ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ STANDARTLARI (UMS)

Transkript

1 Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ STANDARTLARI (UMS) Trişinellozun (Trichinella spp enfeksiyonunun) Mikrobiyolojik Tanısı Hazırlayan Birim Klinik Parazitoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Parazitoloji Bölüm Mikrobiyolojik Tanımlama Standart No P-MT-09 Sürüm No 1.1 Onay tarihi Geçerlilik tarihi Sürüm no Tarih Değişiklik

2 İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ... 3 KISALTMALAR VE TANIMLAR... 3 GENEL BĠLGĠ... 3 TEKNĠK BĠLGĠLER Hedef mikroorganizmalar Tanı için asgari laboratuvar koģulları TriĢinelloz tanısında kullanılan teknikler Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim Olası sorunlar/kısıtlılıklar... 8 ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ... 9 KAYNAKLAR Sayfa 2 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-09 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

3 Kapsam ve Amaç TriĢinelloz (triģinoz), Trichinella spp larvaları ile enfekte etlerin çiğ veya az piģmiģ olarak tüketilmesi ile geliģen bir enfeksiyondur. Ġnsanlara enfekte domuz etlerinin çiğ veya az piģmiģ olarak tüketilmesi ile bulaģır. Sorumlu etlerin en baģında evcil ya da yabani domuzlar gelmekteyse de bunlardan baģka at, ayı, diğer memeli hayvanlar ile tropikal bölgelerde sürüngenler, hatta kuģlar bile Trichinella türlerini kasları içinde barındırabilmektedir. TriĢinelloz bildirimi zorunlu bir hastalıktır (1,2). Ülkemizde zaman zaman çoğu kaçak et kesimi ile iliģkili salgınları bildirilmiģtir. Ġzmir de, Aralık 2003 de çıkan ve Trichinella britovi'nin etken olduğu bilinen en büyük salgında 600 den fazla kiģinin etkilendiği rapor edilmiģtir (3,4,5). Semptomatik bireylerde, eozinofili, ateģ, kas ağrıları ve periorbital ödem sık görülen belirti ve semptomlardır. Tanısı, enfeksiyon düģünülen kiģilerden alınan kas biyopsisi, dıģkı, BOS, kan gibi örneklerin incelenmesi ile konulur. Rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarının triģinelloz tanısı talebi ile karģılaģma olasılığı düģük görünüyorsa da bu UMS de laboratuvarların gerektiğinde tanı koyabilmeleri veya ilgili diğer laboratuvara yönlendirebilecek bilgiye sahip olabilmeleri için triģinelloz tanısında kullanılan yöntemlere dair bir rehber sunulmaktadır. Kısaltmalar ve Tanımlar Aköz hümör Siliyer epitelden salgılanan Ģeffaf, plazmaya benzer bir sıvıdır; daha az protein içerir. Lens ile kornea arasında bulunur. WB Western blot Genel Bilgi Trichinella türleri Trichinelloidea ailesinde yer alan nematodlardır (yuvarlak solucanlar). Ġnsanda hastalık yapan en önemli tür Trichinella spiralis tir. Fakat Trichinella pseudospiralis ve Trichinella britovi de insanda hastalık etkeni olarak sık görülen diğer türlerdir. TriĢinelloz, Trichinella spp larvaları bulunan domuz veya diğer bir hayvan (sıklıkla at) etinin çiğ veya az piģmiģ yenmesini takiben, parazitin konağın çizgili kaslarına yerleģmesi sonucu meydana gelen bir enfeksiyondur. Dünyada oldukça yaygındır. Trichinella spp nin yaģam döngüsü oldukça basittir; enfekte memeli hayvan hem eriģkin formları bulunduran kesin konak, hem de kaslarında enfektif larval formları bulunduran ara konak olarak iģlev görür. Evcil domuzlar bu yuvarlak solucanın insanlara bulaģmasında en önemli konak vazifesini görmektedirler. Parazitik döngünün domuz ve kemirgenler arasında ahırlarda sürdüğü tahmin edilmektedir (6). Trichinella spp larvalarını içeren çiğ veya iyi piģmemiģ etler yenildiğinde larva bağırsakta kistten çıkar ve saatte olgunlaģır. DiĢiler bağırsak mukozasında derinlere göç ederek burada larvalarını doğurur. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 3 / 10 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-09 / Sürüm: 1.1 /

4 Larvalar kan ve lenf damarlarına girerek kan dolaģımına karıģırlar. Vücudun değiģik doku ve boģluklarına geçerler. Genellikle iskelet kaslarına yerleģir, geliģimlerini sürdürürler (6). Larvaların kaslarda yol açtığı klinik tablo eriģkinlerin bağırsaklarda neden olduğu semptomlardan daha ciddidir. Bağırsakta çok sayıda parazit bulunduğunda Ģiddetli bir kataral yangı ile ishal ve sindirim kanalındaki kanamaya bağlı olarak koyu renkte dıģkı görülür (3,5). Bu hastalıkta saptanabilen klinik belirtiler gastrointestinal yakınmalara ek olarak ateģ, yüz ve göz kapaklarında ödem, kornea çevresinde, konjonktivada, retinada kanamalar, deri döküntüleri, kas ağrıları, solunum Ģikayetleri, göğüs ağrıları, larvaların beyin tutulumu yapması sonucu geliģen baģ ağrıları, baģ dönmesi, kulak çınlaması gibi sinir sistemi belirtileri, aģırı zayıflık, miyokard yetmezliği olarak sayılabilir (7,8). TriĢinellozun tanısı kas biyopsisi, dıģkı, BOS, kan gibi örneklerden yapılan laboratuvar incelemeleri ile konulmaktadır. Bu amaçla mikroskobik inceleme, serolojik yöntemler ve moleküler yöntemler kullanılmaktadır (4,5,6). Dünyada 11 milyon insanın Trichinella spp ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir. Türkiye de 2003 yılında çıkan triģinelloz salgınında 600 den fazla vaka saptanmıģtır. Parazitin, denetimsiz hayvan kesimi ve tüketimine bağlı olarak gıda kaynaklı salgın yapabilme potansiyeli vardır (4,5). Teknik Bilgiler 1 Hedef mikroorganizmalar Trichinella spiralis ve diğer Trichinella spp 2 Tanı için asgari laboratuvar koģulları 2.1. Laboratuvar güvenliği Potansiyel enfeksiyöz organizmalar içerebileceği için parazitolojik inceleme örnekleri asgari BGD2 laboratuvar Ģartlarında incelenmeli ve daima Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi nde belirtilen standart güvenlik önlemleri uygulanmalıdır. Serolojik çalıģmalarda en ciddi risk kan-kaynaklı patojenlerin (özellikle HIV ve hepatit etkenleri) bulaģması riskidir. Serum ayırma iģlemi sırasında ve testler yapılırken daima eldiven giyilmelidir. Lamlar, boyanmıģ olsun olmasın, kesici-delici atık kabul edilir ve kesinlikle kesici-delici atık kutusuna atılırlar! Diğer biyolojik kirlilerin konduğu torbalara atılmaları halinde torbayı deler ve ciddi infeksiyöz risk oluģtururlar! Güvenlik uyarısı! Trichinella spp larvaları oldukça enfektiftir! Bu prosedür uygulanırken daima eldiven giyilmelidir. Sayfa 4 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-09 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

5 2.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Bu UMS yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) tekniklerin uygulanmasından önce, amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almıģ olmalı; (ii) tekniğe tüm yönleriyle aģina olmalı, ve (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır. İnvaziv bir teknik kullanılarak alınmıģ örnekler en kısa sürede ve mutlaka Tıbbi Mikrobiyoloji /Tıbbi Parazitoloji Uzmanı tarafından bizzat incelenmeli, değerlendirilmeli ve sonuçlandırılmalıdır Örnek, Kit, Donanım İnceleme örnekleri ġüpheli gıda tüketimi öyküsü olan ve eozinofili, ateģ, kas ağrıları ve periorbital ödem Ģikayetleri ile baģvuran bireylerde triģinelloz tanısı için serum, kas biyopsi örneği, BOS ve dıģkı örneği incelenebilir. Örneklerinin alınması ve gönderilmesine iliģkin detaylı bilgi BulaĢıcı Hastalıkların Laboratuvar Tanısı için Saha Rehberi nden edinilebilir. AĢağıda bazı önemli noktalara tekrar dikkat çekilmektedir. Buna göre: Serum (ve gerekiyorsa BOS) enfeksiyondan en erken 10 gün sonra alınmalıdır. Serum örneği 2-4 hafta sonra tekrar alınmalı ve antikor titrelerinde artıģ olup olmadığı takip edilmelidir. NOT: Parazitolojik (mikroskobik) inceleme için alınan BOS örneği asla buzdolabına konmaz, asla dondurulmaz! Kas biyopsisi enfeksiyondan en erken 10 gün sonra, ideal olarak ise 2-3 hafta sonra örnek alınmalıdır. Örnek aseptik koģullarda, hekim tarafından alınır. Kültür yapılacaksa her bir dokudan en az 2 parça 2-3 g örnek alınmalıdır. Formol eklenmemelidir! DıĢkı - triģinelloz tanısında öncelikli bir inceleme örneği olmamakla birlikte incelenebilir. Örneklerinin alınması ve incelenmesinde izlenecek prosedür için ayrıca bkz. UMS P-ÖY-01. Reaktif /Kit Serolojik inceleme için piyasada özgül antikorların saptanmasına yönelik IHA, IFA, ELISA veya WB kitleri mevcuttur. Moleküler testler için ticari olarak hazır DNA izolasyon ve PCR kitleri kullanılabilir ya da bütün enzim, primerler ve diğer reaktiflerden geleneksel PCR uygulanabilir. Diğer gereç, donanım Serolojik yöntemler için; Floresan mikroskobu (IFA testi kullanılıyorsa) ELISA yıkayıcı, ELISA okuyucu, mikroplaklar Ayarlanabilir otomatik mikropipetler ( µl) ve pipet uçları Santrifüj Mikroskobik yöntemler için; Mikroskop, binoküler (rutin) 10 (düģük), 40 (yüksek kuru), 100 (immersiyon) objektifleri ve 10 oküleri olan tercih edilir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 5 / 10 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-09 / Sürüm: 1.1 /

6 NOT: Ġnceleme duyarlılığı düģük olduğu için 5 oküler önerilmez! (9). Lamlar (25 75 mm; tercihen kenarı rodajlı) ve lameller (22 22 mm) Pastör pipetleri, 1 ve 10 ml pipetler, mikropipetler ve pipet uçları Biyolojik atık kapları, kesici-delici atık kabı PCR ve diğer moleküler yöntemler için; En az üç ayrı oda - Nükleik asit ekstraksiyonu, PCR karıģımı hazırlama, amplifikasyon ve sonuç gözetimi için ayrı odalar. Ġdeal olarak PCR karıģımı hazırlama odası (temiz) pozitif basınçlı, agaroz jel elektroforezi yapılan oda (kirli) negatif basınçlı havalandırmaya sahip olmalıdır. Donanım BGK, soğutmalı mikrosantrifüj, hassas terazi, vorteks, su banyosu, PCR ısı döngü cihazı (gerçek zamanlı veya geleneksel), mikrodalga fırın, jel görüntüleme sistemi, elektroforez ünitesi vb Kalite kontrol Tüm ekipmanın bakım ve kalibrasyonu yapılmıģ olmalıdır. Mikroskop belirli aralıklarla (yoğun kullanılıyorsa yılda en az bir kez) kalibre edilmelidir. Mikroskoba herhangi bir parça eklenmesi veya değiģtirilmesi durumunda da kalibrasyon yapılmalıdır. Kalibrasyon için kullanılmıģ optikler mikroskobun üzerinde olmalıdır. Tüm objektifler için kalibrasyon faktörleri göz önündeki bir panoda asılı olmalıdır (bkz. UMS, P-TP-01 Mikroskop kalibrasyonu) (9). Her yeni -hazırlanmıģ veya ticari- reaktif seti veya kit lotu, kullanıma sokulmadan önce pozitif kalite kontrol örnekleri ile test edilmelidir. Kullanılan kitlerin (moleküler testler için olanlar dâhil) son kullanım tarihleri ve saklama koģullarına dikkat edilmelidir. Kontrol örnekleri kullanılarak bu etkinlik değerlendirilebilir. Tüm kalite kontrol sonuçları kaydedilmelidir. 3 TriĢinelloz tanısında kullanılan teknikler 3.1. Serolojik tanı TriĢinelloz tanısında en yaygın baģvurulan yöntem serolojik testlerdir. Serolojik inceleme için piyasada özgül antikorların saptanmasına yönelik IHA, IFA, ELISA kitleri mevcuttur. Yüksek duyarlılığa ve genellikle %100 e yakın özgüllüğe sahiptirler (6). T. spiralis IgG antikor yanıtı hastaların çoğunda (%80-100) enfeksiyondan 3 ila 5 hafta sonra geliģir. Bu nedenle akut hastalık esnasında IgG antikor titreleri negatif bulunabilir. Ancak 2-4 hafta sonra test tekrarlanmalıdır. En sık ELISA-IgG kullanılmaktadır. Trichinella antikorlarının düģük olasılıkla da olsa diğer parazitlerle çapraz reaksiyon verebiliyor olması, ELISA testi ile zayıf pozitiflik elde edildiğinde belirsizliğe yol açabilir. Böyle durumlarda Western blot (WB) yöntemi ile özgül bantların görülmesi serolojik sonucu destekleyicidir. Tipik klinik bulgular ve öykü dikkate alınarak karar verilmelidir. Sayfa 6 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-09 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

7 Örnek hazırlanır BOSTr Diğer steril vücut sıvıları Perikard sıvısı Amniyon sıvısı Vitreus hümör Aköz hümör Mikroskopi Hücre kültürü Fare inokülasyonu PCR Goldmann-Witmer katsayısı* Tr Tr Etkenin saptanması toksoplazmoz veya triģinelloz tanısı koydurur Etkenin saptanması toksoplazmoz tanısı koydurur Etkenin DNA sının saptanması toksoplazmoz veya triģinelloz tanısı koydurur Katsayının >2 olması toksoplazmoz düģündürür *Sadece aköz humör için uygulanır Tr: TriĢinelloz tanısında kullanılır Şekil 2. Doku parazitlerinin tanısında BOS veya diğer steril vücut sıvılarına uygulanabilecek laboratuvar yöntemleri akıģ Ģeması Kas biyopsisinde larvaların görülmesi Kas biyopsisi örneklerinden mikroskobik inceleme için preparatlar basitçe iki lam arasında kas parçasının sıkıģtırılarak ezilmesi ile hazırlanabilir. Böyle hazırlanmıģ preparatların direkt mikroskopta incelenmesi ile larvalar gözlenebilir (6). Histopatolojik incelemeler ile de kas dokusunda larvalar gözlenebilir. BOS un mikroskobik incelemesinde nadir de olsa (direkt yayma veya rutin santrifüj sonrası) parazitin larvası görülebilir DıĢkı incelemesi DıĢkı triģinelloz tanısında öncelikli bir inceleme örneği değildir. Nitekim, çoğu zaman parazit, baģka bir amaçla yapılan dıģkı incelemeleri sırasında tesadüfen saptanabilir. Bununla birlikte, enfekte et yenildikten sonraki 5-15 gün içerisinde dıģkıda eriģkin formlar veya larvalar görülebilmektedir (8) Moleküler tanı Kas biyopsisinden PCR yapılabilir. T. spiralis için türe özgü bir rapid-cycle PCR geliģtirilmiģtir. Ancak bu ve benzeri metotların gerek potansiyel enfekte hayvan kaynaklı gıdaların taranmasında, gerekse Ģüpheli insan vakaların tanısında nasıl kullanılabileceği henüz tam olarak netleģmemiģtir (6). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 7 / 10 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-09 / Sürüm: 1.1 /

8 3.5. Saklama, Referans merkeze gönderme Pozitif kas örneği %10 formol içinde eğitim ve kalite kontrol uygulamalarında kullanılmak üzere saklanmalıdır. Gerekli bilgiler lam üzerine yazılmalı ve bir arģivleme sistemi kurulmalıdır. Serum veya kas biyopsi örnekleri doğrulama amaçlı testler (ileri tanı veya moleküler testler) için baģka bir merkeze gönderilecekse alındıktan sonraki 48 saat içinde +4 C de taģınmalıdır. BOS ise oda sıcaklığında gönderilir. Örnekler kesinlikle sızdırmaz örnek kaplarına alınmıģ olmalıdır ve bu kaplarla taģınmalıdır. Eğer ileri tanı veya moleküler testler için örnekler baģka bir Ģehirdeki laboratuvara gönderilecekse, öncelikle paketleme ve taşıma biyolojik materyal taģıma Ģartlarına uygun olmalıdır (10) (ayrıca bkz. UMS GEN- OY-01 Enfeksiyöz Maddelerin TaĢınması Rehberi). 4 Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim Serolojik incelemede IgG antikorları için 2-4 hafta ara ile alınan örneklerde serokonversiyonun gösterilmesi (antikor titrelerinin negatif iken pozitifleģmesi) veya 4 kat titre artıģının gösterilmesi ve kesin tanı koydurur. Serolojik incelemelerde çapraz reaksiyondan Ģüphelenildiğinde western blotting yapılabilir. Özgül bantların görülmesi tanıyı destekler. Kas biyopsisinin (ve nadiren BOS un) mikroskobik incelemesinde larvaların görülmesi kesin tanı bulgusudur. DıĢkı incelemesinde eriģkin Trichinella spp veya larvasının görülmesi kesin tanı bulgusudur. Eğer larva (dıģkıda eriģkinleri de) görülmüģ ise sonuç cins adı ve tür adı yazılarak rapor edilmelidir. Örnek rapor aģağıdaki gibi olabilir: Kas biyopsisinden yapılan mikroskobik incelemede Trichinella spiralis larvaları görülmüģtür. DıĢkının mikroskobik incelemesinde Trichinella spp eriģkin ve larvaları görülmüģtür. TriĢinelloz bildirimi zorunlu bir hastalıktır ve bir salgınla iliģkili olabilir. Pozitif sonuç vakit geçirmeden ilgili birime haber verilmelidir ve olguların kayıt ve bildirimi için Sağlık Bakanlığının BulaĢıcı Hastalıkların Ġhbarı ve Bildirim Sistemi, Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi izlenmelidir (1,2). 5 Olası sorunlar/kısıtlılıklar Antikor yanıtı hastaların çoğunda enfeksiyondan 3-5 hafta sonra baģlar. Bu nedenle akut hastalık esnasında Trichinella-IgG antikor titreleri negatif bulunabilir. Bir haç hafta sonra tekrarlanan testin pozitife dönüģmesi (antikor yanıtının geliģmesi) hastalığın güçlü kanıtıdır. Sayfa 8 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-09 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

9 BOS un mikroskopisinde akut dönemde parazitin larvası görülmeyebilir. Kas biyopsisi incelemesinde örnek alınan bölgeye bağlı olarak yalancı negatiflik görülebilir. Bu nedenle iģlemin tekrarlanması gerekebilir. DıĢkının mikroskobik incelemesinde 1-2 gün ara ile 2. ve gerekirse 3. örnek incelenmelidir. Kronik dönemde dıģkı örneklerinde parazit larvası ve eriģkinine rastlanmayabilir. İlgili diğer UMS belgeleri Bu prosedür belgesi (TriĢinellozun Mikrobiyolojik Tanısı) ayrıca aģağıda listelenen UMS belgeleriyle de ilgilidir ve gerekli bilgi için bu belgelere de bakılması önerilir: UMS, P-ÖY-01 DıĢkı örneklerinin parazitolojik incelemesi UMS, P-TP-01 Mikroskop kalibrasyonu UMS, GEN-OY-01 Enfeksiyöz maddelerin taģınması rehberi Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 9 / 10 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-09 / Sürüm: 1.1 /

10 Kaynaklar 1 BulaĢıcı Hastalıklar Sürveyans ve Kontrol Esasları Yönetmeliğinde DeğiĢiklik Yapılmasına Dair Yönetmelik. Resmi Gazete; (son eriģim tarihi: ) 2 BulaĢıcı Hastalıkların Ġhbarı ve Bildirim Sistemi, Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi, Sağlık Bakanlığı, Ankara breh.pdf (son eriģim tarihi: ) 3 TriĢinelloz. Genelge 2004 / 28. T.C. Sağlık Bakanlığı. Temel Sağlık Hizmetleri Genel Müdürlüğü. BulaĢıcı ve Salgın Hastalıklar Kontrolü Daire BaĢkanlığı, Zoonoz ve Paraziter Hastalıklar ġube Müdürlüğü, Ankara. Yazı No: 03557, Bayram DelibaĢ S, Usluca S, Arcak S, Özkoça S, Akısü Ç. Evaluation of specific antibody responses in early stage human trichinellosis. Turkiye Klinikleri J Med Sci 2013;33(1): Akar S, Gurler O, Pozio E, Onen F, Sari I, Gerceker E, Gunes AJ, Akinci B, Birlik M, Akkoc N. Frequency and severity of musculoskeletal symptoms in humans during an outbreak of trichinellosis caused by Trichinella britovi. J Parasitol 2007;93: Procop GW, Neafie RC. Less common helminths: Trichinella species. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW (eds). Manual of Clinical Microbiology. 10th ed., ASM Press, Washington D.C. 2011, p CDC. Trichinellosis (also known as Trichinosis). (son eriģim tarihi: ) 8 Garcia LS. Tissue nematodes. In: Garcia LS (ed). Diagnostic Medical Parasitology. 4th ed., ASM Press, Washington D.C. 2001, p Garcia LS. Calibration of microscope with an ocular micrometer. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p Enfeksiyöz madde ile enfeksiyöz tanı ve klinik örneği taģıma yönetmeliği. Sağlık Bakanlığı, Ankara. Resmi Gazete Sayfa 10 / 10 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-09 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji