antibakteriyel ve antiviral etki gösterdikleri bilinmektedir (Benito ve ark., 1998). Bupleurum falcatum L. (Umbelliferae) kökleri geleneksel Çin tedavisinde yayg n olarak kullan lmaktad r. Türkiye'de do al olarak 45 Bupleurum türü yeti mektedir. Co kun ve ark. (1996) Türkiye'de yeti en Bupleurum falcatum alt türlerinin köklerinde bulunan saikosaponinlerin te hisi, miktar n tayini ve elde edilen sonuçlar tedavide kullan lan Japonya kökenli Radix Bupleuri ile kar la rmak amac yla yapm olduklar çal mada, Türkiye'de yeti en Bupleurum falcatum ssp. polyphyllum ve Bupleurum falcatum ssp. cernuum'un köklerinin özellikle

13 5 saikosaponin a yönünden çok zengin oldu unu ortaya koymu lar ve B. falcatum ssp. polyphyllum ve B. falcatum ssp. cernuum köklerinin Japonya'da kullan lan B. falcatum kökleri gibi kullan labilece ini belirtmi lerdir. Zhu ve ark. (2009) nitrojen ve fosfor gübresinin Bupleurum chinense DC. nin yap nda bulunan saikosaponin verimi üzerine etkisini ara rd klar çal malar nda orta düzeydeki gübrenin bitkinin canl a rl nda ve köklerdeki saikosaponin a miktar nda önemli bir art a sebep oldu u ancak köklerdeki saikosaponin d miktar nda ise önemli bir etkisinin olmad göstermi lerdir. Saikosaponin a ve d deki en büyük art n nitrojen ve fosfor gübresinin birlikte uyguland durumlarda ortaya ç kt bildirmi lerdir. Bu durum bitkinin geli imi ve saikosaponin üretimi üzerinde sinerjik bir etkiye sahip olduklar göstermektedir. Bupleurum köklerinden izole edilen ço u saikosaponinlerin kas gev etici, antiviral veya antihepatoksik aktiviteleri içeren farmokolojik etkilere sahip oldu u rapor edilmi tir (Cheng ve ark., 2005). Bupleurum chinense DC. çok önemli bir Çin ilac olarak bilinir. Ço unlukla so uk alg nl, ate, titreme, duygusal yo unluk gibi s nt durumlarda tedavi için kl kla kullan r. Liang ve ark. (1998) yapt klar çal mada Bupleurum chinense DC. bitkisinin içeri inden yeni bir saikosaponin izole etmi ler ve yap nda 3 beta, 16 beta, 28-trihydroxy-11-alpha-methoxy-olean-12-ene-3-O-beta-D-fucoside eklinde bir kimyasal oldu unu belirlemi lerdir. Buna ek olarak 6 saikosaponin olarak bilinen ve karakterize edilen saikosaponin a, saikosaponin d, saikosaponin c, saikosaponin f, saikosaponin b3 ve saikosaponin b2 yi de izole etmi lerdir. Bütün bu içerikler Bupleurum chinense DC. den tek seferde ay rt edilmi tir. Bupleurum kökleri genellikle geleneksel hekimlikte grip ya da so uk alg nl ile ate, a ve iltihab n birlikte bulundu u durumlarda tedavi amac yla kullan lmaktad r. Bitki uçucu ya n ate in etkili tedavisinde ba ca rol oynad genellikle iddia edilmektedir. Xie ve ark.(2006) yapt klar çal malarda burun spreyinin formülüne Bupleurum köklerinden elde edilen uçucu ya ilave edilirse ate in tedavisinde kuvvetli bir etki olu turaca belirtmi lerdir. Fernández-Ocaña ve ark. (2004) Bupleurum gibraltarium un toprak üstü mlar ndan elde edilen uçucu ya n ayçiçe indeki Plasmopara halstedii ye kar olan antifungal aktivitesini ara rm lard r. Daha önce uçucu ya ile muamele görmü olan mantar sporlar ayçiçe i fidelerine a lanm ve sporulasyon oran 11 gün sonra ölçülmü tür. 5,0 ml./l. konsantrasyonundaki ya aç k bir ekilde mantar n spor

14 6 olu turmas engellemi tir. Fakat dü ük konsantrasyonda yaln zca ço almas azaltmaktad r. Ya n ana bile iminde ise sabinen, -pinen ve 2,3,4- trimethilbenzaldehit bulundu unu belirlemi lerdir. Bupleurum scrozonerifolium un kökleri (Nan-Chai-Hu) geleneksel Çin t bb nda hepatit ve siroz gibi karaci er hastal klar nda kullan lmaktad r. Cheng ve ark. (2005) yapt klar çal mada Bupleurum scrozonerifolium un aseton ekstrakt n (BS-AE) A549 insan akci er kanser hücrelerinde ço almay inhibe edici etkisini belirlemi lerdir. Sonuçlar, BS-AE nin A549 hücrelerinde tubulin polimerizasyonuna sebep olarak ve hücrelerdeki caspase 3 ve 9 u aktive ederek hücreyi G2/M safhas nda tuttu unu göstermi tir. Fernández-Ocaña ve ark. (2006) n n, Bupleurum gibraltarium Lam. n yaprak, gövde, çiçek ve tüm toprak üstü k mlar ndan elde ettikleri uçucu ya n verimi ve bile imini ara rd klar çal mada yaprak ve gövdeden elde edilen uçucu ya n çiçeklenme sonras, buna kar n çiçeklerinden elde edilen uçucu ya n tam çiçekli oldu u dönemde maksimum seviyeye ula belirlenmi tir. Ayr ca uçucu ya numuneleri GC ve GC/MS ile analiz edildi inde ortak bile enin en fazla sabinen oldu u bildirilmi tir. Navarro ve ark. (2001) Bupleurum rotundifolium dan elde ettikleri saponin maddesinin etkisini farelerin kulak ödemleri üzerinde denemi lerdir. Elde ettikleri saponin örneklerinin farelerin kulak ödemlerinin üretti i TPA maddesini inhibe etti ini bildirmi ler ve ayr ca Bupleurum rotundifolium un kas gev etici etkisinde de saponinlerin aktif rol oynad belirtmi lerdir. Ocete ve ark. (1989), yapt klar çal mada Bupleurum gibraltarium un uçucu ya n s çanlarda ayak ödemlerine kar iltihap önleyici aktivite gösterdi ini belirlemi lerdir. Bu sonucun -3-carene bile iminden dolay oldu u, uçucu ya ve -3- carene nin her ikisinin de ratlarda kas lmalara neden olan oksitoksin ve asetilkolin niteli ine benzer etkide bulunduklar saptanm r. Gil ve ark. (1989) Granada n n 3 farkl bölgesinden (Cazulas da, Balconde kanal ve Quentar havzas ) toplanan Bupleurum gibralticum Lamarck n meyvelerinden elde ettikleri uçucu ya n kar la lmal çal mas nda 3 uçucu ya n da benzer kompozisyonda oldu u ve esas bile enlerin monoterpenik hidrokarbonlardan olu tu unu belirtmi lerdir. Lorente ve ark. (1989) Bupleurum fruticosum u iltihap önleyici aktivitesiyle birlikte nicel ve nitel olarak incelemi lerdir. Buna ek olarak asetilkolin ve oksitoksin

15 7 kullan larak haz rlanan preparat n s çan uteruslar ndaki spazm önleyici aktivitesini belirlemi lerdir. Bu uçucu ya n iltihap önleyici aktivitesini sa layan iki önemli bile enin -pinen ve -pinen oldu unu bildirmi lerdir. Martin ve ark. (1993) Bupleurum fruticescens in uçucu ya nitel ve nicel olarak GC ve GC-MS analizleriyle ara rm lard r. Uçucu ya n iltihap önleyici aktivitesi ve temel bile imleri s çanlar n arka ayaklar ndaki ödemlerde ara lm r. ltihap önleyici aktivitenin uçucu ya n iki temel bile eni olan -pinen ve -karyofilen taraf ndan sa land belirlemi lerdir. Testai ve ark. (2005) Bupleurum fruticosum köklerinin dola m sistemi üzerine etkilerini ara rmak üzere yapt klar çal mada kloroformik Bupleurum fruticosum köklerinden elde ettikleri ekstrakt n, endotelyumda ba ms z vazodilatör etkisinin varl göstermi lerdir. Estevez-Braun ve ark. (1994) Bupleurum salicifolium dan izole edilen polyacetylene bile iminin Gr (+) bakteri Staphylococcus aureus ve Bacillus subtilis e kar anlaml bir antibiyotik aktivitesi oldu u ancak Gr (-) bakteriler olan Escherichia coli, Salmonella ssp., Pseudomonas aeuriginosa ve Candida albicans a kar inaktif oldu unu göstermi lerdir. M K de eri Staphylococcus aureus için 10 g/ml, Bacillus subtilis için 10,5 g/ml olarak belirlenmi tir. Ayr ca bu çal mada betulin, herniarin, 6,7,8- trimethoxycoumarin, -hidroxyphenethyl alkol, pluviatolide, guamaroline, bursehernin, guayadequiol, kaerophyllin ve matairesinol gibi bile imler de izole edilmi tir. Temelinde saponin ve flavonoidler içeren Endonezya Umbelliferae bitkilerinin birço u kas gev etici etkiye sahip olduklar için bununla ilgili bir çal ma yap lm ve sonuçlar kas gev etici etkisi kan tlanm olan Bupleurum falcatum L. gibi bir bitkiyle yaslanm r. Her bir bitkinin kökleri, tohumlar toplan p kurutularak etanolle ekstrakt yap lm r. Saponin ve flavonoid içeri i gravimetrik ve UV-vis spektrofotometrik metotla analiz edilmi tir. Saponin ve flavonoid bak ndan en yüksek oran n Apium graveolens bitkisinin tohumlar nda bulundu u ve kas gev etici etkisinin ise Bupleurum falcatum L. bitkisinin kökleriyle ayn oldu u saptanm r (Pramono, 2005). Shan ve ark. (2007) baharat ve t bbi bitkilerden elde ettikleri toplam 46 ekstrakt n laboratuar ortam nda agar difüzyon metodu kullanarak 5 g da kaynakl bakteri (Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli ve Salmonella anatum) üzerinde antibakteriyel etkilerini ara rm lard r. Ayr ca fenolik içeriklerini de de erlendirmi lerdir. Ço u bitki ve baharat ekstrakt n yüksek

16 8 oranda fenolik içeri inin bulundu unu ve g da patojenlerine kar antibakteriyel etki gösterdi ini gözlemlemi lerdir. Ara rma sonucunda test ekstraktlar nda bulunan fenolik içerik ile antibakteriyel etki aras nda yüksek pozitif bir ili ki oldu unu saptam lard r. Ayr ca bu çal mada Bupleurum scorzonerifolium Willd. isimli bitkinin antibakteriyel etkisi de ölçülmü ve test mikroorganizmalar na kar antibakteriyel bir etkiye sahip olmad görülmü tür. Bertoli ve ark. (2004) Bupleurum fruticosum L. bitkisinin tarlada ve kültür ortam nda yeti en türlerinin uçucu ya bile imini GC ve GC-MS kullanarak analiz etmi ler, kültür bitkisiyle tarla bitkisinin yapraklar n ayn temel bile enleri ihtiva etti i ancak gövdesinin farkl bile enlere sahip oldu unu görmü lerdir. Saponinler tümör önleyici varl yla bilinen bitki glikozitleridir. Bachran ve ark. (2008), tümör tedavisinin ve tümör geli iminin hücresel ve sistemik mekanizmalar yla ilgili olan saponin gruplar yla, in vivo ve in vitro ortamlarda çal ma yapm lard r. Ayn zamanda geleneksel tümör tedavi edici ba ar bulunan bile imlerdeki saponinleri de tan mlam lard r. Baz saponin kombinasyonlar ve antitümör ilaçlar n gizlenmi inhibisyon geli imi üzerinde sinerjik etkiye sahip olduklar gözlemlemi lerdir. Bupleurum ssp. nin kökleri geleneksel Çin bitkisel ilac olarak karaci er hastal klar n tedavisinde kullan lmaktad r. Yaprak ve köklerinde biyoaktif saikosaponinler bulunmas na ra men bitkinin üst k mlar göz ard edilmi tir. Liu ve ark. (2006), bu nedenle bir çal ma yapm lard r. Bu çal mada Tayvan da yabani bir Bupleurum türü olan Bupleurum kaoi Liu, Chao et Chuang bitkisinin yapra ndan demlenen çayda, antioksidan etkinin varl ve karaci er koruyucu özelli i belirlenmi tir. Sonuçlar bile imin negatif iyon geli imini engelleyici ve temizleyici etkisi oldu unu göstermi tir. Bu bile imin ayr ca acetaminophen (APAP) ve karbon tetraklorit in, ratlar n karaci er hücreleri üzerine olan toksik etkisini de azaltt bildirilmi tir. Laouer ve ark. (2009) Bupleurum montanum ve Bupleurum plantagineum uçucu ya lar n antiplasmodial ve antimikrobiyal aktivitesini agar difüzyon tekni i kullanarak ve M K de erlerini hesaplayarak 11 mikroorganizmaya kar denemi lerdir. Bu ya lar n orta derecede antimikrobiyal etkilerinin oldu unu görmü lerdir. Maksimum antimikrobiyal aktivite Nocardia asteroides, Staphylococcus aureus ve Enterococcus faecalis e kar gözlenirken, fungasidal aktivite ise Candida albicans a kar gözlenmi tir.

17 9 Bupleurum ssp., Heteromorpha ssp., Scrophularia scorodonia gibi t bbi bitkilerden izole edilen saikosaponinlerin çe itli biyolojik aktivitelerinin oldu u rapor edilmektedir. Cheng ve ark. (2006) saikosaponinlerin (A, B2, C, D), anticoronaviral aktivitelerini saptamak için yapt klar çal mada saikosaponin B2 nin mekanizmas tam olarak anla lamayan bir anticoronaviral etkisinin oldu unu ve bu etkinin muhtemelen viral replikasyonun absorbsiyon ve penetrasyon gibi erken safhalar nda araya girmesi eklinde gerçekle ti ini bildirmi lerdir. Bupleurum salicifolium un sekonder metabolitleri virüslere, Gram (-) ve Gram (+) bakterilere, Candida albicans mayas na, Globodera pallida ve Globodera rostochiensis nematodlar na, Spodoptera littoralis böce ine ve Artemia salina ya kar test edilmi tir. Ayn zamanda bile im tümoral ve non-tümoral hücre döngüsüne olan etkisi yönüyle de test edilmi tir. Bile iminin içerisindeki baz maddelerin Artemia salina ya ve Gram (+) bakterilere kar antibiyotik etkisi gösterdi i belirlenmi tir (González ve ark., 1995). Saikosaponinlerin Bupleurum ssp. nin temel aktif bile eni olup, karaci er koruyucu, antitümör ve antiviral etki gösterdikleri bilinmektedir. Chiang ve ark. (2003), yapt klar çal mada, saikosaponin a,c,d nin sitotoksik etkisi ve anti-hepatit B aktivitesini de erlendirmi lerdir. Sonuç olarak saikosaponin c nin Hepatit B Virus (HBV) DNA replikasyonunu inhibe edici bir aktivite olu turdu unu belirlemi lerdir. Saikosaponin d nin ise HBV li insan karaci er hücrelerinde sitotoksik etki göstermesine ra men HBV nin ço almas inhibe etmede ba ar z oldu unu tespit etmi lerdir.

18 10 Mikroorganizmalar n antibiyotiklere duyarl n saptanmas nda, yayg n olarak kullan lan, ba ca 2 yöntem vard r. Difüzyon yöntemi; Bu yöntem test mikroorganizmas a lanm petri kutusundaki uygun agarl bir besiyerine uygun bir ekilde eklenen antimikrobiyal maddenin, besiyerinde diffüze olmas ve diffüze oldu u alanda test mikroorganizmas n geli imini engelleyip engellemedi inin belirlenmesi prensibine dayanmaktad r. Denenen antimikrobiyal madde test mikroorganizmas üzerinde etkiliyse, antimikrobiyal maddenin eklendi i yerin çevresinde inkübasyon sonras nda mikroorganizma geli iminin gözlenmedi i bir inhibisyon zonu olu ur. Yöntem birkaç ekilde uygulanabilmektedir. En yayg n olan ise disk agar difüzyon ve delik agar difüzyon yöntemleridir (Temiz, 2000). Kirby-Bauer yöntemi olarak da bilinen bu teknik az masrafl, az zahmetli ve kolay uygulan rl n yan s ra, bir petri kutusunda 5-6 antibiyoti e kar duyarl belirlemek ve en etkili olan ilac saptamak amac yla kullan labilir. Bu nedenle çok fazla tercih edilmektedir ( Disk agar difüzyon yöntemi; Dökme plak yöntemi veya yüzeye yayma yöntemi eklinde uygulanabilir. Fakat yüzeye yayma yöntemi daha çok kullan r. Petri kutusuna dökülmü ve kat la mas sa lanm steril agarl besiyerinin kuru yüzeyine s kültürden steril pipetle 0,1 ml. örnek aktar r, steril bir özeyle agar yüzeyine yayma yap r. Daha sonra sterilize edilmi yakla k 1 cm. çap ndaki antimikrobiyal madde çözeltisi absorblanm 5-7 tane disk (absorblama gücü yüksek olan ka t filtreden haz rlanm ) uygun aral klarla yerle tirilir. Petri etüve düz bir ekilde yerle tirilir. 37 C de saat inkübasyonu sa lan r. nkübasyon sonras nda disklerin çevresinde olu acak inhibisyon zonlar ölçülür (Temiz, 2000). Delik agar difüzyon yöntemi; Bu yöntemde test mikroorganizmas yla a lanm agarl besiyerinde uygun aral klarla ve belli say da delikler aç larak bu deliklerin her birine denenecek antimikrobiyal madde çözeltisi dökülmektedir. Kontrol deli ine ise steril dam k su dökülür. Etüvde 37 C de 48 saat inkübe edilir. nkübasyondan sonra deliklerin çevresinde olu acak inhibisyon zonlar ölçülür (Temiz, 2000). Dilüsyon yöntemi; Bu teknik antimikrobiyal ilaçlar n M K (minimal inhibisyon konsantrasyonunu) ve MLK (minimal letal konsantrasyonu) de erlerini belirlemede yard mc olur ( 2010).

19 11 K de eri, denenen test mikroorganizma süspansiyonunda, test ko ullar nda bakteri üremesini inhibe eden en dü ük antimikrobiyal madde konsantrasyonudur. Üreme olup olmad besiyerinde bulan kl k olu umu yönünden takip edilir. Sonuçta üreme olmayan en dü ük konsantrasyon M K de eri olarak kabul edilir (Temiz, 2000).

20 12 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Ara rma yap lan bitki türü Ara rmada Bupleurum lancifolium Hornem. bitkisi kullan lm r. Bitki örnekleri Karaman-Ermenek, Ermenek-Kazanc yolu, yol giri inden (1125m.) toplanm ve Doç. Dr. Tuna UYSAL taraf ndan te his edilmi tir. Te his edilen bitki örnekleri ZY KNYA eklinde numaraland larak herbaryum örne i olmak üzere haz rlanm r. Bitkinin genel özellikleri: Apiaceae (Umbelliferae) familyas ndan çiçekli bir bitki türüdür. Kökeni Akdenizdir. Tüysüz olmakla birlikte 50 cm. ye kadar uzayabilir. Mumlu gövdenin etraf nda tabandan birle mi yapraklar vard r. Cans z, mumlu, koyu ye il yapraklar oval, yakla k 3-10 cm. uzunlu unda m zrak eklindedir. Çiçek durumu emsiye eklinde çe itli uzunluklarda olabilen bir çiçek sap içerir. Bu emsiye geni, yuvarlak, oval bazen nokta eklinde küçük yaprakç klar taraf ndan ku at lm r. Çiçekleri sar dan, sar ms ye ile do ru de ir ( Bupleurum_lancifolium, 2010). Tek y ll k, 5-35 cm., taban ndan dall, dik görünümüyle birlikte yükselen dall, küçük türlerinde dik ve dallanmam r. Yapraklar n sap 3-10 cm. yapraklar dar, düzgün, oval ve genellikle konik apikulat tipte, alt yapraklar ise perfoliat tiptedir (Davis, 1972). ekil 3.1. Bupleurum lancifolium bitkisinin görünümleri

21 Ara rmada kullan lan bakteriler Test etti imiz bitkinin antimikrobiyal aktivitesinin belirlenmesinde özellikle insanlarda ve hayvanlarda çe itli hastal klara sebep olan bakteri türleri seçilmi tir. Çal mada 14 adet standart bakteri su u kullan lm r. Bu su lardan Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 3166, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 29988, Proteus mirabilis ATCC 43071, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Pseudomonas aeruginosa ATCC 29853, Bacillus cereus ATCC 11778, Streptococcus salivarius RSHE 606 bakterileri; Selçuk Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji laboratuar ndan, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas fluorescens ATCC 49642, Enterobacter sakazakii ATCC Konya l Kontrol Laboratuar Müdürlü ün den temin edilmi tir. Stok kültürlerden elde edilen koloniler içinde Mueller Hinton Broth (MHB) besiyeri bulunan tüplere aktar lm 37 C de saat inkübasyona b rak lm r. Çal mada bu ekilde haz rlanan bir günlük taze kültürler kullan lm r. Bacillus cereus; Toprak, su, süt, süt tozunda bulunan do ada yayg n olan bir bakteridir. 3-5 m. boy ve 1-1,2 m. eninde düz ve hafif k vr k, bazen uzun zincirler yapabilen bir çomakç kt r. Hareketli ve kapsülsüzdür (Bilgehan, 1992). nsanlarda en s k yapt klar hastal k besin zehirlenmeleridir. Bunun d nda direnci k lm ki ilerde f rsatç patojen olarak abseler, selülit, göz içi enfeksiyonlar, menenjit, endokardit, akci er, böbrek enfeksiyonlar, osteomiyelit, idrar yollar enfeksiyonlar ndan hastal k etkeni olarak soyutlanm lard r (Bilgehan, 1992). Enterobacter sakazakii; Gram (-), çomak tarz nda, hareketli, fakültatif anaerobik özellikte olan bu etken non-hemolitik olup laktozu fermente etmektedirler. Toprak ve suda bulunan bu mikroorganizmalar insan ve hayvanlar n normal barsak floras nda da yer almaktad rlar ( zgür, 2006). Yeni do anlarda menenjit, nekrotik enterokolit ve nadiren invaziv enfeksiyonlara yol açar. En çok dü ük do um a rl kl, prematüre ya da savunma sistemi bask lanm bebeklerde risk olu turmakta ve mortalite oran %10-80 aras nda de mektedir. Özellikle toz bebek mamalar n enfeksiyonlar n kayna oldu u dü ünülmektedir. Do ada yayg n olan bir mikroorganizma oldu u dü ünülmesine kar n do al kayna bilinmemektedir. Peynir, et, sebze, baharat gibi g dalar n yan nda

22 14 hastaneler, hububat ve süt tozu i letmeleri gibi pek çok kaynaktan izole edilmektedir (To ay, 2008). Escherichia coli; Gram(-), az hareketli, 2-6 m. boyunda çomakç klard r. Baz kültürlerinde koklara benzer, baz kültürlerinde ise daha uzun flamanl ekilleri görülebilir. Sporsuzdurlar. Genel kullan m besiyerinde ürerler. McConkey agarda pembe-k rm koloniler olu tururlar (Bilgehan, 1992). E. coli, normal barsak floras üyelerinden olup ba rsaklarda enterit, enterokolit gibi enfeksiyonlar olu turabilirler. Barsak lümeni d nda piyelit, piyelonefrit ve özellikle sistit gibi idrar yolu enfeksiyonlar da olu turabilirler. Ayr ca septisemi, yumu ak doku enfeksiyonlar, abseleri, yeni do anlarda menenjit gibi enfeksiyonlarda etken olabilirler (Bilgehan, 1992). Proteus mirabilis; Gram(-), çomak tarz nda ancak pleomorfik özellik gösterebilen, hareketli, kanl agarda hemolizsiz bakterilerdir. Laboratuar çal malar nda önemli bir kontaminasyon nedeni olarak görülürler zgür, 2006). Barsak normal floras nda bulunurlar. Özellikle hastane ortam nda yuvalanarak hastane enfeksiyonlar tipinde hastal klar olu tururlar. Ayr ca diyabetiklerde ve ba k yan zay flam ki ilerde f rsatç enfeksiyonlar yaparlar. drar yollar enfeksiyonlar, menenjit, septisemi, yara, yan k, yumu ak doku enfeksiyonlar, yeni do anlarda göbek kordonu enfeksiyonu ve buradan kaynaklanan septisemi olu turduklar ba ca enfeksiyonlard r (Bilgehan, 1992). Pseudomonas aeruginosa; Küçük, bazen iki erli, bazen zincir olu turacak gibi fakat ço u kez tek tek görülen, sporsuz, uçlar ndaki tek, nadiren 2-3 adet kirpikleri ile çok hareketli, gram (-) çomakç klard r. Her besiyerinde ürerler. Ço u mavi ye il bir ekstrasellüler bir pigment yaparak üredikleri ortam bu renklere boyarlar. Bu pigmenti ba ka hiçbir bakteri olu turmad ndan önemli bir tan de eri vard r. nsanlarda ve özellikle savunma mekanizmalar aksam ki ilerde önemli hastal klar olu turur. Antibiyotiklere dirençli oldu undan hastane ortam nda kolayca yuvalan r. Yapt ba ca enfeksiyonlar: Yan k yaras enfeksiyonlar, kronikle meye e ilimli idrar yollar enfeksiyonlar, menenjitler, kornea ülseri, panoftalmi, bron it, bronkopnömoni, septisemi, orta kulak enfeksiyonlar, çocuklarda diyareler ayr ca sistik fibrozistir (Bilgehan, 1992). Pseudomonas fluorescens; Görünümleri Pseudomonas aeruginosa ya benzer. Bir uçlar nda çok say da kirpikleri vard r. Kolonileri ço u kez yuvarlak, nemli ve parlak yüzeylidirler. Glikonat okside etmemeleri, tetrazoliumlu besiyerinde

23 15 üreyememeleri Pseudomonas aeruginosa dan olan önemli ayr mlar r (Bilgehan, 1992). Staphylococcus aureus; Kok eklinde, ortalama 1 m. çap nda, tek tek, çiftler veya düzensiz kümeler tarz nda görülürler. Gram (+), hareketsiz, sporsuz, fakültatif anaerob bakterilerdir. Stafilokok türleri, insan ve hayvanlar n derisinde, üst solunum yolu, alt sindirim, ürogenital sistem mukoz membranlar ile ili kili mikroorganizmalard r. nsan ve hayvanlarda f rsatç patojen olarak tan mlanmalar n yan nda, hayvanlarda mastitis, kuzu piyemisi, atlarda botriyomikozis olmak üzere lokal ve genel irinli enfeksiyonlara neden olurlar. nsanlarda g da kaynakl enfeksiyonlara sebep olduklar için halk sa aç ndan oldukça önemlidirler (Akan, 2006). Streptococcus salivarius; Yakla k 0,6-1,0 m. çap nda sporsuz, hareketsiz koklard r. Gram (+) dirler. nsanda normal a z floras nda bulunurlar. Yerlerini de tirmeleri ve organizman n direncinin k lmas durumuna ba olarak çe itli hastal klar olu tururlar (Bilgehan, 2000) Ara rmada kullan lan çözücüler Kloroform: Kimyasal yap CHCl 3 dür. Triklorometan olarak da bilinir. Anestezik ve çözücü olarak kullan lan renksiz, saydam, alevlenmeyen a r bir s r. -62 C de kat la r, 61 C de kaynar. Özgül a rl 20 C de 1,476 d r. Suda çok az çözünmesine ra men hayvansal ve bitkisel ya larda, alkolde, eterde, asetonda, benzende ve di er organik çözücülerin ço unda kolayl kla çözünür (Uyar, 1992). Etil asetat: Formülü CH 3 COOC 2 H 5 olan ve 77 C de kaynayan bir s r. Boya, vernik, patlay madde, foto rafç k ve yapay tekstil maddeleri ile ilgili i lerde çözücü olarak kullan r. Pratik olarak suda çözünmez ama hem alkol hem de eterde çözünebilir (Uyar, 1992). Aseton: Kimyasal formülü CH 3 COCH 3 olan bir bile iktir. 56 C de kaynar, -94 C de kat la r. Kimya sanayisinin temel ürünlerinden biridir. Su, etanol ve eterde her oranda kar r. Özellikle selüloz esterleri için çok kullan lan bir çözücüdür. Foto raf filmlerinin haz rlanmas nda, hayvansal ve bitkisel maddelerden çe itli maddelerin ekstraksiyon yoluyla ayr lmas nda, parafinin safla lmas nda, dokular n sertle tirilmesinde ve suyun al nmas nda kullan r (Uyar, 1992).

24 16 Etanol: Kimyasal formülü CH 3 CH 2 OH olan bir bile iktir.78,4 C de kaynar ve suyla her oranda kar abilir. Suyla kar nda aç a ç kar ve hacimce büzülür. Glikozun mayalanmas ndan olu ur. T pta kullan lan araçlar n sterilizasyonunda kullan lmas n yan s ra organik bile ikler için iyi bir çözücüdür (Uyar, 1992). Metanol: CH 3 OH (Metil alkol, metanol, karbinol) en basit yap alkoldür. Saf metanol 1 atm'de 64,6 C de kaynayan ak kan bir s olup, parlak olmayan mavimsi bir alevle yanar. Bütün organik çözücülerde her oranda çözünür. Çok az miktardaki metanol dahi canl organizma için zehirdir. Kal yaralar, bozukluklar meydana getirir. 25 gr. metanol içilirse insanlarda körlü e neden olur ( 2009). Dimetil sülfoksit (DMSO): Organik sülfürlü, formülü (CH 3 ) 2 SO olan bir bile iktir. Bu renksiz s hem polar hem nonpolar bile imleri çözebilen ve su ile geni oranda kar abilen önemli bir polar aprotik çözücüdür. lk olarak 1866 da sentezlenmi tir. PCR da DNA primerleri veya örneklerinde sekonder yap lar n olu mas engellemek için kullan r. Ayr ca hücrelerin ölmesini engellemek için yap lan dondurma i leminde kriyoprotektan olarak kullan r ( 2010) Ara rmada kullan lan besiyeri Haz rlanan mikroorganizma su lar n antimikrobiyal aktivitesinin belirlenmesi amac yla uygulanan mikrodilüsyon metodunda Mueller Hinton Broth (Merck) besiyeri kullan lm r.

25 Metot Ekstrelerin haz rlan Ekstrelerin haz rlanmas nda baz modifikasyonlar yap larak, Gücin ve Tamer (1986) taraf ndan bildirilen yöntemden yararlan lm r. Bu yönteme göre, toplanan bitki örnekleri uygun ko ullarda kurutulduktan sonra kök ve toprak üstü k mlar birbirinden ayr lm ve aseptik artlara uyularak mekanik bir parçalay (laboratuar de irmeni) kullan larak toz haline getirilmi tir ( ekil 3.2). ekil 3.2. Mekanik parçalay Toz haline gelen kök k sm ndan 20 gr. tart p yakla k 200 ml. kloroform içerisinde Soxhlet cihaz na yerle tirilmi tir ( ekil 3.3). 8 saat boyunca ekstraksiyon devam etmi, sonras nda ekstraksiyon faz ayr lm ve materyal etüvde tamamen kurutulmu tur. Ekstraksiyon s ras yla ayn ekilde etil asetat, aseton, etanol ve metanol ile sürdürülmü tür. 40 C nin alt nda bir s cakl kta ve dü ük bas nçta Rotary evaporatör ile çözücüler tamamen tükenene kadar uçurulmu tur ve ekstrakt toz haline gelerek jojelerin çeperlerine yap r. ( ekil 3.4). Ekstrelerin bulundu u balon jojelerin bo haldeyken daralar al nm ve içerisinde ekstre miktarlar belirlenmi tir. Ekstreler % 25 lik Dimetil sülfoksit (DMSO) ile çözdürülmü, mikrodilüsyona ba lamadan önce 0,45 m. çap ndaki miliporfiltrelerden geçirilerek sterilize edilmi tir. Ayn i lem toprak üstü k m için de yap lm çal ma kök ve toprak üstü k m için e zamanl yürütülmü tür.

26 18 ekil 3.3 Soxhlet Cihaz ekil 3.4. Rotary evaporatör

27 19 Çal mada ikinci bir ekstraksiyon metodu olarak so uk ekstraksiyon metodu da kullan lm r. Bu metod için laboratuar de irmeni kullan larak toz haline getirilmi bitkinin kök ve toprak üstü k mlar 20 er g. tart larak e zamanl olarak s ras yla çözücülerde (200 ml. kloroform, etilasetat, aseton, etanol, metanol) ekstraksiyona tabi tutulmu tur. Ekstraksiyon i lemi bal kl manyetik kar ile 24 C de 8 saatte yap lm r ( ekil 3.5). Ekstraksiyon i lemleri tamamland ktan sonra kar m filtre ka ndan süzülmü tür. Daha sonraki a amalar önceki metottaki gibi sürdürülmü tür. ekil 3.5. Bal kl manyetik kar Mikrodilüsyon yöntemiyle antibakteriyel etkinin belirlenmesi Bitkilerden elde edilen ekstraktlar n antibakteriyel etkilerinin belirlenmesinde mikrodilüsyon yöntemi kullan lm r. Antibakteriyel testler için 96 adet U tipi kuyucu a sahip olan steril mikrotitrasyon pleytleri kullan lm r. Bitki ekstrelerinin 80 g/ml den 0,15625 g/ml ye kadar seri konsantrasyonlar elde edilmi tir (Koneman ve ark., 1997; Zgoda ve ark., 2001). 10,5 g. Mueller Hinton Broth ve 500 ml. saf su ile haz rlanan besiyeri iyice eritildikten sonra otoklavda 121 C de 15 dk. sterilize edilmi tir. Daha sonra besiyerinden kullanaca z tüm gözlere 100 l. konulmu tur. Mikropleytlerin ilk kuyucuklar na (1. Sütuna) haz rlad z bitki ekstrelerinden de 100 er l. ilave

28 20 edilmi tir. lk kuyucukta bulunan 200 l. olan besiyeri- ekstre kar ndan 100 l. al narak ikinci kuyucu a konulmu ve bu ekildeki seyreltme i lemi 11. kuyucu a kadar devam etmi ve burada son bulmu tur. 11. Kuyucuk 200 l. di er kuyucuklar 100 l. olmu tur (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1. Ekstrelerin seyreltilmesi l B l E 100 l B 100 l B 100 l B 100 l B 100 l B 100 l B 100 l B 100 l B 100 l B 100 l B 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 200 l N.K. 100 l B 100 l P.K. * B: Besiyeri, E: Ekstre, N. K: Negatif Kontrol, P.K: Pozitif Kontrol Mc Farland 0,5 yo unlukta yani yakla k olarak 10 8 CFU/ml yo unlukta olan bakteri süspansiyonu densitometre de ayarlanm r. Bu yo unluktaki süspansiyondan 100 l, besiyerinden de 900 l. al narak steril bir kapta kar lm r. Bakteri kar ndan 11. kuyucuk hariç bütün gözlere 100 er l. ilave edilmi tir. Testte 11. kuyucuk negatif kontrol gözü, 12. kuyucuk ise pozitif kontrol gözü olarak kullan lm r. Bu a amadan sonra bütün kuyucuklar 200 l. s içermektedir (Çizelge 3.2). Çizelge 3.2. Kuyucuklara bakteri ilavesi l E+B l M 100 l E+B l M 100 l E+B l M 100 l E+B l M 100 l E+B l M 100 l E+B l M 100 l E+B l M 100 l E+B l M 100 l E+B l M 100 l E+B l M 200 l E+B 100 l B l M * E: Ekstre, B: Besiyeri, M: Mikroorganizma (bakteri)

29 21 14 farkl bakterinin her biri için farkl mikropleyt kullan lm r. Ayr ca kontrol antibiyoti i olarak kullan lan chloramphenicol ve DMSO için de ayn i lem tekrarlanm bunlar için kontrol amaçl farkl pleytler kullan lm r. Kullan lan bütün mikropleytler 37 C de 24 saat inkübasyona b rak lm r. nkübasyon sonunda üremenin olmad en dü ük konsantrasyon M K (Minimum nhibisyon Konsantrasyonu) de eri olarak belirtilmi tir.

30 22 4. ARA TIRMA BULGULARI VE TARTI MA Bupleurum lancifolium türünden elde edilen kloroform, etil asetat, aseton, etanol ve metanol ekstrelerinin kök ve toprak üstü k mlar için antibakteriyel etkilerinin belirlenmesinde mikrodilüsyon metodu kullan lm r. Çal mada Bupleurum lancifolium türünün kök ve toprak üstü k mlar ndan haz rlanan ekstrelerin test edilen konsantrasyonlar nda, kullan lan 14 bakteri su una kar, herhangi bir antibakteriyel etkiye sahip olmad görülmü tür. Çal mada ekstrelerin çözünmesinde kullan lan % 25 lik Dimetil sülfoksit (DMSO) maddesi ise ayr bir pleytte test edilmi ve herhangi bir antibakteriyel etkisinin bulunmad tespit edilmi tir. Kontrol antibiyoti i olarak kullan lan Chloramphenicol un farkl bakterilere kar farkl M K de erleri belirlenmi tir. Kullan lan mikropleytlerin ilk be sat r kuyucuklar kullan lm r. S ras yla öyledir: A: Kloroform ekstresi B: Etilasetat ekstresi C: Aseton ekstresi D: Etanol ekstresi E: Metanol ekstresi

31 23 Çizelge 4.1. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Staphylococcus aureus ATCC 6538 bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.1. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Staphylococcus aureus ATCC 6538 bakterisine kar antibakteriyel etkisi

32 24 Çizelge 4.2. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Staphylococcus aureus ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.2. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Staphylococcus aureus ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

33 25 Çizelge 4.3. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Staphylococcus aureus ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.3. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Staphylococcus aureus ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

34 26 Çizelge 4.4. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Escherichia coli ATCC 3166 bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.4. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Escherichia coli ATCC 3166 bakterisine kar antibakteriyel etkisi

35 27 Çizelge 4.5. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Escherichia coli ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.5. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Escherichia coli ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

36 28 Çizelge 4.6. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Escherichia coli ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.6. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Escherichia coli ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

37 29 Çizelge 4.7. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Escherichia coli ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.7. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Escherichia coli ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

38 30 Çizelge 4.8. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Proteus mirabilis ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.8. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Proteus mirabilis ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

39 31 Çizelge 4.9. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Pseudomonas aeruginosa ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil 4.9. Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Pseudomonas aeruginosa ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

40 32 Çizelge Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Pseudomonas fluorescens ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Pseudomonas fluorescens ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

41 33 Çizelge Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Pseudomonas aeruginosa ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Pseudomonas aeruginosa ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

42 34 Çizelge Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Bacillus cereus ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Bacillus cereus ATCC bakterisine kar antibakteriyel etkisi

43 35 Çizelge Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Streptococcus salivarius RSHE 606 bakterisine kar antibakteriyel etkisi A B C D E : effaf, inhibisyon var + : Bulan k ekil Bupleurum lancifolium kök ekstrelerinin Streptococcus salivarius RSHE 606 bakterisine kar antibakteriyel etkisi