GÜVENLİ VE ETKİN LABORATUVAR UYGULAMALARI BAKTERİ KÜLTÜRÜ. Doç. Dr. Hilâl Özdağ RİSK GRUPLARI

Transkript

1 GÜVENLİ VE ETKİN LABORATUVAR UYGULAMALARI BAKTERİ KÜLTÜRÜ Doç. Dr. Hilâl Özdağ RİSK GRUPLARI Sınıf 1(risksiz): Patojen olmayan(e. coli, B. subtilis) Sınıf 2(düşük risk): Shigella, Salmonella Sınıf 3 (soluma durumunda yüksek risk): Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis Sınıf 4 (birey ve toplum için yüksek risk): arbovirüs, arenavirüs, filovirus. 1

2 RİSK GRUPLARI Sınıf 1(risksiz): Bençte çalışılabilir. Sınıf 2(düşük risk): Sınıf 2 biyogüvenlik kabini. Sınıf 3 (soluma durumunda yüksek risk): Ayrı bir oda gerektirir. Diğer odalarla kapı veya havalandırma yolu ile hava değişimi olmamalıdır. Giriş çıkış kontrollü olmalı, özel kıyafet giyilmeli ve bütün çalışmalar biyogüvenlik kabinlerinde yürütülmelidir. Sınıf 4 (birey ve toplum için yüksek risk): Hükümet nezninde izni olan az sayıda laboratuvarda yürütülebilen çalışmalardır. ALTYAPI Labtezgahında: Mutant seçimi Organizmaların büyütülmesi Bakteri konsantrasyonunun belirlenmesi Transformasyon Plazmid izolasyonu yapılabilir. 2

3 ALTYAPI İnkübatör: Genellikle 37oC Çalkalamalı inkübatör(aerobik büyüme için) Santrifüjler Vorteks Bek(bunsen burner) Biyogüvenlik kabini (petri dökmek, besiyeri bileşenlerinin filtre sterilizasyonlarını gerçekleştirmek için) Elektroporatör(transformasyon için) Spektrofotometre(büyümeyi gözlemek için) Çalışma Kuralları Yemek, içmek, ağızla pipetleme yapmak, açık ayakkabı giymek veya lab önlüğünü lab dışında giymek yasaktır. Çalışma alanınızı günde en az bir kez ve her bakteri döküldüğünde bir dezenfektan ile silin. Bulaşıcı(enfeksiyöz) atıkları atmadan önce dekontamine edin. Eldiven giyiyorsanız dahi laboratuvardan çıkmadan önce muhakkak ellerinizi yıkayın. Sıvı atığı son konsantrasyonu %10 olacak şekilde çamaşır suyunda 30 dakika bekletip lavabodan akar suyun altında dökün. Katı atığı tıbbi atık çöpüne atın. 3

4 Çalışma Kuralları Aerosol oluşumunu minimalize edecek şekilde çalışın. Pipetleme, dökme, kapak açma aşamalarına itina edin. Petri kaplarını ve tüpleri gereksiz yere biriktirmeyin. Buzdolabındaki gereksiz kültürler tam bir kontaminasyon kaynağıdırlar. Bakterileri Nereden Elde Edeceğiz? Labüyeleri Diğeraraştırıcılar ATCC Firmalar 4

5 BAKIM VE BÜYÜTME Aerobik/Anaerobik Durağan/Çalkalamalı Sıvı/Yarı-katı Bir bakteriyi üretmeden önce fizyolojisini bilmelisiniz. SIVI KÜLTÜRLER Mümkünse besiyerini laminar kabinde hazırlayın. Eğer besiyerinin kontamine olduğunu düşünüyorsanız gece boyu 37 o C deinkübeedin,üremeolupolmadığınıgörün. 5

6 KATI KÜLTÜRLER 100 mm hücre kültürü kaplarını bakteri kültürü için kullanmayın. Gereksiz ve pahalı bir harcama yapmış olursunuz. Katı kültürleri birbirinden ayırmak için kod veya renk uygulaması yapılmasında fayda vardır. 50 o C veya üstündeki sıcaklıktaki besiyerini eldivenle tutup dökebiliyorsanız da dökmeyin zira çok sıcak dökülen besiyerleri aşırı kondensasyona neden olur. KATI KÜLTÜRLER Besiyerinin şişenin kenarından taşıp akmasına fırsat vermeyin. Petri kabına damlayıp kontaminasyona neden olabilir. Böyle sızıntıları hemen temizleyin. Petri kabının yüzeyi pürüzsüz olmalı. Petri yüzeyinde kabarcık oluşursa hızlıca alevden geçirip kabarcığı yok edin. Plastik petrilerde bu aşamaya dikkat edin. Kullandığınız antibiyotik ışığa duyarlı ise petri kaplarını alüminyum folyo ile kaplayın veya bir kutuya koyun (örn. Tetrasiklin) 6

7 DONDURULMUŞ KÜLTÜRLER Çözülüp yeniden ekilen kültürlerin lag fazları biraz uzayacaktır. Bu nedenle bu tip kültürlere normalden iki kat fazla süre verin. Bakteri kültürlerini sürekli olarak dondurup çözmekten kaçının. Eğer kültürünüz antibiyotik direnç geni içeren plazmid taşıyorsa besiyerine antibiyotik ilave etmelisiniz. Ancak Tetr, Ampr, Kanr veya Camr taşıyan suşların antibiyotik direnç genleri ifade bulana dek antibiyotiksiz olarak kültür edilmeleri gerekmektedir. ANTİBİYOTİKLER Genetik olarak tasarlanmış plazmidlerin genellikle en azından bir antibiyotik için direnç geni taşırlar. Bu ilgili bakterinin araştırıcının istediği geni ifade etmesi durumunda seçilebilmesini mümkün kılar. Plazmidlerin hemen tamamı bir veya daha fazla direnç geni taşır (amp, tet, chl, kan). Antibiyotikler ısıya duyarlıdır bu nedenle besiyeri sterilize olup soğuduktan sonra eklenir. Genellikle dondurulmuş ve tek kullanımlık hacimlere bölünerek saklanır. 7

8 TEK KOLONİ EKİMİ Özeile Tek tip bakteri üretmek için muhakkak gerekli. Kontaminasyonu asgariye indirmek için: Eğer sağ elinizi kullanıyorsanız alevi sağınıza yerleştirin. Petri kaplarını solunuza. Bakteri örnekleri ortada olmalı. Tüp veya şişelerin ağızlarını gevşetmiş olun. Bütün petri kaplarını baş aşağı yerleştirin ki kondensasyon kolonilerin üzerine damlamasın. Yayma yapmadan önce özenizi petrinin yayma yapmayacağınız bir köşesinde soğutun. SAKLAMA Kısa dönemli: Petri kaplarındaki koloniler ve sıvı kültürler 4 o C de birkaç hafta saklanabilir. Petri kaplarının ömrünü uzatmak için parafilm ile iyice kaplanmalıdır. Uzun dönemli: Her bakteri için tercih edilmesi gereken usul değişebilir. Altkültür: Sürekli büyütme ve saklama Avantaj: Hemen ulaşılabilirlik. Düşük maliyet. Dezavantaj: Hayatiyet kaybı, kontaminasyon riskinin yükselmesi, fenotip stabilitesinin kaybı. Kurutma: Su uzaklaştırılır. Mantar için sık kullanılır. Bazı bakteriler için de uygundur. Avantaj: Ucuz, kontaminasyona açık değil. Dezavantaj: Hangi suşa uygun olduğu bilgisi çok açık değil. Dondurma/Kurutma: Donmuş kültürden süblimasyon ile su uzaklaştırılır. Kurutulduktan sonra örnekler vakum altında cam ampüllerde saklanır. Avantaj: Uzun dönemli kültürler kolayca korunur. Dezavantaj: Gerekli cihazlar bütün laboratuvarlarda mevcut değildir. Dondurma ve düşük ısıda saklama: Gliserol stokları -70 veya -196 o C de saklamak mümkündür. Avantaj: Birçok hücre için uygundur. Dezavantaj: Dondurucular pahalıdır. Soğutmadan dondurmaya ve eritme aşamalarında hücrelere hasar verilmesi mümkündür. 8

9 BAKTERİLERİ DONDURMAK Alt kültür hazırlamayı asgariye indirin. Hücreleri ideal koşullarda kültüre edin. Hücrelerinizin dondurma koşullarını öğrenin. Dondurma besiyerini taze hazırlayın. Bütün bu bilgileri lab defterinizin dışında ayrı bir kayıt defterine girin. KONTAMİNASYON Petri kapları: Koloni biçimlerine dikkat edin. Eğer farklı görünen koloni varsa tek koloni ekimi ile test edin. Maya: Ökaryotiktirler. Bakteri gibi üretilirler. Petri ve sıvı kültürde ürerler. Besiyerleri bakterilerinkine benzerdir. Memeli hücrelerinden ziyade bakteri hücrelerinebenzerçiftlenme sürelerivardır.genellikle 30 o C deürerler. Maya ve bakteri: Asla aynı inkübatörde üretilmemelidirler. Ayrı odada çalışılmaları tercih nedenidir. Mayalar bakterilerden kontamine olurlar genellikle. EĞER ŞÜPHELENİYORSANIZ ATIN!! 9