IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERĐ

Transkript

1 ÜREME SAĞLIĞI VE ĐNFERTĐLĐTE DERNEĞĐ KANITA DAYALI UYGULAMA REHBERLERĐ IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERĐ 2008 ÜREME SAĞLIĞI VE ĐNFERTĐLĐTE DERNEĞĐ KLĐNĐK EMBRYOLOJĐ ALT ÇALIŞMA GRUBU TARAFINDAN HAZIRLANMIŞTIR TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 1

2 Üreme Endokrinolojisi, İnfertilite ve Yardımcı Üreme Teknikleri Derneği tarafından alt çalışma grupları kurulmuş olup, bu grupların işbirliği ile kadın doğum ve fertilite uzmanları, reprodüktif biyologlar, embryologlar ve reprodüktif genetik uzmanlarının ilgili alanlarda gerekli araştırmalarının, bilgilendirme ve eğitimlerinin yapılabilmesi amaçlanmıştır. Klinik embryoloji adı altında kurulan alt çalışma grubunun oluşumundaki amaç ise, yardımcı üreme tekniklerinin uygulandığı infertilite merkezleri bünyesinde bulunma zorunluluğu olan IVF (invitro fertilizasyon) laboratuvarlarının genel çalışma koşullarını belirlemek, çalışacak personel, donanım ve rutin laboratuvar uygulamalarında ortak görüş sağlayabilmektir. Bu amaca yönelik olarak klinik embryoloji alt çalışma grubu bir uygulama rehberi hazırlamıştır. Bu rehberin hazırlanımında uluslararası standartlar dikkate alınarak ESHRE (European Society of Human Reproduction and Endocrinology) tarafından yayınlanmış uygulama prosedürleri kaynak olarak kullanılmıştır (Gianoroli et al., ESHRE Guidelines, 2000). Hazırlanmış olan uygulama rehberinde, yardımcı üreme teknikleri uygulayan laboratuvarların minimal gereklilikleri göz önünde bulundurulmuş ve bu sahada çalışan ya da çalışmaya başlayacak olan reprodüktif biyolog ve embryologlara IVF laboratuvarlarında olması gereken kalite kontrol standartları sunulmaya çalışılmıştır. Bu kuralların IVF laboratuvarlarında dikkatli bir şekilde uygulamasının yardımcı üreme teknikleri uygulayan kliniklere yararlı olabileceği hedeflenmiştir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 2

3 1. LABORATUVAR PERSONELİ 1.1. T.C. Sağlık Bakanlığı Ana Çocuk Sağlığı ve Aile Planlaması Genel Müdürlüğü tarafından oluşturulmuş Üremeye Yardımcı Tedavi Merkezleri Yönetmeliği nce; IVF laboratuvarından sorumlu kişinin üremeye yardımcı tedavi teknikleri konusunda, yurtiçindeki eğitim merkezi olmaya hak kazanmış merkezlerden veya yurt dışındaki (Sağlık Bakanlığı mızca onaylanmış olması şarttır) merkezlerde en az altı aylık eğitim görmüş ve kurul tarafından kabul edilen sertifika veya belgesi olan tıp doktoru, histolog-embryolog, veteriner, biyolog, eczacı veya hemşire gibi en az dört yıllık yüksek okul mezunu bir sağlık personeli olması şarttır. Bu kişinin aynı zamanda mikroenjeksiyon uygulaması yapabilmesi için bu konuda en az iki ay süre ile eğitim almış ve sertifikasının kurul tarafından kabul edilmiş olması gerekmektedir Yardımla üreme tekniklerinin uygulandığı infertilite merkezlerindeki siklus sayısının yoğunluğu dikkate alınarak belirlenecek sayıda yardımcı laboratuvar personelinin çalıştırılması, laboratuar rutin uygulamalarının düzenli ve daha önemlisi güvenli bir şekilde devam edebilmesi açısından gereklidir Göreve yeni başlayan laboratuvar personelleri için, mutlaka kapsamlı bir oryantasyon ve genel eğitim programı periyodik aralıklarla verilmeli, takip eden dönemlerde ise laboratuvarda çalışan tüm sağlık personelinin bilgilendirilmesi açısından dünyada hızla gelişmekte olan yeni IVF laboratuvar prosedürleriyle ilgili eğitim programları düzenlenmelidir Laboratuvar içerisinde çalışan her personelin görev ve sorumluluklarının belirtildiği yazılı belgeler hazırlanmalıdır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 3

4 2. PROSEDÜRLER 2.1. Yardımla üreme teknikleri uygulayan infertilite merkezlerine ait her IVF laboratuvarında, hasta bazında uygulanan tüm prosedürlerinin detaylı olarak açıklandığı aynı zamanda hasta özerkliği ve gizliliğinin korunduğu formlar oluşturulmalıdır Tüm hastalara ait laboratuvar sonuçları bu amaçla düzenlenmiş, tarihleri belirtilmiş, geçerliliği olan yazılı bir prosedür içerisinde raporlanmalıdır. Sonuçlarla ilgili tüm tanımlamalar ayrıntılı, doğru ve klinik açıdan uygun olmalıdır Laboratuvarda bulunan tüm aletlerin, kalibrasyon ve kalite kontrol materyalinin yazılı olarak belgelendirilmesi gereklidir Laboratuvarda günlük olarak kaydedilmesi gereken, uygulanan tüm prosedürlerin tanımlandığı, günlük alet kullanım ve gerekli oldu ise bakımlarının belirtildiği belgeler hazırlanmalıdır IVF laboratuvarlarında hastaya uygulanan işlemlerin her aşamasında uygulayıcının tanımlandığı belgeler düzenlenmelidir (Ör: Laboratuvarda solüsyon hazırlıklarını yapan, sperm hazırlama işlemini gerçekleştiren embryolog ya da teknisyenler, oosit toplamada görev alan klinisyen, anestezi uzmanı, embryolog, embryo transferini uygulayan kişiler vb) Gerekli olduğunda laboratuvarın kendi personeli ya da eğitim amaçlı gelen diğer kişiler tarafından kullanılmak üzere, konsültasyona uygun, tüm laboratuvar prosedürlerinin detaylı olarak tanımlandığı bir laboratuvar manueli hazırlanmalıdır Sonuçların regüler evalüasyonu için genel laboratuvar bilgilerini içeren bir defter düzenlenmelidir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 4

5 3. LABORATUVAR ÖZELLİKLERİ VE GÜVENLİĞİ 3.1. LABORATUVAR PLANI Sağlık Bakanlığı Ana Çocuk Sağlığı ve Aile Planlaması Genel Müdürlüğü tarafından oluşturulmuş Üremeye Yardımcı Tedavi Merkezleri Yönetmeliği nce, IVF laboratuvarları embryoloji ve androloji olmak üzere iki bölmeden oluşmakta; embryoloji laboratuvarlarının oosit toplama ve embryo transferlerinin gerçekleştirildiği ameliyathaneye bitişik en az 25 metrekare büyüklüğünde, androloji laboratuvarının ise aynı merkez içinde en az 10 metrekarelik bir alan içerisinde bulunması zorunludur yılında embryo krioprezervasyonunun yasallaşması ile birlikte, bu yılı takiben kurulan yada kurulacak IVF laboratuvarlarında tercihen embryoloji laboratuvarına yakın (dondulacak embryoların embryoloji laboratuvarından alınacağı düşünülerek), fakat sepere bir alan içerisinde embryo krioprezervasyonunun yapılabildiği, krioprezervasyon işleminde kullanılacak gerekli araç ve gereçlerle donatılmış bir krioprezervasyon laboratuvarının ilavesi zorunlu hale gelmiştir. Tüp Bebek Merkezleri Yönetmeliği embryo krioprezervasyonunun yasallaşması öncesinde hazırlandığı için, yönetmelikte henüz bir krioprezervasyon laboratuvarının zorunluluğu belirtilememiştir. Krioprezervasyon laboratuvarının tercihen minimum 10 metrekare büyüklüğünde olması ideal olacaktır. IVF laboratuvarlarının uygun büyüklükte olması, araç ve gereçlerin gerekli şekilde yerleşiminin sağlanabilmesi ve laboratuvar personelinin rahat ve effektif çalışmabilme düzenini beraberinde getireceğinden başarıyı indirekt olarak etkileyebilmektedir. ESHRE guidelineları ele alınarak laboratuvar yapısı daha detaylı spesifiye edilecek olursa: TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 5

6 Laboratuvarın kurulumunda, gamet ve embryo manüplasyonları esnasında kesinlikle toksik etkisi olmayacak aseptik malzemeler kullanılmalıdır. Laboratuvar aletlerinin yerleşimi, efektif ve güvenli bir çalışma ortamı sağlanabilmesi amaçlı mekan projesinde mutlaka önceden belirlenmelidir İdari işler, laboratuvar datalarının girişi ve saklanması için ayrı bir ofis alanı oluşturulmalıdır. Deiyonize su aletinin bağlanıp, laboratuvarda kullanılan malzemelerin yıkanabileceği, sterilizasyon ve benzeri işlemlerin yapılabileceği, su kaynağının bulunduğu bir ortam oluşturulmalıdır. Bu ortam embryoloji laboratuvarından ayrı bir bölgede olmalıdır (Kriyoprezervasyon laboratuvarı yeterli büyüklükte ise, bu ortam kriyoprezervasyon laboratuvarı içerisinde yer alabilir). Eğer birtakım fiksatif solüsyonlar kullanılacak ise, bu işlemler için mümkünse ayrı bir oda yada koku giderici hoodlar kullanılmalıdır. Laboratuvar ortamı içerisinde kullanılacak havalandırma sistemide, ayrıca detaylı olarak ele alınması gereken bir konudur. Günümüz IVF laboratuvarlarında olması gereken hava kalitesi, bu ortamın embryo ve gametler üzerine etkisi hakkında halen universal değerler oluşturulamamış olup, embryo gelişiminin her aşamasında ve buna bağlı olarak implantasyon ve gebelik oranları üzerinde negatif etki yaratabileceği görüşü savunulmuştur (Cohen-1997,Hall-1998,Mayer-1999,Boone-1999). Medikal hijenin yeterli düzeyde sağlanabilmesi için önerilen ideal laboratuvar ortamında, TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 6

7 saatte yüksek hava değişimiyle çalışabilecek (Cohen-1997,Gardner-2001) pozitif basınç sağlayan (en az su) HEPA (toz partüküllerin filtrasyonunu sağlar) ve yabancı gaz filtrasyonunun sağlayabilecek aktif karbon filtreleri içeren detaylı havalandırma sistemleri önerilmektedir (Cohen-2001). Birçok havalandırma sisteminde, sadece ortam içerisindeki toz partiküllerin filtrasyonunu sağlayabilen HEPA filtreler kullanılmaktadır. Ancak ortamdaki yabancı gaz filtrasyonunda HEPA filtreler tek başına yeterli olmayıp, bu işlevi gerçekleştirebilecek aktif karbon filtrelerininde havalandırma sistemine dahil edilmesi gerekmektedir. Günümüzde HEPA ve aktif karbon filtrelerini birlikte içeren laboratuvar ortamı, CO2 kaynağı ve inkübatör içi kullanılabilecek üniteleri, mevcut lokal aletlerin (CODA, GEN-X International, inc. Madison, USA) IVF laboratuvarları içerisinde kullanımı önerilmektedir (Cohen-2001). Sonuç olarak günümüz IVF laboratuvarları havalandırma sistemleri için önerilen ortamlar, HEPA mümkünse aktif karbon filtreleri ile havalandırılabilen laboratuvarın en steril olması gereken iç bölgesinde (bu bölge tercihen IVF ve mikroenjeksiyon işlemlerinin yapıldığı embryoloji laboratuvarı olmalıdır), maksimum pozitif basınca sahipken sırayla (androloji, kriyoprezervasyon bölümleri, su kaynağının bulunduğu bölüm ve son olarak IVF laboratuvarı girişi) dışa doğru basıncı azalan, mümkünse özellikle embryoloji bölümünde ana havalandırmaya ek olarak HEPA ve aktif karbon filtreleri içeren lokal aletlerin ortamı, CO2 kaynağı ve inkübatör içi ünitelerinin kullanıldığı ortamlar olarak özetlenebilir. Bu tür havalandırma sistemlerinin daha güvenli ve efektif olarak çalışabilmesi için, IVF laboratuvarlarında pencere olmaması önerilmektedir. Laboratuvar ortamında hava kalitesine ek olarak sabit ısı (22-24C) ve nem oranının (%30-45) ayarlanması, gamet TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 7

8 ve embryo gelişimi için önemlidir (Barnes-2001, Cohen-Gilligan,,ALPHA Environmental, Inc-2001). Laboratuvar ortamında kullanılan ışık kaynağının embryo gelişimi üzerine olumsuz etkileri olabileceğinden, yüksek voltajlı parlak florasan ışık yerine daha yumuşak olan sarı gün ışığı kullanımı önerilebilir. Sonuç olarak yeni bir IVF laboratuvarı kurulacağı zaman, tüm alet ve fasiliteler yardımcı üreme tekniklerinde son gelişmeler göze alınacak şekilde belirlenmeli; tezgah yükseklikleri, uygun ayarlanabilir sandalyeler, göz seviyesine uygun ayarlanmış mikroskop yerleşimleri, boş alan ve yüzeylerin efektif bir şekilde kullanımını sağlayan bir plan, yeterli hava kalitesi ve ışık miktarını oluşturabilen bir ortamın sağlanabilmesi şarttır. Laboratuvar ortamı düzenlenirken bu ortamda çalışacak personelin sağlık ve güvenliliği de dikkate alınmalıdır IVF LABORATUVARLARI ARAÇ VE GEREÇLERİ IVF laboratuvarlarında kullanılan ekipmanın her zaman laboratuvar çalışmalarına uygun, temizliği ve dezenfeksiyonu kolay olan ürünler arasından seçilmesi gerekmektedir. İnkübatörler, buzdolapları, dondurulmuş embryoların saklandığı sıvı nitrojen tankları gibi kullanımında oluşacak arızaların çok kritik olabileceği, aletlerin mutlaka detaylı bir yöntemle monitörize edilebilen bir alarm sistemine bağlı olması gerekir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 8

9 Tüm embryoloji laboratuvarlarında oluşabilecek herhangi bir elektirik kesintisine karşın, kesintisiz güç kaynağı (UPS) kullanılması şarttır. İnkübatörler ve laminar flow tüpleri, IVF laboratuvarı dışında fakat periodik aralıklarla kontrol edilebilecek yakınlıkta ayrı bir alanda olup, mutlaka otomatik backup sistemleri olmalıdır. İnkübatörler sayı ve merkezde uygulanan siklus sayısına bağlı olarak sıklıkla temizlenmeli (15gün-1 ay). Sıvı nitrojen tankları ise, yılda en az bir kere olmak koşulu ile boşaltılıp temizlenmelidir. Sağlık Bakanlığı Ana Çocuk Sağlığı ve Aile Planlaması Genel Müdürlüğü Üremeye Yardımcı Tedavi Merkezleri Yönetmeliği nce, IVF laboratuvarlarında bulunması gereken araç ve gereç listesi aşağıdaki şekildedir. Laminar flow hood İnkübatör; 2 adet, %5 CO2, %5 O2 ve havayı sağlayacak özellikte olmalı (Günümüzde kullanılan kültür solüsyonlarında %6 lık CO2 oranı solüsyon ph sını dengelemek açısından daha uygundur). Mikroskoplar: Standart laboratuvar mikroskobu Stereoskopik (dissecting) mikroskop İnverted mikroskop (Mikromanüplasyon yapılacak ise gerekli standart aletler). --Multiblok heater --Derin donduruculu Buzdolabı --Osmometre --Mikrobalans --ph metre TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 9

10 --Klinik tipi santrifüj --Sperm sayımı için gerekli standart ölçüm aletleri **** Günümüz IVF laboratuvarları için gerekli aletleri daha detaylı olarak değerlendirecek olursak, sırasıyla; KRİYOPREZERVASYON LABORATUVARI - Sıvı azot kullanım tankı ile birlikte programlanabilir kriyoprezervasyon aleti - En az bir tane sıvı azot saklama tankı - Seeding işlemi ve azot aktarımında kullanılacak manüplasyonunun kolay ve güvenli olabilmesi için, ufak bir sıvı azot transfer tankı - Seeding işlemini güvenli bir şekilde gerçekleştirecek paslanmaz çelik bir penset - En az 2 adet örnek saklama tankı - Sıvı nitrojen aktarımında kullanılacak en az birer adet kriolojik eldiven, gözlük ve önlük *** Daha öncede belirtildiği üzere su kaynağı mekanın yeterliliğine göre, IVF laboratuvarı yanında (embriyo çözme işlemlerinde vücut ısısı su sıklıkla kullanılacağından, ayrıca embriyoloji laboratuvarının dışında bir bölgede olması gerektiğinden, tercihen kriyoprezervasyon laboratuvarına yakın olabilir), separe bir alanda yada kriyoprezervasyon laboratuvarı içinde olabilir. Su kaynağına mutlak suretle inkübatörlerde ve laboratuvar malzemelerinin temizliği için kullanılacak bir deiyonize su sistemi bağlanmalıdır. Aynı bölgede IVF laboratuvarında kullanılacak cam malzemelerin (pasteur pipetleri) sterilizasyonu için, kuru hava sterilizatörü koyulabilir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 10

11 ANDROLOJİ LABORATUVARI - En az bir adet vertikal laminar air flow (Class II özellikte) - Faz kontrast mikroskop; 10X, 20X, 40X ve 100X lik objektifleri olan (Faz kontrast mikroskobun yapılan işlemlerin sterilitesi ve güvenliği açısından, laminar flow içerisine montajı sperm analizi takibinde sperm yıkama işlemlerinin aynı alanda yapılabilmesi açısından uygun ve kullanımda pratik olabilir) - Klinik tipi santrifüj - En az bir adet CO2 inkübatörü (tercihen O2 kontrollü) - Etüv (Günümüzde IVF laboratuvarlarında gamet ve embryoların dış ortama maruz kaldıkları süreç içerisinde, ph değişimlerinden minimum düzeyde etkilenmeleri için HEPES yada MOPS içerikli tampon solüsyonlar kullanılmaktadır. Bu tür solüsyonların CO2 inkübatörlerinde inkübe edilmeleri sakıncalıdır. Bu sebeple 37C sıcaklıkta muhafaza edilmelidirler) - En az bir adet no-frost buzdolabı - Vortex - Gerekli miktarlarda medium ölçümü için kullanılacak muhtelif ölçülerde mikropipetörler - Medium aspirasyonu için kullanılacak otomatik chargeable makropipetörler - Sperm sayımı için gerekli standart ölçüm aletleri TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 11

12 EMBRİYOLOJİ LABORATUVARI - En az bir adet vertikal laminar air flow - En az bir adet stereomikroskop (laminar flow içinde kullanılacaktır) - En az 2 adet CO2 (tercihen O2 kontrollü) inkübatörü - En az bir adet inverted mikroskop (manüplasyon ataçmanları ile birlikte) - Etüv 3.3. ENFEKTE EDİCİ AJANLAR Tüm yardımcı üreme tekniklerinde biyolojik materyallerle temas içerisinde olunduğu için, bazı hastalıkların çalışan personele bulaşabilme riski vardır. Enfeksiyon kaynakları çoğunlukla hayvan kaynaklı madde ve follikül sıvısı kaynaklıdır. Bu sebeple tüm IVF merkezleri personel güvenliliği için gerekli prosedürler oluşturmalıdır. Bunun için nasyonel yada lokal sağlık güvenlilik yönetmeliklerinden yararlanılabilir. Bu sebeple aşağıdaki taramalar yapılmalıdır. Hepatit B veya aynı yolla bulaşabilecek diğer viral hastalıklara karşı personelin aşılanması gereklidir. Hastaların tedaviye alınmadan önce HIV, hepatit B/C yada seksüel yolla bulaşan diğer hastalıklara karşı taranmaları şarttır. Hastalar IVF tedavisine başlayacakları zaman her ne kadar ilk aşamada sadece klinisyenler bilgilendirilselerde, bu hastalara ait enfekte biyolojik materyal üzerinde çalışılacak ise, mutlaka laboratuvar personelininde önceden bilgilendirilmesi gerekir. Bu amaçla ESHRE guidelinelarında önerilen tavsiyeleri inceleyecek olursak: Eğer çiftlerden bir yada ikisi HIV pozitif ise, IVF tedavisine alınmamalı yada lokal kurallara göre kabul edilecekse mutlaka ekstensif bir araştırmadan geçirilmelidir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 12

13 Eğer erkek seropozitive ise ( HIV-1 viral partikülleri motil spermin sitoplazmik kompartmanında bulunabilir, Baccetti et.al.,1994), seronegatif olan kadına donor sperm kullanımı önerilebilir. Dolayısıyla tüp bebek (IVF ) ya da mikroenjeksiyon (ICSI) yöntemi ile fertilizasyon esnasında viral partiküllerin oositin içerisine girme riski mevcuttur. Bu partiküllerin oluşan embriyo üzerindeki gelecekteki etkisi bilinmemektedir. Erkek partner hepatit B virüsü taşıyor ise, seronegatif kadın partner IVF tedavisine girmeden önce mutlaka aşılanmalıdır. Eğer kadın hepatit B virüsü taşıyor ise IVF tedavisi uygulanabilir, fakat doğacak bebeğin doğum sonrasında aşılanması gereklidir. Yakın bir zamanda hepatit B pozitif hastalarda mikroenjeksiyonun kullanımı ile birlikte, oosite etrafındaki sıvıdan bulaşmak (muhtemelen sperm membranına yapışarak) üzere virüsün geçişi olabileceği düşünülmüştür. Taraflardan birisi hepatit C virüsünü taşıyor ise, ekstensif tarama sonrasında IVF tedavisine alınabilir. Sifilis seropozitivitesi mevcut ise, IVF tedavisine alınmadan önce gerekli tedavi yapılmalıdır KORUYUCU ÖNLEMLER IVF laboratuvarlarında koruyucu önlemlerin alınması embryo ve gametler için aseptik ortamların garantilenmesi açısından önemlidir. ESHRE guidelinelarına göre alınacak önlemleri inceleyecek olursak: Laboratuvarda çalışırken özel kıyafetler giyilmelidir. İşlemler esnasında non-toksik (pudrasız) eldiven ve maske kullanılmalıdır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 13

14 Göz, yüz ve ellerle deri temasını engellemek amaçlı sıvı azot kullanımında, koruyucu kriyojenik materyaller kullanılmalıdır. IVF laboratuvarlarında vertikal laminar flow kullanımı daha uygun görülmektedir. Solüsyonlar için mutlaka mekanik pipetleme araçları kullanılmalıdır. Fiksatif solüsyonlar kullanılıyor ise, koku çekici hoodlar içerisinde çalışılmalıdır Enfekte aletlerin dezenfeksiyon ve sterilizasyonu şarttır. Disposable materyal kullanımından hemen sonra, kullanılan malzeme için uygun atık konteynırlarına atılmalıdır. Enfeksiyon riski taşıyan materyaller ise laboratuvar çalışanlarının, servis görevlileri ve temizlikçilerin sağlığını tehlikeye atmayacak şekilde imha edilmelidir. İğne ve sivri uçlu atıklar dikkatli bir şekilde manüple edilmeli ve bu tür materyaller için uygun olan konteynırlara atılmalıdır. Embryo ve sperm kriyoprezervasyonunda hücreler içlerinde bulundukları solüsyon içine strawlar daldırılarak çekilmekte ve eksternal dezenfeksiyon yapılmadan sıvı azot tanklarına transfer edilmektedir. Dolayısıyla tank içerisinde bir hastadan diğerine cross-kontaminasyon riski mevcuttur (Tedder et al.,1995). Dolayısıyla sıvı azot tankları içerisinde saklanan örneklerin biolojik içerikleriyle sıvı azot temas etmemelidir. Günümüzde embriyo ve sperm kriyoprezervasyonunda oluşabilecek kontaminasyon riskine karşı, özel üretilmiş yüksek korumalı strawlar kullanılmalıdır. Özellikle kontaminasyon riski yüksek numunelerin, bu strawlar içerisinde saklanması şarttır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 14

15 4. GAMET VE EMBRYOLARIN GÜVENLE ELE ALINMASI VE TANIMLANMASI IVF tekniklerinin farklı aşamaları, yazılı dökümanlarla detaylı olarak belirlenmelidir. Gamet ve embryo manüplasyonları esnasında uygulanan her aşamanın check edildiği (gerekirse double check) kayıtlar oluşturulmalıdır. Laboratuvar personelleri periodik aralıklarla oluşturulan dokümanlarla ilgili eğitim almalıdır. Hastalardan elde edilen tüm materyaller, kan tüpleri, follikül sıvıları ve semen örneği hasta bazında işaretlenmeli ve not edilmelidir. Laboratuvarda uygulanan IVF prosedürleri esnasında embriyolar, oositler ve sperm örneklerine ait inkübatör içi yerleşim düzeni belirlenmeli ve yazılı bir belge ile günlük takip edilmelidir. IVF prosedürlerinin özellikle en kritik noktalarında, oosit toplama öncesinde, semen örneğinin alınmasında ve embriyo transfer aşamasında double check kontrol yapılmalı ve not edilmelidir. Ayrıca oosit inseminasyonunda, embriyoların kültür dishi değişikliklerinde, embriyo dondurma ve çözme işlemlerinde de detaylar double check edilmeli ve yazılı bir dokümana not edilmelidir. IVF prosedürlerinde uygulanan her işlemin detaylı olarak yazılı dokümente edilmesi şarttır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 15

16 5. KÜLTÜR SOLÜSYONLARININ HAZIRLIĞI VE KALİTE KONTROL TESTLERİ 5.1. Disposable materyaller ve kültür solüsyonları Kültür solüsyonlarının hazırlanmasında kullanılan tüm cam malzeme ve disposable materyallerin, doku kültürü kullanımında tescilli ürünler olmaları gereklidir Kültür solüsyonları yada bu solüsyonların hazırlanımında kullanılan ajanların, IVF kullanımına uygun saflıkta ürünler olması şarttır Laboratuvar protokollerinin tümünde laboratuvarda hazırlanan solüsyonlara ait kalite kontrol prosedürlerinin not edilmesi gereklidir. Laboratuvarda hazırlanan tüm doku kültürü solüsyonları, uygun bir bioassay sistemi ile kalite kontrolünden geçirilmelidir. Hazır solüsyonlar kullanılacak ise, transport şartları ve ürünün içerisinde geldiği paket sisteminin mutlaka kontrol edilmesi gerekmektedir. Hazır olarak kullanılacak tüm ürünlerin detaylı analiz sertifikalarının ve ana firmadan teslimat tarihlerinin temin edilmesi gerekmektedir Kültür solüsyonlarının kullanımında üretici firmanın belirlemiş olduğu son kullanma tarihlerine uyulması gerekmektedir Kültür solüsyonlarının hazırlanımında kullanılacak suyun uygun saflıkta olması gerekmektedir Eğer lokal bir su arındırma sistemi kullanılıyor ise, su siteminin kalite konrolünü gösterir protokoller belirlenip dokümente edilmelidir. Bu dokümantasyon içerisinde TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 16

17 sistemin sanitizasyonu,regüler kartuş değişimleri, diğer komponentlerin ilavesi ve bakteriyel tarama detayları not edilmelidir. Hazır saf su kullanılıyor ise ısı farklılıklarına göre kullanım sürelerine, saklanma koşullarına ve raf ömürlerine mutlaka dikkat edilmesi gerekir Laboratuvarda hazırlanıp kullanılan her solüsyon, ajan ve disposable malzemenin batch numaraları sistemde kullanıma başlandığından itibaren not edilip sistematik olarak kayıt edilmelidir. Kültür solüsyonlarının hazırlanımında kullanılan her ajanın, kültür solüsyonu hazırlanımı için üretilmiş olması gerekmektedir Donör serum yada follikül sıvısı kullanımı önerilmemektedir. Bu ürünler kullanılacak ise, lokal donör kan kullanım yönetmeliklerine uygun olarak gerekli taramalardan geçmiş olması gerekmektedir. İnsan serum albümini (HSA), yukarıda belirtilen şartlara uygun olarak gerekli taramalardan geçirilmelidir. Bu ürünler hazır HSA yada serum üreten firmalardan kullanılacaksa, firmadan bu taramaların dokümantasyonu alınmalıdır Oositler ekuilibre edilmiş mineral yağ altında kültüre edilebilmektedir. Kültür ortamında yağ kullanımı ısı değişimleri,ozmotik basınç ve oositlerin kısa süreli manüplasyonları esnasında, açıkta kaldığı ortamlarda ph değişimlerini azaltmaktadır. Kullanımı öncesinde inkübatörde pre-ekuilibrasyona ihtiyacı vardır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 17

18 6. OOSİT VE SPERM MANÜPLASYONU Yardımcı üreme tekniklerinde gamet manüplasyonları için, laboratuvar prosedürlerinin standardize edilebilmesi amaçlı ESHRE tarafından yayınlanan guidelinelar kullanılabilir. Bu guidelinelar hazırlanırken prosedürlerin kolay, basit ve effektif olmasına tüm işlemlerin 37C sıcaklıkta ve laminar flowlar altında yapılmasına dikkat edilmiştir. İşlemi yapan kişiyide koruması açısından Class II hoodların kullanımı önerilmektedir. Kullanılan tüm disposable malzemelerin doku kültürüne uygun ürünler olması şattır Yapılan işlemlerin her aşamasında aseptik teknikler kullanılmalıdır Tüm işlemlerin 37C de yapıldığından emin olabilmek için sık aralıklarla, tercihen günde bir ya da iki kere ısıtıcı tablası olan aletlerden ölçüm alınmalıdır Vücut sıvısı ve hücrelerin kültüründe, sadece doku kültürü için uygun olan disposable materyaller kullanılmalıdır Embriyo ve gamet manüplasyonunda kullanılan pipetleme ürünleri (cam pasteur pipetleri, ucu çekilerek inceltilmiş pasteur pipetler, eppendorf uçlar...) her hasta için ayrı kullanılmalı, işlem bitiminde mutlaka imha edilmelidir Aynı çalışma sahası içerisinde aynı anda birden fazla hastanın prosedürleri uygulanmamalıdır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 18

19 6.6. Özellikle yumurta toplama, semen örneğinin alınması ve embryo transferi gibi kritik anlarda, hasta kültür dishleri üzerine işaretlenen isimler hastayla birlikte aynı anda check edilmeli ve gerekli form, dosya ve defterlere not edilmelidir Tüm prosedürler sıralı olarak düzenlenmeli, böylece her hastanın her aşamada identifikasyonunun daha güvenli olarak belirlenmesi sağlanmalıdır. Oosit, embriyo ve sperm örneklerinin bulunduğu tüp yada kültür dishleri kokusuz, her hangi bir müdaheleyle çıkmayan boyaya sahip kalemlerle yapılmalıdır. Embriyo, oosit ve sperm tanımlanmasını kolaylaştırmak için inkübatörler içi yerleşim düzeni belirlenmelidir Uygulanan prosedürlerin her aşamasında, uygulayıcı embryologlar not edilmelidir. 7. OOSİT TOPLAMA Oositlerin mümkün olduğunca vücut ortamına yakın (36-37 C) ısıda muhafaza edilmeleri canlılıkları açısından önemlidir. Laboratuvar ortamında oosit manüplasyonlarının yapıldığı aletlerin, bu ısıyı sağlayacak donanıma sahip olması gerekir. Kullanılacak tüm petri-dishler, toplama tüpleri ve ısıtıcılar işlemler öncesinde 37 C ye ısıtılmış olmalıdır. Oosit toplama işlemi esnasında folikül sıvısı içinden gelebilecek oosit-kumulus komplekslerinin kontrol edildiği stereo mikroskop stage lerinin 37 C sıcaklıkta olması şarttır. İşlemler esnasında oositlerin mümkün olduğunca ışığa maruz bırakılmamalarına dikkat edilmelidir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 19

20 8. SPERM HAZIRLIĞI Hasta tedavi siklusuna başlamadan önce, WHO (World Health Organization,1999) kriterlerine göre semen analizi değerlendirilir. Semen kondom, krem yada diğer kayganlaştırıcı ürünler kullanılmadan steril plastik bir kaba alınır. Semen örneği alındıktan sonra hasta ismi, hasta ve alan kişi tarafından double check edilerek kaba etiketlendirilir Cinsel pehriz süresi, kullanılan kap özellikleri (normal semen kaplarından farklı ise), semenin verildiği yer (merkez dışında bir yerden geliyor ise) ve zaman, alınmahazırlanma arasında geçen zaman süreci gibi özellikler, mutlaka bir form içerisinde dokümante edilmelidir Sperm analizini yapan ve sperm yıkamayı gerçekleştiren laboratuvar personelinin not edildiği formlar oluşturulmalıdır. Her hasta için kullanılan sperm yıkama tekniği yada standart laboratuvar protokollerinden farklı uygulanmış yöntemler not edilmelidir Bazal ve yıkama sonrası sperm parametreleri bir form içerisinde belirtilmeli, inseminasyon öncesi yapılan dilüsyon işlemi var ise not edilmelidir Sperm cerrahi yöntemler kullanılarak elde edildi ise, daha sonraki sikluslarda cerrahiye tekrar ihtiyaç duymamak için dondurulması önerilmektedir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 20

21 9. OOSİT İNSEMİNASYOU 9.1. Spermin inseminasyon için hazırlanması Kullanılacak hazırlama metodu, her semen örneği içerisindeki sperm sayım ve hareketliliğine göre değişkenlik gösterebilmektedir. Hastanın siklusa başlamadan önceki analizlerinde, denenebilecek farklı yıkama yöntemleri tedavi siklusundaki yıkama yöntemini belirlemek açısından yararlı olabilir. Sperm yıkama tekniklerindeki amaç; Semen örneğinin yüksek devirde konsantre edilerek aktif ve motil spermin ayrımını sağlamak. Semen içerisindeki seminal plasma, döküntü ve contaminant maddelerden arındırmak. Özellikle gradient sisteminin kullanımıyla anormal morfolojideki spermlerin bir kısmını elimine etmek. Semen örneği vermekte güçlük çeken hastalarda örnek, siklus öncesinde yada siklus günü alınabilmiş ise bir sonraki siklusta kullanılabilmek üzere dondurulabilir. Literatürde farklı sperm yıkama teknikleri ile ilgili birçok yayın mevcuttur. Bunlar arasında en yaygın kullanılanları, swim-up ve gradient santrifügasyon yöntemidir (Burkman et al., 1984; McClure et al.,1989 ; Van der Zwalmen et al., 1991). Sperm yıkamada genel bir kural olarak, fazla sayıda yada çok yüksek devirde gereksiz santrifügasyon özellikle oligospermik örneklerde reaktif oksijen radikallerinin konsantrasyonunu arttıracağından engellenmelidir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 21

22 Ocak 1997 yılından itibaren percoll kullanımı klinik amaçlar için önerilmemektedir. Cerrahi yöntemlerle elde edilmiş spermlere ait farklı yıkama protokolleri geliştirilmiştir (Devroey et al.,1994; Silber et al., 1994,1995; Oates et al.,1997; Kupker et al., 1998) İnseminasyon süresi ve sperm konsantrasyonu yazılı olarak not edilmelidir. Konvansiyonel inseminasyonda, fertilizasyonun oluşumunu sağlayıp embryo gelişimini gerçekleştirecek konsantrasyonda spermin hesaplanıp, insemine edilmesine dikkat edilmelidir Mikroenjeksiyon esnasında canlı spermin seçimine(genellikle hareketlilikten yararlanılarak) özenle dikkat edilmelidir. Ejekülat içerisindeki tüm spermlerin cansız olması durumunda, testiküler spermlerin kullanımı önerilebilir ICSI prosedürü için oositlerin hazırlanması, kumulus-koronanın temizlenmesi. Oositleri çevreleyen kumulus korona hücreleri öncelikle enzimatik yöntemlerle hyalüronidaz kullanılarak ayrıştırılır, bunu takiben mekanik olarak yaklaşık 150 mikrometre uç kalınlığındaki steril bir pipetle ortadan kaldırılır. Oositlerin etraflarındaki hücreleri temizlenirken harcanan süreç ve kullanılan enzim konsantrasyonuna dikkat edilmelidir (Van de Velde et al., 1998 ). Bu işlemler esnasında oositin hasar görmemesine çok dikkat edilmelidir. Oosit enzimatik solüsyon içerisinde uzun süreli bekletilmemeli, mekanik işlemler esnasında ucu düzgün olmayan yada çapı çok dar pipetler kullanılmamalıdır. Oositler kumulus-korona hücrelerinden arındırıldıktan sonra yıkama solüsyonu içerisinde birkaç kere TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 22

23 yıkanıp, inverted mikroskopta 200 büyütme ile matürasyon seviyeleri tespit edildikten sonra, mikroenjeksiyon zamanına kadar kültüre edilirler MİKROENJEKSİYON PROSEDÜRÜ ICSI (Intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu) esnasında dikkat edilmesi gereken hususlar; Canlı sperm hücresinin seçimi ve immobilizasyonu. Oosit enjeksiyonu öncesinde kutup cisimciğinin lokalizasyonun tespit edilip enjeksiyonun ona göre yapılması. Oolemma içerisindeki ani sitoplazmik kırılmayı dikkatle gözlemleyip, spermin içeriye daha sonrasında bırakılması. PVP ( Polyvinylpyrolidone ), ICSI pipeti içerisinde sperm manüplasyonunu kolaylaştırmak ve sıvı kontrolünü daha rahatlatmak amaçlı olarak kullanılabilir. Mikroenjeksiyon esnasında oosit içerisine enjekte edilmemesine dikkat edilmelidir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 23

24 10. FERTİLİZASYON KONTROLU Klasik inseminasyon ya da mikroenjeksiyon sonrasında tüm oositlerdeki fertilizasyon kontrolünün saatler arasında yapılması gerekir Tüm oositlerin morfolojik yapıları not edilmelidir Bir yada ikiden fazla pronukleusa sahip oositlerin, diğer normal döllenme gösteren oositlerden izole edilmesi gerekir ( Plachot et al., 1992) Fertilizasyon gelişimi göstermeyen oositlerin konrolüne, geç pronukleus gelişimi gözlenebilme olasılığından dolayı ilerleyen saatlerde de devam edilmelidir Normal fertilize olmuş oositlerin, taze kültür solüsyonuna alınmaları önerilmektedir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 24

25 11. EMBRİYO KÜLTÜRÜ VE TRANSFERİ Embriyoların periyodik aralıklarla gözlenmesi, embriyologlara embriyo gelişimini detaylı olarak izleme imkanı tanımaktadır Embryo transferinde, transfer edilen embriyonun gelişiminin hangi safhasında olduğu not edilmelidir. Embriyo transferi, embryo gelişiminin 5-6.günü yani blastokist aşamasına kadar uygulanabilir. Günümüzde geliştirilmiş ardışık kültür solüsyonları (embriyo gelişiminin 3. gününe kadar 1. step medium, 3-5. gününe kadar 2. step medium), ko-kültür sistemlerine gerek kalmaksızın canlılığı ve buna bağlı olarak implantasyon potansiyeli yüksek blastokistlerin elde edilebilmesini sağlamaktadır (Guerin and Nicollet,1997; Gardner et al., 1998) Bazı ülkelerde transfer edilecek maksimum embriyo sayısı, ülke yasalarına göre sınırlandırılmıştır. Sınırlandırma yapılmasa bile, günümüzde transfer edilecek embriyo sayısının ikiyi geçmemesi tüm dünyaca önerilen bir tavsiyedir. İkinin üzerinde embriyo transferi yapılan hastalar, mutlaka çoğul gebelik riski açısından bilgilendirilmelidir. Blastokist transferlerinde de, transfer edilecek blastokist sayısı maksimum iki ile sınırlandırılmalıdır. Transfer sonrası geriye kalan iyi kalitede embriyolar, çiftin rızasına ve ülke yasalarına bağlı olarak dondurulabilir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 25

26 11.3. Embriyo transferi yapılmış olan hastalarda bulunması gereken dokümantasyonlar: Transferde kullanılan mediumun tipi ve batch numarası Oosit toplamadan transfer gününe kadar geçen süre Oosit inseminasyonundan transfere kadar olan süreç Transfer edilecek embriyoların sayı ve kaliteleri, hücresel bölünme aşamaları Excess embryolarla ilgili yapılmış işlemler Kullanılan kateter tipi Embriyoloji laboratuvarı transfer yapılacak ameliyathaneden uzak ise, embriyoların sıcaklık ve ph değişikliklerinden etkilenmemesi için transport esnasında embriyolara bu ortamı sağlayabilecek mobil ekipmanlar kullanılmalıdır Her transferde yeni steril bir embryo transfer kateteri kullanılmalıdır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 26

27 12. EMBRYO KRİYOPREZERVASYONU Embryo dondurma işlemi, embryoların farklı gelişim aşamalarında (zigot aşaması, 2-3. gündeki embryo aşamasında, blastokist aşamasında); yüksek oranda fragmantasyon içeren, yavaş bölünen yada arrest olma potansiyeli yüksek embryoların kriyoprezervasyonu ile çözülme sonrasında çok düşük canlılık ve gebelik oranları bildirilmektedir. Bu sebeple kötü kalitedeki embryoların dondurulması uygun değildir. Bazı ülkelerde krioprezervasyon yapılabilmesi için uygulanan yasalar mevcuttur Embryo krioprezervasyonu için gerekli alet ve tekniklerin, her IVF laboratuvarında bulunması gerekir. Bunun amacı ; Transfer sonrası fazlalık embryoların dondurulması Hastanın uygulanan tedavi sırasında hastalanması yada ovaryen hiperstimülasyon sendromuna (OHSS) girmesi durumunda, embryoların dondurularak transferin daha geç bir tarihe ertelenmesi Literatürde dondurulacak embryoların gelişim aşamasına, kullanılan krioprotektan türüne ve soğutma hızına göre değişkenlik gösteren pek çok çalışma mevcuttur (Testart et al., 1986; Menezo et al., 1992; Veeck et al., 1993) Sıvı azot içerisinde enfeksiyon transmisyon riskini minimuma indirebilmek için, mutlaka krioprezervasyon için kullanılması önerilen malzemeler kullanılmalı (straw,vial) TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 27

28 ve bu malzemelerde sealing (uçların kapatılması) işlemi güvenli bir şekilde uygulanabilmelidir. Kullanılan embryo krioprezervasyon yönteminde, straw yada vial içerisine embryoların yerleştirilmesi esnasında eksternal yüzeyin kontamine olabilme riski olmamalıdır. Dondurma öncesinde sealing in doğru ve güvenli bir şekilde yapıldığı dikkatle kontrol edilmelidir Çözülmüş embryoları transfer edilecek hastalarda, hepatit B-C, ve HIV taraması yapılmalıdır. Enfeksiyon kaynağı riski oluşturabilecek hastalarda, ayrı bir saklama tankı kullanılmalıdır Dondurulmuş embryolarla ilgili tutulması gereken dokümantasyonlar; Kulanılan krioprotektanın tipi ve batch numarası Embryonun dondurulduğu gelişim safhası Her straw/vial içerisinde bulunan embryo sayısı (bu sayı tercihen ikiyi geçmemelidir). Hasta başına kullanılan straw/vial sayısı İçerisine embryo yerleştirilen her straw/vial çiftin isimini içeren bir işaretle etiketlenmeli ve her bir straw için özel kodlar kullanılmalıdır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 28

29 12.7. Krioprezervasyon ve çözme işlemlerinde kullanılacak solüsyon ve disposable malzeme hazırlığını (üstlerine not edilecek isim, adet gibi kayıtlar) yapan, işlemleri gerçekleştiren laboratuvar personelinin not edildiği formlar oluşturulmalıdır Krioprezervasyon dokümantasyonları, hem hasta bilgilerini içeren dosyada hemde laboratuar detaylarının (tank,kanister,cane ve goblet numarası,goblet rengi, straw / vial ve embryo sayısı, kullanılan plug yada sealing powder rengi...gibi) dokümente edildiği kaynaklara not edilmelidir Sakalanan gamet ve embryoların, detaylı krioprezervasyon dokümantasyonlarının yıllık kontrol edilebileceği bir sistem kurulmalıdır Saklama dokümantasyonları, straw/viallerin lokalilazyonu ile ilgili detaylı bilgileri mutlaka içermelidir Çözülmüş embryolara ait dokümantasyon bilgileri, embryonun çözme ve transfer anında gelişen morfolojik değişimlerini içermelidir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 29

30 13. ASSISTED HATCHING Assisted hatching, embryo hatching ini ve implantasyonunu arttırmak amaçlı geliştirilmiş bir tekniktir. Fakat günümüzde literatürde halen klinik effektivitesi ile ilgili çelişkili sonuçlar mevcuttur Assisted hatching prosedürü ile ilgili 3 farklı yöntem mevcuttur; Mekanik teknik: Cam mikropipetlerle parsiyel zona diseksiyonu (Cohen et al., 1990) Kimyasal teknik: Asit tirod solüsyonu kullanılarak zonanın parsiyel eritilip inceltilmesi (Cohen et al., 1992) Lazer tekniği: Lazer ışını kullanılarak zonanın parsiyel inceltilmesi (Strohmer and Feichtinger,1992) Assisted hatching uygulamasının embryo dejenerasyonunu engellemek için büyük bir dikkatle uygulanması gerekmektedir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 30

31 14. PREiMPLANTASYON GENETİK TANI Preimplantasyon genetik tanı tekniği, genetik yada kromozomal anomali içeren in-vitro geliştirilmiş embryoların transfer öncesinde elimine edilip, sağlıklı olanlarının transfer için kullanılabilmesini amaçlamaktadır Genetik risk taşıyabilecek her çifte genetik danışma verilmelidir Biopsi prosedürü aşağıdaki şekillerde uygulanmaktadır. Polar body biopsisi (Verlinsky et al., 1996) Embryo gelişiminin 3. gününde tek yada çift blastomer biopsisi (Tarin and Handyside,1993) Blastokist aşamasında trofoektoderm biopsisi (halen tartışmalıdır) Genetik araştırma için kullanılacak hücreler, IVF laboratuvarlarında mikromanüplatörler yardımıyla yapılmaktadır. Genetik araştırmaya tabi tutulacak hücre ve embryoların her birisi ayrı ayrı ele alınır, numaralandırılır ve not edilir Biopsi esnasında hücreye zarar vermemeye özellikle itina gösterilmelidir. Ayrıca blastomer biopsisi, anında çıkartılan hücrenin bütünlüğü genetik analizin doğru tespiti açısından çok önemlidir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 31

32 14.5. Biopsi sonrası alınmış hücreyle ilgili yapılacak çalışmalar (özellikle fiksasyon), ayrı bir laboratuvarda konu experi olan kişiler tarafından uygulanmalıdır. Hücre içerisindeki nukleus fiksasyonu esnasında kullanılabilecek fiksatif solüsyonlar, kesinlikle embryoloji laboratuvarından uzak tutulmalı ve işlem mümkünse koku giderici hood lar içerisinde uygulanmalıdır. Preimplantasyon genetik tanı tekniği uygulayan merkezlerin sayısı halen tüm dünyada sınırlıdır, ve bazı ülkelerde uygulanımı yasal değildir. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda invazif bir teknik olmasına karşılık, biopsi prosedürü sonrasında embryo gelişimi yada implantasyon sonuçları üzerine negatif bir etkisi gösterilememiştir ( Gianoroli et al., 1999). Avantajlarına bakacak olursak ; Sağlıksız embryoların transferini minimize ettiği için, teropatik düşüğe alternatiftir. Öploid embryoların transferini sağladığı için, daha yüksek eve bebek götürme oranları bildirilmiştir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 32

33 15. SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ İLE KALİTE KONTROLÜ Sonuçlar düzenli bir sıra içerisinde değerlendirilmelidir. Kalite konrolü amaçlı sonuçların değerlendirilmesinde hasta değişkenliğinden doğabilecek yan tutuculukların engellenmesi ve spesifik kriterlerin doğru değerlendirilebilmesi için hasta grupları seçilmelidir. Aşağıdakiler düzenli olarak analiz edilmelidir. Fertilizasyon oranları Embryo kalitesi Gebelik oranları Çoğul gebelik oranları İmplantasyon oranları Sonuçların eksiksiz değerlendirilebilmesi için, bu analizler klinisyenlerle ortak yapılmalıdır. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 33

34 GELECEKTE IVF LABORATUVARININ ROLÜ Hızla gelişmekte olan yardımcı üreme tekniklerinde günümümüzde yeni uygulamalar gündeme gelmektedir. Bunlar; Oosit ve over dokusunun dondurulması Oosit ve sperm prekürsör hücrelerinin in-vitro matürasyonu ve enjeksiyonu İntrasitoplazmik transfer Embryo implantasyonu şeklinde özetlenebilir. Bu konuların yardımcı üreme tekniği olarak IVF laboratuvarlarında, klinikte rutin uygulanımı için hayvan çalışmaları halen devam etmekte ve bilimsel sonuçlar değerlendirilmektedir. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 34

35 REFERANSLAR Bacetti B, Benedetto A, Buruni A. G. et al. (1994) HIV-particles in spermatozoa of patients with AIDS and their transfer into the oocyte. J. Cell. Biol, 127; Barnes L.F. (2001) Equipment and general technical aspects of micromanuplation of gametes and embryos. In: Gardner DK, Weissman A, Howles CM, Shoham Z eds. Textbook of Assisted Reproductive Techniques; Laboratory and Clinical Perspectives, London,Martin Dunitz. 139 Boone RW, Johnson JE, Locke AJ et al. (1999) Cotrol of air quality in an assisted reproductive technology laboratory. Fertil. Steril, 71 ; 150. Burkman L. J (1984) Characterisation of hyperactivated motility by human spermatozoa during capacitation: comparison of fertile and oligozoospermic sperm population. Arch. Androl.,13, Cohen J. (1992) Zona pellucida micromaniplation and consequences for embryonic development and implantation. In Cohen J,Malter HE,Talansky B.E and Grifo J (eds) Micromaniplation of human gametes and embryos. Raven Press, New York, Cohen J, Elsner C, Kort H. et al. (1990) Impairment of the hatching process following IVF in the human and improvement of implantation by assisted hatching using micromaniplation. Hum. Reprod., 5 ; TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 35

36 Cohen J, Gilligan A, Esposito W. Et al. (1997) Ambient air and its potential effects on conception in vitro. Hum. Reprod. 12; Cohen J, Gilligan A, Garrisi J. (2001) Setting up an ART laboratory. In: Gardner DK, Ariel Weissman A, Colin M, Howles CM, Shoham Z. Eds. Textbook of Assisted Reproductive Techniques; Laboratory and clinical perspectives, London, Martin Dunitz, Gardner DK, Schoolcraft W. B, Wagley L. et al. (1998) A prospective randomized trial of blastocyst culture and transfer for in-vitro fertilization. Hum. Reprod. 13; Gardner DK, Lane M. Embryo Culture. (2001) In: Gardner DK, Weissman A, Howles MC, Shoham Z. Textbook of Assisted Reproductive Techniques: Laboratory and Clinical Perspectives. London, Martin Duritz Gianoroli L, Magli MC, Munne S. Et al. (1999) Advantages of day four embryo transfer in patients undergoing preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy. J. Assist. Reprod. Genet, 16; Gianoroli L, Plachot M, Van Kooij R. Et al. (2000) ESHRE guidelines for good practice in IVF laboratories. 10; TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 36

37 Guerin JF. And Nicollet B. (1997) Interest of co-cultures for embryos obtained by in-vitro fertilization: a French collaborative study. Hum. Reprod. 12; Hall J, Gilligan A, Schimmel T. Et al. (1998) The origin, effects and control of air pollution in laboratories used for human embryo culture. Hum. Reprod. 13 Suppl. 4; 146. Kupker W, Al Hasani S, Bals-Pratsch M. et al. (1998) Cryo TESE-the use of frozen-thawed testiculer sperm for ICSI. 16th.World Congress on Fertility and Sterility, Oct. 4-9, San Francisco, USA. Mayer J, Nehchiri F, Weedon V. Et al. (1999) Prospective randomised analysis of the impact of an IVF incubator air filtration system (CODA,Gen-X) on clinical pregnancy rates. Abstr. Book of World Congress on In Vitro Fertilization and Human Reproductive Genetics. May 9-14 Sydney, Australia Pp-096. McClure RD, Nunes L and Tom R. (1989) Semen maniplation: improved sperm recovery and function with a two layer Percoll gradient. Fertil. Steril. 51; Menezo Y, Nicollet B, Herbaut N. et al. (1992) Freezing co-cultured human blastocysts. Fertil. Steril, 58; Oates RD, Mulhall J, Burgess C. et al. (1997) Fertilization and pregnancy using intentionally cryopreserved testiculer tissue as the sperm source for ICSI in 10 men with non-obstructive azoospermia. Hum. Reprod. 12; TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 37

38 Plachot M. and Crozet N. (1992) Fertilization abnormalities in human IVF. Hum. Reprod, 7 (Suppl) 1, Silber SJ, Nagy ZP, Liu J. et al. (1994) Coventional in-vitro fertilization versus intra cytoplasmic sperm injection for patients requiring microsurgical spserm aspiration. Hum. Reprod. 9; Silber SJ, Van Steirteghem AC, Liu J. et al. (1995) High fertilization and pregnancy rate after intracyoplasmic sperm injection with spermatozoa obtained from testicle biopsy. Hum. Reprod, 10; Strohmer H. and Feichtinger W. (1992)Successful clinical application of laser for micromanipulation in an in-vitro fertilization program. Fertil. Steril, 58; Tarin JJ. and Handyside A.H. (1993) Embryo biopsy strategies for preimplantation diagnosis. Fertil. Steril, 59; Tedder RS, Zuckerman M.A, Goldstone AH. et al. (1995) Hepatitis B transmission from contaminated cryopreservation tank. Lancet, 346; Testart J, Lasalle B, Belaisch-Allart J. et al. (1986) High pregnancy rate after early human embryo freezing. Fertil. Steril, 46; TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 38

39 Vanderzwalmen P, Bertin-Segal G, Geertz L.et al. (1991) Sperm morphology and IVF pregnancy rate: comparison between Percoll gradient centrifugation and swim up procedures. Hum.Reprod., 6; Van de Velde H, De Vos A, Joris H.et al. (1998) Effect of timing of oocyte denudation and microinjection on survival,fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod, 13; Veeck LL, Amundson CH, Brothman LJ.et al. (1993) Significantly enhanced pregnancy rates per cycle through cryopreservation and thaw of pronuclear stage oocytes. Fertil. Steril, 59; Verlinsky Y, Cieslak J, Freidine M. et al. (1996) Polar body diagnosis of common aneuploidies by FISH. J. Assist. Reprod. Genet, 13; World Health Organization (1999) WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm cervical mucus interaction. Cambridge University Press, Cambridge. TSRM IVF LABORATUVARI UYGULAMA REHBERİ/2008 SAYFA 39