ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Yusuf UYSAL TIBBİ MANTAR Ganoderma lucidum UN ANTİKOLESTEROLEMİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2006

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MANTAR Ganoderma lucidum UN ANTİKOLESTEROLEMİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Yusuf UYSAL YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez Edilmiştir. / /2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul İmza.. İmza... İmza Prof. Dr. Burhan ARIKAN Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Doç. Dr. Gökhan CORAL DANIŞMAN ÜYE ÜYE İmza İmza... Doç Dr. Hatice GÜVENMEZ ÜYE Yrd. Doç. Dr. Nisa ÜNALDI CORAL ÜYE Bu Tez Enstitümüzün Biyoloji Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu Tarafından Desteklenmiştir Proje No:FEF2004YL56 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve sanat eserleri kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ TIBBİ MANTAR Ganoderma lucidum UN ANTİKOLESTEROLEMİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Yusuf UYSAL ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Burhan ARIKAN Yıl : 2006, Sayfa: 55 Jüri : Prof. Dr. Burhan ARIKAN Jüri : Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Jüri : Doç. Dr. Gökhan CORAL Jüri: Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ Jüri: Yrd. Doç. Dr. Nisa ÜNALDI CORAL Bu çalışmada, tıbbi bir mantar olan Ganoderma lucidum un kolesterol düşürücü özelliği araştırılmıştır. Deney hayvanı olarak, dişi sıçanlar (Vistar albino) ve erkek tavşanlar (Oryctologus cuniculus L.) kullanılmıştır. Deney hayvanları dört hafta süre ile % 10 oranında yağ içeren kolesterol yükseltici besinle beslenmiştir. Besleme işlemlerine dört hafta süre ile, içerisinde % 5 oranında mantar meyvesi ve % 10 oranında yağ bulunan besinle devam edilmiştir. Beslemenin gerçekleştirildiği süre içersinde belirli aralıklarla hayvanların ağırlıkları tartılmış ve kan örnekleri alınarak, toplam kolesterol değerleri ölçülmüştür. Ölçümler sonucunda toplam kolesterol miktarında besleme süresindeki artışa paralel olarak, sıçanlarda ortalama %41,35 oranında artış, tavşanlarda ise %52,94 oranında düşüş gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, Ganoderma lucidum un kullanım süresine bağlı olarak toplam kolesterol düzeyinde düşüşe neden olduğu ve bu amaçla kullanılmasının uygun olabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Ganoderma lucidum, tıbbi mantar, kolesterol, sıçan, tavşan. I

4 ABSTRACT MSc THESIS THE RESEARCH OF ANTICHOLESTEROLEMIC EFFECT OF MEDICINAL MUSHROOM Ganoderma lucidum Yusuf UYSAL DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Year: 2006 Page: 55 Jury: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Jury: Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Jury: Doç. Dr. Gökhan CORAL Jury: Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ Jury: Yrd. Doç. Dr. Nisa ÜNALDI CORAL In this study, we studied cholesterol lowering properties of medicinal mushroom Ganoderma lucidum (G. lucidum). We used female rats (Wistar albino) and male rabbits (Oryctologus cuniculus L.) for experimental studies. The animals were fed hypercholesterolmic diet that include %10 fat for four weeks. Then, animals were fed with experimental diet which include %5 G. lucidum basidiocarp and %10 fat for four week. During the feding procedure, animals blood samples were taken and plasma total cholesterol were analyzed with enzymatic kits and their weights were weighed. This analyzes showed that total cholesterol percentage increased by %41,35 in rats, on the other hand, rabbits total cholesterol decreased by %52,94. According to the results, G. lucidum decreased total cholesterol. As a result, G. lucidum could be used for cholesterol lowering agent. Key Words: Ganderma lucidum, medicinal mushroom, cholesterol, rat, rabbit. II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarım sırasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Prof. Dr. Burhan ARIKAN a ve Prof. Dr. Ömer ÇOLAK hocalarıma, deneysel çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan Veteriner Dr. Y. Kenan DAĞLIOĞLU hocama teşekkürlerimi bir borç bilirim. Yine çalışmalarım esnasında bana yardım eden araştırma görevlisi hocalarım ile tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim. Her zaman yanımda olan ve desteklerini esirgemeyen annem, babam ve ablalarıma ne kadar teşekkür etsem azdır. III

6 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Sıçan Diyeti...24 Çizelge 3.2. Tavşan Diyeti...25 Çizelge 4.3. Normal besin, Mantar+Kolesterol ve Kolesterol içeren besinle beslenen sıçanlarda 30, 45, 66 ve 79 gün sonunda yapılan toplam ağırlık ve kolesterol miktarları...31 Çizelge 4.4. Mantar+Kolesterol ve Kolesterol içeren besinle beslenen tavşanlarda 34, 47 ve 60 gün sonunda yapılan toplam ağırlık ve kolesterol miktarları IV

7 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Kolesterolün Biyosentezi ve Moleküler Yapısı...12 Şekil 3.1. Sıçanların beslendiği kafesler ve deney ortamı...29 Şekil 3.2. Tavşanların beslendiği kafesler ve deney ortamı...29 Şekil 3.3. Deneyde kullanılan sıçanlar...30 Şekil 3.4. Deneyde kullanılan Kontrol Grubu tavşanlardan biri...30 Şekil 4.5. Normal diyetle beslenen sıçanlarda kolesterol değişimi...32 Şekil 4.6. Mantar+kolesterol içeren besinle beslenen sıçanlarda kolesterol değişimi.33 Şekil 4.7. Kolesterol içeren besinle beslenen sıçanlarda kolesterol değişimi...34 Şekil 4.8. TK1 tavşanından elde edilen kolesterol değerleri...36 Şekil 4.9. TK2 tavşanından elde edilen kolesterol değerleri...37 Şekil TK3 tavşanından elde edilen kolesterol değerleri...38 Şekil TD1 tavşanından elde edilen kolesterol değerleri...39 Şekil TD2 tavşanından elde edilen kolesterol değerleri...39 Şekil TD3 tavşanından elde edilen kolesterol değerleri...40 V

8 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ..I ABSTRACT.II TEŞEKKÜR III ÇİZELGELER DİZİNİ...IV ŞEKİLLER DİZİNİ...V 1. GİRİŞ Ganoderma lucidum un Geleneksel Kullanımı Ganoderma lucidum un Biyolojik Bileşenleri Triterpenler ve Triterpenoidler Acı Tadı Olan Maddeler (Bitterness) Sitotoksisite Antihipertansiyon Hepatoprotektif Aktivite Anti-HIV Özelliği Kan Şekerini Düşürücü (Hipoglisemik) Etkileri Steroidler Kolesterol Nedir İyi Ve Kötü Kolesterol Yüksek Kolesterol Kolesterolün Önemi Vücuda Verdiği Zararlar Tedavide Temel Prensipler İlaçsız Tedavi Kanın Pıhtılaşmasını Azaltan Makro Mantarlar Arter Kan Basıncını Düşürücü Etkisi Olan Makro Mantarlar Lipit Ve Kolesterol Üzerine Etkili Makro Mantarlar Ganoderma lucidum un Tıbbi Etkileri ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD...22 VI

9 3.1. Materyal Ganoderma lucidum un İzolasyonu Ganoderma lucidum un Gelişme Parametreleri Deney Hayvanları Beslemede Kullanılan Sıçan Yeminin İçeriği Beslenmede Kullanılan Sıçan Yeminin İçeriği Metod Kolesterol Tayini Enzimatik Olmayan Metodlar Libermann Burchard Metodu Zak Metodu (Deproteinizasyonlu kolorimetrik metod) Enzimatik Metod BULGULAR TARTIŞMA VE SONUÇ...41 KAYNAKLAR...46 ÖZGEÇMİŞ...55 VII

10 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL 1.GİRİŞ 2000 yıldan daha uzun zamandır bilinmekte olan Ganoderma lucidum (Reishi, Ling Zhi), (P. Karst.) Çin de ölümsüzlük bitkisi olarak anılmaktadır. Japon ve Çin kültüründe önemli bir yere sahip olan bu mantarın pek çok ismi bulunmaktadır. Japonlar Reishi yada Mannentake (10000 yıl mantarı), Çinliler ve Koreliler Ling Zhi veya Ling Chi (Ölümsüzlük Mantarı yada Ölümsüzlük Bitkisi) şeklinde adlandırmaktadırlar. Ganoderma lucidum, Aphyllophorales ordosunun, Polyporaceae (Ganodermataceae) familyasına ait, Bacidiomycetes sınıfında yer alan bir türdür. Latince de lucidus parlak yada göz alıcı anlamındadır. Son yıllarda sadece Çin ve Japonya da değil Kuzey Amerika ve Dünyanın diğer bölgelerinde de tıbbi yararlarının kavranması nedeniyle, Ganoderma lucidum un mantar meyvesi (basidiocarp) çok popüler olarak üretilmektedir. Ganoderma lucidum (G. lucidum), başta meşe olmak üzere sert odunlu, geniş yapraklı ağaçlarda ve bu ağaçların talaş ortamlarında rahatça üremektedir. Daha çok ılıman bölge mantarıdır. Şapka çapı 5 20 cm olan G. lucidum un nemli iken çok parlak bir yüzeyi vardır. Şapka rengi donuk kırmızıdan kırmızı kahverengine, bazen de siyaha yakın olabilmektedir. Porların bulunduğu alt yüzey beyazdır. Fakat dokunularak tahriş edildiğinde kahverengi, bazen siyah olabilir. Sap kısmı beyazdan sarıya, daha sonra kahverengine değişen renkli, yaklaşık 10 cm uzunluğa sahip eksentrik konumlu bir yapıdadır. G. lucidum yıllık bir mantardır. Özellikle ölmüş ya da ölmekte olan sert odunlu ağaçlar ile kesilmiş ağaç kütüklerinde geliştiklerinden, Phytophapathogenic mantar olarak da tanımlanmaktadır. Asya nın tropik ve subtropik bölgelerinde yaygın şekilde rastlanmaktadır. Sporları kırmızı - kahverengi çift duvarlı, bir ucu yumurta gibi küt, 9 12 mikron eninde ve mikron boyunda büyüklüğe sahiptir (Stamets, 2000). Ticari olarak da üretilen G. lucidum un açık arazide üretilmesi özellikle Asya da çok yaygındır. Bu uygulamada odun kütüklerinin aşılanmasından sonra en 1

11 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL erken 6 ay, genellikle 1 2 yılda ürün alınabilmekte ve dört - beş yıl ürün elde edilebilmektedir (Hengshan ve ark., 1991). Tıbbi yönden çok değerli olan mantarların ve özellikle G. lucidum un, son yıllarda kolesterol düşürücü özellikleri ile ilgili çalışmalar yapılmaktadır (Kabir ve ark., 1988, Li ve ark., 1989). Bu mantarlar arasında Pleurotus ostreatus (oyster (istiridye) mantarı), Volvariella volvacea (straw (saman) mantarı), Agaricus bisporus, A. campestris, Auricularia auricula, Tremella fuciformis, Grifola frondosa, Lentinus erodes ve Polyporus confluens sayılabilir (Berger ve ark., 2004). Ganodermataceae familyasinin en önemli tıbbi mantarı olan G. lucidum un anti kolesterolemik etkisinin yanı sıra, anti tümör, anti enflamatuar (iltihap reaksiyonunu engelleyici), anti platelet aggregation (trombosit kümelenmesini engelleyici) gibi pek çok faydalı özelliklerinden dolayı, üzerinde çeşitli çalışmalar yapılmaktadır (Tao ve Feng, 1990, Shiao, 2003). Ayrıca, anti-allerjen, antioksidant, analjezik, antifungal, antiviral, antiparazitik, antidiyabetik, immunomodulatör, hepatoprotektif, hipotensive ve hipertensive, seksüel gücü artırıcı, kan basıncını ve şekerini düşürücü özelliklerini de saymak mümkündür. Kaneda ve Tokuda (1966), Lentinus erodes, Auricularia polytricha, Flammulina velutipes ve Agaricus bisporus mantarlarının sap ve baş kısımlarından (meyve) ether, su ve ethanol ile extraksiyon yaparak, kolesterol azaltıcı özellikleri çalışmışlardır. Bu çalışmaların büyük çoğunluğu sıçanlar üzerinde yapılmıştır. Cordiseps cinensis in kolesterol azaltıcı etkisi insanlarda da denenmiştir (Shao, 1985). G. lucidum un biyolojik etki spektrumundaki genişlik yapısında bulunan alkoloidler, aminoasitler, peptitler, inorganik elementler, steroidler, yağ asitleri ve organik asitlerin çeşitliliğine bağlanabilir. En önemli bileşenleri, önemli farmakolojik etkiler göstermelerinden dolayı, triterpenler ve polisakkaridlerdir. Geçen 30 yıl boyunca, 150 den fazla triterpen (Kim ve Kim, 2002) ve 50 den fazla karsinostatik polisakkarit (Jong ve Birmingham, 1992) G. lucidum dan izole edilmiş ve etkileri araştırılmıştır. G. lucidum dan elde edilen değişik triterpen ve polisakkaritler ile 2

12 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL bunların kombinasyonundan oluşmuş ürünlerin daha iyi sonuç verdikleri bulunmuştur (Leung ve ark., 2002). G. lucidum un, kolesterol düşürücü bileşenleri henüz yeterince aydınlığa kavuşturulamamıştır. Fakat, ganoderan tipi glukanlar (Chen ve Miles, 1996, Hikino ve ark., 1989, Bao ve ark., 2001), hetero-β-glukanlar, glukan-protein kompleksleri (sikloglukanlar, uronik asid-β-glukanlar), lektinler (Wasser ve Weis, 1999), terpenoid triterpenler (Zhu ve ark., 1999, Lu ve ark., 2002), ergostan steroller (Ma ve ark., 2002), okside olmuş yüksek ganoderik asitler ve lanostanoid triterpenler (Luo ve ark., 2002, Ha ve ark., 2000) kolesterolün düşmesinde etkili olabilirler. G. lucidium un fibröz kompenentleri, lipofilik komponentlerin kolesterol sentezine etkili oldukları gibi safra asitlerinin dönüşümüne ve kolesterol absorbsiyonuna etkili olabilirler (Berger ve ark., 2004). Kolesterol biyosentezi beş aşamada gerçekleşmektedir. Birinci evre, asetil- KoA dan altı karbonlu bir bileşik olan mevalonatın sentezlenmesi. İkinci evre, mevalonattan CO 2 yitirilmesiyle izopronoidlerin oluşturulması. Üçüncü evre, altı tane izoprenoid biriminin kondasyasyona uğrayarak skualen i oluşturması. Dördüncü aşama skualenden lanosterolün meydana gelmesi. Son aşama, lanosteroldeki üç metil grubunun molekülden uzaklaştırılarak kolesterol oluşturulmasıdır (Murray ve ark., 1996). G. lucidum, kolesterol sentezinin 3-hidroksi-3-metilgluteril koenzim A redüktaz (HMG-CoA redüktaz) rate-limiting basamağında veya lanosterol 14-α-metil demetilaz (P-45014DM) basamağından sonra, lanosterol kolesterol dönüşümünde etkili olabilir (Walker ve ark., 1993, Frye ve Leonard, 1999). G. lucidum dışındaki mantar türlerinde ve primatlarda, fungal metabolitlerin zaragozik asit üzerinden skualen sentetazı inhibe ettiği bildirilmiştir (Bergstorm ve ark., 1995). G. lucidum, tüm Dünyada sağlık sıvısı olarak bilinmekte ve günlük diyetlere eklenerek kullanılmaktadır (Chang ve Mshigeni, 2001). Milyonlarca insan 3

13 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL her gün enerjilerini artırmak, hazımlarını kolaylaştırmak ve daha iyi uyku için bu mantarı kullanmaktadırlar. Kardiyovasküler sistem hastalıklarında ve immün sistemin dengelenmesi ve güçlendirilmesi ile bu hastalıklardan korunmada G. lucidum kullanılır. Shan Nong Ben Caojing (M. S. 25, 250 arası, Doğu Han Hanedanlığı) ve Li Shi-Zhen tarafından yazılan Ben Cao Gang Mu (M. S. 1590, Ming Hanedanlığı), adını taşıyan iki ünlü Çin Bitkisel Tıp kitabına göre, o yıllarda Çin de 6 farklı G. lucidum türü bulunmaktaydı. Oysa bugün, 90 dan fazla tür bilinmektedir (Zhao ve Zhang, 1994). Tüm Dünyada 250 den fazla Ganoderma türü tanımlanmıştır (Buchanan ve ark., 1995, Ryvarden, 1994). Bununla birlikte, terapotik uygulamalar ve literatür araştırmalarında, genellikle Ling Zhi, G. lucidum türü olarak tanımlanmaktadır. Tıbbi çalışmalar ve terapotik uygulamalarda G. lucidum, diğer mantar türlerine kıyasla çok daha değerlidir. Gerçekten de, tüm kitaplar, sempozyumlar ve tedavi amaçlı uygulamalar G. lucidum üzerine yoğunlaşmıştır. Daha da ilginci, eski zamanlar da Çinde yaşayanların sağlık, uzun hayat ve sonsuz gençlik vermesi için Reishi Tanrısı na (Reishi Senshi) tapındıklarından bahsedilmektedir (Berger ve ark., 2004) Ganoderma lucidum un Geleneksel Kullanımı Geleneksel Çin Tıbbında, ister diğer tıbbi bitkilerle birlikte, isterse tek başına kullanılsın, Ling Zhi nin önemli bir yeri vardır. Zihinsel kapasiteyi ve hafızayı geliştirmesi, çevikliği arttırması, yaşamı uzatması, karaciğer hastalıkları, nefritler, hiperlipemiya, artrit, astım, gastrik ülser, arteriyosiklerosis, lökopeniya, diyabet ve anoreksiya gibi tedavisi ve iyileştirilmesinde geleneksel tıpta çok kullanılmaktadır (Chang ve But, 1998, Jong ve Birmingham, 1992). Günümüz çağdaş Çin tıbbın da, G.lucidium (Chang ve Busswell, 1996) tıbbi mantarı, nevrastemi (sinir bozukluğu), uzun süren hastalıkların verdiği yorgunluğun iyileştirilmesi, insomnia (uykusuzluk), anoreksia, dizziness (baş dönmesi), kronik hepatit, hiperkolesterolemia (yüksek kolesterol), mantar zehirlenmesi, koroner kalp rahatsızlıkları, hipertansiyon, altitude 4

14 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL sickness (dağ hastalığı), karsinoma (kötü huylu tümörler) gibi hastalıkların tedavisinde ve kolesterol sentezinin inhibe edilmesi gibi durumlarda kullanılmaktadır (Kim ve ark., 2000). Çin de, halk arasında Ganoderma, her türlü hastalığın tedavisinde, her derde deva olarak bilinmektedir (Liu, 1999). Tüm eski Çin tıp kaynakların da, uzun süre yüksek dozda kullanıldığı zaman bile toksik ve yan etkilerinin olmayışından dolayı, en değerli mantar olarak bahsedilmektedir. Doğu geleneğinde Ganoderma dan tıbbi mantar, diğer mantarlardan ise sağlıklı gıda olarak bahsedilmektedir. Gerçekten de G. lucidum, yenilebilen mantarlar sınıfına dahil edilmemektedir. Çünkü mantarın meyvesi kalın, katı ve sert olup, Agaricus bisporus ve Lentinulla edodes gibi yenebilen mantarların karakteristik özelliği olan etli yapıda değildir. Bununla birlikte, misel ürünleri ya da mantar meyvesinin ekstrakları, yiyecek veya içeceklere karıştırılarak kullanılabilir ve daha sonra sağlık içeceği veya sağlık gıdası olarak satılabilir. Genellikle, geleneksel ilaçların yalnız tek aktif madde içerdiği ve bu tek bileşenin çeşitli hastalar üzerinde klinik denemelerde ve kapsamlı hayvan çalışmalarında etkili ve güvenli olarak denendiği bilinmektedir. Buna karşılık, Ganoderma ürünlerinin, yeterli farmakolojik gereksinimler ve ilaç kontrol yasalarını karşılamaması nedeniyle bu konuda güçlükler bulunmakta olup, bu durum üreticileri endişelendirmektedir. Bununla beraber, mantarın farmakolojik özelliklerini tanımlamak için yapılan hayvan denemeleri ve kullananlardaki gözlemler, Ganderma nın bazı bileşenlerinin önemli biyoaktiviteye sahip olduğunu açıkça ortaya koymaktadır. İnsanların immün sistemlerini güçlendirmek için alkol ekstraktları (triterpenler) ve sıcak su ekstraktları (polisakkaritler) ile ekstrakte edilebilen biyoaktif bileşenleri diyet katkıları veya besleyiciler olarak, özellikle kullanılmaktadır. Ekstrakte edilebilen Ganoderma ürünlerinden nütrisötikler, farmasotiklerden daha kolay elde edilebilmektedirler. Ganoderma nın yan etkilerinin ve belirgin zehirleyici etkilerinin olmadığının defalarca belirtilmesi ise en dikkat çekici olanıdır. 5

15 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL 1.2. Ganoderma lucidum un Biyolojik Bileşenleri Modern analitik tekniklerle yapılan son araştırmalar ve uygulamalar, daha önceki bilimsel olmayan gözlemleri doğrulamakta olup, Ganoderma nın çeşitli hastalıklara farklı yararlarının ve önemli tıbbi etkilerinin olduğunu göstermektedir. Ling Zhi, yapısında bulunan önemli biyoaktif bileşenler sayesinde tıbbi etkisini göstermektedir. Medikal etkileri ve etkinlik spektrumunun genişliği, Ling Zhi nin çok geniş biyoaktif bileşenleri içermiş olmasına da bağlanabilir. Biyoaktif proteinlerine, nükleik asitler ve diğer maddelere rağmen belirgin farmakolojik aktivitelere sahip en önemli bileşenleri polisakkaritler ve triterpenlerdir (Lindequist, 1995). G. lucidum un miselinden ve basidiokarpından 50 den fazla karsinostatik polisakkarit izole edilmiştir (Jong ve Birmingham, 1992). Ganoderma lucidum a ait çok sayıda polisakkarit sıcak su ekstraktı, amonyum oksalat solüsyonu, alkali solüsyon, dimetil sülfat solüsyonu ve süper kritik CO 2 ile ekstrakte edilmiştir. Çeşitli kromatografik metodlar kullanılarak bileşenler birbirinden ayrılabilmişlerdir. Son zamanlarda, % 82,8 i karbonhidrat, %17,2 si protein olan, G. lucidum un sıvı misel kültüründen elde edilen bir glikoproteinin, kobayın (mice) yüzme kapasitesinin artmasına neden olduğu gösterilmiştir. Bununla beraber, mantarın miseli ve meyvesi yüzme kapasitesine pozitif etki yapmamışlardır (Yang ve ark., 2001). Polisakkaritlerin anti kanser ve anti tümör etkileri, bu bileşenlerin sitosidal etkilerinden ziyade konağın immün sistemini geliştirerek gerçekleşmektedir (Chen ve ark., 1995, Lieu ve ark., 1992, Wang ve ark., 1997, Zhu ve Mori, 1993). G. lucidum, G. tsugae ve diğer mantarlardan izole edilmiş olan fungal immünomodülatör proteinler (FIPs) özellikle ilginç bir gruptur. Aminoasit sequensleri ve immünolojik etkilerindeki benzerliklerinden dolayı, FIPs proteinleri farklı bir grup içerisinde sınıflandırılmışlardır (Kino ve ark., 1998, Ko ve ark., 1995, Ko ve ark., 1997). 6

16 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL Triterpenler ve Triterpenoidler Kubato ve arkadaşları Ganoderma mantarından, ilk olarak triterpen bileşenleri olan ganodermerik A ve B yi izole etmişlerdir (1982). Daha sonra, Ganoderma da bulunan 150 den fazla lanostan tipi triterpenoidin fizikokimyasal özellikleri tanımlanarak yapısal, biyolojik ve tıbbi aktivitelerine göre 10 gruba ayrılmışlardır (Kim ve Kim, 2002). Bu bileşenler mantarın meyvesinden, sporlarından ve mümkün oldukça misellerinden izole edilmişlerdir. Kimyasal yapıları lanosterol özelliktedir. Lanosterol, hayvanlar ve mikroorganizmalarda, triterpenler ve steroidler için biyosentetik yapımda önemli bir ara bileşendir. Triterpenler, sitotoksik, hepatoprotektiv ve hipolipidemik özelliklere sahip bileşiklerdir. Farklı triterpenler, farklı biyoaktif özellikler gösterirler Acı Tadı Olan Maddeler (Bitterness) G. lucidum da diğer mantarlarda bulunmayan ve tadı acı olan maddeler vardır. Bu maddeler üretim şartlarına, kullanılan cinse, üretimin yapıldığı ortama vb. farklı koşullara bağlı olarak değişim göstermektedir. Mantarın sap bölgesinde pilusundan daha keskin tatlı maddelerin olması çok ilginçtir. Bununla beraber, bazı tadı acı olan maddeler, misel kültürlerinde veya sıvı kültürlerde bulunmamaktadır. Bu acı maddelerin hiç birinin farmakolojik etkileri saptanamamış olmasına rağmen, farmakolojik değişimler ve kimyasal kalite yönünden, belirleyici madde olarak etkileri önemlidir. Bazı müşteriler, örneğin Koreliler, mantar satın alırken Ganoderma nın bitterness ürünleri ile ilgilenirler. Mantar, meyve evresi boyunca, bu maddeleri üretir. Bu maddeler; ganoderik asitler A, C, I ve J, lucidenik asitler A, D ve I ile lucidenaz A ve C gibi triterpenoidlerdir. Bu triterpenoidler iki şekilde sınıflandırılır; birincisi, C 30 tipi ganoderik asit diğeri C 27 tipi lucidenik asittir (Nishitoba, 1996). 7

17 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL Sitotoksisite Sitotoksik triterpenlerin anti kanser ajanı potansiyelleri vardır. Bu bileşenler misel ve mantar meyvesi ekstraktlarından izole edilmiştir. Hepatoma hücrelerinde, miselden elde edilen ganoderik asitler Z, Y, X, W, V ve T nin in vitro sitotoksik aktivitelerinin araştırıldığı ve mantar meyvesinden izole edilen çeşitli lanosteroidlerin in vitro uygulamalarda tümör hücrelerinin inhibisyonunda etki gösterdiği bildirilmektedir (Kim ve Kim, 2002) Antihipertansiyon Morigiwa ve arkadaşları (1996), ganoderik asit F nin en güçlü hipertansiyon aktivitesine sahip olduğunu ve ganoderik asitler B, D, H ve Y gibi diğer terpenoidlerin daha az etkili olduğunu bulmuşlardır Hepatoprotektif Aktivite Geleneksel Çin tıbbında, G. lucidum un mantar meyvesi kronik hepatitlerin tedavisinde kullanılmaktadır. Hirotani ve arkadaşları (1986), misel kültüründen elde ettikleri ganoderik asit R ve S nin, sıçan hepatosit kültürlerinin galaktozamin indükleme sitotoksik testlerinde güçlü antihepatoksik etki gösterdiklerini bulmuşlardır. Bir başka hepatoprotekitf bileşen olan ganosporik asit A, Chen ve Yu (1991, 1999) tarafından mantarın sporlarının ether solüsyonlarından izole edilmişlerdir Anti HIV Özelliği G. lucidum un su ekstraktının anti HIV aktivitesinin olduğu bildirilmiştir (Hattori ve ark.,1997, Kim ve ark., 1997). el-mekkawy ve arkadaşları (1998) Anti HIV bileşenlerini izole ederek bunların ganoderiol F ve ganodermanontriol olduğunu 8

18 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL saptamışlardır. Min ve arkadaşları (1998) anti HIV bileşenlerini ganoderik asit β, ganodermanondiol, ganodermanontriol, ganolucidik asit A ve lucidimol B olarak tanımlamışlardır Kan Şekerini Düşürücü (Hipoglisemik) Etkileri G. lucidum un meyvesinden izole edilen ganoderan A, B ve C gibi çeşitli triterpenlerin, etkili hipoglisemik etkiye sahip oldukları gösterilmiştir (Hikino ve ark., 1985). Diyabette kullanılan ilaçların yan etkileri Ganoderma nın kullanılmasıyla azaltılabilir. Diyabet hastalarının birçok ciddi rahatsızlığa yakalanma korkuları vardır. Bu hastalıklar arasında kroner arter rahatsızlıkları, immün sistem zayıflığı, hipertansiyon, göz rahatsızlıkları vb. sayılabilir. G. lucidum da bulunan kimyasal bileşenlerinin en önemli özellikleri diyabet hastalarının şikayetlerini hafifletme ve bu hastalıklardan korumalarıdır Steroidler G. lucidum steroidlerin çoğunu içermektedir. Steroidler, ergosterol ve kolesterol olmak üzere iki gruba ayrılmaktadırlar. G. lucidum dan yaklaşık 20 farklı steroid izole edilmiştir (Ha ve ark., 2000, Ma ve ark., 2002). Bu steroidler, G. lucidum un anti-atherosiklerotik ve lipit düşürücü etkilerinin sebebi olarak gösterilmektedir Kolesterol Nedir? Kolesterol, yaşam için gerekli olan mum kıvamında yağımsı bir maddedir. Kolesterol, beyin, sinirler, kalp, bağırsaklar, kaslar ve karaciğer başta olmak üzere tüm vücutta yaygın olarak bulunur. Vücut kolesterolü kullanarak hormon (kortizon, seks hormonu), D vitamini ve yağları sindiren safra asitlerini üretir. Bu işlemler için kanda çok az miktarda kolesterol bulunması yeterlidir. 9

19 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL Eğer kanda fazla miktarda kolesterol varsa, kan damarlarında birikerek kan damarlarının sertleşmesi ve daralmasına (arteriyoskleroz) yol açar. Arteriyosklerozda damar duvarında biriken tek madde kolesterol değildir. Akyuvarlar, kan pıhtısı, kalsiyum vb. gibi maddeler de birikir. Damarlar tüm vücutta yaygın olarak bulunur ve kalp, beyin, böbrek gibi organlara kan taşıyarak bu organların görev yapmasını sağlar. Kolesterol, hangi organın damarında birikirse o organa ait hastalıklar ortaya çıkar. Örneğin, kalbi besleyen atardamarlarda kolesterol birikimi olursa, göğüs ağrısı ve kalp krizi gibi sorunlar oluşur. Böbrek damarlarında kolesterol birikimi ise, yüksek tansiyon ve böbrek yetmezliğine yol açabilir (TKD, 1998) İyi Ve Kötü Kolesterol Kolesterol, yağımsı bir maddedir. Normal koşullarda, yağ suyun içinde çözünmez. Kolesterol de su özelliklerini taşıyan kanda normal koşullarda çözünmez. Kolesterol, kanda çözünmesi ve taşınması için karaciğerde bir protein ile birleştirilir. Bu kolesterol ile protein birleşimine lipoprotein adı verilir. Değişik tipte lipoproteinler vardır: LDL (Low Density Lipoprotein, düşük yoğunluklu lipoprotein): Kötü huylu kolesteroldür. HDL (High Density Lipoprotein, yüksek yoğunluklu lipoprotein): İyi huylu kolesteroldür. VLDL, LDL ve şilomikronlar. Yağ metabolizması bozukluğu olan hastaların yaptırdığı diğer bir kan incelemesi de trigliserid ölçümüdür. Trigliserid de kolesterol gibi kanda çözünen bir yağdır. Kan trigliserid düzeyi ile arteriyoskleroz arasındaki ilişki, kolesterol kadar belirgin değildir (TKD, 1998). 10

20 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL Yüksek Kolesterol Kanda kolesterol ve LDL-kolesterolün yüksek olması, hasta için risk taşımaktadır. HDL kolesterolün düşük olması da bir risktir. Bu riske sahip hastalarda, kalp krizi, felç, damar tıkanması, böbrek yetmezliği gibi hastalıkların ortaya çıkma olasılığı daha fazladır. 20 Yaş Üzerinde Kan Kolesterol Düzeyi; < 200 mg/dl ; İstenilen Düzey mg/dl arası ; Sınırda Yüksek > 240 mg/dl ; Yüksek 20 Yaş Üzerinde Kan LDL-Kolesterol Düzeyi; < 130 mg/dl ; İstenilen Düzey mg/dl arası ; Sınırda Yüksek > 160 mg/dl ; Yüksek 20 Yaş Üzerinde Kan HDL-Kolesterol Düzeyi; < 35 mg/dl ; Düşük mg/dl ; İstenilen Düzey >65 mg/dl ; İdeal Düzey Kolesterol > 200 mg/dl veya LDL-kolesterol > 130 mg/dl veya HDLkolesterol < 35 mg/dl ise risk yüksektir. Kanda kolesterolün yüksek olması, yağ metabolizması bozukluğunu göstermektedir. Yağ metabolizması bozukluğundan şüphe edilen bir hastada yapılması gereken işlem, kan alınarak öncelikle kolesterol, LDL-kolesterol, HDLkolesterol ve trigliserid düzeyinin ölçülmesidir. Tedaviye karar vermeden önce, bu değerler en az 2 kere ölçülmelidir. Tedavi düzenlenirken öncelikle LDL-kolesterol düzeyleri temel alınmalıdır (TKD, 1998). 11

21 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL Şekil 1.1: Kolesterolün Biyosentezi ve Moleküler Yapısı 12

22 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL Kolesterolün Önemi Kalp ve damar hastalıkları, Türkiye'de ve diğer ülkelerde ölümlere ve kalıcı sakatlıklara yol açan yaygın sorunlardır. Türkiye de, 6 milyon kişide kan kolesterol düzeyi sınırda yüksek ( mg/dl) ve 2 milyon kişide yüksektir (240 mg/dl ve üstü). Gelişmiş ülkelerde ölüm nedenleri arasında, kalp ve damar hastalıkları ilk sırada olup, yüksek kolesterol, yüksek tansiyon, şişmanlık gibi sorunların düzeltilmesi ile bu ölümler önlenebilir veya geciktirilebilir. Bu nedenle, Dünya Sağlık Örgütü, kalp ve damar hastalıklarını bir numaralı insanlık düşmanı ilan etmiştir. Kalp ve damar hastalıklarını kolaylaştıran faktörlere, kardiyovasküler risk faktörleri adı verilir. Kanda, kolesterol ve LDL-kolesterolün yüksek olması, hasta için risktir ve kolesterol yüksekliği kardiyovasküler risk faktörüdür. HDLkolesterolün düşük olması da bir risktir. Bu riske sahip hastalarda, kalp krizi, felç, damar tıkanması, böbrek yetmezliği gibi hastalıkların ortaya çıkma olasılığı daha fazladır (TKD, 1998) Vücuda Verdiği Zararlar Kanda aşırı miktarda bulunan kolesterol, yavaş yavaş (yıllar içinde) damarların duvarında birikir. Bu birikim sonucu damarlarda daralma, tıkanma ortaya çıkar. Bu durum, bir su borusunda pisliklerin birikmesine benzetilebilir. Kolesterol hangi damarda birikmişse o damarla ilişkili sorunlar ve hastalıklar ortaya çıkar. Kolesterol yüksekliğinde belirti ve bulgular, çoğu zaman ani kolesterol yükselmesine bağlı değildir, uzun süreli kolesterol yüksekliğinin damar duvarında kolesterol birikmesine yol açmasının sonucudur. Yani kolesterolünüz şu andaki değerinin 2-3 katına yükselse ve 3-4 saat yüksek kalsa size bir zararı olmaz. Asıl sorun, sizde daha önce uzun süreli kolesterol yüksekliği olmasıdır. 13

23 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL Kalbi besleyen damarlarda kolesterol birikimi bu damarlarda tıkanma ve daralmanın sonucu göğüs ağrısı, kalp krizi ve kalp yetmezliği gibi sorunlara neden olur. Bunların sonucu, hasta koroner by-pass ameliyatı (cerrahi olarak darlığın ortadan kaldırılması) veya anjiyoplasti (daralmış koroner arterin balonla genişletilmesi) işlemine ihtiyaç duyabilir. Beyini besleyen boyun damarlarında kolesterol birikimi olması, felçlere, konuşma bozukluklarına, dengesiz yürümeye, ve bilinç kaybına yol açar. Böbrek damarlarında kolesterol birikimi, yüksek tansiyon ve böbrek yetmezliğine yol açabilir. Ana atardamarda (aort) kolesterol birikimi de tehlikelidir. Buradan kopan kolesterol birikintileri, daha küçük damarları tıkayarak çok değişik sorunlara yol açabilirler. Bağırsağı besleyen damarları tıkayarak bağırsak ölümüne, göz damarlarını tıkayarak körlüğe, bacak damarlarını tıkayarak kangrene yol açabilirler. Kolesterol yüksekliğine bağlı sorunlar ortaya çıktığı zaman, hasta geç kalmış olabilir. Bu nedenle kolesterol yüksekliğini önlemek, yükselmişse düşürmek çok önemlidir (TKD, 1998) Tedavide Temel Prensipler Yüksek kolesterolün kontrol altına alınması ile yaşam süresinin uzadığı, kalp ve damar hastalıklarına bağlı ölümlerin azaldığı ve kalıcı sakatlıkların önlendiği kesin olarak gösterilmiştir. Kolesterol yüksekliğine ilaveten şişmanlık, yüksek tansiyon, şeker hastalığı, sigara gibi diğer kardiyovasküler risk faktörlerinin tedavisi de planlanmalıdır. Tedavi 2 aşamada gerçekleştirilir: 1. İlaç dışı tedavi 2. İlaç tedavisi 14

24 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL Her hasta için tedavi farklılıklar taşır. İlaç dışı tedaviler kesinlikle ihmal edilmemelidir. İlaç tedavisi, kesinlikle doktor denetiminde olmalıdır. Tedavide hedef belirlenirken LDL-kolesterol düzeyinin esas alınması tercih edilir. Hedef LDL-kolesterol düzeyi, hastada kalp ve damar hastalığının olup olmadığına göre değişir. Kişide kalp ve damar hastalığı yok ise, LDL-kolesterol düzeyinin 130 mg/dl nin altına düşürülmesi yeterlidir. Kişide kalp ve damar hastalığı varsa, hedef LDL-kolesterol düzeyini 100 mg/dl nin altına düşürmek olmalıdır olmalıdır. Yani kalp krizi geçirmişseniz, koroner arter daralmasına bağlı göğüs ağrınız varsa, koroner damar ameliyatı geçirmişseniz, koroner arterler balon ile genişletilmişse, beyine, böbreğe ve bacaklara giden damarlarda kolesterol birikimi varsa, hedef LDL-kolesterol düzeyi, 100 mg/dl nin altı olmalıdır (TKD, 1998) İlaçsız Tedavi İlaçsız tedaviler yaşam düzeninin değiştirilmesi olarak da isimlendirilir. Yüksek kolesterol tedavisinde en önemli konu, ilaçsız tedaviler olup, kesinlikle ihmal edilmemelidir. İlaçsız tedavilerde yapılan ihmal, kolesterol düşürmek amacı ile kullanılan ilaçların başarısını da azaltır. İlaçsız tedavilerin başında, beslenme alışkanlığının değiştirilmesi gelir. Sigara kesinlikle bırakılmalıdır. Sigara da kolesterol yüksekliği gibi bir kardiyovasküler risk faktörüdür. Sigara ayrıca akciğer kanseri, akciğer hastalığı, beyin kanaması ve birçok kansere de zemin hazırlar. Hastada yüksek tansiyon varsa, yüksek tansiyon tedavisinde geçerli olan ilaç dışı tedaviler ihmal edilmemelidir. Yüksek tansiyon ve kolesterol yüksekliğinde 15

25 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL uygulanan ilaç dışı tedaviler birbirine benzerlik gösterir. Yüksek tansiyonlu hastalarda, ilaveten beslenme ile alınan tuzun da azaltılması gerekir. Şeker hastalığı kontrol altına alınmalıdır. İnsülin kullanmak gerekiyorsa kaçınılmamalıdır. Şişmanlık kesinlikle kontrol altına alınmalıdır. Düzenli egzersiz HDL-kolesterolü (iyi kolesterol) yükseltir, LDLkolesterolü (kötü kolesterol) düşürür. Hastalar düzenli egzersiz yapmayı alışkanlık haline getirmelidirler. Haftada en az 3 tercihen 5 kez dakika süre ile yürüyüş, koşu, yüzme ve bisiklete binme gibi sporlar yapılmalıdır. Alkol, HDL-kolesterolü yükseltir ancak alkolün insan sağlığı ve sosyal yaşantı üzerine çok sayıda olumsuz etkisi olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle, alkol alımı kesinlikle sınırlandırılmalıdır. İzin verilen etil alkol miktarı, erkeklerde günde 30 ml, kadınlarda günde 15 ml dir. 30 ml etil alkol, 720 ml bira, 300 ml şarap, 60 ml 100 derece viski ve 60 ml rakıda bulunur (TKD, 1998) Kanın Pıhtılaşmasını Azaltan Makro Mantarlar Altı tür mantarın İn vitro uygulamalarda pıhtılaşmayı azalttığı saptanmıştır (Francia ve ark., 1999). Bunlar; Auricularia auricula-judae, Calyptella sp., Ganoderma lucidum, Kuehneromyces sp., Neolentinus adhereus ve Panus sp Arter Kan Basıncını Düşürücü Etkisi Olan Makro Mantarlar Üç mantar türünün arter basıncını düşürdüğü saptanmıştır (Francia ve ark., 1999). Bunlar; Ganoderma lucidum, Grifola frondosa ve Tricholoma mongolicum 16

26 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL 1.6. Lipitler ve Kolesterol Üzerine Etkili Makro Mantarlar Yedi mantar türünün genelde lipitler ve özellikle de kolesterol üzerine etkili olduğu gösterilmiştir (Francia ve ark., 1999). Buna karşın altı türün total kolesterol miktarını düşürdüğü saptanmıştır. Bunlar; Auricularia auricula judae, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa,pleurotus ostreatus ve Tremella fuciformis tir. İki tür, kötü kolesterol (LDL) miktarını düşürmüştür. Bu türler; Auricularia auricula judae ve Tremella fuciformis tir. Üç tür trigliserid düzeyini düşürmüştür. Bunlar; Cordyceps sinensis, Grifola frondosa, Lentinus edodes tir. kanıtlanmıştır. Agaricus campestris in hiperkolesterolemik etkisinin olmadığı 17

27 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL 1.7. Ganoderma lucidum un Tıbbi Etkileri (Kim ve Kim, 1999) ETKİ BİLEŞEN Anti HIV etkisi Ganoderik asit α ve β Ganoderik asitler B, C1, H Ganoderioller A, B, F Ganodermanondiol Ganodermanontriol Ganolucidik asit A Lucidumol B 3β, 5α-Dihidroksi-6β-metoksiergasto-7-dien Antihipertansiyon (ACE inhibitörü) Bitterness Ganoderik asitler B, D, F, H, K, S, Y Ganoderol B Ganoderik asitler A, C1, J Lucidenik assitler A, D1 Lucidon A, C Sitotoksisite Ganoderik asitler T, V, W, X, Y, Z 3β-Hidroksi-26-oxo-5α-lanosta-8,24-dien-11-one Ergosta-7,22=diene3β,3α,9α-triol 18

28 1. GİRİŞ Yusuf UYSAL ETKİ BİLEŞEN Enzim İnhibitörleri FPT İnhibitörü PLA-2 İnhibitörü Ganoderik asitler A ve C Ganoderik asit T DNA pol. Β İnhibitörü 5,8-epidoksi-5α,8α-ergosta-6,22E=dien-3β-ol Hepatoprotektivler Ganoderik asitler R, S Ganosporerik asit A Histamin İnhibitörü Hipokolesterolemik Cyclooctasulfur, Ganoderik asitler C ved Ganoderik asit Mf Ganodermik asit B Ganodermik asit T-O Pıhtılaşma İnhibitörü Ganodermik asit S Bu çalışmada, tıbbi öneme sahip Ganoderma lucidum mantar meyvesinin besinlere katılarak kullanılması halinde, mantarın kolesterol düzeyinin düşürülmesi üzerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. 19

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yusuf UYSAL 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Genellikle mantarların, özellikle de Pleurotus, Lentinus ve Grifola nın, çok lifli olmaları, yapılarında steroller, proteinler ve mikro elementler taşımaları ve çok düşük kalori içermelerinden, kardiyovasküler hastalıklardan korunmak için uygulanacak diyetlerin düzenlenmesinde özellikle ideal oldukları ilk kez geleneksel Çin Tıbbında ortaya konulmuştur (Breene, 1990; Hobbs,1995). Bodek ve arkadaşlarının (1991) yaptıkları bir çalışmada, yüksek kolesterol diyetine %4 oranında eklenen kurutulmuş Pleurotus mantarı deney sıçanlarının karaciğer ve serumunda kolesterol birikimini düşürmüş, HDL nin lehinde kolesterolü düzenlemiştir. Yine aynı çalışmada Pleurotus, LDL ve VLDL kolesterolün oluşumunu düşürmüş, kolesterol emilimini azaltmıştır ve karaciğerdeki HMG-CoA redüktaz aktivitesini azaltmıştır. Kontrollü klinik denemelerde, bir ay süresince gr kurutulmuş Pleurotus un günlük diyete eklenmesiyle hepsinde değil ama pek çok hastada hiperkolesterolemiyi azalttığı görülmüştür (Bodek ve ark., 1998). Bu da Pleurotus mantarının insan diyetinde doğal bir kolesterol düşürücü olabileceğini göstermektedir (Gunde ve Cimerman, 1999). Benzer sonuçlarların Grifola frondosa ve Auricularia auricula mantarları ile elde edildiği bildirilmiştir (Ryong ve Tertov, 1989). Plazma kolesterol miktarını düşürmek için, Tremella fuciformis ve T. aurantia dan elde edilen ve anti lipemik etkiye sahip polisakkaritlerin yararlı olduğu Sheng ve Chen (1989) tarafından gösterilmiştir. Ayrıca, T. aurantia nın miselinden ve meyvesinden anti hiperkolesterolemik etkili sıvı üretilmiştir (Koichi ve Takahiro, 1999). 20

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yusuf UYSAL Japonya da yapılan çeşitli küçük çaplı araştırmalarda, Lentinus mantarına ait ekstraktın 60 yaşından büyük kişilerde ve genç bayanlarda serumdaki kolesterolü pozitif olarak düşürdüğü gösterilmiştir (Hobbs, 1995). Francia ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada (1999), deney hayvanlarında kardiyovasküler hastalıklar için risk faktörlerinin, farklı mantar aktiviteleriyle düzenlenebilirliği karşılaştırılmıştır. 17 adet makro mantar türü denenmiştir ve bunlardan 16 sının çeşitli etkiler gösterdiği saptanmıştır. Örneğin; hiperkolesterolemiyi düzenleme, dislipoproteinemiyi tedavi edebilme, hiperglisemi, ve yüksek tansiyonu düşürme ile damar sertliğini tedavi edebilme özellikleri bunlar arasında sayılabilir. Berger ve arkadaşları yaptıkları çalışmada (2004) Ganoderma lucidium un kolesterol düşürücü etkisini hamsterler ve domuzları kullanarak in vitro ve ex vivo koşullarda araştırmışlardır. Bu çalışmada, %5 ve %2,5 oranında Ganoderma lucidum un mantar meyvesini deney hayvanlarının besinine karıştırılmıştır. T9A4 hepatositlerde, lanosterol bileşenleri içeren organik fraksiyonların kolesterol sentezini inhibe etmiştir. Hamsterlarda, %5 oranında Ganoderma lucidum kullanılması LDL kolesterole düşürücü yönde etki etmemiştir. Fakat, total kolesterolü %9,8, HDL kolesterolü %11,2 oranında düşürmüştür. Her iki dozdaki Ganoderma lucidum hepatik mikrozomal HMG-CoA redüktaz aktivitesini azaltmıştır. Domuzlarda ise, %2,5 oranında Ganoderma lucidum, total kolesterolü %20, LDL kolesterolü %27 ve HDL kolesterolü %18 oranında düşürmüştür. 21

31 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Ganoderma lucidum un İzolasyonu Ganoderma lucidum tıbbi mantarı Balıkesir iline bağlı Bandırma ilçesi kırsalından toplanarak, Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü nde literature uygun şekilde (uygun talaş ortamı, sıcaklık, nem, CO 2 konsantrasyonu ve beyaz ışık altında) izolasyonu gerçekleştirilip kültürü yapılmıştır (Stamets, 2000). Laboratuvar ortamında üretilip hasat edilen mantar meyvaları (Basidiocarp) oda sıcaklığında kurutulup çalışmalarda kullanılmıştır Ganoderma lucidum un Üreme Parametreleri Ganoderma lucidum un spor aşamasından olgun meyva oluşuncaya kadar üç önemli gelişim aşaması vardır. Bunlar spawn oluşumu, primordial oluşumu ve meyve gelişimi şeklinde adlandırılır. He bir aşama için gerekli olan kültür koşulları aşağıda verilmiştir. A. Spawn aşaması Sıcaklık ; o C Nem ; % Süre ; Gün CO 2 ; < ppm Hava ; 0 1 per/h Işık ; istemez 22

32 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL B. Primordia aşaması Tetikleme Sıcaklığı ; o C Süre ; Gün Nem ; % CO 2 ; ppm Hava Değişimi ; 0-1 per/h Işık ;4 8 h, lux C. Meyve gelişimi Sıcaklık ; o C Nem ; % Süre ; 60 Gün Hava Değişimi ; Oldukça fazla Işık ; 12 h, lux Deney Hayvanları Çukurova Üniversitesi Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezi nden alınan Wistar albino türü gr ağırlığındaki 24 dişi sıçan her grupta 8 deney hayvanı olacak şekilde 3 gruba ayrılarak uygun koşullarda üretilmişlerdir. Hayvanlardan iki grup 4 hafta süreyle kolesterol yükseltici diyetle beslenirken, üçüncü grupta yer alanlar normal diyet besini ile beslenmişlerdir (Berger ve ark., 2004; Bethlehem, 1997). Beslemede kullanılan diyet içeriği Çizelge 3.1 de verilmiştir. 23

33 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL Çizelge 3.1. Sıçan Diyeti Kurur Madde En Az: % 85 VİTAMİNLER Ham Protein En Az % 24 Vitamin A En Az 300 İ. Ü. / Kg Ham Selüloz En Çok % 7 Vitamin D3 En Az 1000 İ. Ü. / Kg HCl de Çözünmeyen Kül En Çok % 2 Vitamin E En Az 60 mg / Kg Ham Kül En Çok % 8 Vitamin B2 En Az 4 Ca En Az En Çok % 1,0 2,8 mg / Kg Vitamin B12 En Az 50 mg / Kg Fosfor En Az % 0,9 Vitamin K3 En Az 1 mg / Kg NaCl En Çok % 1 Metabolik Enerji En Az Kcal/Kg 2650 Yağ En Az % Beslenmede Kullanılan Sıçan Yeminin İçeriği Diyet besini; mısır, buğday, arpa, yulaf, yonca unu, topiyaka, sorgum, A.T.K, P.T.K, S.F.K, fındık küspesi, mısır proteini, razmol, kepek, bonkalite, balık unu, kemik unu, et-kemik unu, D.C.P, CaCO 3, NaCl, melas, yağ, bira mayası, süt tozu, kolza küspesi, fülfet soya küspesi, vitamin ve mineraller. Sıçan besini Aytekinler İlaç Kimya LTD. ŞTİ. Konya/TÜRKİYE den alınmıştır. Çalışmamızda kullandığımız diğer bir hayvan grubu tavşanlar olup (Oryctologus cuniculus L.), Çukurova Üniversitesi Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma Ve Uygulama Merkezi nden (TIBDAM) alınmıştır. Her bir tavşan gr arasında ağırlığa sahiptir. Altı adet tavşan alınarak iki gruba ayrılmış ve denemelerde kullanılmışlardır. Besleme sırasında tavşanlar birerli olarak kafeslere yerleştirilmiş ve uygun sıcaklık, nem ve ışık altında 4 hafta boyunca kolesterol 24

34 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL yükseltici diyetle beslenmişlerdir (Berger ve ark., 2004; Bethlehem, 1997). Tavşanların beslenmesinde kullanılan besinin içeriği Çizelge 3.2 de verilmiştir. Çizelge 3.2. Tavşan Diyeti Kuru Madde En Az % 88 VİTAMİNLER Ham Protein En Az % 16 Vitamin A En Az 8000 İ. Ü / Kg Ham Selüloz En Çok %10 Vitamin D 3 En Az 800 İ.Ü / Kg Ham Kül En Çok % 10 Vitamin E En Az 10 mg / Kg HCl de En Çok % 1 Vitamin B 2 En Az 3 mg / Kg Çözünmeyen Kül Kalsiyum En Az En Çok Vitamin B12 En Az 5 mg / Kg % 0,8 1,4 Fosfor En Az % 0,6 Vitamin K 3 En Az 1 mg / Kg NaCl En Çok % 1 Metabolik Enerji En Az Kcal / Kg 2300 Yağ En Az % Beslenmede Kullanılan Sıçan Yeminin İçeriği Diyet besini; mısır, buğday, arpa, yulaf, yonca unu, topiyaka, sorgum, A.T.K, P.T.K, S.F.K, fındık küspesi, mısır proteini, razmol, kepek, bonkalite, balık unu, kemik unu, et-kemik unu, D.C.P, CaCO 3, NaCl, melas, yağ, bira mayası, süt tozu, kolza küspesi, fülfet soya küspesi, vitamin ve mineraller. Tavşan besini Aytekinler İlaç Kimya LTD. ŞTİ. Konya/TÜRKİYE den alınmıştı. 25

35 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL 3.2.Metod Deney hayvanı yetiştirme koşullarında (16 C-26 C sıcaklık; %36-%70 nem; 12 h aydınlık-12 h karanlık) (Philips ve Sechzer, 1998) ön beslemeye alınan sıçan ve tavşanlardan, bir aylık ön besleme sonunda kan örnekleri alınmaya başlanmıştır. Kan örneklerinin serumları ayrıldıktan sonra Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Merkez Laboratuarında Total Kolesterol miktarları ölçülmüştür. Ayrıca deneye başlamadan önce ve deney süresince hayvanların kilolarındaki değişimi gözlemlemek üzere uygun aralıklarla ağırlıkları kontrol edilmiştir. Çalışmamız boyunca kullanılan sıçan besinin içersine, kolesterol yükseltici besini elde etmek için, %10 oranında yağ ilave edilmiştir ve kontrol grubu hayvanlar deney süresince bu besinle beslenmiştir (Berger ve ark., 2004). Deney grubundaki hayvanlar dört hafta süreyle kolesterol yükseltici besinle beslendikten sonra, dört hafta süreyle de içersinde mantar meyvesi bulunan besinle beslemeye devam edilmiştir. Mantarlı besin %10 yağ ve %5 mantar meyvesi içermektedir (Berger ve ark., 2004). Deney hayvanlarından sıçanlarda, riskli olmasına rağmen, kan örnekleri hayvanların kalplerinden alınmıştır. Hayvanlar ether koklatılarak bayıltılıp, sırt üstü yatırılarak kalbin en güçlü attığı nokta işaret parmağıyla belirlenmiş ve iğne orta hattın hafifçe solundan ksifoid kıkırdağın altına sokulmuştur. Kalbe girmek için iğne horizontal akstan sternuma 20 o -30 o açı yaparak ilerletilmiştir. İğne ilerletilirken hafifçe aspire edilmiştir. Çalışmalar için her bir hayvandan yaklaşık 1,5-2 ml kan örneği alınmıştır (Philips ve Sechzer, 1998, Flecknell, 1987). Tavşanlarda ise kan örneği kulak veninden alınmıştır. Tavşanlarda kulağın marginal veni küçük miktarlarda kan almak için çok uygun olup oldukça kolaydır. Kan alma işleminden önce, işlem sırasında zarar görmemesi için tavşan ahşaptan yapılmış bir kafese alınmıştır. Kulağın kan alınacak bölgesi tıraşlandıktan sonra, önce alkol daha sonra ksilol kullanılarak temizlenmiştir. Damar, parmakla 26

36 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL bastırılarak tıkanmış, iğne dikkatlice damara sokularak kan yavaşça çekilmiştir. Yaklaşık 3 4 ml kan alınarak toptam kolesterol analizlerinde kullanılmıştır (Philips ve Sechzer, 1998, Flecknell, 1987) Kolesterol Tayini Kolesterol, direk veya indirek olmak üzere iki şekilde gerçekleştirilen kimyasal veya enzimatik metodlarla tayin edilir. Direkt metodlarda doğrudan serum yada plazma kullanılır. Direkt metodlar daha basit ve oto analizörlere uygulanabilir olduklarından tercih edilirler (Mehmetoğlu, İ., 2002). Kolesterol, kloroformlu ortamda H 2 SO 4 ile kırmızı renk verir ve buna Salkowsky Reaksiyonu denir. Öte yandan, yine kloroformlu ortamda sülfürik asit + asetik anhidrit ile yeşil renk meydana getirir. Buna ise Liebermann-Burchard Reaksiyonu adı verilir. Kolesterolün meydana getirdiği kırmızı veya yeşil renge ise halokrom adı verilir. Kolesterol tayin yöntemlerini ikiye ayırabiliriz; Enzimatik Olmayan Metodlar Libermann-Burchard Metod Bu metodda serum kolesterolü önce alkol-eter karışımı ile ekstrakte edilir. Ekstrakt, kum banyosunda kurutulur ve kloroformda eritilir. Kloroformdaki eriyik asetik anhidrit ve sülfürik asitle muamele edilerek, meydana gelen renk 650 nm dalga boyunda okunur Zak Metodu (Deproteinizasyonlu kolorimetrik metod) Serum, glasiyal asetik asit içindeki demir üç klorürle deproteinize edilir. Proteinler süzülerek veya santrifigürasyonla uzaklaştırılır. Geriye kalan süpernatant Zak metoduna göre kolesterol tayini için analiz edilir. 27

37 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL Enzimatik Metod Bu metodda önce kolesterol esteri, kolesterol esterazla hidroliz edilerek serbest kolesterol elde edilir. Kolesterol oksidaz, oksijen kullanarak H 2 O 2 oluşumunu sağlar. H 2 O 2 çeşitli bileşiklerle reaksiyona girerek renkli kuinoneimine oluşturur. Meydana gelen renkli kompleks 500 nm de okunur (Mehmetoğlu, İ., 2002). Kolesterol esteraz Kolesterol esteri Kolesterol + Yağ asidi Peroksidaz 2 H 2 O aminoantipyrine + fenol kuinoneimine +4 H 2 O (Renkli Kompleks) Bu metodlar uygulanırken deney tüplerinin son derece kuru ve temiz olmasına dikkat edilmelidir. Direkt metodlarda bulanık, lipemik, ikterik veya hemolizli numunelerde önemli pozitif interferans görülür. Billirubin, Liebermann- Burchard ve Zak metodlarında pozitif interferansa sebep olur. Serumlar oda sıcaklığında yada buzdolabında 6 gün saklanabilir. Enzimatik metodda bilirubin H 2 O 2 ile reaksiyona girerek negatif interferansa sebep olur (Mehmetoğlu, İ., 2002). Çalışmamızda enzimatik yöntem kullanılarak kolesterol tayini yapılmıştır. 28

38 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL Şekil 3.1. Sıçanların beslendiği kafesler ve deney ortamı. Şekil 3.2. Tavşanların beslendiği kafesler ve deney ortamı. 29

39 3. MATERYAL VE METOD Yusuf UYSAL Şekil 3.3. Deneyde kullanılan sıçanlar. Şekil 3.4. Deneyde kullanılan Kontrol Grubu tavşanlardan biri. 30

40 4. BULGULAR Yusuf UYSAL 4. BULGULAR Çizelge 4.3; Normal besin, Mantar+Kolesterol ve Kolesterol içeren besinle beslenen sıçanlarda 30, 45, 66 ve 79 gün sonunda yapılan toplam ağırlık ve kolesterol miktarları T. Kol. T. Kol. T. Kol. T. Kol. T. Kol. Ağırlık Ağırlık Ağırlık Ağırlık Ağırlık Mik. Mik. Mik. Mik Mik. (gr) (gr) (gr) (gr) (gr) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) N , , , , D , , , , K , , , , Çizelge: N; Normal diyetle beslenen sıçanlar D; Mantar + kolesterol içeren besinle beslenen sıçanlar K; Kolesterol içeren besinle beslenen sıçanlar Normal diyetle beslenen sıçanların toplam ağırlıkları başlangıçta 1450 gr iken besleme süresi boyunca sırasıyla 1500, 1550, 1600 ve 1550 gr olarak bulunmuştur. Çizelge 4.3 incelendiğinde ağırlık 30 gün sonunda %3.5 oranında artarken kolesterol miktarı mg/dl olarak bulunmuştur. Beslemenin 45 inci gününde ağırlık artışı %6.9, kolesterol miktarı 15 mg/dl, 66 gün sonra ağırlık %10.3, kolesterol miktarı 17.8 mg/dl düzeyine ulaşmıştır. Beslemenin 79 uncu gününde ise ağırlık artışı başlangıç gününe göre %6.9 oranında artmakla birlikte bir önceki ölçüm dönemine göre ( ) %3.4 oranında düşmüştür. Bununla birlikte aynı dönemde yapılan kolesterol ölçümlerinde mg/dl lik değer elde edilmiştir. Normal besinle beslenen sıçanlarda ağırlık artışı ilk üç ölçüm döneminde devam etmiş, son dönemde ise düşme gerçekleşmiştir. Buna karşılık kolesterol miktarı sürekli artış göstermiştir. Artış oranı 45 inci günde otuzuncu güne göre %27,65, 66 ıncı günde otuzuncu güne göre %51.48, 79 uncu günde otuzuncu güne göre %68.08 oranında artmıştır (Şekil 4.5). 31