YABAN TİP MAYA SUŞLARINDA TERMOTOLERANSLIĞIN ARAŞTIRILMASI VE HEAT- SHOCK PROTEİNLERİNİN İZOLASYONU *

Transkript

1 YABAN TİP MAYA SUŞLARINDA TERMOTOLERANSLIĞIN ARAŞTIRILMASI VE HEAT- SHOCK PROTEİNLERİNİN İZOLASYONU * Investigation of Thermotolerance in Wild Type Yeast Strains and Isolation of Heat Shock Proteins * Mutlu Nisa ÜNALDI Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Burhan ARIKAN Ç.Ü.Fen-Edeb. Fakültesi Biyoloji Bölümü ÖZET Bu çalışmada, doğal ortamlardan izole edilen çeşitli yaban tip maya suşlarında termotoleranslık araştırılmıştır. Termotoleranslık gösteren suşlardan heat-shock proteinler izole edilmiş ve SDS- PAGE de moleküler büyüklükleri saptanmıştır. İzole edilen 34 adet yaban tip maya suşu öncelikle optimum üreme sıcaklığında üremeye bırakılmış, daha sonra ısı şoku verilerek üremenin devam edip etmediği gözlenmiştir. Üreme görülen suşlardan total proteinler çıkarılarak SDS-PAGE de moleküler büyüklükleri saptanmıştır. Y1, Y2, Y9, Y14, Y18 ve Y23 numaralı suşlarda termotolerans davranış bulunmuştur. Total proteinlerin SDS- PAGE analizinde Y2 suşunda yaklaşık D luk farklı bir protein bandı tespit edilmiş ve Hsp (H sp 90) proteini olarak değerlendirilmiştir. ABSTRACT In this study, the thermotolerance behaviour was scanned in wild type yeast strains which were isolated from the nature. Heat-shock proteins from the strains which have thermotolerance were isolated and molecular weights were determined by SDS-PAGE. Firstly, 34 wild type yeast strains isolated were incubated on optimum growth temperature and then shocked with high temperature and it was observed whether there was a growth or not. Total proteins were isolated from the strains and moleculer weights were determined. Thermotolerance behaviour of Y1, Y2, Y9, Y14, Y18, and Y23 strains were found. On SDS-PAGE analysis, a different protein band approximately D of molecular weight was determined and it was estimated as a Hsp (H sp 90) protein on Y2 strain. Giriş Mayalar doğada çok geniş yayılım alanı bulunan ve mantar olarak sınıflandırılan tek hücreli organizmalardır. Mayalar endüstriyel proseslerde en fazla kullanılan mikroorganizmalardandır. Fermantasyon yeteneklerinin çok yüksek olması nedeniyle alkol, şarap, bira ve pasta endüstrisinde çok geniş bir kullanım alanı bulmuşlardır (Lee, 1996). Ayrıca, ökaryotik hücre karakteri taşımaları, laboratuar şartlarında kolayca üretilebilmeleri, genetik düzeyde manipulasyonlar yapılabilmesi ve patojenik olmamaları gibi nedenlerle moleküler biyoloji çalışmalarında da önemli bir yeri vardır (Arda, 1990). Mayalar, mayalanma süresince ortamdaki şekeri alkol ve karbondioksite dönüştürürler. Şarap ve bira üretiminde oluşması istenen temel ürün alkoldür, buna karşılık ekmek ve pastacılık ürünlerinde kabarmayı sağlaması açısından oluşması beklenen ürün karbondioksittir (Keskin, 1982). Mayalar doğada çok yaygındır, mayaların hayat çemberinde esas olarak toprak, tatlı ve sulu meyveler bulunur. Konaklarından yağmurla düşen yaprak ve meyvelerle toprağa geçer ve toprağın üst tabakalarında 0-10 cm derinliklerde kışı geçirirler. Mayaların özel konaklara geçişi ise böcekler, kelebekler sinekler ve özellikle çiçeklere konan arılar vasıtasıyla olur. Mayayı nakleden böceklerin çok çeşitli yerleri ziyaretleri nedeniyle mayanın doğadaki yayılışı çok geniştir (Pamir, 1977). Endüstriyel alanda kullanılacak olan mayalarda olması istenilen bazı karakterler vardır, bunlar; -Şekeri yüksek düzeyde kullanabilmesi -Alkol üretiminin fazla olması -Yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı olmaları * Doktora tezi- PhD Thesis

2 -Yüksek alkol konsantrasyonlarına toleransının bulunması -İyi bir aroma oluşturabilmesi -Fermantasyonu hızlı gerçekleştirebilmesi ve en önemlisi genetik stabilitesinin olmasıdır (Spencer ve Spencer,1983). Tipik maya fermantasyonları maksimum etanol üretimi için C ler arasında gerçekleştirilir. Tropikal ve subtropikal bölgelerde sıcaklık yaz ayları boyunca 40 C nin üzerine çıkar. Bu da fermantasyonun erken sonlanmasına neden olur. Bu bölgelerde yapılan fermantasyon işleminin erken sonlanmasını engellemek için soğutma sistemleri kullanılır ki bu uygulamalar maliyeti çok yükseltir. Bu durum ancak termotolerant maya suşlarının kullanılmasıyla daha ekonomik duruma getirilebilir (D Amore ve ark., 1989). Heat-Shock Proteinleri Mikroorganizmaların üreyebilmesi ve hayatta kalabilmesi için gerekli çevresel faktörlerin en önemlilerinden birisi sıcaklıktır. Sıcaklığın optimal seviyeye yaklaştığı durumlarda hücre içindeki kimyasal ve enzimatik reaksiyonlara bağlı olarak daha hızlı oranda büyüme ve gelişme meydana gelir. Sıcaklığın optimal düzeyin üzerine çıkması durumunda ise Proteinler, nükleik asitler ve diğer hücresel yapılarda geri dönüşümsüz zararlar oluşabilir (Parsell ve ark., 1993). Mikroorganizmalar değişen ortam koşullarına karşı kendilerini koruyabilmek için özel yaşam stratejileri veya adaptasyon mekanizmaları geliştirmişlerdir. Bu adaptasyon mekanizmalarında proteinlerin büyük bir rol oynadığı moleküler çalışmalarla ortaya konulmuştur. Hsp proteinleri olarak isimlendirilen proteinler hücreyi devam eden strese karşı koruyan ve oluşan zararları tamir eden proteinlerden oluşmaktadır (Mager ve Moradaz, 1993). Çeşitli çevresel streslere karşı Saccharomyces cerevisiae de üretilen stres proteinleri, yüksek sıcaklıklarda, besin eksikliğinde ve yüksek konsantrasyonlardaki alkollü ortamlarda sentezlenmektedir (Iida ve Yahara, 1984). Bitkiler, hayvanlar, bakteriler gibi bir çok organizma gruplarında sıcaklığa maruz bırakılmak, heat-shock proteinlerini indükler, aynı zamanda daha yüksek öldürücü sıcaklığa dirençlilik sağlar. 23 C de üretilen Saccharomyces cerevisiae, 37 C ye konulursa stres proteinleri sentezlenir. Bu muamele sonunda organizma 52 C ye kısa bir süre maruz kaldığında yüksek sıcaklığın ölümcül etkisinden korunmuş olur. Termotolerans durum hücreler 23 C ye döndürüldüğünde hızlı bir şekilde kaybolur (Hall, 1983).Bu çalışmada yaban tip mayalarda (S.cereviciae) heat-shock protein üretiminin uyarılabilirliği, izolasyonu ve termotoleranslık yeteneği araştırılmıştır. Materyal ve Metod Maya suşlarının izolasyonu ve üretilmesi için YPD buyyon besiyeri ; Maya özütü %1, Pepton %2, Glukoz %2, ph:5.3 (Laluce ve ark., 1993) ve YPD buyyon besiyerine 15gr/L agar ilave edilerek YPD Agar kullanılmıştır (Kaiser ve ark., 1994), Heat-shock proteinlerinin izolasyonu için Tris (50 mm), NaN 3 (10 mm) ve ESB; (SDS %2, Tris.HCI 80 mm, Gliserol %10, DTT %1.5, Bromfenol Blue 0.1 mg/ml) çözeltileri kullanılmıştır (Kaiser ve ark., 1994). İzole edilen proteinler %10 luk SDS-PAGE de yürütülmüşlerdir (Bollag ve Edelstein, 1991). Termotoleranslığın Saptanması 1- YPD besiyerine 1 gece üremiş maya kültüründen yayma şeklinde hücreler ekilmiştir. 2- Ekilen petriler 25 C de 6 saat inkübasyona bırakılmıştır. 3- Örnekler, 38 C de 90 dakika inkübe edilerek şok uygulanmıştır.. 4- Petriler, 56 C deki inkübatöre alınarak 8-16 dakika bekletilmiştir. 5- Petriler 25 C lik etüvde 1-2 gün inkübasyona bırakılarak koloni oluşumu gözlenmiştir (Guthrie ve Fink, 1991).

3 Total Proteinlerin Çıkarılması 1- Protein Ekstraktı OD6 00 de 2 ünitelik maya hücrelerinden hazırlanmıştır. 5 ml lik YPD ye buygona petri kutusunda üremiş kültürden bir öze ekim yapılarak 1 gece inkübasyona bırakılmış ve hücre konsantrasyonunun OD 600 = olması sağlanmıştır. 2- OD 6 00 de 2 ünite hücre kültürü buz üzerindeki 2 ml lik 50 mm Tris (ph:7.5), 10 mm NaN 3 çözeltisine transfer edilip, hücreler santrüfüjde çöktürülmüştür. 3- Süpernatant atılarak, hücreler 30 µl ESB çözeltisinde süspanse edilmiştir. 4- Süspansiyon mikrosantrüfüj tüpüne transfer edilip, 100 C de 3 dakika bekletilmiştir. Isıtma basamağı proteazları inaktive etmek için oldukça hızlı yapılmalıdır. Bu aşamadan sonra örnekler -20 C de saklanabilir. 5- Örneğin üzerine yaklaşık 20 ml kadar sıvı azot eklenir, havanda ezilerek hücrelerin parçalanması sağlanmıştır. 6- Karışımın üzerine 70 µl ESB çözeltisi eklenerek vortekste karıştırılmış ve 100 C de 1 dakika ısıtılmıştır. 7- Örnekler 5-20 µl miktarlarda SDS-PAGE jellerine yüklenmiştir (Modifize-Kaiser ve ar., 1994). Protein Örneklerinin SDS-PAGE de yürütülmesi Heat-shock proteinlerin moleküler büyüklüklerinin saptanması için %10 luk SDS-PAGE de örnekler yürütülmüştür. ESB içinde çözülmüş total protein örneklerinden 20 şer µl %10 luk SDS- Poliakrilamid jele yüklenmiştir. 15 ma verilerek separe olması sağlanmıştır. Jel, Coomasie Brillant Blue R 250 boyasında 2 saat bekletilerek protein bantlarının görünür hale gelmesi sağlanmıştır. Jeldeki boyanın fazlası boyadan kurtarma solüsyonunda 4-5 saat bekletilerek alınmıştır (Bollag ve Edelstein, 1991). Araştırma Bulguları Topraktan ve üzüm şırasından YPD Agar besiyerine seri sulandırma şeklinde ekim yapılmış ve toplam 34 adet yaban tip maya suşu izole edilmiştir. 34 adet maya suşunda termotolerans davranışa bakılmıştır. Suşlar önce optimum üreme sıcaklıklarında üretilip daha sonra optimum sıcaklığın yaklaşık C yükseğinde bir süre bekletilerek heat-shock proteinlerinin indüklenmesi sağlanmıştır. İndüklenen suşlar 56 C de 8-15 dakika bekletilip YPD besiyerine ekilmişler ve üreme davranışları gözlenmiştir. Bunlardan Y1, Y2, Y9, Y14, Y18 ve Y23 olarak numaralandırılanlarda termotolerans davranış saptanmıştır. Y2 suşunun optimum üreme sıcaklığında (25 C de) 1 gece üretilmiş taze kültüründen yayma şeklinde ekim yapılmış, 25 C de 6 saat, 38 C de 90 dakika, 56 C de 15 dakika ve 25 C de 1,5 gün süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Kontrol deneyi olarak aynı suş 25 C de 6 saat 56 C de 15 dakika ve 25 C de 1.5 gün üretilmiş ve iki suş arasındaki üreme davranışı bakımından ortaya çıkan farklılık Resim 1ve 2 de gösterilmiştir. Resim 1. Y2 suşunun 23 C deki 2 günlük üreme görüntüsü

4 Resim 2. A: 38 C de şoklandıktan sonra 56 C de inkübe edilerek (15 dak) 25 C lik ortamda üretilen örneğin 48 saatlik üreme davranışı. B: Şoklanmaksızın 56 C de inkübe edilerek 25 C lik ortamda üretilen örneğin 48 saatlik üreme davranışı. SDS-PAGE Bulguları: Y1, Y2, Y9, Y14, Y18 ve Y23 numaralı suşlarda termotolerans davranış saptandıktan sonra, hücrelerde ısı şoku proteinlerinin varlığını saptamak amacıyla test edilen 6 suştan total protein izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Suşlardan izole edilen total protein örnekleri %10 luk SDS- PAGE ortamında 15mA de 1 gece yürütülmüştür. Ana suşlardan ve sıcaklığa maruz bırakılmış suşlardan çıkarılan total proteinler karşılaştırılarak, ısı şoku proteinlerinin varlığı araştırılmıştır. Resim 3 de Y2 suşunun total protein profilleri görülmektedir. Ana suşlardan ve ısı şoku uygulanmış suşlardan elde edilen proteinler karşılaştırıldığında, şoktan sonra Y2 suşundan elde edilen izolatta farklı bir protein bandı saptanmış ve literatür verilerine dayanılarak Hsp proteini olarak değerlendirilmiştir. Resim 3.Isı şoku muamelesinden sonra ve ana suşlardan izole edilen total proteinlerin SDS- PAGE analizleri.1. Y9 ana suşunun total proteini, 2.Y9 suşunun ısı şokundan sonra total proteini, 3. Boş, 4.FY23 suşunun total proteini, 5-6. Y2 suşunun ısı şokundan sonraki total proteinleri, 7-8. Y2 ana suşunun total proteinleri, 9. Boş, 10. Protein markeri

5 Marker proteinlerinin Rf değerleri (Çizelge 1) ile moleküler ağırlık arasındaki regresyon eğrisinden (Çizelge 2) protein bandının moleküler büyüklüğünün yaklaşık D olduğu bulunmuştur. Çizelge 1: Y2 Hsp proteinlerinin ve Protein markerlerinin Rf değerleri ÖRNEKLER GÖÇ MESAFESI RF DEĞERI İzleme Boyası 15.3 cm - Marker Bant I 2.8 cm 0.18 Marker Bant II 3.7 cm 0.24 Marker Bant III 4.8 cm 0.31 Marker Bant IV 6.5 cm 0.42 Marker Bant V 8.2 cm 0.53 Marker Bant VI 11.1 cm 0.72 Hsp Pro.bandı 4.6 cm 0.30 Çizelge 2: Rf değerleri ile Moleküler ağırlıkları arasındaki doğrusal ilişki Moleküler ağırlık (D) Seriler 1 0 0,18 0,24 0,31 0,42 0,53 0,72 Rf değerleri Sonuç ve Tartışma Doğada çok geniş bir yayılım alanı bulunan mayalar, yüksek fermantasyon yeteneğine sahip olmalarından dolayı endüstriyel proseslerde çok sık kullanılırlar (Keskin, 1982). Endüstriyel alanda kullanılacak olan maya suşlarında olması arzu edilen özelliklerden en önemlileri yüksek alkol konsantrasyonlarına, yüksek şeker konsantrasyonlarına ve yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı olmalarıdır (Bertolini ve ark., 1991). Bu çalışmada yaban tip maya suşlarında termotolerans davranışın varlığı saptanmaya çalışılmıştır. Hücreler orta derecedeki stres koşuluna maruz bırakıldıklarında stres faktörlerine karşı dirençleri indüklenmekte ve aynı faktörün daha yüksek derecelerine dayanıklı duruma gelmektedirler (Ruis ve Schüller, 1995). Çalışmamızda izole edilen toplam 34 suştan 6 sında termotolerans davranış bulunmuştur. Denenen suşlar arasında %17 oranında termotolerans davranış özelliği saptanmıştır. Resim 1 de maya suşunun optimum sıcaklıktaki üreme şekli görülmektedir. Resim 2 A da ise aynı suşun 38 C de indüklendikten hemen sonra 52 C lik ortama bırakılmış ve 25 C de üremenin devam edip etmediği gözlenmiştir. Resim 2 B de ise Y2 suşunun 38 C de indükleme yapılmaksızın 52 C de tutulmasından sonra 25 C lik ortamda inkübasyon sürdürülerek üreme kontrolü yapılmıştır. Resim 2 de görüldüğü gibi indükleme yapılan suşta üreme devam ederken, indükleme yapılmadan yüksek sıcaklığa maruz bırakılan suşta üreme durmuştur. Bu sonuç, İndüklemeye bağlı olarak Heat-shock proteinleri sentezlendiğini ve bunun sonucunda maya hücresinin daha yüksek sıcaklıklarda canlılığını sürdürebildiğini göstermektedir. Heat-shock proteinlerinin sentezlenebilmesi için organizmanın normal üreme sıcaklığının (25 C) üstündeki bir sıcaklıkta (38 C) belirli süre indüklenmesinin gerekliliğini ortaya koymaktadır. Hsp proteinlerinin varlığını göstermek amacıyla total proteinler çıkarılmıştır. Y2 suşunun total protein profili %10 luk SDS-PAGE de analiz edilmiş ve Resim 3 de gösterilmiştir.

6 Hsp proteinleri ortalama moleküler ağırlıklarına göre Hsp90, Hsp70, Hsp60 gibi bir kaç gruba ayrılmışlardır (Chaffin ve ark., 1998). Hsp 90 (moleküler ağırlığı ile arasında olanlar) grubundaki proteinler, bakterilerden insanlara kadar bir çok organizmada görülmektedir (Borkovich ve ark., 1989). Test organizması olarak seçip analiz edilen Y2 suşunda saptadığımız Hsp proteini yaklaşık D ağırlığında olduğundan, Hsp90 grubu içerisinde değerlendirmek mümkündür. Sonuç olarak, elde edilen bulgular, maya hücrelerinin normal üreme sıcaklıklarından yüksek sıcaklıklarda belirli süre üretilmesinin, yüksek sıcaklıklarda sentezlenen özel proteinlerin oluşmasına neden olduğunu ortaya koymaktadır. Bu durum özellikle sıcaklığa toleransın heat-shock preteininden kaynaklandığını göstermektedir. Termal toleransın bulunması bu suşun yüksek sıcaklıkta gerçekleştirilen fermantasyonda kullanılabileceğini gösterir. Elde edilen suşlardaki termotolerant davranış yüksek sıcaklıkta gerçekleştirilen fermantasyon çalışmaları sırasında ortamın soğutulması için harcanan yüksek miktardaki enerji kullanımını minimuma indireceği için ekonomik olarak işletmelere büyük katkı sağlayacak boyuttadır. Kaynaklar ARDA, M., Biyoteknoloji. A. Ü. Veterinerlik Fak. Mikrobiyoloji A.B.D., Kükem Yayınları, no:1, 189s. BERTOLINI, M. C., ERNANDES, J. R., and LALUCE, C., New Yeast Strains for Alcoholic Fermentation at Higher Sugar Concentration. Biotechnology Letters. 13 (3), BOLLAG, D.M. and EDELSTEIN, S.J Protein Methods. Villey-Liss Press., USA, 180p. BORKOVICH, K., FARRELLY, F., FINKELSTEIN, D., TAULIEN, J., and LINDQUIST, S., Hsp82 is an Essential Protein that is Required in Higher Concentrations for Growth of Cells at Higher Temperature. Mol. Cell. Biol., 9: CHAFFIN, W.L., RIBOT, J.L.L, CASANOVA, M., GOZABO, D., and MARTINEZ, J.P., Cell Wall and Secreted Proteins of Candida albicans: Identification, Function and Expression. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), D AMORE, T., CELOTTO, G., RUSSELL, I., and STEWART, G.G., Selection and Optimization of Yeast Suitable for Ethanol Production at 40 C. Enzyme Microb. Technol., 11, HALL, B. G., Yeast Thermotolerance Does Not Require Protein Synthesis. Journal of Bacteriology, 156 (3), GUTHRİE, C., FİNK, G.R., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Academic Press, Inc. San Diego, California, 933p. IIDA, H., and YAHARA, I., Durable Synthesis of High Molecular Weight Heat-Shock Proteins in GO Cells of the Yeast and Other Eucaryotes. J. Cell Biol., 99, KAİSER, C., MİCHAELİS, S., MİTCHELL, A., Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor- Laboratory Press, New York, 234p. KESKİN, H., Besin Kimyası. İstanbul Üniversitesi Kimya Fak., 4. Baskı, Cilt 2, İstanbul, 558s. LALUCE, C., ABUD, C.L., GREENHALF, W., and SANCHES, P.M.F., Thermotolerance Behavior in Sugar Cane Syrup Fermantations of Wild Type Yeast Strains Selected Under Pressures of Temperature, High Sugar and Added Ethanol. Biotechnology Letters, 15 (6), LEE, B.H., Fundamentals of Food Biotechnolology, VCH Publishers, USA, 431p. MAGER, W. H., and MORADAS-FERREIRA, P Stress Response of Yeast. Biochem. J., 290, 1-13 PAMİR, H., Fermantasyon Mikrobiyolojisi, Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Yayını, Ankara, 131s. PARSELL, D. A., TAULIEN, J., and LINDQUIST, S., The Role of Heat-Shock Proteins in Thermotolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 29, 339 (1289): RUIS, H., and SCHÜLLER, C., Stress Signaling in Yeast. Bio Essays, 17 (11), SPENCER, J.F.T., and SPENCER, D.M., Genetic Improvement of Industrial Yeasts, Ann. Rev. Microbiol, 37,