( Y Ü K S E K L SANS TEZ )

Transkript

1 EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER E N S T TÜSÜ ( Y Ü K S E K L SANS TEZ ) SERT ÇEK RDEKL MEYVE A AÇLARINDA GÖRÜLEN PEACH LATENT MOSA C V RO D (PLMVd) VE HOP STUNT V RO D (HSVd) LER N N RT-PCR YÖNTEM LE TANILANMASINA YÖNEL K ÇALI MALAR Kamil DUMAN Bitki Koruma Anabilim Dal Bilim Dal Kodu: Sunu Tarihi: Dan man: Doç. Dr. Mustafa GÜMÜ BORNOVA ZM R 2008

2 III Kamil DUMAN taraf ndan Yüksek Lisans tezi olarak sunulan Sert Çekirdekli Meyve A açlar nda Görülen Peach Latent Mosaic Viroid (Plmvd) ve Hop Stunt Viroid (Hsvd) Lerinin RT-PCR Yöntemi le Tan lanmas na Yönelik Çal malar ba l kl bu çal ma E.Ü. Lisansüstü E itim ve Ö retim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyar nca taraf m zdan de erlendirilerek savunmaya de er bulunmu ve tarihinde yap lan tez savunma s nav nda aday oy birli i/oy çoklu u ile ba ar l bulunmu tur. Jüri Üyeleri mza Jüri Ba kan : Raportör Üye: Üye: Doç. Dr. Mustafa GÜMÜ Prof. Dr. Semih ERKAN Prof. Dr. Serra HEPAKSOY

3 V ÖZET SERT ÇEK RDEKL MEYVE A AÇLARINDA GÖRÜLEN PEACH LATENT MOSA C V RO D (PLMVd) VE HOP STUNT V RO D (HSVd) LER N N RT-PCR YÖNTEM LE TANILANMASINA YÖNEL K ÇALI MALAR DUMAN, Kamil Yüksek Lisans Tezi, Bitki Koruma Bölümü Tez Dan man : Doç Dr. Mustafa GÜMÜ Aral k 2008, 39 Sayfa Sert çekirdekli meyve a açlar nda önemli sorun te kil eden viroidlerden, Peach latent mosaic viroid (PLMVd) ve Hop stunt viroid (HSVd) etmenlerinin farkl nükleik asit ekstraksiyon metodlar kullan larak RT-PCR yöntemi ile tan lanmalar na çal lm t r. zmir ilinin farkl meyve bahçelerinde hastal k belirtileri gösteren sert çekirdekli meyve a açlar ndan yaprak örnekleri al narak, Silica capture metot, Citric buffer metot, Lithium chloride metot ve Ames buffer metot uygulanarak total nükleik asit ekstraksiyonlar yap lm t r. RT-PCR a amas ndan sonra nükleik asitler agaroz jele yüklenerek elektroforezde ko turulmu tur. Sonuçlar n agaroz jelde olu turduklar görüntüler incelenerek üzerinde çal lan dört ekstraksiyon metodu birbiri ile kar la t r lm t r. 64 sert çekirdekli bitki örne i ile yap lan çal mada sadece silica capture metod ile RT- PCR sonras nükleik asit tespit edilebilmi di er ekstraksiyon metodlar ile nükleik asit ekstraksiyonu elde edilememi tir. Tüm örnekler içerisinde, Peach latent mosaic viroid 12 bitkide ve Hop stunt viroid 8 bitkide tespit edilmi tir. Anahtar Kelimeler: Viroid, RT-PCR, TNA

4 VII ABSTRACT STUDIES ON THE DETECTION OF PEACH LATENT MOSAIC VIROID (PLMVd) AND HOP STUNT VIROID (HSVd) ON STONE FRUITS BY USING REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) DUMAN, Kamil MSc, Department of Plant Protection Supervisor: Assoc. Prof. Mustafa GÜMÜ December 2008, 39 Pages RT-PCR method performed with using different nucleic acid extraction methods for identification of viroids; Peach latent mosaic viroid (PLMVd) and Hop stunt viroid (HSVd) which causes serious problems on stone fruits. Leave samples are taken from different fruit gardens which show viroid disease indications in zmir province, total nucleic acids have been extracted with Silica capture method, Citric buffer method, Lithium chloride method and Ames buffer method. After RT-PCR stage, nucleic acid extractions are loaded on the agarose gel and ran in the electrophoresis. Images composed by results on agarose gel are evaluated and four of the extraction methods used during the assay, have been compared with each other. In 64 stone fruit tree samples, only Silica capture method indicated the presence of nucleic acids after RT-PCR, with other methods nucleic acids couldn t be detected. In all samples, Peach latent mosaic viroid was detected in 12 plants and Hop stunt viroid was detected in 8 plants. Keywords: Viroid, RT-PCR, TNA

5 IX TE EKKÜR Bu çal ma süresince bilgilerini benimle payla an ve yard mlar n esirgemeyen de erli hocam Doç. Dr. Mustafa Gümü e ve Prof. Dr. Semih Erkan a Ayr ca çal malar mda bilgi ve zaman n benimle payla an de erli büyü üm Ar. Gör. smail Can Paylan a te ekkür ederim. Yüksek lisans e itimim süresince maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen de erli aileme de ayr ca te ekkür ederim.

6 XI EK LLER D Z N Sayfa 1.1. PLMVd nin yapraklarda ve bütün bitkide görülen belirtileri PLMVd nin çiçekte ve meyvede görülen belirtileri HSVd nin bütün bitkide, yapraklarda ve meyvede olu turdu u belirtiler HSVd nin domates bitkisinde olu turdu u belirtiler PCR testlerinde kullan lan Gene AMP thermal cycle PCR sonuçlar n de erlendirmede kullan lan DNR jel görüntüleme sistemi Invitrojen firmas n n önerdi i prosedüre uygun yap lan cdna sentezi RT-PCR testlerindeki a amalar Silica Capture Metod ile yap lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) TNA ekstraksiyonlar nda denenen 12 örne in agaroz jel görüntüleri Silica Capture Metod ile yap lan Hop stunt viroid (HSVd) TNA ekstraksiyonlar nda denenen 6 örnekten; 1,2 ve 4 nolu örneklerin agaroz jel görüntüleri...25

7 XII 4.3. Silica Capture Metod ile ekstraksiyonu ç kar lan Hop stunt viroid (HSVd) ile enfekteli oldu u dü ünülen 12 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri Silica Capture Metod ile ekstraksiyonu ç kar lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) ile enfekteli oldu u dü ünülen 8 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri Citric Buffer Metod ile ekstraksiyonu ç kar lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) (1-5 aras örnekler) ve Hop stunt viroid (HSVd) (6-10 aras örnekler) ile bula k oldu u dü ünülen 10 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri Lithium Chloride Metod ile ekstraksiyonu ç kar lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) (1-5 aras örnekler) ve Hop stunt viroid (HSVd) (6-10 aras örnekler) ile bula k oldu u dü ünülen 10 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri Ames Buffer Metod ile ekstraksiyonu ç kar lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) (1-5 aras örnekler) ve Hop stunt viroid (HSVd) (6-10 aras örnekler) ile bula k oldu u dü ünülen 10 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri...27

8 XIII Ç ZELGELER D Z N Sayfa 3.1. Reverse Transkripsiyon Polymeraz Zincir Reaksiyon Amplifikasyonunda Kullanılan Viroid Primerleri PCR testlerinde uygulanan sıcaklık aralıkları ve döngü sayıları. 22

9 XV SÍMGELER VE KISALTMALAR Simgeler µ Mikron µl Mikrolitre g Gram pmol Pikomol M Molar mg Miligram ml mm Mililitre Milimolar U Ünite V Volt bp Baz çifti kg Kilogram mg/ml Miligram/mililitre

10 XVII Kısaltmalar ACLSV Apple Chlorotic Leaf Spot Virus ApMV Apple Mosaic Virus ApMV Apple Mosaic Virus cdna Komplementer Deoksiribonükleikasit CEVd Citrus Exocortis Viroid CLRV Cherry Leaf Roll Virus CMLV Cherry Mottle Leaf Virus ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EtOH Ethanol HSVd Hop Stunt Viroid PCR Polymerase Chain Reaction PDV Prune Dwarf Virus PLMVd Peach Latent Mosaic Viroid PSTVd Potato Spindle Tuber Viroid RNAse Ribonükleaz Enzimi rpm Dakikadaki devir sayısı RT Revers Transkriptaz TNA Total Nükleik Asit

11 XIX Ç NDEK LER Sayfa ÖZET V ABSTRACT VII TE EKKÜR IX EK LLER D Z N. XI Ç ZELGELER D Z N XIII S MGELER VE KISALTMALAR Simgeler XV K saltmalar.. XVII Ç NDEK LER.. XIX 1. G R ÖNCEK ÇALI MALAR MATERYAL VE METOD Materyal Çal malarda kullan lan viroid materyali Çal malarda kullan lan bitki materyali PCR testlerinde kullan lan materyal Total Nükleik Asit Ekstraksiyonlar nda kullan lan materyal cdna Sentez A amas nda Kullan lan Materyal RT-PCR testlerinde kullan lan primerler Ço alt lm PCR Ürünlerinin Analizinde Kullan lan Materyal Metod Çal ma Alan ve Örneklerin al nmas Total Nükleik Asit (TNA) Ekstraksiyonu Silica Capture Metod Citric Buffer Metod Lithium Chloride Metod.. 19

12 XX Ames Buffer Metod RT-PCR Yöntemi Komplimenter DNA n n (cdna) Sentezi RT-PCR (Polymerase Chain Reaction) Agaroz Jel Eletroforezde Ko turma Jel Görüntüleme Cihaz nda PCR Sonuçlar n n De erlendirilmesi BULGULAR SONUÇ VE ÖNER LER KAYNAKLAR D Z N EKLER. 37 EK 1 TNA Ekstraksiyonunda ve Elektroforezde kullan lan çözeltiler EK 2 Elektroforez leminde Kullan lan Tampon Çözeltiler. 38 ÖZGEÇM 39

13 1- G R Sert çekirdekli meyve a açlar n n ülkemiz ekonomisinde büyük bir yeri olup, meyve üretiminin yakla k %30 unu olu turmaktad r. A aç say s olarak ülkemizde yakla k 160 milyon adet sert çekirdekli meyve a ac bulunmaktad r. Sert çekirdekli meyveler hemen hemen yurdumuzun tüm bölgelerinde yeti tirilebilen ve hem iç tüketimde hem de ihracat ürünü olarak de erlendirilen bir tar msal ürünümüzdür (Anonymus, 1999). Türkiye de y ll k toplam ton sert çekirdekli meyve üretimi yap lmaktad r (Anonymus, 2008). Büyük bir öneme sahip olan sert çekirdekli meyvelerde, kalitatif ve kantitatif kay plara neden olan hastal klar da üphesiz son derece önemlidir. ç tüketim ve ihracat m z için çok önemli olan sert çekirdekli meyve a açlar nda tek ba na veya birlikte zarar yapan pek çok hastal k etmeni bulunmaktad r (Çal, 2008). Hastal k etmenleri aras nda varl bitki üzerinde net bir ekilde görülebilece i gibi ( ekil 1.1.) ( ekil 1.4.) ancak hasat zaman nda olu an meyve kalite ve kantitesinden anla labilecek olan virüs ve viroid hastal klar büyük önem ta maktad r. Ancak sa l kl üretim materyali kullan larak önlenebilecek olan virüs ve virüs benzeri etmenlerin meydana getirdi i hastal klar olu turduklar ekonomik kay plar n belirsizli i yönünden de çok büyük önem ta maktad r. Virüs ve benzeri hastal klar dünyada meyve yeti tirilen hemen hemen her yerde sorun olmaktad r. Bu durumun ba l ca nedeni, üretim materyali olan anaç ve kalemin kontrolsüz bir biçimde da t lmas ve bunun ard ndan da baz hastal klar n vektörler ile yay lmas d r (Gümü et al., 2007). A gözü ve anaç gibi, üretim materyali ile de kolayl kla yay lan viroidler tan lanmalar n n güç olmas nedeni ile h zla yay lmaktad r (Hammond and Owens, 2006).

14 2 Kimyasal sava m na olanak bulunmamas nedeni ile virüs ve virüs benzeri hastal klar n ayr bir önemi vard r. Bu tip hastal klar a ac n ömrünü k saltt gibi verim kalitesi ve miktar aç s ndan da büyük önem ta maktad r. Virüs, viroid ve fitoplazma gibi hastal klar; a açlar n zay flamas na, ölümüne, ürünlerin kalitelerinin dü mesine, a tutmamas na ve köklenme oran nda azalmaya neden olabilmektedir. Virüs benzeri hastal k etmenleri içerisinde son y llarda çok büyük önem arz eden ve varl klar üzerine son 20 y ld r çal malar ba lat lan etmenlerden biri de viroidlerdir (Pallás et al., 2007). Viroidler k sa tarifi ile: protein k l f içermeyen, dü ük moleküler a rl ktaki, dairesel, tek sarmall, bitkilerde hastal klara neden olan patojenik RNA lard r (Góra-Sochacka, 2004). Viroidler proteinleri kodlamaz veya de i tirmezler. Konukçu bitkilerdeki etkilerini bitkisel enzimler ile gösterirler. Bitkilerde büyüme ve geli meyi idare eden genlerin de i mesine neden olurlar (Góra-Sochacka, 2004). Bilimde yürütülen ara t rma ve çal malar sonucu elde edilen beklenilmedik bulgular, baz yeni ke iflere neden olabilmektedir. Yeni bir patojen olarak viroidlerin ortaya ç kmas da bu ekilde olmu tur. Bilinen ilk viroid olan Patates Yumru Hastal na sebep olan PSTVd (Potato spindle tuber viroid); 1967 y l nda, daha önceleri virüs olarak dikkate al nan Patateste i yumru hastal n n etmenini ar tmak ve baz özelliklerini belirlemek amac yla yap lan çal malar s ras nda bulunmu tur (Diener, 1987; Boonham et al., 2004). Viroidlerin orijinine bakt m z zaman; Viroidlerin ke finden bugüne kadar, moleküler yap lar, ço alma mekanizmalar, evrimsel olanaklar, birbirileri ve konukçular ile ili kileri gibi birçok özellikleri üzerine ara t rmalar yap lm t r. Bununla birlikte yap lan tüm çal malara ra men viroidlerin orijinine bakacak olursak geride bir s r olarak durdu unu görmekteyiz. Bu problem do al viroid kaynaklar ve bitki bula ma kaynaklar ile yak ndan ili kilidir (Góra-Sochacka, 2004).

15 3 Viroidlere daha önceleri spesifik konukçularda rastlan p o konukçu ailesindeki di er türlere de bula ma riski ta yabilece i söylenirken 2002 y l ndan bu yana yap lan çal malar ile edinilen bulgular göstermektedir ki, viroidlerin gayet geni bir konukçu dizini yer almaktad r (Góra-Sochacka, 2004). Sert çekirdekli meyve a açlar nda görülen viroidler ise otsu bitkilerde ve yumu ak çekirdeklilerde görülen viroidlerden daha çok önem arz etmi ve günümüze dek yap lan çal malar bu viroidlerin öneminin ne kadar artt n n göstergesidir. Yap lan ara t rmalar ile, viroidlerin yaln zca yüksek yap l bitkilerde hastal k meydana getirmedikleri ve birçok Familya ve Genus tan konukçu bitkilere sahip olduklar na ve Ribo Nükleik Asit (RNA) yap s nda olduklar kesin olarak saptanm t r (Boonham et al., 2004). Bu bitkiler aras nda; patates, domates, erbetçiotu, hindistan cevizi, asma, turunçgiller, avakado, eftali, elma, armut ve krizantem gibi bitkiler yer almaktad r. Viroidlerin, bulunduklar konukçular üzerinde belirtilerini hemen belli etmemeleri ve hatta bazen bitkide fizyolojik bir bozukluk olarak görüntülenmeleri de viroidlerin varl n n anla lmas nda büyük bir engel te kil etmektedir. ekil 1.1. PLMVd nin ve HSVd nin belirtileri görülmektedir, ( /autthumb. cfm? aut=20729&start=1)

16 4 ekil 1.2. PLMVd nin çiçekte ve meyvede görülen deformasyon belirtileri görülmekte rt=1 ekil 1.3. HSVd nin bütün bitkide, yapraklarda ve meyvede olu turdu u belirtiler, ekil 1.4. HSVd nin domateste meydana getirdi i l ml dan iddetliye do ru giden cücele me, epinasti ve yapraklarda kabala ma belirtileri,

17 5 Viroidlerin ta nma yollar aras nda; A, küsküt türleri, böcek vektörler, tohum, çiçek tozu ve mekanik yöntemler yer almaktad r (Sano and Shikata, 2008). Görüldü ü gibi viroidlerin konukçu a n n bu kadar geni olmas ndaki önemli bir sebep de ta nma yollar n n fazla olmas d r. Viroidlerin çe itlili inde en etkin mekanizma RNA sarmal nda yer alan merkezi korunakl bölgedir. Bu bölgedeki nükleotidlerin s ralan viroidlerde hem çe itlili in ve sistemati in olu mas nda hem de viroidlerin tan lanmas nda rol oynamaktad r (Góra-Sochacka, 2004). Viroidler sistematik olarak iki familyadan olu maktad r. Bu familyalar; Pospiviroidae ve Asunviroidae dir. Projemizde yapt m z çal malarda üzerinde durdu umuz viroidler her iki familyada yer almakta olup Peach latent mosaic viroid (PLMVd) Pospiviroidae familyas nda, Hop stunt viroid (HSVd) ise Asunviroidae familyas nda yer almaktad r (Hammond and Owens, 2006). Viroidlerin olu turduklar hastal klarda, öncelikle etmeni her yönü ile tan mak, rklar n ve konukçu dizinini belirlemek ve h zl tan yöntemleri ile etmeni saptamak kontrol aç s ndan önemlidir (Flores et al., 2004). Bitki viroid hastal klar n n tan s nda protein k l flar n n olmamas nedeni ile serolojik olarak tan mlanamamakta ancak Hibridizasyon ve RT-PCR gibi moleküler yöntemler ile tan mlanabilmektedir (Ragozzino et al., 2004; Sano and Shikata, 2008). Sert çekirdekli meyve a açlar nda hastal k olu turan viroidlere bakt m z zaman; Peach latent mosaic viroid ve Hop stunt viroid u ana kadar saptanan iki en önemli viroid olarak kar m za ç kmaktad r. Bu iki etmenin bitkilerde olu turdu u belirtileri en iddetli hali ve en l ml halleri ile ekil 4.1. ve ekil 4.4. de net bir ekilde görülmektedir. Viroidlerin yay lmas n n önlenmesinde al nan kültürel ve sanitasyon önlemlerinin yan s ra etmenin bitkide te his ve tan lamas na yönelik çal malar da çok büyük önem ta maktad r. Tan lama yöntemlerinden, indikatör bitki

18 6 kullan m, Moleküler Hibridizasyon ve RT-PCR yöntemleri al nan sonucun güvenilirli i aç s ndan ülkemizde ve dünyada pek s k kullan lan güvenilir test yöntemleridir. ndikatör bitki kullan m daha çok belirtilerini k sa sürede gösteren ve konukçusu çok olan viroidler için kullan lmakta olan bir yöntemdir. Bu yöntemde sera bitkilerinde veya tarla bitkilerinde yap lan denemeler hem uzun periyoda yay lmakta hem de maliyeti çok yüksek rakamlar bulabilmekte oldu u için viroid tan lamalar nda çok s k kullan lan bir yöntem de ildir. Ayr ca bu indikatör bitkilerde bazen birden fazla viroidin bir araya gelerek veya çevre ko ullar ile viroidin etki mekanizmas etkilenerek beklenenden farkl belirtiler ortaya ç kabilmektedir. Özgül nükleik asit dizilimlerinin ço alt lmas temeline dayal RT-PCR yöntemi oldukça duyarl bir yöntem olarak bitki viroidlerinin te hisinde gittikçe artan bir yayg nl kta kullan lmaya ba lanm t r. Farkl total nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerine dayanan RT-PCR testleri ile viroidlerin tan lamalar yap l r. RT-PCR testlerinden elde edilen sonuçlar n do ruluk ve netlikleri ise bu çal malarda kullan lmak üzere haz rlanan Total Nükleik Asit ekstraksiyonlar n n kalite ve kantitesine ba l d r. yi kalitede viroid RNA s ekstrakte edilmeye ba land ndan bu yana, bitki virüs ve viroidleri üzerine yap lan moleküler biyolojik çal malar do ru orant l olarak aç kl k ve netlik kazanmaya ba lam t r. Son zamanlarda bitki materyallerini uzun süre saklayabilme üzerinde yap lan çal malar ile bitki DNA ve RNA lar art k PCR testlerinde kullan labilmek üzere uzun süre saklanabilmektedir (Sipahio lu et al., 2006). Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) uzun zamand r moleküler biyoloji çal malar nda geni alanda kullan lmaktad r. Nükleik asitleri (RNA) ço altabilmek için, bu moleküller belki de bu ço altma

19 7 i lemlerini engelleyebilecek olan di er bitkisel veya mikroorganizma kaynaklar ndan ekstrakte edilip safla t r lmaktad r (Wiedbrauk et al., 1995; Schepetiuk et al, 1997). Bitki yap s nda bulunan hücre s v s, zamklar, fenolik bile enler gibi birçok materyal RT-PCR reaksiyonunu engelleyici rol oynamaktad rlar (Martelli et al., 1994). RT-PCR uygulamas nda ana engelleyici husus iyi kalitede bir nükleik asit izolasyonunun haz rlanmas a amas nda kar m za ç kmaktad r ki bu da PCR engelleyicilerinin serbest b rak ld a ama olmaktad r. Bu sorun daha çok odunsu bitkilerden özellikle Malus ve Prunus orijinine sahip olan bitkilerde yap lan çal malarda kar m za ç kmaktad r (Korschineck et al, 1991). Genel olarak kullan lan nükleik asit ekstraksiyon prosedürleri, RT-PCR olu umunu engelleyen, polisakkaridler ile veya fenolik bile enler ile temas tam olarak ortadan kald ramamaktad r (Demeke and Adams, 1992). RNA ekstraksiyonun ç kar lmas ile ilgili birçok çal ma yap lm, birçok metod denenmi ve hatta bitki RNA s n n ekstraksiyon i lemlerini kolayla t rmak için RT-PCR kitleri ve bitki ekstrakt elde etmenin süresini k saltmak için birçok tampon çözelti bulunmu ve bunlar ticari bir ekilde kullan ma sunulmu tur. Fakat bütün bunlara ra men bu güne kadar tüm bitkiler için veya tüm viral etmenler için kullan labilecek standardize edilmi bir RNA ekstraksiyon metodu bulunamam t r. Yapt m z çal malar ile örnek materyallerin çok dü ük s cakl klarda oklanarak saklanmas n sa layarak bu engelleyici faktörlerin etkisini azaltma yoluna gidilmi tir. Yapm oldu umuz çal malarla imdiye dek farkl etmenler için kullan lm bulunan Total Nükleik Asit ekstraksiyon yöntemlerinin en çok bilinen dördü çal malara dahil edilmi tir.

20 8 2. ÖNCEK ÇALI MALAR Sert çekirdekli meyve a açlar n n hemen hemen tümü için risk te kil eden viroidlerin temiz üretim materyal kullan m ve sanitasyon önlemleri d nda bir önlem yolunun olmamas hastal k ile mücadeleyi gün geçtikçe zor duruma sokmaktad r (Pallás et al., 2007). RT-PCR kullanarak viroidlerin tespit edilmesinde, kullan lan örnek nükleik asitlerin olabildi ince orijinalleri kadar saf olmalar gerekmektedir. Safla t rma a amas nda ise RNA virüsleri ile çal ld için, Revers Transkriptaz (RT) a amas n n olmas özellikle gerekmektedir. Gerçekten de revers transkriptaz n a r duyarl l amplifikasyon reaksiyonlar nda yer alan maddelerin engelleyici veya düzenleyici özelliklerinin ortaya ç kmas nda büyük önem ta maktad r (Wilde et al., 1990). Ragozzino et al., (2003) taraf ndan Güney talya daki sert çekirdekli meyve bahçelerinde, Peach latent mosaic viroid (PLMVd) ve Hop stunt viroid (HSVd) etmenlerini tan lamak ve birbirinden ay rt edebilmek için tek-tüp multiple RT-PCR çal mas yap lm t r. Çal mada PLMVd ve HSVd için geli tirilmi primerlerin kar m kullan lm t r. Çal ma sonuçlar güney bölgelerden elde edilmi ve iki kat oranda viroid enfeksiyonu içerdi i dot-blot hibridizasyon ile belirlenmi örnekler ile kar la t r lm t r. Kullan lan protokol, seçilen 129 örnek bitkideki bula man n iddetini ölçmek, belirti gösteren ve göstermeyen bitkiler aras ndaki korelasyonu gözlemlemek için düzenlenmi tir. Her iki viroidin de geni ölçüde varl tespit edilmi tir. Bütün örnek bitkiler içerisinde PLMVd %17 oran nda, HSVd ise %42,6 oran nda bulunmu tur. HSVd tüm Vitillo çe idi kay s larda, meyvelerde yüzey bozulmas eklinde rastlanm, çekirdek beneklenmesi halinde belirtiler ise Barracca çe idinde çekirdek beneklenmesi eklinde rastlanm ayr ca Pellecchiella çe idinde ise yüzey meyvelerde sertle mesi ve çekirdek beneklenmesi eklinde kendini göstermi tir. Toplamda tüm kay s lar n %54,5 lik oran nda, erik a açlar n n ('Florentia, Sorriso ve Primavera çe itlerinde) ise %50 lik oran nda HSVd

21 9 enfeksiyonu tespit edilmi tir. Bununla beraber PLMVd erik a açlar nda belirtisiz bir ekilde hiç rastlanmam t r. eftali a açlar nda ise PLMVd %45,8 HSVd ise %33,3 oran nda enfekteli olarak tespit edilmi tir. PLMVd tüm bitkilerde meyvelerde olu turdu u belirtiler ile dikkat çekmi tir (10 bitkide ise HSVd ile birlikte belirti olu turarak). Buna ek olarak kiraz a açlar nda PLMVd veya HSVd viroidlerine rastlanmam t r. Tek-tüp RT-PCR çal mas basit, çabuk ve maliyet etkili bir ekilde bu iki viroidden kaç nman n gerekti ini göstermi tir. Peach latent mosaic viroid etmeni taraf ndan meydana getirilen Gizli mozaik hastal geni bir ölçüde yay lma göstermektedir. Viroidin baz izolatlar yapraklarda mozaik olu umunu, baz lar yapraklanmada gecikmeyi, çiçeklenme olgunla may tetikledi i ve meyvelerde ekil bozuklu unu ortaya ç karmaktad r. Loreti et al., (1999) taraf ndan bu etmenin daha çok yay lmadan eftali üretim materyali olan GF305 anaç üretim kaynaklar ndan al nan örnekler ile etmeninin elimine edilerek temiz üretim materyali elde etmek için çal malar yap lmas gerekti i üzerinde durmu lard r. Bu amaç do rultusunda çal malar nda kulland klar alg lama metodlar n n; hassas, özerk, güvenilir ve k sa zaman al c özellikte olmas na dikkat etmi lerdir. Yap lan çal malarda biyolojik indikatörler kullan lm ve elde edilen sonuçlar moleküler teknikler (spot-blot ve tissue-blot hibridizasyon, non-radyoaktif prob kullan m ve revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu) kar la t r lm t r. Bitkilerin birçok organ ndan (yaprak, tomurcuk ve kabuk) al nan numuneler üzerinde iki ayr nükleik asit ekstraksiyon metodu denenmi tir. Elde ettikleri sonuçlardan, tomurcuklardan al nan örneklerin Tissue-Blot Hibridizasyon yöntemi ve crna dioksijenin-i aretli prob kullan m ile PLMVd nin eldesinin daha güvenilir olabilece ini belirtmi lerdir. Bu metodun eftali sertifikal ve temiz üretim materyali eldesinde kullan labilece i üzerinde durmu lard r. Hassan et al., (2004) yapm oldu u çal mada Çek Cumhuriyetinde son zamanlarda belirtileri görülen ve varl klar iyice belirginle en Peach latent mosaic viroid (PLMVd) ve Hop stunt viroid (HSVd) lerinin çe itli meyve

22 10 bahçelerinden al nan yaprak, çiçek ve kabuk numuneleri üzerinde RT-PCR çal malar ile tan lanmas na yönelik bir çal ma yürütmü tür. Çal mada farkl RNA ekstraksiyon metodlar ve farkl zamanlarda al nan çe itli bitki materyalleri kullan lm t r. Elde edilen primerler güven verici sonuçlar ortaya koymu tur. Viroidlerin tan lanmas nda RNA ekstraksiyonlar nda kullan lacak yaprak numunelerinin en iyi al nma zaman olarak geç ilkbahar ve erken yaz oldu u tespit edilmi tir. Yaz ortas nda al nan ya l yaprak numuneleri ile çal malarda ise ticari olarak sat lan RNA ekstraksiyon kitlerinin kullan m n n daha do ru olaca belirtilmi tir. Her iki viroidi de kabuk dokular ndan al nan numunelerden tespit edebilmenin k boyunca bile mümkün olabilece i fakat sonuçlar n her zaman güven verici olmad belirtilmi tir. Ragozzino et al., (2004) taraf ndan 4 familyadan 7 ayr viroidin (Apple scar skin viroid, Apple dimple fruit viroid, Pear blister canker viroid, Hop stunt viroid, Chrysanthemum stunt viroid, Citrus exocortis viroid ve Peach latent mosaic viroid) enfekteli oldu u 4 cinsten 8 tür bitki üzerinde tan lamas na yönelik tek tüp, tek a amal RT-PCR yöntemi geli tirilmi tir. Metodlar üzerindeki özgünlük ve rand man optimize etmek için ise Moloney-Murine leukemia virüs (M-MuLV) reverts transkriptaz n ve tan lama hassasiyetini belirleyen HotStarTaq DNA polimeraz kullan lm t r. Tek tüp tek a amal RT- PCR ço altma çal mas n n; tek elden yap lmas ile hem daha k sa sürede yap lan i lemlerin tamamlanabilmesini sa lad, tüm çal man n tek bir tüp içerisinde yap larak d ar dan bula ma riskini ortadan kald rd hem de çapraz bula madan kaynaklanabilecek edilebilecek yanl pozitif sonuçlar n ortaya ç kmas n azaltmas nedeni ile standart multiple RT-PCR ço altma çal mas na göre büyük avantajlara sahip oldu u ortaya konmu tur. Yap lan çal man n sonunda uygulanan metodun rutin olarak viroid tan lamalar nda, karantina ve sertifikasyon programlar nda kullan labilece i belirtilmi tir. Standart veya çoklu Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)- Probe capture hybridization yöntemleri kullan larak, viroidlerin tan lanmas ve tespiti üzerine gayet h zl ve hassas bir yöntem çal ma

23 11 gerçekle tirilmi tir. Shamloul et al., (2002) yapm oldu u çal mada, Potato Spindle Tuber Viroid (Pospiviroid), Peach latent mosaic viroid (Pelamoviroid), Apple scar skin viroid (Apscaviroid), Apple dimple fruit viroid (Apscaviroid), Pear blister canker viroid (Apscaviroid) ve Hop stunt viroid (Hostuviroid) lerinden olu an, alt tür viroidin hasta bitki dokular ndan al narak tespit ve tan lanmalar için ba ar ile uygulanm t r. Total RNA enfekteli dokudan Qiagen RNeasy kiti kullan larak elde edilip, daha sonra cdna viroide özel tamamlay c DNA primeri ile sentezletilmi tir. Bu alt viroid DNA s n n tan mlanmalar ve ay rt edilmeleri için; her bir DNA parçac ço altma i lemi boyunca dioksijenin ile (DIG)- i aretli olarak tutulmu, daha sonra kolorimetrik sistemde her bir viroid için özelle tirilmi biotinli cdna yakalama probu ile tespit edilmi lerdir. Sonuçlar her bir probun sadece kendine e olan tamamlay c DIG-i aretli DNA parçac n yakalay p melezledi ini göstermi tir. Böylece; bu çok yönlü çal ma ile bahsedilen alt viroid çoklu RT-PCR-ELISA yöntemi ile tan lan p ve ay rt edilmi tir. Alt viroidin cdna lar ayn zamanda, bir tüp içerisinde sentezlenmi, ço altma i lemi boyunca DIG ile i aretlenmi ve daha sonra DIG ile i aretlenmi ço alt lm materyallerin bir k sm seçilmi olan yakalama probunda melezlenmi tir. Tüm bu viroid yakalama problar her biri kendisinin olan tamamlay c DIG-i aretli RT-PCR da ço alt lm parçac n melezlemi tir. Bu bulgular; viroid hastal klar n n yönetimi, kontrolü ve konukçu-viroid etkile imi üzerine yap lan çal malar için büyük önem ta maktad r. Hassen et al., (2005) taraf ndan, Tunus ta son zamanlarda oldukça hassas ve h zl bir ekilde, armut ve eftali bahçelerindeki Peach latent mosaic viroidinin tespiti ve tan lanmas üzerine bir çal ma geli tirilmi tir. Test ilk ba larda seçilmi olan izolatlardaki total RNA ekstraksiyonlar n n haz rlanmas eklinde yap lmaya ba lan p, daha sonra 2003 y l nda Kuzey Tunus ve Sahel bölgelerindeki 20 bahçeden al nan yaprak ve kabuk doku örneklerinden elde edilen total RNA ekstraksiyonlar üzerine uygulanmas eklinde devam etmi tir. Yap lan çal mada eftali ve armut a açlar nda peach latent mosaic viroidine rastlanm t r. Testlerde saptanan viroidin tan lanmas, daha önceden bulunmu olan izolatlar ile kar la t rmal yap lan s ra analizler ile gerçekle tirilmi tir.

24 12 Testlerde bitki özsuyunun seyreltilerek kullan lmas durumu daha da kolayla t rm t r. Sert çekirdekli meyve türlerinde virüs ve viroid bula malar son on y lda göze çarpmaktad r, buna ra men, bugüne kadar Bat Anadolu (Türkiye) daki sert çekirdekli meyveli bitkilerde virüs ve viroid hastal klar na ili kin bilgi rapor edilmemi tir y llar Haziran-A ustos aylar nda Gümü ve ark., (2007) taraf ndan, belli ba l sert çekirdekli meyve üreten bahçelerde ve Bat Anadolu daki merkezi bölgelerde Prunus türlerini etkileyen yedi en önemli virüs ve iki önemli viroid üzerine büyük ölçekli bir çal ma yürütülmü tür farkl test bitkisinde yap lan serolojik (ELISA) ve moleküler (PCR ve Tissue Printing Moleküler Hybridization) test çal malar n n sonuçlar nda; Plum pox virüs (PPV), Prune dwarf virüs (PDV), Prunus necrotic ringspot virüs (PNRSV), Apple chlorotic leaf spot virüs (ACLSV), Apple mosaic virüs (ApMV), Apricot latent virüs (ApLV), Plum bark necrosis stem pitting-associated virüs (PBNSPaV), Peach latent mosaic viroid (PLMVd) ve Hop stunt viroid (HSVd) in toplam bula ma seviyesi %30 olarak bulunmu tur. Sonuçlar göstermi tir ki a yolu ile ta nan bu ajanlar n Bat Anadolu bölgesinde ortaya ç kmas n n ve yay lmas n n önlenebilmesi için bir sertifikasyonun veya temiz kaynak sa lama program n n uygulamas n n gerekti ini göstermi tir. Do u Anadolu bölgesinde; viroid, fitoplazma ve mantar hastal klar n n bulunma oran n saptamak için y llar n n Haziran ve Ekim aylar aras nda Sert çekirdekli meyve a açlar nda Sipahio lu et al.,. (2006) taraf ndan birçok çal ma düzenlenmi tir. Peach latent mosaic viroid (PLMVd) ve Hop stunt viroid (HSVd) in varl n n ara t r lmas için Moleküler Hibridizasyon yöntemi (tissue printing ve dot-blot) kullan lm t r. Viroidler için toplamda 491 a açtan 16 s enfekteli olarak saptanm t r. Peach latent mosaic viroid (PLMVd) e 15 eftalide (%3) ve Hop stunt viroid (HSVd) e ise sadece bir tek kay s a ac nda rastlanm t r. Ortalama viroid bulunma oran %3,2 olarak tespit edilmi tir. PLMVd infeksiyonunun kay s üretim merkezlerinde hiç görülmemesine ra men; Hop stunt viroid (HSVd) e Do u Anadolu bölgesinde ilk kez rastlanm t r.

25 13 Lee et al., (2004) taraf ndan yap lan çal mada bitki dokular nda yo un miktarda bulunan polifenoller ve polisakkaridlerin nükleik asit ekstraksiyon çal malar nda revers transkriptaz engelledi i veya RT-PCR n nükleik asitleri tespit edebilirli i üzerinde olumsuz etkilerde bulundu una i aret etmi lerdir. Bu engelleyicilerin etkisiz hale getirilebilmesi için de ekstraksiyon kitleri ile birlikte sodyum sülfit kullanarak bitki dokular n n ekstraksiyon esnas nda koyu renk almas n önlemeye çal m lar ve bu çal man n RT-PCR sonuçlar na nas l etki etti ini rapor etmi tir. Sodyum sülfit kullan ld ktan sonra bitki dokular ndan yap lan nükleik asit ekstraksiyonlar RT-PCR sonras nda incelendi inde yüksek kalitede nükleik asit elde ettiklerini ve RT-PCR n nükleik asitleri tespit etmede daha ba ar l oldu unu belirtmi lerdir. Cieslinska, (2004) yapm oldu u çal mada çileklerde yo un olarak sorun olu turan Strawberry mottle virüs ün RT-PCR ile tan lanmas nda Lihtium chloride metod ile Silica capture metodu deneyerek bu iki metodu elde edilen nükleik asitlerin kalitesi ve tespit edilebilirlik durumu konusunda birbiri ile k yaslama yapm t r. Çal mas nda Lithium chloride metodun seyreltilmi formlar nda dahi Silica capture metod dan daha yüksek miktarda nükleik asit ekstrakte etti ini ve bunun da RT-PCR sonuçlar na direkt olarak etki etti ini belirtmi, Silica capture metod un ise ancak hiç seyreltme yap lmam formunun 3 örnek bitkiden sadece ikisinde ba ar l olarak nükleik asit ekstrakte etti ini ifade etmi tir. MacKenzie et al., (1997) yapm olduklar çal mada bitki dokular nda yer alan polifenollerin ve polisakkaritlerin haz r ticari engelleyiciler ile pasif hale getirilerek yo un olarak kullan lan total nükleik asit ekstraksiyon metodlar ile bitki RNA s n n ekstrakte edilmesi üzerine çal ma yapm lard r. Bu çal mada, Silica capture metod kullan larak haz rlanan ekstraksiyonlarda RT-PCR sonuçlar nda net bir ekilde nükleik asit ekstraksiyonunu görüntülemeyi ba arm t r. Bu metod ile kullan lan polifenol ve polisakkarid engelleyicilerin RT-PCR ile nükleik asit ekstraksiyonunda çok büyük önem ta d n belirtmi tir.

26 14 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Çal malarda kullan lan viroid materyali Çal ma materyalini olu turan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) ve Hop stunt viroid (HSVd) izolatlar daha önce yap lan çal malar ile belirlenmi ve in-vitro çal malarda kullan lmak üzere haz rlanm izolatlard r. Bu izolatlar RT-PCR testinde kullanmak üzere al nm t r Çal malarda kullan lan bitki materyali Bu çal mada kullan lan bitki materyalini zmir ilinde, çe itli meyve bahçelerinde tespit edilen ve hastal k belirtisi gösteren eftali, erik ve kay s a açlar ndan periyodik olarak ilkbahar-yaz aylar nda al nan yaprak örnekleri olu turmaktad r PCR testlerinde kullan lan materyal Gene Amp. PCR System 9700 thermal cycle (Sekil 3.1), solüsyonlar çözeltiler, Çizelge 3.1. deki primerler, RT-PCR sonuçlar n de erlendirmede kullan lan DNR jel görüntüleme sistemi ( ekil 3.2.) ve 96 hazneli 25 µl kapasiteli PCR plate materyal olarak kullan lm t r.

27 15 ekil 3.1. PCR testlerinde kullan lan Gene Amp. PCR System 9700 thermal cycle. ekil 3.2. PCR sonuçlar n de erlendirmede kullan lan DNR jel görüntüleme sistemi.

28 Total nükleik asit ekstraksiyonunda kullan lan materyal zmir ilinde, çe itli meyve bahçelerinde tespit edilen ve hastal k belirtisi gösteren eftali, erik ve kay s a açlar ndan periyodik olarak ilkbahar-yaz aylar nda al nan yaprak numuneleri TNA ekstraksiyonunun materyalini olu turmu tur. RNA ekstraksiyonu s ras nda Sigma D37520 marka santrifuj, çözeltiler, ETG MBT 250 marka s t c, -30 C'ye kadar so utabilen derin dondurucu kullan lm t r cdna sentez a amas nda kullan lan materyal Daha önceden haz rlanm olan TNA örnekleri, Fermantas marka cdna sentez kiti, s t c, shaker (Heidolph Unimax 2010) ve inkubator (Nuve ES500) materyal olarak kullan lm t r RT-PCR testlerinde kullan lan primerler RT-PCR testlerinde kullan lan viroid primerlerine ait bilgiler, çizelge 3.1. de verilmi tir.

29 17 Çizelge 3.1. Reverse Transkripsiyon Polymeraz Zincir Reaksiyon Amplifikasyonunda Kullan lan Viroid Primerleri Baz Viroid Primer Dizi Say s PLMVd cplmvd 25 hplmvd 25 HSVd VP19 26 VP AACTGCAGTGCTCCGA ATAGGGCAC CCCGATAGAAAGGCTA AGCACCTCG GCCCCGGGGCTCCTTT CTCAGGTAAG CCCGGGGCAACTCTTC TCAGAATCC-3 PLMVd, Peach latent mosaic viroid; HSVd, Hop stunt viroid. Pozisyon Ço alt lan DNA (bp) Referanslar Ço alt lm PCR ürünlerinin analizinde kullan lan materyal Loreti et al. (1999) Astruc et al. (1996) Owl A2 ve Owl Bl marka jel elektroforez düzene i, Consort ES15 marka güç kayna kullan lm t r. Örneklerin ve jellerin haz rlanmas nda ve boyanmas nda kullan lan kimyasallar, çözeltiler ve DNA markeri materyal olarak kullan lm t r. Tüm jellerin foto raflar DNR Bio-imaging Systems Minibis Pro marka jel görüntüleme cihaz nda çekilmi tir Metod Çal ma alan ve örneklerin al nmas Çal mada kulland m z bitki materyalini belirti gösteren ve hasta oldu undan üphelenilen a açlar n yapraklar olu turmaktad r. Örnekler ilkbahar ve yaz aylar nda a açlardan toplanm t r. Al nan örnekler polietilen torbalar içerisine konulmu ve torbalar etiketlenerek buz kutusunda laboratuara getirilmi ve testleri yap l ncaya kadar -20 o C de derin dondurucuda saklanm t r.

30 Total nükieik asit (TNA) ekstraksiyonu Total nükleik asit ekstraksiyonu dört farkl metod kullan larak yap lm t r. Bu metodlar s ras ile; 1- Silica Capture Metod 2- Citric Buffer Metod 3- Lithium Chloride Metod 4- Ames Buffer Metod dur Silica capture metod Silica capture ekstraksiyon metodu Fossiac et al., (2001) un geli tirmi olduklar metoda uygun olarak düzenlenmi tir. TNA ekstraksiyonunda kullan lan tüm malzemeler yap s na uygun olarak ekstrakte edilmi tir. Her izolat için yakla k 100 mg yaprak kullan larak, 1 ml %1 mercapto-ethanol içeren ekstraksiyon tampon çözeltisi varl nda steril örnek po etleri içinde homojenize edilmi tir. Tüpler s t c da 70 C 10 dakika inkube edildikten sonra 5 dakika buzda bekletilmi tir. Daha sonra örnekler rpm de 10 dakika santrifüj edilmi, üst s v dan 300 µl al narak yeni tüplere aktar lm t r. Tüplere 150 µl etanol, 300 µl 6 M NaI, 25 µl silika süspansiyonu eklenerek 10 dakika oda s cakl nda inkubasyona b rak lm t r. Tüpler 6000 rpm'de 1 dakika santrifüj edildikten sonra üst s v at lm tüpün içinde kalan silika partiküllerinin y kanmas için 500 µl y kama tampon çözeltisi eklenmi tir. Bu i lemden sonra tüpler 6000 rpm'de santrifuj edilmi tir. Y kama i lemi iki kere yap lm t r. Y kamadan sonra silika partikülleri içeren tüplere 150 µl RNAse'dan ari steril su eklenmi tir. Tüpler 70 C de 4 dakika s t c da inkube edilen tüpler rpm'de 3 dakika santrifüj edilmi tir. Tüpün üst k sm nda kalan s v dan 100 µl al narak yeni tüplere aktar lm ve TNA ekstraksiyonu tamamlanm t r. Örnekler cdna sentez ve PCR uygulamalar yap l ncaya kadar -20 C'de derin dondurucuda saklanm t r.

31 Citric Buffer Metod Bu yöntem Wetzel et al., 1992 a göre yap lm t r. 10 mg kurutulmu bitki örne i 1 ml Citric Buffer ph:8.3 (Sodyum citrate 50 mm, PVP %2, DIECA 20 mm) içerisine konulmu ve Quartz Kumu ile havanda kar t r lm t r. Kar m 8000 devirde 3 dakika santrifüj edilerek 50 µl süpernatant elde edilmi tir. Son olarak içerisine 450 µl citric buffer ilave edilerek, TNA haz r duruma getirilmi tir. Elde edilen TNA, kullan ma kadar -20 C s cakl kta saklamaya al nm t r Lithium Chloride Metod Lityum klorit temelli ekstraksiyon a amas Hughs & Galau nun küçük düzeltmeleri ile düzenlenmi tir (Hughes et al., 1988). 10 mg kurutulmu bitki örne i içerisine 1 mg buffer (200mM Tris-HCL, ph 8.5, %1.5 Sodyum dodecysulphate, 300 mm Lithium schloride, 10 mm EDTA, %1 Sodium deoxycholate, %1 NP 40 ilave edilmemi ) ve %0.5 lik 2-mercapto ethanol kar t r larak havanda ezilmi ve homojen bir hale getirilmi tir. Daha sonra bu kar m içerisinden 500 µl lik s v k s m 1,5 ml lik mikrosantrifüj tüplerine aktar lmi t r. Tüpler 65 C de 15 dakika inkube edildikten sonra, 500 µl 5M l k Potasyum asetat (ph:6.5) eklenerek buz üzerinde 10 dakika bekletilmi tir. Haz rlanan örnek say s kadar yeni steril bo tüp haz rlan p, devirde 15 dakika santrifüj edilerek her tüpten 600 µl al narak haz rlanan bo steril tüplere aktar lm t r. Steril tüplerdeki örnekler içerisine 600 µl zopropanol eklenip, elde edilen kar m -20 C de bir gece bekletilmi tir. Ertesi gün pellet haline gelmi kar m devirde 15 dakika santrifüj edilip %70 lik Ethanol ile y kand ktan sonra, kullan m na kadar -20 C de saklanm t r (Hughes et al., 1988) Ames Buffer Metod Bu yöntem Jannson Krist in (2008) çal malar na dayanarak düzenlenmi tir. Elimizdeki örnek say s kadar bo tüp haz rlan p; 10 mg

32 20 kurutulmu bitki örne i 2 ml Ames Buffer ph:6.0 (NaCl, dh 2 O, MgCl 2, Na- Acetate, ETOH, SDS) içerisine konulup ve havanda ezilerek kar t r lm t r. Havandaki s v k s m eppendorf tüplerine al narak kar m 37 o C s cakl kta 30 dakika inkube edilmi tir. nkubasyonun ard ndan tüplerdeki örnek miktar kadar kloroform, tüplere ilave edilerek vortex de k sa bir süre kar t r ld ktan sonra buz içerisinde 3 dakika bekletilmi tir. Daha sonra tüplerdeki kar m 3000 devirde 10 dakika santrifüj edilerek bu i lem sonucunda total RNA tüplerin üst k sm ndaki s v k s mda yer al r hale gelmi tir (Krist, 2008) RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction) yöntemi Komplementer DNA (cdna) sentezi PCR reaksiyonunda kullan lmak üzere elde edilen total nükleik asit içerisinde yer alan viroidlere ait RNA genetik materyaline komplementer DNA (cdna) sentezi gerçekle tirilmi tir. Bu amaçla Invitrogen (Invitrogen, TECH- LINE SM U.S.A.) firmas ndan temin edilen cdna kiti (Super Script RNAase H) firman n belirtti i prosedüre uygun kullan larak sentez gerçekle tirilmi tir. Bo tüplere, 2 µl TNA, 1µl Oligo dt primer, 9 µl DEPC-Water, 12 µl toplam s v olacak ekilde konulmu tur. Daha sonra bu tüp içerisindeki s v lar n kar mas için vortex üzerinde hafifçe kar t r lm ve 3 5 saniye santrifüj edilmi tir. 70 o C s cakl kta, 5 dakika inkubasyon yap l p, ard ndan tüpler buz üzerine yerle tirilmi tir. Elimizdeki örnek say s na yetecek kadar ayr bir tüp içerisinde her bir tüp ba na; 4 µl, 5x Reaction Buffer, 1 µl Ribolock Ribonucleic Inhibitor, 2 µl 10 mm dntp mix, 7 µl s v eklenecek ekilde kar m haz rlanm t r. Bu kar mdan 7 µl lik s v inkube olmu ve buzda beklemi örneklerin tüplerine konulmu tur. K saca kar t r l p, k saca santrifüj edilmi tir.

33 21 Kar m 37 o C s cakl kta 5 dakika inkube edilip, tüplerin her biri için 1 µl M-MuLV Reverse Trans. Koyulup, k sa bir süre santrifüj edilmi tir. 42 o C de 60 dakika inkube edildikten sonra, 70 o C de 10 dakika inkube edilmi tir. nkubasyondan sonra örnekler 1-2 dakika süreli ine buz üzerinde bekletilip, örneklerimiz cdna olarak haz r hale getirilmi tir. Bir po et içerisine konulup, po et üzerine ekstraksiyonlar n ç kar lma tarihi ve cdna yaz lm ve PCR için kullan ma kadar -20 o C s cakl kta saklanm t r. ekil 3.3. Invitrojen firmas n n önerdi i prosedüre uygun yap lan cdna sentezi a.pcr tüplerine gerekli parametlerin ve total nükleik asit'in ekstraksiyonun eklenmesi, b.inkubasyon, c.cdna sentezi için gerekli bile enler tüplere yerle tirildikten sonra 42 C de 50 dk inkubasyon için PCR tüplerinin PCR cihaz na yerle tirilmesi RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction) PCR lemi Fermentas firmas n n önerdi i prosedüre göre 50 µl hacimde yap lm t r. RT-PCR testlerinde kullan lan primerler Çizelge 3.1.'de verilmi tir. Steril PCR tüplerine 25 µl 2x PCR master mix. 1 µl primerl, 1 µl primer 2, 2 µl cdna ve 21 µl nuclease free su eklenmi tir. Tüpler PCR cihaz na yerle tirilerek test edilecek viroid için spesifik olan program uygulanm t r (Candresse et al., 1995). Uygulanan program Çizelge 3.2 de belirtilmi tir. Tüm i lemler boyunca eldiven kullan lm ve herhangi bir kontaminasyon olas l n

34 22 belirlemek için de nükleik asit eklemeden sadece kar m n yer ald bir tüpte (kontrol) PCR program nda ço altma i lemine al nm t r. Çizelge 3.2. PCR testlerinde uygulanan s cakl k aral klar ve döngü say lar PCR testlerinde kullan lan programlar PLMVd 1 döngü 95 o C s cakl kta 3 dakika 30 döngü 95 o C de 30s 60 o C de 45s 72 o C de 45s 1 döngü 72 o C de 7 dakika HSVd 1 döngü 95 o C s cakl kta 3 dakika 30 döngü 95 o C de 30s 60 o C de 45s 72 o C de 45s 1 döngü 72 o C de 7 dakika Agaroz jel elektroforezde ko turma 100 ml 1X TAE tamponu içine 1,5 g agaroz konularak mikrodalga f r nda 3,5 dakika tutulmu ve eriyik haline getirilmi tir. Stok TAE 50X çözeltisi; 40 mm Tris-acetate (ph 8), 57.1 ml Glacial Acetic Acid, 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8)'den olu maktad r. Bu kar m 1000 ml ye tamamlanarak stok solüsyon olu turulmu tur. Stok çözeltiden 20 ml al narak distile H 2 O ile 1000 ml 'ye tamamlanarak 1X TAE konsantrasyon haz rlanm t r. Elektroforez ko umu, 100 V 'da, yatay düzenekte 60 dakika sureyle ve 1X TAE çözeltisi içerisinde uygulanm t r. Jel yükleme yap lmadan önce örneklere (10µl örne e) 2µl yükleme tamponu eklenmi tir.

35 Jel görüntüleme cihaz nda PCR sonuçlar n n de erlendirilmesi Ethidium bromide ile boyanan jel, DNR Bio-Imaging marka Jel Dokümantasyon ve Analiz Sistemi ile foto raf çekilerek kay t edilmi tir. Uygulanan i lem s ras n ekil 3.4. de s ras ile belirtilmi tir. ekil 3.4. RT-PCR testlerindeki a amalar. a) PCR tüplerinin haz rlanmas b) PCR ürünlerinin agar jele konulmas, c) PCR ürünlerinin 80V'da ko umu. d) ethidium bromide uygulamas.

36 24 4. BULGULAR Çal mada kullan lan dört metod için toplam 64 adet örnek test bitkisi, 2 negatif ve 2 pozitif örnek bitki kullan lm t r. Dört ayr metod için her bir viroid ile birlikte 4 ayr primer kullan larak çal malar gerçekle tirilmi tir. Bu primerler daha önce yap lan çal malarda tespit edilen ve Silica Capture Metod ile varl klar birkaç kez kesin olarak tespit edilmi primerlerdir. Örnek test bitkilerinden yaln zca 12 tanesinin sadece Peach latent mosaic viroid ile ( ekil 4.1 ve ekil 4.4), 8 tanesinin sadece Hop stunt viroid ile ( ekil 4.2 ve ekil 4.3.) enfekteli oldu u silica capture metod ile tespit edilmi tir. Di er ekstraksiyon metodlar ile nükleik asit ekstraksiyonu ba ar l olmad için herhangi bir enfeksiyon tespit edilememi tir. RT-PCR sonuçlar n n elektroforez de ko ulmas ndan sonra elde edilen sonuçlar n jel görüntüleme cihaz nda incelenmesinde ise herhangi bir bant olu umu görülememi tir ( ekil 4.5, ekil 4.6, ekil 4.7). Ba lang ç olarak her bir metod için TNA ekstraksiyonu haz rland ktan sonra bu ekstraksiyonlar n elektroforez de ko umu yap larak nükleik asit olu umlar agaroz jel üzerinde incelenmi tir. ekil 4.1. Silica Capture Metod ile yap lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) TNA ekstraksiyonlar nda denenen 12 örne in agaroz jel görüntüleri.

37 25 ekil 4.2. Silica Capture Metod ile yap lan Hop stunt viroid (HSVd) TNA ekstraksiyonlar nda denenen 6 örnekten; 1,2 ve 4 nolu örneklerin agaroz jel görüntüleri. ekil 4.3. Silica Capture Metod ile ekstraksiyonu ç kar lan Hop stunt viroid (HSVd) ile enfekteli oldu u dü ünülen 12 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri. ekil 4.4. Silica Capture Metod ile ekstraksiyonu ç kar lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) ile enfekteli oldu u dü ünülen 8 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri.

38 26 ekil 4.5. Citric Buffer Metot ile ekstraksiyonu ç kar lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) (1-5 aras örnekler) ve Hop stunt viroid (HSVd) (6-10 aras örnekler) ile enfekteli oldu u dü ünülen 10 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri. ekil 4.6. Lithium Chloride Metot ile ekstraksiyonu ç kar lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) (1-5 aras örnekler) ve Hop stunt viroid (HSVd) (6-10 aras örnekler) ile enfekteli oldu u dü ünülen 10 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri.

39 27 ekil 4.7. Ames Buffer Metot ile ekstraksiyonu ç kar lan Peach latent mosaic viroid (PLMVd) (1-5 aras örnekler) ve Hop stunt viroid (HSVd) (6-10 aras örnekler) ile enfekteli oldu u dü ünülen 10 örne in RT-PCR sonras agaroz jel görüntüleri.

40 28 5. SONUÇ VE ÖNER LER Elde edilen sonuçlar Silica Capture Metod un uygulanan dört metod içerisinde en yüksek safl kta ve konsantrasyonda RNA y verdi ini, aç k ve belirgin bir farkla TNA ekstraksiyon metodunun RT-PCR final ürünlerinin olu mas nda ne kadar önemli bir etken oldu unu göstermi tir. Her ne kadar Lithium Chloride metodu birçok çal madan (Sipahio lu et al., 2007; Ragozzino et al., 2003; Loreti et al., 1999; Shamloul et al., 2002; Cieslinska, 2004) referans al narak yap lm ve di er örnek çal malarda olumlu sonuçlar elde edilmi olsa dahi, çal mam zda elde etti imiz sonuçlar bunun tam tersi yönde olup tamamen olumsuz ve negatif sonuçlar vermi tir. Farkl sonuçlar n elde edilmesinde; gerek ekstraksiyon esnas nda kullan lan kimyasallar n miktar ve gerek, al nan bitki türlerinin farkl l gerekse de bitki örneklerinin al nma tarihleri farkl l n rol oynad dü üncesi kar m za ç kmaktad r. Bu da yap lacak çal mada kullan lan ekstraksiyon metodu ile bitki numunelerinin al m zamanlar n n ve hatta bitki türlerinin birbiri ile ili kisi oldu unu gözler önüne sermektedir. Bununla birlikte Sipahio lu et al., 2007 y l nda yapm oldu u çal mada kullanm oldu u Lithium Chloride metodunda kullan lan lithium chlorid in 300mMolar olmas ve Shamloul et al., 2002 nin yapt çal mada ise 500 mmolar olmas bizim çal mam zda kullanm oldu umuz bitki ve numune çe idine göre en yak n çal ma olan Sipahio lu nun çal mas ile paralel sonuçlar ç karmas beklenirken tam tersine agaroz jel üzerinde herhangi bir nükleik asit olu umuna rastlanmamas da yap lan çal malarda kullan lan materyalin ve bitki numunesinin birbiri ile etkile imi aç s ndan çok önem ta d n göstermektedir. Cieslinska (2004), yapm oldu u çal mada çileklerde Silica capture metod ve Lithium chloride metod u kullanarak Lithium chloride metod un seyreltilmi oranlar n n bile RNA ekstraksiyonunda Silica capture metod dan daha rand manl ve ba ar l oldu unu ifade ederken, üzerinde çal lan bitki

41 29 türünün de RNA ekstraksiyon metodu üzerinde ne kadar etkili oldu unu göstermektedir. Çal man n ba lar nda Lithium Chloride metodun TNA ekstraksiyonunda elde edilebilecek ürünlerin kalitesi ve safl aç s ndan Citric Buffer metod dan daha etkili ve kullan l olaca dü ünülse de al nan sonuçlar aç s ndan hiçbir farkl l k göstermedi i bu da ekstraksiyon metodunun hangi bitki dokular ndan al nan örnekler ile çal lmas konusunda ara t rmalar yapmaya itmi tir. Bu konuda Hassen et al., 2005 n yapm oldu u çal malarda elde edilen sonuçlar n güvenilirli i önem ta maktad r. Lithium Chloride Metod un, di er metodlara göre dezavantaj olarak yap lan çal man n süresi, kullan lan kimyasal madde say s ve çe itlili i aç s ndan daha fazla imkan ve zaman gerektirmesi göze çarpm t r. Lithium Chloride metodun uygulanmas iki güne yay lm dört saatten olu makta (izopropanol un çökelme a amas n n beklenmesi) ve bunun yan s ra ekstra laboratuar ekipman gerektirmektedir. Ayr ca Lithium Chloride metodun uygulanmas nda kullan lan kimyasallar n miktar ve yo unluklar n n birçok çal mada farkl de erlerde olmas da çal malarda elde edilen sonuçlar n birbirinden farkl de erlerde olmas na neden olmu tur. Test sonuçlar na bak ld nda ise ekil 4.6. da da görüldü ü üzere Lithium metodda da Ames, Citric buffer metod gibi agaroz jel de herhangi bir bant olu umuna rastlanmam t r. Bunlara ek olarak Hassan et al., 2004 yapm oldu u çal mada elde edilen sonuçlar n güvenilirli i ile ilgili özellikle unun da alt n çizmi tir ki, çal mada sadece belirlenmi ekstraksiyon metodlar ile elde edilen ürünlerin de il ticari olarak sat lan nükleik asit ekstraksiyon kitlerinin kullan m n n da gerekti ini, aksi taktirde haz rlanan buffer lar n sa l kl çal mad n ve hatta bazen en titiz çal malarda bile yan lt c sonuçlar n ortaya ç kabilece ini belirtmi tir.

42 30 Krist in (2008) belirledi i Ames Buffer yöntem ile yap lan çal malarda elde edilen tampon çözeltiler ve ç kar lan nükleik asit ekstraksiyonlar üzerinde yap lan çal malar n di er ekstraksiyon metodlar na nazaran örneklerin en az sürede ekstraksiyonunun ç kar lm olmas bu metodun bir avantaj d r. Fakat metodun süresi kadar metod sonunda elde edilen RNA n n safl ve miktar da önem ta maktad r. ekil 4.7. de de görülece i gibi RT-PCR sonuçlar nda agaroz jel üzerinde hiçbir RNA olu umuna rastlanmamas ve gerek di er metodlara k yasla Krist in (2008) yapt çal mada kulland bitki çe itleri gerekse de kullan lan tampon çözeltideki kimyasal madde kalitesi aç s ndan elde edilen olumsuz sonucun çok fazla a rt c olmam t r. Çünkü Krist, yapm oldu u çal malarda patates ve erbetçiotundan alm oldu u bitki örneklerini kullanarak çal mas n n ba ar l oldu unu belirtmi tir. Fakat hem çal mam zda kullanm oldu umuz bitki çe itlerinin farkl olmas hem de kullan lan kimyasallar n safl k ve kalitesinin farkl olabilece i gibi faktörlerin, elde edilen sonuçlar n güvenirlirli i üzerinde çok büyük rol oynad gözümüze çarpm t r. Uygulanan nükleik asit ekstraksiyon metodlar içerisinde ku kusuz en çok dikkati çeken metod yakla k dakika sürmesi ile Citric Acid Buffer Metod olmu tur. Bu metod uygulama esnas nda di er metodlara k yasla en uygun metod olarak göze çarpm t r. Fakat ekil 4.5. de görüldü ü gibi, elde edilen agaroz jel görüntülerinde hiçbir bant olu umuna rastlanamamas bu yöntemin çal mam zdaki bitkiden veya viroidlerden kaynaklanm olabilece i kan s n ortaya ç karm t r. Gerek, Citric acid metod ile gerekse de Ames buffer ile yap lan çal malarda göze en çok batan çal malarda TNA ekstraksiyonunda da RT-PCR ürünlerinin agaroz jel üzerinde de herhangi bir bant olu umuna rastlanmamas bu iki metodun nükleik asit ekstraksiyonu ve revers transkriptaz esnas nda bitkideki fenolik ve polisakkarid bile iklerini etkisiz hale getiremedi i ve hatta bu bile iklerin RT-PCR çal malar nda tespit edilmeyi tamamen engelledi i dü ünülmektedir.