Spermanın Kısa ve Uzun Süreli Saklanmasında Oksidatif Stres ve Antioksidan Kullanımı

Transkript

1 Spermanın Kısa ve Uzun Süreli Saklanmasında Oksidatif Stres ve Antioksidan Kullanımı Umut Çağın ARI Yavuz ÖZTÜRKLER Kafkas Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı Kars-TÜRKİYE Özet Oksijeni kullanarak solunum yapan canlılarda, hücresel düzeyde, reaktif oksijen türleri olarak isimlendirilen bileşikler ve ara formları oluşarak, hücrelerin lipid, protein, karbonhidrat temelli yapı taşlarına ve doğrudan DNA ya zarar vermektedir. Hücrede reaktif oksijen türlerinin (ROS) ana kaynağı oksijenin kullanıldığı mitokondrilerdir. Mitokondrilerde oksijenli solunum esnasında, tüm reaktif oksijen türlerinin kaynağı olan, süperoksit anyonu (O - 2) açığa çıkmaktadır. Evrimsel süreçte hücreler, süperoksit anyonuna ve reaktif oksijen türlerine karşı antioksidan koruma sistemlerini geliştirmiş ve oksidatif stresin hücresel düzeydeki olumsuz etkisi en aza indirgenmiştir. Spermatogenezis sonucu sitoplazmasının çoğunu kaybeden spermatozoonlar antioksidan koruma sistemlerinden görece yoksun olmasına rağmen, yüksek enerji ihtiyaçları dolayısı ile, mitokondrial aktiviteleri çok yüksek olan hücrelerdir. Ayrıca membran yapıları da, somatik hücrelere göre, oksidatif strese çok duyarlı olan doymamış yağ asitlerinden zengindir. Bunlara ek olarak spermatozoonlar, oksidatif stres sonucu meydana gelecek yapısal hasarları giderecek onarım mekanizmalardan da yoksundur. Spermada oksidatif strese karşı temel antioksidan kaynağı seminal plazma olup, spermatozoonlara sınırlı koruma sağlayabilmektedir. Spermanın kısa ve uzun süreli saklanmasında, spermatozoonların çok daha uzun süreli oksidatif strese maruz kalacağı açıktır. Oksidatif stresin kaynağının ve spermatozoonlar üzerindeki olumsuz etkilerinin bilinerek, antioksidatif önlemlerin alınması; spermanın uzun ve kısa süreli saklama başarısını arttırabilir. Anahtar Kelimeler: Reaktif Oksijen Türleri (ROS), Oksidatif Stress, Antioksidanlar, Sperma Oxidative Stress during Long and Short Term Storage of Sperm and Usage of Antioxidant Summary: In living creatures carrying out respiration with oxygen, components and metabolites, called as reactive oxygen species (ROS), are occurred in cell. ROS detrimentally affects cell constituents; lipids, protein, carbohydrates and also DNA. In cells, the main sources of ROS are mitochondria, in which oxygen is used in order to produce ATP. Singlet oxygen (O - 2), the source of all ROS, comes out in mitochondria during respiration. Cells have developed antioxidant defense systems against singlet oxygen and ROS during evolution. In this way, detrimental effects of oxidative stress are reduced on cell base. Although spermatozoon, whose cytoplasm are lost during spermatogenesis, is lacking antioxidant defense systems, spermatozoa have higher mitochondrial activity compared to somatic cells. Moreover, membrane of spermatozoa is rich from unsaturated fatty acids, vulnerable to oxidative stress. Furthermore, there is not any repairing mechanism in spermatozoa in order to obviate cell injuries caused by ROS. The main source of antioxidants is seminal plasma in semen and its protective effects is limited. It is exact that spermatozoa are long time exposed to oxidative stress during short or long term storage. Antioxidative precautions against ROS, with knowledge of oxidative stress and its detrimental effects on spermatozoa, may improve success of short and long term storage of sperm. Key words: Reactive Oxygen Species (ROS), Oxidative Stress, Antioxidants, Sperm Giriş Spermada Oksidatif Stresin Kaynağı ve Reaktif Oksijen Türleri Spermatozoonların mitokondrilerinde aktif olarak süperoksit anyonu (O ) açığa çıktığı ve O 2 anyonunu mitokondri dışına saldığı bilinmektedir. 1 Spermada ROS ana kaynağının spermatozoonun kendisi olduğunu söylemek yanlış olmayacaktır. Ayrıca spermada bulunan lökositler ve nötrofillerde ROS kaynağı olarak bilinmektedir. Kısa veya uzun süreli saklama amacıyla farklı solüsyonlar ile spermanın sulandırılması, ROS

2 karşı antioksidanların doğal kaynağı olan seminal plazma oranını ve antioksidatif yoğunluğu da seyreltmektedir. Yine uzun veya kısa süreli saklama koşullarında atmosferik oksijen basıncına maruz kalan spermada oksidatif stres meydana geleceği açıktır. Dış ortamda tutulan spermanın gün ışığı ve mor ötesi (UV) ışınlara maruz kalması da oksidatif stresi arttırabilir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumuna ve kaynağına daha ayrıntılı bakacak olursak, spermatozoonların mitokondrionlarında oksijen ve şekerlerden ATP üretilmektedir. ATP ise spermatozoonların hareket, akrozom reaksiyonu, memrandan gerçekleşen aktif transport gibi fizyolojik olaylarda ana enerji kaynağı olarak kullanılmaktadır. Mitokonrionlarda ATP için kullanılan oksijenin büyük kısmı suya dönüşürken, %1-2 lik bölümü ise istenmeyen bir şekilde süperoksit anyonuna (O - 2) dönüşmektedir. Süperoksit anyonu ise mitokondrionlarda ve hücrenin sitoplazmasında bulunan süperoksit dismutaz (SOD) enzimi ile hidrojen peroksite (H 2 O 2 ) dönüştürülmektedir. H 2 O 2, O - 2 anyonuna göre daha az aktif olan ROS ara metaboliti olarak tanımlanmaktadır, ancak H 2 O 2 (eğer ortamda hidrojen peroksidi suya indirgeyecek antioksidan sistemleri yok ise) ortamdaki demir iyonu aracılığı ile hızlı bir şekilde hidroksil (OH - ) radikaline dönüşecektir. Hidroksil radikali ise hücredeki lipid, karbonhidrat ve protein bileşikleri ile etkileşerek yeni peroksit radikallerinin türemesine ve hücresel yapı taşlarının zarar görmesine neden olacaktır. 2 Bu noktada OH radikalinin oluştuğu H 2 O 2 ara metaboliti büyük önem taşımaktadır. OH radikalinin yarılanma ömrü, çok aktif olduğundan, çok kısadır ve oluştuğu çevredeki yapılara zarar vermektedir. H 2 O 2 metaboliti daha az aktif olmasına rağmen, biyolojik membranları geçerek bütün hücreye yayılması nedeniyle (sonradan OH radikaline dönüşerek) bütün hücrede zarar meydana getirebileceği vurgulanmaktadır. 3 Nitrik oksitin (NO) reaktif oksijen türlerinin etkileşimi sonucu ortaya çıktığı ve bir çok fizyolojik olayda yer alığı bilinmektedir. Ancak yüksek düzeydeki NO in spermatozoonlarda apopitozisi tetikleyebileceği de bildirilmektedir. 4 Reaktif oksijen türlerinin zararlı etkilerinin yanı sıra, savunma hücreleri tarafından bakteri, virus ve kanser hücrelerinin yok edilmesinde kullanıldığı bilinmektedir. Ayrıca akrozom reaksiyonu ve fertilizasyon olgularında ROS lerinin ve metabolitlerinin rollerinin olduğu bilimsel çalışmalarla ortaya konulmuştur. ROSlerinin düşük dozları bazı fizyolojik olayları indüklerken, yüksek dozları oksidatif stresi ve apopitozisi tetikleyerek spermatozoonların işlevlerini yitirmesine neden olabilir. 1 Spermatozoonların mitokondrion, sitoplazma ve seminal plazmada belirli düzeyde antioksidan bileşikler bulunmaktadır. Spermatozoonlar, spermatogenezis sürecinde, sitoplazmalarının büyük kısmını kaybettiklerinden hücre içi antioksidan aktivitenin sınırlı olacağı söylenebilir. Antioksidan koruma mekanizmaları ve spermatozoonlardaki durum öz olarak ele alınmıştır. Oksidatif Strese Karşı Başlıca Koruma Mekanizmaları ve Antioksidanlar Hücrenin yapı taşlarını ve dolayısı ile hücreyi reaktif oksijen türlerine ve oksidatif strese karşı koruyan özel kimyasal bileşiklere ve/ve ya enzimlere antioksidanlar denilmektedir. Genel olarak antioksidanlar kararsız olan ROS bileşiğini veya ara metabolitlerini, hücre yapı taşlarına zarar vermeden, elektron veya hidrojen aktarımları ile daha kararlı hale getiren ve kendileri de kararlılıklarını koruyan (prooksidant özellikleri düşük) bileşiklerdir. Ancak bazı durumlarda antioksidanlar da oksidatif özellik kazana bilmektedir. Bu duruma pro-oksidasyon denilmektedir. Hücresel düzeyde ROS karşı ilk önlem mitokondrionlarda ortaya çıkan süper oksit anyonunu (O - 2), hidrojen peroksit(h2o2) ara metabolitine dönüştüren süper oksid dismutaz (SOD) enzimi ile başlar. H2O2 görece zararsız ROS ara metabolitidir. H2O2 kısa sürede, ortamdaki demir iyonu varlığında, hidroksil radikaline (OH) dönüşecektir ancak H2O2 en kararlı ve hücre zarlarını kolaylıkla geçebilen ara metabolittir. Bu aşamada H2O2 in OH dönüşmeden suya (H2O) dönüştürülmesi gerekmektedir. Bu işlemi ise katalaz enzimi veya yapısından hidrojen vererek H2O2 yi suya indirgeye bilecek diğer antioksidanlar (glutatyon, ergotiyonin, sistein, N-asetil sistein vd.) üstlenmektedir. 1,2 ROS lerine karşı hücrenin geliştirdiği antioksidan koruma sistemine bakıldığında, tek bir antioksidan veya enzimin değil; bu antioksidan ve enzimlerin bütün olarak çalıştığı, göründüğünden daha kompleks bir işleyişin olduğu anlaşılmaktadır. Çünkü ROS leri etkisizleştirilmeye çalışılırken hücreye daha zararlı olabilecek ara metabolitler açığa çıkabilmektedir; bu ara metabolit veya oksidantlarında biyokimyasal süreçlerle ortadan kaldırılması gerekmektedir (Şekil 1) Ayrıca bazı vitaminler ve mineraller de (A, E ve C vitaminleri ve öncü maddleri, Se) antioksidan özelliğe sahip bileşikler olup hücreyi ROS karşı korumaktadır. Somatik hücrelerde bulunan hücresel onarım mekanizmaları da ROS meydana getirdiği oksidatif hasarın giderilmesi için önemli bir unsurdur.

3 Genel olarak bakıldığında ROS lerine karşı hücrenin korunması için 3 unsurdan yararlanılabileceği görülmektedir, 1. ROS lerinin oluşumun engellenmesi, 2. Oluşmuş ROS lerinin zararlı etkilerini yok edecek sistemler: Antioksidanlar 3. Oksidasyon sonucu meydana gelen hücresel hasarın onarılması Spermatozoonlar söz konusu olduğunda ROS lerinin oluşmasının engellenmesinin güç ve hücresel hasarın onarılmasının imkansız olacağı söylenebilir. Bu durumda ROS lerine karşı spermatozoonları koruyabilecek tek unsurun antioksidan koruma sistemleri olduğunu söylemek yanlış olmaz. Bu noktada spermatozoonların oksidatif strese duyarlılığına ve başlıca koruma mekanizmalarına daha yakından bakmak gerekir. SPERMATOZOON C 6H 12O 6 + O 2 Mitokondri ATPs O 2 - SOD O 2 - OH - OH - OH - 2GSH H 2O 2 H 2O 2 GPx+NADP Katalaz ROOH ROOH ROS Saldırısı H 2O GR+NADPH H 2O + GSSG ROOH ROOH *Membran Hasarı *DNA Kırılması *Mikroanatomik yapıda bozulma *Ölü Oranında Artış *Motilite Oranında Azalma *Fertilizasyon Oranında Düşüş Şekil 1. Spermatozoonda, oksidatif stres kaynağı, ROSlerinin oluşumu ve antioksidan koruma sisteminin şematik görünümü. SOD: Süperoksit Dismutaz, GSH: Glutatyon, GSSG: Yüseltgenmiş Glutatyon, GPx: Glutatyon Peroksidaz, GR: Glutatyon Redüktaz. Spermatozoonların Oksidatif Strese Duyarlılığı ve Koruma Mekanizmaları Sperma membranında doymamış yağ asitleri somatik hücrelere göre daha fazladır. Spermatozoonların membranındaki doymamış yağ asit oranın artmasının spermanın kalitesini olumlu yönde etkilediği de belirlenmiştir. 5 Spermatozoon un membranında bulunan çoklu doymamış yağ asitlerinin membran akışkanlığını arttırdığı, bu nedenle sperm kapasitasyonu ve spermatozoonların motilitesiyle de yakından ilişkili olduğu da bilinmektedir. 6-8 Yüksek düzeyde doymamış yağ asidi içeren sperma membranı reaktif oksijen türlerine karşı daha duyarlı olabilir. 9 Bu duyarlılık kapasitasyon ve akrozom reaksiyonu gibi fizyolojik olayların gerçekleşmesi için bir gereklilikte olabilir. Spermatozoonlarda, reaktif oksijen türlerinin temel kaynağı olan, süper oksit anyonu mitokondrionlarda meydana gelmekte, mitokondrion dışına sızarak spermatozoon membranına ve spermatozoon DNA sına zarar verebileceği belirtilmektedir. 9 Spermatozoonda görülen DNA kırılmasının ana nedeninin oksidatif stresten kaynaklandığı da belirlenmiştir. Özelliklede, ROS ara metaboliti olan, H 2 O 2 in, membranları kolaylıkla geçerek, spermatozoonlarda DNA kırılmalarını arttırdığı belirtilmektedir 10

4 Oksidatif stresin, hücrelerin programlı ölümü olarak tanımlanan, apoptozisi tetikleyebileceği belirtilmektedir. Apopitozis meydana gelecek spermatozoonlarda mitokondrial ROS üretiminin arttığı da belirlenmiştir. Spermatozoonların apopitozisten tek kurtuluş yolu fertilizasyondur. Oositi dölleyemeyen spermatozoonlar apopitozise uğrayacaktır. ROS düzeyinin yüksek olması erken apopitozise neden olabilir. 9 Özet olarak ROS lerinin spermatozoonlar üzerindeki olumsuz etkileri bilinmektedir. Ancak ROS lerinin fertilizasyonun belirli aşamalarında ihtiyaç duyulan bileşikler olduğu da ortaya konulmuştur. Bu noktada ROS lerinin oluşumu ve zararlı etkileri hücre tarafından denetlenebildiği sürece hücre üzerindeki etkilerinin sınırlı kalabileceği söylenebilir. Spermatozoonların ve seminal plazmanın belirli düzeylerde antioksidan kapasiteye sahip olduğu iyi bilinmektedir. 11 Ancak, antioksidan koruma sistemlerinden, somatik hücreler ile karşılaştırıldığında, yoksun olan spermatozoonların, ROSlerinden daha fazla olumsuz etkilenebileceği unutulmamalıdır. Özellikle, spermanın uzun ve kısa süreli saklanmasında antioksidanların kullanımı yararlı olabilir. Spermanın Kısa ve Uzun Süreli Saklanmasında Oksidatif Stres ve Antioksidan Kullanımı Spermanın kısa ve uzun süreli saklanmasında oksidatif strese karşı birçok antioksidan veya antioksidan olabileceği düşünülen bileşik kullanılmıştır. Antioksidan özelliğe sahip binlerce bileşik ve bu bileşiklerin kullanıldığı binlerce yayın bulmak mümkündür (sciencedirect taramasında toplam antioksidant+sperm aramasıyla 7779 adet literatür sonucu çıkmaktadır;). Birçok yeni bileşiğinde kullanıldığı yayınlar da mevcuttur. Bu derlemede en güncel birkaç antioksidan bileşik ve enzimin yer aldığı yayına yer verilerek antioksidanların kullanımının faydaları-zararları ortaya konulmaya çalışılmıştır. Kısa ve uzun süreli saklanan spermada bulunan spermatozoonların oksidatif strese maruz kaldığı açıktır. 12 Ancak gerçekleştirilmiş olan çalışmalara bakıldığında oksidatif stresin spematozoonlar üzerindeki etkisinin fertilizasyona ve gebelik oranları üzerine kesin olumsuz etkisini belirleyen bir çalışma bulunmamaktadır. Bunun nedeni örneğin kryopreservasyon sırasında oksidatif stresin meydana getirdiği olumsuz etkinin, donmanın hücre üzerindeki olumsuz etkisine göre çok sınırlı kalması olabilir. Çalışmalara bakıldığında bir çok çalışmanın tek düze gerçekleştirildiği görülmektedir. İn vivo koşullarda antioksidanların koruyuculuğu bir döngü ve enzim sistemi üzerine oturmuş durumdadır. İn vitro olarak sperma sulandırıcılarına eklenen antioksidanlar tek başlarına bu döngüyü devam ettirecek kapasiteye sahip olmadığı açıktır. Örneğin indirgenmiş glutathione (GSH) bir çok çalışmada tek başına sperma sulandırıcılarına eklenmiş ve elde edilen sonuçlara göre çözüm sonu bir çok spermatolojik parametreyi de olumlu yönde etkilemiştir. GSH glutathione peroksidaz (GPx) enzimi ve ortamda NADP olmaksızın bir etkinlik gösterilmediği bilinmektedir. Yine bazı çalışmalarda yükseltgenmiş gulutathione (GSSG) antioksidan olarak kullanılmıştır. GSSG glutathione redüktaz enzimi ve NADPH olmaksızın tekrar antioksidan özellik gösterecek yapıya sahip bir molekül değildir. Ancak bu çalışmalarda da GSSG nin spermatolojik parametreler üzerine olumlu etkileri gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar eğer doğru ise, antioksidanların reaktif oksijen türlerinin olumsuz etkilerini bertaraf etmenin yanı sıra spermatozoon üzerinde başka bazı koruyucu etkisinin olabileceğini akla getirmektedir. Belki de hücreyi soğuk şokuna karşı korumakta veya kryoprotektif özellik gösteriyor olabilir. Glutatyon ve Glutatyon redoks döngüsünde yer alan antioksidanlar üzerine yapılan çalışmalarda, de Olliveira ve ark. 13 2,5 mm düzeylerinde bazı olumlu etkilerinin görüldüğü ancak 2,5 mm üzerinde dondurma-çözdürme sonrası spermatolojik parametreleri olumsuz yönde etkilediğini bildirmişlerdir. Arı ve ark. (Effect of antioxidants in glutathione redox cycle on freezability of ram semen, P13 page54, Reprod Dom Anim 49(Suppl.3) 2014, doi: /rda.12391) glutatyonun biyokimyasal çevrimine bakarak, glutatyonun (GSH) antioksidan etkisini sergileyebilmesi için glutatyon peroksidaz (GPx) ve glutathione redüktaz (GR) ihtiyaç olduğunu savlayarak yaptıkları çalışmada; GSH çözüm sonu spermatolojik parametereleri sayısal olarak olumlu etkilese de, bu etkinin istatistiksel farka dönüşmediğini tespit etmişlerdir. Aynı çalışmada en büyük olumlu etkiyi tek başına kullanılan GPx enziminin yapması da ilginç bir sonuç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu noktada GPx enziminin katalaz enzimine benzer şekilde (GSH a ihtiyaç duymaksızın) H2O2 yi suya indirgemesinden kaynaklanmış olabileceği düşünülmektedir. GSH+GR kombinasyonu çözüm sonu spermatolojik parametreleri olumlu yönde etkileyen diğer bir kombinasyon olarak göze çarpmaktadır. GSH+GPX+GR kombinasyonunda çözüm sonu spermatolojik

5 parametereler üzerine olumlu etki göstermemesi de bu çalışmanın diğer bir ilginç sonucudur. Bucak ve ark. ise yaptıkları çeşitli çalışmalarda indirgenmiş (GSH) ve yükseltgenmiş glutatyonun (GSSG) çözüm sonu spermatolojik parametreler üzerine etkilerini incelemek için yapmış oldukları çalışmada, GSH nun ve GSSG nun spermatolojik parametreler üzerine herhangi bir etkisini saptayamamışlardır. 14 Tuncer ve ark. 15 (spermatolojik parametreler üzerine herhangi bir etkisini belirleyemedikleri, GSH DNA bütünlüğü üzerinde olumlu etkileri olabileceğini saptamıştır. GSSG nin spermatolojik parametreler üzerine etkisinin, glutatyon redoks döngüsüne bakıldığında, doğrudan değil dolaylı olabileceği düşünülmelidir. Çünkü GSSG son ürün olup, GSH a dönüşmeden antioksidan özellik göstermeyeceğinden, GR enzimine ihtiyaç duymaktadır (Şekil 1). Kasimanickam ve ark. 16 SOD ve GPx aktivitesi ve DNA kırılımı arasındaki ilişkiyi belirlemek için yapmış oldukları çalışmada, DNA fragmantasyonu ile antioksidan aktivitesi arasında negatif korelasyon saptamışlardır. Aynı araştırmacılar spermatozoonlardaki lipid peroksidasyon ile DNA kırılımı arasında önemli düzeyde pozitif korelasyon belirlemişlerdir. El-Taieb ve ark. 17 MDA düzeyine bağlı olarak, oksidatif stresin artmasıyla akrozomal anormalitenin önemli ölçüde arttığını elektron mikroskop görüntüleri ile tespit etmişlerdir. Aynı araştırmacılar motilite değerlerinde önemli bir değişim gözlemlememişlerdir. ROS maruz kalan spermada, spematozoonların kemotaksis özelliklerinin olumsuz etkilendiği ve ortama katalaz gibi antioksidanların eklenmesinin, bu olumuz etkiyi azalttığı tespit edilmiştir. ROS kemotakis üzerine olumsuz etkisinin spermatozoonların membran yapısı üzerine etkisinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Spermatozoonlar oosite yönlenmesinde kemotaksisin önemi açık olup, böyle bir durumda fertilizasyon oranlarında düşüş yaşanması olasıdır. 18 Yıldız ve ark. 19 L-ergotiyonin (LE), N-asetilsisteinin(NAC) ve sisteinin koç spermasının dondurulması ve antioksidan aktivite üzerine etkisini araştırmak için yürütmüş oldukları çalışmada LE herhangi bir etkisi görülmezken; NAC ın yüksek dozlarının çözüm sonu spermatolojik parametreler üzerine olumsuz etkileri olabileceğini belirlemişlerdir. Çoyan ve ark. LE nin koç spermasının dondurma çözdürme sonrası spermatolojik parametreleri olumlu yönde etkilediğini tespit etmişlerdir. 20 Tuncer ve ark. 15 sisteinin çözüm sonu spermatolojik parametreler üzerine herhangi bir olumlu yada olumsuz etkisini belirleyememişlerdir. Yıldız ve Ark. 19 dondurma öncesi sisteinnin sulandırıcılara eklenmesinin çözüm sonu parametreleri olumsuz etkilediğin belirlerken Bucak ve ark. sisteinin koç spermasının çözüm sonu spermatolojik parametreler üzerine olumlu etkilerini belirlemişlerdir. Görüldüğü gibi Yılız ve ark. 19 sisteinin dondurma çözdürme sonrası spermatolojik parametreleri olumsuz etkilediğini belirlerken, Bucak ve ark. olumlu etkilerini tespit etmişlerdir. Bu durum sisteinin spermanın dondurulmasında sulandırıcılara eklenerek kullanımında şüpheler oluşturmaktadır. Arı ve ark. 21 yine LE üzerine yürüttükleri çalışmada, LE sulandırıcılara eklenmesinin istatistiksel olarak çözüm sonu parametrelere etkisinin olmadığını belirlerken; dondurulabiliği düşük olan denemelerde LE nin çözüm sonu parametreler üzerine olumlu etkilerinin olabileceğini saptamışlardır. Arı ve ark. NAC ın 0,75 mm a kadar farklı dozlarının spermanın uzun süreli saklanmasının etkisini incelemişlerdir. Arı ve ark. NAC üzerine yapmış oldukları çalışmada NAC nin yüksek dozlarının (>0,75mM) spermatolojik parametreleri olumsuz etkileyebileceğini belirlemişlerdir (Arı, U.Ç., R. Kulaksız, S. Yıldız, Y. Öztürkler ve N.C. Lehimcioğlu, Süt bazlı sperma sulandırıcısına eklenen N-asetilsistein in (NAC) Tuj koçlarının çözüm sonu sperma kalitesi üzerine etkisi: NAC ın yüksek dozları toksik olabilir, VII. Ulusal Reprodüksiyon ve Suni Tohumlama Bilim Kongresi, Kongre Kitapçığı, 149, Kars, 2013.). Sonuçta NAC ın yüksek dozlarının çözüm sonu spermatolojik parametreleri olumsuz etkileyebileceğini tespit etmişlerdir. Bu etkilerin antioksidanların prooksidant ve yan etkilerinden kaynaklı olarak sperma üzerine olumsuz etkiler olabileceği düşünülmektedir. Dondurma öncesi sulandırıcılara vitamin E katkısının 22 çözüm sonu spermatolojik parametreleri olumlu yönde etkileyebileceği de bazı araştırmacılar tarafından belirlenmiştir. Vitamin C nin koç spermalarının kısa süreli saklanması üzerine olumlu etkileri olduğu da bildirilmektedir. 23 Ancak özellikle vitaminlerin, besin katkısı olarak alınımının, spermanın antioksidan kapasitesini iyileştirmesi üzerine pek çok çalışma bulunmaktadır

6 Antioksidanların spermanın kısa ve uzun süreli saklanmasında spermatolojik parametreler üzerine yapılan araştırmalar incelendiğinde kullanılan antioksidanlar aynı olsa da birbiriyle çelişen sonuçların elde edildiği dikkati çekmektedir. Sonuç Spermanın uzun ve kısa süreli saklanmasında sulandırıcılara antioksidanların eklenmesi ile çözüm sonu spermatolojik parameterelerin ve bu spermanın kullanılması ile elde edilecek gebelik oranlarının yükseleceğini gösteren çalışmalar olmasına rağmen, antioksidanların mucizevi bileşikler olduğu düşüncesinin yanlış olabileceği ortaya çıkmaktadır. Genele bakıldığında ROSlerinin sperma üzerindeki olumsuz etkisi, diğer unsurlara bakıldığında sınırlı kalabilmektedir. Örneğin spermanın dondurulması esnasında oluşan fiziksel zararın oksidatif stresin oluşturduğu zarardan çok daha fazla olduğu kesindir. Bu noktada antioksidanların sadece ROS bileşiklerinin olumsuz etkilerini önlemek yanında, farklı mekanizmalarla kryoprotektif etki gösterebildiği düşüncesi doğmaktadır. Bu noktada spermanın saklanmasında sulandırıcılara antioksidanların eklenmesinin bazı yararları olabileceği birçok bilimsel yayın tarafından ortaya konsada ticari olarak kullanılan spermalara eklenmeleri sınırlı kalmıştır. Diğer bir deyiş ile antioksidanların, suni tohumlamada kullanılan spermalara eklenmesi pratiğe geçememiştir. Bu durumun antioksidanların koruyucu etkilerinin tam olarak ortaya konulamamasından ve kar-zarar denkleminde antioksidan bileşiklerin sperma üretim maliyetlerini arttırmasından ve yine sahada gebeli oranları üzerine etkisinin tam olarak kanıtlanamamasından kaynaklanmış olabilir. Öz olarak ucuz ve etkin antioksidanların belirlenerek (araştırmalar halen en etkin antioksidanın bulunmasına yönelik olarak devam etmektedir) sperma sulandırıcılarına katılması yararlı olabilir. Ancak büyük yarar beklentisi içine de girilmemelidir. Yürütülen çalışmalar ve antioksidan kullanımının pratikte-sahada yer alamaması buna işaret etmektedir. Ticari olarak üretilen boğa sperması sulandırıcılarına antioksidanların eklenmemesi kar-zarar dengesinin antioksidanlar alehine olduğunu göstermektedir. Sulandırıcılar içerisinde bulunan birçok bileşikte (örneğin yumurta sarısı, süt, süt tozu, soya lesitini, kryoprotektan bileşikler, şekerler vb.) zaten doğal antioksidan nitelik taşımakta olup; ek antioksidan kullanımına bazı durumlar hariç gerek kalmamaktadır. Genel olarak bakıldığında antioksidanların pahalı kimyasallar olduğu, bazı durumlarda sulandırıcının hassas ph dengesini ve ozmotik basıncını bozabileceği de unutulmamalıdır. Eğer spermanın saklanmasında sulandırıcılara antioksidan eklenmesi düşünülüyor ise etkinliği kanıtlanmış, ucuz ve sulandırıcının karakteristiğini olumsuz etkilemeyecek antioksidanların tercih edilmesine gayret edilmelidir. Belirtilen tanıma giren antioksidan bulunmamakta olup, pratikte ticari sperma sulandırıcılarına antioksidan eklenmesi yapılmamaktadır. Kaynaklar 1. Aitken RJ, Smith TB, Lord T, Kuczera L, Koppers AJ, Naumovski N, Connaughton H, Baker MA, De Luliis GN. On methods fort he detection of reactive oxygen species generation by human spermatozoa: analysis of the cellular responses to catechol oestrogen, lipid aldehyde, menadione and arachidonic acid. Androl 2013; 1: Aitken RJ, Clarkson JS, Fishel S. Generation of reactive oxygen species,lipid peroxidation, and human sperm function. Biol Reprod 1989; 41: Rhoades R, Pflanzer R. Human Physiology, 1996, 3rd edition. Harcourt Brace and Company, Orlando. 4. Moran JM, Madejon L, Ortega FC, Pena FJ. Nitric oxide induce caspace activity in boar spermatozoa. Therio 2008; 70: Argov N, Sklan D, Zeron Y, Roth Z. Association between seasonal changes in fatty acid compostion, expression of VLDL receptor and bovine sperm quality. Therio 2007; 67: ) 6. Retterstol K, Haugen TB, Tran TN, Christophersen BO. Studies on the metabolism of essential fatty acid in isolated human testicular cells. Reproduction 2001; 121: Zeron Y, Tomczak M, Crowe J, Arav A. The effect of liposomes on thermotropic membrane phase transitions of bovine spermatozoa and oocytes: implications for reducing chilling sensivity. Cryobiology 2002; 45:

7 8. Connor WE, Lin DS, Wolf DP, Alexander M. Uneven distribution of desmosterol and docosahexaenoic acid in the heads and tails of monkey sperm. J Lipid Res 1998; 39: ) 9. Aitken RJ, Lambourne S, Gibb Z. The John Hughes Memorial Lecture: Aspects of Sperm Physiology- Oxidative Stress and the Functionality of Stallion Spermatozoa. Jour Equi Vet Sci 2014; 34: ). 10. De Luliis GN, Thomson LK, Mitchell LA, Finnie JM, Koppers AJ, Hedges A, Nixon B, Aitken RJ. DNA damage in human spermatozoa is highly correlated with the efficiency of chromatin remodeling and the formation of 8-hydroxy-2 -deoxyguanosine, a marker of oxidative stress, Bio Reprod 2009; 81: Gürler H, Calisici O, Bollwein H. Inter- and intra-individual variability of total antioxidant capacity of bovine seminal plasma and relationships with sperm quality before and after cryopreservation, Animal Reprod Sci 2015; 155: Aitken RJ., Baker MA. Oxidative stress and male reproductive biology. Reprod Fertil Dev 2004; 16; de Oliveira RA, Wolf CA, Viu MAO, Gambarini ML. Addition of Glutathione to an Extender for Frozen Equine Semen, Jour Equi Vet Sci 2013; 33: Bucak MN, Ateşşahin A, Yüce A. Effect of anti-oxidants and oxidative stress parameters on ram semen after the freezing-thawing process. Small Rum Res 2008; 75: Tuncer PB, Bucak MN, Büyükleblebici S, Sarıözkan S, Yeni D, Eken A, Akalın PP, Kinet H, Avdatek F, Fidan AF, Gündoğan M. The effect of cystein and glutathione on sperm and oxidative stress parameters of post-thawed bull semen. Cryo 2010; 61: Kasimanickam R, Pelzer KD, Kasimanickam V, Swecker WS, Thatcher CD. Association of classical semen parameters, sperm DNA fragmentation index, lipid peroxidation and antioxidant enzymatic activity of semen in ram lambs, Theriogenology (2006) 65: ) 17. El-Taieb MA, Ali MA, Nada EA. Oxidative stress and acrosomal morphology: A cause of infertility in patients with normal semen parameters, Mid East Fertil Soc J 2015; 20: Sanchez R, Sepulveda C, Risopatron J, Villegas J, Giojalas LC. Human sperm chemotaxis depends on critical levels of reactive oxygen species, Fertil Steril 2010; 93: Yıldız S, Öztürkler Y, Arı UÇ, Lehimcioğlu NC, Kulaksız R. The Effects of L-Ergothioneine, N- acetylcystein and Cystein on Freezing of Ram Semen. Kaf Üniv Vet Fak Derg, 2015; 21(1): Çoyan K, Başpınar N, Bucak MN, Akalın PP. Effects of cysteine and ergothionine on post-thawed Merino ram sperm and biochemical parameters. Cryo 2011; 63: Arı UÇ, Kulaksız R, Öztürkler Y, Yıldız S, Lehimcioğlu NC. Effect of L-(+)- Ergothioneine (EGT) on Freezability of Ram Semen. Int Jour Anim Vet Adv, 2012; 4(6): Kalthur G, Raj S, Thiyagarajan A, Kumar S, Kumar P, Adiga SK. Vitamin E supplementation in semenfreezing medium improves the motility and protects sperm from freze-thaw induced DNA damage, Fertility and Sterility, 2011, 95(3) Yıldız S, Daşkın A. Liquid storage of ram semen with extenders that containing different antioxidants. Kafkas Üniv Vet Fak Derg 2004; 10: Abdulkareem TA, Al-Haboby AH, Al-Mjamei SM, Hobi AA. Sperm abnormalities associated with vitamin A deficiency in rams, Small Ruminant Research, 2005, 57(1); Sönmez M, Yüce A, Türk G. The protective effects of melatonin and Vitamin E on antioxidant enzyme activities and epididymal sperm characteristics of homocysteine treated male rats. Reprod Toxic 2007; 23(2): Liu Q, Zhou YF, Duan RJ, Wei HK, Jiang SW, Peng J. Effects of dietary n-6:n-3 fatty acid ratio and vitamin E on semen quality, fatty acid composition and antioxidant status in boars, Anim Repro Sci 2015: