KİTOZAN MİKROKÜRELERDEN ETKİN MADDE SALIMINI ETKİLEYEN PARAMETRELERİN İNCELENMESİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİTOZAN MİKROKÜRELERDEN ETKİN MADDE SALIMINI ETKİLEYEN PARAMETRELERİN İNCELENMESİ Sezer ESİRGEN FARMASÖTİK TEKNOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Nurten ÖZDEMİR ANKARA- 2007

2 Ankara Üniversitesi Sağlık Birimleri Enstitüsü Farmasötik Teknoloji Yüksek Lisans Programı Çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: 17 / 01 / 2007 Prof. Dr. Tamer BAYKARA Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Jüri Başkanı Prof. Dr. Nurşen ÜNLÜ Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Prof. Dr. Nevin ÇELEBİ Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Prof. Dr. Nurten ÖZDEMİR Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Prof Dr. Asuman BOZKIR Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı ii

3 ÖNSÖZ Çalışmamı gerçekleştirmek için her türlü imkanı sağlayan Anabilim Dalı Başkanımız Sayın Prof. Dr. Tamer BAYKARA ya teşekkür ederim. Çalışmam boyunca manevi desteğini her an hissettiğim, kimi zaman bir öğretmen kadar sabırla, kimi zaman da bir anne gibi şefkatle yaklaşan, görüşleriyle hayatımın her alanında bana yol gösteren değerli tez yöneticim Sayın Prof. Dr. Nurten ÖZDEMİR e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmada kullandığımız Metilprednisolon u gönderen Mustafa Nevzat ilaç firmasına teşekkür ederim. Formüllerin partikül büyüklüğü tayinini gerçekleştirilmesi için olanak yaratan Sayın Prof. Dr. Nevin ÇELEBİ ve Ecz. Şeyda AKKUŞ a ilgileri için teşekkür ederim. Kendime her zaman örnek aldığım Sayın Prof. Dr. Seyhun Mahir FÜSUNOĞLU na gösterdiği tüm doğru yollar için teşekkür ederim. Deneylerim boyunca bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan Dr. Ecz. Özge İNAL, Uzm. Ecz. Zerrin SEZGİN, Uzm. Ecz. Burcu DEVRİM, Uzm. Ecz. Ulya NUMANOĞLU, Uzm. Ecz. Tuba ŞENGEL e teşekkür ederim. Çalışmam süresince yardımlarını benden hiç esirgemeyen Günseli, Berna, Berrin, Gülin ve Şerife ye teşekkür ederim. Canım çalışma arkadaşlarım Gökçe DEMİR ve Leyla BEBA ya paylaştığımız tüm güzel anlar için teşekkür ederim. Uzak yada yakın tezimin bana kazandırdığı en değerli şey canım dostum Sayın Ebru KURUL a sonsuz teşekkürler. iii

4 Hayatımın en stresli anlarında yanımda olan ilgi ve desteklerini derinliklerimde hissettiğim iş arkadaşlarım Ecz. Yelda DEMİRBİLEK, Ecz. Olgu DİKMEN YÜLEK, Ecz. Perihan YOLAÇAN, Ecz. Selda TÜRKSOY a; yöneticilerim Cüneyt TURAN ve Mehmet EM e teşekkürü bir borç bilirim. Her türlü kararımda arkamda durarak beni destekleyen, yüreklerini yanımdan hiç ayırmayan canım annem Emine ESİRGEN ve canım babam Hikmet ESİRGEN e hiçbir zaman beni yalnız bırakmayan abim Eser ESİRGEN ve yengem Figen ESİRGEN e sonsuz teşekkürler. Yüreğimin derinliklerinde yaşayan, nişanlım Ümit Galip UNCU ya her an yanımda olduğu ve sonsuzluğa benimle yürüyeceği için teşekkür ederim. iv

5 İÇİNDEKİLER SAYFA KABUL VE ONAY ÖNSÖZ İÇİNDEKİLER SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ TABLOLAR DİZİNİ ii iii v xi xii xv 1. GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER Kontrollü Salım Sistemleri Kontrollü Salım Sistemi Olarak Mikroküreler İmplante Edilebilen Kontrollü Salım Sistemleri İmplante Edilebilen Kontrollü Salım Sistemi Tipleri İmplante Edilebilen Kontrollü Salım Sistemlerinin Biyouyumluluğu Kontrollü Salım Sistemlerinde Kullanılan Polimerler Polimerlerin Sınıflandırılması Kitozan Kitozanın Yapısı Ve Elde Edilmesi Kitozanın Fizikokimyasal Yapısı Kitozanın Farmakolojik Özellikleri Kitozanın Uygulama Alanları Kitozanın Farmasötik Teknolojide Kullanımı Kitozan ile Hazırlanan Kontrollü Salım Sistemleri Kitozan Mikroküre Hazırlama Yöntemleri Anyonlarla Etkileşim Esasına Dayalı Yöntemler İyonotropik Jelasyon Islak Faz Inversiyon Emülsifikasyon ve İyonotropik jelasyon Modifiye Emülsifikasyon ve İyonotropik jelasyon yöntemi Sodyum Dioktil Sülfosüksinat ile İyonik Etkileşim Yoluyla Yüzen Delikli Kitozan Mikroküreleri 27 v

6 Koaservasyon Kompleks-koaservasyon Diğer Kimyasallarla Çapraz bağlama Emülsiyon Çapraz Bağlama Yöntemi Çoklu Emülsiyon Yöntemi Çökelme- kimyasal çapraz bağlanma Doğal Olarak Oluşan Bir Ajan ile Çapraz Bağlama Diğer Yöntemler Termal Çapraz bağlama Çözücü Buharlaştırma Yöntemi Püskürterek Kurutma Ters Miseller Yöntemi Elek Yöntemi Kitozan Çözeltisi ile Kaplama Kitozan Mikrokürelerinde Etken Madde Tutma- Yükleme 34 Etkinliğini Etkileyen Faktörler 1.9. Kitozan Mikrokürelerinde Etkin Madde Yükleme Polimer Matrislerden Etkin Madde Salım Mekanizmaları Kitozan Mikrokürelerden Etkin Madde Salımı ve Salım Kinetikleri Etkin Maddelerin Kitozan Mikrokürelerinden Salım Karakterlerini 48 Etkileyen Parametreler Kitozanın Moleküler Ağırlığının Etkisi Kitozan Konsantrasyonunun Etkisi Mikrokürelerde Etkin Madde İçeriğinin Etkisi Mikrokürelerdeki Etkin Maddelerin Fiziksel Durumu Çapraz Bağlama Yoğunluğunun Etkisi Katkıların Etkisi Kitozanın Yapısı Sterilizasyon Etkin Madde Fizikokimyasal Özellikleri Farmakolojik Özellikler Farmakodinamik Özellikler 57 vi

7 Farmakokinetik Özellikler Terapötik Endikasyon GEREÇLER VE YÖNTEM Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Aletler Yöntemler Etkin Maddenin Özelliklerinin Belirlenmesi Etkin Maddenin IR Spektrumu Etkin Maddenin Erime Noktası Tayini Etkin Maddenin DSC Analizi Etkin Maddenin UV Spektrumu Etkin Maddenin UV Spektrofotometrik Yöntemle Kalibrasyonu Etkin Maddenin UV Spektrofotometrik Yöntemle Kalibrasyonun 64 Validasyonu Etkin Maddenin Çözünürlük Tayini Etkin Maddenin Stabilitesinin İncelenmesi Polimerin Özelliklerinin Belirlenmesi Polimerin IR Spektrumu Polimerin Erime Noktası Tayini Polimerin DSC Analizi Polimerin Viskozite Tayini Formülasyon Ön Çalışmalar İyonotropik Jelasyon Yöntemi ile Formüllerin 71 Hazırlanması Hazırlanan Formüllerde Yapılan Kontroller Hazırlanan Formüllerde IR Analizi Hazırlanan Formüllerde Etkin Madde Miktar Tayini ve İşlem 76 Etkinliği Partikül Büyüklüğü ve Dağılımı Mikroküre Morfolojisinin SEM ile İncelenmesi 77 vii

8 Hazırlanan Mikrokürelerin DSC Analizi Çözünme Hızı Tayinleri Çözünme Hızı Deneylerinde Kullanılan Ortam Çözünme Hızı Deneylerinin Yapılışı Hazırlanan Mikrokürelerin Sterilizasyonu Kinetik Hesaplamalar ve Sonuçlarının Değerlendirilmesi BULGULAR Etkin Maddeye ait Bulgular Metilprednisolonun IR Spektrumu Metilprednisolonun Erime Noktası Tayini Metilprednisolonun DSC Analizi Metilprednisolonun UV Spektrumu Metilprednisolonun UV Spektrofotometrik Yöntem ile 84 Kalibrasyonu Metilprednisolonun UV Spektrofotometrik Yöntem ile 85 Kalibrasyonunun Validasyonu Metilprednisolonun Çözünürlük Tayini Metilprednisolonun Stabilitesinin İncelenmesi: Polimere Ait Bulgular Kitozanın IR Spektrumu Kitozanın Erime Noktası Tayini Kitozanın DSC Analizi Kitozanın Viskozite Tayini Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular Formüllerin IR Analizi Hazırlanan Formüllerde Etkin Madde Miktar Tayini ve İşlem 94 Etkinliği Formüllerin Partikül Büyüklüğü ve Dağılımı Analizleri Formüllerin Yüzey Özelliklerinin İncelenmesi Formüllerin DSC Analizi Formülasyonların Çözünme Hızı Tayini 107 viii

9 Formüllerde Kullanılan Kitozanın Molekül Ağırlığı Değişiminin 107 Etkin Madde Çıkışı Üzerine Etkisi Formüllerde Yeralan Etkin madde Miktarının Etkin madde Çıkışı 109 Üzerine Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine Kitozanın Çözündüğü Asetik Asit 110 Konsantrasyonunun Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine Çapraz Bağlayıcı Ajan 111 Konsantarsyonunun Etkisi Etkin Madde Salınımı Üzerine İç: Dış Faz Oranlarının Etkisi Dış Faza İlave Edilen Çapraz Bağlayıcı Ajan Tipi ve Oranlarının 113 Etkin Madde Çıkışı Üzerine Etkileri Sterilizasyonun Etkisi Çözünme Hızı Verilerinin Kinetik Değerlendirilmesi TARTIŞMA Etkin Maddenin Özellikleri Polimer Özellikleri Formülasyon Çalışmaları Formülasyon Parametrelerindeki Değişikliklerin Partikül 125 Büyüklüğü Üzerine Etkilerinin Değerlendirilmesi Formüllerin Morfolojik Özelliklerinin Değerlendirilmesi İn vitro Çözünme Hızı Verilerinin Değerlendirilmesi Etkin Madde Salımı Üzerine Polimer Tipinin Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine Etkin Madde Oranının Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine Asetik Asit Konsantrasyonunun 130 Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine Çapraz Bağlayıcı Ajan 131 Konsantrasyonunun Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine İç: Dış Faz oranının Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine Dış Faza Na- aljinat İlavesinin Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine Dış Faza Na- aljinat: Pektin İlavesinin Etkisi 132 ix

10 Etkin Madde Salımı Üzerine Dış Faza Jelatin İlavesinin Etkisi Etkin Madde Salımı Üzerine Sterilizasyonun Etkisi Kinetik Mekanizmalara Uyumun İncelenmesi SONUÇ 137 ÖZET 139 SUMMARY 140 KAYNAKLAR 141 ÖZGEÇMİŞ 155 x

11 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Cps DOS HMw IR LMw MMw Mrad TPP UV Centipoise Dioktilsülfosüksinat Yüksek molekül ağırlıklı Infrared Düşük molekül ağırlıklı Orta dereceli molekül ağırlıklı Megarad Sodyum tripolifosfat Ultraviyole xi

12 ŞEKİLLER Sayfa Şekil 1.1 Kitin ve kitozanın kimyasal yapıları 14 Şekil 1.2 Kitozan mikroküre hazırlama yöntemleri 22 Şekil 1.3 İyonotropik Jelasyon Yöntemi 24 Şekil 1.4 Etkin madde salım mekanizmaları 45 Şekil 1.5 Metilprednisolonun açık formülü 56 Şekil 2.1 Jelleşme süresinin tespiti 74 Şekil 3.1 Metilprednisolonun IR spektrumu 81 Şekil 3.2 Metilprednisolonun DSC termogramı 82 Şekil 3.3 Metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponu içindeki UV 83 spektrumu. Şekil 3.4 Metilprednisolonun 0,1 N HCl içindeki spektrumu 84 Şekil 3.5 Metilprednisolonun ph 7,4 Fosfat Tamponu içindeki 85 Kalibrasyon Doğrusu Şekil 3.6 Metilprednisolonun 0,1 N HCl çözeltisi içerisindeki kalibrasyon 85 doğrusu Şekil 3.7. Doğrusallık ve aralığının saptanmasımda farklı ortamlara ait 87 lineer regresyon grafikleri a) ph 7,4 b) 0,1 N HCl Şekil 3.8. Kitozanın IR Spektrumu 91 Şekil 3.9. Kitozanın DSC termogramı 92 Şekil FH1 formülasyonuna ait IR spektrumu 93 Şekil FL1 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 96 Şekil FM1 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 96 Şekil FH1 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 97 Şekil FH7 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 97 Şekil FH9 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 98 Şekil FH11 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 98 Şekil FH13 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 99 Şekil FH14 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 99 Şekil FH15 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 100 Şekil FH17 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 100 xii

13 Şekil 3.21 a)%50 oranında etkin madde içeren FH1 formülasyonu 102 görüntüsü (x 100), b) FH1 formülasyonu yüzey görüntüsü (1) (x 1000), c) FH1 formülasyonu kesit görüntüsü (1)(x 1000) Şekil a)fh1 formülasyonunun 70. saatte salım sonrası 103 görüntüsü (x 100), b) FH1 formülasyonu 70. saatte salım sonrası yüzey görüntüsü (x 1000), c)fh1 formülasyonu 70. saatte salım sonrası kesit görüntüsü (x 100), Şekil3.23. a)fh1 formülasyonu 170. saatte salım sonrası görüntüsü (x ), b)fh1 formülasyonu 170. saatte salım sonrası yüzey görüntüsü (x 1000), c)fh1 formülasyonu 170. saatte salım sonrası kesit görüntüsü (x 100) Şekil a)%50 oranında etkin madde içeren ve dış faza %0.5 Na- 105 aljinat eklenmiş FH14 formülasyonu görüntüsü (x 100) b)fh14 formülasyonu yüzey görüntüsü (x 1000) c)fh14 formülasyonu dış çeper görüntüsü (x 1000) d)fh14 formülasyonu kesit görüntüsü (x 100) Şekil FH1 formülüne ait DSC termogramı. 106 Şekil FH1 formülüne ait sterilizasyon sonrası DSC termogramları 107 Şekil %50 oranında etkin madde içeren formüllerde polimer tipinin kısa süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi 108 Şekil %50 oranında etkin madde içeren formüllerde polimer tipinin 108 uzun süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil %1 HM w kitozan ile hazırlanmış formüllerde etkin madde oranı 109 değişiminin kısa süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil %1 HM w kitozan ile hazırlanmış formüllerde etkin madde oranı 109 değişiminin uzun süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi. Şekil HM w kitozanın çözündüğü asetik asit konsantrasyonunun kısa 110 süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil HM w kitozanın çözündüğü asetik asit konsantrasyonunun 110 uzun süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi. Şekil %50 oranında etkin madde içeren formüllerde TPP konsantrasyonunun kısa süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi 111 xiii

14 Şekil %50 oranında etkin madde içeren formüllerde tripolifosfat konsantrasyonunun uzun süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil % 50 oranında etkin madde içeren formüllerde iç:dış faz oranının kısa süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil % 50 oranında etkin madde içeren formüllerde iç: dış faz oranının uzun süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil %50 oranında etkin madde içeren formüllerde dış faza eklenen Na-aljinat miktarının ve Na-aljinat: pektin oranının kısa süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil %50 oranında etkin madde içeren formüllerde dış faza eklenen Na-aljinat miktarının ve Na-aljinat: pektin oranının uzun süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil %50 oranında etkin madde içeren formüllerde dış faza eklenen jelatin miktarının kısa süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil %50 oranında etkin madde içeren formüllerde dış faza eklenen jelatin miktarının uzun süreli etkin madde çıkışı üzerine etkisi Şekil Gamma ışınlamasının % 50 etkin madde içeren FH1 formülünde etkin madde salım hızı üzerine etkisi Şekil Etkin madde, FH1, FH14, FH19 formüllerinin kısa süreli çözünme profilleri Şekil 3.43 Etkin madde, FH1, FH14, FH19 formüllerinin uzun süreli çözünme profilleri xiv

15 TABLOLAR DİZİNİ Sayfa Tablo 1.1. Kullanılan kitozan çeşitlerinin fizikokimyasal özellikleri 15 Tablo 1.2. Kitozanın farklı asitlerdeki çözünme dereceleri 16 Tablo 2.1. ph değişim tablosu 73 Tablo 2.2. Formüller 75 Tablo 3.1. Metilprednisolonun erime noktası 82 Tablo 3.2. Metilprednisolonun ph 7,4 Fosfat Tamponu ve 0,1 N HCl 84 içersinde elde edilen kalibrasyon parametreleri Tablo 3.3. Metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponunda ve 0,1 N HCl 86 de doğrusallık bulguları Tablo 3.4. Metilprednisolonun a) ph 7,4 fosfat tamponu ve b)0,1 N HCl 88 de doğruluk bulguları Tablo 3.5. Metilprednisolonun a) ph 7,4 fosfat tamponu b) 0,1 N HCl deki 89 kalibrasyonunun tekrar elde edilebilirlik bulguları Tablo 3.6. Metilprednisolonun ph 7,4 ve 0,1N HCl deki tekrarlanabilirlik 90 bulguları Tablo 3.7. Metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponu ve 0,1N HCl de 90 elde edilen LOD ve LOQ bulguları Tablo 3.8. Metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponu içindeki 91 çözünürlüğü Tablo 3.9. Kitozanın erime noktası 92 Tablo Polimerlerin viskozite değerleri 93 Tablo Hazırlanan mikroküre formülasyonlarında etkin madde miktar 94 tayini ve işlem etkinliği Tablo Formülasyon değişkenlerinin partikül büyüklüğü dağılımı 95 üzerine etkileri Tablo Formülasyonların çözünme hızı kinetik verileri 117 Tablo FH1 ve FH14 formüllerinin belirli zaman aralıklarındaki kinetik değerleri 134 xv

16 1. GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER Günümüzde hastalıkların tedavisi; hastanın tedavisi yanında yaşam kalitesini artırmak, kullanılan ilaç dozunu azaltmak, dozlama aralığını uzatmak, hastayı yan ve zararlı etkilerden arındırmak ilacı hedef bölgeye göndermek amacına yöneliktir. Bu doğrultuda en iyi yanıt veren sistem implante edilebilen kontrollü salım sistemleridir. Bu sistemlerle; plazma proteinlerine bağlanma, invivo yarılanma ömrünün kısalığı, karaciğerden ilk geçiş etkisine uğrama, lenfatik sistem yolu ile uzaklaşma, kan-beyin bariyerlerinden geçiş, membranlardan geçiş, etkin maddenin gönderilmesi hedeflenen bölgede kanlanmanın az olması gibi nedenlerle etkin madde kaybı önlenmektedir. Çalışmamızda sentetik bir kortikosteroid olan yüksek antiinflamatuar etkinlik ve düşük mineralokortikoid aktiviteye sahip metilprednisolon model madde olarak seçilmiştir. Etkin maddenin istenilen bölgeye, farklı dozlarda, istenilen zamanlarda cerrahi işleme gerek kalmaksızın tatbik edilebilmesi için partiküler implante edilebilen dozaj formunun hazırlanması amaçlanmıştır. Tatbik sonrasında polimer kalıntısının uzaklaştırılması sorununun ortadan kaldırılabilmesi amacıyla formülasyonda biyoparçalanabilen bir polimer olan kitozan kullanımına karar verilmiştir. Etkin maddenin tüm farmokokinetik parametreleri maddenin kontrollü salım yapan implant formülasyonu için uygun olduğunu göstermiştir. İmplante edilebilen dozaj formlarından biri olan mikroküreler pasif ve aktif hedeflendirme yöntemleriyle vücudun istenilen doku, hücre ya da organına gönderilebilme olanağı sağlayan taşıyıcılardır. 1

17 1.1. Kontrollü Salım Sistemleri Uzatılmış etkili preparatlarla ilk kez 1940 lı yıllarda etkin maddenin etki süresinin uzatılması yolunda çalışmalar yapılmış olup 1960 lardan sonra kontrollü salım sistemleri terimi dozaj formundan kontrollü ve uzatılmış etkili etkin madde salımını açıklamak üzere kullanılmaya başlanmıştır. Kontrollü salım terimi, etkin maddenin kan konsantrasyonunu istenen süre boyunca istenen düzeyde tutan dozaj formları için olduğu gibi etkin maddenin etki istenen bölgeye lokalize tatbikini ve etki istenen bölgeye hedeflendirilmesini sağlayan dozaj formları için de kullanılabilmektedir. USP 29, (2006) da bu sistemler dozlama sıklığını klasik dozaj formlarına göre en az iki kez azaltan preparatlar olup kontrollü salım (controlled release), uzatılmış etki (prolonged release) ve sürekli etki(sustained release) terimleri bu dozaj formları için eş anlamlı olarak kullanılmaktadırlar. Kontrollü salım sistemlerinin yararları şunlardır: Etkin maddenin plazma düzeyinin belirlenen sürede istenilen değerde tutulabilmesi, Sık olmayan aralarla ilaç alınması nedeniyle tedaviye uyuncun artması, Sisteme yüklenen total etkin madde miktarının alışılagelmiş dozaj şekillerine göre daha az olması, Etkin maddenin yan etkilerinin ve toksisitesinin ortadan kaldırılabilmesi veya azaltılabilmesi, In vivo yarılanma ömrü kısa olan etkin maddelerin parçalanmasının önlenebilmesi ve yarılanma ömrünün uzatılabilmesi, Hastaya, hasta yakınlarına ve bakıcılara kolaylık sağlanması ve özellikle tıbbi kontrolün tam sağlanamadığı az gelişmiş bölgelerde etkin madde kullanımının daha kolay denetlenebilmesi 2

18 Kontrollü salım sistemlerinin istenen bölge, organ, dokuya hedeflendirilebilmesidir. Bu sistemler içinde verilen etkin maddelerin tedavi etkinliği ve güvenirliği artmaktadır. Bütün bu yararlarına rağmen kontrollü salım sistemlerinin henüz aşılamamış bazı sorunları da vardır. Bunlar; Kullanılan polimerlerin kendisinin veya parçalanan ürünün toksik etki veya biyolojik uyuşmazlık göstermesi, Sistem kullanıldıktan sonra etkin madde salımının istenilen anda durdurulamaması, Üretimde, saklamada, dağıtım sürecinde oluşabilecek fiziksel değişikliklerde (örneğin kılcal çatlaklar vb.) sistemin güvenirliğinin zayıflaması, Kullanılan polimerlerin veya sistemin ilacın maliyetini aşırı artırması, Her etkin maddenin bu sistemle hazırlanmasının mümkün olmamasıdır. İyi tasarlanmış kontrollü salım sistemleri, maliyet- etki ilişkisi yönünden değerlendirildiğinde, genel sağlık harcamalarının düşmesine neden oldukları için, tercih edilmektedir. Biyoteknolojik olarak veya klasik teknolojilerle üretilen kanser ilaçları, hormonlar, enzimler, antibiyotikler, antiromatizmal ilaçlar gibi pek çok etkin maddenin geliştirilmiş kontrollü salım sistemleri bulunmaktadır. Son yıllarda moleküler tıptaki gelişmeler sonucu, kontrollü salım sistemleri protein, peptit yapılı ilaçların kullanımında da başarılı sonuçlar vermiştir. Bu moleküllerin güvenlik ve etkinliğini arttırmak, istenmeyen etkilerini azaltıp, biyoyararlanımı artırarak hasta uyuncunu sağlamak için ilaç taşıyıcı mikropartiküler ve vücudun değişik yerlerine yerleştirilen polimerik ilaç taşıyıcı sistemler geliştirilmiştir. Mikrokapsüller, mikroküreler, nanopartiküller, katı-lipid nanopartiküller, mikrosüngerler bu amaçla kullanılan ilaç taşıyıcı sistemler olarak sayılabilmektedir. 3

19 1.2. Kontrollü Salım Sistemi Olarak Mikroküreler İçlerindeki etken maddenin moleküler düzeyde ya da makroskopik partiküller halinde disperse edildiği, birkaç µm' den mm boyutlarına kadar değişen çap dağılımına sahip, katı, küresel, partiküller şeklindeki dozaj formları olup kontrollü salımı sağlayan ilaç taşıyıcı sistemler olarak da hazırlanabilmektedirler. Burada "kontrollü salım" deyimi; Etkin maddenin salım hızının ve/veya etkin maddenin vücuttaki biyolojik dağılımının kontrol edilmesini ifade etmektedir. Dolayısıyla mikroküreler; a. Hem oral hem prenteral yolla sürekli etki elde edilmesi, b. İntramusküler, subkütan, perkütan, intra-artiküler, oftalmik veya nazal yolla bölgesel kontrollü etken madde salımı, c. Kan dolaşımına enjeksiyonla etken maddenin etki yerine hedeflendirilmesi için kullanılabilmektedir. Böylece etkin maddenin dozunun düşürülmesi ve yan etkilerinin azaltılması amaçlanmaktadır. Mikrokürelerin etki yerine hedeflendirilmesi iki farklı yolla sağlanabilmektedir. Birincisi, ilaç taşıyıcı sistemin yapısı ve bileşiminden bağımsız olarak I.V. enjeksiyondan sonra vücuttaki doğal dağılımı ile oluşan pasif hedeflenmedir. Bu şekilde hedeflemede mikroküreler retiküloendotelyal sistem (RES) tarafından tutulurlar. Büyük partiküller (>7 µm) akciğerlerde tutulurken orta çaptaki partiküller (> 100 nm, <7 µm) karaciğer ve dalağa yönelirler. İkinci yol ise, mikroküre yüzeyine bağlanan, spesifik tanıma özelliğine sahip biyomoleküller ile vücudun istenilen bölgesine hatta spesifik hücrelere yapılan aktif hedeflemedir. Belirli hücre ve reseptörlere özgü monoklonal antikorların mikroküre yüzeyine bağlanması ile aktif hedefleme sağlanabilmekte olup bu çok spesifik bir yaklaşımdır. Bunların dışında mikroküreleri magnetik partiküller ile yüklemek de dolaşım sistemine verdikten sonra vücut dışından yönlendirerek istenilen bölgeye hedeflemeyi mümkün kılmaktadır (Bayomi ve ark., 1998; Mi ve ark., 4

20 2002). Bu sistemlerin; 1. Kanser Kemoterapisi 2. Kardiyovasküler uygulamalar 3. İnsülin ve diğer peptid/protein salım sistemleri 4. Kontraseptif uygulama (Özellikle hormon salımı ) 5. Enfeksiyonların tedavisi Antiviral ajanlar Antibiyotikler Antifungal ajanlar Antiparaziter ajanlar 6. Bağışıklık kazandırma alanlarında uygulanabilirliği üzerinde çalışmalar yapılmaktadır (Sinha V.R., 2004; Şenel S. ve McClure J.,2004) İmplante Edilebilen Kontrollü Salım Sistemleri İlk defa 1861 yılında Lafarge tarafından uzun süreli ve sürekli tedavi sağlamak amacıyla subkutan etkin madde pelletleri hazırlanarak geliştirilmiş; daha sonra 1936 yılında Deanesly ve Parkes tarafından hormonların salımında sabit kan konsantrasyonu elde etmek üzere subdermal implantların geliştirilmesiyle tekrar gündeme getirilmişitir (Novel Drug Delivery Systems 1982, s: ). İmplantlar sayesinde vücuttaki tüm biyolojik bariyerin etkin maddenin etki bölgesindeki etkinliğini azaltmasının önüne geçilebildiği gibi sağlıklı dokulardaki yan etkileri de engellenebilmektedir. Etkin maddenin hedef dokuda uzun süre etkili olması sağlanabilmektedir. Klasik olarak, etkin maddenin bölgesel seçiciliği, hedef dokuya en yakın bölgeden uygulanması suretiyle yapılmaya çalışılmıştır. Ancak suppozituvarlar, göz damlaları, 5

21 inhalasyon aerosolleri ve enjektabl preparatlar gibi taşıyıcı sistemlerle etkin madde verilişinde de, etkin maddenin plazma düzeyindeki değişimler, yan etkiler ve hasta uyuncunun zor olması gibi dezavantajların olması uygulamada implante edilebilen sistemlere yönelmeye sebep olmuştur (Gürsoy ve ark., 1989, s: ; Dancwerts ve Fassihi, 1991; Kumar ve Kumar, 2001). Etkin maddenin az sıklıkta, düşük dozlarda ve bölgesel seçici olarak uygulanabilmeleri implante kontrollü salım sistemleri ile mümkündür (Dancwerts ve Fassihi, 1991). İmplante kontrollü salım sistemlerinin avantajları: Spesifik etki bölgesinde etkin madde düzeyinin kontrolü sağlanabilmektedir. Aynı zamanda, sık ve düzensiz doz tekrarlanmasından kaynaklanan kan konsantrasyonundaki piklerin, dalgalanmaların önlenebilmesi de mümkün kılınmaktadır. İyi tasarlanmış bir implante edilebilen sistem, uzun süre sabit hızda etkin madde salımı yapabilmekte ve görülebilecek yan etkiler azaltılabilmektedir. Etkin madde, hedef bölgeye mümkün olan en yakın bölgeye verildiğinden vücuttaki diğer bölgelerde oluşabilecek istenmeyen etkiler en alt düzeye inmektedir. Hızlı metabolize olan veya in vivo yarılanma ömrü kısa olan etkin maddelerin implantasyon ile korunabilmesi söz konusudur. Diğer yollarla verilemeyen etkin maddeler için tercih edilirler. Enjektabl preparatlarla karşılaştırıldıklarında, etkin maddelerin alerji ve yan etki yaratması durumunda vücuttan hızla uzaklaştırılabilmeleri mümkündür. Ayrıca vücuttan uzaklaştırılabilmeleri oral yolla alınan ilaçlar için uygulanan mide yıkaması işleminden çok daha az rahatsız edicidir (Dancwerts ve Fassihi, 1991). İmplante edilebilen kontrollü salım sistemlerinin dezavantajları ise; 6

22 İmplantlar için kullanılan materyallerin toksisitesi ve vücutla uyumsuzluğu sözkonusu olabilmektedir. Özellikle biyoparçalanabilen formlarda zararlı yan ürünler oluşabilmektedir. İmplant varlığında ağrı ve rahatsızlık oluşabilmektedir. Polimer, pompa ve üretim maliyetleri nedeniyle diğer sistemlere göre pahalı sistemlerdir İmplante Edilebilen Kontrollü Salım Sistemi Tipleri İmplante edilebilen kontrollü salım sistemleri aşağıda belirtildiği gibi başlıca iki grup altında incelenmektedir. İlk grup etkin maddenin biyolojik sistemdeki salımının değişik tipteki polimerle ve polimer membranlarla kontrol edildiği polimerik implantlardan oluşmaktadır. İkinci grupta ise etkin madde salımını mekanik olarak kontrol eden pompa tipi implantlar yer almaktadır: A. Polimerik İmplante Edilebilen Kontrollü Salım Sistemi I. Difüzyon Kontrollü Sistemler II. Kimyasal Kontrollü Sistemler III. Çözücünün Aktive Ettiği Sistemler IV. Magnetik Kontrollü Sistemler B. Mekanik İmplante Edilebilen Kontrollü Sistemleri 1.4. İmplante Edilebilen Kontrollü Salım Sistemlerinin Biyouyumluluğu İmplante edilebilen ilaç taşıyıcı sistemlerde, kullanılan tüm maddelerin biyolojik olarak uyumlu, fiziksel ve kimyasal olarak stabil olmaları gerekmektedir. Bu sistemlerde kullanılacak materyallerin taşıması gereken özellikler; - Biyomateryal kesinlikle kimyasal olarak inert olmalı ve herhangi bir biyolojik etkiye neden olmamalıdır ve formülasyondaki diğer yardımcı maddelerle etkileşmemelidir. 7

23 - Bağışıklık sisteminde reaksiyona ve enflamasyona neden olmamalıdır. - Kendisi ve eğer parçalanabilir ise parçalanma ürünleri karsinojenik olmamalıdır. - Alerjik reaksiyonlara ve aşırı duyarlılık reaksiyonlarına neden olmamalıdır. - Biyomateryalin fiziksel ve kimyasal özellikleri biyolojik sistem tarafından değiştirilmemelidir. - Mekanik özellikler açısından dayanıklı olmalıdır. - Biyoparçalanabilen polimerler salım işlemi bitinceye kadar degrade olmamalıdır. - Biyomateryal faklı şekillerde ve içeriklerde üretilebilir olmalıdır. - Kimyasal, fiziksel ve mekanik hiçbir değişime uğramadan sterilize edilebilir olmalıdır. - Terapötik etki süresinin bitiminden sonra kolayca uzaklaştırılabilir özellikte olmalıdır. - Mekanik olarak yerleştirildiği bölgede uzun süre stabil olmalıdır. Eğer biyoparçalanabilen ise, zamanla kontrollü bir degredasyon göstererek aynı oranda boyutu da küçülmelidir. - Geniş bir etkin madde grubu ile uyumlu olabilmelidir. - Hiçbir şekilde pıhtılaşmaya neden olmamalıdır (Dancwerts ve Fassihi, 1991) Kontrollü Salım Sistemlerinde Kullanılan Polimerler Polimerler çok sayıda aynı veya farklı atomların kimyasal bağlarla az veya çok düzenli bir biçimde bağlanarak oluşturduğu uzun zincirli yani yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerdir. Mikrokürelerin hazırlanmasında doğal ve sentetik polimerler kullanılmaktadır (Chien, 1985). Doğal polimerler arasında lipidler, aminopolisakkaritler, proteinler, karbonhidratlar sayılabilmekte olup; biyolojik olarak parçalanabilir olmaları, metabolize edilebilmeleri, stabilite ve büyüklük dağılımlarının kontrol edilebilir olmaları ve suda çözünen etkin 8

24 maddeler için yüksek yükleme kapasitesi vermeleri nedeni ile tercih edilirler. Sentetik polimerler arasında da biyolojik olarak parçalanabilen ve parçalanamayan polimerler sayılabilmektedir (Tunçay ve Çalış, 1999; Göpferich A.,1996; Watts ve ark., 1990). Sentetik polimerler ise istenilen spesifikasyonlara göre sentezlenebilmeleri, hazırlama ve saklama süresince dayanıklı olmaları, fazla miktarda ve yüksek saflıkta üretilebilmeleri gibi üstünlüklerinden dolayı tercih edilmektedirler. Bu polimerler ilaç taşıyıcı sistemlerde en çok kullanılan biyomateryal grubudur (Park, 1979; Black, 1984; Özalp ve Özdemir,1996). Kontrollü salım sistemlerinin hazırlanmasında kullanılan biyoparçalanabilen polimerlerin en ideali etkin madde salımı yapabilen ve parçalanma sonucu hiç kalıntı bırakmayan sistemlerdir. Genel olarak aranılan biyolojik özellikler; polimerin biyolojik çevre ile iyi uyuşması, dokuyla temas ettiğinde iltihaba yol açmaması, kanserojen veya teratojen etki göstermemesi ve toksik olmamasıdır (Gürsoy ve ark., 1989; s:30-31) Polimerlerin Sınıflandırılması Kontrollü salım sistemlerinde kullanılan polimerlerin seçiminde kullanılış yolu, etkin maddenin cinsi, dozu ve salım süresi dikkate alınır. Özellikle son yıllarda etkin madde yapısına, etki etmesi istenen bölgeye ve hatta etki süresine uygun yeni polimerler geliştirilmektedir ve bu polimerler tailor madde, intelligent polymers veya fonksiyonel polimerler olarak adlandırılmaktadır (Peppas ve ark.,2000). PH, iyonik güç, sıcaklık etkin madde konsantrasyonu, çözücü yapısı gibi bazı çevre faktörlerinden etkilenerek şişme özellikleri değişen hidrojeller bu sınıftadırlar. (Hoffman,1997; Ramkissoon ve ark.,1999). Polimerler genel olarak iki grup olarak incelenir: 9

25 A- Biyodegredabl olmayan (Biyoparçalanamayan) Polimerler: Biyolojik ortamda parçalanamazlar. Bu polimerler hidrofil veya hidrofob yapıda olurlar. Hidrofil olanlar hidrojel olarak adlandırılır. Suda çözünmez ama suda şişerler. Hidrofoblar suda çözünmez ve şişmezler. B- Biyodegredabl (Biyoparçalanabilen) Polimerler : Biyoparçalanan polimerler suda çözünmezler fakat biyolojik sıvılarla temas edince kimyasal ve fiziksel değişime uğrarlar. Biyolojik parçalanmada özellikle yığın parçalanmada iki aşama vardır. Birinci aşama, moleküler bağların rasgele kopmasıdır ve bunun sonucunda değişen molekül ağırlığı, polimerin mekanik özelliklerinde ve morfolojisinde değişimlere neden olur ama moleküler ağırlık değişmez (Brannon-Peppas, 1997). İkinci aşama, zincir kopması yanısıra ölçülebilir ağırlık kaybıdır. Bu aşamada polimerin molekül ağırlığı iyice azalır ve yapıdan koparak çözünen en küçük birim oligomerler oluşur. Bu oligomerler en yakın dokuya difüze olacaklarından biyolojik olarak uyumlu olmaları istenir. İn vivo ortamda enzimatik ve enzimatik olmayan yolla parçalanabilen ve toksik olmayan biyouyumlu ürünler oluşturabilen biyoparçalanabilen polimerler doğal ve sentetik olmak üzere iki temel gruba ayrılmaktadır (Rezaul, 1990). Doğal biyoparçalanabilen polimerler ; - Lipidler: LDL Şilomikronlar Emülsiyonlar Mum 10

26 - Aminopolisakkarit: Kitozan - Proteinler: Jelatin Albümin Kollagen Fibrinojen Eritrosit DNA İmmunoglobulinler - Karbonhidratlar: Nişasta Dekstroz Agar Hiyaluronik asit İnsulin Selüloz (Bogdansky, 1990) Sentetik biyoparçalanabilen polimerler; - Polilaktik asit - Poliglikolik asit - Polihidroksi valerat - Püsodopoiamino asitler - Poli (aminoasitler) - Poli (ortoesterler) - Polianhidritler - Polistiren - Polikaprolaktan - Psödohidroksibütirat - Poliamid, poliakrilamid 11

27 - Polialkilsiyanoakrilat - Vinil türevleri - Polikarbonat (Wood, 1980) İmplante ilaç taşıyıcı sistemlerin hazırlanmasında kullanılan biyolojik parçalanabilen polimerlerin en ideali, etkin madde salımı ve polimerin parçalanması sonucu hiç kalıntı bırakmayan sistemlerdir. Teorik olarak bütün polimerler degredabl olmaktadır. Ancak degredasyon için gerekli süre polimerin yapısına bağlı olarak değişmektedir. Biyolojik olarak parçalanabilir polimerler; Toksisitelerinin olmaması, Biyolojik sistemle geçimli olmaları, Biyolojik ortamda kalıntı bırakmamaları nedeniyle tercih edilmektedirler. Bu polimerler kullanılarak istenilen fizikokimyasal özellikte, in vitro ve in vivo koşullarda stabil mikropartiküler sistemler hazırlanabilmektedir (Lloyd, J.P.,1987; Tuncay ve Çalış, 1999). Doğal biyoparçalanabilen polimerler; Biyolojik olarak parçalanabilme özelliklerinin daha iyi olması, Antijenik olmamaları ve metabolize edilebilmeleri, Retiküloendotelial sisteme taşınabilmeleri, Stabilite ve büyüklük dağılımlarının kolay kontrol edilebilmeleri, Suda çözünürlüğü yüksek etkin maddeler için yüksek yükleme kapasitesine sahip olmaları gibi avantajlı özellikleri nedeni ile tercih edilirler (Lloyol, 1987; Müller ve ark., 1996; Rubino ve ark., 1993). 12

28 1.6. Kitozan Kitozan pozitif yüklü ve mukoadhezif özelliklere sahip bir polimer olduğundan etkin madde kontrollü salım çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır. Kitozanın biyouyumluluğu, yüksek yükleme etkinliği, toksik olmaması da farmasötik uygulamalar için yüksek potansiyele sahip doğal bir polimer olduğunu gösterir (Sinha V.R. ve ark., 2004) Kitozanın hidrofilik özellikleri nedeniyle etkin madde çözünürlüğünü arttırdığı belirtilmektedir. Jel oluşumu kitozanın, polifosfat, sülfat gibi düşük moleküllerle etkileşimi ve glutaraldehit ile çapraz bağlanma yoluyla elde edilebilmektedir ve kitozanın bu jelleşme özelliği, farmasötiklerin ve yiyecek ürünlerin kaplanması, biyokimyasalların, bitki embriyolarının, tüm hücrelerin ve mikrorganizmalarla yosunun jel şeklinde kapsüllenmesi gibi geniş bir uygulama imkanı vermektedir (Şenel, S. ve McClure, S. ; 2004) Kitozanın Yapısı Ve Elde Edilmesi Glukozamin ve N- asetil- glukozamin ko- polimerlerinden oluşan (Sıngla ve Chawla, 2001; Kato ve ark., 2003) doğal bir lineer biyopoliaminosakkarit olan kitozan, doğada selülozdan sonra en fazla polisakkarit içeren kitinin alkalin deasetilasyonu yoluyla elde edilmektedir (Muzzzarelli,1994; Roberts,1992; Şenel, S. ve McClure, S. ; 2004) Elde işlemi için yengeç veya karides; %3-5 lik (a/h) sulu NaOH ile, C de birkaç saat muamele edilerek ya da oda sıcaklığında bir gece bekletilerek proteinlerden uzaklaştırılır. İnorganik maddeleri uzaklaştırılan ürüne %3-5 (a/h) HCl uygulanarak (oda sıcaklığında) kitinin beyaz rengi elde edilir. Elde edilen örneğe, %40-45 lik (a/h) NaOH çözeltisi, C de 4-5 saat uygulanır.bu işlemle kitinin N- deasetilasyonu sağlanmış olur.çözünmeyen bu çözelti yıkanır ve ham kitozan elde edilmiş olur.ham kitozan %2 lik asetik asitte çözündürülüp, çözünmeyen kalıntılardan 13

29 uzaklaştırılır, NaOH ile yıkanıp nötralize edilir. Beyaz temizlenmiş kitozan elde edilmiş olur (Sandford ve Steinnes, 1989). CH 2 OH CH 2 OH H H H OH H H OH H H n H NHCOCH 3 KİTİN H [(1-4)-2-asetamido-2-deoksi-B-D-glukoz] CH 2 OH CH 2 OH H H H OH H H OH H H n H NH 2 KİTOZAN H NH 2 [B-(1-4)-2 amino-2-deoksi-d-glükoz] Şekil 1.1 Kitin ve kitozanın kimyasal yapıları 14

30 1.6.2 Kitozanın Fizikokimyasal Yapısı Kitozan, glikozaminlerin homojen olmayan bir şekilde birbirine bağlanması ile oluşmaktadır. Deasetillenen glikozamin fraksiyonu deasetilasyon derecesini göstermekte olup çözünürlüğü ve viskoziteyi etkileyen önemli özelliklerdir. Deasetilasyon derecesi düşük (% 40), ve ph>9 ise çözünürlük iyidir. Oysaki deasetilasyon derecesi yüksekse ancak ph 6,5 un altında çözünmektedir (Chandy ve Sharma, 1990). Deasetilasyon derecesinin artması viskoziteyi arttırır. Bunun sebebi amin ve hidroksil gruplarının artmasıdır. Kitozanın yüksek molekül ağırlığı ve lineer yapısı asit ortamında viskozite sağlayıcı ajan olmasına; hidrofilik ve katyonik bir poliamin olması ise negatif yüklü yüzeylere bağlanmasına olanak sağlamaktadır. Kitozan özellikleri N- deasetilasyon derecesi değiştirilerek istenildiği gibi modifiye edilebilmektedir. Tablo 1.1. Kullanılan kitozan çeşitlerinin fizikokimyasal özellikleri Kitozan Çeşitleri Deasetilasyon Derecesi (%) Viskozitesi (cps) HM W 81, MM W 81, LM W 80, Kitozan 3800 ile aralığında molekül ağırlığa sahiptir ve %40 ile %98 arasında deasetiledir (Illum, 1998). %1 asetik asit içerisindeki %1 kitozan çözeltisi molekül ağırlığına bağlı olarak değişik viskozluk değerleri gösterir (<2000mPa.s) (Sigma- Aldirich, 2003). Kitozan zayıf bir baz olup ve su ve organik çözücülerde çözünmemektedir; bununla birlikte, glikozamin birimlerini çözünmüş R-NH + 3 ya dönüştürebilen saf sıvı asetik asit çözeltisinde (ph< 6,5) çözünmektedir 15

31 (Chandy ve Sharma, 1990). Alkali polianyonik ortamlarda çökelmekte ve düşük ph da ise jel oluşturmaktadır. Tablo 1.2. Kitozanın farklı asitlerdeki çözünme dereceler KİTOZAN Çözünür Kısmen Çözünür Çözünmez Asetik Asit Hidroklorik Asit Sülfirik Asit Propiyonik Asit Perklorik Asit Fosforik Asit Laktik Asit Nitrik Asit Formik Asit Pozitif yüklü kitozanın, negatif yüklü mukozal yüzeyler ile arasındaki elektrostatik etkileşim nedeni ile muko-adhesif özelliklere sahip olduğu görülmüştür (Lehr ve ark.,1992; Needleman and Smales, 1995; Rillosi and Bockton, 1995; He ve ark., 1998; Shimoda ve ark., 2001; Kockisch ve ark., 2003) Kitozanın Farmakolojik Özellikleri Kitozan alerjik reaksiyona neden olmadığı için canlı dokularla biyo- uyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilen bir polimerdir. İnsan vücudu tarafından tamamıyla emilen zararsız ürünler (amino şekerler) halinde parçalanmaktadır, toksik değildir ve organizmadan kolaylıkla atılabilir (Nicol S., 1991). Anti-mikrobik bir yapıya sahiptir ve civa kadmiyum gibi zehirli metalleri absorbe edebilmektedir. Buna ek olarak iyi adhezyon, koagülasyon gücüne sahiptir ve immunositümilan etki gösterir (Şenel, S. ve McClure, S. ; 2004, Suh, J.K.F. ve ark.; 2000). Laboratuar fareleri üzerindeki LD 50 değeri 16g/kg olup, bu değer şeker ve tuza yakındır (K.Arai ve ark., 1986). 16

32 Kitozan toksisite içermez ve nazal epitele uygulanabilir. Nazal boşluktaki mukoza katmanından su emerek sıvı ortamda şişer ve jele benzer bir katman oluşturur. Bu durum polimerin ve glikoprotein zincirlerinin mukozanın içine işlemesi açısından faydalıdır (Felt ve ark., 1998). Kitozan pozitif yüklü olmasından dolayı negatif yüklü mukozal yüzeylerle veya siyalik asit kalıntılarıyla güçlü elektrostatik etkileşime girerek muko-adhesif karaktere sahip olmuştur (IIIum ve ark.,1994). Kitozan ayrıca uygun biyoadhesif özellikler gösterir ve etkin maddelerin nazal boşlukta uzun süre kalmasını sağlar (Soane ve ark.,1999; Aksungur, P., 2004). Kitozandan hazırlanan zarlar, bazik ilaçlara göre asidik etkin maddeler daha fazla geçirgenlik göstermiştir (Sawayanagi ve ark., 1982). Düşük toksisite ve iyi biyo-uyumluluk, biyomedikal ve farmasötik formülasyonlarda kullanıma uygun olmasını sağlamaktadır (Candy ve Sharman, 1990; IIIum ve ark., 2001). Örneğin hipobilüribinemik ve hipokolesterolemik etkiler (Furda,1980; Nagyuvary,1982), antiasit ve antiülser aktiviteleri (Ito ve ark.,2000), yara ve yanık iyileştirme (Tachihara ve ark.,1997) özellikleri nedeniyle kullanılmaktadır. Kitozan, film oluşturma kapasitesine sahip olması nedeniyle, yumuşak ve sert kontak lens geliştirmede tercih edilen bir biyopolimer olarak tavsiye edilmiştir. Kitozan, travma görmüş gözler için koruyucu amaçlı olarak kullanılan oküler bandaj lenslerin üretiminde kullanılmaktadır (Markey ve ark.,1989). Kitozan zarları, uygun geçirgenliğe ve yüksek gerilme gücüne sahip olmaları nedeniyle suni böbrek zarları olarak da faydalı bulunmuştur (Amiji, 1995) Kitozanın Uygulama Alanları -Atık Su Arıtımı: Metal İyonların Ayrıştırılması Flokülant /Koagülant 17

33 Protein Aminoasit Dye -Gıda Endüstrisinde: Süspande katıların uzaklaştırılması Besin koruyucu Renk Stabilisyonu Sağlayıcı Hayvan yemi katkı maddesi -Medikal Bandaj/ Sünger Yapay kan damarı Kan kolesterol kontrolü Tümör inhibisyonu Etken maddelerin kontrollü salımı Deri yanıkları/yapay deri Kontak lens Dental/ Plak inhibisyonu Kemik hastalıkları tedavisi Membran -Biyoteknoloji Enzim immobilizasyonu Protein ayrıştırılması Kromotografi Hücre immobilizasyonu Hücre kaplanması (recovery) -Tarım Tohum kaplanması 18

34 Dölleyici (fertilizer) Kontrollü agrokimyasal salım -Kozmetik Pudra Nemlendirici Yüz,el ve vücut kremleri Banyo losyonları Diş macunu Köpük tutucu -Kağıt Endüstrisi Yüzey düzeltici Fotoğraf kağıdı Karbonsuz kopya kağıdı -Membran Geçirgenlik kontrolü Ters osmoz Çözücü ayrıştırılması Kitozanın Farmasötik Teknolojide Kullanımı Kitozan aşağıda belirtilen formlarda hazırlanarak değişik amaçlar için kullanılabilmektedir. Çözelti/ Jel Bakteriostatik ajan Fungustatik ajan Kozmetikler Flokülasyon ajanı Kaplama ajanı 19

35 Jel/ Pasta Etkin madde taşıyıcısı Spermisid İmmobilizasyon / enkapsülasyon ajanı Tanecik (Bead ) Hücre / enzim immobilizasyonu Protein ayrıştırılması Film/ Membran Dializ membranı Kontakt lens Yara örtücü Memeli hücresi enkapsülasyonu Sünger Mukozal hemostatik ajan Yara örtücü Lif Sütur Toz Direkt tabletleme ajanı olarak (Sawayanaghi ve ark., 1982a), Tablet imalatında yardımcı madde ve kaplayıcı olarak (Abletshauser ve ark., 1993; Bhagat ve ark., 1991; Upadrashta ve ark., 1992), Aşınabilen sistemlerde jel matriksin oluşturulmasında (Thacharodi ve Rao, 1993a; Thacharodi ve Rao, 1993b), Çözünürlüğü düşük olan etken maddelerin çözünürlüklerinin arttırılmasında (Sawayanaghi ve ark., 1982b; Sawayanaghi ve ark., 1983), Kontrollü salım yapan dozaj formlarının hazırlanmasında ( Jameela ve ark., 1998; Hou ve ark., 1985). 20

36 Kitozan ile Hazırlanan Kontrollü Salım Sistemleri Kitozan katyonik özelliği ve film oluşturabilme yeteneğine bağlı olarak kontrollü salım sistemlerinin geliştirilmesinde çok uygun bir ajandır. Nishioka ve ark.(1989), albümin mikrokürelerine kitozan ilavesi ile etkin madde salımını geciktirmişlerdir. TPP den başka sülfat ve sitrat gibi anyonların da kitozanla elektrostatik etkilerine girdiği saptanmış ve buna bağlı olarak sülfat ve sitratla çapraz bağlanmış kitozan filmleri oluşturulmuş ve bunların kontrollü etkin madde salım özellikleri incelenmiştir (Shu ve ark, 2001). Dini ve ark., (2003) hidrofilik etkin madde, hidrokinon içeren kitozan mikrokürelerinin glutaraldehitle çapraz bağlanması üzerinde çalışmıştır. Bu çalışmada yüksek kitozan konsantrasyonu, yüksek kitozan moleküler ağırlığı ve /veya daha düşük etkin madde konsantrasyonları kullanılarak hazırlanan mikrokürelerden daha yavaş etkin madde salım oranları elde edildiği tespit edilmiş; hidrokinonun salım oranının, temelde polimer çapraz bağlama yoğunluğu ve hidrojel matriksin şişme oranı ile kontrol edildiği belirlenmiştir Kitozan Mikroküre Hazırlama Yöntemleri Kitozanın uygulanan yönteme göre asidik, nötr veya bazik ortamlarda çok değerlikli anyonlarla tepkimeye sokulması çapraz bağlanmayla sonuçlanır. Bu çapraz bağlanma, kitozan mikrokürelerin hazırlanmasında geniş ölçüde kullanılmaktadır ve bu yöntem aşağıdaki şekilde özetlenmiştir ( Sinha V.R ve ark., 2004). 21

37 KİTOZAN MİKROKÜRELER Anyonlarla Etkileşim (Sülfat, Tripolifosfat, Hidroksit, Molybdat) Sitrikasitle Termal Çapraz- Bağlanma Çözücü Buharlaştırıcı Mikropartiküler Kaplama Kimyasal Çapraz-Bağlama İyonotropik Jelasyon Islak Faz İnversiyon Koaservasyon Glutaraldehitle Çapraz-Bağlama Formaldehitle Çapraz- Bağlama Genipin ile Çapraz- Bağlama Emulsifikasyon ve İyonotropik Jelasyon Modifiye Emülsifikasyon ve İyonitropik Jelasyon Prespitasyon Tekli Emülsiyon Çoklu Emülsiyon Kompleks Koaservasyon Kimyasal Çapraz- Bağlama ile Prespitasyon Şekil 1.2. Kitozan mikroküre hazırlama yöntemleri 22

38 Anyonlarla Etkileşim Esasına Dayalı Yöntemler İyonotropik Jelasyon Çalışmamızda da kullanılan bu yöntemde kitozan mikroküreleri hazırlamak için ters yüklü makro moleküller arasında kompleks oluşumundan yararlanılır; süreç çok basittir. Buna ek olarak, kimyasal çapraz bağlama yerine elektrostatik etkileşim yoluyla geri dönüşümlü fiziksel çapraz bağlama, ajanların olası toksik etkilerini ve diğer istenmeyen yan etkileri önlemek amacıyla uygulanmıştır. Tripolifosfat (TPP), katyonik kitozan ile elektrostatik olarak etkileşime girebilen bir poli-anyondur. Bodmeier ve ark. nın kitozan çözeltisinin TPP çözeltisine damlatma yoluyla TPP-kitozan kompleksi hazırlanmasına yönelik araştırmalarından, bu yöntem farmasötik alanda kullanılmaya başlamıştır. İyonotropik jelasyon için kullanılan çapraz bağlayıcılar üç grupta incelenebilir: a)düşük moleküller ağırlıklı iyonlar (örn. Pirofosfat, tripolifosfat, tetrapolifosfat, oktapolifosfat, hekzametafosfat ve (Fe(CN) 6 ) -4 /(Fe(CN) 6 ) -3 ), b) hidrofilik ajanlar (örn. alginat, k-karagenan, poli-1-hidroksi-1-sülfonat-propen- 2, polialdehidro-karbonik asit), c)yüksek moleküler ağırlıklı iyonlar (Örn. Oktil sülfat, lauril sülfat, hakzadesil sülfat, setilsteril sülfat) (Skaugrud, 1991). Bu yöntem ile hazırlanan mikrokürelerden genel olarak etkin madde salımı üzerine etkili olan faktörler: - Polimer tipi ve viskozitesi, - Polimer konsantrasyonu, - Çapraz bağlayıcı ajan konsantrasyonu, - Yüklenen etkin madde miktarı, - Jelleşme süresi, - Kurutma süresi ve şeklidir. 23

39 Kitozan çözeltisi Yüksek Hızda Karıştırıcı Poli-anyonik Çözelti Kitozan Partikülleri Şekil 1.3. İyonotropik Jelasyon Yöntemi İyonik jelleşme yönteminde; kitozan, asidik çözücüde çözülür. Bu çözelti daha sonra damlatma yoluyla sabit bir karıştırma hızında, poli-anyonik TPP çözeltisine karıştırılır. Zıt yükler arasındaki kompleks oluşumuna bağlı olarak, kitozan iyonik olarak jelleşir ve küresel partiküller oluşturur (Shiraishi ve ark.,1993; Calvo ve ark.,1997). Kitozan mikroküreler içerisindeki asetik asit TPP tarafından hızla nötralize edilir ayrıca asetik asit dış faza difüze olur. Metilred ve bromtimol mavisi kullanılarak mikroküre içerisindeki ph değişimi gözlenerek, çapraz bağlanma için gerekli sürenin tespiti mümkündür. Yöntem, şematik olarak Şekil 1.3. te verilmiştir. Bununla birlikte, oluşan TPP/kitozan mikropartikülleri, mekanik güç açısından zayıftır ve bu da etkin madde salımında kullanımlarını kısıtlamaktadır. Yapılan bir çalışmada insülin yüklü kitozan nano-partikülleri, TPP çözeltisi ile insülin karıştırılması ve daha sonra bunun sabit karıştırma hızında kitozan çözeltisine ilavesiyle hazırlanmıştır. Moleküler ağırlık ve deasetilasyon derecesinde değişiklik gösteren hidroklorür tuzu halindeki iki kitozan türü (Seacure 210 CI ve Protasan 110 Cl), nano-partikül 24

40 hazırlanmasında kullanılmıştır. Her iki kitozan türü için TPP konsantrasyonu 6:1 kitozan/ TPP oranı elde edilecek şekilde ayarlanmıştır (Fernandez R. ve ark., 1999). Dambies ve ark (2001), jelleşme ajanı olarak molibdat kullanarak kitozan jel damlaları hazırlamıştır. Bu yeni jelasyon tekniğinin, kitozan çözeltisinin alkali koagülasyonu sırasında üretilenden farklı bir yapı oluşturduğu gözlenmiştir. Geniş, açık gözeneklerle karakterize edilen bir morfoloji yerine, optimum koşullar altında (ph 6; molibdat konsantrasyonu 4g/l) molibdat çözeltisinde oluşturulan jel damlaları, oldukça sıkı bir 100 µm kalınlıkta dış tabaka ve küçük gözenekli bir iç tabaka ile, çift tabakalı katman yapısı göstermiştir. İyonotropik jelasyon yöntemi kullanılarak hazırlanan partiküler dozaj şekillerinin avantajları şöyle sıralanabilmektedir: - Hazırlanışları kolaydır, karmaşık alet kullanımı gerektirmezler. - Kullanılan çapraz bağlayıcı ajanlar toksik olmadığından istenmeyen etkilere neden olmazlar. - Farklı partikül büyüklüklerinde hazırlanabilirler ( µm). - Partikül büyüklüğü dağılımları dardır. - Geniş bir sıcaklık aralığında stabildirler. - Etkin madde salımı ph a bağımlı olarak kontrol edilebilir. Bu nedenle özellikle mide rahatsızlıklarının tedavisinde kullanılan etkin maddelerin formülasyonu için tercih edilmektedirler (Shu ve Zhu, 2002a) Islak Faz Inversiyon Bu yöntemde, asidik asit içerisindeki kitozan çözeltisi, sıvı bir çapraz bağlayıcı olan sodyum tripolifosfat çözeltisine damlatılmıştır. Oluşan mikroküreler %5 etilen glikol diglisidil eter ile çapraz bağlanmıştır. Son olarak 25

41 mikroküreler yıkanmış ve gözenekli kitozan mikroküreleri oluşturmak için dondurularak kurutulmuştur. Koagülasyon ortamının ph ının değiştirilmesi, kitozan mikrokürelerinin gözenek yapısını değiştirebilmiştir (Mi ve ark., 1999) Emülsifikasyon ve İyonotropik jelasyon Bu yöntemde, kitozan çözeltisinden oluşan su fazı, s/y emülsiyonun oluşması için, sürekli faza eklenmiştir. Sodyum hidroksit (1N) çözeltisi, iyonotropik jelasyonun sağlanması için, daha sonra farklı aralıklarla eklenmiştir. Oluşan mikroküreler, filtrasyon ile ayrılmış, yıkanmış ve kurutulmuştur (Lim ve ark., 1997) Modifiye emülsifikasyon ve iyonotropik jelasyon yöntemi Shu ve Zhu (2001), turbidimetrik titrasyon yoluyla kitozan ile etkileşebilecek üç tür anyon (tripolifosfat, sitrat ve sülfat) üzerinde araştırma yapmıştır. Elde edilen sonuçlar, yukarıdaki anyonlarla kitozan arasında belirli bir ph (sülfatkitozan için 1,0-7,5, sitrat/kitozan için 4,5-7,5, tripolifosfat/kitozan için 1,9-7,5) bölgesinde elektrostatik etkileşim olduğunu göstermiştir. Anyonların kitozan ile etkileşime girdiği ph bölgesi dışında, mikroküre oluşumu görülmemiştir. Bununla birlikte, geleneksel emülsifikasyon ve iyonotropik jelleşme yöntemiyle, kitozan ile anyonların etkileşime girdiği ph bölgeleri de dahil, sadece düzensiz mikropartiküller oluşurken, bu yöntemde, onlarca mikron aralığında çapa sahip küresel mikroküreler oluşmuştur. Bu sürecin anahtar noktası, jelatinin kullanılması ve kitozan/jelatin s/y emülsiyonunun iyonik çapraz bağlama sürecinin, düşük ısıda koagülasyon koşulları altında gerçekleşmesidir. Sodyum sülfat çapraz bağlı kitozan/jelatin mikrokürelerinin ve sodyum sitrat çapraz bağlı kitozan/jelatin mikrokürelerinin yüzeyleri, oldukça düzgündür ancak tripolifosfat/kitozan mikrokürelerinin yüzeylerinde 26

42 büyük boşluklar gözlenmiştir. Karıştırma hızının arttırılması, çapın azalmasına ve partikül büyüklüğü dağılımının daralmasına yol açmıştır (Kim ve ark., 2003) Sodyum Dioktil Sülfosüksinat ile iyonik etkileşim yoluyla yüzen delikli kitozan mikroküreleri Melatonin içeren yüzen mikrokapsüller, kitozan ile negatif yüklü sürfaktan olan sodyum dioktil sülfosüksinat arasında iyonik etkileşim yoluyla hazırlanmıştır (El-Gibaly, 2002). Oluşturulan yüzen mikrokapsüllerin özellikleri, kitozan ve sodyum tripolifosfat ile elde edilen klasik yüzmeyen mikrokürelerle karşılaştırılmıştır. Kitozanın koagülasyonunda dioktil sulfosüsinat çözeltisinin kullanımı; yuvarlak, gözenekli çekirdeğe ve %31,2-59,74 arasında etkin madde yükleme etkinliğine sahip iyi oluşmuş mikrokapsüller meydana getirmiştir. Kitozan konsantrasyonu ve etkin madde polimer oranı, dioktilsulfosüksinat/kitozan mikrokapsüllerinin etkin madde tutmasında önemli etkiye sahip olmuştur. Mikrokapsüllerin çoğunun çözünme profilleri, gastrik sıvıda sıfır derece kinetiğe uyum göstermiştir Koaservasyon Bu yöntemde kitozanın alkali ortamda çökme özelliğinden yararlanılır. Damlacık oluşturmak üzere kitozan çözeltisi sodyum hidroksit, NaOHmetanol veya etandiamin gibi bir alkali çözeltiye basınçla gönderilir. (Nishimuna K., 1986). Eklenen çapraz bağlayıcı ile damlacıklar sertleştirilir. Partiküllerin ayrılması ve arıtılması, sıcak ve soğuk su ile arka arkaya yıkama ve filtre etmek suretiyle gerçekleştirilir. 27

43 Değişen hava basıncı veya püskürtme çapı ile partikül boyutu kontrol edilirken daha sonra partiküllerin sertleştirilmesi için kullanılan çapraz bağlayıcı ajan miktarı ile de etkin madde salımı kontrol edilebilmektedir Kompleks-koaservasyon Kitozan mikroküreleri, ayrıca kompleks koaservasyon yöntemiyle de hazırlanabilir. Sodyum alginat, sodyum karboksimetilselülöz, k-karregenan ve sodyum poliakrilik asit, mikroküre oluşturmak için kitozan ile kompleks koaservasyon için kullanılabilir. Bu mikro partiküller, ters yüklü polimerlerin etkileşimi ile oluşturulur. Kitozan-alginat ve kitozan-k-karregenan koaservat kapsüllerinin formülasyonu, yukarıda belirtilen çözeltilerin sırasıyla potasyum klorür ve kalsiyum klorür ile etkileşimiyle gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kapsüller, yıkama ve kurutma öncesinde sertleştirilmiştir (Daly ve Knorr, 1988; Ohtakara ve ark., 1989a,b; Nishioka ve ark., 1990; Li ve ark., 1991; Pandya ve Knorr, 1991; Ohya ve ark., 1993) Diğer Kimyasallarla Çapraz bağlama Kitozan mikroküreleri hazırlamak için glutaraldehid, formaldehid ve genipin gibi çapraz bağlama ajanları kullanılmıştır Emülsiyon Çapraz Bağlama Yöntemi Bu yöntemde, çapraz bağlama ajanının aldehit grupları kitozanın işlevsel amino grubu ile çapraz bağlanarak mikropartikül oluşumunu sağlar. Bu yöntemde yağ içinde su emülsiyonu; kitozan sulu çözeltisinin yağ fazında emülsiyonu ile hazırlanmaktadır. Sıvı damlacıklar uygun bir sürfaktan kullanılarak stabilize edilmektedir. Stabil emülsiyonun glutaraldehit gibi uygun bir çapraz bağlayıcı ajan kullanılarak çapraz bağlanması suretiyle, damlacıkların sertleşmesi sağlanır. 28

44 Emülsiyon çapraz - bağlama yöntemi birkaç dezavantaja sahiptir: Reaksiyona girmeyen çapraz bağlayıcının ortamdan uzaklaştırılmasının zor olması, Etken madde ile kimyasal reaksiyona girebilecek çapraz bağlayıcı ajan kullanımı, Kimyasal çapraz bağlayıcı ajanların, biyolojik sistemde çoğunlukla toksik etkili olması Çoklu Emülsiyon Yöntemi Etkin madde yükleme etkinliğini arttırma yolu çoklu emülsiyondur. Bu yöntem, (y/s) birincil emülsiyon oluşumu (kitozan çözeltisinde sıvı olmayan etkin madde çözeltisi) ve birincil emülsiyonun y/s/y emülsiyonu oluşturması için dış yağlı faza eklenmesi ve daha sonra glutaraldehid (çapraz bağlayıcı) eklenmesi ve organik solventin buharlaşmasını içerir (Pavanetto ve ark., 1996) Çökelme- kimyasal çapraz bağlanma Bu süreç, kimyasal çapraz bağlama sonrasında polimerin çökelmesini içermektedir. Çökelme, glutaraldehid veya formaldehid kullanımıyla oluşan kimyasal çapraz bağlama sonrasında sodyum sülfat veya NaOH ile gerçekleştirilebilir (Berthold ve ark., 1996b). Hem emülsiyon çapraz bağlama hem de çökelme ilkelerinden faydalanan yöntem, Tokumitsu ve ark. (1999), tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde stabil damlacıkların çapraz bağlanması yerine, kitozan damlacıklarının NaOH damlacıkları ile birleşmesine izin verilerek çökelme gerçekleştirilir. İlk olarak, sıvı parafin yağında etkin madde ile kitozan sıvı 29

45 çözeltisi içeren stabil bir emülsiyon oluşturulur ve daha sonra aynı şekilde NaOH kitozan çözeltisi içeren başka bir stabil emülsiyon oluşturulur. Her iki emülsiyon da yüksek hızda karıştırıldığında, emülsiyonların her birinin damlacıkları gelişigüzel bir şekilde çarpışır, birleşir, böylece çökelen kitozan damlacıkları, küçük boyutlu partiküller oluşturur. Nanopartiküllerin boyutu, damlacık boyutuna bağlı değildir Doğal olarak oluşan bir ajan ile çapraz bağlama Mi ve ark (2002), düşük sitotoksisite ile enjekte edilebilen kitozan bazlı salım sistemi hazırlamıştır. Küçük partikül boyutlu, düşük kristaliniteli ve iyi küreselliğe sahip kitozan mikroküreleri, doğal olarak oluşan bir çapraz bağlama ajanı (genipin) ile çapraz bağlama yoluyla, sprey-kurutma yöntemiyle hazırlanmıştır Diğer Yöntemler Çapraz bağlayıcı maddelerin kullanımına ek olarak, kitozan mikrokürelerin hazırlanmasında başka mikroenkapsülasyon süreçleri vardır. Bu süreçler, aşağıdaki bölümlerde açıklanmıştır Termal Çapraz bağlama Orienti ve ark. (1996), sitrik asit kullanarak termal çapraz bağlama yoluyla indometazin yüklü kitozan mikroküreleri hazırlamıştır. 30

46 Çözücü Buharlaştırma Yöntemi Bu yöntemde, sıvı (y/s) veya sıvı olmayan (s/y) karışmaz bir faz ile polimer çözelti arasında emülsiyon oluşumu söz konusudur. Bogataj ve ark., (2000), sıvı parafin/aseton çözücüleri kullanarak çözücü buharlaştırma yöntemiyle mikroküre hazırlamıştır. Etkin madde çözeltisi (asetonda) kitozan çözeltisinde dağıtılmış ve bu karışım sıvı parafinde emülsiyona dönüştürülmüş ve karıştırılmıştır. Mikroküre süspansiyonu süzülmüş, yıkanmış ve kurutulmuştur. Aglomerat önleyici ajan magnezyum stearat da eklenmiştir. Sonuçlar, ortalama partikül boyutunun, mikroküre hazırlanmasında kullanılan magnezyum stearat miktarının artmasıyla azaldığını göstermiştir. Yağda kurutma adlı yeni bir yöntemde ise, asidik asitteki kitozan çözeltisi yağa damlatılmış, sistemin sıcaklığı arttırılmış, basınç azaltılmış; bu durum çözücünün buharlaştırılması ve mikrokürelerin oluşumu ile sonuçlanmıştır (Li ve ark., 1991) Püskürterek Kurutma Bu yöntem, atomize damlacıkları sıcak hava akımında kurutmaya dayalıdır. Bu yöntemde, ilk olarak kitozan sıvı asetik asit çözeltisinde çözülür, daha sonra etkin madde ve çapraz bağlayıcı bu çözeltiye eklenir. Bu çözelti, sıcak hava akımında atomize edilir. İstenen partikül boyutunun elde edilmesi için çeşitli süreç parametrelerinin kontrol edilmesi gereklidir. Partikül boyutu; 31

47 1. püskürtme delik çapı, 2. sprey akış hızı, 3. atomizasyon basıncı, 4. giriş hava sıcaklığı 5. çapraz bağlama yoğunluğuna bağlıdır (He ve ark,1999) Ters Miseller Yöntemi Ters miseller, su, yağ ve sürfaktanın termodinamik sıvı karışımlarıdır. Makroskobik olarak, homojen ve izotropiklerdir. Ters miseller damlacıkların boyutu genellikle 1 ile 10 nm arasında değiştiği ve bu damlacıklar tek düze dağılıma sahip olduğu için, etkin madde yüklü nanopartiküllerin ters misellerde hazırlanması oldukça iyi sonuç verdiği gözlenmiştir (Maitra A., 1984). Bu yöntemde, ters miseller oluşturmak için sürfaktan organik bir çözücüde çözülür. Buna, tortulanmayı önlemek için sürekli karıştırma yoluyla sıvı kitozan ve etkin madde çözeltileri eklenir. Sıvı faz, tüm karışımı optik olarak şeffaf mikro emülsiyon fazda tutabilecek şekilde düzenlenmiştir. Daha büyük boyutlu nanopartikül elde etmek için bir miktar su daha eklenir. Bu şeffaf çözeltiye, sabit karıştırma hızında bir çapraz bağlama ajanı eklenir ve çapraz bağlama bir gece süresince karıştırılma sonucu elde edilir. Ters misellerde çözünebilecek maksimum etkin madde miktarı, etkin madde özelliklerine göre değişiklik gösterir ve temiz mikro emülsiyon yarı saydam bir çözeltiye dönüşünceye kadar etkin madde miktarı kademeli olarak arttırılarak belirlenir. Organik çözücü daha sonra şeffaf kuru bir kütle elde etmek için buharlaştırılır. Kurutulan kütle su içinde dağıtılır ve daha sonra uygun bir 32

48 tuzun eklenmesi, sürfaktanın çökelmesini sağlar. Karışım daha sonra santrifüjlenmeye bırakılır. Etkin madde yüklü nanopartikül içeren çözelti dikkatle boşaltılır. Sıvı dispersiyon, hızlı bir şekilde 1 saat süresince diyaliz membrandan filtre edilir ve tozun kurutulması için sıvı liyofilize edilir (Maitra A., 1984) Elek Yöntemi Agnihotri ve Aminabhavi, (2004) basit ancak yeni bir kitozan mikropartikül oluşturma yöntemi geliştirmiştir. Bu yöntemde, mikropartiküller, çapraz bağlanan kitozanın, yapışmayan bir hidrojel elde edilmek üzere, elekten geçirilmesi suretiyle hazırlanır. Uygun miktardaki kitozan, glutaraldehit eklenmesiyle kalın bir jölemsi kütle elde etmek için, %4 asidik asit çözeltisinde çözünmektedir. Yapışmayan çapraz bağlı kütle, istenen mikropartikül boyutu elde etmek için uygun bir elekten geçirilir. Mikropartiküller, çapraz bağlanmamış fazla glütaraldehidin uzaklaştırılması için 0,1 N NaOH çözeltisi ile yıkanır ve 40 C de etüvde bir gece süresince kurutulur Kitozan Çözeltisi ile Kaplama Bu yöntem, önceden oluşturulmuş mikropartiküllerin kitozan ile kaplanması esasına dayanır ( Nishioka ve ark., 1989; Takashi ve ark., 1990; Meshali and Gabr, 1993; Murata, 1996; Vural ve ark., 1994; Hari ve ark., 1996; Takisihima ve ark., 2002) 33

49 1.8. Kitozan mikrokürelerinde etkin madde tutma- yükleme etkinliğini etkileyen faktörler Kitozan mikrokürelerinde etkin madde yükleme etkinliğini etkileyen birçok faktör bulunmaktadır; - etkin maddenin yapısı, - kitozan konsatrasyonu, - etkin madde- polimer oranı, - karıştırma hızı gibi. Genellikle düşük kitozan konsantrasyonu, düşük enkapsülasyon etkinliği göstermektedir (Orienti ve ark., 1996). Bununla birlikte, yüksek konsantrasyonlarda kitozan işlenmesi zor yüksek viskozlukta çözeltiler oluşturmaktadır. Çalışmalarda; yükleme etkinliğinin, kitozan konsantrasyonunda artışla arttığı görülmüştür. Bu durum, konsantrasyondaki artışla kitozan çözeltisinin viskozitesinin artmasının, etkin madde kristallerinin mikroküreden çıkmasını önlemesiyle açıklanabilmektedir. Nishioka ve ark. (1990) tarafından yürütülen bir çalışma, sispilatin içeriğinin, kitozan konsantrasyonunun artmasıyla yükseldiğini ortaya koymuştur. Nishioka ve ark. (1990) daha sonra, taşıyıcı matrise kitin eklenmesinin, etkin madde içeriğinde daha belirgin artış oluşturduğunu kanıtlamıştır. Genta ve ark. (1998), polimer / etkin madde oranı 1:2 a/a ile, tüm kitozan mikrokürelerinde yüksek ketoprofen içeriği elde etmiştir. Yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı kitozan (1:2 a/a) karışımı ile hazırlanan mikroküreler ise polimer/ etkin madde oranından bağımsız olarak yüksek yükleme etkinliği göstermiştir. 34

50 Pavanetto ve ark. (1996), polimerik çözeltideki asetik asit konsantrasyonunun, mikrokürelerin ketoprofen içeriğini etkilediğini ortaya koymuştur. Maksimum etkin madde enkapsülasyon etkinliği, en düşük etkin madde / kitozan oranlarında elde edilmiştir. Singla ve ark. (2001), nifedipin mikrokürelerin hazırlanmasında nifedipinin. kitozan çözeltisine dispersiyonu sırasında sürekli karıştırma yoluyla kitozan çözeltisine dağıtıldığında yükleme etkinliğinin arttığını bildirmiştir. Dhawan ve Singla (2003), etkin madde içeriği artışı ile, yükleme etkinliğinin azaldığını bildirmiştir. Mikrokürelerin yüzeylerindeki pürüzlü yapının, yüklemenin artışıyla arttığını göstermiştir (Miglani, 2002) Kitozan mikrokürelerinde etkin madde yükleme Kitozan mikro/nano partiküllerine etkin madde yüklemesi; partiküllerin hazırlanması sırasında ve partiküller oluştuktan sonra olmak üzere iki yöntemle gerçekleştirilebilir. Bu sistemlerde, etkin madde fiziksel olarak polimerik matriste tutulabildiği gibi yüzeyden de adsorbe olabilmektedir. Yükleme şekli, büyük ölçüde hazırlama yöntemine ve etkin maddenin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olmaktadır. Maksimum etkin madde yüklemenin, etkin maddeyi, partiküllerin oluşumu sırasında eklemekle gerçekleştirilebildiği belirtilmiştir. Etkin madde hazırlama yöntemi ve katkı maddelerin varlığı yükleme şeklini etkileyebilmektedir. Örneğin, sisplatin %99 kadar yüksek kapsülleme etkinliği ile partiküllerin oluşumu sırasında yüklenmiştir (J. Akbuga ve ark., 1999). Suda çözünmeyen etkin maddeler ve asidik ph çözeltisinde çökelebilen etkin maddeler ise partiküller oluştuktan sonra etkin madde çözeltisi ile oluşmuş partikülleri bir arada tutmak suretiyle yüklenebilmektedir. Asidik ph koşullarında çöken diklofenak sodyum yine bu şekilde yüklenmiştir (Kumbar S.G ve ark.,2002). Bu yöntemde, yükleme partiküllerin su içersinde şişme özelliğine bağlıdır. Yüklenen etkin madde oranı artan 35

51 çapraz bağlanmayla artar. Suda çözünmeyen etkin maddeler, çoklu emülsiyon tekniği kullanılarak yüklenebilir. Bu yöntemde, etkin madde uygun bir çözücü içerisinde çözünür ve sonra su içinde yağ (y/s) türü emülsiyon oluşturmak için kitozan çözeltisi içerisinde emülsiyon haline getirilir. Bazen etkin madde, bekletmenin sağlanması için bir sürfaktan kullanılarak kitozan çözeltisi içerisinde dağıtılabilir. Buna göre, hazırlanan y/s emülsiyonu veya süspansiyonu, y/s/y çoklu emülsiyonu elde edebilmek için sıvı parafin içerisinde emülsiyon haline getirilebilir. Ortaya çıkan damlacıklar, uygun bir çapraz bağlama ajanı kullanarak sertleştirilebilir. Hejazi ve Amiji (2002), iyonik çapraz bağlama ve sodyum sülfat ile çökeltme yoluyla kitozan mikroküreleri hazırlamıştır. Etkin madde yükleme için iki farklı yöntem kullanılmıştır. İlk yöntemde, eşzamanlı çapraz bağlama ve çökeltmeden önce, tetrasiklin kitozan çözeltisiyle karıştırılmıştır. İkinci yöntemde, etkin madde 48 saat süresince önceden oluşturulmuş mikrokürelerle bekletilmiştir. Etkin madde, çapraz bağlama ve çökeltme öncesinde polimer çözeltisine eklendiğinde, sadece %8 i (a/a) yükleme elde edilmiştir. Öte yandan, etkin maddenin önceden oluşturulmuş mikrokürelerle uzun süre temasında, maksimum %69 (a/a) yüklenebilmiştir. Bu durum, etkin maddenin ikinci yöntem kullanılarak çok daha yüksek düzeyde kitozan mikrokürelerine adsorbe olduğunu göstermektedir. Jameela ve ark. (1994) tarafından yürütülen bir araştırma, organik çözücülere, ph ve ısıya aşırı duyarlı biyolojik makromoleküllerin (bovin serum albumin ve toksoid) pasif bir adsorbsiyon tekniğiyle biyopolimerik matrislere yüklenebildiğini ve böylece biyolojik bütünlüklerinin korunduğunu ortaya çıkarmıştır. Etkin maddelerin bu tür matrislere, şişme davranışı nedeniyle adsorbe edildiği gözlenmiştir. Buna ek olarak, ilk aşamada etkin madde tam olarak salınmamıştır. 36

52 1.10. Polimer Matrislerden Etkin Madde Salım Mekanizmaları Hazırlanan formüllerin uygun çözünme hızı yöntemleriyle test edilmesi sonucunda elde edilen veriler çeşitli kinetiklere uygunlukları yönünden incelenmektedir. Elde edilen kinetik parametreler formüllerin birbirleri ile karşılaştırılmaları ve davranışlarının açıklanabilmesi için kullanılmaktadır. Burada etkin madde çıkışını değerlendirmek amacıyla, dozaj formu, kullanılan polimerler, hazırlama tekniği, etkin madde özellikleri v.b. göz önünde bulundurarak kullanılacak uygun kinetik modelleri bulmak önemlidir. Matris tipi preparatlardan etkin madde salımı genellikle difuzyon mekanizması ile olmaktadır. Fick kuralları ile açıklanan difüzyon olayında esas, etkin madde partiküllerinin çok yoğun ortamdan az yoğun ortama geçişidir. İki taraf arasındaki konsantrasyon farkı sıfır olunca difuzyon işlemi tamamlanmış olmaktadır. Fick'e göre maddenin difüze olma hızı 1.1 no' lu denklemle ifade edilmiştir. Bu eşitlik Fick'in difuzyon ile ilgili 1. kuralı olarak bilinmektedir (Robinson ve Lee, 1987). dq/dt= - D A dc/dx (Denklem 1.1.) Denklemde; dq/dt: Etkin maddenin difüze olma hızı (mg/s) D : Etkin maddenin difüzyon katsayısı (cm 2 /s) A : Etkin maddenin difüze olduğu yüzeyin kesit alanı (cm 2 ) dc/dx:etkin maddenin difüze olduğu kalınlığa göre konsantrasyon farkı (mg/cm 2 ) Denklemdeki eksi işareti konsantrasyonun zamanla azalmasını ifade etmektedir. Denklemde D ile gösterilen difuzyon katsayısı Stokes- Einstein eşitliği ile belirlenmektedir. 37

53 D= RT/6πηN (Denklem1.2.) Denklemde; D : Difüzyon katsayısı(cm2/s) N : Avagadro sayısı ( 60,2 x ) r : Difüze olan partikülün yarıçapı (cm) T : Mutlak sıcaklık (K o ) η : Ortamın viskozluğu (cps) R : Molar gaz sabiti (1,987 cal.mol -1.derece -1 ) Denklemde görüldüğü gibi difüzyon katsayısı, maddenin partikül büyüklüğü ve ortamın viskozluğu ile ters, sıcaklık ile doğru orantılıdır. Herhangi bir t anında difüze olan madde miktarını bulmak için Fick 1 denkleminin integrali alınırsa aşağdaki 1.3. no' lu denklem elde edilir. Q= D/XA(C 1 -C 2 )t (Denklem1.3) Denklemde; Q : Birim yüzeyden difüze olan yığılmalı etkin madde miktarı (mg/cm 2 ) C 1 : Etkin maddenin difüzyona başladığı yerdeki konsantrasyonu (mg/ml) C 2 : Etkin maddenin çözünme ortamındaki konsantrasyonu (mg/ml) X : Etkin maddenin kat ettiği uzaklık (cm) D : Etkin maddenin difüzyon katsayısı (cm 2 /s) A : Difüzyonun oluştuğu kesitin yüzey alanı (cm 2 ) 38

54 Biodegradabl polimerlerle kontrollü salım sağlamak amacıyla hazırlanmış mikropartiküler sistemlerden etkin maddenin açığa çıkışının açıklanabilmesi için değişik kinetiklere uyumlar incelenmiş ve çıkışın tek bir modelle açıklanamayacağı belirtilmiştir. Ancak hazırlanan sistemlerde amaç sıfır derece kinetik ile etkin madde salımının sağlanması olup, bu kinetik 1.4. no'lu denklemde verilmektedir. (Martin ve ark.,1993, Bölüm: 12). C= Co - k r o t (Denklem 1.4) Denklemde; Co : Başlangıçtaki etkin madde miktarı (mg) C : t anında çözünmeden kalan etkin madde miktarı (mg) k r o t : Sıfır derece salım hız sabiti : zaman (sa) o Yukardaki denklemde yer alan k r çözünme hız sabiti olup çözünmeden kalan etkin maddenin zamana karşı grafiğe geçirilmesi ile elde edilen doğrunun eğimine eşittir. Birim zamanda açığa çıkan madde miktarı ortamdaki madde konsantrasyonundan bağımsızdır ve etkin madde çıkışı sabit hızdadır. Bazı durumlarda ise etkin maddenin çıkış hızı ortamdaki madde miktarı ile orantılıdır. Bu durumda geçerli olan birinci derece kinetiğe göre; lnc= lnco-k 1 t (Denklem 1.5) Denklemde; Co : Başlangıçtaki etkin madde miktarı (mg) C : t anında çözünmeden kalan etkin madde miktarı (mg) k 1 : Birinci derece salım hız sabiti t : zaman (sa) 39

55 Biyoparçalanabilen polimerlerden etkin madde salımında çıkışın Higuchi tarafından ortaya konulmuş olan homojen ve heterojen matrislerden çıkışı açıklayan kinetiklere de uyumu söz konusu olabilmektedir. Düz yüzeyden tek yönlü çıkışın söz konusu olduğu homojen matriste etkin madde matris içinde çözünüp temasta bulunduğu çözünme ortamına basit difüzyon ile geçiş yapmaktadır. Homojen matris için 1.6. no' lu denklem verilmiştir. Q= (D.t(2A-C s )C s ) ( Denklem 1.6) Denklemde; Q : Birim yüzeyden t zamanında salınan etkin madde miktarı (mg/cm 2 ) D : Homojen matris ortamındaki etkin maddenin difüzyon katsayısı(cm 2 /s) A : Matriste birim hacimdeki etkin madde miktarı (mg/ml) C s : Etkin maddenin matris içindeki çözünürlüğü (mg/ml) Heterojen matriste (Denklem 1.7.) ise matris içinde çözünen etkin madde, matris yapısındaki porları dolduran ortam sıvısından basit difüzyon ile salınmaktadır. Bu durumda sırasıyla matrisin porozitesi ve kapiller sistemin bükümlülük katsayısı olan ε ve τ değerlerini de hesaba katmak gerekmektedir. Q= D.ε/τ.(2A-ε.C s )C s.t (Denklem 1.7) Denklemde; Q : Birim yüzeyden t zamanında salınan etkin madde miktarı (mg/cm 2 ) D : Etkin maddenin ortam sıvısındaki difüzyon katsayısı(cm 2 /s) ε : Matrisin porozitesi (%) C s : Etkin maddenin matris içindeki çözünürlüğü (mg/ml) τ : Kapiller sistemin bükümlülük katsayısı (tortuosity) 40

56 A : Matriste birim hacimdeki etkin madde miktarı (mg/ml) Denklemlerden de görüldüğü gibi düzlemsel yüzeyden herhangi bir t anında salınan etkin madde miktarı zamanın karekökü ile orantılıdır (Higuchi, 1963). Kontrollü salım sistemlerinde preparatın şekline bağlı olarak Hopfenberg kinetiğine de uyum görülmektedir. Bu kinetikte, elde edilen verilerin tabaka, silindir ve küresel matris denklemlerine uygunlukları araştırılmıştır (Park ve ark.,1990, ). Mt /M =1-[1-k 0 t /C 0 a ] n (Denklem 1.8) Kullandığımız sistemlerden tabaka için n= 1 alındığında denklem; Mt /M = k 0 t / C 0 a (Denklem 1.9) Silindir için n= 2 alındığında denklem; (1-Mt /M ) 1/2 = 1-k 0 t / C 0 a (Denklem 1.10) Küre için ise n= 3 alındığında denklem; (1-Mt /M ) 1/3 = 1-k 0 t / C 0 a (Denklem 1.11) şeklindedir. Bu denklemlerde; 41

57 Mt : t anında çıkan etkin madde miktarı (mg) M : Toplam etkin madde miktarı (mg) Co : Başlangıç anındaki etkin madde konsantrasyonu (mg/ml) a : Düzlemin yarıkalınlığı, silindir ve kürenin yarıçapı k : Salım hız sabiti n : Şekil faktörü Etkin maddenin açığa çıkışının difiizyonla ve/veya polimerde meydana gelen gevşeme ile oluşunu açıklamak üzere Peppas ve ark. tarafından geliştirilen denklem sıkça kullanılmaktadır (Peppas ve ark., 1980). Mt / M = k t n (Denklem 1.12) Denklem 1. 12' nin logaritmik formu şu şekildedir. log Mt/ M = log k + n log t (Denklem 1.13) Denklemde; Mt M k n : t anında çıkan etkin madde miktarı (mg) : Toplam etkin madde miktarı (mg) : Salım yapan sistemin yapısal ve geometrik özelliklerini birleştiren bir sabit : Difüzyonal sabiti Denklem 1.13., etkin madde salımının % 60' lık ilk fraksiyonu (Mt / M 0.60) için ve sink koşul altında geçerlidir. Şişebilen sistemlere bu denklemin uygulanabilmesi için diğer bir şart ise sistemin orijinal hacminin %25' inden fazla şişmemesi, ya da denge oranının 1,33' den yüksek olmamasıdır. 42

58 Etkin madde salımı difüzyonun yanı sıra polimerik yapının gevşemesi ve degredasyonu ile gerçekleşiyorsa denklem aşağıdaki şekilde kullanılmaktadır. Mt / M =k 1 t 0,5 + k 2 t (Denklem 1.14) Burada etkin madde çıkışını kontrol eden iki mekanizma vardır. Bunlardan ilki olan difüzyonla çıkışın (Fickian diffision) (k 1 ) olduğu durumlarda, ki bu durum genellikle salımın ilk başlarında görülür, salım zamanın karekökü ile doğru orantılıdır. İkinci mekanizma ise polimerin gevşeme aşamasıdır (k 2 ) ve burada etkin maddenin difüzyonu hızlıdır ve sıfır dereceden çıkış vardır. Denklemde yer alan k 1 ve k 2 değerlerine bakılarak difüzyon-gevşeme mekanizmalarından hangisinin etkin olduğu saptanmaktadır no' lu denklem kalın membran tarzındaki preparatlara uygulandığından n değeri 0,5-1 arasında değişmektedir. n=o,5' te difüzyonla çıkış (case 1), n=1 olduğunda ise sıfır dereceden çıkış (case 2) söz konusudur. Teste tabi tutulan preparat küresel bir yapıya sahip olduğu zaman ise n=o,43' de difüzyonla, n=o,55 olduğunda ise sıfır dereceden çıkış olduğu belirtilmektedir. Formülde şişebilen polimerik yapıların bulunmasının etkin madde çıkışını sıfır dereceye yaklaştırdığı belirtilmektedir. 'n' için belirtilen bu değerler arasında bir değerin bulunması ise anomali olarak değerlendirilmekte olup bu noktada difüzyon ve polimerik gevşemenin bir arada olduğu ayrıca istatistiksel analiz problemlerinin olmasından bahsedilmektedir (Ritger ve Peppas, 1987a, Ritger ve Peppas, 1987b). Çözünme hızı verilerini doğrusallaştırmada sıkça kullanılan RRSBW kinetiğinin genel formülü ise denklem 1.15' de gösterilmiştir. 43

59 ψ (τ) =1-exp {-(τ-τ d )β} (Denklem 1.15) Denklemde; ψ : Çözünen etkin madde yüzdesi τ β τ d : Zaman (dk) : Şekil faktörü : etkin maddenin %63,2' sinin çözünmesi için geçen süre (dk). Elde edilen çözünme hızı verilerinin doğrusallaştırılması yukarıdaki bu denklemin logaritması alınarak elde edilen denklem kullanılmaktadır Kitozan mikrokürelerden etkin madde salımı ve salım kinetikleri Kitozan- bazlı partiküler sistemlerinden etkin madde salımı, çapraz bağlama yoğunluğu, partiküler sistemin morfolojisi, boyutu ve yoğunluğu etkin madde fizikokimyasal özelliklerinin yanında, yardımcı maddelerin varlığına ve çözünme ortamı özelliklerine bağlıdır. Kitozan partikül sistemlerinden etkin madde salımı, üç farklı mekanizma içerir: a) partiküllerin yüzeyinden salım, b) şişmiş kauçuğumsu matristen salım (difüzyonla), c) polimer erozyonuna bağlı salım. 44

60 Mikropartikül Yüzeyden salım Erozyonla salım Şişmiş matristen difüzyonla salım Şekil.1.4. Etkin madde salım mekanizmaları Bu mekanizmalar Şekil 1.4 te şematik olarak verilmiştir. Çoğu durumda etkin madde salımı birden fazla mekanizma ile olmaktadır. Yüzeyden salım durumunda, adsorbe edilen etkin madde, salım ortamıyla temasa geçtiği anda birden çözülür. Bu tür etkin madde salımı, burst effect dediğimiz patlama etkisine yol açar. He ve ark.(1999) simeditin-yüklü kitozan mikrokürelerinin çözünmenin ilk aşamalarında patlama etkisi gösterdiğini gözlemlemiştir. Bu çalışmada püskürterek kurutma yöntemiyle hazırlanan partiküllerin büyük bir kısmında etkin madde, birkaç dakika içerisinde salınmış; çapraz bağlama yoğunluğunun arttırılması ve mikropartiküllerin uygun bir çözücü ile yıkanması suretiyle burst effect etkisinin engellendiği görülmüştür. 45

61 Difüzyon ile etkin madde salımı, üç aşamadan oluşmaktadır. Bunlardan birincisinde, su, matrisin şişmesine neden olacak biçimde partikül sisteme girer; ikincisinde, camsı polimerin kauçuğumsu matrise dönüştürülmesi gerçekleşirken, üçüncü adımda şişmiş kauçuğumsu matristen etkin madde salımı görülür. Buna göre, salım yavaş bir şekilde başlar ve sonra hız kazanır. Bu tür salım hidrojeller için daha önemlidir. Al-Helw ve ark., (1998) hazırlanan formülasyonların tümünde etkin maddenin ilk başta yüksek salım gösterdiğini bildirmiştir. Çalışmada etkin maddenin yaklaşık olarak %20-30 u ilk bir saatte salınmış olup salım, kitozanın moleküler ağırlığına ve mikrokürelerin partikül boyutuna bağlı olmuştur. Yüksek moleküler ağırlıklı kitozandan elde edilen mikrokürelerden salım oranı, orta ve düşük moleküler ağırlığa sahip kitozandan elde edilene göre daha yavaştır. Bu durum, hem yüksek moleküler ağırlığa sahip kitozanın düşük çözünürlüğüne hem de çözünme ortamıyla temas eden etkin madde partikülleri üzerinde oluşan jel katmanın yüksek vizkozitesine bağlanabilmektedir. İlk 3 saatteki µm aralığında boyuta sahip mikrokürelerden salım, hızlı olmuştur (%75-95), ancak µm aralığında boyuta sahip partiküller için etkin madde salımı 5 saatte %56-90 arasında olmuştur. Bunun nedeni partikül boyutlarının küçük olmasının çözünme için daha geniş yüzey alanı oluşturmasıdır, böylece küçük mikroküreler büyük mikrokürelere kıyasla daha hızlı salım göstermiştir. Kweon ve Kang (1999), prednisolonun çeşitli koşullarda salımı üzerinde çalışmak amacıyla, kitozan-g-poli (vinil alkol) matrisi hazırlamıştır. Etkin madde salımı ile zamanın kare kökü arasındaki ilişki, difüzyon-kontrollü salımı gösterecek biçimde lineer olmuştur. Etkin madde salımı, PVA miktarı, ısı uygulaması veya çapraz bağlama yoğunluğu ile kontrol edilmiş, ancak sadece kitozanla karşılaştırıldığında ph den daha az etkilenmiştir Ganza-Gonzalez ve ark.(1999), Higuchi denklemini kullanarak etkin madde salım verilerini incelemiştir. Elde edilen veriler; küreden değil, düz bir yüzeyden difüzyonla çözünen maddenin salımını tanımlamış Q t kinetiğine uyum sağlamıştır. 46

62 Difüzyon kontrollü matris sisteminin en çok kullanılan denklemi, Ritger ve Peppas tarafından kullanılan ve etkin maddenin %60 lık miktarının çıkışına dek geçerli olan bir denklemdir (P.L. Ritger, N.A Peppas; 1987). (Denklem 1.12). Teste tabi tutulan preparat küresel ise n=0,43 difüzyonla, n=0,55 ise sıfır derece çıkışı göstermektedir. Glutareldehit, sülfrik asit ve ısıyla çapraz bağlı kitozan mikrokürelerinden etkin madde salımı, 0,47 ile 0,61 aralığında değişen farklı n değerleri göstermiştir. n değerleri, farklı çapraz bağlı formülasyonlarda artan etkin madde yüklenmesiyle artış göstermiştir (Kumbar S.G, 2002). Jameela ve ark., (1998) salınan kümülatif etkin madde ile zamanın karekökü arasında iyi bir korelasyon uyumu elde etmiş ve bu da, mikroküre matrisinden salımın difüzyon kontrollü olduğunu ve Higuchi denklemine uyduğunu göstermiştir. Salım oranının, mikrokürelerin boyutuna bağlı olduğu gösterilmiştir. Daha küçük boyutlu mikrokürelerden salım, büyük boyutlu olanlara göre daha hızlı olmuştur, bunun nedeni etkin madde için daha kısa dağılım yolu ve küçük partiküllerin çözünme ortamıyla temas alanının daha geniş olmasıdır. Kullanılan polimerin şişebilen yapıya sahip olması nedeniyle şişme kontrollü salım mekanizmasıyla da etkin madde salımı söz konusu olabilmektedir. Burada camsı polimer ortam sıvısıyla şişmekte etkin madde şişen polimerden yine difüzyon mekanizması ile açığa çıkmaktadır. Salımda hız saptayan aşama tayin edilmelidir. Bu sistemlerden difüzyon mekanizması yanında salımı sıfır dereceye yaklaştıran erozyon mekanizmasıyla etkin madde çıkışı, difüzyonla etkin madde açığa çıkışının daha ileri aşamalarında söz konusu olabilmektedir ve 1.13 no lu denklem geçerli olmaktadır. 47

63 Kitozanla yapılmış çalışmalarda etkin madde çıkışlarında difüzyon kinetiğinin baskın olduğu belirtilmiştir. Ancak etkin madde açığa çıkışlarının başlangıçtaki hızlı difüzyonun aksine zamanla yavaşladığı ancak yine de erozyonla çıkışın saptanamadığı belirtilmektedir. Orienti ve ark.(1996) matris erozyonu ile indometazin yüklü kitozan mikrokürelerinin salım kinetiği arasındaki korelasyonu incelemiştir. Salım kinetikleriyle, mikroküredeki kitozan konsantrasyonu ve salım ortamının ph ı arasında bağlantı kurulmuştur. ph 7,4 de yüksek kitozan konsantrasyonlarında difüzyondan sıfır derece kinetiklerine doğru sapmalar görülmüştür Etkin maddelerin kitozan mikrokürelerinden salım karakterlerini etkileyen parametreler Etkin maddenin kitozan mikrokürelerinden salım karakteristiklerini etkileyen birçok faktör vardır; bunlar arasında, kitozan konsantrasyonu ve moleküler ağırlığı, çapraz bağlama ajanının türü ve konsantrasyonu, karıştırma hızı, yağ tipi, katkılar, kullanılan çapraz bağlama işlemi, etkin madde / kitozan oranı sayılabilir. Birçok araştırmacı, kitozan mikrokürelerinden etkin madde salımı konusunda farklı modeller önermiştir. Açıkgöz ve ark. (1996) kitozan mikrokürelerinden diklofenak sodyum salımında en uygun çalışmanın Higuchi denklemi ile elde edildiğini bildirmiştir. Sezer ve Akbuğa (1995) ise, kitozan mikrokürelerinden piroksikam salım verilerinin non-fickian ve süper durum II tipi olduğunu gözlemiştir. 48

64 Kitozanın moleküler ağırlığının etkisi Kitozan mikrokürelerinden etkin madde salım çalışmaları genellikle etkin madde salımının, kitozanın molekül ağırlığındaki artışla azaldığını göstermiştir. Shraishi ve ark. nın çalışmalarında (1993), kitozan hidroksilat moleküler ağırlığının artmasıyla, indometazinin salım oranının azaldığı görülmüştür. Benzer sonuçlar, asetile kitozan mikrokürelerinden oksitetrasiklin salımları araştırıldığında elde edilmiştir. Salımın, kitozanın moleküler ağırlığının artmasıyla azaldığı gözlenmiştir (Mi ve ark., 1997). Benzer şekilde, Al-Helw ve ark. (1998) çapraz bağlı kitozanlardan fenobarbiton salımının, orta ve düşük moleküler ağırlığa sahip kitozanlarla karşılaştırıldığında yüksek moleküler ağırlığa sahip olanlardan daha yavaş gerçekleştiğini bildirmiştir. Diğer bir çalışmada Polk ve ark. (1994), kitozan moleküler ağırlığının, kitozan mikrokürelerinden albumin salımında temel değişken olduğunu bildirmiştir. Kitozanın moleküler ağırlığı 1,25 x 10 6 ile 0,25 x 10 6 arasında değişkenlik göstermektedir. Moleküler ağırlığın azaltılması, albumin salımını arttırmıştır (yüksek moleküler ağırlıklı kitozandan 4 saate %37 salım gerçekleşirken, düşük moleküler ağırlıklı kitozandan %77 salım gerçekleşmiştir). Bununla birlikte, Genta ve ark. (1998) kitozan mikroküreleriniden en hızlı ketoprofen çözünme profilinin, orta moleküler ağırlığa sahip kitozanlardan elde edildiğini bildirmiştir. Bunun sebebi, kitozan mikrokürelerinin şişme davranışına bağlanmıştır. Kitozanın moleküler ağırlığının arttırılması, etkin madde dağılımını ve aynı zamanda mikrokürelerin erozyonunu etkileyen jel tabakanın viskozitesinin artmasına yol açmıştır. 49

65 Kitozan konsantrasyonunun etkisi Nishioka ve ark. (1990), sisplatin salım oranının, kitozan konsantrasyonunun arttırılmasıyla azaldığını bildirmiştir. Aiedeh ve ark. (1997), su/yağ sisteminde yüzeyler arası çapraz bağlama yöntemiyle elde edilen askorbil palmitat ile kitozan mikrokapsüllerden, sıfır derece kinetiğe uygun salım elde edilirken hazırlama çözeltisinde kitozan içeriğinin azaltılmasıyla salım hızı artış göstermiştir Mikrokürelerde etkin madde içeriğinin etkisi Etkin madde salımı etkisi üzerinde yapılan pek çok çalışma, mikrokürelerden etkin madde salımının, mikrokürelerdeki etkin madde içeriğinin artmasıyla arttığını göstermiştir (Bayomi ve ark., 1998). Bununla birlikte, bunun tam tersi sonuçlar da bildirilmiştir. Akbuğa ve Durmaz (1994), kitozan mikrokürelerinden furosemid salımının, Higuchi matris modelini takip ettiğini bildirmiştir. Furosemid miktarı arttıkça, furosemid salımı da artmıştır. Bodmeier ve ark. (1989a) sülfadiazin (suda çözünmez bir etkin madde) salımının mikrokürelerde etkin madde içeriğinin artışıyla azaldığını bildirmiştir Mikrokürelerdeki etkin maddelerin fiziksel durumu Bir dozaj formundan etkin madde salım kinetiklerinin araştırılmasında, etkin maddenin fiziksel durumu da önem taşımaktadır. Etkin maddenin fiziksel durumu, moleküler dağılımdan kristal yapısına kadar değişiklik gösterebilir. He ve ark. nın (1999a) yaptığı çalışmada; simetidin ve famotidinin mikrokürelerde katı bir çözelti halinde moleküler olarak dağıldığını gözlemiştir. Bu duruma göre, etkin madde salımı patlama etkisi nedeniyle hızlı bulunmuştur. 50

66 Çapraz bağlama yoğunluğunun etkisi Çapraz bağlama yoğunluğu, mikrokürelerden etkin madde salımı üzerinde önemli etkiye sahiptir. Jameela ve ark. (1998), düşük düzeyde çapraz bağlı mikrokürelerden salım %70 düzeyinde iken, yüksek düzeyde çapraz bağlı mikrokürelerin, 40 günde sadece %35 progesteron saldığını ortaya koymuştur. Kitozan mikrokürelerinden mitoksantron salımı, çapraz bağlama miktarıyla kontrol edilmiştir. Çapraz bağlanma, glutaraldehide doymuş toluen kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Jameela ve Jayakrishnan, 1995). Yüksek düzeyde çapraz bağlı mikrokürelerden, etkin maddenin sadece %25 i 36 günde salınmıştır. Shu ve Zhu (2002a), modifiye bir kitozan çapraz bağlama yöntemi geliştirmiştir; düşük ısıda koyulaştırılan kitozan/ jelatin mikroküreleri, anyonlarla (sülfat, sitrat ve tripolifosfat) ve önceden hazırlanmış kitozan mikroküreleriyle çapraz bağlanmıştır. Sülfat ve sitrat ile çapraz bağlanan kitozan mikroküreleri deneysel gastrik sıvıda şişmiş ve böylece model etkin madde (riboflavin) 5 saatte salınmıştır. İntestinal sıvıda ise mikroküreler büzülme göstermiş ve etkin madde salımı yavaş olmuştur (salım yüzdesi, 24 saatte %70 den azdır). Bununla birlikte, tripolifosfat / kitozan mikrokürelerinin şişmesi ve etkin madde salımı, genellikle ortam ph sine karşı hassasiyet göstermemiştir. Tripolifosfat ve sitrat (veya sülfat) karışımı ile çapraz bağlanan kitozan mikroküreleri ise sadece iyi şekle sahip olmakla kalmayıp aynı zamanda gelişmiş ph-hassas salım özellikleri göstermiştir. Bu sonuçlar, iyonik olarak çapraz bağlı kitozan mikrokürelerinin, mideye özel etkin madde salımında faydalı olabileceğini göstermektedir. Ko ve ark. (2002), iyonik çapraz bağlama yoluyla tripolifosfat (TPP) ile, felodipin yüklü kitozan mikropartikülleri hazırlamıştır. TPP çözeltisinin ph ının azaldığı ve kitozan moleküler ağırlığının arttığı durumlarda tarayıcı elektron mikroskopisi ile TPP-kitozan mikropartiküllerinin incelenmesi üzerine, 51

67 mikropartiküllerin daha küresel ve düzgün yüzeylere sahip olduğu gözlenmiştir. Düşük ph veya daha yüksek TPP çözeltisi konsantrasyonu ile hazırlanan kitozan mikropartikülleri, daha yavaş felodipin salımı göstermiştir. Moleküler ağırlığın ve kitozan çözelti konsantrasyonunun azaltılmasıyla, etkin madde salımı artmıştır. TPP-kitozan mikropartiküllerinden etkin madde salımı, çapraz bağlama süresi arttıkça azalmıştır. Kumar ve ark.(2002), depo oluşturan etkin madde salım sistemi oluşturmak için, bovin serum albumin ve kitozana curcumin (%79,49 ile 39,66 arası) eklemiştir. Mikroküreler, doğal polimerlerin kimyasal çapraz bağlanmasıyla birleştirilen emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemiyle hazırlanmıştır. Çapraz bağlama ajanı konsantrasyonu, etkin madde salımında önemli etkiye sahip olmuştur. Sistemlerden, tipik patlama etkisinden sonra günlerce süren yavaş salım ile karakterize edilen, çift fazlı etkin madde salım gözlenmiştir Katkıların etkisi Lim ve Wan (1998), çapraz bağlayıcı olarak pentasodyum tripolifostat kullanarak, emülsifikasyon-koaservasyon yöntemiyle kitozan mikroküreleri hazırlamıştır. Bu, yüksek düzeyde kümelenmeye neden olmuştur. Kümelenme, dağılma fazında magnezyum stearat karışımıyla önemli ölçüde azaltılmıştır. Bu etkin madde salımını etkilememiştir. Artan magnezyum stearat içeriği ile, daha büyük kitozan mikroküreleri üretilmiştir. Bogataj ve ark. (2000), pipemidik asit ile yaptıkları çalışmada kullanılan magnezyum stearat miktarı arttırıldığında mikrokürelerde daha yüksek etkin madde içeriğinin gözlendiğini bildirmiştir. Çalışma ayrıca, ortalama partikül boyutunun, artan magnezyum stearat miktarı ile azaldığını göstermiştir. magnezyum stearat konsantrasyonu partikül boyutu ve etkin maddenin çözünme miktarını önemli ölçüde etkilemiştir. 52

68 Lim ve ark. (1997), kitozan mikrokürelerini emülsifikasyon iyonotropik jelasyon ile oluşturulduğunda, Span 85 konsantrasyonunun mikrokürelerin yüzeyinde belirgin bir etkiye sahip olduğunu bildirmiştir. Yüksek Span 85 konsantrasyonunda, mikrokürelerin yüzeyi çökmüştür. Aynı etki, Singla ve ark. (2001) tarafından da bildirilmiştir Mikrokürelerin hazırlanması sırasında kitin eklenmesi, emülsiyon çapraz bağlama tekniği ile hazırlanan sisplatin yüklü kitozan mikrokürelerinde patlama etkisi göstermiştir (Wang ve ark., 1996a) Kitozanın Yapısı Özelliklerini değiştirebilmek amacıyla kitozanın yapısında kimyasal değişiklikler yapılmaya çalışılmıştır. N- Trimetil kitozan klorit (TMC) ile hidrofilik makromoleküllerin geçişinin etkin bir biçimde arttırıldığı kanıtlanmıştır (Thanou ve ark. M., 2000). Çalışmada, polikatyonik bir emilim geliştirici olan TMC ile birlikte uygulandığında kitozan süksinat ve kitozan ftalat sentezlenmiş; kolonspesifik etkin madde salım uygulamaları için de çok uygun matrisler geliştirilmiştir. Hazırlanan matrisler, asidik koşullar altında çözünmeye direnç göstermiştir. Daha iyi etkin madde salımı profilleri vermiştir (Aiedeh K.ve ark., 1999). Kitozanın nötr ph ta düşük çözünürlüğünü gidermek için, N- Trimetil ve N- Trietil oligosakkaritler sentezlenmiştir (Florea ve ark. B.I, 2000). Lee ve ark.(1998) 1-etil- 3- (3-dimetilaminopropil)karbodimit (EDC) kullanılan çift reaksiyon yoluyla 100 anhidroglükoz birimine 5,1 deoksikolik asit grupları içeren hidrofilik olarak değiştirilmiş kitozan sentezlenmiş ve memeli hücrelerde genetik malzeme transferi açısından incelenmiştir. Mikrokristalin kitozan, jel oluşturma eksipiyanı olarak incelenmiştir. Sakinken ve ark., (2002) yeni bir kitozan türevini hazırlamış ve karakterize 53

69 etmiştir: metil prolidon kitozan. Bu kovalent bağla polisakkarite bağlı prolidonun gruplarını gelişigüzel olarak taşımaktadır. Bu kitozan türevi, özellikle lizozomun hidrolitik (Muzzarelli ve ark. R. A.A, 1988) hareketine karşı hassas olacak şekilde, kitozanın biyouyumluluğunu ve prolidonun hidrofilik karekteristiklerini birleştirmektedir. Zhang ve ark.(2004), yaptıkları çalışmada galaktoz gruplarını kitozanın amin gruplarıyla birleştirerek yani fiziksel çökelme ve koaservasyon yöntemlerini sırasıyla uygulayarak galaktozilat kitozan mikroküreleri sentezlemişlerdir. Bu reaksiyonda kitozanın amino gruplarında açil reaksiyonu olmasına karşın galaktozilat değişimi %20 olmuştur. Oluşan ürünün kristalleşme, çözünürlük, stabilite ve diğer fiziksel özellikleri kitozandan farklı olmuştur. Galaktozilat kitozan mikroküreleri sırasıyla 0,54 ile 1,05 µm aralığında ortalama çapa ve +15 ile +17mV arasında ortalama zeta potansiyeline sahip küresel mikrokürelerdir; pasif ve aktif peptik hedefleme için kullanılacağı ileri sürülmüştür Sterilizasyon Mikroorganizmaların vejetatif şekillerinin, fiziksel veya kimyasal yöntemlerle öldürülme işlemidir. Steril kullanım gerektiren preparatlar için iki yol kullanılır: Aseptik uygulama Terminal uygulama Terminal sterilizasyonda preparatlar ambalaj içinde sterilize edilir, işlem kolaylığı sağlar, ekonomiktir. Daha çok tercih edilir. Eğer biyoaktif maddeler terminal sterilizasyondan etkilenirse alternatif yöntem olarak aseptik uygulama seçilir. 54

70 Farmasötik preparatların sterilizasyonu için dört yöntem bulunmaktadır. A- Isı ile Strelizasyon : Otoklavda sterilizasyon Tindalizasyon Kuru hava ile sterilizasyon B- Filtrasyonla Sterilizasyon C- Gazlarla Sterilizasyon D- Radyasyonla Sterilizasyon Bu yöntemlerden biri seçilmeden önce formülasyon üzerindeki etkileri iyi düşünülmelidir. Isıyla sterilizasyon ısıya duyarlı etkin madde içeren formülasyonlarda etkin maddenin bozunmasına veya yüksek ısı ve basınçtan dolayı polimer yapısının bozunmasına neden olur. Gaz strelizasyonunda ise propilen oksit, etilen oksit gibi gazlara ait kalıntıların toksik etkili olmaları problem yaratmaktadır. Parenteral kullanım için üretilen mikropartiküler sistemlerin sterilizasyonu için γ radyasyon sterilizasyonu önerilir ancak bu yöntemde biyoparçalanabilen polimerlerin kullanıldığı sistemlerde gamma ışınlarına maruz kalan polimerde zincir kırılması ve çapraz bağlanma gibi kimyasal değişimlere uğramasına neden olan bu durum degredasyonu etkiler, degredasyon hızında meydana gelen artış ise salım hızında artışa neden olur. Polimerde sterilizasyon için γ ışını dozu 2,5 Mrad dır. 55

71 1.13. Etkin Madde Çalışmamızda model olarak, metilprednisolon (11β, 17, 21 trihidroksi-6αmetilpregna-1, 4 diene- 3, 20- dione) seçilmiştir. Açık formülü aşağıda gösterilmiştir. (USP-29, 2006; EP 5.0, 2005; Merck Index, 2001; Remington, 2000; Martindale, 2002) Şekil 1.5. Metilprednisolonun açık formülü Fizikokimyasal Özellikleri Molekül ağırlığı 374,48 olup kokusuz, beyaz renkte ve toz halinde bir maddedir. Metilprednisolon, 1gr ı ml suda 100mL alkolde, 800 ml kloroformda veya 800 ml eterde çözünür. (USP-29, 2006; EP 5.0, 2005; Merck Index, 2001; Remington: The Science and Practise of Pharmacy, 2000; Martindale, 2002). 56

72 Farmakolojik Özellikler Farmakodinamik Özellikler Metilprednisolon kortikosteroidlerin bütün özelliklerini içeren florsuz bir sentetik glükokortikoidtir. Metilprednisolon diğer kortikosteroidler gibi belirli dokulardaki hücrelerin protein sentezini kontrol altında tutar. Metilprednisolon anti-allerjik, antienflamatuar, anti-ödematöz ve anti-şok etkilidir; immün sistemi baskı altında tutar. Metilprednisolon dokuların enflamasyona karşı reaksiyonunu kontrol altına alarak enflamasyon sahasına makrofaj ve lökosit göçünü azaltır, kollajen dokudaki fibroblast proliferasyonunu, aktivitesini ve sayısını azaltır. Hücre ve organel membranları stabilize eder ve akut enflamasyon sonucu açığa çıkan histamin ve kinin'in yol açtığı kapiler geçirgenliğin artmasını önler. Lizozomal membranları stabilize ederek hidrolitik enzimlerin salgılanmasını önler ve lizozomların yıkılmadan korunmasını sağlar. Metilprednisolon iltihablı dokulardaki timus-bağımlı T -lenfosit, monosit ve eozinofil konsantrasyonlarını azaltır. Aynı zamanda imminoglobulinin hücre duvar reseptörlerine bağlanmasını inhibe ederek interlökin sentezini ve salınmasını engeller. Metilprednisolon hücre zarından intraselüler kompartımana yayılarak ve spesifik sitoplazmik reseptörler ile bağlantı sağlayarak bir kompleks oluşturur. Bu kompleks hücre nükleusu içine girerek DNA'a bağlanır ve messenger RNA (m-rna) transkripsiyonu ile çeşitli enzimlerin protein sentezlerini inhibe eder. Bununla beraber, kortikosteroidler bazı hücrelerin m-rna transkripsiyonunu engeller (örneğin lenfositler). Metilprednisolon'un glukokortikoid etkisi (antiinflamatuar etki steroidal etki), dokuların enflamatuar reaksiyona cevabını azaltma ya da önleme şeklindedir. 57

73 Böylece, altta yatan nedeni etkilemeden enflamasyon semptomlarının meydana gelmesini önler. Glukokortikoidler enflamasyon bölgelerinde, makrofaj ve lökositleri içeren enflamatuar hücrelerin artışını engeller. Bu ajanlar aynı zamanda fagositozu, lizozomal enzim salınmasını ve enflamasyonunun çeşitli kimyasal aracılarının sentez ve/veya salınmasını da önler. Kesin mekanizmalar tam olarak bilinmemekle beraber, bu etkilere önemli katkıları bulunabilecek olayları Makrofaj Inhibitör Faktör (MIF) etkisinin blokajı ve bunun da makrofaj lokalizasyonunun inhibisyonuna yol açması; enflamasyonlu kapillerlerin dilatasyon ve permeabilitesinin azalması ve lökositlerin kapiller endoteryuma adherasansının düşmesi ve bunların da lökosit migrasyonu ve ödem formasyonunun inhibisyonuna yol açması yer almaktadır. Ayrıca, hücre membran fosfolipidlerinden fosfolipaz A2 'nin aracı olduğu araşidonik asit salınmasının bir inhibitörü olan lipomodulin (makrokortin) sentezinin artması ve bunun sonucu, enflamasyonun araşidonik asitten türetilmiş aracıların (prostoglandinler, tromboksanlar ve lökotrinler) sentezlerinin inhibisyonu da ön plana çıkmaktadır. Immünosüpressif etkilerinde bu anti-enflamatuar etkiye anlamlı katkıları bulunabilir. Metilprednisolon'un immünosupressan etki mekanizması tam olarak bilinmemekle beraber, hücrelerin aracı olduğu (aşırı duyarlılığın gecikmesi) immün reaksiyonların bastırılması ya da önlenmesini ve immün cevabı etkileyen daha spesifik etkileri içerebilir. Glukokortikoidler timüse bağımlı lenfositler (T-Ienfositler), monositler ve eozinofillerin konsantrasyonunu azaltır. Bu ajanlar aynı zamanda immünoglobulinin hücre yüzeyi reseptörlere bağlanmasını azaltır ve interlökin sentezini ve/veya salınmasını engeller ve böylece T-Ienfosit blastogenezini yavaşlatır ve primer immün cevabın yayılmasını kısıtlar. Glukokortikoidler aynı zamanda immün kompleksierin bazal membranlardan pasajını düşürür ve kompleman kompanantların ve immünoglobülinlerin konsantrasyonlarını azaltır. Sodyum reabsorbsiyonu, potasyum ve hidrojen itrahı ve bunun sonucu su tutulmasına, mineralokortikoidlerin, sodyum transportunu kolaylaştıran renal distal tübüller üzerindeki etkisi neden olur. Diğer sekretuar hücrelerdeki 58

74 katyon transportu da aynı şekilde etkilenir. Su ve elektrolitlerin kalın bağırsak ile tükürük ve ter bezleri tarafından itrahı da değişir; fakat bu olay daha düşük düzeydedir. Metilprednisolonun mineralokortikoid etkisi yok denilecek derecede azdır (Remington, 2000) Farmakokinetik Özellikler Metilprednisolon oral yoldan alındıktan sonra sindirim kanalından süratle ve tamamen absorbe edilir. Maksimal serum konsantrasyonu ortalama 60 dakika (1-2 saat) içinde oluşmaktadır. Metilprednisolon'un plazma yarılanma süresi ortalama 3,5 saat olup, biyolojik (doku) yarılanma süresi saat arasında değişmektedir. Kortikosteroidler çeşitli dokularda yavaş bir tempo ile metabolize edilir (Martindale, 2002). Bu tempo karaciğer, böbrek, kolon ve parotis de daha hızlıdır. Total vücut kleransı ortalama 33,6 ml/dak/kg ve dağılım hacmi 1,4 L/ kg dır. Metilprednisolon inaktif metabolitler şeklinde idrar ile atılır; safra ve feçes ile atılım önemli miktarda değildir. Metilprednisolon'un proteinlere bağlanma oranı %40-60 arasında değişmektedir Terapötik Endikasyon Romatizmal hastalıklar: romatoid artrit (düşük doz uygulamaları ile jüvenil romatizmal artrit dahil ), psöriatrik artrit, ankilozan spondilit, akut gut artriti, post-travmatik osteoartrit, akut nonspesifik tendosinovit, akutsubakut bursit ve epikondilit. Kollajen doku hastalıkları : sistemik lupus eritematosus, sistemik dermatomiyosit ve akut romatoid kardit. 59

75 Deri hastalıkları: pemfigus, eritema multiform (Stevens-Johnsons sendromu), eksfoliyatif dermatit, bünü dermatitis herpetiformis, ağır seyreden psoriasis, seberoik dermatit ve mikozis fungoides. Göz hastalıkları: herpes zoster oftalmikus, iritis, iridosiklitis, korioretinitis, yaygın posterior uveitis ve koroiditis, optik nevrit, sempatetik oftalmi, ön segment enflamasyonu, aleıjik konjonktivit, aleıjik komeal maıjinal ülser ve keratit. Alerjik reaksiyonlar : bronşiyal astım, kontakt dermatit, atopik dermatit, serum hastalığı, mevsimsel ya da uzun süreli alerjik rinit, aşırı ilaç duyarlılığı, ürtikeriyel transfüzyon reaksiyonları ve akut non-enfeksiyöz larenks ödemi. Solunum sistemi hastalıkları: semptomatik sarkoidoz. berilliosis, tedavi edilemeyen Löffler sendromu, aspirasyon pnömonisi ve gerekli antitüberküloz tedavi ile birlikte fülmine ya da dissemine pulmoner tüberküloz. Hematolojik hastalıklar: kazanılmış (otoimmün) hemolitik anemi, yetişkinlerdeki sekonder trombositopeni, eritroblastopeni, konjenital hipoplastik anemi. Sinir sistemi hastalıkları: multipiskleroz. Sindirim sistemi hastalıkları: ülseratif kolit ve rejyonel enterit. Standart akut şok tedavisine cevap vermeyen şoklar: Kardiyojenik şok, septik şok, anaflaktik şok, hipovolemik şok, karışık şok durumları, travma, yanıklar, çeşitli etyolojik nedenli geç şoklar. 60

76 2. GEREÇLER VE YÖNTEM 2.1. Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Metilprednisolon Kitozan (high Mw) Kitozan (medium Mw) Kitozan (low Mw) Tripolifosfat DOS Sodyum Aljinat Pektin Jelatin Potasyum dihidrojen fosfat Sodyum Hidroksit Hidroklorik Asit Asetik Asit Potasyum Bromür Sodyumsülfit Sodyumsülfat Mustafa Nevzat İlaç Sigma-Aldrich Co. Aldrich Co. Sigma-Aldrich Co. Sigma Co. Sigma Co. Sigma Co. BDH Chemicals BDH Chemicals Merck Merck Merck Merck Merck Merck Merck 61

77 2.1.2 Kullanılan Aletler Spektrofotometre (UV/VIS) Shimadzu 1021 Spektrofotometre (IR) Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 2010 Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Gamma Işınlama Sistemi Paletli Karıştırıcı Hassas Terazi Vasco FT-IR-420 TA Instruments DSC Jeol JSM 840A PX-8-30 Isslodovatelj Heidolph RZR-2000 Sartorius BL 210 S ph Metre Meterlab PHM 2001 Viskozimetre Magnetik Karıştırıcı Çalkalayıcı Su Banyosu Brookfield DV-II Velp Multistirrer Memmert Isıtıcılı Su Banyosu Haake E 12 Etüv Optik Mikroskop Heareus, B5050 Olympus BH-2 Vakum Pompası Gast 0892 Filtre Filtre tutucu Partikül büyüklüğü ölçer alet Whatman no.42 Sartorious Sympatec Laser Diffraction 62

78 2.2. Yöntemler Etkin Maddenin Özelliklerinin Belirlenmesi Etkin Maddenin IR Spektrumu Etkin maddenin çok saf ve kuru potasyum bromür ile 1:10 oranında hazırlanmış disklerinin cm 1 dalga boyları arasında spektrumu alınmıştır Etkin Maddenin Erime Noktası Tayini Metillprednisolonun erime noktası tayini için Buchi SMP 20 aleti kullanılmıştır. Toz etkin madde ucu kapalı kılcal cam çubuğa doldurularak içinde ısıtma sıvısı olarak silikon yağı bulunan aletin uygun bölümüne yerleştirilmiştir. Maddenin fiziksel değişime başlayıp eridiği sıcaklık, termometreden okunarak: ±1 O C duyarlılıkla saptanmıştır Etkin Maddenin DSC Analizi Etkin maddenin termal davranışını incelemek ve kristalliğini belirlemek üzere diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılmıştır mg ağırlıklarda hassas olarak tartılmış numune, alüminyum pan içine konulmuş ve preslendikten sonra alete yerleştirilmiştir O C sıcaklık aralığında 10 O C /dak. hızda termogramı alınmıştır Etkin Maddenin UV Spektrumu Etkin maddenin ph 7,4 fosfat tamponu ve 0,1 N HCl çözeltisi içindeki konsantrasyonları bilinen berrak çözeltilerinin nm aralığında UV spektrumları alınmış ve λ max değerleri belirlenmiştir. 63

79 Etkin Maddenin UV Spektrofotometrik Yöntemle Kalibrasyonu Etkin maddenin ph 7,4 fosfat tamponundaki 10 mg/100 ml ve 0,1 N HCl çözeltisinde 10 mg/ 100 ml konsantrasyonlardaki stok çözeltilerinden hareketle uygun seyreltmelerle farklı konsantrasyonlu çözeltiler hazırlanmış ve absorbansları önceden belirlenmiş λ max değerlerinde okunmuştur. Her bir konsantrasyon ve ona karşılık gelen absorbans değerleri grafiğe geçirilmiş ve en küçük kareler yöntemine göre doğru denklemleri hesaplanmıştır. Daha sonra yapılan tüm analizlerde bulunan bu doğru denklemleri kullanılmıştır Etkin Maddenin UV Spektrofotometrik Yöntemle Kalibrasyonun Validasyonu Kimyasal analiz yöntemleri; analizi yapanların ihtiyaçlarına cevap verecek belirli kriterlere sahip olmalıdır. Pratik karakteristikler yöntemin yararlılığının değerlendirilmesini sağlar. Bilimsel karakteristikler ise yöntemde elde edilen analitik dataların güvenirliliği hakkında bilgi verir. İstenilen, analitik uygulamalar için gerekenleri sağlamak üzere metodun performans karakteristiklerinin laboratuar çalışmaları vasıtasıyla belirlenmesidir. Miktar tayini ve çözünme hızı gibi analitik yöntemlerin kantitatif ölçümlerinde uygulanan validasyon karakteristikleri şunlardır ( ICH Q2A, Q2B, 3A Q11A; USP 28 NF 23, 2005 ): 64

80 1. Seçicilik 2. Doğrusallık 3. Uygulama Aralığı 4. Doğruluk 5. Kesinlik 6. Teşhis Sınırı 7. Tayin Alt Sınırı 1-Seçicilik: Yöntemin, aranan maddeyi örnek matrisin içindeki diğer maddelerden ayırabilme özelliğidir. Bu yüzden nm arasında ph 7,4 fosfat tamponu ve 0,1 N HCl de ortamda bulanabilmesi beklenen bileşenlerin varlığında etkin madde dışında madde piki olup olmadığı incelenerek etkin maddenin kesin bir şekilde tayin edilebilmesidir. 2-Doğrusallık: Bir analitik yöntemin doğrusallığı verilen bir aralıkta (en az 5 konsantrasyon noktası seçilerek) etkin madde konsantrasyonu ile doğrudan orantılı test sonuçlarını sağlayabilmesidir. Doğrusallığın tespitinde instat paket programı kullanılarak en küçük kareler yöntemi ile konsantrasyona karşı elde edilen absorbans değerlerinden regresyon doğru denklemi hesaplanır. Bu doğrunun eğimi, madde konsantrasyonu ile bulunan deney sonuçları arasındaki matematiksel ilişkiyi verir. Yapılan hesaplamalar sonucunda bulunan artık kareler toplamı ve ortalamanın artık kareler toplamı küçük, korelasyon katsayısı ise 1 e yakın olmalıdır. 3-Uygulama Aralığı: Kullanılan yönteme göre etkin maddenin yer aldığı alt ve üst limitler arasındaki oranın kesinlik, doğruluk ve doğrusallık açısından tayin edildiği aralıktır. 4-Doğruluk: Bir analitik yöntemin doğruluğu, o yöntem ile elde edilen test sonuçlarının gerçek değere yakınlığıdır. Doğruluk, örnekteki maddenin bilinen miktarının tayini ile yüzde geri elde değerleri bulanarak hesaplanır. Üç konsantrasyon noktasında üçer kez hazırlanan numune miktarlarının ya 65

81 da aynı konsantrasyon noktasında altı kez hazırlanan numune miktarlarının yüzde geri eldeleri bulunarak hesaplanır. %Geri elde değerlerinin ortalaması bu dağılımın standart sapması, % bağıl standart sapması (varyasyon katsayısı ) belirlenmiştir. Bu şekilde elde edilen % bağıl standart sapma değerinin %2 den küçük olması gerekmektedir. Böylece yöntemin doğruluğu tayin edilmiş olur 5-Kesinlik: Bir analitik yöntemin kesinliği normal deney koşulları altında yöntemin tekrarlanabilirliğinin, tekrar elde edilebilirliğinin ve ortam uygunluğunun bir ölçüsüdür. Birbirini izleyen ölçümler arasındaki yakınlığın derecesini ifade eden bir parametredir. Kesinlik, genellikle ölçümlerin standart sapması veya bağıl standart sapması ve güven sınırları ile ifade edilir. Kesinlik belirli aralığı içine alan üç konsantrasyon noktasında aynı laboratuar koşullarında üçer kez hazırlanan numune miktarlarının farklı günlerde değerlendirerek ortam uygunluğunun araştırılması ya da farklı stok çözeltilerden hareketle 6-10 adet farklı konsantrasyonda çözeltinin oluşturulması ve bu çözeltilerin absorbans değerlerinin en az altı defa okunması ile tayin edilir. Sonuçlar hesaplanan konsantrasyonların ortalaması, standart sapması (SS) ve % bağıl standart sapması (RSD) şeklinde verilmiştir. Yöntemin tekrarlanabilir ve tekrar elde edilebilir olması için okunan absorbsiyon değerlerine karşılık gelen konsantrasyon değerlerinin %2 den küçük olması gerekmektedir. 6-Teşhis Sınırı (LOD): Teşhis sınırı, var olan deneysel koşullar altında örnekteki maddenin teşhis edilebilen ancak tayin edilemeyen en küçük miktarıdır. LOD = 3.3 σ/s σ : Regresyon doğrularının aynı konsantrasyon noktasında elde edilen y kesişim değerlerinin standart sapması s: Kalibrasyon eğrisinin eğimi 66

82 7-Tayin Alt Sınırı (LOQ): Tayin alt sınırı örnekteki maddenin var olan deneysel koşullar altında kabul edilebilir kesinlik ve doğrulukla tayin edilebildiği en küçük miktarıdır. LOQ = 10 σ/s Etkin Maddenin Çözünürlük Tayini Etkin maddenin ph 7,4 fosfat tamponundaki çözünürlüğünün saptanabilmesi için kapaklı erlenlere konulan 50 ml ph 7,4 fosfat tamponu çözeltisi üzerine metilprednisolonun aşırısı konularak 37 C 'deki termostatlı su banyosu içinde karıştırılarak, çeşitli zaman aralıklarında filtre yardımı ile alınan numunelerin absorbansları önceden belirlenmiş λ max değerinde okunmuştur ve sistemin dengeye ulaştığı andaki konsantrasyon değeri metilprednisolonun çözünürlük değeri olarak saptanmıştır. Numune çekme işlemi sırasında kullanılan sistem (cam malzeme ve filtre) 37 C 'lik etüvde bekletilerek sıcaklığın düşmemesine dikkat edilmiştir Etkin Maddenin Stabilitesinin İncelenmesi Etkin maddenin, çalışılan ph 7,4 fosfat tamponunda hazırlanan; konsantrasyonu belli çözeltilerinin stabiliteleri, 37 C de ve oda sıcaklığında 3 ay süre ile belirli zaman aralıklarında alınan numunelerin absorbansları ölçülerek ve UV spektrumları alınarak incelenmiştir. Ayrıca etkin maddenin formülasyon hazırlama süresince %1 'lik (h/h) asetik asit çözeltisi içindeki stabilitesinin incelenmesi amacıyla, konsantrasyonu belli olan etkin madde- asetik asit çözeltisi, formülasyon hazırlama sıcaklığı olan 25 O C' de 4 saat süre ile bekletilmiş ve belirli zaman aralıklarıyla numune alınarak stabilitesi incelenmiştir. 67

83 Polimerin Özelliklerinin Belirlenmesi Polimerin IR Spektrumu Polimerlerin çok saf ve kuru potasyum bromür ile 1:10 oranında hazırlanmış disklerinin cm -1 dalga boyları arasında spektrumu alınmıştır Polimerin Erime Noktası Tayini Polimerin erime noktası tayini için Buchi SMP 20 aleti kullanılmıştır. Öğütülerek toz hale getirilen polimer ucu kapalı bir kılcal cam çubuğa doldurularak içinde ısıtma sıvısı olarak silikon yağı bulunan aletin uygun bölümüne yerleştirilmiştir. Maddenin fiziksel değişime başlayıp eridiği sıcaklık, termometreden okunarak ±1 O C duyarlılıkla saptanmıştır Polimerin DSC Analizi Hassas olarak tartılan 5 10 mg polimer, aluminyum pan içine konulmuş ve preslendikten sonra alete yerleştirilmiştir O C sıcaklık aralığında 10 O C /dak hızda termogramı alınmıştır Polimerin Viskozite Tayini Polimerlerin viskotize tayini için, %1 (h/h) asetik asit içindeki kitozanın %1 lik (a/h) çözeltileri hazırlanmıştır. Hazırlanan bu çözeltinin viskozitesi 25 0 C de Brookfield viskozimetresi kullanılarak ölçülmüştür. 68

84 Formülasyon Ön Çalışmalar: Metilprednisolon içeren kitozan mikrokürelerin önce s/y emülsiyon iyonotropik jelasyon yöntemi uygulanarak hazırlanması yönünde formülasyon çalışmaları yapılmış olup bu aşamada; Çapraz bağlayıcı ajan tipi ve konsantrasyonu, Çapraz bağlayıcı ekleme şekli, Emülsifikasyon süresi, Emülgatör (Span 80) miktarı, Karıştırma hızı ve süresi gibi parametreler değiştirilerek formülasyona etkileri incelenmiştir. Bu amaçla formüller hazırlanırken; Yöntemde etkin madde içeren kitozan çözeltisinden oluşan faz (su fazı), s/y emülsiyonunun oluşması için, izo-oktan ve Span 80 içeren faza eklenmiştir. Daha sonra farklı aralıklarla, iyonotropik jelasyonun sağlanması için çapraz bağlayıcı (NaOH veya TPP) eklenmiştir. Oluşan mikroküreler, filtrasyon ile ayrılmış, yıkanmış ve kurutulmuştur. Bu yöntemde çapraz bağlayıcı olarak ilk önce %1 (a/a) sodyum tripolifosfat kullanılmıştır. Ancak aşırı topaklanma gösteren zayıf mikroküreler elde edilmiştir. Sodyum tripolifosfat yerine daha kuvvetli bazik özellik gösteren 1M NaOH kullanıldığında ise mikroküreler zayıf olmasına karşın daha az topaklanma göstermiştir. Emülsyona bir anda eklenen NaOH ani hacim artışı nedeniyle emülsiyon yapısını bozmuştur. NaOH güçlü bir baz olduğundan, NaOH ın kitozan çözeltisinin s/y emülsyonuna eklenmesi halinde; asitbaz reaksiyonu nedeniyle kitozanın çözeltide jelleşmesine neden 69

85 olmuştur. Bu sebeple eklenecek total NaOH miktarı eşit üç parçaya bölünerek 30 dk aralıklarla eklenmiştir. Yönteme eklenen NaOH miktarı değiştirildiğinde; çok küçük miktarda NaOH ile yeterli bütünlüğe sahip mikroküre oluşturulamazken, büyük miktarda NaOH mikrokürelerin topaklanmalarına sebep olmuştur. Emülsifikasyon süresinin artırılması mikrokürelerin boyut dağılımını değiştirmiştir ayrıca kümeleşmelere sebep olmuştur. Emülgatör (Span 80) miktarını artırmak mikrokürelerin yapısında çökmeye neden olmuştur. Karıştırma hızının artması mikroküre boyutunu küçültürken agregasyon derecesinin artmasına sebep olmuştur. Karıştırma süresinin artırılması homojen dağılımlı mikroküre oluşumunu sağlamamıştır. Çalışmalarımız sonucunda bu yöntem ile; o Elde edilen mikrokürelerin partükül boyutlarının çok farklı, partikül büyüklüğü dağılımının geniş olduğu, o Mikrokürelerin dayanıksız olduğu, o Mikrokürelerin aşırı agregasyon eğilimi gösterdiği dezavantaj olarak saptandığından, Emülsiyon iyonotropik jelasyon yöntemi yerine iyonotropik jelasyon yönteminin kullanılmasına karar verilmiştir ve tüm formüller bu yöntemle hazırlanmıştır. Bu yöntemde, kitozan etkin madde dispersiyonu damlatma yoluyla sabit bir karıştırma hızında, poli-anyonik TPP çözeltisine karıştırılır, oluşan küresel partiküller süzülür ve yıkanır. Burada tripolifosfatın farklı oranlardaki sulu çözeltileri sertleştirici ajan olarak kullanılmıştır. 70

86 Mikrokürelerin hazırlanmasında ; Etkin madde miktarı, Polimer tipi ve konsantrasyonu, Polimerin çözündüğü asetik asit konsantrasyonu, Çapraz bağlayıcı ajan konsantrasyonu, İç: dış faz oranı, Dış faza eklenen sodyum aljinat miktarı, Dış faza eklenen jelatin miktarı, Dış faza eklenen sodyum aljnat: pektin oranı, gibi formülasyon değişkenlerinin etkin madde çıkışı üzerine etkileri incelenmiştir İyonotropik Jelasyon Yöntemi ile Formüllerin Hazırlanması Öncelikle %1 'lik (h/h) asetik asit çözeltisi içinde kullanılacak yüksek molekül ağırlıklı kitozanın % 1 'lik (a/h) çözeltisi hazırlanmıştır. Polimer çözeltisinin hazırlanması sırasında dikkat edilecek nokta, kitozanın yüksek viskozluğu sebebiyle çeperlere yapışmasını önleyebilmek için hacmen tamamlamanın, çözünme tam olarak sağlandıktan sonra yapılmasıdır. Bu çalışmada tam bir çözünme sağlanabilmesi için karıştırma süresi 24 saat olarak belirlenmiştir. Bu süre sonunda çözelti, 0,45 mm'lik filtre kâğıdından süzülmüş, hava kabarcıklarından arındırılmak üzere beklemeye bırakılmıştır. Sonraki aşama etkin maddenin kitozan çözeltisi içindeki dispersiyonunun hazırlanmasıdır. 10 ml % 1 (a/h) kitozan çözeltisi içine %25, %50 ve %75 (a/a) oranında etkin madde ilave edilerek 1,5 saat magnetik karıştırıcıda karıştırılmak suretiyle etkin madde-polimer dispersiyonu oluşturulmuştur. Hazırlanan bu dispersiyon sertleştirici çözeltiye damlatılmak üzere enjektöre çekilmiştir. Sertleştirici çözelti olarak tripolifosfatın sudaki %1, %3, %5' lik (a/h) çözeltileri kullanılmıştır. 10 ml 71

87 etkin madde- polimer dispersiyonu 0.45 mm çaplı insülin enjektöründen, 2 ml/dak hızda 100 rpm hızla karışmakta olan 100 ml tripolifosfat çözeltisi içine damlatılarak 30 dakika süren karıştırma işleminden sonra oluşan mikroküreier filtre edilmiş ve 3 kez 20 ml distile su ile yıkandıktan sonra 24 saat süre ile 37 Clik etüvde kurutulmuştur. Üç farklı molekül ağırlığına sahip kitozan kullanılmıştır. HM(High molecule), MM(medium molecule), LM (Low molecule). Bunlardan HM ile daha küresel ve etkin madde yüklemesi daha yüksek mikroküreler elde edilmiştir. İki farklı karıştırıcı (Heidolph ve stirpac) aynı hızda 100, 300, 600 rpm de çalıştırılmıştır. Miktar tayini ve işlem etkinliği bakımından her iki alet arasında büyük fark olmasa da düşük rpm de stirpacla yapılan mikrokürelerde işlem etkinliği daha yüksek çıkmıştır Heidolph da oluşturulan mikrokürelerin daha küresel olduğu gözlenmiştir. %1HM ile Heidolph da 100 rpm de oluşturulan mikrokürelerden hareketle kitozan oranı % 0,5 ve %1,5 yapılmıştır. Oluşan mikrokürelerden etkin madde miktar tayini en yüksek olan formüller %1,5 HM ile yapılan formüller olmuştur ancak kitozan çözeltisini %1,5 hazırlamak oldukça güç olmuştur. Kitozanın çözündüğü asetik asit oranı %1 iken; bu oran %2 %3 olarak değiştirilmiştir ancak miktar tayininde fark gözlenmemiştir. İyonotropik jelasyon yönteminde kullanılan çapraz bağlayıcı tipi değiştirilmiştir. Kalsiyum klorür, sodyum sülfat, sodyum sülfit, dioktilsülfosüksinat ve sodyumtripolifosfat denenmiştir. Kalsiyum klorür, sodyum sülfat, sodyum sülfitle oluşturulan mikroküreler oldukça zayıf ve yumuşak yapıda olduklarından kuruduklarında şekillerini kaybederek yassılaşmış ve kurudukları ortama yapıştıkları görülmüştür. Farklı konsantrasyonlarda denenen dioktilsülfosüksinatla ise mikroküre oluşturulamamıştır. En iyi sonuç sodyumtripolifosfatla alınmıştır. 72

88 Karıştırma hızı 100, 300, 600 rpm de denenmiştir. Hız arttıkça mikrokürelerin küresel şekillerini kaybettikleri görülmüştür. Damlatma yapılacak enjektör olarak ilk önce 0.90 mm çaplı yeşil uçlu enjektör denenmiştir ancak damlatılan mikrokürelerin partikül boyutu oldukça büyük olmuştur bu yüzden 0,45 mm çaplı insülin enjektörü kullanılmıştır. Jelleşme süresinin tespiti için metilkırmızısı kullanılmıştır. Jelleşme sırasında kitozan mikroküre içerisindeki asetik asit TPP tarafından nötralize edilmektedir. Bu sırada asetik asitin dış faza difüzyonu söz konusudur. Mikroküre içerisindeki ph asitten baza doğru kayarken, renk değişimi gözlenmektedir (Tablo2.1). Metilkırmızısının rengi kırmızıdan sarıya dönmektedir (Şekil 2.1). Bu renk değişim süresi jelleşme için gereken zamanı göstermektedir. Tam bir jelleşme için yeterli sürenin dk olduğu saptanmıştır. % 1 a/a kitozan çözeltisinin ph değeri 4,1 dir. % 4 a/h TPP çözeltisinin ph değeri 8,9 dur. Tablo 2.1 ph değişim tablosu Zaman Metilkırmızısı (PH 4,2-6,2) Asit (Kırmızı)-Baz (Sarı) Bromtimol mavisi (PH 6,0-7,6) Asit(Sarı)-Baz (Mavi) 5 Kırmızı/ Kırmızı 4,2 Asit Sarı/ Sarı 6,0 Baz 10 Sarı/ Kırmızı Mavi spots/sarı 15 Sarı/Kırmızı Mavi/ Sarı 20 Sarı/Sarı Mavi/ Sarı 25 Mavi/Yeşil 35 6,2 Baz Mavi/Mavi 7,6 Nötr 73

89 Şekil 2.1. Jelleşme süresinin tespiti Damlatma süresinin uzaması sonucunda ilk damlatılan boncukla son boncuk arasındaki çapraz bağlanma süresinin değişmesinin ve mikrokürelerin farklı çapraz bağlama yoğunluklarında oluşmasının söz konusu olabileceği düşünülerek damlatma hızı 2 ml/ dak olarak belirlenmiştir. İç faz / dış faz oranı değiştirilmiştir. Çapraz bağlayıcı yüzdesi değiştirilmiştir. Yüklenen etkin madde yüzdesi değiştirilmiştir. Hazırlanan tüm formüller Tablo 2.2. de verilmiştir. 74

90 Tablo 2.2. Formüller KOD Etkin madde kons.(% a/a) Polimer Tipi Polimer kons.(%a/h) Asetikasit kons.(% h/h) TPP kons.(%a/h) Karıştırma hızı (rpm) İç/Dış faz oranı Dış faza eklenen Naaljinat kons.(%a/h) Dış faza eklenen Naaljinat/pektin oranı (%a/h) Dış faza eklenen jelatin kons. (%a/h) FL1 50 LM / FM1 50 MM / FM2 50 MM / FM3 50 MM S * 10/ FM4 50 MM / FM5 50 MM S * 10/ FH1 50 HM / FH2 50 HM / FH3 50 HM S * 10/ FH4 50 HM / FH5 50 HM S * 10/ FH6 50 HM 0, / FH7 50 HM 1, / FH8 50 HM / FH9 50 HM / FH10 50 HM / FH11 50 HM / FH12 25 HM / FH13 75 HM / FH14 50 HM /100 0,5 - - FH15 50 HM /100-0,5/1 - FH16 50 HM / FH17 50 HM / FH18 50 HM / ,5 FH19 75 HM / (*) "S": Stirpac 75

91 Hazırlanan Formüllerde Yapılan Kontroller Hazırlanan Formüllerde IR Analizi Hazırlanan formüllerde polimer ve etkin madde yapısında bir değişiklik olup olmadığını test etmek amacıyla seçilen formüllerin çok saf ve kuru potasyum bromür ile 1: 10 oranında hazırlanmış disklerinin cm -1 dalga boyları arasında spektrumu alınmıştır Hazırlanan Formüllerde Etkin Madde Miktar Tayini ve İşlem Etkinliği Hazırlanan mikrokürelerde etkin madde miktar tayini için tartılan belirli miktar boncuğun içerdiği metilprednisolon miktarı bulunmuştur. Bunun için tartılan mikroküreler, 100 ml 0,1 N HCl çözeltisi içinde çözüldükten sonra spektrofotometrik olarak metilprednisolon miktarı tayin edilmiştir. Sonuçlar üç paralel çalışmanın ortalaması alınarak bulunmuştur. Elde edilen etkin madde miktarı çözünme hızı verilerinin değerlendirilmesinde kullanılmıştır. Sonuçlar, 1.19 no'lu denklem ile ifade edilen, işlem etkinliği şeklinde verilmiştir. Teorik etkin madde içeriği(a) = iç fazdaki etkin madde miktarı (Denklem 1.17) iç fazdaki total katı miktarı x100 Ölçülen etkin madde içeriği (b) = Ölçülen etkin madde miktarı x100 (Denklem 1.18) Ölçümde kullanılan total katı miktarı İşlem Etkinliği = ( b / a ) x 100 (Denklem 1.19) 76

92 Partikül Büyüklüğü ve Dağılımı Hazırlanan formüllerin partikül büyüklüklerinin tayini için lazer kırınımı yöntemi uygulanmıştır. Hazırlanan mikrokürelerin partikül büyüklükleri Sympatec Laser Diffraction Particle Sizer ile hesaplanmıştır. Mikroküreler hazırlanırken kullanılan etkin madde ve polimer suda çözünmediğinden ölçümler aletin küvetine su konularak yapılmıştır Mikroküre Morfolojisinin SEM ile İncelenmesi Mikroküreler hazırlandıktan sonra çözünme hızı deneyleri öncesinde alınan ve ayrıca çözünme hızı sırasında ve sonrasındaki değişimlerin saptanabilmesi için çözünme hızı deneyinin başlangıcında 70. ve 170. saatlerinde alınan örneklerin taramalı elektron mikroskobu tekniğine uygun olarak vakum altında altınla kaplanması suretiyle değişik büyütmelerde görüntüleri alınmıştır Hazırlanan Mikroküreların DSC Analizi Hazırlanan mikrokürelerde etkin madde polimer arasında herhangi bir etkileşim olup olmadığının saptanabilmesi için; ayrıca sterilizasyon öncesi ve sonrasında meydana gelebilecek değişimlerin saptanabilmesi amacıyla formülasyonların DSC analizleri, O C sıcaklık aralığında, 10 O C / dak. tarama hızı ile yapılmıştır. 77

93 Çözünme Hızı Tayinleri Çözünme Hızı Deneylerinde Kullanılan Ortam Çalışma ortamı olarak 1/ oranında polisorbat 20 içeren ph 7,4 fosfat tamponu kullanılmıştır. ph 7,4 Fosfat Tamponu: 1. Potasyum dihidrojen fosfat ,22 g Distile su y.m ml 2. Sodyum hidroksit...8 g Distile su...y.m ml 200 ml lik bir balona 1. no lu çözeltiden 50 ml, 2. no' u çözeltiden 39,1 ml alınıp distile su ile 200 ml' ye tamamlanarak ph 7,4 fosfat tamponu hazırlanır (USP 29, 2006) Çözünme Hızı Deneylerinin Yapılışı Hazırlanan formüllerin çözünme hızı deneyleri statik yöntem kullanılarak yapılmıştır. 5 mg etkin madde içeren mikroküre miktarı tartılarak 250 ml'lik kapaklı erlenler içine konmuş ve üzerine 100 ml ph 7,4 fosfat tamponu ilave edilmiştir. Hazırlanan formüllerde partikül büyüklükleri birbirine yakın olduğundan partiküller çözünme hızı deneylerinde belirli bir partikül büyüklüğü analizi yapılmadan kullanılmışlardır. Deneylere başlamadan önce çözünme hızı yönteminin tekrarlanabilirliğini saptamak amacıyla 6 paralel çalışılmış, alınan her bir numuneden okunan absorbans değerlerinde anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Aynı formülün farklı zamanlarda yapılan çözünme hızı analizlerinde de bulunan sonuçlar arasında anlamlı fark gözlenmemiştir. Numuneler, 37 C' ye ayarlı dakikada 68 salınım yapan çalkalayıcı su banyosu içine yerleştirildikten sonra belli aralıklarla aynı yüksekliklerden aynı 78

94 şekilde 1,5 ml numune alınmıştır. Alınan bu numunelerin absorbansları, spektrofotometrede önceden belirlenen λ max değerinde ölçüldükten sonra erlenlerin içine geri ilave edilmiştir. Çözünme hızı deneylerine 120 saat devam edilmişitr. Çözünme hızı deneyleri sonucunda açığa çıkan etkin madde miktarları zamana karşı grafiklenmesi ve bu verilerin kinetik yönden değerlendirilmesi suretiyle etkin madde oranı, asetik asit konsantrasyonu, polimer tipi ve konsantrasyonu, çapraz bağlayıcı ajan konsantrasyonu, iç:dış faz oranı, dış faza eklenen Na-aljinat, jelatin ve dış faza eklenen Na-aljinat:Pektin oranı değişimlerinin etkin madde çıkış hızına etkisi incelenmiştir. Metilprednisolon içeren mikrokürelerin sterilizasyon sonrasındaki çözünme hızı deneyleri de yapılmış ve elde edilen sonuçlar sterilizasyon öncesi çözünme hızı verileri ile karşılaştırılarak sterilizasyonun etkin madde çıkışı üzerine etkisi incelenmiştir Hazırlanan Mikrokürelerin Sterilizasyonu Hazırlanan formüllerin implantasyon yoluyla uygulanması düşünüldüğünden sterilize edilmeleri gerekmektedir. Ancak sterilizasyon sonucunda polimerik yapıda değişiklik olabilmekte ve bu da etkin madde salımında beklenmeyen değişimlere sebep olabilmektedir. Bu nedenle hazırlanan mikroküreler, polimerik ilaç taşıyıcı sistemler için en uygun sterilizasyon yöntemi olan gamma ışınları ile sterilize edilmiştir. Sterilizasyon, 6O Co gamma kaynağı ile kenar doz hızı 0,51 Mrad/sa, merkez doz hızı 0,47 Mrad/sa olan PX-γ-30 Issolodovatejl sisteminde yapılmıştır. Sterilize edilecek ürünler amber renkli flakonlar içine konularak ışınlama alanına yerleştirilmiştir. Işınlama dozu olarak polimerik materyaller için uygunluğu kabul edilen 2,5 Mrad seçilmiştir. 79

95 Kinetik Hesaplamalar ve Sonuçlarının Değerlendirilmesi Hazırlanan formüllerden etkin madde açığa çıkışının hangi kinetik eşitliğe uygun olduğu Bölüm 1.12' de incelenen kinetik modeller ve doğru denklemlerinden hareketle bulunmuş, hesaplanan parametreler değerlendirilerek, formülasyon değişkenlerinin etkin madde salımı üzerine etkileri incelenmiştir. 80

96 3.BULGULAR 3.1. Etkin Maddeye ait Bulgular Metilprednisolonun IR Spektrumu Bölüm de anlatıldığı şekilde elde edilen IR spektrumunda Metilprednisolonun fonksiyonel gruplarına ait gerilim bantlar şekil 3.1 de gösterilmiştir. Spektrumda görülen etkin maddeye ait spesifik bantlar referans spektrumla uyum göstermektedir (Clarke s,1986). Şekil 3.1. Metilprednisolonun IR spektrumu Metilprednisolonun Erime Noktası Tayini Metilprednisolonun erime noktası tayini 3 paralel ölçümün sonucu olarak Bölüm ' de anlatıldığı şekilde yapılmıştır. Bulunan değerler literatür verileri ile uyumludur. (Remington,2000; USP-29,2006; Merck Index, 2001). 81

97 Tablo 3.1. Metilprednisolonun erime noktası. Metilprednisolon'un Erime Noktası ( 0 C) SS SH Güven Sının (95% ) n 242,7 0,498 0,323 ±1, Metilprednisolonun DSC Analizi Bölüm ' de anlatıldığı şekilde yapılan etkin maddenin DSC analizi sonucunda elde edilen termogram Şekil 3.2.' de gösterilmiştir. Metilprednisolonun O C' de endotermik bir pik verdiği görülmüştür. Şekil 3.2. Metilprednisolonun DSC termogramı 82

98 Metilprednisolonun UV Spektrumu Metilprednisolonun UV spektrumu Bölüm de anlatıldığı şekilde alınmıştır (Şekil 3.3, Şekil 3.4). Etkin maddenin ph 7,4 fosfat tamponu ve 0,1 N HCl çözeltisi içinde maksimum absorbans verdiği dalga boyu 247,5 nm olarak belirlenmiş olup, bu bulgular referans verilerle de parelellik göstermektedir (Clarke s,1986; Merk Index, 2001). Şekil 3.3. Metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponu içindeki UV spektrumu. 83

99 Şekil 3.4. Metilprednisolonun 0,1 N HCl içindeki spektrumu Metilprednisolonun UV Spektrofotometrik Yöntem ile Kalibrasyonu Bölüm de anlatıldığı şekilde ph 7,4 fosfat tamponu ve 0,1 N HCl içinde yapılan ölçümler sonucu elde edilen kalibrasyon parametreleri ve kalibrasyon doğruları sırasıyla Tablo 3.2, Şekil 3.5 ve Şekil 3.6 da verilmiştir. Tablo 3.2. Metilprednisolonun ph 7,4 Fosfat Tamponu ve 0,1 N HCl içersinde elde edilen kalibrasyon parametreleri Ortam Eğim ± SH Kesişim ± SH ph 7,4 Fosfat Tamponu Determinasyon Katsayısı (R 2 ) Güven Sınırı (95%) 38,9± 0,005 0,0117 ± 0,00 1,00 ± 0,060 0,1 N HCl 38,6± 0,002 0,0106 ± 0,00 1,00 ± 0,008 84

100 Şekil 3.5 Metilprednisolonun ph 7,4 Fosfat Tamponu içindeki Kalibrasyon Doğrusu Şekil 3.6 Metilprednisolonun 0,1 N HCl çözeltisi içerisindeki kalibrasyon doğrusu Metilprednisolonun UV Spektrofotometrik Yöntem ile Kalibrasyonunun Validasyonu I- Seçicilik: Bölüm da belirtilen şekilde formülasyonda yer alan tüm yardımcı maddelerin hem formülasyonda kullanılan miktarları üzerinden ayrı ayrı çözeltileri hem de etkin madde içermeyen mikroküre formülasyonları 85

101 hazırlanmış ve nm dalga boyları arasında UV spektrumları alınarak etkin maddeye ait spektrumla karşılaştırma yapılmıştır. Kullanılan yardımcı maddelerden hiçbiri bu aralıkta belirgin pik vermemiş böylece yöntemin metilprednisolon miktarını tam olarak belirleyebildiği saptanmıştır. II- Doğrusallık ve Aralığı: Bölüm da belirtilen şekilde 12 konsantrasyon noktası seçilerek doğrusallık ve aralığının tayinine yönelik SPSS 12.0 programı kullanılarak farklı ortamlar için hesaplanan veriler Tablo 3.3 de verilmektedir. Tablo 3.3. : Metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponunda ve 0,1 N HCl de doğrusallık bulguları Çözünme ortamı PH 7,4 fosfat tamponu Eğim (m) 38,9 38,6 0,1 N HCl Standart Hata 0,129 0,063 Kesişim (n) 0,012 0,011 Standart Hata 0,002 0,001 Regresyon Katsayısı ( r 2 ) 1 1 Regresyon doğrusundan sapmaların Standart sapması (Sy.x) 0,0027 0,0014 Doğrusallıktan sapma kareler Toplamı 0,665x10-5 0,766x

102 a) b) Şekil.3.7. Doğrusallık ve aralığının saptanmasında farklı ortamlara ait lineer regresyon grafikleri a) ph 7,4 b) 0,1 N HCl 87

103 a) III- Doğruluk : Bölüm da anlatılan şekilde yapılan ölçümlerle elde edilen doğruluk bulguları Tablo 3.4 de gösterilmiştir. Tablo 3.4. Metilprednisolonun a) ph 7,4 fosfat tamponu ve b) 0,1 N HCl de doğruluk bulguları Çözünme ortamı Teorik Konsantrasyon (mg/ml) Ph 7,4 fosfat tamponu Pratik Konsantrasyon 0,006 0, ,30 0,006 0, ,30 0,006 0, ,006 0, ,6 0,006 0, ,30 0,006 0, ,6 Ortalama % Geri Elde 99,7 SS 1,63 RSD 0,663 % Geri Elde b) Çözünme ortamı 0,1 N HCl Teorik Konsantrasyon Pratik Konsantrasyon % Geri Elde (mg/ml) 0,006 0, ,006 0, ,006 0, ,6 0,006 0, ,6 0,006 0, ,30 0,006 0, Ortalama % Geri Elde 100,3 SS 1,24 RSD 0,504 88

104 a) IV-Kesinlik : Bölüm da anlatıldığı şekilde metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponu ve 0,1 N HCl içindeki kalibrasyonunun tekrar elde edilebilirlik ve tekrarlanabilirlik bulguları Tablo 3.5. ve Tablo 3.6 da gösterilmiştir. Tablo 3.5. Metilprednisolonun a) ph 7,4 fosfat tamponu b) 0,1 N HCl deki kalibrasyonunun tekrar elde edilebilirlik bulguları 1.Gün Absorbans Konsantrasyon (mg/ml) 2.Gün Absorbans 0,241 0,0060 0,242 0,0060 0,239 0,0059 0,241 0,0060 0,241 0,0060 0,242 0,0061 0,242 0,0061 0,239 0,0059 0,241 0,0061 0,240 0,0059 0,238 0,0059 0,240 0,0059 Ortalama 0,0060 0,0059 SS 8,94x10-5 8,16x10-5 RSD 0,0024 0,0033 b) 1.Gün Absorbans Konsantrasyon (mg/ml) 2.Gün Absorbans 0,244 0,0060 0,246 0,0061 0,243 0,0060 0,245 0,0061 0,240 0,0059 0,245 0,0061 0,244 0,0060 0,244 0,0060 0,239 0,0059 0,243 0,0060 0,245 0,0061 0,245 0,0061 Ortalama 0,0060 0,0060 SS 7,52x10-5 5,16x10-5 RSD 3,073x10-5 2,10x10-5 Konsantrasyon (mg/ml) Konsantrasyon (mg/ml) 89

105 Tablo 3.6. Metilprednisolonun ph 7,4 ve 0.1N HCl deki tekrarlanabilirlik bulguları ph 7,4 fosfat tamponu 0,1 N HCl Absorbans Konsantrasyon (mg/ml) Absorbans Konsantrasyon (mg/ml) 0,560 0, ,552 0, ,561 0, ,554 0, ,563 0, ,551 0, ,562 0, ,554 0, ,560 0, ,552 0, ,562 0, ,553 0,01405 Ortalama 0, ,01404 SS 3,20x10-5 2,92x10-5 RSD 1,30x10-5 1,19x10-5 V-Teşhis Ve Tayin Alt Sınırı: Bölüm da belirtildiği şekilde hesaplanan LOD ve LOQ değerleri Tablo 3.7. gösterilmiştir. Tablo 3.7. Metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponu ve 0,1N HCl de elde edilen LOD ve LOQ bulguları Teshis Sınırı Tayin Sınırı (LOD)(mg/ml) (LOQ)(mg/ml) ph 7,4 fosfat tamponu 1,17x10-4 1,64x10-5 0,1 N HCl 1,08x10-3 1,01x Metilprednisolonun Çözünürlük Tayini Metilprednisolonun Bölüm da anlatıldığı şekilde saptanan ph 7,4 fosfat tamponu içindeki çözünürlük değeri Tablo 3.8 de verilmiştir. 90

106 Tablo 3.8.Metilprednisolonun ph 7,4 fosfat tamponu içindeki çözünürlüğü. Metilprednisolonun Çözünürlüğü (mg/ml) SS SH Güven Sınırı (95 %) 0,128 3,606x10-3 2,082x10-3 0,017 3 n Metilprednisolonun Stabilitesinin İncelenmesi: Metilprednisolon un 20 µg/ml konsantrasyondaki çözeltisinden Bölüm de anlatıldığı şekilde üç ay süreyle alınan numunelerin absorbans değerleri ve UV spektrumlarında herhangi bir değişim gözlenmemiştir ve gerek formülasyon aşamasında gerekse çözünme hızı deneyleri süresince etkin maddenin stabilite açısından bir sorun yaratmayacağı sonucuna varılmıştır Polimere Ait Bulgular : Kitozanın IR Spektrumu: Bölüm de anlatıldığı şekilde elde edilen IR spektrumunda kitozanın fonksiyonel gruplarına ait gerilim bantları Şekil 3.8. de gösterilmiştir. Şekil 3.8. Kitozanın IR Spektrumu: 91

107 Kitozanın Erime Noktası Tayini: Kitozanın erime noktası tayini Bölüm de anlatıldığı şekilde yapılmıştır. Polimerlerin erime noktası tek nokta olarak belirlenememiş ve renk değişimi ile dekompoze olduğu sıcaklık aşağıdaki tabloda gösterilmiştir.bu değerler HM w, MM w, LM w olmak üzere her üç tip polimer için üçer paralel ölçüm sonucunda aynı bulunmuştur. Tablo 3.9. Kitozanın erime noktası. POLİMERLERİN ERİME NOKTASI ( C ) SS SH Güven Sınırı (%95) n 238,3 1,155 0,667 ± 2, Kitozanın DSC Analizi Bölüm de anlatıldığı şekilde yapılan etkin maddenin DSC analizi sonucunda elde edilen termogram Şekil 3.9 da gösterilmiştir. Şekil 3.9. Kitozanın DSC termogramı 92

108 Kitozanın Viskozite Tayini Bölüm de belirtildiği şekilde RV06 Spindle No ve 10 rpm dönü hızı kullanılarak ölçülen polimere ait viskozite değerleri Tablo 3.10 da verilmiştir. Tablo Polimerlerin viskozite değerleri. Kitozan Tipi HM w MM w LM w Viskozite (cps) Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular Formüllerin IR Analizi Formülasyon çalışmaları sonucunda gerek polimer gerekse etkin madde yapısında bir değişim olup olmadığını test etmek amacıyla seçilen formüllere ait, bölüm de anlatıldığı şekilde elde edilen IR spektrumlarında gözlemlenen hem polimer hem de etkin maddeye ait fonksiyonel grupların gerilim bantları Şekil da gösterilmiştir. Şekillerden de görüldüğü üzere madde yapısında bir değişim gözlenmemiştir. Şekil FH1 formülasyonuna ait IR spektrumu 93

109 3.3.2 Hazırlanan Formüllerde Etkin Madde Miktar Tayini ve İşlem Etkinliği Mikrokürelere yüklenen etkin madde miktarı ve yükleme işlem etkinliği Bölüm de anlatıldığı şekilde hesaplanmış ve Tablo 3.11 da gösterilmiştir. Tablo Hazırlanan mikroküre formülasyonlarında etkin madde miktar tayini ve işlem etkinliği Teorik Etkin Madde Miktarı (a) (%) Ölçülen Etkin Madde Miktarı (b) (%) Miktar Tayini İşlem Etkinliği (a/b) (%) Güven Sınırı Kod SS (% 95 ) FL ,48 0,001 ± 0, ,96 FM ,20 0,013 ± 0, ,40 FM ,10 0,016 ± 0, ,20 FM ,40 0,008 ± 0, ,90 FM ,00 0,016 ±0, ,00 FM ,70 0,002 ± 0, ,00 FH ,3 0,056 ± 0, ,7 FH ,50 0,001 ±0, ,10 FH ,50 0,005 ± 0, ,10 FH ,90 0,027 ±0, ,00 FH ,60 0,009 ±0, ,00 FH ,10 0,025 ±0, ,20 FH ,02 0,013 ±0, ,0 FH ,40 0,020 ±0, ,00 FH ,50 0,050 ±0, ,00 FH ,50 0,002 ±0, ,98 FH ,60 0,014 ±0, ,20 FH ,30 0,012 ±0, ,2 FH ,7 0,002 ±0, ,3 FH ,4 0,002 ±0, ,8 FH ,2 0,002 ±0, ,5 FH ,4 0,022 ±0, ,8 FH ,6 0,041 ±0, ,02 FH ,24 0,001 ±0, ,5 FH ,3 0,002 ±0, ,2 94

110 Formüllerin Partikül Büyüklüğü ve Dağılımı Analizleri Bölüm de anlatıldığı şekilde mikrokürelerin ortalama partikül büyüklüğü dağılımları lazer kırınım yöntemiyle saptanmıştır. Elde edilen veriler Şekil 3.11, Şekil 3.12, Şekil 3.13, Şekil 3.14, Şekil 3.15, Şekil 3.16, Şekil 3.17, Şekil 3.18, Şekil 3.19, Şekil 3.20 ve Tablo 3.12 de yer almaktadır. Tablo 3.12.Formülasyon değişkenlerinin partikül büyüklüğü dağılımı üzerine etkileri Formüller Formülasyon Değişkenleri Mukayese Formülü Partikül Büyüklüğü Saptanan Formül Ortalama Geometrik Çap (µm) FH1 814,14 1,23 Dağılımın Geometrik Standart Sapması Etkin madde oranı FH1 (%50 Etkin madde) Polimer tipi FH1 (%1 HM w) Polimer kons. FH1 (%1 HM w) FH13 (%75 Etkin madde) FM1, FL1 (%1HM w, %1HL w ) 1065,35 1,35 944,5; 1476,23 1,42 1,34 FH7 (%1.5 HM w) 803,38 1,26 Asetik asit oranı İç : dış faz oranı TPP kons Dış faza eklenen Na-aljinat oranı FH1 (%1As. Ac) FH1 (10:100) FH1 (%1 TPP) FH1 (yok) FH9 (%3 As. Ac) 875,80 1,29 FH11 (10:300) 785,05 1,20 FH17 (%5 TPP) 780,16 0,76 FH14 (%0.5Na-aljinat 763,96 0,94 Dış faza eklenen Na-aljinat :pektin oranı FH1 (yok) FH15 (%0.5Na-aljinat :pektin) 823,98 1,28 95

111 Şekil FL1 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı Şekil FM1 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 96

112 Şekil FH1 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı Şekil FH7 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 97

113 Şekil FH9 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı Şekil FH11 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 98

114 Şekil FH13 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı Şekil FH14 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 99

115 Şekil FH15 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı Şekil FH17 formülasyonuna ait partikül büyüklüğü dağılımı 100

116 Formüllerin Yüzey Özelliklerinin İncelenmesi Metilprednisolonun farklı mikroküre formülasyonlarının, çözünme hızı öncesindeki şekilleri ve sonrasında uğradığı değişimler, Bölüm te anlatıldığı şekilde SEM ile inceleme sonucunda aydınlatılmaya çalışılmıştır. Sonuçlar Şekil 3.21., Şekil 3.22., Şekil ve Şekil te gösterilmiştir. 101

117 (a) (b) (c) (d) Şekil a) %50 oranında etkin madde içeren FH1 formülasyonu görüntüsü (x 100) b) FH1 formülasyonu yüzey görüntüsü (1) (x 1000) c) FH1 formülasyonu kesit görüntüsü (1)(x 1000) d) FH1 formülasyonu kesit görüntüsü (2) (x 100) 102

118 (a) (b) (c) Şekil a) FH1 formülasyonunun 70. saatte salım sonrası görüntüsü (x 100) b) FH1 formülasyonu 70. saatte salım sonrası yüzey görüntüsü (x 1000) c) FH1 formülasyonu 70. saatte salım sonrası kesit görüntüsü (x 100) 103

119 (a) (b) (c) Şekil a) FH1 formülasyonu 170. saatte salım sonrası görüntüsü (x 100) b) FH1 formülasyonu 170. saatte salım sonrası yüzey görüntüsü (x 1000) c) FH1 formülasyonu 170. saatte salım sonrası kesit görüntüsü (x 100) 104

120 (a) (b) (c) (d) Şekil a) %50 oranında etkin madde içeren ve dış faza %0,5 Na- aljinat eklenmiş FH14 formülasyonu görüntüsü (x 100) b) FH14 formülasyonu yüzey görüntüsü (x 1000) c) FH14 formülasyonu dış çeper görüntüsü (x 1000) d) FH14 formülasyonu kesit görüntüsü (x 100) 105