FARE EMBRİYOLARI İLE PARTENOTLARININ GELİŞİMSEL POTANSİYELLERİ VE MORFOLOJİK ÖZELLİKLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI. Arş. Gör. İrem MATUR YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI FARE EMBRİYOLARI İLE PARTENOTLARININ GELİŞİMSEL POTANSİYELLERİ VE MORFOLOJİK ÖZELLİKLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Arş. Gör. İrem MATUR YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. Suna SOLMAZ ADANA-2009

2 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI FARE EMBRİYOLARI İLE PARTENOTLARININ GELİŞİMSEL POTANSİYELLERİ VE MORFOLOJİK ÖZELLİKLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Arş. Gör. İrem MATUR YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. Suna SOLMAZ Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TF2007YL9 nolu proje olarak desteklenmiştir. Tez No:. ADANA-2009

3 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim süresince her konuda yanımda olan, manevi yönden desteğini hissettiren; tez konumun seçilmesi, yürütülmesi ve tamamlanmasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Suna Solmaz a; eğitimim sırasında, yardımlarını ve desteğini esirgemeyen Anabilim Dalı Başkanımız Prof. Dr. Sait Polat a saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Deneylerimin yürütülmesi esnasında, tüm laboratuvar imkanlarından faydalanmamı sağlayan ve laboratuvar çalışmalarımda önerileri ile bana yol gösterici olan Fizyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden Sayın Doç. Dr. Şeref Erdoğan a, yardımları için Biyoistatistik Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden Prof. Dr. Nazan Z. Alparslan a ve deneysel çalışmalar sırasında paylaştığı bilgileri ve manevi desteği ile yanımda olan Fizyoloji Anabilim Dalı ndan Uzm. Dr. Ayper Boğa Pekmezekmek e sonsuz teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım. Ayrıca yüksek lisans eğitimim sırasında bana her zaman destek olan Anabilim Dalımız Öğretim Üyelerine ve tezimin hazırlanmasında emeği geçen bütün akademik ve idari personeline teşekkür ederim. Varlıkları ile kendimi şanslı ve güvende hissetmemi sağlayan, her türlü konuda yanımda olarak beni cesaretlendiren hayatımdaki en önemli insanlar babam Ali Matur, annem Neval Matur ve ağabeyim M. Arda Matur a; ayrıca hayatıma renk katan ve beni mutlu kılan tüm arkadaşlarıma çok teşekkür ederim. Arş. Gör. İrem Matur iii

4 İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vi ÇİZELGELER DİZİNİ vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ix ÖZET xi ABSTRACT xii 1.GİRİŞ 1 2.GENEL BİLGİLER Farede Oositin Yapısı ve Oositte Gerçekleşen Olaylar Farede Embriyo Oluşumu, Gelişimi ve Yapısı Farede Oosit ve Embriyo İnce Yapısı Oosit İnce Yapısı Embriyo İnce Yapısı Partenogenetik Aktivasyon Partenot İnce Yapısı CZB (Chatot-Ziomek-Bavister) Solüsyonu İn Vitro Ortam 18 3.GEREÇ VE YÖNTEM Deney Hayvanlarının Özellikleri ve Gruplandırılmaları Süperovülasyon Protokolü Embriyoların Toplanması Oositlerin Elde Edilmesi ve Partenogenetik Aktivasyon Uygulanması Gelişim Takibi ve Işık Mikroskobik Değerlendirme Elektron Mikroskopi Yöntemi İstatistiksel Analiz 24 4.BULGULAR Gelişim Potansiyelleri Embriyoların Gelişim Takibi Partenotların Gelişim Takibi Embriyo ve Partenotların Gelişimsel Potansiyellerinin İstatistiksel Değerlendirilmesi Işık Mikroskobik Değerlendirme Embriyoların Işık Mikroskobik Değerlendirilmesi Embriyo: Pronüklear Evre Embriyo: İki Hücreli Evre Embriyo: Dört Hücreli Evre Embriyo: Sekiz Hücreli Evre Embriyo: Morula Evresi Embriyo: Blastokist Evresi Partenotların Işık Mikroskobik Değerlendirilmesi Partenot: İki Hücreli Evre 39 iv

5 Partenot: Dört Hücreli Evre Partenot: Sekiz Hücreli Evre Partenot: Morula Evresi Elektron Mikroskobik Değerlendirme Embriyo İnce Yapısı Embriyo: Pronüklear Evre Embriyo: İki Hücreli Evre Embriyo: Dört Hücreli Evre Embriyo: Sekiz Hücreli Evre Partenot İnce Yapısı Partenot: İki Hücreli Evre Partenot: Dört Hücreli Evre 65 5.TARTIŞMA 69 6.SONUÇLAR 80 7.KAYNAKLAR 82 8.ÖZGEÇMİŞ 86 v

6 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil-1: Embriyo kalitelendirme sistemi. Şekil-2: Pronüklear evrede elde edilen embriyolar ile partenotların günler itibariyle gelişimlerinin dağılımı. Şekil-3: Pronüklear embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-4: İki hücreli embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-5: Dört hücreli embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-6: Sekiz hücreli embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-7: Morula evresindeki embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-8: Blastokist evresindeki embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-9: İki hücreli partenotların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-10: Dört hücreli partenotların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-11: Sekiz hücreli partenotların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-12: Morula evresindeki partenotların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Şekil-13: Pronüklear embriyo ve atılan kutup cisimciği. Şekil-14: Pronüklear embriyoda kortikal bölge. Şekil-15: Pronüklear embriyoda perinüklear bölge. Şekil-16: İki hücreli embriyoda kortikal bölge. Şekil-17: İki hücreli embriyoda blastomerlerin karşılaşma bölgesi. Şekil-18: İki hücreli embriyoda çekirdek ve perinüklear bölge. Şekil-19: Dört hücreli embriyoda bir blastomerin genel görüntüsü. Şekil-20: Dört hücreli embriyoda kortikal bölge. Şekil-21: Dört hücreli embriyoda kortikal bölge. Şekil-22: Dört hücreli embriyoda kortikal ve ara bölgeler. Şekil-23: Sekiz hücreli embriyoda komşu blastomerlerin kortikal bölgeleri. Şekil-24: Sekiz hücreli embriyoda ara ve perinüklear bölge. Şekil-25: İki hücreli partenotlarda komşu blastomerlerin kortikal ve ara bölgeleri. Şekil-26: İki hücreli partenotta kortikal bölge. Şekil-27: İki hücreli partenotta perinüklear bölge. Şekil-28: Dört hücreli partenotta kortikal ve ara bölgeler. vi

7 Şekil-29: Dört hücreli partenotta kortikal ve ara bölgeler. Şekil-30: Dört hücreli partenotta çekirdek ve perinüklear bölge. vii

8 ÇİZELGELER DİZİNİ Tablo-1: CZB medyumu Tablo-2: CZB HEPES medyumu Tablo-3: CZB Sr medyumu Tablo-4: Embriyoların gelişim potansiyelleri. Tablo-5: Partenogenetik aktivasyon uygulanmış oositlerin gelişim potansiyelleri. viii

9 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ BSA CaCMKII COC CSF CZB DNA EDTA FSH GER GnRH GV GVBD hcg InsP 3 InsP 3 R KC KCl LH MAPK MII oosit MIII oosit MPF NaCl NPC PBS PMSG PN PVB SB Sığır serum albümini Kalsiyum-Kalmodulin bağımlı protein kinaz II Kümülüs-oosit kompleksi Sitostatik faktör Chatot-Ziomek-Bavister Deoksiribonükleik asit Etilendiamintetraasetikasit Follikül uyarıcı hormon Granüler endoplazmik retikulum Gonadotropin salgılatıcı hormon Germinal vezikül Germinal vezikül yıkımı İnsan koriyonik gonadotropini İnositol 1,4,5-trifosfat İnositol 1,4,5-trifosfat reseptörü Kutup cisimciği Potasyum klorür Lüteinize edici hormon Mitojenler tarafından aktive edilen protein kinaz Metafaz II oosit Metafaz III oosit Olgunlaşmayı ilerletici faktör Sodyum klorür Nükleolus prekürsörü cisim Fosfat tampon solüsyonu Gebe kısrak serum gonadotropini Pronükleus Perivitellin boşluk Sitokalazin B ix

10 SER Sr SrCl 2 ZP 6-DMAP Agranüler endoplazmik retikulum Stronsiyum Stronsiyum klorür Zona pellusida 6-Dimetilaminopürin x

11 ÖZET Fare Embriyoları ile Partenotlarının Gelişimsel Potansiyelleri ve Morfolojik Özelliklerinin Karşılaştırılması Bu çalışmada, in vitro koşullarda elde edilen insan embriyolarının deneysel amaçlarla kullanımı ile ilgili etik ve legal kaygılar temel alınarak doğal fare embriyoları ile fare oositlerinden partenogenetik aktivasyon protokolleri ile üretilen partenotların gelişimsel ve morfolojik olarak karşılaştırılması ve partenotların ne ölçüde embriyo yerine kullanılabileceğinin saptanması amaçlanmıştır. Çalışmada, 80 adet dişi ve 20 adet erkek olmak üzere toplam 100 adet fare kullanıldı. Süperovulasyon sonrası farelerin yarısından, doğal yolla fertilize olmuş preimplantasyon evresindeki embriyolar; kalan yarısından ise toplanan oositlerin stronsiyum ve sitokalazin B içeren medyum içerisinde aktive edilmesini izleyerek diploid partenotlar elde edildi. İki grup hem gelişimsel yönden izlendi ve ışık mikroskop altında değerlendirildi, hem de ince yapı düzeyinde incelendi. Gelişim takibi sonucu pronüklear aşamada elde edilen embriyolardan, ertesi gün %89,19 u gelişimlerine devam etti ve 5. gün %43,24 ü blastokist evresine ulaştı. Partenot eldesi için oviduktlardan toplanan olgun oositlerden %31,88 oranında aktivasyon başarısı elde edildi. Dördüncü gün kontrolünde %3,75 inin canlılıklarını korudukları ve 2 tanesinin (%2,50) morula evresine ulaştığı görüldü. Embriyolar ile partenotların gelişimleri karşılaştırıldığında, partenot potansiyelinin ilerleyen günlerde belirgin olarak azaldığı izlendi. Ultrastrüktürel olarak incelendiğinde, hem embriyolar hem de partenotların kortikal, ara ve perinüklear yerleşimli organel topluluklarına sahip oldukları ve bu topluluklar dahilinde mitokondriyonlar başta olmak üzere, lipid damlacıkları, lizozomal yapılar, ribozomlar, miyelin yapılar, agranüler ve granüler endoplazmik retikulum, fibriler kafes ve veziküler yapıların yer aldığı izlendi. Ayrıca gelişim ilerledikçe embriyolarda multiveziküler cisimcik ve kristalloid yapıların görülmeye başlandığı fark edildi. Partenotlarda, ileri evre embriyolarda görülen benzer oluşumlar yanısıra kristalloidler ile ilişkili organelsiz bölgeler gelişimin daha erken evrelerinde yer almakta idi. Sonuç olarak; özellikle gelişimin ilk gününde partenotlar ile embriyoların gelişimsel potansiyelleri istatistiksel olarak anlamlı şekilde benzer bulundu(p=0,98102). Ancak, ışık mikroskobik olarak hem embriyo hem de partenotlar, blastomer boyutu ve regülaritesi, blastomer sitoplazmasının granülaritesi ve fragmentasyon kriterlerine göre değerlendirildiğinde, ilerleyen günlerde partenotlarda gelişme geriliği izlendi. Ultrastrüktürel olarak da özellikle partenotlarda, multiveziküler cisimciklerde, miyelin ve kristalloid yapılarda artış, perinüklear bölgede organellerin azalması ve organelsiz bölgelerin ortaya çıkması, gibi dejeneratif belirtilerin embriyolara kıyasla daha erken evrelerde görülmeye başladığı dikkati çekti. Anahtar Kelimeler: Embriyo, Fare, Gelişim, Morfoloji, Partenot xi

12 ABSTRACT Comparison of Developmental and Morphological Properties of Mouse Embryos and Parthenotes This study is based on the ethical and legal obstacles about using human embryos in experimental studies in vitro. In this work, developmental and morphological properties of mouse embryos obtained by natural fertilization and parthenotes produced by parthenogenetic activation protocols were determined to compare the probability of using parthenotes instead of embryos. We used 80 female and 20 male mice. Naturally fertilized preimplantation stage embryos and diploid parthenotes activated in the medium containing SrCl 2 and Cytochalasin B were obtained from female mice after superovulation protocols. These two groups were monitored by light and electron microscopic techniques to evaluate their developmental aspects and ultrastructural features. The rate of development of pronuclear embryos on the first day was 89.19% and the rate that reached the blastocyst stage on the 5 th day was 43.24%. The success rate of activation of the mature oocytes picked up from oviducts was 31.88%. On day 4, 3.75% of the parthenotes were still alive and 2 of them (%2.50) reached the morula stage. The developmental potential of parthenotes reduced in the progressive days when compared with the developmental potential of the embryos. Both embryos and parthenotes owned organelle groups in cortical, mid and perinuclear reigons. These organelle groups included mitochondria, lipid droplets, lisosomal structures, ribosomes, smooth and granular endoplasmic reticulum, fibrillar lattice and vesicles. Moreover, multivesicular bodies, myelin figures and crystalloids became visible in advanced stage embryos and even earlier in parthenotes. Crystalloid related organelle-free areas attracted attention in parthenotes which began to be visible in the earlier stages. In conclusion, the developmental potentials of embryos and parthenotes especially in the early stages were statistically similar and significant (p=0,98102). But in the following days, light microscopic observations according to the criteria of blastomere size and regularity, cytoplasmic granularity and fragmentation revealed that growth retardation in the developmental potential of parthenotes was conspicious. Also, ultrastructurally, degenerative signs such as increased myelin figures, multivesicular bodies, crystalloids, organelle-free areas; in addition to the decreased amount of organelles in perinuclear regions were evaluated earlier in developmental stages of parthenotes compared to embryos. Key words: Development, Embryo, Morphology, Mouse, Parthenote xii

13 1. GİRİŞ Özellikle günümüz tedavi yöntemleri arasında önemli yere sahip olan doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanlarında kullanılan kök hücreler arasında, her türlü hücre ve dokuya dönüşebilme yetenekleri nedeniyle embriyonik kök hücreler oldukça büyük bir öneme sahiplerdir. Bununla birlikte embriyonik kök hücre çalışmalarında canlı embriyolar kullanılması gerektiğinden, bu konuda etik ve legal birçok engelle karşılaşılmaktadır 1. Bu tip engelleri aşabilmek için, canlı embriyolar yerine alternatif olarak partenogenetik aktivasyon uygulanmış oositlerin kullanılabilirliği akla gelmektedir. Partenogenez, alt türlerde yeni bireylerin oluşumu ile sonuçlanabilen, bir spermatozoon etkisi olmaksızın gerçekleşen embriyonik gelişim sürecidir. Aktivasyon uygulaması; klonlama ve kök hücre çalışmalarında, fertilizasyon ve erken embriyonik gelişim mekanizmalarının anlaşılması ve açıklığa kavuşturulmasında önemli bir adım olarak görülmektedir 2,3,4. Ayrıca elde edilen bilgilerin, in vitro fertilizasyon (IVF) kliniklerinde karşılaşılan başarısız intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) uygulamalarında, enjekte edilen spermin oositi aktive edememesi gibi durumlarda yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine ve dolayısıyla infertilite tedavisine katkı sağlayacağı düşünülmektedir 5. Fertilizasyon esnasında gerçekleşen oositlerin aktivasyon mekanizması, üreme biyolojisi konusunda uzun yıllar çalışılmış ancak hala tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Genel olarak fertilizasyon; kortikal granül ekzositozu, zigotik genomun aktivasyonu, polisperminin engellenmesi ve oositin mayotik bölünmesine devam ederek ikinci mayozu tamamlaması gibi olayları kapsamaktadır. Birçok tür üzerinde yapılan araştırmalar, fertilizasyon sırasındaki oosit aktivasyonunun, ooplazmik kalsiyum konsantrasyonundaki artışla bağlantılı olduğunu göstermektedir. Memelilerde bu kalsiyum miktarındaki artış, bir seri karakteristik dalgalanma şeklinde kendini göstermektedir 5. Partenogenez çalışmalarında kullanılan çeşitli ajanların yanısıra, fare oositlerinin aktivasyonunda kullanılan en popüler ve en çok verim elde edilen kimyasal ajan stronsiyumdur. Stronsiyum kimyasalı, fertilizasyonu taklit eder nitelikte çoklu kalsiyum dalgalanmaları oluşturur. Bu çeşit dalgalanma, oositin metafaz 1

14 duraklamasından çıkarak ikinci mayoz bölünmesini tamamlamasını sağlamakla kalmayıp, aynı zamanda embriyonun gelişimini kolaylaştırmaktadır 2,6,7. Partenogenetik aktivasyon yöntemlerini iyileştirme ve geliştirme çabalarına karşın, partenotların, in vitro koşullarda düşük gelişimsel potansiyele sahip oldukları bilinmektedir. Düşük metabolik aktivite, kromozomal anomali görülme sıklığında artış ya da paternal genom yokluğu gibi nedenlere bağlanan gelişimlerindeki bu yetersizlik, aynı zamanda partenotlardan bugüne kadar doğum elde edilememesine de neden olarak gösterilmektedir 8. İnsan oositleri dahil aktivasyon uygulanan diğer memelilerin oositlerinde, partenotların gelişebildiği en ileri düzey blastokist evresi olarak rapor edilmiştir 4. Literatürde az da olsa partenotların ince yapıları incelenmiş olmasına rağmen, stronsiyum kimyasalı ile partenogenetik aktivasyon uygulanarak elde edilen partenotlar ile doğal yolla fertilizasyon sonucu elde edilen embriyoların elektron mikroskobik düzeylerinin karşılaştırıldığı bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada aynı zamanda, iki ana grubun gelişimleri ışık mikroskop altında izlenerek gelişimsel potansiyelleri de karşılaştırılmıştır. Bu sayede partenotların, deneysel çalışmalarda karşılaşılan engelleri aşabilmek adına canlı embriyolara ne derece alternatif olarak kullanılabilecekleri konusuna katkı sağlanması amaçlanmıştır. 2

15 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Farede Oositin Yapısı ve Oositte Gerçekleşen Olaylar Dişi farelerin üreme hücresi olan oosit, fare puberteye ulaşana dek primordial follikül içerisinde primer oosit olarak adlandırılan aşamada beklemektedir. Primordial follikül; primer oosit ve onu tek tabaka halinde çevreleyen yassı folliküler hücrelerden oluşmaktadır. Bu aşamadaki oosit, I. mayoz bölünmenin profaz aşamasında duraklamış vaziyettedir. Dişi farenin puberteye girmesiyle, salgılanan hormonlar sayesinde her estrusta birkaç tane olmak üzere oositler mayoza kaldıkları yerden devam ederler 9,10. Gebelik, yalancı gebelik ya da başka bir nedenden ötürü (örneğin hormonal bir düzensizlik) kesintiye uğramadığı sürece, dişi fare her 4 5 günde bir, periyodik estrus siklusları sergiler. Bu sikluslar; sonuç olarak fertilizasyonu amaçlayan, hipotalamus, hipofiz ve ovaryumdan salgılanan hormonların etkileşimi ile salgısal, anatomik ve davranışsal değişimlere neden olan ritmik olaylardır 10. Estral sikluslar, farelerde 4 aşamada incelenir. Proestrus ve estrus; aktif büyümenin, ovulasyon, fertilizasyon ve implantasyonun gerçekleştiği aşamalardır. Onu takip eden metestrus; dejeneratif değişikliklerin gerçekleştiği aşamadır. Metestrusu diestrus takip eder; bu evrede pasif ve yavaş büyüme görülür 10,11. Folliküllerin en erken aşaması sayılabilecek primordial folliküllerin sayısı zamanla ovulasyon ve atrezi nedeniyle gittikçe azalır, ardından tükenir 10. Hipotalamustan salgılanan gonadotropin salgılatıcı hormonun (GnRH) etkisi altında ön hipofizden salınan follikül uyarıcı hormon (FSH) ve bir miktar lüteinize edici hormon (LH), ovaryumda follikülerin gelişimini uyarırlar 9,10,11,12. FSH, follikül gelişimini ilerletirken; LH, olgun follikülün son gelişim aşamalarına katkı sağlar ve östrojen üretimini uyarır. Folliküller, gelecek ovulasyon için büyümeye ve gelişmeye diestrus evresinde başlarlar 10,13. Preantral follikül içerisinde gelişen oositler; olgunlaşma, fertilizasyon ve implantasyon öncesi embriyo gelişimi için gereken kaynakları biriktirirler. Örneğin, zona pellusida glikoproteinleri preantral follikül oositleri tarafından sentezlenir ve salgılanır. Bununla birlikte, ileride fertilizasyon sonrası salınımı ile polispermi blokajı sağlayacak olan membran bağımlı-salgı vezikülleri olan kortikal granüller de folliküler 3

16 gelişimin başlangıcında Golgi apparatustan salgılanır 14. Ayrıca her ne kadar bu aşamadaki oositler, mayozu tamamlama yeteneğine sahip olmasalar da, bunun için gerekli moleküller olan siklin B ve mitojenler tarafından aktive edilen protein kinazı (MAPK) sentezlerler 13. Hormonal uyarım etkisi ile mayoz bölünmesini tamamlama yeteneği kazanmış olan oositlerde, germinal vezikül yıkımı (GVBD) olarak adlandırılan nüklear kılıfın ve çekirdekçiğin kaybolduğu olaylar görülür ve sonrasında kromozomlar kondanse olarak metafaza ilerlerler 13. Germinal vezikül yıkımından önce hücre sitoplazmasında, bir regülatör komponent olan siklin B ve katalitik bir alt ünite olan p34 cdc2 den meydana gelen olgunlaşmayı ilerletici faktör (MPF) aktivitesi hızla artmaya başlar ki bu sayede nüklear kılıfın yıkımı ve kromozom kondansasyonu gerçekleşir. MPF, kromozomların mayotik iğ üzerinde ekvatoriyal düzlemde dizildiği evre olan 1. mayozun metafazı süresince yüksek kalır. Anafaz ve telofazda yeniden düşer, ancak 2. mayozun metafazında tekrar artar 15. Oosit mayoz bölünmesine devam ederken etrafındaki folliküler hücreler önce kübik ya da alçak prizmatik hücrelere dönüşür, ardından da mitoz bölünme ile çok tabakalı bir yapı kazanırlar. Bu küçük bazofilik folliküler hücreler granüloza hücreleri; oluşturdukları çok katlı yapı stratum granülozum adını alır ve follikül artık primer follikül olarak adlandırılır. Bu aşamada oosit ve granüloza hücreleri arasında aselüler, saydam bir yapı olan zona pellusida oluşumu gözlenir 9,10,12,16. Zona pellusida; yaklaşık 7 µm kalınlığında 16, glikozaminoglikan ve ZP1, ZP2 ve ZP3 olarak tanımlanmış üç glikoproteinden oluşan ve türe özgü olarak spermatozoonun tanınması, akrozom reaksiyonunun indüksiyonu, spermatozoonun oosit içine penetrasyonu, polisperminin engellenmesi, oositlerin füzyonu olayının engellenmesi (mozaizm üretme çalışmalarında uygulandığı gibi) 17 ve implantasyon öncesi blasmoterlerin kaybı ya da blastokistin çeşitli patojenlere karşı korunması gibi önemli fonksiyonlara sahiptir 18,19,20. Follikül gelişimine devam ederken granüloza hücrelerinin çevresinde stroma hücrelerinden kaynaklanan bir kılıf oluşmaya başlar. Bu kılıf, içte gevşek düzenlenmiş, en önemli fonksiyonu östrojen salgılamak olan hücrelerden oluşan oldukça vasküler teka interna ve dışta herhangi bir salgılama fonksiyonu olmayan hücrelerin daha sıkı bir şekilde bir arada olduğu fibröz teka eksternaya farklanır, kılıfın tamamı teka folliküli ismini alır. Teka folliküli ve granüloza hücreleri, birbirlerinden bir bazal lamina ile ayrılırlar. Bu aşamada granüloza hücreleri arasında içi sıvı ile dolu düzensiz boşluklar 4

17 oluşur. Sekonder ya da antral follikül olarak adlandırılmaya başlanan bu follikülde, follikül sıvısı ile dolu boşluklar gelişim devam ettikçe genişler, follikül sıvısının miktarı artar ve boşluklar birleşerek içi sıvı ile dolu antrum denilen tek bir boşluk oluştururlar 9,10,11,12. Follikül sıvısı ya da likör folliküli, hiyaluronandan zengin bir sıvıdır 9. Sekonder follikül gelişmeye devam ettikçe, oosit ve etrafında bulunan granüloza hücreleri follikül içerisinde bir kenara çekilmiş ve antruma doğru bir şişkinlik oluşturmuş duruma gelirler; granüloza hücreleri kümülüs ooforus, oositle beraber oluşturdukları kompleks ise kümülüs-oosit kompleksi (COC) adını alır. Kümülüs ooforusun en iç tabakasındaki prizmatik hücreler, radyal düzenlenmelerinden ötürü korona radiata olarak adlandırılırlar 9,10,12. Korona radiatadan oosite doğru olan uzantılar, zona pellusidayı aşarak oosit yüzeyindeki mikrovilli ile oluklu bağlantılar aracılığıyla iletişimdedir 9. Antrum genişledikçe, follikül sıvısı miktar olarak artar, kümülüs-oosit kompleksini bir tarafından granüloza hücreleriyle bağlantılı kalacak şekilde sarar ve visköz bir hal alır. Antrumun büyümesiyle beraber follikül de büyür ve oositi ovaryumun stigma denilen bölgesinden periovaryan boşluğa atmak üzere ovaryum yüzeyine iyice yaklaşır 9,10. Atılmaya hazır, olgun follikül Graff follikülü ismini alır ve bu follikülün görüldüğü aşama, proestrustur 10,11. Olgun follikül yaklaşık 125µm çapa sahipken, içerisindeki oosit 70µm çapa ulaşmıştır 10. Ovulasyondan önce oosit, son olgunlaşma aşamalarına girerek birinci mayoz bölünmesini tamamlar ve birinci polar cisimciğini atar. İkinci mayoz bölünme başlar ancak metafazda duraklar. Ve oosit sperm tarafından fertilize olana dek bu aşamada kalır 12. İkinci mayoz bölünmenin metafazındaki bu duraklama, bir sitostatik faktör (CSF) etkisi ile sürdürülen yüksek bir olgunlaşmayı ilerletici faktör (MPF) aktivitesi ile sağlanır 21. Follikül gelişiminin son aşamalarında, oositi çevreleyen hücrelerin aralarının, hiyaluronik asitten zengin hücrelerarası sıvı girmesiyle bir miktar açılmaya ve hücrelerin nispeten daha gevşek bir şekilde toplanmaya başladıkları görülür. Kan akışı ovulasyon bölgesinde giderek azalır, ardından yok olur, follikül şeffaf bir görünüm kazanır. Germinal epitel bu bölgede düzensizleşir ve stroma giderek incelir. Oldukça incelmiş teka folliküli ve germinal epitel ile periovaryan boşluktan ayrılan bu olgun follikül, ön hipofizden ikinci bir LH salgılanmasıyla, içerisinde bulunan kümülüs-oosit kompleksini periovaryan boşluğa atar 12. LH salgısı etkisindeki follikülde oositin çapında önemli bir değişiklik olmaz ancak follikülün çapı ovulasyon öncesi 550µm ye ulaşmıştır 10. Ovulasyon, estrus evresinde gerçekleşir 10,11. Atılan oositin oolemma adı 5

18 verilen membranının dışında; zona pellusida, follikül hücrelerinin oluşturduğu topluluk olan kümülüs ooforus ve bu hücrelerin aralarında asidik mukopolisakkarit, hiyaluronik asit, protein içerikli bir matriks bulunur. Follikülden geriye kalan kısım, iki önemli steroid hormon olan progesteron ve bir miktar da östrojen salgılamakla görevli korpus luteumdur. Ovulasyondan sonra stigma bölgesi epiteli onarılır, granüloza hücreleri hipertrofik hal alır ve bağ dokusu ve kapillerler antrumu kapatacak şekilde teka interna içerisine ilerler 10. Daha önce küçük ve bazofilik sitoplazmalı, büyük bir çekirdeğe sahip olan granüloza hücreleri, daha sonra vakuollü eozinofilik sitoplazma içeren, büyük veziküler tip çekirdeğe sahip, poligonal lutein hücrelerine dönüşürler 9,10. Her estrusta birkaç follikül olgunlaştığından, aktif ovaryumda birkaç korpus luteum görmek mümkündür. Bu, metestrus aşamasıdır. Ovulasyonla atılan oosit eğer implante olursa korpus luteum varlığını sürdürür ancak fertilizasyon gerçekleşmezse geriler ve giderek atretik hale gelir. Bunun dışında birçok oosit ya da follikül de gelişimin çeşitli aşamalarında olgunlaşmaya devam etmez, atreziye gider. Atretik follikül, piknotik hücreleri ve fragmente olmuş oositi ile karakterizedir. Kortekste folliküller dışında bulunan interstisyel hücreler morfolojik olarak olgun lutein hücrelerine benzerler. Kökenleri tam olarak bilinmese de, hipertrofik stromal hücrelerden, korpora lutea kalıntılarından ve teka interna hücrelerinden kaynaklanıyor olabilirler 10. Ovulasyon ile atılan oosit, oviduktun fimbria denilen parmaksı çıkıntıları sayesinde tutularak fertilizasyonun gerçekleşeceği ampulla bölgesine iletilir. Ovulasyondan 10 ila 12 saat sonrasına kadar, atılan oosit, fertilize olma ve normal embriyo oluşturma yeteneğini korur 10. Spermin ampullaya ulaşması bazen 5 dakika kadar kısa zaman alabilir ancak bu spermler fertilizasyon için gereken kapasitasyon olayını bir saatten önce tamamlayamadıklarından dölleme yeteneğinde değillerdir 16. Sperm genellikle ovulasyon olduğu sırada ampullada hazır olarak beklemektedir ancak sperm oosite penetre oluncaya kadar birkaç saat gecikme olur. Sperm 8 saat dölleme yeteneğini korur ancak fertilizasyon olayı çiftleşmeden sonra yaklaşık 6 saat içinde gerçekleşmektedir 11. 6

19 2.2. Farede Embriyo Oluşumu, Gelişimi ve Yapısı Spermin akrozomundan salınan enzimlerin hücrelerarası maddeyi depolimerize etmesiyle kümülüs ooforusun dağılması sağlanır 12. Spermin kümülüs kompleksini ve zona pellusidayı geçmesi yaklaşık 1 saat alır 11. Daha fazla sayıda sperm perivitellin boşluğa girse de çoğunlukla yalnızca bir sperm oosite penetre olup onu döller. Zona pellusidanın motil sperm ile penetrasyon noktası, spermatozoonun zona pellusida üzerindeki reseptörlere bağlanması ile başlayan akrozom reaksiyonu sonucu akrozomdan salınan hiyaluronidaz enzimi ile eritilir ve sperm perivitellin boşluğa girer 9,10. Sperm, bu noktadan sonra hareketliliğini kaybeder 12. Oolemmanın büzülmesi ve zona pellusidanın ise genişlemesi ile oluşan perivitellin boşlukta sperm yaklaşık 50 dakika kalır 10. Daha sonra oolemmaya penetre olan sperm, oolemmada öncelikle yaklaşık 1 dakika süren geçici ve büyük bir depolarizasyon dalgası ile elektriksel olarak polispermiye karşı blokaj oluşturur. Ardından oolemmadaki bu değişiklik, ooplazmik depolardan kalsiyum salınımını uyarır ve oosit korteksindeki kortikal granüller kalsiyuma bağımlı olarak oolemma yüzeyinden ekzositozla perivitellin boşluğa bırakılırlar. Kortikal granül kaynaklı glikozidaz içeriği, zona pellusidada primer sperm reseptörü görevi olan ZP3 glikoproteinlerinde; proteaz içeriği ise, ZP2 glikoproteinlerinde değişikliğe neden olarak 22 polispermiye karşı son ve sürekli bir zona engeli oluşumuna neden olur. Bu olay, zona reaksiyonu olarak adlandırılır 9,16. Oosit, metafaz duraklamasından fertilizasyonun tetiklemesi ile çıkmaktadır. Fertilizasyonu takiben MPF aktivasyonu hızla düşer. MPF ve bir sitostatik faktör komponenti olan mitojenler tarafından aktive edilen protein kinaz (MAPK) inaktivasyonu olayları, oositin metafaz duraklamasından çıkarak mayozun devam etmesi ve tamamlanması ile pronukleusun şekillenmesini sağlar. Bu olay, fertilizasyon sonrası hücre içi depolardan salınan kalsiyum iyonlarındaki dalgalanmalar ile gerçekleşir. Sperm girişi, fertilizasyon sonrası ilk birkaç saat süresince birkaç dakikalık aralıklarla meydana gelen bir seri hücre içi kalsiyum dalgalanmalarını uyarır. Kalsiyum dalgalanmaları, muhtemelen kalsiyum-kalmodulin-bağımlı protein kinaz II (CaCMKII) aktivasyonu yolu ile sitostatik faktörün inaktivasyonunu ve dolayısıyla MPF nin inaktivasyonunu uyarmaktadır. Böylece oosit ikinci mayoz bölünmesini tamamlar ve ikinci polar cisimciğini atar. Fertilizasyonun oluşturduğu hücre içi kalsiyum dalgalanmaları, kortikal granül salınımı, zona pellusida glikoproteinlerinin 7

20 modifikasyonları, mayozun tamamlanması, ikinci kutup cisimciğinin atılması, pronükleusun şekillenmesi, DNA sentezi ve ilk mitotik yarıklanma bölünmesi dahil bir seri hücresel ve biyokimyasal olayları başlatır ki hepsi bir bütün olarak oosit aktivasyonu olarak isimlendirilir 21. Perivitellin boşluktan geçerek oolemma ile kaynaşan spermin çekirdeği oosit sitoplazması içine girer 9,10. Dişiye ait pronükleus, sperm ile gelen erkek pronükleusundan daha geniş oluşu ve ikinci polar cisimciğe daha yakın konumda olması ile ayırt edilebilir 10. Haploid sayıda kromozoma sahip oosit ve sperm pronükleuslarının merkeze doğru göçleri sırasında DNA replikasyonu gerçekleşir. Pronüklei birbirleriyle kaynaşmaz ancak membranlar yıkılır ve kromozomlar iğ üzerine dizilirler; ardından ilk yarıklanma bölünmesi gerçekleşir 16. Zigotun yarıklanma bölünmeleri olarak adlandırılan seri mitoz bölünmelerinden ilki, sperm penetrasyonundan saat sonra gerçekleşir 16. İlk yarıklanma bölünmesi sonucu oluşan iki hücreli embriyonun hücreleri çoğunlukla eşit büyüklükte olurlar. Daha sonraki bölünmeler çok daha hızlı gerçekleşir, senkronize bir şekilde dört hücreli, sekiz hücreli vs. olarak devam eder. Ancak bazen bir hücre bölünmesini tamamlamış olup diğeri hala bölünmemiş olabilmektedir. Bu durumda, embriyonun tek sayı kadar hücre içerdiği görülür. Eşit olarak bölünmeme durumunda ise, büyük blastomerlerin daha hızlı bölündüğü görülmüştür 10. Embriyo, on altı hücreli iken ve bir kavite belirmeden önce morula ismini alır. Bu aşamaya fertilizasyondan yaklaşık 60 saat sonra ulaşılır. Fertilizasyon ampulla bölgesinde gerçekleşir ve embriyo implantasyonun gerçekleşeceği uterusa doğru yol alır 10. Embriyo uterusa girdikten ve otuz iki hücreli olduktan hemen sonra hücrelerin arasında içi sıvı dolu bir kavite gelişir ve blastosöl ismini alan bu kavite hızla genişler. Blastosöl boşluğuna sahip embriyo, blastokist olarak adlandırılır. Blastosöl kavitesi genel olarak trofoblast tabakası denilen tek sıralı bir hücre tabakasıyla sarılıdır ancak bir kısmında, iç hücre kitlesini oluşturacak şekilde hücrelerin toplandığı bir bölge görülür. İleride bu iç hücre kitlesinden embriyo, etrafını saran trofoblast hücrelerinden ise plasenta gelişecektir 9. Blastokist oluştuktan sonra implantasyon gerçekleşir. İmplante olacak blastokist zona pellusidasından kurtulur 10. Fertilize olmayan oositler ise ovidukt ve uterus içerisinde dejenerasyona gider. Normal olarak bölünüyor gibi görünseler de eşit olmayan boyutları ve düzensiz nüklear dağılımları vardır. Spontan fragmentasyon ile oluşan bu hücrelerden bazıları çekirdek içerirken, bazıları içermeyebilirler 10. 8

21 2.3. Farede Oosit ve Embriyo İnce Yapısı Oosit İnce Yapısı Folliküler gelişimin en erken aşaması olan primordial follikülün oositleri; büyük, eksentrik yerleşimli, çekirdekçiği belirgin ve yaygın kromatin içeren veziküler tip çekirdeğe sahiptirler. Birinci mayoz bölünmenin profaz aşamasında bekleyen bu oositin germinal vezikül (GV) adı verilen büyük çekirdeği ışık mikroskobunda dahi net olarak seçilebilmektedir 23. Bu oositte, jukstanüklear yerleşimli iyi gelişmiş Golgi apparatus çok sayıda mitokondriyon ile çevrelenmiştir. Golgi apparatus paralel bir görünüm veren kısa sisternal yapılar ve çok miktarda küçük veziküllere sahiptir 9,12. Ooplazma içerisinde Golgi apparatustan köken aldığı düşünülen benzer küçük veziküller dağılmış olarak bulunur 12. Perinüklear yerleşimli olarak, merkezde Golgi apparatus ve çevresinde mitokondriyonlar dışında endoplazmik retikulum, lizozomlar ve granülofibriler yapıların da içinde bulunduğu bir organel topluluğu bulunur ki, başta bu yapı farklı bir organel olarak düşünüldüğünden Balbiani cisimciği adını almıştır 9,24. Balbiani cisimciği, primordial follikül oositlerinde bulunmakta ancak follikül gelişmeye başladığında mitokondriyonlar ve endoplazmik retikulum yapılarının tüm ooplazma içerisinde dağılması nedeniyle ortadan kalkmaktadır 24. Endoplazmik retikulum, erken aşamalarda, veziküler ya da bir miktar ribozom içeren hafifçe uzamış oluşumlar şeklindedir ancak daha sonraları daha uzun sisternal yapılar gittikçe artarak paralel düzenlenme gösterirler. Gelişim ilerledikçe sayıları artan multiveziküler cisimcikler de ooplazma içerisinde yer alır 12. Ayrıca enerji ihtiyacını karşılamak üzere, glikojen granülleri, lipid damlacıkları ve fibröz yapıları kapsayan sitoplazmik inklüzyonlar da ooplazmada dağılmış şekilde yer almaktadır 25. Oosit ve etrafını saran yassı folliküler hücrelerin yüzeyleri birbirleri ile yakın ilişkilidir 9. Büyüyen follikülün gelişiminde ilk farklanma; primordial follikülden primer folliküle geçiş aşamasıdır. Primer follikül gelişirken oositte, folliküler hücrelerde ve komşu stromada değişiklikler olur. Preantral folliküllerde, oositin hacmi yaklaşık 34 katı kadar artış gösterir ki bu, protein içeriğindeki artışla ilişkilidir 13. Folliküler hücreler ilk olarak yassı hücreden kübik hücrelere değişir. Organellerin dağılımında fark edilir bir değişim gözlenir. Mitokondriyonlar, ooplazma içine dağılmaya başlar. Başta tek bir tane olan ve jukstanüklear yerleşen Golgi apparatus, ooplazma içinde dağılmış olarak 9

22 çok miktarda bulunmaya başlar. Granüler endoplazmik retikulum, ooplazmada gittikçe yaygınlaşır ve serbest ribozomların, küçük veziküllerin ve multiveziküler cisimciklerin sayısı gözle görülür şekilde artar 9,12. Lipidden zengin dens granülleri de ooplazma içinde görmek mümkündür 12. Ayrıca oolemmadan kaynaklanan klatrin kaplı veziküller de ooplazmada yer almaktadır. Fertilize olmamış oositte ooplazma içinde dağılmış şekilde bulunmaktadırlar. Embriyolarda ise; endozomlar, filamentöz aktin ve klatrin yapılarının hep birlikte kutuplaşmaya katkı sağladığını düşündürecek şekilde farklı bölgelerde toplandıkları rapor edilmiştir 26. Oolemmanın hemen altında, kortikal granül adı verilen salgı vezikülleri bu evrede görülmeye başlar. Bu salgı granüllerinin yerleşiminde follikül gelişimiyle birlikte birtakım değişiklikler görülür. Sitoplazmik olgunlaşma kapsamında değerlendirilebilecek olan bu dağılım önce kortekse doğru oolemmanın hemen altında devamlı bir tabaka oluşturacak şekildedir; ardından özellikle fare oositlerinde görülen germinal vezikül yıkımından yaklaşık 1 saat sonra, metafaz mekiğinin etrafında bir kortikal granülsüz bölge bırakacak şekilde düzenlenirler 14. Bu granüller, sperm tarafından aktive edilen oositten ekzositoz yoluyla dışarı atılan yapılardır; glikozidaz ve proteaz içerikli bir salgı içerirler. Oosit yüzeyindeki düzensiz mikrovilli, folliküler hücrelere doğru uzanır. Follikül büyüdükçe, oosit ve çevre folliküler hücrelerin arasında homojen, oldukça koyu boyanan, asidofilik ve kesintisiz bir tabaka olan zona pellusida, oosit tarafından salgılanır. Gelişen primer follikülde granüloza hücrelerinin de yüzeyinde, oosite doğru ince uzantılar vardır ve bazen oosit plazma membranına invajine olabilmektedirler 9. Oosit ve granüloza hücre uzantıları arasında mayotik yeterliliği kazanmak için gerekli olan heterolog oluklu bağlantılar bulunmaktadır. Oolemma ve zona pellusida arasındaki perivitellin boşluk (PVB), bu transzonal uzantıların azalması nedeniyle genişlemektedir. Bu genişlemenin, mayotik yeterliliğin kazanılması ile ilişkili olduğu ve onunla koordineli olarak gerçekleştiği düşünülmektedir 23. Granüloza hücrelerinin aralarındaki hyaluronandan zengin likör folliküli ile dolu boşlukların birleşmesi ile antrum oluşmuş ve follikül gelişmeye devam ederek daha da büyüyüp olgun Graff follikülü haline gelmiştir. Bu aşamada; granüloza hücrelerinde mitotik figürlerin azaldığı görülür 9. Ovüle edilecek oosit ise, 1. mayozunu tamamlayıp 2. mayoz bölünmenin metafazına kadar ilerlemektedir. Preovülatuvar oositin yüzeyinde antral folliküllere kıyasla daha kısa mikrovilli yapıları görülmektedir

23 Oosit sitoplazmasında aktin, tübülin ve bazı sitokeratinler dahil sitoiskelet elemanlarının kompleks bir matriksi bulunur. Fertilizasyonda meydana gelen göç olayında pronükleideki değişiklikler ve özellikle sitokinez olayı için hücre yüzeyindeki olayların koordineli bir şekilde gerçekleşmesi için bu sistemin gerekli olduğu düşünülmektedir Embriyo İnce Yapısı Oosit fertilize olduktan sonra, kromatini dekondanse olur ve pronükleus oluşumu görülür 16. Ardından pronüklei zigotun merkezine göç eder ve membranları kaybolur 26. Yarıklanma bölünmeleri süresince, fertilize olmuş oositin sitoplazmik organellerinde hem sayısal hem de yapısal birtakım değişiklikler görülmektedir. Preimplantasyonel gelişim süresince lipid damlacıkları, multiveziküler ve rezidüel cisimcikler, orta düzeyde elektron-dens içerikli büyük sitoplazmik veziküllerin yoğunluklarının değişmediği ancak diğer bazı organellerde birtakım farklılıklar olduğu göze çarpmaktadır. Örneğin; mitokodriyonların yoğunluğu erken blastokist evresine kadar hemen hemen aynı kalırken, bu aşamadan sonra gittikçe artmaktadır. Granüler endoplazmik retikulum yoğunluğu yarıklanma süresince artmakta iken agranüler endoplazmik retikulum gittikçe azalmaktadır. Otofajik vakuollerin yoğunluğunda da artış görülmekte ve en fazla blastokist evresinde bulunmaktadırlar. Kristalloid inklüzyonların yoğunluğu embriyonun 4 hücreli evresinden itibaren çok belirgin olmasa da artmaktadır 27. Klatrin kaplı veziküller, erken embriyonik evrelerde, iki istisna dışında ooplazma içerisinde dağılmış vaziyette bulunmaktadırlar. İstisnalardan biri, mayotik ya da mitotik iğe yakın bölgede; diğeri ise, sekiz hücreli embiyolarda blastomerlerin apikal bölgelerinde toplanmış olarak bulunmalarıdır 26. Golgi apparatus dağılımının ise bazı çalışmalarda değişmediği 27 savunulurken; diğer bazı çalışmalarda ise, özellikle 16 hücreli embriyolarda, hem Golgi apparatusun hem de lizozomların embriyonun endositik ve salgılama fonksiyonu ile bağlantılı olabilecek şekilde merkezdeki blastomerlerde ve dıştaki blastomerlerin ise merkeze bakan bazal yüzeylerinde çok daha yoğun olarak bulunduğu söylenmektedir 26. Glikojen granülleri 11

24 ve fibriler yapılar gibi sitoplazmik inklüzyonların miktarı da gelişim süresince fark göstermemektedir 25. Yedi hücreli embriyolar ile yapılan bir çalışmada; blastomerlerden iki adedinin ultrastrüktürel olarak diğerlerinden daha elektron dens olduğu rapor edilmiştir. Buna neden olan faktörlerin, blastomerlerin sitoplazmik özleri ve organellerin sitoplazma içindeki dağılımları olduğu düşünülmektedir. Daha az elektron dens olan blastomerlerde; mitokondriyonların düzensiz dağıldığı, agranüler endoplazmik retikulumun genellikle subkortikal ve perinüklear alanlarda ve mitokondriyonlar ile ilişkili şekilde bulunduğu görülmektedir. Elektron dens blastomerlerde; mitokondriyonların, agranüler endoplazmik retikulum sisternalarının, Golgi appatarusun daha koyu sitoplazmik matrikse sahip olduğu; embriyoyu, orta veya dens yoğunluklu madde içerikli granüller bulunan homojen olmayan bir ZP yapısının çevrelediği; perivitellin boşlukta yerleşen çeşitli şekillerde ve büyüklüklerde sitoplazmik parçalar ve hücresel artıkların, ayrıca organelden yoksun kutup cisimciklerinın varlığı rapor edilmiştir 28. Geç sekiz hücreli evrede, blastomerler arasında oluklu bağlantılar görülmeye başlar. Bu bağlantılar, daha ileri evrelerde iç hücre kitlesini oluşturan hücreler arasında ve iki trofoblastik hücre arasında yoğun olarak bulunmaktadırlar Partenogenetik Aktivasyon Fare dahil birçok memeli hayvanın oositi, ortamda sperm olmaksızın embriyonik gelişimi başlatılmak üzere uyarılabilmektedir 16. Özellikle kök hücre ya da klonlama çalışmalarında, nüklear transferin uygulandığı alıcı oositin aktivasyonu, bu prosedürlerin en önemli aşamasıdır 8. Bunun dışında, fertilizasyon ve erken embriyonik gelişim sırasında meydana gelen biyokimyasal ve morfolojik değişikliklerin çalışılması için model olarak partenotlar kullanılabilmektedir 21. Partenogenetik aktivasyon; spermatozoon girişi olmaksızın gerçekleşen embriyonik gelişim sürecidir ki alt düzey canlılarda yeni bir birey oluşumu ile sonuçlanabilir. Ancak memelilerde partenogenetik aktivasyon ile elde edilen embriyolar olan partenotlar, türe göre değişiklik gösterir şekilde farklı evrelere kadar gelişebilir ise de hiç doğum elde edilememiştir. Spontan partenotlar olarak da 12

25 isimlendirilen in vivo oluşan partenotlara nadiren rastlanır ve bunların farklı germ tabakalarından köken alan tümörlerin (teratoma) primer nedeni olduğu düşünülmektedir 4. İn vitro olarak partenot eldesi için kullanılan ilk yöntem; 1939 yılında tavşanlara uygulanan ısıtma yoluyla partenogenetik embriyo eldesidir. Ardından domuz ve tavşanlarda başka bir aktivatör olmadan başarılı bir şekilde partenogenezi sağlayan elektriksel uyarım uygulanmıştır li yıllarda, fare oositlerinin aktivasyonu için anestezik ya da hiyaluronidaz uygulaması denenmiştir 30. Bu yöntemler dışında ise; kalsiyum iyonoforları, etanol, stronsiyum gibi kimyasal ajanları 2 kullanarak ya da inositol 1,4,5-trifosfat (InsP 3 ) reseptörlerinin azaltılarak düzenlenmesi 31 yolları ile aktivasyon sağlanmıştır. Stronsiyum, fare oositlerinin aktivasyonu için sıklıkla kullanılan bir ajandır 2. Hem fertilizasyonda hem de partenogenezde oosit aktivasyonu; kortikal granüllerin salınımı, mayozun tamamlanması ve ikinci kutup cisimciğinin atılması, pronükleusun şekillenmesi, DNA sentezi ve ilk mitotik (yarıklanma) bölünme gibi olayları kapsar ve bunun için hücre içi kalsiyum iyonu artışına ihtiyaç vardır 31. Oositin aktive olması için gerekli kalsiyum iyonu yükselişini diğer kimyasal ajanların da sağlamasına karşın, InsP 3, timerozal, adenofostin A ve stronsiyum kimyasalları 32 fertilizasyon sonucu sperm ile uyarımı taklit eder nitelikte uzun süreli kalsiyum dalgalanmaları oluştururlar. Etanol, kalsiyum iyonoforları gibi bazı aktivasyon ajanları ve elektroporasyon gibi yöntemler, uzun süreli tek bir kalsiyum salınımını uyarırlar ve bu uyarım oositin metafaz duraklamasını aşmasını sağlamaktadır. Etanol, oositin plazma membranında inositol 1,4,5-trifosfat oluşumu ile hücre dışından içeriye kalsiyum akışı yolu ile oositi aktive eder ve böylece hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda büyük, tek bir artış meydana gelmektedir 21. Ancak, bu tip uyarımda bir süre sonra MPF düzeyi yeniden hızla artacak ve bu nedenle ileri gelişim görülmeyecektir 4. Tek bir kalsiyum iyonu yükselişi (monotonik) ile elde edilen aktivasyon, gelişimin ilerleyişi için yeterli olmazken, stronsiyum gibi kimyasalların sağladığı çoklu kalsiyum yükselişleri, oosit gelişimini belirgin şekilde arttırmaktadır 33. Sperm ile uyarım sonucu elde edilen kalsiyum dalgalanmaları birkaç saat sürer ve yaklaşık olarak pronüklear oluşum zamanı son bulur. İlk ve sonraki birkaç kalsiyum geçişi oositin aktivasyonu için; daha sonraki uzun süreli dalgalanmalar ise erken embriyo gelişimini kolaylaştırmak için gereklidir 7. Tüm bunlara ek olarak, aktivasyon ajanı olarak stronsiyum kimyasalı kullanılarak elde edilen partenotlarda anöploidi 13

26 görülme oranı, etanol ile aktive olanlara kıyasla oldukça düşüktür 34. Stronsiyum, aktive olan oositlerde kromozomal anomalilere neden olmamaktadır 33. Stronsiyumun taklit ettiği fertilizasyon sonrası sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki ilk artış, birlikte oosit aktivasyonu olarak isimlendirilebilecek kortikal granül ekzositozu ve mayozun tamamlanmasının uyarılması olaylarında gereklidir. Bu artışı başlatan ve düzenleyen sinyal yolağı çalışmalarında görülmüştür ki; sperm kaynaklı fosfolipaz C aktive edildiğinde, fosfotidilinositol 4,5-bifosfatı, ikinci mesajcı olan inositol 1,4,5-trifosfata (InsP 3 ) hidrolize eder. InsP 3, endoplazmik retikulum üzerindeki, kalsiyum kanalı ihtiva eden InsP 3 reseptörleri (InsP 3 R) ile etkileşime girerek oositin hücre içi depolarından kalsiyum salınımını uyarır. Kalsiyum, siklin B üzerinden mayozun tamamlanmasını sağlar 7,32. Aktivasyon olayında da aynen fertilizasyonda olduğu gibi artmış olan MPF aktivasyonu hızla düşer 15. Stronsiyum klorür (SrCl 2 ) de, InsP 3 reseptörleri üzerindeki kalsiyum bağlanma bölgelerine bağlanarak ya da muhtemelen oosit içinde bağlı kalsiyum iyonlarının yerini alarak 21 aktivasyon sağlar 32. Bazı aktivasyon uygulamalarında, 6-Dimetilaminopürin (6-DMAP) isimli bir protein kinaz inhibitörü, aktivasyon ajanlarına ek olarak kullanılmaktadır. 6-DMAP, memeli oositinin metafaz duraklamasından çıkarak pronükleus oluşumu için öncelikli olarak gerekli olan MPF ve MAPK inaktivasyonuna yol açmakta, bu sayede aktivasyonu kolaylaştırmaktadır. Kalsiyum iyonofor A23187 ve 6-DMAP ile yapılan çalışmada, oositlerin aktivasyon oranının arttığı fakat bu kombin uygulamanın, elde edilen partenotların embriyonik gelişimlerinde zararlı etkileri olduğu rapor edilmiştir. 6-DMAP kullanılan aktive olmuş oositlerde; iğ rotasyon inhibisyonu, sperm kromatini etrafında oluşan prematür çekirdek kılıfı ya da sürekli olarak küçük pronüklei oluşumu gibi birçok anomalilere rastlanmaktadır 35. Stronsiyum ve 6-DMAP nin kombin olarak kullanıldığı bir aktivasyon çalışmasında ise; 6-DMAP nin sadece aktivasyon oranını arttırmakla kalmayıp; aynı zamanda partenotların total ve iç hücre kitlesindeki hücre sayısında artış gösteren ve blastokist evresine kadar gelişimi arttıran bir etkisi olduğu gösterilmiştir 36. Partenogenetik embriyolar; deneysel ortam, oositin postovulatuvar yaşı ve sitoiskelet elemanlarının durumu ile ilişkili olarak 5 farklı genotipe sahip olabilmektedir. İkinci kutup cisimciği atılmış ise uniform haploid; ikinci kutup cisimciği atılmış ancak normal bir blastomer gibi davranıyor ise mozaik haploid; ikinci 14

27 kutup cisimciğin atılmasını engelleyerek veya pronükleus ile kutup cisimciğinin füzyonu sonucu heterozigot diploid; haploid dişi genomun diploidizasyonu ile homozigot diploid; özellikle alkol ile aktivasyon sonucu görülen ayrılmama durumunda ise anöploid partenotlar oluşmaktadır 16. Haploid, diploid partenogenetik embriyolar ve kontrol amaçlı olarak in vitro fertilizasyon ile elde edilen embriyoların karşılaştırıldığı bir çalışmada, haploid partenotların diğerlerine göre hem yarıklanma bölünmelerinin, dolayısıyla gelişimin daha yavaş olduğu, hem de gelişimlerini engelleyen apopitoza yatkınlıklarının çok daha fazla olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, aynı çalışmada, diploid partenotların, kontrol embriyolar ile aynı oranda preimplantasyonel gelişim ve apopitoz gösterdiği; yani partenogenetik aktivasyonun değil, haploid yapıda oluşunun preimplantasyonel embriyolarda apopitoz görülme sıklığını arttırdığı rapor edilmiştir 33. Genellikle diploid partenogenetik embriyo elde etmek için kullanılan kimyasal sitokalazin B veya D dir. Bu ajanlar, aktin polimerizasyonunu inhibe ederek ikinci kutup cisimciğinin atılmasını ve dolayısıyla kromozom kaybını engellemekte ve böylece bir çift kardeş kromatid içeren diploid pronükleusa sahip partenogenetik embriyolar elde edilebilmektedir. Yapılan çalışmalarda diploid partenotların, haploid karşılıklarına oranla çok daha yüksek oranda gelişim gösterdiği rapor edilmektedir 4. Her ne kadar partenotlar çok çeşitli yollarla elde ediliyor olsalar da, bu embriyoların doğumu bugüne kadar başarılamamıştır. Ancak kaynaklarda, bazı soy farelerden elde edilen oositlerden stronsiyum kullanılarak aktivasyon sonucu elde edilen partenotların, yalancı gebe taşıyıcı farelere transfer edilmesiyle 13,5 günlük gelişim gösterdikleri çalışmalar bulunmaktadır 30. İn vivo ve in vitro gelişim sağlanabiliyor olsa da, partenotların gelişim potansiyellerinin düşük olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, partenogenetik embriyolardaki hem toplam hücre sayısının hem de iç hücre kitlesini oluşturan hücrelerin sayısının, fertilizasyon sonucu elde edilen embriyolar ile kıyaslandığında, kompakt morula aşamasına kadar bir fark göstermezken ileri blastokist aşamasında oldukça azalmış olduğu rapor edilmiştir 8. Diploid partenogenetik fare blastokistlerinde iç hücre kitlesindeki hücre sayısı 20 ya da doğal yolla fertilize olanlardakine kıyasla yarısı kadar ise de haploidlerde bu sayı daha da azdır 30. Yavaş hücre bölünmesi, düşük metabolik aktiviteler, ince yapı düzeyindeki bozukluklar, kromozomal anomalilerin görülme sıklığının fazla oluşu gibi gözlemler, partenogenetik embriyoların gelişim yeteneklerinin düşük oluşu ve doğum elde edilememe durumlarını açıklamaktadır 8. 15

28 Partenot İnce Yapısı Aktive olmuş oositlerde, sperm penetrasyonu ile stimülasyonun yokluğuna bağlı tamamlanmamış kortikal reaksiyon nedeniyle, salınmamış durumdaki kortikal granüller varlıklarını sürdürdüğü rapor eden çalışmalar 30 yanında; stronsiyum ile aktive edilen sıçan oositlerinin incelendiği bir çalışmada, fertilizasyon sonucunda olduğu gibi kortikal granüllerin perivitellin boşluğa salındığı saptanmıştır 32. Etanol ve sitokalazin B ile elde edilen diploid partenotların ultrastrüktürel incelemelerinde; vakuolize kristalı çok sayıda mitokondriyon ve az sayıdaki Golgi apparatus, ribozomlar, multiveziküler cisimcikler, otofajik vakuoller, miyelin yapılar, lizozom benzeri yapılar ve de yüzeyde sitoplazmik katlantıların olduğu rapor edilmiştir. Ayrıca aynı çalışmada, embriyolara kıyasla daha az miktarda kristalloidlere ve lipid damlacıklarına sahip oldukları ifade edilmektedir 30. Hiyaluronidaz ve ozmotik şok ile aktivasyon sonucunda ise; partenotlarda kortikal reaksiyonun gerçekleşmediği, blastomerlerin yüzeyinde mikrovilli olmadığı, sitoplazmada çok sayıda fibröz cisimciklerin, vakuollerin, lipid damlacıklarının, multiveziküler cisimciklerin bulunduğu görülmüştür. Yine bu yöntemle elde edilen partenotlarda da mitokondriyonlar çok miktarda bulunmuştur. Sitokinezin düzensiz olduğu ve çok sayıda membranla çevrili küçük ve büyük sitoplazmik parçaların bölünen hücreler arasında varlıkları saptanmıştır. Ribozom çok az, yine çok az sayıda çekirdekçikte retikülasyon ve de fibriler ve granüler kısımların oluşumu görülmüştür CZB (Chatot-Ziomek-Bavister) Solüsyonu Normal memeli embriyolojisine ilişkin çalışmalarda, manipulasyonu ve elde edilmesi kolay olan fareler oldukça sık kullanılmaktadır. Yaşamaları için uygun ortam (temiz kafes, yeterli yiyecek ve su, uygun sıcaklık, nem ve havalandırma gibi) sağlanan fareler, üreme dahil doğal fizyolojilerini sağlamak amacıyla 14 saat aydınlık/10 saat karanlık döngüsüne maruz bırakılmaktadırlar 11. Fareler genellikle yaklaşık 4 haftalık iken, dolaşımda gonadotropinlerin artmasıyla seksüel olgunluğa erişirler. Bu nedenle çiftleşme olmamasını garantilemek için, 3 haftalık dişi ve erkekleri ayrı kafeslere koymak doğru olacaktır. Seksüel 16

29 olgunluğun tayin edilmesinde çeşitli belirleyiciler dikkate alınmaktadır. Dişilerde puberte, vajinal açıklığın oluşması ve vajinal smearda kornifiye hücrelerin görülmesi gibi östrojene bağlı bir olaydır. Vajinanın açılması 24. günde görülebildiği gibi, çoğunlukla 4. hafta olarak rapor edilmiştir. Bu çeşitliliğin sebebi genetik altyapı, mevsimsel ya da diyet kaynaklı olabilir 10. Oosit ve embriyoları in vivo ortama en yakın şekilde in vitro ortamda tutabilmek için çeşitli kültür medyumları kullanılmaktadır. Bu medyumların içerikleri, oosit ve embriyoların ihtiyaçları doğrultusunda belirlenmiştir ve her geçen gün yapılan çalışmalar sayesinde geliştirilmektedir. Osmolarite, ph ve iyon dengesi, amino asit miktarı, enerji kaynakları gibi faktörlerin izlenmesi, bu süreçte önemli rol oynamaktadır. Çoğunlukla bu amaç için kullanılan kültür medyumlarının içerikleri benzer olmakla birlikte birbirlerinden bir takım farklılıklarla ayrılırlar 16. Bu çalışmada, CZB (Chatot-Ziomek-Bavister) solüsyonu (medyumu) kullanılmıştır. CZB medyumu da, osmolarite dengesi için NaCl, iyon dengesi için KCl, potasyum sülfat, magnezyum sülfat, kalsiyum klorür, glutamin (özellikle ilk 48 saatlik gelişim için) (34), sodyum laktat ve sodyum piruvat gibi yaşamsal besin kaynakları, ph dengesini stabil tutabilmek için bikarbonat tamponu, penicilin, streptomisin gibi bakteri üremesini engelleme amacıyla antibiyotikler, embriyoların birbirlerine veya kültür kabına yapışmalarını engelleyen BSA, ağır metalleri tutma özelliğindeki şelatör EDTA 29 gibi kimyasallar içerir 16. EDTA, bu özelliği ile fare embriyolarının iki-hücre bloğundan çıkarak gelişimine devam etmesini sağlamaktadır 29. Memeli embriyolarında embriyogenezin preimplantasyonel aşamalarında, zigotik gen aktivasyonu ya da embriyonik gen aktivasyonu olarak isimlendirilen bir evre görülmektedir. Bu evre; anne ve babadan gelen genomların eşleşmesi, embriyonik genomun aktivasyonu, intrasitoplazmik homeostatik mekanizmalarının aktivasyonu ve sitoplazmik organellerin yeniden düzenlenmesi gibi olayları kapsamaktadır. Kültür ortamına alınan preimplantasyonel embriyolarda iyon homeostazı sağlanamadığında ve de gelişimin artık maternal kontrolden embriyonik kontrole geçmesi için gereken sinyalleri oluşturan proteinlerin sentezindeki değişiklikler nedeniyle, bu aşamada embriyolar geri dönüşümsüz bir şekilde gelişimlerini durdurabilmektedir. Fare embriyolarında bu evre iki hücreli aşamada iken görüldüğünden, iki-hücre bloğu olarak adlandırılmaktadır 1,29,38. CZB medyumunu diğer medyumlardan ayıran sekiz hücreli evreye kadar glukoz içermemesidir 16,38. Embriyolar, gelişimlerinin ilk 48 saatinde 17

30 enerji kaynağı olarak laktat ve piruvat kullanmaktadırlar. Bu süre içerisinde medyumda glukoz varlığı embriyo gelişimine zarar verdiğinden, CZB medyumu, blastokist gelişiminin sağlanabildiği verimli bir medyumdur. Ancak sekiz hücreli embriyo gelişiminde glukoz gerektiği için, morula evresindeki embriyonun bu evreye geçişi sırasında medyuma glukoz takviyesi gerekmektedir 38. İnkübatörde saklamak için kullanılan medyumlar ile atmosferik basınçta çalışılan medyumlar tampon içerikleri bakımından farklıdır. İnkübatörde, in vivo şartlarda olduğu gibi bikarbonat tamponu içeren medyum kullanılır. Bu medyum, oosit ve embriyoları uzun süre in vivo ortama en yakın şekilde tutulmasını sağlar. Medyum değişimleri, transferler gibi atmosferik basınçta çalışılması gereken durumlarda ise, medyumlarda HEPES tamponu kullanılır. Çünkü karbondioksit miktarı, %5 CO 2 içeren inkübatör ortamına kıyasla oldukça az olduğundan, reaksiyon bu yöne doğru kayacak ve ortamdaki hidrojen ile reaksiyona girip önce karbonik aside, ardından da su ve karbondioksite ayrışacaktır. Bununla birlikte hidrojen moleküllerinin kullanılması nedeniyle, kültür ortamı alkolize gidecek, yani ph dengesi bozulacaktır. Atmosferik basınçta yapılan çalışmalarda HEPES tamponu içeren medyumları kullanmak gerekse de, oositleri ve/veya embriyoları bu medyumlar içerisinde uzun süre tutmamak doğru olacaktır. Ancak inkübatördeki oosit ve/veya embriyoların gelişimlerini takip etmek gerektiği ya da bikarbonat içeren medyum içerisinde, atmosferik basınç altında kısa süre de olsa manipulasyon yapmak gerektiğinde, medyumun üzerini yağ ile kaplamak gerekmektedir. Böylece medyum stabilize edilmiş, ozmolarite artışına neden olabilecek buharlaşma ve karbondioksit miktarındaki azalma nedeniyle sıcaklık ile ph değişimleri en alt düzeye indirilmiş olmaktadır İn Vitro Ortam Başta oosit, zigot ve iki hücreli embriyolar olmak üzere hücrelerin, ph ve sıcaklık değişikliklerine karşı toleransları oldukça düşüktür. Fare zigotlarını oda sıcaklığında 5 dakika tutmak bile yarıklanma bölünmelerinin oranlarını düşürmekte; dakika tutmak ise, blastokiste gelişimi yarı yarıya azaltmaktadır. İn vitro manipülasyonlar sırasında sıcaklık dalgalanmaları, oositlerde iğ yapılarının bozulmasına ve dolayısıyla anormal kromozom dağılımına ve anormal ya da hiç gerçekleşmeyen fertilizasyona 18

31 neden olabilmektedir. Bu nedenle, çalışmaları olabildiğince kısa sürede yapabilmek ve sağlanabildiği takdirde üzerinde uygulama yapılan masanın sıcaklığını 37 C de tutabilmek bu riskleri minimuma indirecektir 16. Kültür medyumları içerisinde antibiyotikler kullanılıyor olmasına karşın, kontaminasyon gerçekleşebilmektedir. Bu durumu engellemek için tek seferlik kullanılıp atılan şırınga, petri kutusu ya da pipet gibi malzemeler kullanmak, ayrıca çalışmaları bir laminar kabin içerisinde yapmak gerekmektedir

32 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Deney Hayvanlarının Özellikleri ve Gruplandırılmaları Bu çalışmada 80 adet dişi, 20 adet erkek olmak üzere toplam 100 adet Balb/C soyu fare kullanıldı. Çalışmada kullanılan tüm fareler, Çukurova Üniversitesi Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezi nden temin edildi. 3 haftalık dişi fareler, gebe kalmalarını engellemek amacıyla, 3 hafta süre ile erkek farelerden uzak tutuldular. Tüm deney boyunca fareler 14 saat aydınlık / 10 saat karanlık döngüsüne maruz bırakıldılar. Çalışmada kullanılan toplam 80 adet dişi fare süperovulasyon uygulamasını takiben eşit sayıdaki iki ana gruba ayrıldı: adet fareden doğal fertilizasyon sonucu farklı gelişim evrelerinde embriyolar elde edildi adet fareden elde edilen oositlere partenogenetik aktivasyon uygulandı. Embriyoların elde edildiği farelerin 6 8 haftalık 16, partenogenetik aktivasyon uygulanacak farelerin ise 8-12 haftalık olgun fareler olmalarına 16 ; erkek farelerin ise genç ve fertil olmalarına özellikle dikkat edildi Süperovülasyon Protokolü Dişi fareler, çalışma planı takvimine göre, uygulama kolaylığı açısından, her hafta 10 adet fare olmak üzere intraperitoneal olarak 5 IU PMSG enjeksiyonu ve 47 saat sonra intraperitoneal olarak 5 IU hcg enjeksiyonu ile süperovüle edildi Embriyoların Toplanması Birinci gruptaki 40 adet dişi fareden 10 tanesi, süperovülasyon sonrası bir gece erkek farelerle aynı kafes içerisinde (her kafeste 2 dişi 1 erkek fare olacak şekilde) tutuldular ve böylece hcg enjeksiyonundan yaklaşık 20 saat sonra vajinal tıkaç kontrolu 20

33 yapıldı. Sonuç pozitif (+) olan fareler aynı gün sakrifiye edilerek oviduktları CZB- HEPES medyumu (Tablo-2) içerisine alındılar. Stereozoom mikroskop altında ve yeni bir CZB-HEPES medyumuna alınan oviduktun penset ile sabitlenmesi sağlanarak, ampulla bölgesi 27-gauge enjektör iğnesi ile zedelendi ve embriyoların ovidukt içerisinden dışarıya çıkmaları sağlandı. Medyuma yayılan yeni döllenmiş pronüklear aşamadaki embriyolar %0.1 hiyaluronidaz içeren medyum içinde toplandılar, üç adet CZB-HEPES medyum damlasından geçirilerek yıkandılar. Embriyoların medyumların birinden diğerine aktarılma işlemleri ucu inceltilmiş cam pastör pipetleri ve ağız pipeti kullanılarak gerçekleştirildi. Ardından stereozoom mikroskop altında kısa sürede fotoğrafları çekilen embriyolar, üzeri mineral yağ ile kaplı üç adet CZB medyum (Tablo- 1) damlalarından geçirildi, bu damlalardan üçüncüsü içerisinde %5 CO2 ve 37 C deki nemli ortamı sağlayan inkübatöre (Sanyo CO 2 İnkübatör MCO-5AC) kaldırıldılar. Kalan 30 fare de yine superovulasyon sonrası, hcg enjeksiyonundan yaklaşık 42 saat, 64 saat ve 70 saat sonra 10 arlı gruplar halinde sakrifiye edilerek sırasıyla iki hücreli, dört hücreli ve sekiz hücreli embriyolar elde edildi. İn vivo koşullarda farklı gelişim evrelerinde bulunan embriyolar gelişimlerine paralel olarak ovidukt içerisinde ilerlediklerinden ve hassasiyetleri nedeni ile flush yöntemi uygulanarak toplandılar. Bunun için CZB-HEPES medyum damlasına alınan oviduktların fimbria bölgeleri, stereozoom mikroskop altında saptandı. Bu açıklığa, ucu kütleştirilmiş enjektör iğnesi ile girilerek tüm ovidukt içine enjektördeki CZB-HEPES medyumunun gönderilmesi ve embriyoların diğer uçtan damlaya dağılması sağlandı. Toplanan embriyolar, 3 adet CZB- HEPES medyum damlalarında yıkandılar, stereozoom mikroskop altında fotoğraflandılar ve üzeri mineral yağ ile kaplı, CZB medyum damlalarında da yıkanarak üçüncü damla içerisinde inkübatöre kaldırıldılar. Sekiz hücreli evreden itibaren embriyoların gelişimleri için gerekli olan %5.6 glukoz içeriği dikkate alınarak, bu evredeki embriyolar CZB+glukoz medyumlarında inkübatöre kaldırıldılar. Dördüncü gün sakrifiye edilenlerin, CZB-HEPES medyumu içerisinde morula ve blastokist aşamasındaki embriyoları da yine flush yöntemi ile toplandı, CZB-HEPES medyumlarında üç kez yıkanarak, stereozoom mikroskop altında fotoğraflandılar ve üzeri mineral yağ ile kaplı CZB + glukoz (%5.6) medyum damlalarından geçirildikten sonra damlaların üçüncüsü içerisinde inkübatöre kaldırıldılar. 21

34 3.4. Oositlerin Elde Edilmesi ve Partenogenetik Aktivasyon Uygulaması İkinci gruptaki 40 dişi fare de her hafta 10 arlı gruplar halinde hcg enjeksiyonundan yaklaşık saat sonra sakrifiye edildiler. Oviduktları CZB-HEPES medyumuna konuldu. Stereozoom mikroskop altında bir penset yardımıyla sabitlenen oviduktların ampulla bölgeleri, 27-gauge enjektör ile zedelendi ve MII aşamasındaki oositlerin, %0.1 hiyaluronidaz içeren medyum içerisinde dağılmaları sağlandı. Kümülüs hücrelerinden arındırılan oositler, ağız pipeti ve inceltilmiş uçlu cam pastör pipetleri ile toplanarak, üç adet CZB-HEPES medyum damlalarının birinden diğerine aktarılarak yıkandılar. Oositlerin birinci polar cisimciğinin varlığı dikkate alınarak ve sitoplazmalarının granülariteleri, vezikül-inklüzyon içerikleri göz önünde bulundurularak sağlıklı olanları seçildi. Aktivasyon için stronsiyum içeren kalsiyumsuz CZB medyumu kullanıldı. Kümülüsten arındırılan oositler yıkandıktan sonra 10 mm SrCl 2 ve 5 µg/ml sitokalasin B içeren CZB-Sr medyumunda (Tablo-3) 150 dakika süresince inkübatörde tutuldu. İnkübasyon sonrası oositler, stronsiyum kimyasalı içermeyen ancak ikinci polar cisimcik atılımını engelleyen ve embriyonun diploid olarak gelişimini sağlayan sitokalasin B içeren medyumda 6 saat kültürde bırakıldılar. Stronsiyum ile aktive edilen ve sitokalazin B ile diploid kalmaları sağlanan oositler 2 hücreli aşamaya ulaştıkları andan itibaren yarısı stereozoom mikroskop altında fotoğraflanıp elektron mikroskop takibine alınırken, diğer yarısının inkübatörde gelişimlerine devam etmelerine izin verildi ve gelişimsel potansiyelleri izlendi. İn vitro koşullarda gelişimleri sağlanan partenotlardan önce gelişimlerinin 2 hücre aşamasında olanlar sonra sırasıyla 4 hücre, 6-8 hücre ve morula aşamalarında partenotlar elde edildi ve fotoğraflandılar. Gelişimin her aşamasında partenotların yarısı elektron mikroskobik takibe alındı Gelişim Takibi ve Işık Mikroskobik Değerlendirme Elde edilen embriyoların ve partenotların, stereozoom mikroskop (Kyowa Optical SDZ-TR-PL) ve invert mikroskop (Nikon Eclipse TE2000U) altında her gün gelişimleri takip edildi. Bütün manipülasyonlar laminar flow kabin (Clauss Damm Laminar Flow HF1206) içerisinde ve aksi belirtilmedikçe Sigma marka kimyasallar kullanılarak 22

35 yapıldı. Tüm gelişim aşamaları ışık mikroskobik olarak değerlendirildi ve fotoğrafları çekildi. Işık mikroskobik değerlendirme sırasında embriyolar aşağıdaki kalite değerlendirme kriterleri (Şekil-1) esas alınarak incelendiler 39. Gelişimlerinin değerlendirilmesi, embriyo kalitelendirme sistemi uyarınca üç temel kriter dikkate alınarak yapıldı. Bu kriterler, blastomer boyutu ve regülaritesi, blastomer sitoplazmasının granülaritesi ve fragmentasyon olarak kabul edildi. Partenotlar için de aynı özellikler değerlendirmede kullanıldı. Morfoloji Kalite Şekil-1: Embriyo kalitelendirme sistemi 39. Eşit şekil ve büyüklüklerde blastomere sahip, fragmentasyon içermeyen 1. Kalite embriyo; düzgün küresel blastomerlere sahip ve bir miktar fragmentasyon içeren 2. Kalite embriyo; düzensiz blastomerlere ve belirgin fragmentasyona sahip 3. Kalite embriyo; yoğun fragmentasyon arasında tek tek blastomerler seçilen 4. Kalite embriyo Elektron Mikroskopi Yöntemi Doğal fertilizasyon sonucu elde edilen embriyolar ile partenogenetik olarak aktive edilen oositlerden gelişen partenotların ince yapı düzeyinde morfolojik olarak kıyaslanması için elektron mikroskop kullanıldı. Toplanan embriyolar ve partenotlar %1,5 luk gluteraldehitte 48 saat süre ile +4 C de fikse edildi. Ağız pipeti yöntemi için inceltilmiş uca sahip cam pastör pipetleri yardımıyla %1,5 gluteraldehitten alınan embriyo ve partenotlar, üç adet PBS damlasında 10 ar dakika yıkandılar. Toksik etkisi nedeniyle ağız pipeti kullanmadan, bunun yerine pastör pipetinin 1 ml lik enjektöre takılması yöntemi ile ikinci fiksatif olan %1 lik osmiyumtetroksite aktarılarak, 1 saat süresince fiksasyona bırakıldılar. Embriyo ve partenotların kaybolmasını önlemek amacıyla bu aşamadan sonra %1 lik taze agar içerisine gömüldüler ve ardından agarın soğuyarak katılaşması için bir süre beklendi. PBS damlalarında tekrar 10 dakika 23

36 yıkandıktan sonra sırasıyla %50 ve %70 oranındaki alkollerde 10 ar dakika, %90 oranındaki alkolde 2 kez 10 dakika, %100 oranındaki alkolde dört kez 15 er dakika bekletilerek dehidrasyon aşamalarından geçirildiler. İçerisinde embriyo ve partenotların bulunduğu agar parçaları, cam petri kutuları içerisinde iki kez 20 şer dakika olmak üzere propilen oksite maruz bırakıldı. Ardından 1:1 oranda hazırlanan araldit / propilen oksit karışımı içerisinde, oda ısısında 1 gece rotatorda dönmeye bırakıldı. Ertesi sabah rotatordan çıkarılan embriyo ve partenotları içerisinde barındıran agar parçaları, saf araldit karışımı içerisinde kapsüllere gömüldü ve 48 saat boyunca kalacağı 60 C deki etüve kaldırıldı. Etüvde bekletildikten sonra bloklardan Reichert Ultracut S ultramikrotomu ile kesitler alındı. Kesitler bakır gridlere toplanarak %70 lik etil alkolde doymuş uranil asetat ve Reynolds un kurşun sitrat solüsyonları ile boyandı. Embriyo ve partenotların ince yapıları, JEOL JEM 1400 (Japan) elektron mikroskop altında incelendi ve fotoğrafları çekildi İstatistiksel Analiz Doğal yolla fertilizasyon sonucu elde edilen pronüklear evre embriyolar ile partenogenetik aktivasyon sonucu elde edilen partenotların in vitro ortamda gelişim dağılımları istatistiksel olarak Kolmogorov-Smirnov (K-S) testi ile değerlendirildi. p>0.05 değeri anlamlı olarak kabul edildi. 24

37 Tablo-1: CZB medyumu mm mg / 100 ml NaCl KCl KH 2 PO MgSO 4-7H 2 O NaHCO Glukoz 0 (5.56) Sodyum piruvat CaCl 2-2H 2 O Glutamin Sodyum laktat µl EDTA Polivinil alkol 10.0 BSA 5 mg / ml Fenol kırmızısı g / lt Penicilin G 0.06 g / lt Streptomisin sülfat 0.05 g / lt 25

38 Tablo-2: CZB HEPES medyumu mm mg / 100 ml NaCl KCl KH 2 PO MgSO 4-7H 2 O NaHCO Glukoz 0 (5.56) Sodyum piruvat CaCl 2-2H 2 O Glutamin Sodyum laktat µl EDTA Polivinil alkol 10.0 HEPES Fenol kırmızısı g / lt Penicilin G 0.06 g / lt Streptomisin sülfat 0.05 g / lt 26

39 Tablo-3: CZB Sr medyumu mm mg / 100 ml NaCl KCl KH 2 PO MgSO 4-7H 2 O NaHCO Glukoz 0 (5.56) Sodyum piruvat SrCl 2-6H 2 O Glutamin Sodyum laktat µl EDTA Polivinil alkol 10.0 BSA 5 mg / ml Fenol kırmızısı g / lt Penicilin G 0.06 g / lt Streptomisin sülfat 0.05 g / lt 27

40 4. BULGULAR Bu çalışmada, doğal yolla fertilize olmuş ve in vivo koşullarda gelişimin farklı evrelerinden elde edilmiş; ayrıca in vitro ortamda gelişimleri izlenmiş embriyolar ile in vitro ortamda aktivasyon sonucu üretilen partenotlar, hem in vitro koşullardaki gelişim potansiyelleri hem de ışık ve elektron mikroskobik benzerlikleri açısından karşılaştırıldı. Bu amaçla, kültür ortamında takip edilen embriyo ve partenotların bir kısmı gelişimsel olarak izlenip fotoğraflanırken, diğer bir kısmı farklı gelişim aşamalarında elektron mikroskobik takibe alındı Gelişim Potansiyelleri Embriyoların Gelişim Takibi Gelişim takibi yapılan embriyolarda, in vitro ortamda elde edilebilen en ileri düzey olan ZP yapılarından sıyrıldıkları ileri blastokist aşamasına kadar ilerlemeleri gözlemlendi ve geçirdikleri her aşama ışık mikroskobu altında değerlendirildi ve fotoğraflandı. Bu embriyoların ulaştıkları embriyonik aşamalar Tablo-1 de görülmektedir. Tablo 4: Embriyoların in vitro gelişim potansiyelleri Elde edilen embriyolar (n) Gelişimin 1. günü (n) Gelişimin 2. günü (n) Gelişimin 3. günü (n) Gelişimin 4. günü (n) Gelişimin 5. günü (n) 2PN (37) 2 hücreli (41) 3 hücreli (1) 2 hücreli (32) 8 hücreli (15) 6 hücreli (6) 4 hücreli (14) 2hücreli (6) 8 hücreli (8) 6 hücreli (12) 4 hücreli (3) 2 hücreli (1) Morula (19) 6 hücreli (4) 4 hücreli (8) 2 hücreli (6) 8 hücreli (21) 4 hücreli (1) 2 hücreli (1) Blastokist (19) Morula (16) 8 hücreli (5) 4 hücreli (1) 2 hücreli (1) Blastokist (15) Blastokist (16) 8 hücreli (3) Morula (3) Blastokist (3) 28

41 Pronüklear aşamada elde edilen 37 embriyodan, gelişimin 1. günü 33 tanesinin (%89,19); 2. günü 24 tanesinin (%64,86); 3. günü 23 tanesinin (%62,16); 4. günü 23 tanesinin (%62,16); 5. günü 16 tanesinin (%43,24) canlılıklarını koruduğu gözlendi. İki hücreli olarak elde edilen 41 adet embriyodan, gelişimin 1. günü 41 tanesinin (%100); 2. günü 37 tanesinin (%90,24); 3. günü 19 tanesinin (%46,34), 4. günü 15 tanesinin (36,58) ve sekiz hücreli olarak elde edilen 3 embriyodan da, gelişimin 1. ve 2. günlerinde 3 ünün de (%100) canlılıklarını korudukları gözlendi Partenotların Gelişim Takibi Süperovülasyondan saat sonra farelerin oviduktlarından toplanan oositlerin stronsiyum içeren CZB medyumunda aktive olmaları sağlanarak, elde edilen partenotların bir kısmı gelişim takibine, kalanlar elektron mikroskobik takibe alındı. Partenotların ulaştıkları embriyonik evreler Tablo 2 de verilmiştir. Tablo-5: Partenogenetik aktivasyon uygulanmış oositlerin gelişim potansiyelleri. Elde edilen partenotlar (n) Gelişimin 1. günü (n) Gelişimin 2. günü (n) Gelişimin 3. günü (n) Gelişimin 4. günü (n) GV (86) Dejenere (86) hücreli (1) MII (298) 2 hücreli (94) - 4 hücreli (31) 2 hücreli (39) 6 hücreli (3) 4 hücreli (20) 2 hücreli (25) Morula (2) 2 hücreli (1) Gelişimin 5. günü (n) Elde edilen germinal vezikül aşamasındaki oositlerin, CZB-Sr-SB solüsyonunda 150 dakika ve CZB-SB solüsyonunda 6 saat bekletildikten sonra herhangi bir aktivasyon belirtisi göstermediği ve ertesi gün yapılan kontrollerde dejenere oldukları görüldü. Ovüle olan olgun MII oositlerin ise aynı protokolle yapılan aktivasyon uygulamalarında, % 31,88 oranında başarı elde edildi. MII aşamasında elde edilen 298 adet oositten, gelişimin 1. günü aktive olan 95 adet partenotun 10 tanesi elektron mikroskobik takibe alındı. Kalan 85 adet partenottan, gelişimin 2. günü 70 tanesinin (%82,35); gelişimin 3. günü ise 48 tanesinin (%56,47) gelişimlerine devam ettikleri gözlendi ve 3. günde 5 tanesi elektron mikroskobik takibe alındı. Kalan 80 adet partenottan, gelişimin 4. günü 3 tanesi (%3,75) canlılığını korumakta idi. 4. gün yapılan 29

42 kontrollerde, aktive edilen tüm oositler içerisinde elde edilen en ileri düzey partenot olan kompakt morula evresi görüldü ve 2 adet morula evresindeki partenot elektron mikroskobik takibe alındılar. Aktive olan ve elektron mikroskobik takibe alınanlar dışında kalan toplam 80 adet partenot içerisinde %2,50 oranında morula evresine gelişim elde edildi Embriyo ve Partenotların Gelişimsel Potansiyellerinin İstatistiksel Değerlendirilmesi Doğal yolla fertilizasyon sonucu elde edilen pronüklear evre embriyolar ile aktivasyon sonucu elde edilen partenotların günler itibariyle in vitro ortamda gelişim dağılımlarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi sonucunda; 1. gündeki iki hücreli evreye gelişim potansiyelleri benzer ve anlamlı bulundu (p=0,98102). Ancak sonraki günlerde geliştikleri evreler farklı idi. (2. gün için p=0,00008, 3. gün için p=0,00084, 4. gün için p=0,0, 5. gün için p=0,0) (Şekil-1) p>0.05 anlamlı değer olarak kabul edildi. 30

43 Embriyo Gelişimsel oran (%) hücreli 70 3 hücreli 60 4 hücreli 50 6 hücreli 40 8 hücreli 30 kompakt A gün 2.gün 3.gün 4.gün 5.gün blastokist Gün Partenot Gelişimsel oran (%) hücreli 3 hücreli 60 4 hücreli 50 6 hücreli 40 8 hücreli kompakt blastokist B gün 2.gün 3.gün 4.gün 5.gün Gün Şekil-2: Pronüklear evrede elde edilen embriyolar ile partenotların günler itibariyle gelişimlerinin dağılımı. Embriyoların (A) ve partenotların (B) 1. günde iki hücreli evre embriyo ve partenotlara gelişim oranları benzer; 2., 3., 4. ve 5. günlerde ise partenotların embriyolara kıyasla düşük gelişim oranına sahip oldukları görüldü. (p>0.05) 31

44 4.2 Işık Mikroskobik Değerlendirme Doğal yolla fertilize olan ve in vivo gelişimlerinin çeşitli aşamalarında elde edilen embriyolar ile bu embriyoların in vitro koşullardaki gelişimleri; ayrıca, in vitro koşullarda çeşitli aşamalara gelişen partenotlar ışık mikroskop altında değerlendirilerek fotoğrafları çekildi Embriyoların Işık Mikroskobik Değerlendirilmesi 1. Kalite embriyolarda, blastomerler düzgün, küresel yapıda ve PVB içerisinde hiçbir ekstrasellüler fragmentasyon içermemekte idi. 2. Kalite embriyolar yine düzgün, küresel blastomerlere sahip ancak bir miktar ekstrasellüler fragmentasyon içermekte idi. 3. Kalite embriyolarda, blastomerler boyut ve şekil açısından bir miktar düzensiz ve belirgin olarak ekstrasellüler fragmentasyon dikkati çekti. 4. Kalite embriyolarda belirgin ekstrasellüler fragmentasyon nedeni ile blastomerler tek tek görünmekte idi. 32

45 Embriyo: Pronüklear Evre Pronüklear aşamada elde edilen embriyolar, düzgün ZP yapıları, 2 adet yuvarlak ya da ovoid şekilli düzgün yüzeyli kutup cisimcikleri (KC), granülarite ve vakuolizasyon içermeyen sitoplazma, 2 adet pronükleus (PN) görüntüleri sergiliyor ise 1. Kalite olarak değerlendirildi. Düzgün ZP yapılarına, iki KC ve iki PN a ve PVB içerisinde az miktarda fragmentasyona sahip embriyolar, 2. Kalite; düzgün olmayan ZP veya hücre yapısına, iki KC ve iki PN a ve belirgin fragmentasyona sahip embriyolar, 3. Kalite; fragmentasyonun yoğun olduğu ve neredeyse hücreyi gölgelediği embriyolar ise 4. Kalite pronüklear embriyolar olarak değerlendirildi. Tek düzlem fotoğraflarında bütün embriyolarda iki PN ve iki kutup cisimciğinin aynı karede görüntülenmesi sağlanamadı (Şekil-3). Şekil-3: Pronüklear embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. 1. Kalite embriyoda ZP yapıları düzgün, iki KC (A) ve iki PN (B) belirgin. 2. Kalite embriyoda ZP yapıları düzgün, iki KC ni atmış ancak sitoplazmik granülarite ve az miktarda ekstrasellüler fragmentasyon gözlenmekte (C, D). 3. Kalite embriyoda iki KC, sitoplazmik granülarite, belirgin fragmentasyon ve düzgün olmayan ZP yapısı (E); 4. Kalite embriyoda yoğun olarak fragmentasyon (F) görülmekte. 33

46 Embriyo: İki Hücreli Evre İki hücreli embriyolar, düzgün ZP ve blastomer yapısı ile eşit şekil ve büyüklükteki iki adet blastomerlere sahip olup, fragmentasyon içermiyorlarsa 1. Kalite; düzgün ZP ve blastomer yapıları, ancak eşit olmayan şekil ve büyüklükte iki adet blastomer ve/veya az miktarda sitoplazmik granülarite ve fragmentasyon içeriyorsa 2. Kalite; düzgün görünüm sergilemeyen blastomerler ve daha fazla sitoplazmik granülarite ve fragmentasyon içeriyor ise 3. Kalite; yoğun fragmentasyon nedeni ile tek tek blastomerler görülebiliyor ise 4. Kalite olarak değerlendirildi. (Şekil-4) Şekil-4: İki hücreli embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Düzgün ZP ve blastomer yapıları, eşit şekil ve büyüklükte blastomerlere sahip ve fragmentasyon içermeyen 1. Kalite embriyo (A). Düzgün ZP yapısına sahip ancak eşit büyüklükte olmayan iki adet blastomer içeren 2. Kalite embriyo (B). Eşit şekil ve büyüklükte olmayan ve sınırları seçilemeyen iki adet blastomere sahip, sitoplazmik granülarite ve fragmentasyon içeren 3. Kalite embriyo (C). Yoğun fragmentasyon gösteren, blastomer boyutları eşit olmayan 4. Kalite embriyo (D). 34

47 Embriyo: Dört Hücreli Evre Dört hücreli embriyolar, düzgün ZP ve blastomer yapıları ile eşit şekil ve büyüklükteki dört adet blastomere sahip olup, fragmentasyon içermiyorlarsa 1. Kalite; düzgün ZP ve blastomer yapısı, eşit olmayan şekil ve büyüklükte dört adet blastomer ve/veya az miktarda fragmentasyon içeriyorsa 2. Kalite; düzgün görünüm sergilemeyen blastomerler ve daha fazla fragmentasyon içeriyor ise 3. Kalite; yoğun fragmentasyon nedeni ile tek tek blastomerlerin görüntülendiği embriyolar ise 4. Kalite olarak değerlendirildi. (Şekil-5) Şekil-5: Dört hücreli embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Düzgün ZP yapısı, eşit şekil ve büyüklükte blastomer içeriği ile 1. Kalite embriyo (A). Düzgün ZP ve blastomer yapıları gösteren, eşit olmayan büyüklükte dört adet blastomer ve PVB ta az miktarda fragmentasyon içeren 2. Kalite embriyo (B). Eşit olmayan şekil ve büyüklükte blastomerler, sitoplazmik granülarite ve PVB ta fragmentasyon içeren 3. Kalite embriyo (C). Farklı şekil ve büyüklüklerde hücreler nedeni ile belirgin fragmentasyon görünümü sergileyen 4. Kalite embriyo (D). 35

48 Embriyo: Sekiz Hücreli Evre Sekiz hücreli embriyolar, düzgün ZP ve blastomer yapısı ile eşit şekil ve büyüklükteki sekiz adet blastomerlere sahip olup, fragmentasyon içermiyorlarsa 1. Kalite; düzgün ZP ve blastomer yapısı, eşit olmayan şekil ve büyüklükte sekiz adet blastomer ve az miktarda fragmentasyon içeriyorsa 2. Kalite; düzgün görünüm sergilemeyen blastomerler ve daha fazla fragmentasyon içeriyor ise 3. Kalite; yoğun fragmentasyon nedeni ile tek tek blastomerler görülebiliyorsa 4. Kalite olarak değerlendirildi. (Şekil-6) Şekil-6: Sekiz hücreli embriyoların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Düzgün ZP ve blastomer yapılarına, eşit şekil ve büyüklükteki sekiz adet blastomerlere sahip ve fragmentasyon içermeyen 1. Kalite embriyo (A). Oldukça eşit şekil ve büyüklükte sekiz adet blastomer ve az miktarda fragmentasyon içeren 2. Kalite embriyo (B). Düzgün olmayan ZP yapısı ve bir miktar fragmentasyon gösteren 3. Kalite embriyo (C). Eşit olmayan blastomerler ve belirgin fragmentasyon içeriği ile 4. Kalite (D). 36

49 Embriyo: Morula Evresi Morula evre embriyolar, düzgün ZP yapısına ve kompaksiyon gösteren blastomerlere sahip olup fragmentasyon göstermiyorlarsa 1. Kalite; düzgün ZP yapısına ve kompaksiyon gösteren blastomerlere sahip olup az miktarda fragmentasyon içeriyorlarsa 2. Kalite; fazla miktarda fragmentasyon içeriyorlarsa 3. Kalite; blastomer yapıları birbirine uymuyor ve yoğun fragmentasyon içeriyorlarsa 4. Kalite embriyolar olarak değerlendirildi. (Şekil-7) Şekil-7: Morulaların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Düzgün ZP yapısı ve kompaksiyon gösteren blastomerlere sahip 1. Kalite embriyo (A). Düzgün ZP yapısı ve kompaksiyon gösteren blastomerler ve az miktarda fragmentasyon içeren 2. Kalite embriyo (B). Düzgün ZP yapısı ve kompaksiyon gösteren blastomerlere sahip ancak genişlemiş PVB içerisinde fragmentasyon içeriği belirgin 3. Kalite embriyo (C). Düzgün olmayan ZP yapısı, genişlemiş PVB içerisinde fragmentasyon ve sitoplazmasında granülarite gösteren 4. Kalite embriyo (D). 37

50 Embriyo: Blastokist Evresi Blastokist evresindeki embriyolar, ileri aşamada olup olmamalarına göre düzgün ZP yapısına sahip, ZP yapılarından sıyrılmış ya da sıyrılmakta olan, blastosöl boşluğu gelişmiş ve fragmantaston göstermiyorlar ise 1. Kalite; bir miktar fragmentasyon içeriyorlarsa 2. Kalite; PVB genişlemiş ve fragmentasyon belirgin ise 3. Kalite; yoğun olarak fragmentasyona sahip ise 4. Kalite embriyolar olarak değerlendirildi. (Şekil-8) Şekil-8: Blastokistlerin ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Düzgün ZP yapısına sahip ya da ZP den sıyrılmakta (A) veya ZP den kurtulmuş (B), blastosöl boşluğu gelişmiş ve fragmentasyon içermeyen 1. Kalite embriyolar (A, B,C). Düzgün ZP yapısı ve gelişmiş blastosöle sahip ancak bir miktar fragmentasyon içeren 2. Kalite embriyo (D). Genişlemiş PVB içerisinde belirgin fragmentasyon gösteren 3. Kalite embriyo (E). Yoğun fragmentasyon içeriği arasında blastomerlerin tek tek bulunduğu, dejenerasyona giden 4. Kalite embriyo (F). 38

51 Partenotların Işık Mikroskobik Değerlendirilmesi Daha önce partenotlar için yapılmış herhangi bir kalitelendirme sistemi olmadığı için embriyolar için kullanılan üç kriter (blastomer boyutu ve regülaritesi, blastomer sitoplazmasının granülaritesi ve fragmentasyon) dikkate alınarak kaliteleri değerlendirildi Partenot: İki Hücreli Evre İki hücreli partenotlar, düzgün ZP ve blastomer yapısı ile eşit şekil ve büyüklükteki iki adet blastomerlere sahip olup, fragmentasyon içermiyorlarsa 1. Kalite; düzgün ZP ve blastomer yapıları ancak az miktarda fragmentasyon içeriyorsa 2. Kalite; düzgün görünüm sergilemeyen blastomerler ve daha fazla fragmentasyon içeriyor ise 3. Kalite; yoğun fragmentasyon nedeni ile tek tek blastomerler görüntülenebiliyor ise 4. Kalite olarak değerlendirildi. (Şekil-9) Şekil-9: İki hücreli partenotların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Düzgün ZP ve blastomer yapıları, eşit şekil ve büyüklükteki blastomerlere sahip ve fragmentasyon içermeyen 1. Kalite e partenot (A). Düzgün ZP ve blastomer yapılarına sahip ancak az miktarda fragmentasyon içeren 2. Kalite partenot (B). Belirgin fragmentasyon görüntüsü ile 3. Kalite partenot (C). Yoğun fragmentasyon gösteren 4. Kalite partenot (D). 39

52 Partenot: Dört Hücreli Evre Dört hücreli partenotlar, düzgün ZP ve blastomer yapısı ile eşit şekil ve büyüklükteki dört adet blastomerlere sahip olup, fragmentasyon içermiyorlarsa 1. Kalite; düzgün ZP ve blastomer yapıları ancak az miktarda fragmentasyon içeriyorsa 2. Kalite; düzgün görünüm sergilemeyen blastomerler ve daha fazla fragmentasyon içeriyor ise 3. Kalite; yoğun fragmentasyon nedeni ile tek tek blastomerler görüntülenebiliyor ise 4. Kalite olarak değerlendirildi. (Şekil-10) Şekil-10: Dört hücreli partenotların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Düzgün ZP yapısı ve blastomerlere sahip, eşit şekil ve büyüklüğe yakın görünüm sergileyen dört adet blastomer içeren 1. Kalite partenot (A). Düzgün ZP yapısı ancak eşit olmayan ve şekilleri çok düzgün olmayan blastomerlere sahip 2. Kalite partenot (B). Eşit olmayan blastomerlere, sitoplazmik granülariteye ve PVB içerisinde fragmentasyona sahip 4. Kalite partenot (C). 40

53 Partenot: Sekiz Hücreli Evre Sekiz hücreli partenotlar, düzgün ZP ve blastomer yapısı ile eşit şekil ve büyüklükteki sekiz adet blastomerlere sahip olup, fragmentasyon içermiyorlarsa 1. Kalite; düzgün ZP ve blastomer yapıları ancak az miktarda fragmentasyon içeriyorsa 2. Kalite; düzgün görünüm sergilemeyen blastomerler ve daha fazla fragmentasyon içeriyor ise 3. Kalite; yoğun fragmentasyon içeriyorlarsa 4. Kalite olarak değerlendirildi. (Şekil-11) Şekil-11: Sekiz hücreli partenotların ışık mikroskobik değerlendirilmesi. Düzgün ZP yapısı, eşit şekil ve büyüklükte sekiz adet blastomere sahip, az miktarda fragmentasyon içeren 2. Kalite partenot (A). Düzgün ZP yapısına ancak eşit olmayan şekil ve büyüklüklerde blastomerlere, sitoplazmik granülarite ve belirgin fragmentasyona sahip 3. Kalite partenot (B). 41

54 Partenot: Morula Evresi Morula evresindeki partenotlar, düzgün ZP yapısına ve kompaksiyon gösteren blastomerlere sahip olup fragmentasyon göstermiyorlarsa 1. Kalite; düzgün ZP yapısına ve kompaksiyon gösteren blastomerlere sahip olup az miktarda fragmentasyon içeriyorlarsa 2. Kalite; PVB ta fazla miktarda fragmentasyon içeriyorlarsa 3. Kalite; yoğun fragmentasyon içeriğine sahipler ise 4. Kalite partenotlar olarak değerlendirildi. (Şekil-12) A B Şekil-12: Morula evresindeki partenotların ışık mikroskopik değerlendirilmesi. Düzgün ZP yapısı ve kompaksiyon gösteren blastomerlere sahip ancak az miktarda fragmentasyon içeren 2. Kalite partenot (A). Düzgün ZP yapısı ancak birbirleri ile eşit büyüklükte olmayan blastomerler, belirgin fragmentasyon ve sitoplazmik granülarite içeren 3. Kalite partenot (B). 42

55 4.3. Elektron Mikroskobik Değerlendirme Elektron mikroskobik takibe alınan tüm embriyo ve partenotların, ışık mikroskop altında kalitelendirme sistemine göre 1. veya 2. Kalite olanlarının seçilmesine dikkat edildi. Embriyoları ve partenotları elektron mikroskobik düzeyde incelerken, sahip oldukları organellerin sitoplazma içerisinde bulundukları bölgeler, bireysel ya da topluluk halinde bulunup bulunmadıkları, sergiledikleri morfolojileri dikkate alındı. Bu sayede iki ana grup arasında karşılaştırma yapıldı. Sitoplazmaları genel olarak dört ayrı bölgede değerlendirildi. Bu bölgeler; i) Plazma membranının hemen altı, ii) Kortikal bölge, iii) Ara bölge, iv) Perinüklear bölge olarak tasarlandı Embriyoların İnce Yapısı Embriyo: Pronüklear Evre Elektron mikoskobik görüntüleri incelendiğinde; pronüklear aşamadaki embriyoların zona pellusidalarının, homojen yapıda olduğu ancak genelde ZP dış yüzeyinin düzgün bir sınırının olmadığı görüldü. Perivitellin boşluk içerisinde, sitoplazmik uzantıların enine ya da boyuna kesitleri, daha büyük veziküler yapılar ve diğer hücresel atıklar yer almaktaydı. Perivitellin boşluk içerisinde yer alan kutup cisimciğinin, embriyo ile aynı sitoplazmik ve membran yapısına sahip olduğu izlendi. Kutup cisimciğinin atılması sırasında zigotta az miktarda da olsa organel kaybının olduğu, kutup cisimciği içerisindeki fibriler kafes yapısı, lipid damlacıkları, mitokondriyonlar ve miyelin yapılar ile kanıtlanmaktaydı. Hem embriyonun hem de kutup cisimciğinin plazma membranı üzerinde boya kalıntılarına benzer yapılar görüldü. Sitoplazmik uzantıların, kutup cisimciğine bakan yüzeyde kısa oldukları ve az miktarda bulundukları; bu bölge dışında 43

56 kalan kısımlarda daha uzun oldukları ve de daha sık yerleştikleri izlendi. Ayrıca plazma membranında invajinasyonlar gözlendi (Şekil-13, 14). Sitoplazma içerisinde, özel olarak herhangi bir bölgede lokalizasyon göstermeyen ve tüm sitoplazmada homojen olarak dağılmış fibriler kafes yapıları, belirli bir düzene göre yerleşmek yerine değişik yönlere doğru uzanan yapılar şeklinde dikkat çekmekteydi. Ayrıca ribozomlar da tüm sitoplazma içerisinde rastgele dağılmış durumdaydılar. Plazma membranının hemen altında; bireysel ya da 1-2 tanesi yan yana bulunan mitokondriyonlar, bireysel miyelin yapılar ve koyu boyanan lizozomal yapılar yer almakta idi. Kortikal bölgede; tek tek ya da birkaç tane bir arada bulunan mitokondriyonlar, Golgi apparatus, koyu boyanan lizozomal yapılar, miyelin yapılar ayırt edildi. Lipid damlacıkları topluluğu, mitokondriyonlar ile çevrelenmiş olarak gözlendi. (Şekil-14) Kortikal ve perinüklear bölge arasında kalan ara bölge, organel açısından çok zengin bir görünüm sergilememekte idi. Bu geçiş bölgesinde mitokondriyonlar, koyu boyanan lizozomal yapılar, miyelin yapılar ve küçük veziküler yapılar görüldü. Perinüklear bölge, organellerin yoğun olarak toplandığı bölge olarak ayırt edildi. Mitokondriyonlar, miyelin yapılar, koyu boyanan lizozomal yapılar, veziküller, Golgi apparatus, agranüler endoplazmik retikulum (SER), granüler endoplazmik retikulum (GER) gibi organeller izlendi. (Şekil-15) 44

57 Şekil-13: Pronüklear embriyo ve atılan kutup cisimciği. KC ne bakan yüzeyde, plazma membranı üzerinde kısa ve seyrek olarak bulunan sitoplazmik uzantılar. Embriyo sitoplazmasında mitokondriyonlar (M), Golgi apparatus (G), miyelin yapılar (My). KC sitoplazmasında mitokondriyonlar (M), lipid damlacıkları (L), koyu boyanan lizozomal yapılar (Lz). 45

58 Şekil-14: Pronüklear embriyoda kortikal bölge. Plazma membranı üzerinde sitoplazmik uzantılar ve invajinasyonlar (ok); kortikal bölgede Golgi apparatus (G), lipid damlacıkları (L) topluluğu ve etrafındaki mitokondriyonlar (M), miyelin yapılar (My). 46

59 Şekil-15: Pronüklear embriyoda perinüklear bölge. Her yöne doğru uzanan, dağınık fibriler kafes (FK), mitokondriyonlar (M), miyelin yapılar (My), veziküler yapılar (V), granüler endoplazmik retikulum (GER), koyu boyanan lizozomal yapılar (Lz) ve nüklear kılıf (NK). Küçük fotoğrafta mitokondriyon yanında GER. 47

60 Embriyo: İki Hücreli Evre Bu aşamadaki embriyonun zona pellusidası oldukça homojen ve dış yüzeyi düzgün bir yapı sergilemekteydi (Şekil-16). Perivitellin boşlukta sitoplazmik parçalar ve atıklar dışında yer alan sitoplazmik uzantılar, ZP ye bakan yüzeylerde oldukça fazla miktarda bulunurken blastomerlerin birbirlerine bakan yüzeylerinde çok sınırlı sayıda bulundukları görüldü. Bu bölgede kesitin kortikal düzeyden geçmesi nedeniyle blastomerler arası perivitellin boşluk çok geniş ve sitoplazmik uzantılar çok az sayıda idi (Şekil-17). Plazma membranı üzerinde boya kalıntılarına benzer yapıların bu evre embriyolarında da bulunduğu ve perivitellin boşluktaki sitoplazmik uzantıların da çevresini sardığı izlendi. Plazma membranının invajinasyonlar gösterdiği görüldü. Plazma membranın hemen altında nadiren organel gözlendi. Salgı granülü benzeri dens yapılar ve koyu boyanan lizozomal yapılar dışında küçük veziküller ayırt edildi. Kortikal bölgede yer yer yoğun organel topluluklarının yer aldığı görüldü. Bireysel ya da topluluk halinde bulunan mitokondriyonlar, az sayıda miyelin yapılar, Golgi apparatus, SER, koyu boyanan lizozomal yapılar, küçük veziküler yapı toplulukları, bireysel ya da topluluk halinde lipid damlacıkları ve çevrelerinde mitokondriyonlar bu bölgede izlendi (Şekil-16). Blastomerlerin birbirlerine baktıkları kısımlarında küçük veziküler yapı toplulukları ya da dens granüler ve koyu boyanan lizozomal yapılar belirlendi (Şekil-17). Ara bölgede de kortikal bölgeye benzer şekilde lipid damlacıkları ve etraflarında mitokondriyonlar, miyelin yapılar, koyu boyanan lizozomal yapılar, SER ve küçük veziküler yapılar görüldü. Perinüklear bölge organelden zengin olarak izlendi. En fazla bulunan organel mitokondriyon idi. Ayrıca miyelin cisimcikler, Golgi apparatus, topluluklar oluşturan lipid damlacıkları belirlendi (Şekil-18). Çekirdek içerisinde kromatin ve kromatinler arası granül yığınların yanısıra nükleolus gelişiminin farklı evrelerini simgeleyen elektron-yoğun küreler halinde gözlenen fibriller ya da fibrillogranüler yapıdaki düzgün sınırlı nükleolus prekürsörü cisimler (NPC) dikkati çekti. Aynı çekirdek içerisinde nükleolusun farklı gelişim evrelerini simgelemekteydiler (Şekil-18). 48

61 Şekil-16: İki hücreli embriyoda kortikal bölge. Zona pellusida (ZP), perivitellin boşluk (PVB) ve içerisindeki sitoplazmik parçalar ve uzantılar görülmekte. Plazma membranı üzerinde boya kalıntıları benzeri yapılar ve kortikal bölgede yerleşen lipid damlacıkları (L), etraflarında mitokondriyonlar (M), miyelin yapılar (My), koyu boyanan lizozomal yapılar (Lz) ve tüm sitoplazma içinde dağılmış fibriler kafes. 49