SÜZME BALLARDA DEPOLAMA SICAKLIĞININ HMF DEĞERİ VE DİASTAZ AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİSİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SÜZME BALLARDA DEPOLAMA SICAKLIĞININ HMF DEĞERİ VE DİASTAZ AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİSİ Seda Dicle KAHRAMAN GIDA HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Özlem KÜPLÜLÜ ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SÜZME BALLARDA MUHAFAZA SICAKLIĞININ HMF DEĞERİ VE DİASTAZ AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİSİ Seda Dicle KAHRAMAN BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Özlem KÜPLÜLÜ ANKARA

3

4 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay... ii İçindekiler iii Önsöz... v Simgeler ve Kısaltmalar... vi Şekiller... vii Çizelgeler... viii 1. GİRİŞ Balın Tarihçesi Bal ve Oluşumu Dünya ve Türkiye de Bal Üretimi Bal Kalitesine Etki Eden Faktörler Melitopalinolojik Özellikler Fiziksel Özellikler BalınViskozitesi Balın Rengi Balın Higroskobik Özelliği Balın Yoğunluğu ve Özgül Ağırlığı Balın Polarizasyonu Balın Kristalizasyonu Balın Elektriksel İletkenliği Kimyasal Özellikler Balın Nem İçeriği Balın Asitliği ve ph Değeri Balın Şeker İçeriği Balın Protein İçeriği Balın Mineral Madde ve Vitamin İçeriği Balın Antioksidan İçeriği Balın Enzim İçeriği Balda HMF Diğer Gıdalarda HMF Oluşumu ve Önemi HMF'nin Sağlık Üzerine Etkisi Bala İlişkinYasal Düzenlemeler GEREÇ VE YÖNTEM Gereç Yöntem HPLC Yöntemi ile HMF Tayini Ekstraksiyon Bal Örneklerinde HMF Miktarının Saptanması Standartların Hazırlanması ve Kalibrasyon Eğrisi HMF için Geri Kazanım Analizi HMF Analizinde Alıkonma Zamanları ve Tekrarlanabilirlik Testi 42

5 iv Spektrofotometre ile Diastaz Tayini Nişasta Çözeltisinin Kalibrasyonu Bal Örneklerinin Diastaz Analizi HPLC Yöntemi ile Şeker Tayini Ekstraksiyon Standartların Hazırlanması ve Kalibrasyon Eğrisi Elektriksel İletkenlik Tayin ph ve Asitlik Tayini Nem Tayini Kül Tayini Polen Tayini İstatistiksel Analizler BULGULAR TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER ÖZET.76 SUMMARY 77 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 89

6 v ÖNSÖZ Hayvansal ve bitkisel kökenli, besin değeri yüksek, doğal bir gıda olan bal kirleticilerden uzak, insan tüketimi için güvenilir, sağlıklı yaşamı destekleyen bir gıda olarak bilinmektedir. Özellikle çocuklar, yaşlı ve hasta insanlar tarafından tüketildiği göz önünde bulundurulduğunda balın üretimi, muhafazası ile kalitesinin korunması büyük önem taşımaktadır. Balın tazeliğinin ve kalitesinin değerlendirilmesinde iki önemli parametre, hidroksi metil furfural (HMF) miktarı ve diastaz aktivitesidir. Karbonhidrat içeren bazı gıdaların tazeliği ve kalitesiyle son derece ilişkili olan HMF, balın işlenmesi sırasında maruz kaldığı sıcaklığın, depolama şartlarının değerlendirilmesinde kullanılan bir indikatördür. HMF, gıdalarda belirli düzeylerin üzerinde bulunması halinde renkte esmerleşmeye, tat ve kokuda değişimlere, gıdanın besleyici değerinde kayıplara neden olmaktadır. Ayrıca yapılan çalışmalarla sitotoksik, genotoksik, karsinojenik etkileri ortaya konulan HMF ve türevlerinin sağlık açısından risk teşkil ettiği bilinmektedir. Çocuklar ve yaşlılar başta olmak üzere tüm yaş gruplarınca tüketilen balın kimyasal kalitesinin belirlenmesi, özellikle muhafaza koşullarına bağlı olarak başta HMF olmak üzere bazı kalite niteliklerinin değişmesi nedeniyle gıda güvenliği ve halk sağlığı yönünden önem taşımaktadır. Türkiye de tüketime sunulan ambalajlı ballarda kalite kriterlerinin belirlenmesi ve önemli kalite indikatörü olan HMF ve diastaz aktivite değişimine ilişkin birçok araştırma olmasına rağmen dolum tarihlerindeki başlangıç HMF ve diastaz aktivite değerinin muhafaza sıcaklığı ve süresine bağlı değişimi göz önünde bulundurularak raf ömrünün değerlendirilmesine ilişkin bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada, Türkiye de üretilen orijinal ambalajlarındaki süzme ballarda HMF miktarı ve diastaz aktivitesi üzerine farklı muhafaza sıcaklıkları etkisi ortaya konularak HMF nin gıda kalitesi ve güvenliği açısından öneminin ortaya konulması amaçlanmıştır. Tez çalışmamın seçiminde ve yürütülmesinde değerli fikir ve destekleriyle bana yol gösteren danışman hocam Prof. Dr. Özlem KÜPLÜLÜ ye, kıymetli bilgi ve deneyimlerini paylaşan, yardımlarını esirgemeyen değerli hocalarım Prof. Dr. İrfan EROL, Prof. Dr. T.Haluk ÇELİK, Prof. Dr. Belgin SARIMEHMETOĞLU ile Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Temel Eczacılık Bilimleri Bölüm Başkanı Prof. Dr. Gülderen YENTÜR a, İstatistik analizlerde yardımını aldığım A.Ü. Veteriner Fakültesi öğretim üyelerinden İ. Safa GÜRCAN a, çalışmalarım sırasında Türkiye nin öncü bal firmalarında gözlem yapabilme imkanı tanıyan ve bal numunelerinin temininde yardımını esirgemeyen Türkiye Arı Yetiştiriciliği Merkez Birliği Başkanı Bahri YILMAZ a ve Altıparmak Gıda San. LTD. ŞTİ. Yönetim Kurulu Başkanı Özen ALTIPARMAK a, her zaman maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen sevgili AİLEM e teşekkürlerimi sunarım.

7 vi SİMGELER VE KISALTMALAR ABD : Amerika Birleşik Devletleri ACF : Aberrant Crypt Foci a w C DA : Su Aktivitesi : Celcius (Santigrad derece) : Diastaz Aktivitesi DNA : Deoksi Ribo Nükleik Asit F : Fruktoz FAO : Gıda ve Tarım Örgütü (Food and Agriculture Organization) g : Gram G : Glikoz HPLC : Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi (High Pressure Performance Liquid Chromatoraphy) HMF : Hidroksi Metil Furfural IHC : Uluslararası Bal Komisyonu (International Honey Commission) LD 50 : Öldürücü Doz (Lethal Dose) M : Molar μg : Mikrogram mg : Miligram ppm : Parts per million (mg/l) S : Sakkaroz TGK : Türk Gıda Kodeksi TSE : Türk Standartları Enstitüsü TPS : Toplam Polen Sayısı UV : Ultraviyole

8 vii ŞEKİLLER Şekil 1.1: Türkiye deki bal üretiminin yıllara göre değişimi 8 Şekil 1.2: Çeşitli bal örnekleri ve balda rengin belirlenmesinde kullanılan pfund skalası 12 Şekil 1.3: Balın genel kimyasal içeriği 15 Şekil 1.4: Heksozların dehidrasyonu sonucu HMF oluşumu 25 Şekil 1.5: Heksozlardan ve pentozlardan asidik ortamda HMF oluşumu 26 Şekil 2.1: Bal örneklerinin HMF değerlerinin belirlenmesinde kullanılan HPLC cihazı 38 Şekil 2.2: 6. ay HMF standartlarına ait kalibrasyon grafiği 39 Şekil 2.3: 9. ay HMF standartlarına ait pik kromotogramları 40 Şekil 2.4: Bazı bal örneklerine ait HMF kromatogramları 41 Şekil 2.5: HMF alıkonma zamanına ait pik kromotogram örneği 43 Şekil 2.6: Früktoz, glikoz ve sakaroz standartlarına ait kalibrasyon eğrileri ve korelasyon katsayıları 46 Şekil 2.7: Bazı bal örneklerine ait şeker (früktoz, glikoz, sakaroz) kromotogramı 47 Şekil 3.1: Çiçek ve salgı ballarında farklı sıcaklıklarda zamana göre değişen HMF değerleri 58 Şekil 3.2: Çiçek ve salgı ballarında farklı sıcaklıklarda zamana göre değişen diastaz aktiviteleri 59

9 viii ÇİZELGELER Çizelge 1.1: Çiçek ve salgı balı arasındaki farklar 6 Çizelge 1.2: FAO kayıtlarına göre bal üreticisi ilk on ülkenin bal üretim miktarları 7 Çizelge 1.3: yılları arasında Türkiye deki kovan sayısı, bal ve balmumu üretim miktarları 8 Çizelge 1.4: Dünya bal üretiminde ilk 3 sırayı alan ülkelerin bal ihracat miktarları 9 Çizelge 1.5: 2009 yılında bal ihracatı ve ithalatı yapan ülkelere ait bal miktarları ve değerleri 9 Çizelge 1.6: Avrupa daki farklı bal türlerine ait fizikokimyasal parametreler ve ortalama değerler 20 Çizelge 1.7: Balda bulunan mineral ve vitamin değerleri ve yaş gruplarına göre günlük vitamin ihtiyacı 21 Çizelge 1.8: Diastazın farklı sıcaklıklardaki yarılanma süresi 24 Çizelge 1.9: T.G.K. Bal Tebliği nde yer alan kalite kriterleri ve değerleri 34 Çizelge 2.1: 9. ay HMF standartlarına ait yükseklikler ve alanlar 39 Çizelge 2.2: Başlangıç ölçümlerine ait HMF alıkonma zamanları ve alanları 43 Çizelge 2.3: Fruktoz, glikoz ve sakaroz standartlarına ait alanlar 47 Çizelge 3.1: Fabrikalardan alınan çiçek balı örneklerine ait kalite kriterleri 53 Çizelge 3.2: Fabrikalardan alınan salgı balı örneklerine ait kalite kriterleri 53 Çizelge 3.3: Fabrikalardan alınan çiçek balı örneklerinin farklı muhafaza sıcaklıklarında, 3 ay aralıklarla değişen HMF değerleri 54 Çizelge 3.4: Fabrikalardan alınan salgı balı örneklerinin farklı muhafaza sıcaklıklarında, 3 ay aralıklarla değişen HMF değerleri 55

10 Çizelge 3.5: Fabrikalardan alınan çiçek balı örneklerinin farklı muhafaza sıcaklıklarında, 3 ay aralıklarla değişen diastaz aktiviteleri 56 Çizelge 3.6: Fabrikalardan alınan salgı balı örneklerinin farklı muhafaza sıcaklıklarında, 3 ay aralıklarla değişen diastaz aktiviteleri 57 Çizelge 3.7: Fabrikalardan alınan bal örneklerinin zamana ve sıcaklığa göre değişen ortalama HMF değerleri 57 Çizelge 3.8: Fabrikalardan alınan bal örneklerinin zamana ve sıcaklığa göre değişen ortalama diastaz aktiviteleri 58 Çizelge 3.9: Piyasadan temin edilen çiçek ballarına ait HMF değerleri ve diastaz aktiviteleri 60 Çizelge 3.10: Piyasadan temin edilen salgı ballarına ait HMF değerleri ve diastaz aktiviteleri 61 Çizelge 3.11: Piyasadan temin edilen çiçek ballarına ait şeker değerleri 62 Çizelge 3.12: Piyasadan temin edilen salgı ballarına ait şeker değerleri 63 ix

11 1 1. GİRİŞ Bal tarih boyunca insanlar tarafından tüketilen, bitkisel ve hayvansal kökenli doğal bir gıda olup sağlıklı yaşamı desteklemektedir. İnsanlar tarafından işleme tabi tutulmadan tüketilen tek tatlı hayvansal gıda olarak bilinmektedir (Crane, 2004). Türkiye arı yetiştiriciliği ve bal üretiminde coğrafya, iklim ve flora bakımından oldukça zengin bir yapıya sahiptir. Her yıl artan arılı kovan sayısı (2008 yılı verilerine göre ) ve yılda 80 bin tonun üzerinde bal üretimi ile dünyada ilk sıralarda yer almaktadır. Bu potansiyelin ihracatta arttırılabilmesi için baldaki kalite standartlarının yükseltilmesi büyük önem taşımaktadır (Anon, 2009a). Bal kalitesinin belirlenmesinde fiziksel, kimyasal, melitopalinolojik (balın mikroskobik analizi) ve organoleptik analizlerinin birlikte yapılması gerekmektedir. Fiziksel ve kimyasal özelliklerindeki farklılıklar özellikle bitki kaynağına, balın içeriğini oluşturan nektar ve polenin rengine, nemine, şeker ve protein içeriğine göre değişmektedir (Fallico ve ark., 2009). Balın tazelik ve kalitesinin değerlendirilmesinde hidroksi metil furfural (HMF) miktarı ve diastaz aktivitesi iki önemli parametredir (Sancho ve ark., 1993; Castro Vásquez ve ark., 2008). Karbonhidrat içeren bazı gıdaların tazeliği ve kalitesiyle son derece ilişkili olan HMF, balın işlenmesi sırasında maruz kaldığı sıcaklığın, depolama şartlarının ve kalitesinin değerlendirilmesinde kullanılan bir indikatördür. HMF, hekzosların asidik ortamda dehidrasyonu ya da Maillard (enzimatik olmayan esmerleşme) reaksiyonu sonucu oluşmaktadır. Baldaki HMF oluşumu; balın kimyasal özelliklerine (şeker, ph, toplam asitlik, mineral madde), bal işleme prosesine, depolama şartlarındaki sıcaklık ve süreye bağlı olarak değişmektedir (Tosi ve ark., 2002).

12 2 Bala üretim aşamasında fermentasyona uğramaması ve kristalizasyonun önlenmesi için uygulanan ısı işleminin, balın uzun süre kristallenmeden muhafaza edilmesini sağladığı ve pazarlama kalitesini arttırdığı bilinmektedir (Anon, 2009b). Ancak taze ballarda (hasat döneminde) çok düşük miktarda bulunan HMF, uygulanan yüksek ve uzun süreli ısı işlemiyle artmaktadır. Bu durum raftaki başlangıç HMF değerini yükseltmekte, uygun olmayan muhafaza sıcaklığına bağlı olarak hızla artan HMF etkisiyle de raf ömrü kısalmaktadır (Ramirez ve ark., 2000; Sanz ve ark., 2005). Ayrıca balın sindiriminde önem taşıyan diastaz enziminin yıkımlanmasıyla besin değerinin azalmasına, tat aroma ve renk değişikleri oluşturarak kalite kaybına neden olmaktadır (Cocco ve ark., 1996; Kalábová ve ark., 2003). Çocuklar ve yaşlılar başta olmak üzere tüm yaş gruplarınca tüketilen balın kimyasal kalitesinin belirlenmesi, özellikle depolama koşullarına bağlı olarak HMF gibi bazı kalite niteliklerinin değişmesi nedeniyle gıda güvenliği ve halk sağlığı açısından önem taşımaktadır. Tüketime sunulan süzme ballarda, gerek üretim sırasında uygulanan ısı işlemi, gerekse muhafaza sıcaklığına bağlı olarak artan HMF değeri ile azalan diastaz aktivitesi firmalarca belirlenen raf ömrünü kısaltmaktadır. Balda oluşan HMF nin gıda güvenliği ve halk sağlığı yönünden potansiyel risk olduğu bilinmektedir. Türkiye de tüketime sunulan ambalajlı ballarda kalite kriterlerinin belirlenmesine ilişkin birçok araştırma olmasına rağmen dolum tarihlerindeki HMF ve diastaz sayılarının muhafaza sıcaklığı ve süresine bağlı değişimi göz önünde bulundurularak raf ömrünün değerlendirilmesine ilişkin bir çalışmaya rastlanmamıştır. Türkiye de üretilen farklı firmalara ait süzme ballar üzerinde yapılan bu çalışmada, farklı muhafaza sıcaklıklarının balda önemli kalite kriterleri olan HMF değeri ve diastaz aktivitesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Ayrıca farklı satış noktalarında tüketime sunulan bal örnekleri alınarak HMF değeri ve diastaz aktiviteleri belirlenmiştir.

13 Balın Tarihçesi Bal eski çağlardan beri insanlar tarafından kullanılan ilk arı ürünüdür (Krell, 1996). Bal tarihi, insanlık tarihi ile birlikte gelişerek hemen her kültürde gıda, dini bir simge ve tedavi edici özelliği ile yer almıştır. Günümüzden yaklaşık 20 milyon yıl önce, arıların bal yaptığı ve depoladığı bilinmekte olup ancak insanların yalnızca 10 bin yıl önce balı, gıda olarak kullanmaya başladıkları bildirilmektedir (Crane 1983). Bal toplayıcılığı ile ilgili kayıtların mezolitik döneme ait olduğu ve ilk olarak Doğu İspanya da bulunduğu, Valencia yakınlarındaki bir mağara duvarına kazınmış en az on bin yıllık olduğu düşünülen bir resimde, bir ip merdiven üzerinde elinde torbayla bal sağımı yapan insan silueti, petek ve petekten sızan balın bu görüşü doğruladığı belirtilmektedir (Dams, 1978 ; Sarıöz, 2006). Arıcılığın ne zaman başladığına dair net bir bilgi bulunmamakla birlikte en eski kanıt milattan önce (M.Ö.) 2400 lü yıllara ait Mısır da bulunan bir hiyerogliftir (Coulston, 2000). Ebers papirüslerinde M.Ö lerde balın yiyecek ve tedavi amacıyla kullanıldığını, piramitlerde bulunan resimler ve ağızları hava geçirmeyecek kapalı bal dolu çanaklar Mısırlıların arıcılıkla uğraştığını ortaya koymaktadır (Sarıöz, 2006). Gerçek arıcılık, insanların ağaç kovukları içinde yuvalanan arıların hayati faaliyetleri için bir miktar bal bırakarak ürettikleri bal ile ifade edilmektedir. Arıların gen merkezi olan Orta Doğu ülkeleri arıcılığın da merkezi olarak bilinmektedir (Tetkik, 1995; Tutkun, 2000). Anadolu uygarlıkları üzerine önemli araştırmalar yapan İsmet Zeki Eyüboğlu arının özel kovanlara yerleştirilip evcilleştirilmesini bir uygarlık aşaması olarak tanımlamakta, ortaçağ göçlerinden önce Anadolu insanının arı yetiştirip bal ürettiğini bildirmektedir (Sarıöz, 2006). Ortaçağ da arıcılığın gelişmeye başladığı bilinmekte olup Boğazköy de bulunan ve M.Ö yıllarına ait olduğu sanılan taş yazması kanunlarda arıcılığı ve takas yoluyla bal pazarlamasını düzenleyen belgeler bulunmaktadır (Tutkun 2000). Ayrıca Sümerlerin kilden yapılmış yazıtlarında (M.Ö. 6200), Hinduların dini kitabı olan Vedas da (5000 yıl önce), Kuran, İncil, Tevrat ve Zebur da balın önemi ve değerine ilişkin bilgilerin olduğu bilinmektedir (Bansal ve ark., 2005).

14 Bal ve Oluşumu Bal, bitki nektarlarının, bitkilerin canlı kısımlarının salgılarının veya canlı kısımlarının üzerinde yaşayan bazı böceklerin salgılarının bal arıları tarafından toplanarak kendine özgü maddelerle karıştırılarak dehidre edilip olgunlaşması için peteğe bırakılan doğal tatlı bir maddedir (Etherington ve ark., 2003; Anon., 2012c). Bal kovanından alınanarak hiçbir işlem yapılmadan tatlandırıcı olarak tüketilen tek gıdadır. İndirgen şekerlerin derişik bir çözeltisi olup amino asitleri, organik asitleri, fenolik maddeleri, Maillard reaksiyon ürünlerini, vitaminleri ve mineral maddeleri içeren kompleks bir karışımdır (Gheldorf ve ark., 2002). Balın % 99 şeker ve sudan, % 1 ise enzimler, aroma içerikleri, organik asitler ve minerallerden oluştuğu bilinmektedir. (Crane, 1996). Zengin içeriği ile sağladığı besinsel değerinin yanında bağışıklık sistemini güçlendirici, antibakteriyel, antiviral, antioksidan özellikler taşımaktadır (Sato ve Miyata, 2000). Arı, nektarı (balözü) güneş ve nem miktarının az olduğu hava koşullarında kendisine enerji kaynağı oluşturmak üzere nektaryumlardan toplamaktadır. Nektaryumlar, bitkide bulunduğu yeri itibariyle floral ve ekstra floral olmak üzere iki tip olup böceklerle ya da kuşlarla tozlaşan bitkilerde bulunan bal arılarınca sabit, yoğun ve yüksek enerjili besine dönüştürülen şekerli bir sıvı içermektedir. Nektar, bitkinin çiçek tablası ovaryum, taç yaprak ve çanak yapraklarında bulunan nektaryumlardan salgılanıyorsa floral nektar, bitkinin yaprak, yaprak sapı ya da gövdesinde bulunan nektaryumlardan salgılanıyorsa ekstrafloral nektar olarak tanımlanmaktadır (Bölükbaşı, 2007). Şekerin yanı sıra protein, amino asit, enzim, organik asit, alkoloidler, vitaminler ve antioksidanlar çeşitli oranlarda bulunmaktadır. Balda nektarda bulunan bileşiklerden farklı maddelerin bulunması, bal arısından farklı bileşiklerin eklendiğini göstermektedir (Krell, 1996). Bal orijinine göre çiçek ve salgı balı olarak ikiye ayrılmaktadır. Çiçek balı, bal arısının bitkilerin çiçeklerinde bulunan nektaryumlardan topladığı nektarın,

15 5 vücutlarındaki bezlerden salgılanan maddelerle karıştırarak zenginleştirmesi ve peteklerde biriktirmesi, olgunlaştırması sonucu elde edilmektedir (Şahinler ve ark., 2001; Sanz ve ark., 2005). Salgı balı ise bal arılarının, bitkilerin canlı kısımlarındaki salgılardan veya bitkilerin canlı kısımlarını emerek beslenen böceklerin (Marchalina hellenica) salgılarından oluşan bal olarak tanımlanmaktadır (Sanz ve ark., 2005). Çam balının da dahil olduğu salgı balının kaynağını balçiği (balözü) oluşturmaktadır. Balçiği, floem özsuyu ile beslenen böceklerin yoğun şeker içeriğine sahip rektal salgılarıdır. Bir salgı balı çeşidi olan çam balı, Homoptera familyasına ait Marchalina hellenica nın Pinus brutia Ten ve Pinus halephensis miller türleri üzerindeki balçiği sekresyonunun bal arıları tarafından kovana taşınması ile üretilmektedir (Tananaki ve ark., 2007; Sorkun ve ark., 2011). Balçiği de nektar gibi arılar tarafından toplanıp, arının midesinde kovana taşınarak tükürük ve farenks bezlerinden salınan salgılarla muamele edilerek peteklere kusulur. Balın olgunlaşması, bu salgılardan gelen enzim ve asitlerin etkisiyle, su içeriğinin buharlaşmasıyla gerçekleşmektedir. Başlangıçtaki % oranındaki su miktarı petekteki olgunlaşma sonrasında % ye kadar düşmektedir (Şahin, 2000). Ayrıca sakkaroz, glikoz ve fruktoza ayrışırken kısmen yüksek moleküllü oligosakkaridler de oluşmaktadır (Belitz ve Grosch, 1999). Balın kimyasal kompozisyonu, bitki kaynağına bağlı olup, bu nedenle nektar ve salgı ballarının içeriği birbirinden farklı olmaktadır (Lachman ve ark., 2007). Salgı balı, koyu rengiyle ve yüksek ph, kül miktarı ve elektriksel iletkenliği ile karakterize edilmektedir. Çiçek balı, fruktoz ve glikozdan zengin, disakkaritce fakir; salgı balı ise oligosakarit özellikle melezitoz oranınca zengin, glikoz ve fruktoz bakımından fakirdir (Campos ve ark., 2001). Ayrıca salgı ballarının mineral içeriği çiçek ballarından daha fazla olup mineral tuzların yoğunluğu yüksek ph, düşük asidik aktivite sağlamaktadır (Sanz ve ark., 2005). Lachman ve ark. (2007), salgı ballarında nektar ballarına oranla alüminyum (Al), bor (B), magnezyum (Mg), nikel (Ni) ve çinko (Zn) miktarının yüksek olduğunu; kalsiyum (Ca) miktarının ise daha düşük olduğunu tespit etmişlerdir.

16 6 Çizelge 1.1. Çiçek ve salgı balı arasındaki farklar (White ve Doner, 1980). Tür Çiçek Balı Salgı Balı Özellik Değer Aralığı Ortalama Değer Aralığı Ortalama Renk (Profund) Beyazdan koyu renge kadar Koyu beyaz Çok açık kehribardan koyu renge kadar Açık kehribar Nem % Fruktoz % Glikoz % Sakkaroz % ph Serbest asitlik (meq/kg) Lakton Dünyada ve Türkiyede Bal Üretimi Arıcılık, dünyada yapılan en yaygın tarımsal faaliyetlerden birisidir. Dünyada yaklaşık 63.5 milyon arı kovanı bulunmakta ve 1.5 milyon ton bal üretilmektedir. Üretilen balın 427 bin tonu ticarete konu olup dış satımın % 90 ı, yaklaşık 20 bal üreticisi ülkeden yapılmaktadır (Suver, 2011; Sorkun ve ark., 2011). Çin, 7.2 milyon kovan varlığı ve 400 bin ton bal üretimi ile dünya bal üretiminin % 25 ini tek başına sağlayarak ilk sırada yer almaktadır. Arjantin, Türkiye, A.B.D. ve Ukrayna diğer önemli üretici ülkeler olarak üretimin % 20 sini sağlamaktadır (Anon., 2011a). Kovan başına dünya bal üretimi 20 kg dolayında olup bu değer; Çin de 33 kg, Arjantin de 40 kg, Meksika da 27 kg, Avusturalya da 55 kg olarak bildirilmektedir Arılı kovan sayısı 4.9 milyon olan Türkiye ise, 82 bin ton bal üretimi ile dünya bal üretiminde 3. sırada yer almasına rağmen, kovan başına ortalama 16 kg bal üretimi ile dünya üretim değerinin altında kalmaktadır (Anon., 2010; Suver, 2011). Coğrafya, iklim ve flora bakımından arıcılık için ideal olan Türkiye nin koloni varlığı ve üretimdeki payı göz önüne

17 7 alındığında mevcut arıcılık potansiyelinden tam anlamıyla yararlanılamadığı görülmektedir (Suver, 2011). Çizelge 1.2. FAO kayıtlarına göre bal üreticisi ilk on ülkenin bal üretim miktarları (Ton/Yıl) (Anon., 2011a). Ülke Çin Arjantin Türkiye Ukrayna A.B.D Meksika Rusya Hindistan Etiyopya Brezilya Dünyada yer alan 57 fitocoğrafik bölgeden üçü (Akdeniz, Avrupa-Sibirya, İran-Turan) ülkemizde yer almaktadır. Bu bölgelerin sağladığı topoğrafik farklılık, bölgeler arası iklim değişikliği ve zengin bitki örtüsüne sahip olmamızı sağlamaktadır. Türkiye de yaklaşık bitki türünün yetişmekte olduğu, bunların 3500 kadarının endemik bitki türü, 500 ünün ise nektar ve polen taşıyan önemli arı bitkileri olduğu bilinmektedir (Anon., 2010). Türkiye nin en önemli nektar bitkileri; Arbutus andrachne (kocayemiş), Astragalus spp. (geven), Brassica napus (kolza), Brassica oleracea (lahana), Calluna vulgaris (püren), Castanea sativa (kestane), Ceratonia siliqua (keçiboynuzu), Circium arvense (devedikeni), Citrus spp. (portakalgiller), Diospyros kaki (Trabzon hurması), Eucalypthus camaldulensis (ökaliptus), Gossypium spp. (pamuk), Helianthus annuus (ayçiçeği), Robinia pseudoacacia (Akasya), Salvia spp. (adaçayı), Thymus spp.(kekik), Tilia spp. (ıhlamur) dir (Sorkun ve ark., 2011).

18 8 Şekil 1.1. Türkiye deki bal üretiminin yıllara göre değişimi (Anon., 2011b). Çizelge yılları arasında Türkiye deki kovan sayısı, bal ve balmumu üretim miktarları (Anon., 2011b). Yıl Kovan Sayısı Bal Üretimi (ton) Balmumu Üretimi (ton) Türkiye, arıcılıkla uğraşan aile ve 4.9 milyon arı kolonisiyle dünya arıcılığında üçüncü sıradadır. Gezginci arıcılık uygulamaları ve modern kovan kullanımının yaygınlaşması ile büyük gelişme sağlanmaktadır. Türkiye deki kolonilerimizin % 85 ini (3 milyon 900 bin) oluşturan gezici arı kolonileri yılda 3 kez olmak üzere yaklaşık 2000 km yapmaktadırlar. Bitki çeşitliliğinin yanı sıra coğrafik yapısından dolayı gezginci arıcılıkla, erken ilkbaharda Akdeniz Bölgesi nde narenciye balını, yaz aylarında Anadolu dan yayla balını alarak ayçiçeği ve pamuk balı için Trakya Bölgesi ne ekili alanlara, çam balı için de Ege ve Muğla yörelerine gidilebilmesi arıcılar için büyük bir imkan oluşturmaktadır. Dünyada bal üretiminde ilk üç sırada yer alan Türkiye, kalite kriterlerini yeterli ölçüde sağlayamaması nedeniyle ihracatta önemli bir yer edinememiştir (Anon., 2010).

19 9 Çizelge 1.4. Dünya bal üretiminde ilk 3 sırayı alan ülkelerin bal ihracat miktarları (Ton/Yıl) (Anon., 2011a). Ülke Çin Arjantin Türkiye FAO verilerine göre, dünya bal ihracatında önemli paya sahip ülkeler sırasıyla Çin, Arjantin, Almanya, Meksika, Brezilya, İspanya, Macaristan, Avustralya olarak bildirilmektedir yılından itibaren Arjantin ve Çin in bal ihracatının düşmesi en önemli ithalatçı olan A.B.D. den antidamping tarifeler uygulanması ve başta Çin olmak üzere Güneydoğu Asya ülkelerinin ballarının Kloramfenikol yönünden kontamine olmasıyla açıklanmaktadır. (Anon., 2011b). Çizelge yılında bal ihracatı ve ithalatı yapan ülkelere ait bal miktarları ve değerleri (Anon., 2011a). İhracat Yapan Ülkeler İthalat Yapan Ülkeler Ülke Miktar Birim Değer Ülke Miktar Birim Değer (Ton) ($/ton) (Ton) ($/ton) Arjantin Almanya Çin A.B.D Almanya İngiltere Meksika Japonya Brezilya Fransa İspanya İtalya Macaristan Belçika Avusturalya Hollanda

20 Bal Kalitesine Etki Eden Faktörler Balın kalitesi, bitkisel kaynağı ve kimyasal bileşimi ile değerlendirilmektedir (Cherchi ve ark., 1994). Arı türü, çevre, balın hasat edilme zamanı, şekli ve depolama koşulları ile arıcıların eğitimi balın kalitesini belirleyen fiziksel ve kimyasal özelliklerine etki etmektedir (Krell, 1996; Yurtsever ve Sorkun, 2003). Balın kalitesinin belirlenmesinde melitopalinolojik, fiziksel, kimyasal ve organoleptik analizlerinin mutlaka birlikte yapılması gerekmektedir (Devillers ve ark., 2004) Melitopalinolojik Özellikler Balın mikroskobik analizi olarak tanımlanan melitopalinoloji, bala kaynak olan nektarlı bitkilerin kökeni ve coğrafik orijini hakkında bilgi veren etkin bir yöntemdir (Soria ve ark., 2004). Kimyasal tekniklerin gelişmesi ile birlikte farklı bitkisel ve coğrafik kökenli balların kimyasal bileşiminin de farklı olduğu belirlenmiştir (Esti ve ark., 1997; Nanda ve ark., 2003). Her ülkeye ve bölgelerine ait nektarlı bitkilerin listesi melitopalinolojik analizler yapılarak hazırlanmaktadır (Coffey ve Breen, 1997). Balda polen analizi ilk defa 1845 yılında Pfister tarafından yapılmıştır. Türkiye de ise ilk kez 1976 yılında Abdul Muheiman Qustiani tarafından Türk ballarında polen analizi doktora tezi olarak çalışılmıştır (Sorkun ve ark., 2002). Balda polen analizi ile balın botanik ve coğrafik orijininin saptanması mümkün olabilmektedir. Bal, içerisinde en çok hangi bitkinin poleni saptanmışsa o bitki ismiyle adlandırılmaktadır. Balda aynı taksona ait polen oranının % 45 ten fazla olması, balın ünifloral olduğunu göstermektedir. Ancak bölgede tek tür hakim değilse arılar çeşitli taksonların çiçeklerinden nektar ve polen toplamaktadır ve bu durum balın polen içeriğine yansımaktadır. Bu şekilde oluşan ballar multifloral olarak bilinmektedir. Ballarda toplam polen sayısı % arasında ise sekonder, % 3-15 arasında ise minör ve % 3 den az ise eser olarak tanımlanmaktadır (Sorkun, 2008). Balın toplam polen sayısı (TPS-10 g) değerinin, sahte ve saf çiçek ballarının

21 11 ayırt edilmesinde önemli bir kriter olduğu bildirilmektedir (Lieux, 1972; Moar, 1985). Salgı balları genellikle mikroskobik olarak mikroalgler, fundus miselleri ve sporlarından oluşan balçiği elementleriyle karakterizedir. Balın tağşişi, nişasta tanesi içerip içermediği, bala bulaşan ve balda bulunmaması gereken mikroskobik partiküllerin varlığı olarak tanımlanmaktadır (Sorkun ve ark., 2011). Bal içinde bulunan polenlerin teşhis edilmesi; nektar kaynaklarının belirlenmesi, balın coğrafik orijininin saptanması, bal kalitesinin tayini ve balların sınıflandırılmasında önemli rol oynamaktadır. Ayrıca, bala güzel koku, tat ve geç kristalleşme özelliği veren bitkiler ile bal kalitesini bozan istenmeyen koku, tat veren bitkiler saptanabilmekte böylece üstün özellikte bal elde edilecek özel bir flora oluşturulabilmektedir (Pınar ve ark., 2003) Fiziksel Özellikler Balın Viskozitesi Bir akışkanın akmaya karşı gösterdiği iç direnç olarak tanımlanan viskozite, balın toplanması (kovandan alınması) ve işlenmesinde önemli bir özelliktir. Bu özellik, balın işlenmesi sırasında süzme, pompalama, karıştırma, filtrasyon ve dolum aşamasında önem taşınmaktadır (Krell, 1996; Yanniotis ve ark., 2006). Viskozite balın kompozisyonu, nem içeriği ve sıcaklığına bağlı olarak değişmektedir. Baldaki serbest şekerlerin kompozisyonu ve kolloidlerin miktarı viskoziteyi etkilemektedir. Genellikle yüksek nem içeriğine sahip ballar düşük viskoziteye sahiptir (Bhandari ve ark., 1999). Ayrıca balın depolandığı ortamın sıcaklığının artması ile balın viskozluğu azalmaktadır (Mossel ve ark., 2000) Balın Rengi Balın rengi, bileşimini oluşturan çeşitli maddelerin farklı dalga boyundaki ışınları değişik ölçülerde absorbe etmesiyle oluşan optik bir özelliktir. Süzme ballarda renk, açık renkten (su gibi renksiz) koyu amber ve siyaha kadar çeşitlilik göstermektedir (Tutkun, 2000; Kolankaya, 2001). Ballardaki renk çeşitliliği balın bitkisel kaynağı, mineral madde içeriği, muhafaza koşulları ve yaşından kaynaklanmaktadır (D arcy,

22 ). Balın rengini etkileyen bileşenler karoten, ksantofil, antosiyanin gibi bitki pigmentleri ile polen taneleri olarak belirtilmektedir (Terrab ve ark., 2004). Şekil Çeşitli bal örnekleri ve balda rengin belirlenmesinde kullanılan pfund skalası (Krell, 1996; Anon., 2012a). Koyu renkli ballar içerdikleri mineral madde, fenolik madde türevleri ve flavonoid bakımından açık renkli ballara göre daha zengindir (Kolankaya, 2001; Finola ve ark., 2007; Ouchemoukh ve ark., 2007). Koyu renkli ballarda aminoasitler ve şekerler arasında yoğun bir etkileşim olduğu, amino-karbonil reaksiyonu ile meydana gelen melanoidin bileşiğinin balın rengini etkilediği bildirilmektedir. Ayrıca rengin kül ve aminoasit/şeker oranıyla ilgili olduğu düşünülmektedir. Balın rengi ile içerdiği kül miktarı arasında pozitif bir korelasyon bulunmaktadır (Şahinler ve ark., 2001). Bal renginin derecelendirilmesinde sık kullanılan ölçülendirme pfund skalası ile yapılmakta olup Şekil 1.2 de görülmektedir. Avrupa daki balların fizikokimyasal özelliklerinin belirlenmesi üzerine yapılan bir çalışmada, pfund skalasına göre 12.9 mm pfund değeri ile en açık renkli bal akasya, sırasıyla 86.6 ve 87.9 mm pfund değeri ile salgı balı ve kestane balı en koyu renkli bal olarak tespit edilmiştir ve Çizelge 1.6 da gösterilmektedir (Oddo ve Piro, 2004).

23 Balın Higroskobik Özelliği Bal, havanın nemini çekme özelliği gösteren higroskopik bir gıdadır ve bu durum balı fermentasyona karşı duyarlı hale getirmektedir. Balların bu özelliği, içeriğindeki higroskopik özellik gösteren fruktoz miktarının glikoz miktarından fazla olmasından kaynaklanmaktadır (D arcy, 2007). Balın güçlü higroskopik özelliğinin, işlenmesi ve kullanımı için önemli olduğu bilinmektedir. Özellikle gıda ve kozmetik sanayinde bu özellikten yararlanılmaktadır. Balın su içeriğine etki ederek fermentasyonuna neden olabileceğinden, ortamın ve kullanılan kapların neminin kontrol altında tutulması gerekmektedir. Balın % bağıl neme sahip havada, nem içeriği % arasında değişmektedir (Krell, 1996) Balın Yoğunluğu ve Özgül Ağırlığı Bir maddenin yoğunluğu birim hacimdeki ağırlığı olarak tanımlanırken, özgül ağırlığı ise belirli bir sıcaklıkta birim hacmindeki ağırlığının aynı hacimdeki suyun ağırlığına oranı olarak bilinmektedir. Bu fiziksel özellikler balın kompozisyonu, nem miktarı ve ortam sıcaklığına bağlı olarak değişmektedir. Balın özgül ağırlığı 20 ºC de ortalama 1.42 g/ml olarak belirtilmektedir (Tolon 1999) Balın Polarizasyonu Balın polarize ışığı çevirme yönü ve miktarı, bal türü, içerdiği fruktoz ve glikoz miktarına göre değişmektedir. Çiçek balları polarize ışığı sola, salgı balları ise sağa çevirmektedir (Piazza ve ark., 1991; Přidal ve Vorlová, 2002). Bu özellik çiçek ballarındaki negatif spesifik rotasyona sahip fruktozun daha fazla bulunmasının doğal bir sonucu olarak açıklanmaktadır. Mono ve oligosakkaritler çok sayıda asimetrik karbon atomu içerdiklerinden polarize ışığın düzleminde değişime neden olmaktadır. β D fruktozun spesifik rotasyonu iken α-d glikozun +52.7, sakkarozun olarak bilinmektedir (Saldamlı, 1998; Tolon, 1999).

24 Balın Kristalizasyonu Kristalleşme, balın kompozisyonuna ve muhafaza koşullarına göre şekli, sayısı, dağılımı değişen monohidrat glikoz kristallerinin oluşması sonucu gerçekleşmektedir. Şeker içeriğinin su içeriğine oranı yüksek olan ballarda, kristalizasyon kısa sürede gerçekleşmektedir (Cavia ve ark., 2001). Yapılan bir çalışmada, glikoz/su oranı 1.7 den küçük olan balların kristalleşmediği, glikoz/su oranının 2.1 den büyük olanların hızla kristalize olduğu bildirilmektedir (Doner, 1977). Baldaki su, karbonhidratları hidrojen bağları ile bağlamaktadır. Fruktoz, su molekülleri arasındaki hidrojen bağlarına zayıf enerji vermekte ve su molekülleri, fruktoz moleküllerini hidratlamak için etraflarında hareketli tutulmaktadır. Kristalleşme, su moleküllerinin glikozu serbest bırakması sonucu olmaktadır. Başka bir ifadeyle fruktozun bu kararsızlığı nedeniyle, baldaki glikoz ve fruktoz miktarının değişmesinden kaynaklanmaktadır (Gleiter ve ark., 2006). Kristalizasyon sırasında serbest kalan su baldaki nem içeriğini arttırarak fermentasyon oluşumuna neden olmaktadır (Krell, 1996). Balın granül yapısı, ticaretinde önemli bir kalite kriteridir. Türkiye de genellikle balın petek yüzeyinin 1/2-2/3 ünün sırlanması ve yeterince olgunlaşmamış balın hasat edilmesi, su oranının yüksek olmasına dolayısıyla fermentasyon oluşumuna neden olmaktadır (Tolon 1999). Balın kristalleşmesi % 70 den fazla şeker, % 20 den az su içeren doygun bir çözelti olmasının doğal bir sonucudur. Şekerle doymuş halde bulunan balın, oda sıcaklığında iken içeriğindeki glikoz, su kaybederek D-monohidratları şeklinde kristalize olmaktadır. Bu monohidrat kristalleri kristalizasyonda toz, polen, hava kabarcığı gibi küçük partiküllerle birlikte çekirdek gibi davranmaktadır (D arcy, 2007). Balın fiziksel özelliklerinden biri olan kristalizasyon içerdiği su miktarı, fruktoz ve glikoz arasındaki oran, katı partiküllerin miktarına bağlı olarak şekillenmektedir. Tüketiciler tarafından bilinenin aksine muhafaza sıcaklığı 5 C nin altında ve 25 C nin üzerinde olduğunda kristalizasyonun oluşmadığı, optimum kristalizasyon sıcaklığının 14 C olduğu bildirilmektedir (Krell,1996). Bu anlamda

25 15 balların depolama sıcaklığının 10 C altında olması gerekirken kullanım kolaylığı nedeniyle tüketilirken C de bulundurulması önerilmektedir (Belitz ve Grosch, 1999) Balın Elektriksel İletkenliği Elektriksel iletkenlik, nektar kaynağına ve balın mineral madde, organik asit ve protein miktarına bağlı olarak değişen bir özellik olup bal orijinin belirlenmesinde önemli bir kriter olarak bilinmektedir (Singh ve Bath, 1997). Genellikle çiçek ballarının elektriksel iletkenlik değeri, salgı ballarından daha düşük olmaktadır. Kestane balları ve salgı balları koyu renklidirler ve mineral madde içerikleri fazla olduğundan elektrik iletkenlik değerleri yüksek saptanmaktadır (Bogdanov, 1999). Muğla bölgesinde çam balı üzerine yapılan çalışmada, ortalama elektriksel iletkenlik değeri 1.13 Ms/cm olarak belirlenmiştir (Şahinler ve Gül, 2004) Kimyasal Özellikler Balda kaynağı arı veya bitki olan çeşitli karbonhidratlar, aminoasitler, mineraller, vitaminler, flavanoidler, organik asitler, polenler, enzimler ve sudan oluşan 180 den fazla bileşik tanımlanmıştır (Sato ve Miyata, 2000). Şekil Balın genel kimyasal içeriği (Tutkun, 2000).

26 Balın Nem İçeriği Kovandaki balın doğal nemi nektardan kaynaklanmaktadır. Petekteki balın yapısında bulunan nem içeriği, arılar tarafından nektarın olgunlaştırılmasından sonra kalan kısım olarak değerlendirilmektedir. Bu nedenle iklim koşulları, üretim yılı ve mevsimi, nektardaki nem miktarı, nektarın salgılanma hızı, koloni büyüklüğü gibi olgunlaşma üzerine etkili faktörler ile balın işlenmesi sırasında uygulanan sıcaklık ve depolama koşulları balın nem miktarı üzerinde etkili olmaktadır (White ve Doner, 1980; Krell, 1996; D arcy, 2007). Bununla birlikte balın higroskopik özelliği nedeniyle saklandığı kapların nem geçirgenliği ve depolandığı yerin nem oranı, nem miktarına etki etmektedir (Şahinler ve ark., 2001). Ballarda nem miktarı % 20 den az olmalıdır (Anon., 2012c). Balın nem içeriği, kalitesinin değerlendirilmesinde bir gösterge olup raf ömrünü etkileyen önemli bir parametredir (Bogdanov ve ark., 2004; Gómez-Díaz ve ark., 2005). Balda yüksek nem oranı başka bir ifadeyle su aktivitesinin artması, osmofilik maya gelişimi sonucu fermentasyon oluşumuna neden olmaktadır (Yanniotis ve ark., 2006). Bu sebeple fermentasyonun önlenmesi ve balın stabilitesinin sağlanması açısından nem içeriği önem taşımaktadır. Nem içeriği, % 17 den düşük balların fermentasyon riski taşımadan depolanabildiği belirtilmektedir (Singh ve Bath, 1997). Yapılan çalışmalarda farklı ülkelere ait ballarının nem içerikleri; Türk ayçiçeği ballarında % 18.4, Türk çiçek ve salgı ballarında sırasıyla % 17.4 ve % 17.2, Fas ballarında (okaliptus, narenciye, akasya, multifloral ve salgı) % , Fransız ballarında (kestane, ayçiçeği, akasya, lavanta ve kolza) % ve İspanyol ballarında (multifloral) % olarak saptanmıştır (Sorkun ve ark., 2002; Terrab ve ark., 2002; Devillers ve ark., 2004; Terrab ve ark., 2004).

27 Balın Asitliği ve ph Değeri Balın ph değeri, içerdiği organik asit varlığına bağlı olarak arasında değişmektedir (Bogdanov ve ark., 2004). Bal, % organik asit ile % oranında aminoasit içermektedir. Balın asitliği ve karakteristik tadından sorumlu dominant organik asit, glukonik asit olarak bilinmektedir (D arcy, 2007). Asitlik balın tadına, balda oluşan kimyasal reaksiyonların oluşumuna, antioksidan ve antibakteriyel aktivitesine etki etmektedir (Gheldorf ve ark, 2002). Balın içeriğini oluşturan bileşenlerin % 0.5 inden daha azını oluşturan organik asitlerden glikonik asit ile fosfat ve klorür gibi inorganik iyonlar balın asitliğini sağlamaktadır (Nanda ve ark., 2003). Glikonik asit, bal içerisinde glikoz oksidaz enziminin glikoz üzerine etkisi ile oluşmaktadır. Ayrıca diğer organik asitler, inorganik anyonlarla birlikte asitliğe etki etmektedir. Bu organik asitler; formik, asetik, bütirik, laktik, oksalik, sitrik, süksinik, tartarik, maleik, malik, piroglutamik, pirüvik, α-ketaglutamik, glikolik, α, β- gliserofosfat ve glikoz-6-fosfat olarak bildirilmektedir (Krell, 1996; D arcy, 2007). Balın asitliği serbest, laktonik ve toplam asitlik olarak değerlendirilmektedir. Çok yüksek düzeyde serbest asitlik oluşumu, balın fermentasyonunun bir kanıtı olarak bildirilmektedir. Normal şartlarda asitlik, organik asitler ile laktonlar arasında denge olmasından, esterler, sülfatlar ve fosfatlar gibi bazı inorganik iyonlardan kaynaklanmaktadır. Serbest ve laktonik asitlik, balın nem içeriğine ve muhafaza süresine bağlı olarak artmakta, sıcaklık ile değişmemektedir (Terrab ve ark., 2004). Türkiye de ambalajlı ballar üzerine yapılan bir çalışmada, çiçek ve salgı ballarının toplam asitliği meq/kg olarak saptanmıştır (Ünal ve Küplülü, 2006). Hindistan ballarının kalite kriterleri üzerine yapılan araştırmada, toplam asitlik arasında saptanmıştır (Anupama ve ark., 2003). Doğu ve Güney Doğu Anadolu balları üzerine yapılan bir çalışmada ise, ortalama ph değeri 3.8, serbest asitlik 22.3 meq/kg ve lakton 7.4 meq/kg olarak bulunmuştur (Yılmaz ve

28 18 Küfrevioğlu, 2001). Bir başka araştırmada, İspanya ballarının serbest, laktonik ve toplam asitlik değerleri, sırası ile , ve meq/kg olarak belirlenmiştir (Terrab ve ark., 2004) Balın Şeker İçeriği Karbonhidratlar balın temel bileşenleri olup viskozite, higroskopi, kristalizasyon gibi özelliklerini etkilemektedir (Bogdanov ve ark., 2004). Balda kuru maddenin ortalama % 97 si karbonhidrattan oluşurken, bunun % 70 - % 78 ini ana monosakaritler olan fruktoz ve glikoz oluşturmaktadır (Krell, 1996; Nagai ve ark., 2002). Genel olarak ballar fruktozu glikozdan daha fazla içerse de pek azında (Kolza, hindiba) glikoz daha fazla bulunmaktadır (Cavia ve ark., 2001; Devillers ve ark., 2004). Bu şekerler, nektardaki sakkarozun bal arılarının sindirim yolunda invertaz enzimi ve asitlerle su alarak parçalanması sonucu meydana gelen invert şekerler olarak tanımlanmaktadır. Ergin arıların glikoz, fruktoz, sakkaroz, trehaloz, maltoz ve melezitozu kullanabildiği ancak rhamnoz, ksiloz, arabinoz, galaktoz, mannoz, rafinoz ve dekstrini kullanamadıkları bildirilmektedir (Ozcan ve ark., 2006). Nektarda şekerin büyük bir kısmı sakkaroz, olgunlaşmış balda ise fruktoz ve glikoz olarak bulunmaktadır. Balı oluşturan nektarda ortalama % 20 civarında sakkaroz bulunurken, olgunlaşmış balda oranı %1-3 tür. Bu değer balın olgunlaşma derecesine ve nektar bileşimine göre değişmektedir (Belitz ve Grosch, 1999; D arcy, 2007). Balda bulunan disakaridler maltoz, kojibioz, turanoz, izomaltoz, sakkaroz, maltuloz, nijeroz, α-, β-trehaloz, gentiobioz trisakaridler ise erloz, panoz, maltotrioz, izomaltotrioz, melezitoz, gentoz, 3-α-izomaltotrioz olarak bilinmektedir. Ayrıca bal, yüksek moleküllü oligosakaridlerden izomaltotetraoz ve izomaltopentaoz içermektedir (Weston ve Brocklebank, 2000; Sanz ve ark., 2005). Karbonhidrat kompozisyonundaki farklılıklar, balın glikoz doygunluk derecesini etkilediğinden kristalleşme özelliğine de etki etmektedir. Balda glikoz ve

29 19 melezitoz miktarının yüksek olması kristalleşmeyi hızlandırırken, fruktoz ve yüksek şekerlerin fazla olması kristalleşmeyi geciktirmektedir (Hanna ve ark., 1991). Weston ve Brocklebank ın (2000), Yeni Zellanda salgı balları üzerine yaptıkları çalışmada, ortalama monosakarit içeriğini % 62, oligosakarit içeriğini % 17 belirlerken ballarda maltoz % 5.5, melezitoz % 4.3 ve turanoz % 3 düzeyinde saptanmıştır. Muğla ili Ula yöresinde çam balları üzerine yapılan bir çalışmada, ortalama invert şeker değeri % 67.5, sakkaroz değeri ise %3.9 olarak tespit edilmiştir (Şahinler ve Gül, 2004). Sorkun ve ark., (2002) tarafından yapılan bir çalışmada ise Türk çiçek ballarının şeker bileşimi, ortalama % 34,29 fruktoz, % glikoz içerirken; salgı ballarının ortalama % fruktoz, % glikoz içerdiği saptanmıştır Balın Protein İçeriği Bal proteinleri çoğunlukla bitki kaynaklı olup bunların büyük bir kısmı polenden gelmektedir (Hermosín ve ark., 2003). Balda bulunan aminoasitler; prolin, glutamik asit, glisin, alanin, fenil alanin, tirozin, treonin, lösin, izolösin, valin olarak belirtilirken, toplam miktarları mg/100 g olarak bildirilmektedir (D arcy ve ark., 2007). Prolin, nektarın bala dönüşümü sırasında bal arılarından gelen ve balın olgunluğunu gösteren bir aminoasittir. Balda serbest aminoasit konsantrasyonu ortalama 100 mg/100 g olup, toplam amino asit miktarının % ini prolin oluşturmaktadır (Hermosín ve ark., 2003). Balın protein içeriğinin belirlenmesinde genellikle prolin değerinden yararlanılmaktadır. Prolin miktarı, unifloral ballarda karakteristik değerler göstermektedir ancak balların sadece bu değer ile sınıflandırılması mümkün değildir (Sanchez ve ark., 2001). Balın kalite değeri ve olgunluğunun belirlenmesinde bir kriter olması yanı sıra şeker ile tağşişin belirlenmesinde de önemlidir. Almanya da prolin içeriği 18.0 mg/100g dan düşük saptanan balların tağşişe uğradığı ya da olgunlaşmamış olduğu kabul edilmektedir (Bogdanov ve ark., 2004). Türk balları üzerine yapılan bir çalışmada, prolin değerleri 127 adet çiçek balı için mg/kg arasında bulunurken, 33 adet salgı balı için

30 mg/kg arasında belirlenmiştir (Sorkun ve ark., 2002). Meda ve ark. (2005), 27 bal örneği üzerine yaptıkları çalışmada ise balların en düşük prolin içeriği 43.8 mg/kg, en yüksek değer mg/100g olarak tespit edilmiştir. Çizelge Avrupa daki farklı bal türlerine ait fizikokimyasal parametreler ve ortalama değerler (Oddo ve Piro, 2004). Fizikokimyasal Parametreler Kolza n= 715 Akasya n= 715 Biberiye n= 515 Kestane n= 495 Narenciye n= 299 Okaliptus n= 208 Ayçiçeği n= 358 Salgı n= 261 Renk (mm Pfund) Elektriksel İletkenlik (ms/cm) ph Toplam Asitlik (meq/kg) Nem % Diastaz Aktivitesi İnvertaz U/kg Prolin mg/kg Fruktoz % Glikoz % Sakkaroz % Balın Mineral Madde ve Vitamin İçeriği Balın mineral madde konsantrasyonu % arasında değişmektedir (Lachman ve ark., 2007). Potasyum, balda en fazla bulunan element olup külün ortalama % ini oluşturmaktadır. Bal bunun yanı sıra klor, sülfür, silisyum, kalsiyum, magnezyum, sodyum ve fosfor ayrıca eser miktarda demir, bakır, çinko, manganez, lityum, nikel, berilyum ve krom da içermektedir. Mineral madde miktarı, balın oluşumunda etkili olan bitkinin nektar kompozisyonuna bağlı olmaktadır. Nektarlı bitkinin yetiştiği toprağın yapısı, suyu; bitkiye ait nektar ve polenin mineral madde içeriğini etkilemektedir (Hernández ve ark., 2005). Yapılan analizlerle balda saptanan mineral madde kompozisyonu ve miktarlarından, ağır metal kirliliği ile ilgili önemli veriler elde edilmektedir. Ballar, içerdiği mineral maddeler ve eser miktarda elementler dışında, çevresel etkenlerden dolayı demir (Fe), çinko (Zn), bakır (Cu) gibi ağır metalleri de taşıyarak çevre indikatörü özelliği göstermektedirler (Przybylowski ve Wilczynska, 2001).

31 21 Kül oranı yüksek olan balların, mineral madde içeriği de yüksek olduğundan salgı ballarının çiçek ballarına göre daha fazla mineral madde içerdiği bildirilmektedir. Balın içerdiği mineral madde niteliği ve miktarı, rengine etki etmektedir. Koyu renkli balların kalsiyum, demir ve mangan miktarlarının açık renkli ballara göre daha yüksek olduğu bildirilmektedir. Bal katkılı bazı çayların renginin koyulaşmasının da balın içerdiği demirden kaynaklandığı ifade edilmektedir (Conti, 2000). Yapılan bir çalışmada, potasyum miktarı açık renkli ballarda 205 mg/kg, koyu renkli ballarda1676 mg/kg düzeyinde saptanırken; demir miktarı açık renkli ballarda 2.4 mg/kg, koyu renkli ballarda 9.6 mg/kg olarak belirlenmiştir. (Krell, 1996). Türkiye de Muğla çevresinde üretilen çam ballarına ait mineral madde içeriği ortalama % 0.57 olarak bulunmuştur (Şahinler ve Gül, 2004). Balın vitamin içeriği, nektar kaynağına, polen miktarına, üretim ve muhafaza koşullarına bağlı olarak değişmektedir. Bal niasin, tiamin, riboflavin, pantotenik asit, C ve K vitamini içermektedir (Nanda ve ark., 2003). Çizelge 1.7 de 100 g balın içerdiği ortalama mineral madde ve vitamin değerleri ile yaş gruplarına göre insanların günlük vitamin ihtiyacı verilmektedir (Bogdanov ve ark., 2008). Çizelge 1.7. Balda bulunan mineral ve vitamin değerleri ve yaş gruplarına göre günlük vitamin ihtiyacı (Bogdanov ve ark., 2008). Mineral Madde Miktar (mg/ 100g) Günlük Vitamin İhtiyacı (mg) 1-4 Yaş 4-15 yaş 15 yaş < Potasyum Sodyum Kalsiyum Magnezyum Fosfor Vitaminler Filokinon (K) Tiamin (B 1 ) Riboflavin (B 2 ) Niasin (B 3 ) Pantotenik asit (B 5 ) Pridoksin (B 6 ) Folik Asit (B 9 ) Askorbik asit (C)

32 Balın Antioksidan İçeriği Balın antioksidan özellik gösteren bir çok bileşiğe sahip olduğu bilinmektedir. Bu bileşikler balda doğal olarak bulunmaktadır (Nicholls ve Miraglio, 2003). Meyve ağaçlarının yaprakları ve meyveleri gibi antioksidan özellik gösteren fitokimyasalları sentezleyen ve serbest radikalleri yok eden bileşenlerin ana kaynağı olan bitkilerden, bioaktif maddeler arılar ile bala taşınmaktadır (Miliauskas ve ark., 2004; Anon., 2010). Genel olarak bal antioksidan aktiviteye sahip; polifenoller (flavanoidler) veya fenolik bileşikler, enzimler, askorbik asit ve peptidler olmak üzere dört grup içermektedir (Nicholls ve Miraglio, 2003). Balın floral kaynağı, bitkinin ikincil metabolitlerinin içeriğindeki farklılıklar ve enzim aktivitesine bağlı olarak antioksidan özellik şekillenmektedir (Frankel ve ark., 1998). Balın antioksidan kapasitesinden büyük ölçüde balda bulunan fenolik bileşiklerin sorumlu olduğu bilinmektedir. Fenolik bileşikler, baldaki major fitokimyasal antioksidanlardır (Gheldorf ve ark., 2002; Nicholls ve Miraglio, 2003). Balda yaklaşık 20 mg/kg bulunan flavanoidler bitkilerin sekonder metabolitleri olup temel antioksidanlar olarak bilinmektedir (Ferreres ve ark., 1994). Flavanoid içeren temel gıda gruplarının tahıllar, baklagiller, meyve ve sebzeler olduğu ve balın flavon apigenin ve flavanol quercetin içerdiği rapor edilmektedir (Peterson ve Dwyer, 1998). Monofloral ballarda flavanoidler, total fenoliklerin yaklaşık % 42 si olan major bileşenler olarak bildirilmektedir. Bununla birlikte ballarda flavanoidlerin profili oldukça çeşitlilik gösterip coğrafi bölge ve bitkisel orijine bağlı şekillenmektedir. Örneğin akasya balında 5.8 mg/kg düzeyinde bulunan fenolik bileşikler, çilek balında 96 mg/kg olarak tespit edilmiştir (Soler ve ark., 1995). Meda ve ark. (2005) tarafından Burkina Faso da askorbik asit kalibrasyon eğrisi kullanarak yapılan çalışmada, Askorbik asit eş değeri (AAE) ile tanımlanan antioksidan içeriği, çiçek ballarında mg AAE/100 g arasında belirlenirken salgı ballarında mg AAE/100 g arasında saptanmıştır.

33 Balın Enzim İçeriği Bal oluşumunda rol oynayan önemli bileşenlerden enzimler, balı tatlandırıcı diğer gıdalardan ayırmaktadır. Enzim aktiviteleri, balın biyolojik değerine katkı sağlamaktadır (Vorlová ve Celechoská, 2002; Serrano ve ark., 2007). Enzimler, canlı hücreler tarafından oluşturulan ve kimyasal reaksiyonları katalizleme yeteneğine sahip protein yapısındaki maddeler olarak tanımlanmaktadır (Saldamlı, 1998). Balda arıların faranjiyal salgı bezi sekresyonlarından, tükrük sıvılarından ve nektar kaynağından kaynaklanan; yüksek oranda diastaz (α- ve β- amilaz), invertaz (α-glikozidaz), glikoz oksidaz ile düşük oranda katalaz ve asit fosfataz bulunmaktadır (Belitz ve Grosch, 1999). Balda diastaz ve invertaz varlığının, bal arılarının topladıkları nektarı, tükürük ve hipofaranjiyel bezlerin salgılarıyla karıştırması ile kovanda nektarın petek gözlerine doldurulmadan önce arıdan arıya aktarılması sırasında balın olgunlaşmasını sağlayan salgıların artışına bağlı olduğu bilinmektedir. Olgunlaşma sırasında eklenen enzim miktarı; bal arılarının yaşına, fizyolojik evresi ve beslenmesine, koloni gücüne, nektar akışına bağlı olarak değişmektedir (Crane, 1990). Baldaki en aktif enzim olan invertaz, disakkarit olan sakkarozu glikoz ve fruktoza hidrolize etmektedir. İnvertazın glikoinvertaz ve früktoinvertaz olmak üzere iki farklı tipi bulunmaktadır (Huidobro ve ark., 1995; Saldamlı, 1998). Hasat edilmiş limon balının yüksek oranda sakkaroz içerdiği ve ºC de birkaç hafta depolanması sonunda sakkaroz miktarının invertaz etkisiyle kabul edilebilir seviyeye düştüğü rapor edilmektedir (Ötleş, 1995). Diastaz, nişastanın hidrolize olmasını sağlamaktadır. Balın muhafaza süresi ve sıcaklığına bağlı olarak yıkımlandığından balın tazelik indikatörü olarak değerlendirilmektedir (Belitz ve Grosch, 1999; D arcy, 2007). Balın kalitesinin değerlendirilmesinde önemli bir parametre olan diastaz aktivitesi (DA), 40 ºC de bir saatte bir gram baldaki enzim tarafından hidrolize edilebilen % 1 lik nişasta

34 24 çözeltisinin ml si olarak tanımlanmaktadır (Anon., 2012c). Yılmaz ve Küfrevioğlu (2001) tarafından muhafaza süresinin diastaz aktivitesi üzerine etkisi araştırılan çalışmada, ortalama diastaz aktivite değeri 14.6 saptanan bal örneklerinin 20±5 ºC de bir yıl muhafaza edilmesi sonucu diastaz aktivitesi azalarak ortalama değer 10.7 olarak belirlenmiştir. Çizelge 1.8. Diastazın farklı sıcaklıklardaki yarılanma süresi (Krell, 1996). Uygulanan Diastazın Yarılanma Uygulanan Diastazın Yarılanma Sıcaklık Süresi Sıcaklık Süresi 10 ºC 12600gün (34.5 yıl) 40 ºC 31 gün 20 ºC 1480 gün (4 yıl) 50 ºC 5.38 gün 25 ºC 540 gün (18 ay) 60 ºC 1.05 gün 30 ºC 200 gün (6.6 ay) 70 ºC 5.3 saat 35 ºC 78 gün (2.6 ay) 80 ºC 1.2 saat Glikoz oksidaz, glikozun oksitlenmesi ile glikonik asit ve hidrojen peroksit üretimini sağlayan enzim olarak tanımlanmaktadır. Balın gastrointestinal hastalıklarda özellikle bakteriyel gastroenterit, mide ve duodenal ülserlerde tedavi edici etkisi, hidrojen peroksit içeriğinden kaynaklanmaktadır (Saldamlı, 1998; Sato ve Miyata, 2000). Bala nektar kompozisyonundan ve özellikle polenden gelen asit fosfataz ise organik fosfatları inorganik fosfatlara dönüştüren hidrolaz enzimi olarak bilinmektedir. Bu enzimin balın karakterizasyonunda önemli bir kriter olduğu ve miktarı ile balın fermentasyonu arasında ilişki olduğu bildirilmektedir. Buna göre, fermentasyona uğrayan ballar fermente olmayanlara göre daha yüksek miktarda asit fosfataz aktivitesine sahiptir. Depolama süresinin enzim aktivitesi üzerine etkisine yönelik çalışmalar yapılmış ve 6 ay sonunda balda asit fosfataz miktarında önemli düşüşler tespit edilmiştir (Alonso-Torre ve ark., 2006).

35 Balda HMF Karbonhidrat içeren bazı gıdaların tazeliği ve kalitesiyle son derece ilişkili olan HMF, bal kalitesinin belirlenmesinde de kullanılan önemli bir kriterdir. Balın işlenmesi sırasında maruz kaldığı sıcaklığın, depolama şartlarının ve kalitesinin değerlendirilmesinde kullanılan indikatör olarak bilinmektedir. HMF, hekzosların asidik ortamda dehidrasyonu ya da Maillard (enzimatik olmayan esmerleşme) reaksiyonu sonucu oluşmaktadır (Fallico ve ark., 2004). Asitlerin katalizör olarak görev aldıkları tepkimeler sonucunda monosakarit molekülünden su ayrılmasıyla; pentozlardan furfural, hekzoslardan HMF oluşmaktadır (Belitz ve Grosch, 1999). Özellikle asidik ortam ve yüksek sıcaklığın etkisi ile ketopentoz ve hekzosların dehidrasyonu sonucu şekillenmektedir (Teixido ve ark., 2006). Reaksiyon oluşumu Şekil 1.4. de gösterilmektedir. Reaksiyon hızının ph, su aktivitesi (a w ), indirgen şeker ve aminoasit içeriği ile ortam sıcaklığına bağlı olarak değiştiği, her 10 C lik artışın reaksiyon hızını 4 misli arttırdığı bildirilmektedir (Burdurlu ve Karadeniz, 2002). Şekil 1.4. Heksozların dehidrasyonu sonucu HMF oluşumu (Belitz ve Grosch, 1999).

36 26 Monosakaritler, inorganik asitlerin seyreltik çözeltilerine dirençli olmalarına rağmen sıcaklığın etkisiyle dehidrasyona uğrayarak furan türevleri oluşturmaktadır. Ketoheksozlar, aldoheksozlardan daha kolay reaksiyona girmektedir. Oluşan furfurallar, reaksiyon sonucu kahverengi huminleri oluşturmaktadır (Belitz ve Grosch, 1999). Ortamın asitliğinin artması, balda HMF oluşumunu arttırmaktadır (Şekil 1.5). Şekil 1.5. Heksozlardan ve pentozlardan asidik ortamda HMF oluşumu (Morales ve Jimenez-Perez, 1999). HMF oluşumuna neden olan Maillard reaksiyonu ise amino asit ve proteinlerdeki amino grubu ile indirgen şekerler arasında gerçekleşen ve azotlu bileşiklerin oluşması ile sonuçlanan enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonu olarak tanımlanmaktadır (Carabasa ve Ibarz, 2000). Reaksiyon, özellikle karbonhidrat ve lizince zengin gıdaların işlenmesi ve depolanması sırasında şekillenmektedir. Maillard reaksiyonu, çoklu reaksiyon basamakları içermektedir. Başlangıç aşamasında, indirgen şekerdeki karbonil grubu ile proteindeki amino nitrojeni reaksiyona girerek su kaybı ile birlikte kapalı halka formundaki N- glikozilamine kadar amadori ürünleri oluşturmaktadır. Reaksiyon devamında amadori ürünleri deoksiozon ve 1-hidroksi-2-propanon, metilglioksal gibi α,βdikarbonil ya da hidroksi karbonil bileşik fragmentlerine dönüşmektedir (Wang ve ark., 2009). Glikozilamin, zayıf asidik koşulların katalize ettiği amadori dönüşümü ile1-amino-1-deoksi-2-ketoz a dönüşmektedir. Bu aşamadan itibaren 1-amino-1-

37 27 deoksi-2-ketoz un enolizasyonu sonucu furfural ve dehidrofurfural türevleri oluşmaktadır. Reaksiyon sırasında dehidrasyon ile açığa çıkan redüktanlar, amino asitlerle reaksiyona girerek esmer renkli melanoidin pigmentleri ile aroma bileşenleri oluşturmaktadır. Yapılarında bir furan halkası içeren furfural, 2- asetilfuran, 2,5-dimetil-4-hidroksi-3(2H)-furanon ve 5-hidroksimetil-2-furfural gibi furanoidler önemli flavor bileşikleri olarak bilinmektedir (Carabasa ve Ibarz, 2000). Enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonu olarak bilinen Maillard reaksiyonu serbest aminoasit, peptid veya proteinlerin yapısında bulunan serbest amino grubu ile indirgen şekerler arasındaki reaksiyonla başlayıp esmer renkli azotlu polimerlerin oluşması ile tamamlanmaktadır. Serbest ε-amino grubu içermesi nedeniyle lizince zengin gıdalar ile indirgen şekerlerce zengin gıdalar reaksiyona kolayca girmektedir. Sıcaklık, süre, ph, reaksiyona giren maddelerin konsantrasyonu ve metal içeriği reaksiyon hızını etkileyen faktörler olarak bilinmektedir. Reaksiyon hızı, gıdanın su aktivitesindeki (a w ) artışa bağlı olarak artmaktadır ( Belitz ve Grosch, 1999; Yıldız ve ark., 2010). Baldaki HMF oluşumu; balın kimyasal özelliklerine (şeker, ph, toplam asitlik, mineral madde), bal işleme prosesine, depolama şartlarındaki sıcaklık ve süreye bağlı olarak değişmektedir (Tosi ve ark., 2002). Bala üretim aşamasında fermentasyona uğramaması ve kristalizasyonun önlenmesi için uygulanan ısı işleminin, balın pazarlama kalitesini arttırdığı bilinmektedir (Anon, 2009b). Ancak taze ballarda (hasat döneminde) çok düşük miktarda bulunan HMF, uygulanan yüksek ve uzun süreli ısı işlemiyle artmaktadır. Bu durum raftaki başlangıç HMF değerini yükseltmekte, uygun olmayan muhafaza sıcaklığına bağlı olarak hızla artan HMF etkisiyle de balın raf ömrü kısalmaktadır (Sanz ve ark., 2003; Morales ve ark., 2009). HMF artışı ve diastaz enziminin yıkımlanması; tat aroma ve renk değişikleri oluşturarak kalite kaybına neden olmaktadır (Kalábová ve ark, 2003). Balın kalitesinin değerlendirilmesinde kullanılan bu iki parametre için sınır değerler oluşturulmuştur. Türk Gıda Kodeksi (T.G.K.) Bal Tebliği ne göre HMF değeri, çiçek ve salgı ballarında en fazla 40

38 28 mg/kg, diastaz aktivitesi ise çiçek ve salgı balları için en az 8, narenciye balları için ise 3 olarak belirlenmiştir (Anon., 2012c). Balda sıcaklık uygulamaları ve sürelerinin, HMF ve diastaz aktivitesi üzerine etkisini ortaya koyan birçok çalışma yapılmıştır. Şahinler in (2007) Hatay yöresinden alınan narenciye, Antakya yöresinden alınan pamuk ve Muğla yöresinden alınan çam balları üzerine yaptığı çalışmada, farklı sıcaklık (55, 65, 75 C) ve zaman (15, 30, 45, 60 dakika) parametreleri uygulanmış, oda sıcaklığında (21 C ±2) 9 ay depo edilen 144 bal örneğinin 3 ay aralıklarla HMF ve diastaz sayıları saptanarak, sonuçlar değerlendirilmiştir. 9. ayın sonunda 75 C de ısı işlemi uygulanmış narenciye balında HMF değeri 22.5 mg/kg, diastaz sayısı 6.5 iken aynı sıcaklığın uygulandığı pamuk ballarında HMF değeri 21 mg/kg, diastaz sayısı 8.3 bulunmuştur. Tüm parametrelere ilişkin sonuçlar dikkate alındığında, çam ballarının 17.6 mg/kg HMF değeri ve 13.9 diastaz sayısı ile ısı uygulaması ve depolamaya en dirençli bal örneği olduğu gözlenmiştir. Turhan ve ark., (2008) tarafından Karadeniz ve Akdeniz Bölgesi nden alınan çiçek ve salgı balı örneklerine 75, 90, 100 C de 15, 30, 45, 60, 75, 90 dakika ısı işlemi uygulanması sonucunda oluşan HMF miktarı HPLC-RP ile analiz edilmiştir. 100 C de 60 dakika sonunda çiçek ballarındaki HMF değeri mg/kg iken salgı ballarında 116 mg/kg olarak belirlenmiştir. Çalışma sonucunda HMF değerinin sıcaklık ve süre uygulamaları yanı sıra bal orijinine bağlı olarak da değiştiği vurgulanmaktadır. Ramirez ve ark. (2000) sıcaklık-zaman parametrelerinin balın bazı kalite kriterlerine etkisine ilişkin yaptıkları çalışmalarında, HMF ve diastaz aktivitesine ilişkin benzer sonuçlar ortaya koymuşlardır. Turhan (2008) tarafından yapılan çalışmada, Orta Anadolu ve çevresinden alınan 40 bal örneği 90, 105, 120, 135, 150 ve 165 C sıcaklıklarda 20, 40, 60, 80 ve 100 saniye süre bekletilerek HMF ve diastaz sayılarına ilişkin sonuçlar değerlendirilmiştir. Örnekler 1 yıl süre ile 25 C de depolanarak diastaz sayısının ortalama % 30 oranında azaldığı, HMF değerlerinin ise izin verilen limit değer olan 40 mg/kg ı aştığı belirlenmiştir.

39 29 İspanya da yapılan bir çalışmada 1987 Eylül ayında toplanan farklı orijinli 115 bal örneğinin 20 C de depolanarak 4, 16 ve 28 ay sonunda spektrofotometrik metotlarla HMF miktarı ve diastaz sayıları belirlenmiştir. Bu örneklerden % 97 sinin HMF değerinin 2. yılın sonunda 40 mg/kg değerini aşması bölgedeki balların raf ömrüne ilişkin bir sonuç ortaya koymuştur. 22 örneğin (% 19.3), diastaz sayılarının 2 yıldan daha önce limit değer olan 8 in altına düştüğü tespit edilmiştir (Sancho ve ark., 1992). Bir başka çalışmada, turunçgil balları 12 ay süre ile 10, 20, 40 C de depolanarak, depolama sıcaklıklarının balın fizikokimyasal parametreleri ile özellikle HMF ve diastaz değerleri üzerine etkisi incelenmiştir. Balların başlangıçtaki ortalama HMF değeri 10.2 mg/kg, diastaz sayısı 13 iken depolama sonunda HMF değerleri sırasıyla 23.3 mg/kg, 30.4 mg/kg, 284 mg/kg diastaz sayıları ise 10.7, 9.7, 2.2 olarak ölçülmüştür. Buna göre depolama sıcaklığının artmasına bağlı olarak depolama süresinin kısaldığı ortaya konmuştur (Castro-Vásquez ve ark., 2008). Kalábová ve ark., (2003) tarafından yılları arasında yapılan bir araştırmada, her yıla ait farklı sayıda alınan toplam 56 adet Çek balı örneği oda sıcaklığında (22± C) depolanarak HMF değeri HPLC ile belirlenmiştir. Örneklerin başlangıç HMF değeri mg/kg arasında değişirken depolama süresine bağlı olarak 1999 yılına ait örneklerde mg/kg, 2000 yılına ait olanlarda mg/kg, 2001 yılına ait olanlarda mg/kg arasında saptanmıştır yılına ait örneklerin % 56 sının HMF değerinin yasal limit olan 40 mg/kg ı aştığı saptanmış olup elde edilen sonuçlar ile uygun depolama koşullarında Çek ballarının raf ömrünün maksimum 3 yıl olduğu belirlenmiştir. Avusturalya da yapılan bir başka çalışmada ise marketlerden alınan işlem görmüş (Rainforest, Leabrook ve Beechworth) ve işlenmemiş (Mallee, Banksia) bal örnekleri 65, 75, 85 C de 2 dakika su banyosunda bekletilmiş, HMF değeri ve diastaz aktivitesi ölçülerek bu değerler ile sıcaklık uygulaması arasındaki ilişkisi değerlendirilmiştir. En düşük diastaz aktivitesi 7.52 ile Leabrook balında tespit edilirken, HMF değeri 53.6 mg/kg olarak belirlenmiştir. Beechworh balının ise en yüksek HMF değerine (74.7 mg/kg) ulaştığı, diastaz aktivitesinin ise 8.48 olduğu saptanmıştır (Ajlouni ve Sujirapinyokul, 2009).

40 Diğer Gıdalarda HMF Oluşumu ve Önemi Gıdaların işlenmesi ve uzun süre muhafaza edilebilmesi amacıyla uygulanan sıcaklık işlemleri HMF oluşumuna neden olmaktadır. Uygun koşullar altında yapılan uygulamalarla gıdalar istenen duyusal özellikleri kazanırken, yüksek sıcaklıklarda ve uzun süreli uygulamalarla HMF oluşumu hızlanıp gıdaların besin değeri azalmaktadır (Rada-Mendoza ve ark., 2002). Isı işlemi görmüş gıdaların kalitesinin değerlendirilmesinde kullanılan kimyasal indikatörlerin, uygulanan proseslerin kontrolünde ve optimum üretim koşullarının sağlanmasında önem taşıdığı bildirilmektedir. HMF de, çeşitli gıdaların üretimi veya depolanması sırasında ortaya çıkan ve kalite değerlendirilmesinde kullanılan önemli bir indikatör olarak bilinmektedir (Namaka ve ark., 1993). Gıdaların depolama süresi ve sıcaklığı, HMF oluşumunda rol oynamaktadır. Özellikle ticari reçel ve pekmez gibi gıdaların üretiminde proses koşullarına bağlı oluşan başlangıç HMF değerleri ve uzun süre depolanmaları göz önüne alındığında, HMF nin önemli bir kalite kriteri olduğu yapılan çalışmalarla ortaya konulmuştur. Rada-Mendoza ve ark., (2004) tarafından yapılan çalışmada, 38 adet reçel ve 18 adet meyve içerikli bebek gıdasında HMF miktarının mg/kg a kadar değiştiği saptanmıştır. Ayrıca 12 ay boyunca 20 ºC ve 35 ºC de depolanan reçel ve meyve bazlı bebek gıdalarında, artan HMF ve furozin oluşumları incelenmiş, süre ve sıcaklık artışına bağlı kalite belirteçleri olduğu ortaya konulmuştur. Kus ve ark., (2005) tarafından yapılan bir başka çalışmada kurutulmuş gıda, bal, reçel, tahıl ürünleri, meyve suyu, sirke, helva gibi değişik gıdalarda HPLC ile belirlenen HMF içeriği ppm arasında saptanmıştır. HMF konusunda yapılan çalışmalardan biri de meyve sularında pastörizasyon sonrası soğutma işleminin, HMF oluşumunun önlenmesinde önemli bir uygulama olduğunu göstermiştir. Çalışmada, pastörizasyon sonrası soğutulmayan örneklerin, soğutulanlara göre HMF değeri % arasında daha fazla saptanmıştır (Kaplan, 2006). Isı işlemi görmüş şeker içeren birçok gıda (kurutulmuş meyve, meyve suyu, marmelat, reçel, pekmez, salça, sirke, bisküvi, karamelli ürünler v.b.) yüksek

41 31 düzeyde (1-9.5g/kg) HMF içermektedir. Kalite değerlendirilmesinde kullanılan HMF nin, gıdalarda belli değerlerin üzerinde bulunması halinde renkte esmerleşmeye, tat ve kokuda değişimlere, gıdanın besleyici değerinde kayıplara neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenle bazı gıdalarda, bulunmasına izin verilen HMF miktarı sınırlandırılmıştır (Janzowski ve ark., 2000). T.G.K. 2012/58 sayılı Bal Tebliği nde HMF sınır değeri en fazla 40 mg/kg olarak belirtilirken, T.G.K. 2007/27 sayılı Üzüm Pekmezi Tebliği nde bu değer sıvı pekmez için 75 mg/kg, katı pekmez için 100 mg/kg olarak belirlenmiştir (Anon., 2007). Ayrıca daha önce belirlenmiş standartlarda meyve suyu ve meyve suyu konsantreleri için sınır HMF değerleri sırasıyla 5 mg/l ve 25 mg/l iken, bu limit değer 1. sınıf reçeller için 50 mg/kg, 2. sınıf reçeller için 100 mg/kg olarak tayin edilmiştir (Anon., 1981; Anon., 1987). Ancak son dönemde yürürlüğe giren T.G.K. Meyve Suyu ve Benzeri Ürünler Tebliği ile Reçel, Jöle, Marmelat ve Kestane Püresi Tebliği nde HMF yer almamaktadır (Anon., 2012b). Protein (kazein, serum proteinleri) ve şeker (laktoz) içeriği yüksek salep, süt ve sütlü çikolata tozları, meyveli toz içecekler, peynir altı suyu gibi ısı işlemi uygulanarak üretilen gıdalar da HMF oluşumu kaçınılmaz olduğu ve bunlara ilişkin kontrollü uygulamaların yapılmadığı bildirilmektedir (Dogan ve ark., 2004). Gıdaların özellikle meyve ve sebzelerden üretilen birçok ürünün enzimlerin rolü olmadan renk esmerleşmesine uğradıkları bildirilmektedir. Isı, ışık, metaller ve oksijen gibi faktörlerin etkisi ile oluşan bu reaksiyonlar; askorbik asit degradasyonu, karamelizasyon ve Maillard reaksiyonu olarak bilinmektedir (Ibarz ve ark., 1999). Amino asit ve proteinlerin amino grubu ile indirgen şekerler arasında gerçekleşen enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonlarından en önemlisi Maillard reaksiyonudur. Reaksiyonun ilk aşamasında, indirgen şekerlerdeki karbonil grubu proteinlerdeki amino nitrojeni ile reaksiyona girmekte ve su kaybı ile birlikte kapalı halka formundaki glikozilamin oluşmaktadır. İkinci aşamada, glikozilamin zayıf asidik koşulların katalize ettiği amadori dönüşümü ile 1-amino-1-deoksi-2-ketoz a dönüşmektedir. Bu safhadan itibaren en önemli dönüşüm, 1-amino-1-deoksi-2- ketoz un enolizasyonu sonucu furfural ve dehidrofurfural türevlerinin oluşması

42 32 olarak bildirilmektedir. Ayrıca, dehidrasyon sonucu açığa çıkan redüktanlar ortamdaki aminoasitlerle reaksiyona girerek esmer renkli pigmentlerle (melanoidin) aroma bileşenlerini oluşturmaktadır (Belitz, Grosch, 1999; Carasaba-Giribet ve Ibarz-Ribas, 2000). Esmerleşme reaksiyonlarının değerlendirilmesinde genellikle HMF parametresinden yararlanıldığı gibi kuru gıdalar da pirolelisin, süt ve süt ürünlerinde furosin, karboksimetillisin ve lisinoalanin (LAL) oluşumlarından da yararlanılmaktadır (Richardson 2001). Maillard reaksiyonunun hızı ortam sıcaklığı, asitliği, su aktivitesi (aw), indirgen şeker ve aminoasit içeriği ile metal iyonlarına bağlı olmaktadır. Şekerlerin reaksiyona katılma öncelikleri ortam ph sına göre farklılık göstermektedir. Şekerlerden aldozların ketozlara, pentozların heksozlara göre, aminoasitlerden ise bazik olanların (lisin, β-alanin) asidik olanlara (glutamik asit) göre daha kolay tepkimeye girdiği bilinmektedir (Roos ve Himberg, 1994). Reaksiyonda başlangıç ph değeri arttıkça şeker degradasyon hızının aynı oranda arttığı, buna bağlı olarak formik asit, asetik asit, dikarbonil bileşikleri, melanoidin gibi son ürün konsantrasyonlarının yükseldiği bildirilmektedir (Martins ve Van Boekel, 2005) HMF nin Sağlık Üzerine Etkisi 5-HMF ve furan bileşiklerinin insan sağlığına yönelik etkileri uzun süredir araştırma konusu olmaktadır (Miller, 1994). Asitlerin katalizörlüğünde pentozlardan oluşan furfural, hekzoslardan oluşan HMF, maddeler arasında mutajenik aktivite ile sınıflandırılmaktadır. Toksik etkisinin yanı sıra üst solunum yolu, göz, deri ve mukoza membranları üzerinde irritan etkisi de bulunmaktadır (Teixido ve ark., 2006). İnsan sağlığı üzerine etkisi tam olarak ortaya konulamamış olan HMF nin gıdalarda oluşumu ve günlük alınan yüksek değerleri ( mg/kg vücut ağırlığı) konu ile ilgili araştırmaların artmasına neden olmaktadır (Janzowski ve ark., 2000). Mutajenik ve DNA zincirine zarar verici etkilerine ilişkin yapılan çalışmalarda,

43 33 sülfotransferazlar ile aktif hale gelen HMF nin genotoksik etki gösterdiği bildirilmektedir (Rufian-Henares ve De La Cueva, 2008, Durling ve ark., 2009). Yüksek konsantrasyondaki HMF nin sıçanlarda sitotoksik özellik gösterdiği üst solunum yolu, göz, deri ve mukoza membranlarına irritan etki yaptığı saptanmış, farelerde ağız yolu ile alınan HMF LD 50 değeri 3.1 g/kg vücut ağırlığı olarak belirlenmiştir (Teixido ve ark., 2006). Fareler üzerinde yapılan çalışmalarda ağız yolu ile uygulanan farklı HMF dozlarının fare hücrelerinde genotoksisite ve karsinojenitede biyo işaretleyici olan ACF yi (Colonic Aberrant Crypt Foci) arttırıcı etkisi ile deri ve karaciğerde tümör gelişimini stimüle ettiği belirtilmektedir (Glatt ve ark., 2005; Monien ve ark., 2009). Yapılan bir çalışmada mg total HMF uygulamalarının deri lezyonları ile tümör oluşumuna neden olduğu ve 200 mg/kg lık uygulamaların karaciğer tümörü gelişimine yol açtığı rapor edilmiştir (Miyakawa ve ark., 1991). Kanser oluşumuna neden olan bazı gıda bileşenleri ile dünyada giderek artan kanser vakaları yanında tedavi sürecine ilişkin yaşanan güçlükler, yapılan harcamalar da göz önüne alındığında konunun önemi ortaya çıkmaktadır. Yapılan araştırmalarla gıda güvenliği ve insan sağlığına ilişkin risk teşkil eden HMF nin gıdaların işlenmesi sırasındaki oluşumu kontrol altına alınıp ilgili yasalarla sınır değerleri belirlenerek tüketicinin kaliteli gıdaya ulaşması sağlanmalıdır Bala İlişkin Yasal Düzenlemeler Hayvansal ve bitkisel kökenli, besin değeri yüksek, doğal tatlandırıcı olan bal kirleticilerden uzak, insan tüketimi için güvenilir, sağlıklı yaşamı destekleyen bir gıda olarak bilinmektedir. Özellikle çocuklar, yaşlı ve hasta insanlar tarafından tüketildiği göz önünde bulundurulduğunda balın üretimi, muhafazası ile kalitesinin korunması büyük önem taşımaktadır. Türkiye de bala ilişkin yasal düzenlemeler Türk Gıda Kodeksi (TGK) Bal Tebliği ile gerçekleştirilmiştir. Tebliğ, Avrupa Birliği nin 2001/110/EC sayılı direktifi ve Kodeks Alimentarius Komisyonu Bal Standartı göz önünde

44 34 bulundurularak 2012 yılında revize edilmiştir (Anon., 2012c). Tebliğ, öncelikli olarak ilgili AB mevzuatı ve bilimsel olarak kabul görmüş veriler kapsamında, gıda güvenliği ve tüketicinin korunması, haksız rekabetin ve tağşişin önlenmesi temel alınarak hazırlanmıştır. Buna göre belirlenen kalite kriterleri Çizelge 1.9 da gösterilmektedir. Bal Türü Çiçek Balı Salgı Balı Karışım Bal Fırıncılık Balı (çiçek-salgı) Nem (en fazla) %20 % 20 % 20 % 23 %23 Püren (Calluna) %25 (püren-calluna kaynaklı fırıncılık balları) Sakkaroz (en fazla) 5 g/100 g 5 g/100 g 5 g/100 g 5 g/100 g 10g/100 g (Yalancı akasya- Robina psedoacacia, adi yonca- Medicago savita, Banksia meziesii, tatlı yonca- Hdysarum, kırmızı okaliptus- Eucalyptus camadulensis, meşin ağacı- Eucryhia lucida, narenciye balları 15g/100g (Lavanta çiçeği) 10g/100g Kızıl çam (Pinus brutia) ve fıstık çamları (Pinus pinea) F+G (en az) 100 g da 60 g 100 g da 45 g 100 g da 45 g - F/G Suda çözünmeyen 0.1 g/100 g 0.1 g/100 g 0.1 g/100 g 0.1 g/100 g madde (en fazla) Serbest asitlik 50 meq/kg 50 meq/kg 50 meq/kg 80 meq/kg (en fazla) En fazla 0.8 ms/cm (Koca En az 0.8 En fazla 0.8 ms/cm En fazla 0.8 ms/cm Elektriksel iletkenlik yemiş, çan otu,ıhlamur,süpürge çalı, okyanus mersini hariç) En az 0.8 ms/cm (Kestane) ms/cm En az 0.8 ms/cm (Kestane ve salgı balı karışımı) Diastaz Sayısı (en az) 8 3 (Narenciye gibi düşük miktarda enzim bulunduran ve doğal olarak HMF miktarı 15 mg/kg> ballarda) HMF (en fazla) 40 mg/kg 40 mg/kg 40 mg/kg - Prolin (en az) 300 mg/kg 300 mg/kg 300 mg/kg 300 mg/kg Naftalin (en fazla) 10 ppb 10 ppb 10 ppb 10 ppb F: Fruktoz G: Glikoz Çizelge 1.9. T.G.K. Bal Tebliği nde yer alan kalite kriterleri ve değerleri (Anon., 2012c).

45 35 Bal kalitesi, bitkisel kaynağı ve kimyasal bileşimi ile değerlendirilmektedir. Piyasada doğal balların yanında pek çok hileli bal bulunmaktadır. Bunlar, arıların şeker şurubu ile beslenmeleri sonucu elde edilen şekerli ballar, şeker şuruplarına aroma ve boya ilave edilen ballar ve doğal ballara şeker, su, nişasta gibi maddeler katılmak suretiyle elde edilen tağşişli ballar olarak bilinmektedir. Baldaki tağşişin saptanması için, balın bileşimi ve tağşiş amacıyla ilave edilen maddenin spesifik bileşiklerinin belirlenmesi gereklidir. Bu amaçla balın saflığı, bal ve bal protein fraksiyonu arasındaki stabil karbon izotop oranındaki ( 13 C/ 12 C %) farklılığının belirlenmesi ile ortaya konulmaktadır. T.G.K. Bal Tebliği ne göre, balda protein ve ham delta C13 değerleri arasındaki fark kızılçam (Pinus brutia) ve fıstık çamları (Pinus pinea) için 1.6 veya daha pozitif, diğer tüm ballar için veya daha pozitif olmalıdır. Balda protein ve ham bal delta C13 değerlerinden hesaplanan C4 şekerleri oranı ise Kızılçam (Pinus brutia) ve fıstık çamları (Pinus pinea) için en fazla %10, diğer tüm ballar için %7 olarak belirlenmiştir (Anon., 2012c). Kodeks Alimentarius ve diğer uluslararası bal standartlarında; tüketime sunulan balın içeriğinde balı bal yapacak öğeler dışında herhangi bir katkı maddesinin bulunmayacağı, işlenmesi ve muhafazası sırasında reddedilebilecek hiçbir yabancı tat, aroma içermeyeceği, bala özgü polenin yabancı maddelerin arındırılması sırasında kaybolmaması gerektiği ve bal kompozisyonu ile kalitesini değiştirecek uygulamaların yapılmaması gerektiği belirtilmektedir (Anon., 2010). Bu tez çalışmasında, Türkiye de farklı firmalar tarafından üretilen bal örneklerinin HMF miktarı ve diastaz aktivitesi üzerine farklı muhafaza sıcaklıklarının etkisi ortaya konularak gıda kalitesi için uygun muhafaza sıcaklığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Buna ek olarak, farklı satış noktalarından alınan süzme bal örnekleri HMF değeri ve diastaz aktivitesi yönünden incelenerek piyasaya ilişkin durum değerlendirmesi yapılmıştır.

46 36 2.GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Bu çalışmada, Türkiye de üretim yapan beş farklı bal firmasına ait 850 g lık cam kavanozlarda 3 er adet süzme çiçek ve salgı balı, paralel örnekleriyle birlikte dolum tarihlerinde fabrikalarından alınarak materyal olarak kullanıldı. Ayrıca Türkiye nin farklı illerine ait (Adana, Ankara, Antalya, Hatay, İzmir, Konya) çeşitli satış noktalarından orijinal ambalajlarında alınan 25 süzme çiçek ve 25 süzme salgı balı olmak üzere toplam 50 adet bal örneği de materyal olarak kullanıldı. Çalışma kapsamında, Temmuz 2010 dolum tarihli 5 farklı firmaya ait 3 er adet süzme çiçek ve salgı balı örneğinin dolum tarihine ait (0. gün) HMF miktarı ve diastaz aktiviteleri saptandı. Ayrıca Bal örneklerinin kalite kriterlerinin belirlenmesine ilişkin şeker, asitlik, ph, nem, kül, elektriksel iletkenlik, polen analizleri yapıldı. Örnekler 10±2 ºC, 22 ±2 ºC ve 35±2 ºC olmak üzere üç ayrı sıcaklık derecesine ayarlanmış etüvlerde (Nüve ES-500, Nüve ES-120 Türkiye) muhafaza edilerek üç aylık periyotlar (Ekim 2010, Ocak 2011, Nisan 2011 ve Temmuz 2011) sonunda HMF miktarları ve diastaz aktivitelerine ilişkin analizler tekrarlandı. Ayrıca, Türkiye nin farklı illerinden, farklı üretim tarihlerine sahip orijinal ambalajlarında alınan çiçek ve salgı balı örnekleri HMF değeri ve diastaz aktiviteleri ile şeker (fruktoz, glikoz, sakkaroz) içerikleri yönünden analize alındı Yöntem Örneklere ait tüm analizler, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Ofisi onayıyla Ankara Yenimahalle de bulunan özel Güven Laboratuvar ında gerçekleştirildi.

47 HPLC Yöntemi ile HMF Tayini Bal örneklerindeki HMF miktarı, HPLC-UV dedektör kullanılarak Uluslararası Bal Komisyonu nun (IHC) önerdiği metoda göre yapıldı (Anon., 2009c). Bal örnekleri analize alınmadan önce karıştırılıp homojenize edilerek ön hazırlık işlemleri tamamlandı Ekstraksiyon Homojenize edilmiş bal örnekleri, 10 g alınarak g hassasiyetle 50 ml lik balon jojelere tartıldı. Örnekler, saf suda çözülerek balon jojeler 50 ml çizgisine kadar saf su ile tamamlandı. Çalkalayıcıya yerleştirilerek 15 dk süre ile balların tamamen çözülmesi sağlandı. Çözeltiler, enjektöre alınarak 0.45 µm filtreden geçirilip amber renkli 2 ml lik viallere alındı Bal Örneklerinde HMF Miktarının Saptanması Bal örneklerinin HMF miktarları, yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) yöntemi ile tespit edildi (Anon., 2009c). Kullanılan HPLC sistemi, dörtlü pompa, UV-DAD dedektörü, otomatik örnekleyici, gaz giderici (degasser) ve kolon fırınından oluşmaktadır. Hazırlanmış mobil faz HPLC cihazına yerleştirilerek kolonun şartlanması için 1 ml/dak. akış hızıyla kolondan geçirildi. Viale alınan numuneler şartlanmış olan HPLC sisteminde enjekte edildi. Elde edilen kromatogramlar Chromeleon version 6.80 yazılım programı ile değerlendirildi. Balda HMF analizi için HPLC koşulları Kolon: Ters faz C-18 Kolonu (125x4mm, 5 µm) Kolon sıcaklığı: 25 ºC Mobil faz: Su-Metanol (90: 10, v/v) Akış hızı: 1ml/dak. Enjeksiyon süresi: 15 dak. Enjeksiyon hacmi: 20 µl Dalga boyu: 285 nm

48 38 Şekil 2.1. Bal örneklerinin HMF değerlerinin belirlenmesinde kullanılan HPLC cihazı Standartların Hazırlanması ve Kalibrasyon Eğrisi 5- Hydroxymethyl-furan-2-carbaldehyde (HMF) standardı, analitik terazide 10 mg tartılarak 100 ml lik balon jojede saf su ile 100 ml ye tamamlandı. Böylece 100 ppm lik stok standart hazırlanmış oldu. Stok standarttan 100 ml lik balon jojelere sırasıyla 1, 2, 5, 10 ml alınarak çizgisine kadar saf su ile tamamlandı. Hazırlanmış olan 1, 2, 5, 10 ppm lik çalışma standartları, 0.45 µm lik membran filtrelerden geçirilip viallere alınarak HPLC ye verildi. Bu işlemler, 0. gün, 3., 6., 9. ve 12. ayda yapılan analizler öncesi gerçekleştirilerek kalibrasyon grafikleri çizildi. Şekil 2.2 de 6. ayda yapılan HMF standartlarına ait kalibrasyon grafiği gösterilmektedir.

49 39 Şekil ay HMF standartlarına ait kalibrasyon grafiği Kalibrasyon aralığı 1-10 mg arasında çizilen kalibrasyon eğrisine ait korelasyon katsayıları sırasıyla 0. gün, 3., 6., 9. ve 12. ay için R 2 = 0,9999, R 2 = , R 2 = , R 2 = ve R 2 = olarak bulundu. HPLC nin Dionex Chromeleon yazılım programı ile korelasyon katsayıları elde edildi. Örnek olarak 9. aya ait HMF standartlarına ait konsantrasyon, yükseklik ve alanları Çizelge 2.1. de, pik kromatogramları Şekil 2.3 de gösterilmektedir. Çizelge ay HMF standartlarına ait yükseklikler ve alanlar Konsantrasyon Alan Yükseklik 1 mg/l mg/l mg/l mg/l

50 40 Şekil ay HMF standartlarına ait pik kromatogramları Bal örneklerindeki HMF miktarları, standart ve örneklerin pik alanlarının birbirlerine göre oranları ve gerekli seyreltmeler dikkate alınarak hesaplandı. Cihazın yazılımı ile otomatik olarak HMF pikinin alanına göre, 4 farklı konsantrasyondaki standart çözeltilerle oluşturulan kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplama yapıldı. Bal örnekleri için kullanılan seyreltme faktörü, enjeksiyon öncesi cihaz yazılımında belirtilerek final (nihai) sonuç alındı. C HMF = (A N /A C ) x C 1 x Seyreltme oranı C HMF : Bal örneğine ait HMF miktarı (mg/kg) A N A C C 1 : Bal örneğinin verdiği HMF pikinin alanı : Standart çözeltisinin verdiği HMF pikinin alanı : Standart HMF çözeltisinin konsantrasyonu (mg/kg)

51 41 Şekil 2.4. Bazı bal örneklerine ait HMF kromatogramları HMF için Geri Kazanım Analizi Çalışmada analizler sırasındaki muhtemel kayıpları belirlemek amacıyla geri kazanım testi (recovery) yapıldı. Bu yöntemin temeli, örneğe belli miktarda eklenen standardın analiz sonucunda yüzde kaçının geri kazanıldığının tespitine dayanmaktadır. Yöntem iki aşamada gerçekleşti.

52 42 1. Eklenecek standardın örnekteki miktarını belirlemek için örneğin analizi 2. Eklenen standardın, örnekte standarta ait olan pik alanını yüzde kaç arttırdığını belirlemek amacıyla standart eklenmiş örneğin analizi Bu amaçla standart, örneğe analizin başlangıcında ekstraksiyon öncesinde eklendi. Böylece geri kazanım testinin analizde önemli bir aşama olan ekstraksiyon işlemini kapsaması da sağlandı. Buna göre, 10 g (±0.001) bal tartılarak 50 ml distile su ile çözülerek 0.45 µm filtreden geçirildi ve viale alındı. Örnek analizinin ardından 10 ppm düzeyinde HMF standardından ilave edilerek HPLC cihazına verildi. Elde edilen kromatogramlarda oluşan pik alanlar ile hesaplama yapıldı. Örneklerin 0., 3., 6., 9. ve 12. aylarda yapılan HMF analizleri öncesinde geri kazanım testleri yapılarak oranlar sırasıyla % 96.12, % 97.05, % 97.07, % ve % saptandı. Recovery (%) = (A 2 - A 1 ) / A 3 x 100 A 1 : Standart eklenmemiş örnekteki HMF miktarı A 2 : Standart eklenmiş örnekteki HMF miktarı A 3 : Eklenen standart miktarı HMF Analizinde Alıkonma Zamanları ve Tekrarlanabilirlik Testi HMF nin alıkonma zamanları her periyotta analizler yapılmadan önce standart çözeltinin (5 ppm) 6 kez ölçülmesi ile elde edildi. Örnek olarak, başlangıç ölçümlerinden (0. gün) önce yapılan testte bulunan HMF alıkonma zamanları ve alanları Çizelge 2.2 de, HMF alıkonma zamanına ait pik kromatogramı Şekil 2.4 de gösterildi.

53 43 Çizelge 2.2. Başlangıç (0. gün) ölçümlerine ait HMF nin alıkonma zamanları ve alanları Ölçüm Alıkonma (dakika) Alan Toplam ± ±0.057 Şekil HMF alıkonma zamanına ait pik kromatogram örneği

54 Spektrofotometre ile Diastaz Tayini Bal örneklerinin diastaz tayini, UV-Spektrofotometre kullanılarak IHC nin önerdiği metoda göre yapıldı (Anon, 2009c). Yöntem gereği çözeltiler hazırlanarak örnekler analize alındı. Çözeltilerin Hazırlanması Sodyum Klorür Çözeltisi 2.9 g sodyum klorür (NaCl) bir miktar distile suda çözünerek 100 ml lik balon jojeye aktarılıp hacim çizgisine kadar tamamlandı. Sodyum Asetat Tampon Çözeltisi 43.5 g sodyum asetat (CH 3 COONa 3H 2 O), yaklaşık 5 ml glasiyel asetik asit ile ph 5.3 e ayarlanarak 250 ml balon jojede distile su ile hacim çizgisine tamamlandı. Şahit Ana Çözelti 11 g iyot (I 2 ) ve 22 g Potasyum iyodür (KI) ml distile suda çözündü ve 500 ml lik balon jojeye alınarak hacim çizgizine kadar distile su ile tamamlandı. Seyreltilmiş Şahit Çözelti 20 g Potasyum iyodür (KI) bir miktar distile su ile çözündü ve şahit ana çözeltiden 2 ml ilave edilerek 500 ml lik balon jojeye alındı. Çözelti, hacim çizgisine kadar distile su ile tamamlanan balon jojede günlük olarak hazırlandı. Nişasta Çözeltisi Nişasta, 1.5 saat 130 ºC de etüvde bekletilerek desikatöre alındı ve oda sıcaklığına soğutuldu. Analitik terazide g hassasiyetle 2 g tartılarak 250 ml lik erlene alındı ve üzerine 90 ml distile su ilave edildi. Elde edilen çözelti, 3 dak. kaynatılarak 100 ml lik balon jojeye aktarılıp hacim çizgisine kadar distile su ile tamamlandı. Nişasta çözeltisi günlük olarak hazırlandı.

55 Nişasta Çözeltisinin Kalibrasyonu Belirlenecek su miktarının, nişasta çözeltisinin aralığındaki optik yoğunlukta absorbsiyonuna uygunluğunun kontrol edilebilmesi amacıyla 8 ayrı cam tüpe, miktar aritmetik olarak artırılarak (12, 13, 14...,19 ml) distile su kondu. Her bir tüpe 5 ml seyreltilmiş iyodin çözeltisi aktarılarak, 10 ml distile su ile 5 ml nişasta çözeltisi içeren çözeltiden 0.5 ml eklendi ve tüpler iyice karıştırılarak 660 nm dalga boyunda UV- spektrofotometrede (Rayleigh, VIS- 723G, İngiltere) absorbans değerleri okutuldu. Optik yoğunluk değeri arasında çıkan tüpün su miktarı belirlendi. (Okuma yapılmadan önce distile su ile cihazın sıfırlaması yapıldı.) Bal Örneklerinin Diastaz Analizi Analitik terazide g hassasiyetle tartılan 10 g bal örneği, 15 ml distile su ve 5 ml sodyum asetat tampon çözeltisi (ph 5.3) içerisinde çözülerek 50 ml lik balon jojeye aktarıldı. İçerisine 3 ml sodyum klorür ilave edilerek hacim çizgisine distile su ile tamamlanan çözeltiden 10 ml bir tüpe aktarıldı. Bir başka tüpe %1 lik nişasta çözeltisinden 10 ml konularak iki tüp 40 C de su banyosunda 15 dakika bekletildi. Süre sonunda %1 lik nişasta çözeltisinden 5 ml alınıp 10 ml bal çözeltisine ilave edilerek iyice karıştırıldı ve tekrar 40 C de su banyosunda 5 dakika bekletildi. Süre sonunda nişasta-bal çözeltisinden 0.5 ml alınarak çözelti tekrar su banyosuna yerleştirildi. Alınan 0.5 ml nişasta-bal çözeltisine hızlı bir şekilde 5 ml seyreltilmiş şahit çözelti ve kalibrasyonda belirlenen su miktarı kadar distile su ilave edilerek 1 cm lik kuartz küvete aktarılıp 660 nm dalga boyunda UV- spektrofotometrede 5. dakika için absorbans değeri belirlendi. Bu işlem su banyosunda bekletilen nişastabal çözeltisi için 5 dakika aralıklarla (10., 15. ve 20. dak.) 3 kez daha yapıldı ve 4 ayrı absorbans değeri belirlenmiş oldu. Kör noktanın değerlendirilmesi için de 10 ml bal çözeltisi ve nişasta çözeltisi yerine 5 ml distile su karıştırıldı. Karışımdan 0.5 ml alınarak belirlenen su miktarı ve 5 ml seyreltilmiş şahit çözelti ilave edilerek cihazda 660 nm dalga boyunda absorbsiyonu okundu. Spesifik absorbansa (0.235) ulaşmak için gereken sürenin (t x ) belirlenmesi için zamana karşı değişen absorbans değerleri okunarak absorbans-süre eğrisi çizildi ve kör nokta formülde yerine konularak aşağıdaki örnekte olduğu gibi hesaplamalar yapıldı.

56 46 t= 5 dak A= t=10 dak A= t=15 dak A= t=20 dak A= Kör nokta= X= için oluşturulan doğrusal denklemden t x hesaplandı. Y(t x ) = bx+a Y(t x ) = (-39.66) x (0.0436) + (37.01) Y(t x ) = Diastaz aktivitesi, diastaz sayısı (DS) olarak hesaplanır. DS= 60 dak./ t x x (0.10/0.01) x 1/2 DS= 300 / t x DS= 300/ DS= HPLC Yöntemi ile Şeker Tayini Bal numunelerinin şeker (fruktoz, glikoz, sakkaroz) tayini, HPLC- refraktif-indeks (RI) dedektör kullanılarak IHC nin önerdiği metoda göre yapıldı (Anon, 2009c) Ekstraksiyon Bal örnekleri, g hassasiyetteki analitik terazide bir beher içine 5 g tartılarak 40 ml distile su ile çözüldü ve üzerine 25 ml metanol ilave edilerek 100 ml lik balon jojeye aktarılıp saf su ile 100 ml ye tamamlandı. İyice karıştırılan çözeltiler, enjektöre alınıp 0.45 µm lik membran filtreden viallere süzüldü ve HPLC (Agilent 1100, GI362A/RID-A.B.D.) cihazına verildi. Cihaz Şartları Mobil faz: Asetonitril-su (80:20 v/v) Analitik kolon : C-18 ters faz, (250x4.6 mm, 5µm), amin modifiye slica jel (İnertsil, Japonya) Kolon ve dedektör sıcaklığı: 25 C Akış oranı ve enjeksiyon miktarı: 1,3 ml/dk ve 10 µl

57 Standartların Hazırlanması ve Kalibrasyon Eğrisi Fruktoz (F), glikoz (G) ve sakkaroz (S) standartları, g hassasiyetteki analitik terazide 2 g tartılarak 25 ml metanol ve 40 ml distile su ile 100 ml lik balon jojeye aktarıldı, hacim çizgisine kadar distile su ile 100 ml ye tamamlandı. Böylece fruktoz, glikoz ve sakkaroz standartları karıştırılarak 20 mg lık stok standart hazırlanmış oldu. (Standardın +4 C de 4 hafta, -18 C de 6 ay stabil olduğu bilinmektedir.) Stok standarttan 100 ml lik balon jojelere sırasıyla 50 ve 25 ml alınarak hacim çizgisine kadar distile su ile tamamlandı. Böylece hazırlanmış olan , , ppm lik çalışma standartları, 0.45 µm lik membran filtrelerden geçirilip viallere alınarak HPLC ye verildi. Bu işlemler, fabrikalarından dolum tarihinde alınan çiçek ve salgı ballarının kalite kriterlerinin belirlenmesi ile piyasa taraması için alınan 50 bal örneğinin şeker analizleri öncesi gerçekleştirilerek kalibrasyon grafikleri çizildi. Şekil 2.5 de piyasa taramasında yer alan balların şeker analizi öncesi yapılan fruktoz, glikoz ve sakkaroz standartlarına ait kalibrasyon grafiği gösterilmektedir.

58 48 Şekil Fruktoz, glikoz ve sakkaroz standartlarına ait kalibrasyon eğrileri ve korelasyon katsayıları Fruktoz, glikoz ve sakkaroz standartlarından ppm, ppm ve ppm lik standart çözeltilerle çizilerek elde edilen kalibrasyon eğrilerine ait korelasyon katsayıları fruktoz için R 2 = 0,99967, glikoz için R 2 = ve sakkaroz için R 2 = olarak belirlendi. HPLC nin Dionex Chromeleon

59 49 yazılım programı ile korelasyon katsayıları elde edildi. Örnek olarak fruktoz, glikoz ve sakkaroz standartlarına ait konsantrasyon ve alanları Çizelge 2.3 de gösterilmektedir. Çizelge 2.3. Fruktoz, glikoz ve sakkaroz standartlarına ait alanlar Konsantrasyon Alan Fruktoz Glikoz Sakkaroz 5000 ppm ppm ppm Bal örneklerindeki şeker miktarları, sulandırma ölçüsü (50 ml) ve alınan bal miktarları göz önünde bulundurularak kromatogramlardan elde edilen sonuçlar doğrultusunda hesaplandı. Şekil 2.7. Bazı bal örneklerine ait şeker (fruktoz, glikoz, sakkaroz) kromatogramı

60 Elektriksel İletkenlik Tayini Örneklerin elektriksel iletkenliği, iletken ölçer (kondüktometre) kullanılarak IHC nin önerdiği metoda göre belirlendi (Anon., 2009c). Tartım cihazında g hassasiyetle 100 ml lik beherlere 20 g kadar tartılan örnekler, bir miktar distile su ile çözüldükten sonra 100 ml lik balon jojelere aktarıldı ve distile su ilavesi ile 100 ml ye tamamlandı. Hazırlanan %20 lik bal çözetilerinden beherlere 40 ml aktarılıp kalibrasyonu yapılmış kondüktometre (Meterlab - CDM230, Türkiye) probu, çözeltilere daldırılarak ölçümler yapıldı. Okunan değerler, Ms/cm cinsinden direkt sonuç olarak kaydedildi. Kalibrasyon çözeltisinin hazırlanması Potasyum klorür (KCl), 130 ºC etüvde (Nüve- FN500, Türkiye) 2 saat bekletilerek desikatöre alınıp oda sıcaklığına soğutuldu ve g tartılarak bir miktar distile suda çözüldü. Çözelti 1000 ml lik balon jojeye aktarılarak hacim çizgisine kadar distile su ile tamamlandı. Böylece 0.1 M KCl çözeltisi hazırlandı ph ve Asitlik Tayini Bal numunelerinin ph tayini, ph-metre kullanılarak IHC nin önerdiği metoda göre yapıldı (Anon, 2009c). Her örnek için 10 g bal, g hassasiyetle tartılarak 250 ml lik erlenlere alınıp üzerine 75 ml karbondioksiti uzaklaştırılmış distile su eklendi. Ağzı kapatılan erlenler, iyice çalkalanarak balların çözülmesi sağlandı. ph 4.0 ve ph 7.0 değerine sahip iki tampon çözelti kullanılarak kalibre edilen ph-metre (HannapH 211, İtalya) elektrotları, çözeltiler içine daldırılarak ölçümler yapıldı. Bal numunelerinin asitlik tayini, titrimetrik yöntem kullanılarak TSE nin önerdiği metoda göre yapıldı (Anon, 2002). Her örnek için 10 g bal, g hassasiyetle tartılarak 250 ml lik erlenlere alınıp üzerine 75 ml karbondioksiti

61 51 uzaklaştırılmış distile su eklendi. Ağzı kapatılan erlenler, iyice çalkalanarak balların çözülmesi sağlandı. Asitlik tayini için, çözeltilere 4-5 damla fenolftalein çözeltisi damlatıldı. Erlen içerisine magnet konarak manyetik karıştırıcı üzerine alınıp büretten akıtılan 0.05 M NaOH titrisolü ile eşdeğerlik noktasına titre edildi. Fenolftalein in kırmızı rengi en az 15 sn kaybolmadan kaldığında harcanan çözelti hacmi (Vt) kaydedildi. Ayrıca bal örneği olmaksızın şahit bir deney yapılarak titrasyonda kullanılan su ve indikatörün harcadığı titrisol hacmi (Vo) okundu. Son olarak, bal örneğinin tam karşılığı olan 0.05M NaOH titrisol hacmi (Vt-Vo) bulundu. Sonuçların Hesaplanması A= 1000 x M (NaOH çözeltisinin molaritesi, mmol/ml) x V (Harcanan NoOH hacmi, ml) M (Bal örneği kütlesi, g) Nem Tayini Bal örneklerindeki nem miktarı, IHC nin önerdiği metoda göre refraktometre (Atago-Master M, Japan) ile ölçüldü (Devillers ve ark., 2004; Anon., 2009c). Cam çubuk ile alınan bal örneklerinden refraktometrenin cam bölmesine konuldu. Yaklaşık 2 dk. sonunda rekraktif indeks, mercekli kısımdan bakılarak okundu. Refraktif indeks ile nem içeriğine ilişkin skaladan nem yüzdesi belirlendi Kül Tayini Bal örneklerinin kül tayini, kül fırınında IHC nin önerdiği metoda göre yapıldı (Anon, 2009c). Örnekler, g hassasiyetteki analitik terazide platin krozeye 2 g tartılarak kül fırınına (Protherm PFL/ 110, Türkiye) yerleştirildi. 350 ºC sıcaklıkta yaklaşık 1 sa. ön yakma işlemi yapılarak, sıcaklığı 600 ±25 ºC ye yükseltilen fırında yaklaşık 6 sa. süren yakma işlemi gerçekleştirildi. Kül fırınından çıkartılan krozeler, desikatöre

62 52 alınarak oda sıcaklığına soğutuldu. Krozeler tartılarak örneklerin kül miktarı hesaplandı. W A = ( (m 1 - m 2 ) / m 0 ) x 100 m 0= bal ağırlığı, g m 1 = kül ve kroze ağırlığı, g m 2= kroze ağırlığı, g Polen Tayini Bal örneklerinin polen analizi için cam bagetle homojen hale getirilmiş örneklerden 10 g alınarak tüplere aktarıldı ve 20 ml distile su ilave edildi. Balın su içinde çözünmesi için 45 C lik su banyosunda 10 dk bekletilen tüplere, polenlerin boyanmasını sağlayan bir kaç damla bazik fuksin ilave edilerek 4000 rpm de 45 dk santrifüj edildi. Santrifüj edilen tüplerin süpernatant kısmı dökülerek suların iyice süzülmesi sağlandı ve 0.1 ml kadar % 50 lik gliserin ilave edilerek dipteki çökeltinin gliserin ile homojen olarak karışması sağlandı. Lam üzerine alınan bir damla çözelti, lamel kapatılarak mikroskopta (Olympus BH2, Japonya) incelendi (Moar, 1985) İstatistiksel Analizler Çalışmada, fabrikalarından alınan çiçek ve salgı balı örneklerine ait HMF değeri ve diastaz aktiviteleri üzerine muhafaza süresinin etkisi tekrarlı ölçümlerde varyans analizi, muhafaza sıcaklığının etkisi ise tek yönlü varyans analizi ile belirlendi. Farklı sıcaklıklar ve süre farklılıkları, Duncan çoklu karşılaştırma testi ile değerlendirildi. İstatistiksel analizler SPSS for Windows 14.0 programı kullanılarak yapıldı.

63 53 3. BULGULAR Türkiye deki 5 farklı bal firmasından dolum tarihlerinde alınarak kalite kriterleri belirlenen 5 çiçek ve 5 salgı balı örneğinin HMF değeri ve diastaz aktiviteleri üzerine farklı muhafaza sıcaklıklarının etkisinin araştırıldığı bu çalışmada, ayrıca farklı satış noktalarından alınan 25 çiçek ve 25 salgı olmak üzere toplam 50 bal örneğinin HMF değeri ve diastaz aktiviteleri ile şeker (fruktoz, glikoz, sakkaroz) miktarları belirlenerek T.G.K. Bal Tebliği ne göre uygunlukları değerlendirilmiştir. Çiçek balı örneklerine ilişkin polen analizi yapılarak polen varlığı kalitatif olarak belirlenmiştir. Fabrikalarından alınan A, B, C, D ve E firmalarına ait çiçek ve salgı balı örneklerinin şeker (fruktoz, glikoz, sakkaroz, F/G, F+G), serbest asitlik, ph, nem, elektriksel iletkenlik, kül değerleri ile başlangıç (0. gün) HMF ve diastaz aktiviteleri saptanmıştır. Çizelge 3.1 ve Çizelge 3.2 de örneklerin kalite kriterlerine ilişkin analiz sonuçları incelenerek T.G.K. Bal Tebliği ne göre uygunlukları ortaya konulmuştur (Anon, 2012c). Çizelge Fabrikalardan alınan çiçek balı örneklerine ait kalite kriterleri Örnek adı Sakkaroz % m/m Fruktoz % m/m Glukoz % m/m Nem % Kül % Elektriksel iletkenlik ms/cm ph Asitlik meq/kg A B C D E Çizelge 3.2. Fabrikalarından alınan salgı balı örneklerine ait kalite kriterleri Örnek adı Sakkaroz %m/m Fruktoz %m/m Glukoz % m/m Nem % Kül % Elektriksel iletkenlik ms/cm ph Asitlik meq/kg A B C D E

64 54 Kalite kriterleri belirlenen çiçek ve salgı balı örneklerinin başlangıç (0. Gün) HMF değerleri ile belirli sıcaklıklarda ( 10±2 ºC, 22 ±2 ºC ve 35±2 ºC) muhafaza edilerek üç aylık periyotlar (3., 6., 9. ve 12. ay-ekim 2010, Ocak 2011, Nisan 2011 ve Temmuz 2011) sonunda saptanan HMF değerleri Çizelge 3.3. ve Çizelge 3.4. de, başlangıç diastaz aktiviteleri ile belirli sıcaklıklarda (10±2 ºC, 22 ±2 ºC ve 35±2 ºC) muhafaza edilerek üç aylık periyotlar (Ekim 2010, Ocak 2011, Nisan 2011 ve Temmuz 2011) sonunda belirlenen diastaz aktiviteleri Çizelge 3.5 ve Çizelge 3.6 de verilmiştir. Çizelge 3.3. Fabrikalardan alınan çiçek balı örneklerinin farklı muhafaza sıcaklıklarında, 3 ay aralıklarla değişen HMF değerleri HMF değeri (mg/kg) 0. gün 3. ay 6. ay 9. ay 12. ay 10±2 o C A 22±2 o C ±2 o C ±2 o C B 22±2 o C ±2 o C ±2 o C C 22±2 o C ±2 o C ±2 o C D 22±2 o C ±2 o C ±2 o C E 22±2 o C ±2 o C Çizelge 3.3 de görüldüğü gibi A, B, C, D ve E markalarına ait çiçek balı örneklerinin başlangıç HMF değerleri mg/kg arasında değişirken, 12. ay sonunda yapılan analizler sonucunda 10±2, 22±2 ve 35±2 C de muhafaza edilen örneklere ait HMF değerleri sırasıyla; , ve mg/kg arasında degişmiştir. Buna göre, 10±2 ve 22±2 C deki örneklerin HMF değeri T.G.K. Bal Tebliği de sınır değer olarak belirtilen 40 mg/kg ı aşmazken, 35±2 C de muhafaza edilen tüm örneklerin 6. aydan itibaren sınır değeri aştığı ortaya konulmuştur.

65 55 Çizelge 3.4. Fabrikalardan alınan salgı balı örneklerinin farklı muhafaza sıcaklıklarında, 3 ay aralıklarla değişen HMF değerleri HMF değeri (mg/kg) 0. gün 3. ay 6. ay 9. ay 12. ay 10±2 o C A 22±2 o C ±2 o C ±2 o C B 22±2 o C ±2 o C ±2 o C C 22±2 o C ±2 o C ±2 o C D 22±2 o C ±2 o C ±2 o C E 22±2 o C ±2 o C Çizelge 3.4 de görüldüğü gibi A, B, C, D ve E markalarına ait salgı balı örneklerinin başlangıç HMF değerleri mg/kg arasında değişirken, 12. ay sonunda yapılan analizler sonucunda 10±2, 22±2 ve 35±2 C de muhafaza edilen örneklere ait HMF değerleri sırasıyla; , ve mg/kg arasında belirlendi. Buna göre, 22±2 C deki D marka salgı balı hariç 10±2 ve 22±2 C de muhafaza edilen tüm örneklerin HMF değeri T.G.K. Bal Tebliği de sınır değer olarak belirtilen 40 mg/kg ı aşmazken, 35±2 C de muhafaza edilen C, D ve E marka salgı balının 6. aydan, A ve B marka salgı balının ise 9. aydan itibaren sınır değeri aştığı ortaya konuldu.

66 56 Çizelge 3.5. Fabrikalardan alınan çiçek balı örneklerinin farklı muhafaza sıcaklıklarında, 3 ay aralıklarla değişen diastaz aktiviteleri Diastaz aktivitesi 0.gün 3. ay 6. ay 9. ay 12. ay 10±2 o C A 22±2 o C ±2 o C ±2 o C B 22±2 o C ±2 o C ±2 o C C 22±2 o C ±2 o C ±2 o C D 22±2 o C ±2 o C ±2 o C E 22±2 o C ±2 o C Çizelge 3.5 incelendiğinde; A, B, C, D ve E markalarına ait çiçek balı örneklerinin başlangıç (0. gün) diastaz aktiviteleri arasında değişirken, 12. ay sonunda yapılan analizler sonucunda 10±2, 22±2 ve 35±2 C de muhafaza edilen örneklere ait diastaz aktiviteleri sırasıyla; , ve arasında belirlendi. Buna göre, 10±2 ve 22±2 C deki örneklerin diastaz aktiviteleri T.G.K. Bal Tebliği de sınır değer olarak belirtilen 8 in altına düşmezken, 35±2 C de muhafaza edilen tüm örneklerin diastaz aktiviteleri sınır değerin altında bulundu. Çizelge 3.6 da ise yine A, B, C, D ve E markalarına ait salgı balı örneklerinin başlangıç (0. gün) diastaz aktiviteleri arasında değişirken, 12. ay sonunda yapılan analizler sonucunda 10±2, 22±2 ve 35±2 C de muhafaza edilen örneklere ait diastaz aktiviteleri sırasıyla; , ve arasında saptandı. Elde edilen bulgulara göre, 35±2 C deki D marka salgı balı hariç 10±2, 22±2 ve 35±2 C muhafaza edilen tüm örneklerin diastaz aktiviteleri, T.G.K. Bal Tebliği ne uygun bulundu. D marka salgı balına ait diastaz aktivitesi, 7.9 olarak sınır değerin altında saptandı.

67 57 Çizelge 3.6. Fabrikalardan alınan salgı balı örneklerinin farklı muhafaza sıcaklıklarında, 3 ay aralıklarla değişen diastaz aktiviteleri Diastaz aktivitesi 0. gün 3. ay 6. ay 9. ay 12. ay 10±2 o C A 22±2 o C ±2 o C ±2 o C B 22±2 o C ±2 o C ±2 o C C 22±2 o C ±2 o C ±2 o C D 22±2 o C ±2 o C ±2 o C E 22±2 o C ±2 o C Çizelge 3.7 ve Şekil 3.1 de görüldüğü gibi muhafaza süresine bağlı olarak her bir sıcaklıkta çiçek ve salgı balı örneklerinin ortalama HMF değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış bulundu. Bu artışın 3. aydan itibaren belirgin düzeyde olduğu belirlendi (p< 0.001). Çiçek ve salgı balı örneklerinde muhafaza süresi boyunca ortalama HMF değerleri karşılaştırıldığında 10±2 ve 22±2 C deki HMF değerleri arasındaki farklılık birbirine yakın bulunurken 35±2 C de muhafaza edilen balların ortalama HMF değerlerinde belirgin bir artış görüldü (p< 0.001). Çizelge 3.7. Fabrikalardan alınan bal örneklerinin zamana ve sıcaklığa göre değişen ortalama HMF değerleri (mg/kg) Sıcaklık Değerleri Bal Türü (n=5) Başlangıç 3. Ay 6. Ay 9.Ay 12. Ay x x x x x sx sx sx sx sx 10 ± 2 C Çiçek 15.66± ± ± ± ±2.14 Salgı 16.20± ± ± ± ± ± 2 C Çiçek 15.66± ± ± ± ±2.89 Salgı 16.20± ± ± ± ± ± 2 C Çiçek 15.66± ± ± ± ±10.63 Salgı 16.20± ± ± ± ±10.44 x : ortalama±standart hata sx

68 58 Şekil 3.1. Çiçek ve Salgı ballarında farklı sıcaklıklarda zamana göre değişen ortalama HMF değerleri Çizelge 3.8 incelendiğinde, çiçek ve salgı balı örneklerinin ortalama diastaz aktivitelerinde, muhafaza süresine bağlı olarak her bir sıcaklıkta istatistiksel olarak anlamlı bir azalış görüldü. Bu azalışın 6. aydan itibaren belirgin düzeyde olduğu saptandı (p< 0.001). Muhafaza süresi boyunca, örneklerin azalan ortalama diastaz aktiviteleri karşılaştırıldığında 10±2 ve 22±2 C deki değerler arasındaki farklılık istatistiksel olarak birbirine yakın bulunurken, 35±2 C deki diastaz aktivitelerinde belirgin düzeyde azalma görüldü (p< 0.001). Çizelge 3.8. Fabrikalardan alınan bal örneklerinin zamana ve sıcaklığa göre değişen ortalama diastaz değerleri Sıcaklık Değerleri Bal Türü (n=5) Başlangıç 3. Ay 6. Ay 9.Ay 12. Ay x x x x x sx sx sx sx sx 10 ± 2 C Çiçek 12.38± ± ± ± ±0.63 Salgı 14.86± ± ± ± ± ± 2 C Çiçek 12.38± ± ± ± ±0.49 Salgı 14.86± ± ± ± ± ± 2 C Çiçek 12.38± ± ± ± ±0.18 Salgı 14.86± ± ± ± ±0.50 x : ortalama±standart hata sx