artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı

Transkript

1 Eylül 2009 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 24 (katalog no ) 96 (katalog no ) Sürüm 1 Miktarsal in vitro tanılama Rotor-Gene Q Cihazları ile kullanım içindir , TR QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R TR Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN herhangi bir biyolojik örneğin içeriğinin izole edilmesine ve tespit edilmesine olanak sağlayan yeni örnek ve analiz teknolojilerinin önde gelen tedarikçisidir. İleri, yüksek kaliteli ürünlerimiz ve hizmetlerimiz örnekten sonuca başarıyı garantiler. QIAGEN aşağıdaki alanlarda standartları belirler: DNA, RNA ve proteinlerin saflaştırılması Nükleik asit ve protein analizleri mikrorna araştırması ve RNAi Örnek ve analiz teknolojilerinin otomasyonu Görevimiz müstesna başarıya ve büyük ilerlemelere erişmeniz için olanak sağlamaktır. Daha fazla bilgi için adresini ziyaret edin.

3 İçindekiler Kit İçeriği 4 Semboller 4 Saklama 5 Amaçlanan Kullanım 5 Ürün Kullanım Sınırlamaları 6 Teknik Destek 6 Kalite Kontrolü 6 Güvenlik Bilgileri 7 Giriş 8 İlke 8 Patojen bilgileri 8 Performans özellikleri 9 Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Cihaz ve Ayıraçlar 14 Önemli Notlar 15 Genel önlemler 15 DNA izolasyonu 15 Dahili kontrol 16 Miktar tespiti 16 Protokol: PCR ve Veri Analizi 18 Sorun Giderme Kılavuzu 27 Referanslar 30 Sipariş Verme Bilgileri 31 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009 3

4 Kit İçeriği artus BK Virus RG PCR Kit (24) (96) Katalog no Reaksiyon sayısı Mavi BK Virus RG Master 2 x 12 reaksiyon 8 x 12 reaksiyon Sarı BK Virus RG Mg-Sol* 400 μl 400 μl Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı BK Virus RG QS 1 (1 x 10 4 kopya/μl) BK Virus RG QS2 (1 x 10 3 kopya/μl) BK Virus RG QS3 (1 x 10 2 kopya/μl) BK Virus RG QS4 (1 x 10 1 kopya/μl) 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl Yeşil BK Virus RG IC 1000 μl 2 x 1000 μl Beyaz Water (PCR grade) 1000 μl 1000 μl El Kitabı 1 1 * Magnezyum solüsyonu. Miktar tespit standardı. Dahili kontrol. Semboller <N> <N> test için yeterli ayıraca sahiptir Son kullanma tarihi İn vitro tanı amaçlı tıbbi cihaz Katalog numarası 4 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

5 Lot sayısı Materyal numarası Bileşenler İçerik Numara Sıcaklık sınırlamaları Yasal üretici El kitabında verilen bilgilere başvurun Önemli not Saklama artus BK Virus RG PCR Kit bileşenlerinin -20 C de saklanması gerekir ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihi gelene kadar stabildir. Tahlil duyarlılığını azaltabileceği için tekrar tekrar erime ve donma (>2 x) durumlarından kaçınılmalıdır. Eğer ayıraçlar sadece aralıklı olarak kullanılacaksa, alikotlar halinde dondurulmaları gerekmektedir. 2 8 C sıcaklıkta saklama, 5 saatlik bir süreyi aşmamalıdır. Amaçlanan Kullanım artus BK Virus RG PCR Kit, insan plazma veya idrarındaki BK virüsü DNA sının miktarını belirlemek için kullanılan bir in vitro nükleik asit amplifikasyon testidir. Bu tanılama test kiti polimeraz zincir reaksiyonunu (PCR) kullanır ve Rotor-Gene Q Cihazları ile kullanım için ayarlanmıştır. artus BK Virus RG PCR Kit, Rotor-Gene Q 2plex Cihazları ile kullanılamaz. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009 5

6 Ürün Kullanım Sınırlamaları Ürün, sadece in vitro tanı prosedürlerinde (EN375) özel olarak bilgilendirilmiş ve eğitilmiş personel tarafından kullanılacaktır. En uygun PCR sonuçları için, kullanıcı kılavuzuna kesinlikle uyulması gerekmektedir. Tüm bileşenlerin etiketlerine ve kutusuna basılmış olan son kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanma tarihi geçmiş olan bileşenleri kullanmayın. Teknik Destek QIAGEN de, sunduğumuz teknik desteğin kalitesi ve ulaşılabilirliğiyle gurur duyarız. Teknik Servis Bölümlerimizin personeli, örnek ve tahlil teknolojilerinde ve QIAGEN ürünlerinin kullanımında geniş pratik ve teorik uzmanlığa sahip deneyimli bilim insanlarından oluşmaktadır. artus BK Virus RG PCR Kit veya genel olarak QIAGEN ürünleriyle ilgili sorularınız varsa veya herhangi bir zorluk yaşıyorsanız, lütfen bizi aramakta tereddüt etmeyin. QIAGEN müşterileri, ürünlerimizin gelişmiş veya özelleşmiş kullanımına ilişkin olarak başlıca bilgi kaynaklarından biridir. Bu bilgiler, diğer bilim insanlarının yanı sıra QIAGEN deki araştırmacılar için de yararlı olmaktadır. Bu nedenle, sizi ürün performansına veya yeni uygulamalara ve tekniklere ilişkin önerilerinizi bize iletmeye teşvik etmek isteriz. Teknik destek ve daha fazla bilgi için lütfen adresindeki Technical Support Center (Teknik Destek Merkezine) bakın veya QIAGEN Teknik Servis Bölümlerini ya da yerel distribütörlerimizden birini arayın (arka kapağa bakın veya adresini ziyaret edin). Kalite Kontrolü QIAGEN in ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemi ne göre, her artus BK Virus RG PCR Kit lotu, tutarlı ürün kalitesi sağlamak amacıyla önceden belirlenmiş spesifikasyonlar doğrultusunda test edilmektedir. 6 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

7 Güvenlik Bilgileri Kimyasal maddelerle çalışırken her zaman uygun bir laboratuar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Daha fazla bilgi almak için uygun Material Safety Data Sheets (Malzeme Güvenlik Veri Formları) (MSDS) belgelerine başvurun. Her QIAGEN kitinin ve kit bileşeninin MSDS belgesini adresinde çevrimiçi olarak kullanımı kolay ve kompakt PDF dosyaları biçiminde bulabilir, görüntüleyebilir ve yazdırabilirsiniz. Örnek ve analiz atıklarını yerel güvenlik yönetmeliklerine uygun şekilde atın. 24 saat ulaşılabilecek acil bilgi hattı İngilizce, Fransızca ve Almanca dillerinde acil tıbbi bilgiler günün 24 saati boyunca aşağıdaki adresten alınabilir: Die Beratungsstelle bei Vergiftungen (Zehir Bilgi Merkezi) Mainz, Almanya Tel: artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009 7

8 Giriş artus BK Virus RG PCR Kit, BK virüsü DNA sının Rotor-Gene Q Cihazları üzerinde polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile tespitine yönelik kullanıma hazır bir sistemdir. BK Virus RG Master, BK virus genomunun 274 baz çiftlik bir bölgesinin özgün amplifikasyonuna yönelik ve özgün amplikonun Rotor-Gene Q veya Rotor-Gene 6000 in Cycling Green floresans kanalında doğrudan tespiti amaçlı enzimler ve ayıraçlar içerir. Buna ek olarak, artus BK Virus RG PCR Kit olası PCR engellemesi tespiti için ikinci bir heterolog amplifikasyon sistemi içerir. Bu, Rotor-Gene Q veya Rotor- Gene 6000 in Cycling Orange floresans kanalında dahili bir kontrol (IC) olarak tespit edilir. Analitik BK Virus PCR sinin saptama sınırı azalmaz (bkz. Analitik hassasiyet, sayfa 9). Viral DNA nın miktarının tayinine olanak sağlayan harici pozitif kontroller (BK Virus RG QS 1 4) sağlanmıştır. Daha fazla bilgi için, bkz. Miktar tespiti, sayfa 16. İlke Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile patojen tespiti, patojen genomunun özgün bölgelerinin amplifikasyonuna dayanır. Gerçek zamanlı PCR de amplifiye edilen ürün floresans boyalarla tespit edilir. Bunlar genellikle amplifiye edilmiş ürüne özgün olarak bağlanan oligonükleotid problara tutturulmuşlardır. Floresans şiddetlerinin PCR çalışması sırasında (yani gerçek zamanlı) takip edilmesi, biriken ürünün, PCR çalışması sonrası reaksiyon tüplerinin yeniden açılmasını gerektirmeden tespitine ve miktarının saptanmasına imkan sağlar.* Patojen bilgileri BK virüsü (BKV) polyomavirüslerinden bir DNA virüsüdür. Primer enfeksiyon temel olarak çocukluk çağında olur ve genellikle asemptomatiktir. Yetişkinlerde seroprevalans %90 a kadardır. Primer enfeksiyon sonrasında BKV böbrek hücrelerinde latent durumda kalır ve transplantasyon gibi immün yetmezlik durumlarında tekrar aktif hale gelebilir. BKV enfeksiyonu böbrek transplantı hastalarında tübolointerstisyel nefrit ve üreter stenozu ve kemik iliği transplantı yapılmış olanlarda hemorajik sistit ile ilişkilidir. Ayrıca vaskülopati, pnömoni, ensefalit, retinit ve hatta çoklu organ yetmezliği hastalık paternleriyle ilişkili bulunmuştur. Renal transplant hastalarında polyomavirüs ile ilişkili nefropatinin (PAN) tipik özelliği uzun süreli yüksek düzey BKV replikasyonudur. Klinik olarak ilgili enfeksiyonlar çoğunlukla immünosüpresyon bulunan hastalarla sınırlıdır. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

9 Performans özellikleri Analitik hassasiyet artus BK Virus RG PCR Kit in analitik hassasiyetini belirlemek için 10 dan nominal 0,001 kopya eşdeğeri/μl ye standart bir seyreltme serisi hazırlanmış ve artus BK Virus RG PCR Kit ile kombinasyon halinde Rotor-Gene 6000 üzerinde analiz edilmiştir. Test, 3 ayrı günde 8 replikat üzerinde yapılmıştır. Sonuçlar, probit analiziyle belirlenmiştir. artus BK Virus RG PCR Kit in Rotor-Gene Q/6000 ile kombinasyon halindeki analitik saptama sınırı, tutarlı olarak 0,195 kopya/μl (p = 0,05) şeklindedir. Bu durum 0,195 kopya/μl nin %95 olasılıkla tespit edileceği anlamına gelir. Şekil 1. Probit analizi: BK Virüsü (Rotor-Gene 6000). artus BK Virus RG PCR Kit in Rotor- Gene 6000 üzerindeki analitik hassasiyeti. Özgünlük artus BK Virus RG PCR Kit in özgünlüğü, esas olarak ve öncelikle primerler ve prob seçiminin yanı sıra sıkı reaksiyon koşullarının seçimiyle garanti edilmiştir. Primerler ve problar, olası homolojileri bakımından gen bankalarında yer alan tüm yayınlanmış sekanslar için sekans karşılaştırma analiziyle kontrol edilmiştir. Bu şekilde tüm ilgili suşların saptanabilirliği aşağıdaki suşlarla (bkz. Tablo 1) Rotor-Gene Cihazlarında PCR çalışması ve veri tabanı hizalaması ile garanti edilmiştir. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009 9

10 Tablo 1. İlgili suşların özgünlüğünün test edilmesi Virüs Suş Kaynak BK virüsü (Cycling Green) Dahili kontrol (Cycling Orange)) BK virüsü Dunlop ATCC* + + BK virüsü Gardner ATCC + + BK virüsü AB Geneart + + BK virüsü S72390 Geneart + + * American Type Culture Collection. Özgünlük ayrıca 30 farklı BK virüsü negatif plazma örneğiyle doğrulanmıştır. Bunlar, BK Virus RG Master içine dahil edilen BK virüsüne özgü primerler ve problar ile herhangi bir sinyal oluşturmamıştır. artus BK Virus RG PCR Kit ile potansiyel çapraz reaksiyon oluşma durumu Tablo 2 de liste halinde verilen kontrol grubuyla test edilmiştir. Test edilen patojenlerin hiçbiri reaktif olmamıştır. Mikst enfeksiyonlarla herhangi bir çapraz reaksiyon görülmemiştir. Tablo 2. Kitin özgünlüğünün çapraz reaksiyona girebilecek patojenlerle test edilmesi BK virüsü Dahili kontrol Kontrol grubu (Cycling Green) (Cycling Orange) Sitomegalovirüs + Epstein-Barr virüsü + İnsan herpes virüsü 1 (herpes simplex virüsü 1) İnsan herpes virüsü 2 (herpes simplex virüsü 2) İnsan herpes virüsü 3 (varicella-zoster virüsü) İnsan herpes virüsü 6 + JC virüsü + Simian virüs 40 + Candida albicans + 10 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

11 Kesinlik artus BK Virus RG PCR Kit in kesinlik verileri Rotor-Gene Cihazları kullanılarak toplanmıştır ve tahlilin toplam değişkenliğinin belirlenmesine olanak tanır. Toplam değişkenlik, tahlil içi değişkenlik (bir deneydeki aynı konsantrasyona sahip örneklerin çoklu sonuçlarındaki değişkenlik), tahliller arası değişkenlik (tahlilin tek bir laboratuarda farklı çalışanlar tarafından aynı tipteki farklı cihazlar üzerinde üretilmiş çoklu sonuçlarındaki değişkenlik) ve kümeler arası değişkenlikten (tahlilin çeşitli kümeler kullanılarak elde edilmiş çoklu sonuçlarındaki değişkenlik) oluşur. Elde edilen veriler, patojene özgün ve dahili kontrol PCR işlemi için standart sapma, varyans ve varyasyon katsayısının tayininde kullanılmıştır. artus BK Virus RG PCR Kit işleminin kesinlik verileri, en düşük konsantrasyonun (QS 4; 1 x 10 1 kopya/μl) miktar tespiti standardı kullanılarak toplanmıştır. Test, 8 replikatla yapılmıştır. Kesinlik verileri, amplifikasyon eğrilerinin C T değerleri temel alınarak hesaplanmıştır (C T : eşik çevrim, bkz. Tablo 3, sayfa 12). Bu sonuçlara dayanarak, bahsedilen konsantrasyondaki herhangi bir örneğin genel istatistiksel dağılımı %2,11 (C T ) ve dahili kontrolün tespiti için %3,59 (C T ) şeklindedir. Bu değerler, belirlenmiş değişkenliklerin tüm bireysel değerlerinin tamamına dayandırılmıştır. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

12 Tablo 3. Kesinlik verileri, C T değerleri temelinde Tahlil içi değişkenlik: BK Virus RG QS 4 Tahlil içi değişkenlik: Dahili kontrol Tahliller arası değişkenlik: BK Virus RG QS 4 Tahliller arası değişkenlik: Dahili kontrol Kümeler arası değişkenlik: BK Virus RG QS 4 Kümeler arası değişkenlik: Dahili kontrol Toplam varyans: BK Virus RG QS 4 Toplam varyans: Dahili kontrol C T değeri Standart sapma Varyasyon katsayısı (%) 29,45 0,17 0,56 24,31 0,12 0,49 29,42 0,25 0,85 23,30 0,77 3,30 30,31 0,64 2,10 22,53 0,40 1,78 29,80 0,63 2,11 23,12 0,83 3,59 Dayanıklılık Dayanıklılık doğrulanması artus BK Virus RG PCR Kit toplam başarısızlık oranının belirlenmesine olanak tanır. 30 BK virüsü negatif örneğe BK virüsü kontrol DNA sından 1 kopya/μl elüsyon hacmi eklenmiştir (analitik hassasiyet sınırının yaklaşık beş katı konsantrasyon). EZ1 DSP Virus Kit ile çıkarım sonrasında (bkz. DNA izolasyonu, sayfa 15), bu örnekler artus BK Virus RG PCR Kit ile analiz edildi. 30 örneğin hepsi için başarısızlık oranı %0 oldu. Ayrıca dahili kontrol dayanıklılığı 30 BK virüsü negatif örneğin saflaştırılması ve analizi ile değerlendirildi. Toplam başarısızlık oranı %0 oldu. Engelleme izlenmedi. Bu şekilde artus BK Virus RG PCR Kit dayanıklılığı %99 dur. Tekrarlanabilirlik Tekrarlanabilirlik verileri artus BK Virus RG PCR Kit için düzenli performans değerlendirmesi yapılması ve ayrıca başka ürünlerle etkinlik karşılaştırılması yapılmasını mümkün kılar. Bu veriler yerleşmiş etkinlik programlarına katılarak elde edilir. 12 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

13 Tanısal değerlendirme artus BK Virus RG PCR Kit halen bir dizi değerlendirme çalışmasından geçmektedir. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

14 Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Cihaz ve Ayıraçlar Kimyasal maddelerle çalışırken her zaman uygun bir laboratuar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Daha fazla bilgi almak için ürün tedarikçisinden edinilebilen uygun Material Safety Data Sheets (Malzeme Güvenlik Veri Formları) (MSDS) belgelerine başvurun. DNA izolasyon kiti (bkz. DNA izolasyonu, sayfa 15) Pipetler (ayarlanabilir)* Filtreli steril pipet uçları Vorteks karıştırıcı* 2 ml lik reaksiyon tüpleri için rotoru olan tezgah üstü santrifüj* Cycling Green ve Cycling Orange için floresans kanalları olan Rotor-Gene Q veya Rotor-Gene Cihazı* Rotor-Gene Q software sürümü (Rotor-Gene 6000 yazılım sürümü ) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml, 72 yuvalı rotorla kullanım için (kat. no veya ) Alternatif olarak: PCR Tubes, 0,2 ml, 36 yuvalı rotorla kullanım için (kat. no veya ) Soğutma bloğu (Loading Block (Yükleme Bloğu) 72 x 0,1 ml Tubes, kat. no veya Loading Block (Yükleme Bloğu) 96 x 0,2 ml Tubes kat. no ) * Cihazların kontrol ve kalibrasyonunun üreticinin önerileri doğrultusunda yapılmasını sağlayın. artus BK Virus RG PCR Kit, Rotor-Gene Q 2plex Cihazları ile kullanılamaz. 14 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

15 Önemli Notlar Genel önlemler Kullanıcı aşağıdaki hususlara her zaman dikkat etmelidir: Filtreli steril pipet uçları kullanın. Pozitif materyalleri (numuneler, pozitif kontroller ve amplikonlar), diğer tüm reaktiflerden ayrı olarak depolayıp çıkarın ve bunları reaksiyon karışımına mekansal olarak ayrı bir tesiste ekleyin. Tahlile başlamadan önce tüm bileşenleri oda sıcaklığında (15 25 C) iyice çözün. Çözüldüğünde, bileşenleri kısa sürede karıştırın (hızla yukarı-aşağı pipetleyerek veya puls vorteks kullanarak) ve santrifüje alın. Hızlı çalışın ve bileşenleri buz üzerinde veya soğutma bloğunda (72/96 yuvalı yükleme bloğu)tutun. DNA izolasyonu EZ1 DSP Virus Kit (QIAGEN, kat. no )*, EZ1 Advanced DSP Virus Card (kat. no ) ile EZ1 Advanced (kat. no ) üzerinde, artus BK Virus RG PCR Kit ile kullanım için insan plazma ve idrarından viral nükleik asit saflaştırılması bakımından doğrulanmıştır. Viral DNA saflaştırmasını EZ1 DSP Virus Kit El kitabında verilen talimatlar doğrultusunda gerçekleştirin. artus BK Virus RG PCR Kit fenol-bazlı izolasyon yöntemleriyle kullanılmamalıdır. Taşıyıcı RNA nın kullanımı, çıkarım yeterliliği açısından ve dolayısıyla DNA/RNA verimi bakımından elzemdir. EZ1 DSP Virus Kit El Kitabında verilen talimatlar doğrultusunda, her çıkarıma uygun bir miktar taşıyıcı RNA ekleyin. artus BK Virus RG PCR Kit in dahili kontrolü, izolasyon prosedüründe doğrudan kullanılabilir (bkz. Dahili kontrol, sayfa 16). EZ1 DSP Virus Kit kullanılarak çıkarımdan hemen sonra PCR için saflaştırılmış viral nükleik asitlerin kullanılmasını kuvvetle öneririz. Alternatif olarak elüatlar PCR analizi öncesinde 4 C de 3 güne kadar saklanabilir. * EZ1 DSP Virus Kit aynı zamanda CE-IVD işaretli EASYartus BK Virus RG PCR Kitleri olarak artus BK Virus RG PCR Kit ile kombinasyon halinde sağlanabilir (sipariş verme bilgileri için bkz. sayfa 31). artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

16 Dahili kontrol Dahili kontrol (BK Virus RG IC) temin edilmiştir. Bu, kullanıcının hem DNA izolasyon prosedürünü hem de olası PCR engellemelerini kontrol etmesine olanak tanır. Bu uygulama için, dahili kontrolü izolasyona her 1 μl elüsyon hacmi için 0,1 μl oranında ekleyin. Örneğin, viral nükleik asitler EZ1 DSP Virus Kit ile 60 μl elüsyon tamponu (AVE) içerisinde erimişse, ilk aşamada dahili kontrolden 6 μl eklenmelidir. Dahili kontrol ve taşıyıcı RNA (bkz. DNA izolasyonu, sayfa 15), sadece lizis tamponu ve örnek materyal karışımına veya doğrudan lizis tamponuna eklenmelidir. Dahili kontrol doğrudan örnek materyale eklenmemesi şarttır. Lizis tamponuna eklenmişse, lütfen dahili kontrol ve lizis tamponu-taşıyıcı RNA karışımının taze hazırlanıp hemen kullanılması gerektirdiğini unutmayınız (karışımın sadece bir iki saat oda sıcaklığı veya buzdolabında saklanması, dahili kontrol başarısızlığına ve düşük çıkarım verimine yol açabilir). Dahili kontrol ve taşıyıcı RNA yı doğrudan örnek materyale eklemeyin. Seçenek olarak dahili kontrol, tamamen, olası PCR engellemelerinin kontrolüne yönelik kullanılabilir. Bu uygulama için dahili kontrolü doğrudan protokolün 2b basamağında tarif edildiği gibi (sayfa 19) BK Virus RG Master ve BK Virus RG Mg-Sol, karışımına ekleyin. Miktar tespiti Ekteki miktar tespit standartları (BK Virus RG QS 1 4), önceden saflaştırılmış örnekler olarak kabul edilir ve aynı hacim kullanılır (15 μl). Rotor-Gene Q Cihazları üzerinde bir standart eğri oluşturmak için 4 miktar tespit standardının hepsi kullanılmalı ve Edit Samples ( Örnekleri Düzenle ) diyalog kutusunda belirtilmiş konsantrasyonlardaki standartlar olarak tanımlanmalıdır (bkz. cihaz kullanım kılavuzu). Miktar tespit standartları kopya/μl cinsinden tanımlanmıştır. Standart eğri kullanılarak tayin edilen değerleri örnek materyalde kopya/ml olarak çevirmek için, aşağıdaki denklemin uygulanması gerekir: Sonuç (kopya/ml) = Sonuç (kopya/μl) x Elüsyon Hacmi (μl) Örnek Hacmi (ml) İlke olarak, yukarıdaki denkleme ilk örnek hacmi girilmelidir. Bu durum, örnek hacminin nükleik asit çıkarması öncesi değiştirildiği hallerde (örneğin, hacmin santrifüjle azaltılması veya izolasyon için gereken hacme ekleme yollu yükseltilmesi gibi) değerlendirilmelidir. 16 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

17 QIAGEN Teknik Servislerinde Rotor-Gene Cihazlarında patojen tespit sistemlerinin miktarsal analizine yönelik bir kılavuz mevcuttur ( Technical Note for quantitation on Rotor-Gene Instruments ). artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

18 Protokol: PCR ve Veri Analizi Başlamadan önce önemli hususlar Prosedüre başlamadan önce sayfa deki Önemli Notlar ı okuyun. Protokole başlamadan önce Rotor-Gene Q ya aşina hale gelin. Cihaz kullanım el kitabına bakın. Her PCR çalışması için en az bir miktar tespit standardının yanı sıra bir negatif kontrol (Su, PCR kalitesinde) dahil edildiğinden emin olun. Standart eğri oluşturmak için, her PCR çalışmasında, verilmiş olan 4 miktar tespit standardının hepsini (BK Virus RG QS 1 4) kullanın. Başlamadan önce yapılması gerekenler Soğutma bloğunun (Rotor-Gene Q Cihazının aksesuarı) 2 8 C ye önceden soğutulmuş olduğundan emin olun. Her kullanımdan önce bütün ayıraçların tamamen çözülmesi, karıştırılması (yukarı-aşağı tekrar tekrar pipetleyerek veya kısaca vorteks kullanarak) ve kısa süre santrifüjlenmesi gerekmektedir. Prosedür 1. İstenen sayıda PCR tüpünü soğutma bloğunun adaptörlerine yerleştirin. 2. DNA izolasyon prosedürünü izlemek için ya da olası PCR engellemesini kontrol etmek amacıyla dahili kontrol kullanıyorsanız, 2a basamağını takip edin. Dahili kontrolü sadece PCR engellemesini kontrol amacıyla kullanıyorsanız, 2b basamağını takip edin. 2a. Dahili kontrol izolasyona eklenmiş durumdadır (bkz. Dahili kontrol, sayfa 16). Bu durumda, Tablo 4 doğrultusunda bir ana karışım hazırlayın. Reaksiyon karışımı tipik olarak örnek haricinde PCR için gereken bütün bileşenleri içerir. 18 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

19 Tablo 4. Ana karışımın hazırlanması (dahili kontrol, DNA izolasyonu işlemini izlemek için ve olası PCR engellemesini kontrol etmek amacıyla kullanıldığında) Örnek sayısı 1 12 BK Virus RG Master 7 μl 84 μl BK Virus RG Mg-Sol 3 μl 36 μl BK Virus RG IC 0 μl 0 μl Toplam hacim 10 μl 120 μl 2b. Dahili kontrolün doğrudan BK Virus RG Master ve BK Virus RG Mg- Sol karışımına eklenmesi gerekir. Bu durumda, Tablo 5 doğrultusunda bir ana karışım hazırlayın. Reaksiyon karışımı tipik olarak örnek haricinde PCR için gereken bütün bileşenleri içerir. Tablo 5. Ana karışımın hazırlanması (dahili kontrol sadece PCR engellemesini kontrol amacıyla kullanıldığında) Örnek sayısı 1 12 BK Virus RG Master 7 μl 84 μl BK Virus RG Mg-Sol 3 μl 36 μl BK Virus RG IC 1,5 μl 18 μl Toplam hacim 11,5 μl* 138 μl* * PCR tahlilini hazırlarken dahili kontrolün eklenmesiyle oluşan hacim artışı dikkate alınmaz. Tespit sisteminin hassasiyeti etkilenmez. 3. Her bir PCR tüpüne ana karışımdan 10 μl pipetleyin. Sonra, elüsyon yapılmış örnek DNA dan 15 μl ekleyin (bkz. Tablo 6). Buna göre en az bir miktar tespit standardından (BK Virus RG QS 1 4) 15 μl pozitif kontrol olarak ve 15 μl su (Su, PCR kalitesinde) negatif kontrol olarak kullanılmalıdır. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

20 Tablo 6. PCR tahlilinin hazırlanması Örnek sayısı 1 12 Ana karışım 10 μl Her birinden 10 μl Örnek 15 μl Her birinden 15 μl Toplam hacim 25 μl Her birinden 25 μl 4. PCR tüplerini kapatın. Tüplerin çalıştırma sırasında kazayla açılmalarını engellemek için kilitleme halkasının (Rotor-Gene Cihazının aksesuarı) rotorun üzerine yerleştirildiğinden emin olun. 5. BK virus DNA sının tespiti için, aşağıdaki basamaklara göre bir sıcaklık profili oluşturun. Genel tahlil parametrelerinin ayarlanması Şekil 2, 3, 4 Hot-start enziminin ilk etkinleştirilmesi Şekil 5 DNA amplifikasyonu Şekil 6 Floresans kanal hassasiyetinin ayarlanması Şekil 7 Çalışmanın başlatılması Şekil 8 Bütün spesifikasyonlar, Rotor-Gene Q software sürümü ve Rotor-Gene 6000 software sürümü içindir. Rotor-Gene Cihazlarının programlanması hakkında daha fazla bilgi için lütfen cihaz el kitabına başvurun. Şekillerde bu ayarlar koyu siyahla çerçevelenmiştir. Rotor-Gene Q Cihazları için şekiller dahil edilmiştir. 20 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

21 6. Öncelikle, New Run Wizard ( Yeni Çalışma Sihirbazı ) diyalog kutusunu açın (Şekil 2). Locking Ring Attached ( Kilitleme Halkası Takılı ) kutusunu işaretleyin ve Next ( Sonraki ) simgesine tıklayın. Şekil 2. New Run Wizard ( Yeni Çalışma Sihirbazı ) diyalog kutusu. 7. PCR reaksiyon hacmi için 50 yi seçin ve Next (Sonraki) simgesine tıklayın (Şekil 3). Şekil 3. Genel tahlil parametrelerinin ayarlanması. Fiziksel reaksiyon hacmi 25 μl olmasına rağmen Rotor-Gene yazılımında reaksiyon hacmi olarak 50 seçtiğinizden emin olun. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

22 8. Sonraki New Run Wizard ( Yeni Çalışma Sihirbazı ) diyalog kutusunda Edit Profile ( Profil Düzenle ) düğmesine tıklayın (Şekil 4) ve sıcaklık profilini Şekil 4 6 da gösterildiği gibi programlayın. Şekil 4. Profilin düzenlenmesi. Şekil 5. Hot-start enziminin ilk etkinleştirilmesi. 22 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

23 Şekil 6. DNA amplifikasyonu. Yapışma basamağında touchdown fonksiyonunu 10 çevrim için etkinleştirdiğinizden emin olun. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

24 9. Floresans kanallarının tespit aralığı, PCR tüplerindeki floresans şiddetlerine göre belirlenmelidir. Auto-Gain Optimisation Setup ( Oto-Kazanım Optimizasyon Ayarları ) diyalog kutusunu açmak için New Run Wizard ( Yeni Çalışma Sihirbazı ) diyalog kutusundaki Gain Optimisation ( Kazanım Optimizasyonu ) kısmına tıklayın (bkz. Şekil 4). Amplifikasyon programının yapışma sıcaklığına uyması için (Şekil 7) kalibrasyon sıcaklığını 65 olarak ayarlayın. Şekil 7. Floresans kanal hassasiyetinin ayarlanması. 24 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

25 10. Kanal kalibrasyonuyla belirlenen kazanım değerleri, otomatik olarak kaydedilir ve programlama prosedürünün son menü penceresinde listelenir (Şekil 8). Start Run ( Çalışmayı Başlat ) simgesine tıklayın. Şekil 8. Çalışmanın başlatılması. 11. Çalışma bittiğinde, verileri analiz edin. Aşağıda belirtilen sonuçlar (11a, 11b, ve 11c) mümkündür. Pozitif ve negatif PCR reaksiyonları için örnekler Şekil 9 ve Şekil 10 da verilmiştir. 11a.Cycling Green floresans kanalında bir sinyal tespit edildi. Analiz sonucu pozitif: örnek, BK virus DNA sı içeriyor. Bu durum için, Cycling Orange kanalında sinyal tespiti önemsizdir çünkü BK virus DNA sının yüksek başlangıç konsantrasyonu (Cycling Green kanalında pozitif sinyal) dahili kontrolün Cycling Orange kanalında azalmasına veya sıfır floresans sinyali vermesine yol açabilir (rekabet). 11b.Cycling Green floresans kanalında hiçbir sinyal tespit edilmedi. Aynı zamanda, dahili kontrolden Cycling Orange kanalında bir sinyal belirlenir. Örnekte tespit edilebilen BK virus DNA sı yok. Sonuç negatif olarak değerlendirilebilir. Negatif bir BK Virüs PCR si durumunda, dahili kontrolün tespit edilen sinyali, PCR engellemesi olasılığını ortadan kaldırır. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

26 11c.Cycling Green veya Cycling Orange kanallarında hiçbir sinyal tespit edilmedi. Hiçbir sonuca varılamaz. Hata kaynakları ve çözümlerine dair bilgiler sayfa 27, Sorun Giderme Kılavuzu nda bulunabilir. Şekil 9. Miktar tespit standartlarının (BK Virus RG QS 1 4) Cycling Green floresans kanalında tespiti. NTC: Şablon kontrolü yok (negatif kontrol). Şekil 10. Dahili kontrolün (IC) miktar tespit standartlarının (BK Virus RG QS 1 4) eşzamanlı amplifikasyonu ile Cycling Orange floresans kanalında tespiti. NTC: Şablon kontrolü yok (negatif kontrol). 26 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

27 Sorun Giderme Kılavuzu Bu sorun giderme kılavuzu, ortaya çıkabilecek sorunların çözülmesinde yardımcı olabilir. Daha fazla bilgi almak için, Technical Support Center (Teknik Destek Merkezi): adresindeki Frequently Asked Questions (Sık Sorulan Sorular) sayfasına göz atın. QIAGEN Teknik Servisleri ndeki bilim insanları, bu el kitabındaki bilgiler ve protokollere veya örnekleme ve tahlil teknolojilerine ilişkin sorularınızı yanıtlamaktan her zaman mutluluk duyacaklardır (iletişim bilgileri için arka kapağa bakın veya adresini ziyaret edin). Yorumlar ve öneriler Pozitif kontrollerle (BK Virus RG QS 1 4) Cycling Green floresans kanalında sinyal yok a) PCR veri analizi için seçilen floresans kanalı, protokole uygun değil Veri analizinde analitik BK Virus PCR işlemi için Cycling Green floresans kanalını, dahili kontrol PCR si için Cycling Orange floresans kanalını seçin. b) Rotor-Gene Cihazı sıcaklık profilinin hatalı programlanması c) Hatalı PCR kurulumu d) Bir veya daha fazla kit bileşeninin saklanma koşulları Saklama (sayfa 5) bölümünde verilen talimatlara uygun değil e) artus BK Virus RG PCR Kit in kullanma süresi geçti Sıcaklık profilini protokolle karşılaştırın. Bkz. Protokol: PCR ve Veri Analizi, sayfa 18. Çalışma basamaklarınızı pipetleme sırası aracılığıyla kontrol edin ve gerekiyorsa PCR işlemini tekrarlayın. Bkz. Protokol: PCR ve Veri Analizi, sayfa 18. Ayıraçların saklanma koşulları ve son kullanma tarihini (kit etiketine bakın) kontrol edin ve gerekiyorsa yeni bir kit kullanın. Ayıraçların saklanma koşulları ve son kullanma tarihini (kit etiketine bakın) kontrol edin ve gerekiyorsa yeni bir kit kullanın. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

28 Yorumlar ve öneriler artus BK Virus RG PCR Kit aracılığıyla saflaştırılmış negatif plazma veya idrar örneğinin dahili kontrolünün Cycling Orange kanalında zayıf veya sıfır sinyal ve eşzamanlı olarak Cycling Green kanalında sinyal yokluğu a) PCR koşulları protokole uygun değil b) PCR engellendi c) DNA çıkarım sırasında kayboldu d) Bir veya daha fazla kit bileşeninin saklanma koşulları Saklama (sayfa 5) bölümünde verilen talimatlara uygun değil PCR koşullarını (yukarıya bakınız) kontrol edin ve gerekiyorsa PCR yi düzeltilmiş ayarlarla tekrarlayın. Önerilen izolasyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını yakından takip ettiğinizden emin olun. Eğer çıkarıma dahili kontrol eklenmişse, dahili kontrolün sinyal vermemesi, çıkarım sırasında DNA nın kaybedildiği anlamına gelebilir. Önerilen izolasyon yöntemini kullandığınızdan (bkz. DNA izolasyonu, sayfa 15) ve üreticinin talimatlarını yakından takip ettiğinizden emin olun. Ayıraçların saklanma koşulları ve son kullanma tarihini (kit etiketine bakın) kontrol edin ve gerekiyorsa yeni bir kit kullanın. e) artus BK Virus RG PCR Kit in kullanma süresi geçti Ayıraçların saklanma koşulları ve son kullanma tarihini (kit etiketine bakın) kontrol edin ve gerekiyorsa yeni bir kit kullanın. 28 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

29 Yorumlar ve öneriler Analitik PCR nin negatif kontrollerinden Cycling Green floresans kanalında sinyaller a) PCR hazırlanması sırasında kontaminasyon oluştu PCR işlemini yeni ayıraçlar ve replikatlarla tekrarlayın. Eğer mümkünse test edilecek örneğin eklenmesinden hemen sonra PCR tüplerini kapatın. Pozitif kontrolleri en son pipetlediğinizden emin olun. Çalışma alanı ve cihazların düzenli aralıklarla dekontamine edildiğinden emin olun. b) Çıkarım sırasında kontaminasyon oluştu Yeni ayıraçlar kullanarak test edilecek örneğin çıkarım ve PCR işlemini tekrarlayın. Çalışma alanı ve cihazların düzenli aralıklarla dekontamine edildiğinden emin olun. artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

30 Referanslar QIAGEN, QIAGEN ürünlerini kullanan bilimsel yayınların geniş, güncel bir veritabanını çevrimiçi olarak tutmaktadır. Kapsamlı araştırma seçenekleri, ya basit anahtar sözcüklü aramayla ya da uygulama, araştırma alanı, başlık, vb. belirterek aramayla size gereken makaleleri bulmanızı sağlar. Referansların eksiksiz bir listesi için, adresindeki çevrimiçi QIAGEN Reference Database i (Referans Veritabanı) ziyaret edin veya QIAGEN Teknik Servisleri ni veya yerel distribütörünüzle irtibat kurun. 30 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

31 Sipariş Verme Bilgileri Ürün İçindekiler Kat. no. artus BK Virus RG PCR Kit (24) 24 reaksiyon için: Ana, Solüsyonu, 4 Miktar tespit standardı, Dahili Kontrol, Su (PCR kalitesinde) artus BK Virus RG PCR Kit (96) 96 reaksiyon için: Ana, Solüsyonu, 4 Miktar tespit standardı, Dahili Kontrol, Su (PCR kalitesinde) EASYartus BK Virus RG PCR Kitleri tam CE-IVD-uyumlu entegre otomasyonlu örnek saflaştırma ve patojen tespiti için EASYartus BK Virus RG PCR Kit 1 48 viral nükleik asit hazırlama ve 24 tahlil için: 1 x EZ1 DSP Virus Kit, 1 x artus BK Virus RG PCR Kit (24) EA11423 EASYartus BK Virus RG PCR Kit 2 48 viral nükleik asit hazırlama ve 48 tahlil için: 1 x EZ1 DSP Virus Kit, 2 x artus BK Virus RG PCR Kit (24) EA11424 EZ1 DSP Virus Kit EZ1 Advanced ile 1 6 insan plazma, serum veya BOS örneğinden otomasyonlu, eşzamanlı viral DNA ve RNA saflaştırması için EZ1 DSP Virus Kit (48) 48 viral nükleik asit hazırlama için: Önceden Doldurulmuş Ayıraç Kartuşları, Atılabilir Uç Tutucuları, Atılabilir Filtreli Uçlar, Örnek Tüpleri, Elüsyon Tüpleri, Tamponlar, Taşıyıcı RNA EZ1 Advanced DSP Virus Card EZ1 Advanced EZ1 DSP Virüs protokolü için önceden programlanmış kart Avrupa da: in vitro tanı amaçlı kullanım için: EZ1 DSP Kitleri kullanarak nükleik asitlerin saflaştırılmasına yönelik robotize çalışma istasyonu, 1 yıl parça ve işçilik garantisi Rotor-Gene Q ve aksesuarları Rotor-Gene Q 5plex 5 kanallı (yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) gerçek zamanlı PCR çevrimci, dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar, 1 yıl parça ve işçilik garantisi Sorunuz artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

32 Ürün İçindekiler Kat. no. Rotor-Gene Q 5plex HRM Rotor-Gene Q 6plex 5 kanallı (yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) gerçek zamanlı PCR çevrimci ve Yüksek Çözünürlüklü Eritme Analizörü artı HRM kanalı, dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar, 1 yıl parça ve işçilik garantisi 6 kanallı (mavi, yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) gerçek zamanlı PCR cihazı, dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar, 1 yıl parça ve işçilik garantisi dahil Sorunuz Sorunuz Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) PCR Tubes, 0,2 ml (1000) PCR Tubes, 0,2 ml (10.000) 72 x 0,1 ml tüplerde tek kanallı pipetle manüel reaksiyon kurma için alüminyum blok Standart 8 x 12 dizide 96 x 0,2 ml tüplerle manüel reaksiyon kurma için alüminyum blok 4 tüp ve başlıklık 250 strip, 1000 reaksiyon için 10 x 4 tüp ve başlıklık 250 strip, reaksiyon için 1000 ince duvarlı tüp, 1000 reaksiyon için 10 x 1000 ince duvarlı tüp, reaksiyon için Güncel lisans bilgileri ve ürüne özgü sorumluluk reddi beyanları için, ilgili QIAGEN kitinin el kitabına veya kullanım kılavuzuna bakın. QIAGEN kiti el kitapları ve kullanım kılavuzları, adresinde çevrimiçi olarak bulunmaktadır veya QIAGEN Teknik Servisleri veya yerel distribütörünüzden istenebilir. 32 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

33 Bu sayfa özellikle boş bırakılmıştır artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/

34 Bu sayfa özellikle boş bırakılmıştır 34 artus BK Virus RG PCR Kit El Kitabı 09/2009

35 Bu ürünün satın alınması, alıcının ürünü insanda in vitro tanılamaya yönelik tanısal servis amaçlı kullanmasına izin verir. Belirtilen bu özel kullanım hakkı dışında, burada, hiçbir başka tür genel patent veya lisansa izin verilmemiştir. Ticari markalar: QIAGEN, artus, EASYartus, EZ1 (QIAGEN Group); Rotor-Gene (Corbett Research Pty Ltd). artus BK Virus RG PCR Kit, Avrupa İn Vitro Tanı Yönergesi 98/79/AT uyarınca CE işaretli bir tanılama kitidir. Temini her ülkede mümkün olmayabilir. Sınırlı Lisans Anlaşması Bu ürünün kullanılması, artus BK Virus RG PCR Kit i satın alan veya kullanan kişilerin aşağıdaki şartları kabul ettiklerini belirtir: 1. artus BK Virus RG PCR Kit yalnızca BK Virus RG PCR Kit El Kitabı doğrultusunda ve yalnızca Kit içine dahil edilen bileşenlerle birlikte kullanılabilir. QIAGEN, kendisine ait herhangi bir fikri mülkiyet kapsamında, bu Kite dahil olan bileşenleri, BK Virus RG PCR Kit El Kitabı ve adresinde bulunan ek protokollerde belirtilenler hariç olmak üzere, bu Kite dahil olmayan herhangi bir bileşenle birlikte kullanma veya onlara dahil etme lisansını vermez. 2. Açıkça belirtilen lisanslar haricinde, QIAGEN bu Kit in ve/veya kullanımının (kullanımlarının) üçüncü tarafların haklarını ihlal etmediğine ilişkin herhangi bir garantide bulunmaz. 3. Bu kit ve bileşenleri, yalnızca bir defa kullanılmak üzere lisanslanmıştır ve yeniden kullanılamaz, yenilenemez veya yenide satılamazlar. 4. QIAGEN, burada açıkça belirtilenler dışındaki tüm açık veya zımni lisanları bilhassa reddeder. 5. Kiti satın alan veya kullanan kişi, yukarıda yasaklanmış olan davranışlara neden olabilecek ve bunları kolaylaştırabilecek adımları atmamayı veya başkalarının atmasına izin vermemeyi kabul eder. QIAGEN, işbu Sınırlı Lisans Anlaşması nın yasaklarını herhangi bir Mahkeme de yürütebilir ve işbu Sınırlı Lisans Anlaşması nı yürütmeye veya Kit ve/veya bileşenleriyle ilgili fikri mülkiyet haklarını yürütmeye ilişkin, avukatlık ücretleri dahil, tüm araştırma veya Yargılama giderlerini talep edebilir. Güncel lisans şartları için, bkz QIAGEN, tüm hakları saklıdır.

36 Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) TR Sample & Assay Technologies