ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ STANDARTLARI (UMS)

Transkript

1 Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ STANDARTLARI (UMS) Cryptosporidium türlerinin Mikrobiyolojik Tanısı Hazırlayan Birim Klinik Parazitoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Parazitoloji Bölüm Mikrobiyolojik Tanımlama Standart No P-MT-03 Sürüm No 1.1 Onay tarihi Geçerlilik tarihi Sürüm no Tarih Değişiklik

2 İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ... 3 KISALTMALAR VE TANIMLAR... 3 GENEL BĠLGĠ... 3 Parazitin özellikleri... 3 Hastalığın önemi... 4 Klinik özellikleri... 5 Laboratuvar tanısı... 5 TEKNĠK BĠLGĠLER Hedef mikroorganizma(lar) Tanı için asgari laboratuvar koģulları Kriptosporidiyoz tanısında kullanılan teknikler Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim Olası sorunlar/kısıtlılıklar ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ KAYNAKLAR Sayfa 2 / 17 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

3 Kapsam ve Amaç Cryptosporidium spp insan ve hayvanların sindirim ve solunum sisteminde yerleģebilen protozoon parazitlerdir. Bu etkenlerin neden olduğu kriptosporidiyoz, asemptomatik taģıyıcılıktan özellikle immün sistemi baskılanmıģ kiģilerde ölümcül seyredebilen ishale kadar değiģebilen geniģ bir klinik spektruma sahiptir. Kriptosporidiyoz, enfektif Cryptosporidium spp ookistlerinin fekal-oral yolla alınması sonucu bulaģır. Klinik bulgular özgül olmadığından tanı yalnızca laboratuvar incelemesiyle konur. Cryptosporidium spp su kaynaklı kitlesel salgınlar yapabildiğinden, halk sağlığı önemine sahip bir etkendir ve ülkemizde laboratuvardan bildirimi zorunludur (1,2,3). Ancak, ülkemizde klinik laboratuvarların çok azı (%4) bu etkenin tanısı ile ilgili inceleme yapabilmektedir (4). Vakaların önemli bir kısmının bu nedenle tanı alamadığı düģünülürse, uygun bir prosedürün el altında olması tanının yaygınlaģmasını teģvik edecek bir araç olarak önemli görünmektedir. Bu UMS belgesinin amacı klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarına Ģüpheli vakalara kriptosporidiyoz tanısının konulmasında kullanabilecekleri inceleme yöntemleri için yardımcı bir rehber sunmaktır. Kısaltmalar ve Tanımlar FM KOH MAF PVA SAF Floresan mikroskopi (auramin-rhadomine boyama için) Potasyum hidroksit Modifiye Kinyoun asit-fast Polivinil alkol (fiksatif) Sodyum asetat-asetik asit- formol (fiksatif) Genel Bilgi Cryptosporidium ile insan enfeksiyonları altı kıtada 60 dan fazla ülkede bildirilmiģtir. Farklı ülkelerde, dıģkıda ookistlerin görülmesiyle belirlenen enfeksiyon prevalansı, geliģmekte olan ülkelerde daha yüksek olup, bu oran, Avrupa ve Amerika da %1-3 iken, Asya ve Afrika gibi daha az sanayileģmiģ ülkelerde %5-10 arasında değiģmektedir. Ülkemizde değiģik bölgelerde ve çeģitli hasta gruplarında (ishalli, immün yetmezlikli vb.) kriptosporidiyoz görülme sıklığı üzerinde yapılan çalıģmalarda oranların %1-30 arasında olduğu görülmektedir (5). Parazitin özellikleri Kriptosporidiyoz, omurgalıların sindirim ve solunum sistemi epitelinde hücre içi, ancak sitoplazma dıģı yerleģim gösteren Cryptosporidium türlerinin neden olduğu bir protozoon hastalığıdır. Diğer koksidya cinslerinden farklı olarak ookistlerinin içinde sporokist olmaması nedeniyle Cryptosporidium olarak isimlendirilmiģtir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 3 / 17 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-03 / Sürüm: 1.1 /

4 Ġnsanlarda ilk vaka 1976 yılında tanımlanmıģ ve etken olarak Cryptosporidium belirlenmiģtir. Bugün farklı konakları enfekte eden 26 Cryptosporidium türü olduğu, bunların bir kısmının insanlardaki enfeksiyondan da sorumlu olduğu bilinmektedir. Ancak insanda en sık hastalığa neden olan türler C.parvum ve C. hominis tir (5,6,7,8). C. parvum doğada birçok kuģ ve memeli türünün (sığır, koyun ve bazen köpek, kedi, kemirgenler) bağırsaklarında bulunan yaygın bir koksidiyal parazittir. Enfektif ookistler bu konaklar tarafından çevreye yayılır (5,7). Ġnsanlar ookistleri kontamine su veya gıda ile aldıklarında ince bağırsaklarda sporozoitler açığa çıkar ve bunlar epitel hücreleri içine girerek merozoite dönüģürler. Merozoitlerin bazıları zigotları oluģturmak üzere seksüel üreme fazına geçerler. Zigotların fertilizasyonu sonucu da ince ve kalın duvarlı yeni ookistler meydana gelir. Ġnce duvarlı ookistler daha çok konağın yeniden enfeksiyonundan ( autoinfection ) sorumludurlar. Kalın bir duvarla çevrilmiģ içinde dört tane çıplak sporozoit (her biri ~1 5 µm) bulunan ookistler ise çevreye yayılırlar ve yeni bir konağa geçtiklerinde yeni yaģam döngüsü baģlatırlar (3,6,8). BulaĢ Cryptosporidium spp ookistleri ile kontamine olmuģ içme suyu, gıdalar veya daha nadir olarak yüzme suları aracılığıyla fekal-oral yoldan olmaktadır. Ayrıca insandan insana direkt veya solunum yoluyla da bulaģabilir (6,9). Hastalığın önemi Halk sağlığı açısından önemi, öncelikle, Cryptosporidium ookistlerinin boyutlarının içme suyu arıtma tesislerinin kum filtreleri tarafından tutulamayacak kadar küçük (4-6 µm) olmasından kaynaklanır. Dolayısı ile Ģehir Ģebeke suyuna geçebilirler. Daha da ilerisi, klor gibi suyun dezenfeksiyonunda kullanılanlar dahil (ör., %3 lük hipoklorid, iyot bileģikleri, kresilik asit, benzalkonyum klorid vb.) dezenfektanlara da ileri derecede dirençlidirler. Soğuk, nemli ortamlarda canlılık ve enfektivitesini aylarca koruyabilen bu ookistlerin enfeksiyon dozunun hayli düģük -10 ila 100 ookist- olması da sorunu ağırlaģtıran diğer bir özelliğidir (8). Bu özellikleri, içme sularının fekal kontaminasyonu ve yetersiz iģlenmesi ile iliģkili büyük kitlesel salgınlarını izah etmektedir. Dünyada bugüne kadar kontamine içme suyunun tüketimine ya da kontamine sularda yüzme ve diğer aktivitelere bağlı olduğu bilinen çok sayıda su kaynaklı kriptosporidiyoz salgını kaydedilmiģtir. Ġçme suyu aracılığıyla bulaģ sonucu 1984 de Texas da 5.900, 1987 de ABD nin Carroll eyaletinde ve 1993 de Milwaukee de kiģiyi enfekte eden büyük salgınlar olmuģtur. Milwaukee salgını bilinen en büyük su kaynaklı salgın olup, salgın sırasında kanalizasyon örneklerinin %90 ında, nehir suyu örneklerinin %75 inde ve içme suyu örneklerinin de %28 inde ookistlerin varlığı gösterilmiģtir yılları arasında da halka açık havuzlar, su eğlence parkları, göl veya nehir sularında yüzme ile geliģen ve den fazla kiģiyi etkileyen kriptosporidiyoz salgınları rapor edilmiģtir (6,8). Kriptosporidiyoz çocukluk çağı ishalleri arasında da önemli bir yer tutar ve 1-5 yaģ arasında pik yapmaktadır. Çocuklar ile aile içi temas veya mesleğe bağlı karģılaģma nedeniyle yaģ grubu eriģkinler kriptosporidiyoz prevalansı açısından ikinci önemli grubu oluģturmaktadır. Ayrıca enfeksiyonun mevsimsel özellik gösterebildiği, özellikle daha sıcak ve nemli aylarda sık görüldüğü ancak insidansın her ülkede farklı dönemlerde artabileceği bildirilmiģtir (5). Sayfa 4 / 17 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

5 Klinik özellikleri Kriptosporidiyozun inkübasyon süresi 5 ila 28 gün arasında değiģir. Ġshal en yaygın semptomdur ve karakteristik olarak suludur; hatta bazen koleradakine benzer bir sulu ishal gözlenebilir. Daha az olarak hastalarda karın ağrısı, ateģ, bulantı-kusma ve kilo kaybı da görülür. Enfeksiyonun Ģiddeti kiģinin immün sisteminin durumuna bağlıdır. Enfeksiyon sağlıklı bireylerde asemptomatik veya kendini sınırlayan bir hastalık ile seyredebileceği gibi, AIDS baģta olmak üzere immün sistemi baskılanmıģ bireylerde ciddi uzamıģ ishalle birlikte, solunum sistemi, hepatobiliyer sistem ve pankreası da etkileyerek hayatı tehdit eden tablolara neden olabilmektedir (6,8). Laboratuvar tanısı Kriptosporidiyozda klinik bulgular özgül olmadığından tanı laboratuvar incelemesine dayanmaktadır. Tanı amacıyla en sık kullanılan materyal dıģkıdır. Ġmmün sistemi baskılanmıģ kiģilerde ince bağırsak aspirasyon sıvısı/biyopsisi, safra ya da karaciğer biyopsi örneği, solunum sistemi örnekleri ve mide yıkama suyu da tanı amaçlı kullanılabilmektedir (7,10). Küçük yuvarlak ookistlerin genellikle dıģkıda az sayıda olmaları ve mayalara çok benzemeleri nedeniyle boyasız preparatlarda (dıģkının direkt mikroskopisinde) saptanması pratik olarak mümkün değildir. Bu nedenle tanıda asgari yöntem asit-fast boyama teknikleri ile (modifiye Kinyoun asit-fast) boyanmıģ dıģkı yaymalarının mikroskobik incelemesinde Cryptosporidium spp ookistlerinin gözlenmesidir (3,7,10). DıĢkı yaymalarının floresan veren özel asit-fast boyalarla (auramine-rhodamine) boyanması ve floresan mikroskopta incelenmesi ile de Cryptosporidium spp ookistleri gösterilebilir. Ayrıca, dıģkı örneklerinden DFA, özgül antijen varlığını saptayan ELISA ve immünokromatografik hızlı tanı testi gibi immünodiagnostik teknikler ve nükleik asit saptama yöntemleri (PCR) de tanıda kullanılmaktadır (11,12). DFA, Cryptosporidium spp tanısında duyarlılık ve özgüllük açısından altın standart kabul edilir. Ancak floresan mikroskobu gerektirdiği için pahalı bir yöntem olup geliģmiģ laboratuvarlarda uygulanabilmektedir (3,12). Etkeni yakalama olasılığını yükseltmek için, ya da sonucu negatif olarak rapor etmeden önce, en az 3 dıģkı örneği incelenmiģ olmalıdır. Ookistlerin elde edilme olasılığını artırmak için formolde veya baģka bir fiksatif içinde gelmiģ dıģkının önce konsantre edilmesi (ör., formol-etil asetat yoğunlaģtırma yöntemi ile en az 10 dk 500 g de santrifüj) ve daha sonra boyanması önerilir. Ancak eğer örnek ELISA veya hızlı tanı testi ile analiz edilecekse antijen kaybı olabileceği için yoğunlaģtırma önerilmez (3). Tanı tekniklerinin seçimi mevcut donanım, reaktifler ve deneyime, ayrıca zaman ve maliyet değerlendirmelerine bağlıdır. Tanı testlerinin seçimine yardımcı olabilecek bazı özellikler ġekil 1 de özetlenmiģtir. Ülkemizde kriptosporidiyoz ilk olarak 2004 yılında -laboratuvardan bildirimi zorunlu bir etken olarak- bildirimi zorunlu hastalıklar listesine konmuģtur (13). Hemen hemen aynı dönemde Ġzmir e yakın bir kırsal bölgede patlak veren ilk su kaynaklı kriptosporidiyoz salgını da rapor edilmiģtir (1). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 5 / 17 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-03 / Sürüm: 1.1 /

6 Bu geliģmeler dikkatleri Cryptosporidium spp enfeksiyonuna bir nebze yöneltse de halen bildirim oldukça sınırlıdır ve rutin bildirim sistemi içinde bildirilen vakaların ciddi ölçüde beklenen vaka sayılarının altında olduğu tahmin edilmektedir. Bunda tanının ülkemizdeki laboratuvarlar arasında yeterince yaygınlaģmamıģ olmasının rolü olduğu ileri sürülebilir. Halen klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarının sadece %4 ünde Cryptosporidium spp için geçerli bir yöntem ile tanı konulabilmektedir (4). Tanının yaygınlaģamamasında; etkenin akla getirilmeyiģi ve buna bağlı olarak hekimin laboratuvardan inceleme talebinde bulunmayıģı gibi nedenler de sayılabilir. Ancak Cryptosporidium spp sulu ishal incelemesinin bir parçasıdır ve eğer laboratuvar tanısına yönelik faaliyetin amacı fekal-oral kontaminasyon sonucu geliģmiģ bir enfeksiyonda (ishal yakınması ile gelen bir hastada) etiyolojik ajanının ne olduğunu açığa çıkarmak ise o zaman Cryptosporidium spp dahil bütün olası patojenler araģtırılmalıdır. Maliyet İş gücü Duyarlılık Özgüllük Teknik deneyim gereksinimi Asit-fast FM DFA PCR ELISA Hızlı test ELISA Hızlı test FM DFA PCR Asit-fast Asit-fast Hızlı test ELISA FM DFA PCR Asit-fast ELISA Hızlı test FM DFA PCR Hızlı test ELISA FM DFA PCR Asit-fast Şekil 1. Tanı testlerinin bazı özelliklerinin en düģükten yükseğe doğru sıralanıģı (10). Teknik Bilgiler 1 Hedef mikroorganizma(lar) Cryptosporidium spp 2 Tanı için asgari laboratuvar koģulları 2.1. Laboratuvar güvenliği Potansiyel enfeksiyöz organizmalar içerebileceğinden dolayı dıģkı örnekleri ile ilgili incelemeler asgari BGD2 laboratuvar Ģartlarında gerçekleģtirilmeli; bütün örnekler enfeksiyöz kabul edilmeli ve daima standart güvenlik önlemleri uygulanmalıdır (bkz. Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi ). Sayfa 6 / 17 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

7 DıĢkı örnekleri koruyucu maddelerle fikse edilmiģ olsalar bile bu önlemler alınmalıdır; çünkü hala enfeksiyöz olabilirler. Özellikle kalın cidarlı bazı parazit ookistleri ve kistleri formolde fikse edildikten haftalar sonra ölürler. Ascaris lumbricoides yumurtaları formolde saklandığında bile geliģmeye devam edebilir ve enfeksiyözdür. Güvenlik uyarısı! Cryptosporidium spp ookistleri oldukça enfektiftir; kalın cidarlı ookistler %2.5 luk potasyum dikromat koruyucu içinde bir yıla kadar canlılıklarını koruyabilirler. Bu prosedür uygulanırken daima eldiven giyilmelidir! BoyanmıĢ olsun olmasın bütün lamlar kesici-delici atık kabul edilir ve kesinlikle kesici-delici atık kutusuna atılırlar! Diğer biyolojik kirlilerin konduğu torbalara atılmaları halinde torbayı deler ve ciddi infeksiyöz risk oluģtururlar! Güvenlik uyarısı! Metanol yüksek düzeyde toksik ve parlayıcıdır. Eğer yutulacak olursa (herhangi bir miktarı) körlüğe ve hatta ölüme neden olabilir. Kullanım harici zamanlarda metanol ĢiĢesi kilitli bir dolapta tutulmalıdır! 2.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Bu UMS yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) tekniğin uygulanmasından önce, amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almıģ olmalı; (ii) tekniğe tüm yönleriyle aģina olmalı, ve (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır. Bu UMS nin uygulanmasından analist; tekniğin prosedüre uygun yapılmasını sağlamaktan ve denetimi, değerlendirilmesi ve onaylanmasından (sonucun doğru ve güvenilir olmasından) Tıbbi Mikrobiyoloji/Parazitoloji Uzmanı sorumludur. İnvaziv teknik kullanılarak alınmıģ örnekler en kısa sürede ve mutlaka Tıbbi Mikrobiyoloji / Tıbbi Parazitoloji Uzmanı tarafından bizzat incelenmeli, değerlendirilmeli ve sonuçlandırılmalıdır Örnek, Reaktif, Kit, Donanım İnceleme örnekleri Örneklerinin alınması ve gönderilmesine iliģkin detaylı bilgi BulaĢıcı Hastalıkların Laboratuvar Tanısı için Saha Rehberi nden ve ilgili diğer UMS belgelerinden edinilebilir. Ġlgili UMS lerin bir listesi bu belgenin sonunda verilmiģtir. AĢağıda bazı önemli hususlara tekrar dikkat çekilmektedir: DıĢkı - En sık incelenen örnektir. Taze dıģkı veya formolle korunmuģ örnek olmalıdır. Hemen boyanamayacak örnekler için formol en uygun fiksatiftir. SAF diğer bir seçenektir. PVA da korunmuģ örnekler asit-fast boyama için uygun değildir! DıĢkı, eğer ilk örnek incelemesinin sonucu negatif ise, negatif sonuç vermeden önce 1-2 gün ara ile en az 2 kez daha incelenmelidir. NOT 1: Eğer örnek 30 dk içinde incelenemeyecekse dıģkı üç kaba ayrılmalıdır: birinci, fiksatif koymadan (taze); ikinciye, dıģkı miktarının 3 katı kadar %10 luk formol; üçüncüye de dıģkı miktarının 3 katı kadar PVA veya SAF konarak laboratuvara gönderilir (bkz. UMS, P-ÖY-01). NOT 2: Ġmmünodiagnostik veya moleküler yöntemlerde kullanılacak örnekler (dıģkı veya diğer) 1 haftaya kadar +4 C de ya da çalıģılıncaya kadar -20 C de saklanabilirler. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 7 / 17 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-03 / Sürüm: 1.1 /

8 Ayrıca, immün sistemi baskılanmıģ, açıklanamayan gastrointestinal Ģikayeti olan ve/veya kolanjitli hastalarda ince bağırsak aspirasyon sıvısı veya biyopsi örneği, safra, karaciğer biyopsi örneği; solunum sistemi Ģikayeti olan hastalarda balgam, BAL vb. örnekler; sinüziti olan hastalarda mide yıkama suyu incelenebilir (10). Diğer intestinal örneklerin parazitolojik incelemesi için(bkz. UMS, P-ÖY-02) Su örneği - Su kaynaklı bir salgından Ģüphelenildiği zaman en az 10 L su veya en az 10 L su geçirilmiģ filtre kartuģu Serum - Ġnsanlarda prevalans veya seroepidemiyolojik araģtırmalarda Reaktif/Kit Mikroskopi DıĢkının çoklaģtırılmasında gerekli reaktifler - bkz. UMS, P-TP-03. Modifiye Kinyoun asit-fast boyama reaktifleri - bkz. UMS, P-TP-05. Auramine-Rhodamine floresan boya - Piyasadan hazır temin edilebilir. Boyama için gerekli diğer solüsyonlar aģağıdaki gibi hazırlanır: (a) %0.5 asit alkol: 99.5 ml %70 lik etil alkole 0.5 ml konsantre HCl eklenerek edilir. Asit daima alkolün üzerine ve yavaģ eklenmelidir! Asla tersi uygulanmaz! (Hazırda %70 lik etil alkol yoksa, hazırlamak için 70 ml saf etil alkole 30 ml distile su eklenir). (b) %0.5 lik potasyum permanganat: 0.5 g potasyum permanganat 100 ml distile suya eklenir; manyetik karıģtırıcıda karıģtırılarak iyi erimesi sağlanır. Whatman No. 1 filtre kağıdından süzülerek koyu renkli bir ĢiĢeye alınır, etiketlenir. Antijen saptama yöntemleri Hızlı tanı testleri (immünokromatografik kart test) - Piyasadan temin edilebilir. DFA kitleri - Tek baģına veya diğer protozoonlarla (ör., Giardia sp) birlikte Cryptosporidium spp yi saptayabilen bu kitlerin duyarlılık ve özgüllükleri genellikle yüksektir. ELISA - Cryptosporidium spp ye özgü antikorların kullanıldığı duyarlılık ve özgüllüğü yüksek kitler tercih edilmelidir Moleküler yöntemler: Piyasada hazır DNA izolasyon ve PCR kitleri mevcuttur. PCR reaksiyonu moleküler laboratuvar ortamında, enzimler (Hotstart DNA polimeraz, urasil DNA glikozilaz), nükleotidler, primer ve probların (18S rrna; epizomal tekrarlar [SREHP gen bölgelerinin kullanıldığı] ) belli oranlarda karıģtırılması ile öz-yapım geleneksel PCR olarak da gerçekleģtirilebilir. PCR duyarlılığını artırmak amacıyla dıģkıdan DNA izolasyonunda uygun modifikasyonların kullanılması gerekebilir. Diğer gereç, donanım Mikroskopi için; Mikroskop, binoküler (rutin) 10 (düģük), 40 (yüksek kuru), 100 (immersiyon) objektifleri ve 10 oküleri olan tercih edilir. Sayfa 8 / 17 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

9 NOT: 5 oküler daha az büyütme sağlar ve inceleme duyarlılığını düģürür; bu nedenle 10 oküler kullanılması önerilmektedir (14). Modifiye Kinyoun asit-fast boyama gereç/donanımı (bkz. UMS, P-TP-05) Önceden temizlenmiģ lamlar (25 75 mm) tercihen kenarı rodajlı KurĢun kalem - lamın rodajlı kenarına örnek numarası vb. yazmak için Tahta veya plastik örnek alma çubuğu Kesici-delici atık kabı ve toksik boya atıkları için kimyasal atık kabı ELISA/DFA için; ELISA okuyucu, yıkayıcı Floresan mikroskobu - objektifler 40 ve 100 immersiyon; oküler 10 ; 365 nm eksitasyon, 450 nm emisyon filtreli; ve 490 nm eksitasyon, 510 nm emisyon filtreli. Ayarlanabilir otomatik mikropipetler ( µl) ve pipet uçları PCR ve diğer moleküler testler için; En az üç ayrı oda - Nükleik asit ekstraksiyonu, PCR karıģımının hazırlanması, amplifikasyonun ve sonuç gözetiminin yapılabileceği ayrı odalar. Ġdeal olarak PCR karıģımı hazırlama odası (temiz oda) pozitif basınçlı, agaroz jel elektroforezi yapılan oda (kirli oda) negatif basınçlı havalandırmaya sahip olmalıdır. Donanım biyogüvenlik kabini, santrifüj, soğutmalı mikrosantrifüj, hassas terazi, vorteks, su banyosu, yatay çalkalayıcı, PCR ısı döngü cihazı (gerçek zamanlı veya geleneksel), mikrodalga fırın, jel görüntüleme sistemi, elektroforez ünitesi vb Kalite kontrol Mikroskop belirli aralıklarla (yoğun kullanılıyorsa yılda en az bir kez) kalibre edilmelidir. Mikroskoba herhangi bir parça eklenmesi veya değiģtirilmesi durumunda da kalibrasyon yapılmalıdır. Kalibrasyon için kullanılmıģ optikler mikroskobun üzerinde olmalıdır. Tüm objektifler için kalibrasyon faktörleri göz önündeki bir panoda asılı olmalıdır (bkz. UMS, P-TP-01 Mikroskop Kalibrasyonu) (14). Her yeni hazırlanmıģ veya ticari reaktif seti veya kit lotu -moleküler testler için olanlar dahil- kullanıma sokulmadan önce pozitif kalite kontrol örnekleri ile test edilmelidir. Kullanılan kitlerin son kullanma tarihleri ve saklama koģullarına dikkat edilmelidir. Her kullanımdan önce solüsyonlar kontrol edilmeli; bulanık veya renk değiģikliği olmuģ solüsyonlar değiģtirilmelidir. Hazırlanan her preparat -ıslak iken- arkasından gazete kağıdı okunabilecek kalınlıkta olmalıdır. Pozitif kalite kontrol lamları formolde ile saklanmıģ Cryptosporidium spp içeren dıģkı örneklerinden hazırlanır. Boyama sonuçlarının uygunluğundan emin olmak için bu pozitif örnekler her zaman teste dahil edilmelidir. NOT: %10 formolde saklama süresi uzadıkça aside dirençli boyamalarda ookistlerin kaybolduğuna dair tartıģmalar vardır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 9 / 17 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-03 / Sürüm: 1.1 /

10 Boyamalar için hazırlanan her preparat -ıslak iken- arkasından gazete kağıdı okunabilecek kalınlıkta olmalıdır. Auramin-rhodamin boya Ģalesi oda sıcaklığında ve gün ıģığından korunacak Ģekilde muhafaza edilmelidir. Renk giderici solüsyon içeren Ģale her boyamadan sonra yıkanıp, yeniden doldurulmalıdır. Potasyum permanganat ilk hazırlandığında ve Ģale dibinde tortu olduğunda süzülmeli veya yeni boya hazırlanmalıdır. Her kullanımdan önce solüsyonlar kontrol edilmeli; bulanık veya renk değiģikliği olmuģ solüsyonlar değiģtirilmelidir. Floresan mikroskobu her açıldığında ampulün saatinin çalıģtığından emin olunmalı ve kullanım sonrası süre kaydedilerek ampulün ömrü takip edilmelidir. Tüm ekipmanın bakım ve kalibrasyonu düzenli olarak yapılmıģ olmalıdır. Tüm kalite kontrol sonuçları kaydedilmelidir. 3 Kriptosporidiyoz tanısında kullanılan teknikler 3.1. Tanı için akıģ Ģeması Ġshal etkeni olarak Cryptosporidium spp Ģüphesinde Dışkı örneği Taze Fiksatifte Mikroskopi 1 MAF, FM DFA 1 Antijen arama 2 ELISA Hızlı tanı testi Gerçek zamanlı PCR 2 Yoğunlaştırma Kullanılabilecek immün tanı kitlerini araģtır (sınırda pozitif ise doğrula) Mikroskopi Cins veya alt tipleri tanımla Mikroskopi 1 MAF, FM DFA 1 Pozitif ise Pozitif örnekleri tiplendir Pozitif ise Kriptosporidiyoz (KESĠN TANI) Rapor et, bildirim yap Şekil 2. Ġshal etiyolojisinde Cryptosporidium spp tanısı için akıģ Ģeması (10). 1 Direkt / konsantre edilmiģ dıģkı yaymaları 2 Bu testler -20 C de dondurulmuģ örneklerden de çalıģılabilir. Sayfa 10 / 17 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

11 3.2. Örneklerin inceleme için hazırlanması DıĢkı veya diğer klinik örnekler doğrudan veya bir yoğunlaģtırma iģlemi sonrası incelemeye alınabilir. Örneklerde ookist sayısı az olduğu tahmin ediliyorsa duyarlılığı yükseltmek için önce yoğunlaģtırma uygulanması önerilir. %10 formol ile laboratuvara gelen dıģkı örnekleri veya ishal vakalarına ait bol sulu örnekler 10 dk 500 xg de formol-etil asetat yöntemi ile çoklaģtırılmalıdır. Formol-etil asetat yönteminden baģka, Ģeker (Sheather in), tuz veya çinko sülfat solüsyonunda yüzdürme yöntemlerinden biri de yoğunlaģtırma için kullanılabilir. YoğunlaĢtırma uygulamaları için bkz. UMS-P-TP-03. Cryptosporidium spp enfeksiyonunda tipik olarak gözlenen sulu dıģkının varlığında ookistlerin çoğu mukus kısımlar içinde kalabilir ve incelenen örnekte bulunamayabilir. Mukuslu örneklere %10 luk KOH iģleminin uygulanması önerilir. Bu amaçla dıģkı örneği makroskopik olarak mukuslu kısımların varlığı yönünden iyi değerlendirilmelidir. (a) Örnek mukuslu ise; örneğe 10 damla %10 luk KOH eklenip, Ģiddetli karıģtırılarak (vortekslenerek) homojenize edilir. Ardından %10 luk formol eklenip, 500 g de 10 dk santrifüj edilir. Üst sıvı atılıp, dipteki çökeltiden yayma hazırlanır. (b) Ġyi bir yaymada, kurumadan önce ıslakken bakıldığında altına konmuģ bir gazete yazısını okumak mümkün olmalıdır. Diğer örnekler de (duodenal aspirat, safra, balgam, mide suyu vb.) santrifüj edilerek (500 g de 10 dk) çoklaģtırılmalı ve preparat çökeltiden hazırlanmalıdır. Kitlere dayalı teknikler (DFA, ELISA, hızlı tanı) ve PCR için taze veya dondurulmuģ örnekler kullanılabilir. Bu tekniklerin konsantre edilmiģ tekniklere uygulanıp uygulanmayacağı ile ilgili olarak üreticinin kullanma talimatındaki öneriler izlenmelidir. Kriptosporidiyoz Ģüphesinde kullanılan tanı yöntemleri ġekil 2 de verilen akıģ Ģemasında özetlenmiģtir 3.3. Örneklerin mikroskobik incelemesi Modifiye Kinyoun asit-fast (MAF) boyama Taze dıģkı örneklerinden veya çoklaģtırılmıģ örneklerden hazırlanan yayma preparatlar modifiye Kinyoun asit-fast tekniği ile boyanır ve 100 objektifle incelenir (bkz. UMS, P-TP-05). Cryptosporidium spp ookistleri (4-6 µm) mavi bir zeminde kırmızı, pembe, koyu mor boyanmıģ olarak görünürler (bkz. ġekil 3a ve b). Ancak boyanma değiģkenlik gösterebilir; ookistler arasında renk yoğunluğu yönünden farklılık gözlenebilir. Bazı ookistler boya almamıģ veya kısmen boyanmıģ olabilir (hayalet ookist) (bkz. ġekil 3b). Olgun ookistlerde sporozoitler (4 e kadar) ayırt edilebilir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 11 / 17 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-03 / Sürüm: 1.1 /

12 Mayalar ve fekal debris düz kırmızı boyanır. Bazı bakteri sporları da kırmızı boyanabilir ancak bunlar çok küçüktürler ve karıģıklığa neden olmazlar. MAF boyama kriptosporidiyoz tanısında geçerli asgari tekniktir. Bir diğer ifade ile MAF uygulanmıģ preparatlarda Cryptosporidium spp ookistlerinin görülmesi kesin tanı bulgusu olarak kabul edilir. Tek bir dıģkı örneğinin incelenmesiyle Cryptosporidium spp enfeksiyonlarının sadece yarısı saptanabilir. Ġlk dıģkı örneğinde negatif sonuç alınması tanıyı dıģlamaz. Kesin negatif sonuç için 1-2 gün arayla ikinci gerekirse üçüncü dıģkı örneği incelenmelidir. (a) (b) Şekil 3. DıĢkıda modifiye Kinyoun asit-fast boyama yöntemiyle boyanmıģ Cryptosporidium spp ookistleri (5). Auramin-rhodamin floresan boyama Çöktürme yöntemi ile elde edilmiģ örnek çökeltisinden Pastör pipeti yardımıyla 1-2 damla lam üzerine konur. 1 cm çapında bir daire oluģturacak Ģekilde yayma yapılır ve havada kurumaya bırakılır. NOT 1: Yedek olarak en az iki yayma hazırlanması boyama ve değerlendirmede hataların azaltılmasını sağlar. NOT 2: Boyama öncesinde yaymalar tamamen kurumuģ olmalıdır. Yaymalar boya köprüsü üzerine alınır; üzerini tamamen kaplayacak Ģeklide saf metanol dökülerek 1 dk fikse edilir. Süre sonunda alkolün fazlası dökülerek havada kurumaya bırakılır. Yaymalar auramine-rhodamine boya içeren Ģaleye daldırılır ve dk inkübe edilir. Ardından steril distile suyla yıkanırlar. Lamlar %0.5 lik asit alkol (70 ml alkol, 0.5 ml HCl, 30 ml distile su) içeren Ģaleye daldırılır ve 2-3 dk bekletilir. Tekrar steril distile suyla yıkanırlar. Lamlar %0.5 lik potasyum permanganat solüsyonu ile dolu Ģaleye aktarılır ve 3-4 dk bekletilirler. Son olarak steril distile suyla yıkanırlar. Sayfa 12 / 17 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

13 Lamlar havada kurutulduktan sonra immersiyon yağı damlatılarak floresan mikroskobunda 365 nm eksitasyon ve 450 nm emisyon filtreleri ile incelenir. Bu boyama ile aside dirençli olan ookistler ultraviyole altında turuncusarı renkli floresan veren yuvarlak-oval hücreler olarak gözlenir Direkt Floresan Antikor (DFA) Testi DFA Cryptosporidium spp tanısında duyarlılık ve özgüllük açısından altın standart kabul edilir. DFA testi, FITC ile iģaretli cinse özgül Cryptosporidium monoklonal antikorlarının, hasta örneğindeki ookistlerin yüzeyine bağlanarak görünür hale getirmesi prensibine dayanır. Formol içeren örneklere uygulanabilir. Santrifüj sonrası inceleme yapılması tanı Ģansını arttırır. Her kit mutlaka üreticinin talimatına göre kullanılmalıdır ve her test mutlaka pozitif ve negatif kontrol örneklerini içermelidir. Uygulama için bir talimat yoksa basitçe aģağıdaki adımlar izlenebilir: (a) Üretici tarafından tavsiye edilen çapta kuyucuklara sahip teflonlu lamlarda dıģkı yaymaları hazırlanır, metanol ile 1-2 dk sabitlenir ve havada kurutulur. (b) Kuyucuk üzerine 50 µl FITC ile iģaretli özgül monoklonal antikorları içeren reaktif eklenir. (c) Lamlar yatay bir Ģekilde, nemli bir ortamda, 37 C de dk karanlıkta inkübe edilir. NOT: Nemli ortam sağlamak için kapaklı bir cam tepsinin veya Petri kutusunun tabanına nemlendirilmiģ filtre kağıdı konur; üzerine lam köprüsü yerleģtirilir ve üzerine lamlar dizilir. Kapağı kapatılır ve inkübatöre konur. (d) Fazla antikorlar PBS ile yıkanarak uzaklaģtırılır. (e) Kapatma solüsyonu ( mounting medium ) damlatılıp, lamel kapatılır. (f) Floresan mikroskobunda 20 ve 40 objektiflerle incelenerek ookist varlığı araģtırılır. Bir FITC filtre sistemi (maksimum eksitasyon 490 nm, ve ortalama emisyon 530 nm) kullanıldığında monoklonal antikorların bağlandığı ookistler parlak elma yeģili floresan verirler. Floresan mikroskopta floresan boyalı ookistlerin görülmesi ile elde edilen pozitif sonuç kesin tanı bulgusudur. En önemli dezavantajı pahalı donanım ve yetiģmiģ personel gerektirmesidir. Bu özellikleri kullanımını sınırlamaktadır ELISA/Hızlı tanı testleri ELISA yüksek düzeyde duyarlı ve özgül bir yöntemdir ve en önemli özelliği çok sayıda örneğin aynı anda incelenebilmesidir. ELISA cihazı bulunan her laboratuvarda uygulanabilmesi bir diğer avantajdır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 13 / 17 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-03 / Sürüm: 1.1 /

14 Ġmmünokromatografik temelde hızlı tanı kitleri de yüksek düzeyde duyarlı ve özgül testler olup, hiçbir cihaz gerektirmeksizin uygulanabilmesi nedeniyle özellikle klinik laboratuvarlarda yaygın bir Ģekilde kullanıma uygundur. Tercihen taze dıģkı ile çalıģılır. Formol içeren örnekler de kullanılabilir. Kitler üreticinin talimatlarına göre kullanılmalıdırlar. ELISA ya da hızlı tanı testleri ile pozitif sonuç kesin tanı bulgusudur. ELISA ya da hızlı tanı testlerinde sınırda pozitif değerler DFA ile doğrulanmalıdır Moleküler tanı yöntemleri Cryptosporidium spp enfeksiyonlarının tanısında en duyarlı ve özgül moleküler yöntem gerçek-zamanlı PCR dır. Konvansiyonel, nested -PCR, PCR-RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) ve gerçek-zamanlı PCR dıģında birden fazla etkeni saptayabilen multipleks PCR yöntemleri de geliģtirilmiģtir. Tür ve genotiplerin belirlenmesinde en sık kullanılan hedef bölgeler SSU rrna, COWP, GP60, HSP70, Aktin ve β-tubulin i kodlayan genlerdir. DıĢkı örneğinden pozitif PCR sonucu kesin tanı bulgusudur Saklama, Referans merkeze gönderme Pozitif kalıcı boyalı preparatlar eğitim ve benzeri amaçlar için saklanmalıdır. Gerekli bilgiler lam üzerine yazılmalı ve bir arģivleme sistemi kurulmalıdır. Pozitif kalite kontrol lamları hazırlayabilmek için laboratuvar Cryptosporidium spp içeren bir dıģkı örneğini SAF içinde saklamalıdır. Eğer ileri tanı veya moleküler testler için örnekler baģka bir Ģehirdeki laboratuvara gönderilecekse, paketleme ve taşıma biyolojik materyal taģıma kurallarına uygun olmalıdır (15) (ayrıca bkz. UMS GEN-OY-01 Enfeksiyöz Maddelerin TaĢınması Rehberi). Mikroskobik inceleme amaçları için taze örnekler en fazla 24 saat içinde +4 C de Ģehirlerarası gönderilebilirler. Eğer örnekler Cryptosporidium yönünden hemen incelenemeyecekse, ideal olarak %10 formol içinde saklanmalıdır. Bu Ģekilde hem diğer mikroorganizmaların aģırı üremesi olasılığı ortadan kaldırılmıģ olmakta, hem de protozoonun morfolojisi korunmaktadır. NOT: Aslında mikroskopi için ookist morfolojisi de PCR DNA yapısı da +4 C de uzun süre korunabilmektedir. Bununla birlikte zorunlu olmadıkça, özellikle mikroskobik amaçlar için daha güvenli saklama yöntemleri tercih edilmelidir. ELISA, hızlı tanı testleri ve PCR için ise taze dıģkı örnekleri +4 C de 1 haftaya kadar saklanabilirler. Bu süre içinde analiz edilmeyecekse test gününe kadar -20 C de saklanırlar. Sayfa 14 / 17 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

15 NOT: DondurulmuĢ dıģkı örneklerinin moleküler analizler için, DNA yapısı etkilenmeden 2 yıldan uzun süreler boyunca saklanabileceği bildirilmektedir. Hatta uzun dondurma süresinin ardından DNA ekstraksiyon oranlarının arttığı, bunun muhtemelen dondurma sonucu zayıflamıģ ookist duvarının kolay parçalanması ile ilgili olabileceği ileri sürülmüģtür. Dondurularak saklanmıģ dıģkı örneklerinde, DNA hasar görebileceği için tekrarlayan çözdürme-dondurma iģleminden kaçınılması gerektiği belirtilmektedir. Yayma preparatlar; sabitlenmedikçe (tercihen metanol ile) Ģehirlerarası gönderilemezler. SabitlenmiĢ preparatlar, lam kutusu içine birbirine teması önlenecek Ģekilde yerleģtirilir ve oda ısısında gönderilirler. 4 Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim MAF, DFA ve hızlı tanı testlerinin sonucu örneğin laboratuvara geldiği gün rapor edilebilir. ELISA ve PCR için laboratuvar vaka biriktikçe inceleme yapıyor olabileceği için sonuç çıkıģ süresi değiģebilir. Her seferinde pozitif örnek kullanılacağı göz önüne alındığında DFA testinin de ekonomik nedenlerle vaka biriktirilerek çalıģılması kaçınılmaz olabilir. Hatırlanması gereken önemli bir husus vakanın bir salgın ile iliģkili olma ihtimalidir. Bu nedenle sonuçların her zaman mümkün olan en kısa sürede verilmesi hedeflenmelidir. MAF, DFA veya PCR ile elde edilen pozitif sonuç kesin tanı bulgusudur. ELISA veya hızlı tanı testleri ile elde edilen pozitif sonuçların ise MAF veya DFA ile ya da PCR ile doğrulanması gerekir. Genel olarak dıģkı incelemesi sonuçlarının değerlendirilmesi, yorumlanması ve raporlama ile ilgili ayrıntılı bilgi için UMS P-OY-01 DıĢkı örneklerinin parazitolojik incelemesi baģlıklı belgeye bakılmalıdır. Sonuçlar raporlanırken mutlaka incelemenin hangi teknik/boya kullanılarak yapıldığı rapora yazılmalıdır. Sonuçlar raporlanırken mutlaka saptanan parazitin adı ve formu kısaltma kullanılmadan açık olarak yazılmalıdır; Cryptosporidium spp ookistleri görüldü gibi. Cryptosporidium spp ülkemizde laboratuvardan bildirimi zorunlu bir etkendir (2). Tanı koyulması halinde olguların kayıt ve bildirimi için Sağlık Bakanlığının BulaĢıcı Hastalıkların Ġhbarı ve Bildirim Sistemi, Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi izlenmelidir (13). Vakanın bir salgınla iliģkili olabileceği hatırlanmalı ve bildirimler mümkün olan en kısa süre içinde yapılmalıdır. 5 Olası sorunlar/kısıtlılıklar Tek bir örnekten elde edilen negatif sonuç bir intestinal parazit enfeksiyonunu dıģlamaz. Güvenilir bir sonuç için çok sayıda dıģkı örneğinin (2-3 gün aralarla alınmıģ en az 3 örnek) incelenmesi gerekir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 15 / 17 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-03 / Sürüm: 1.1 /

16 DıĢkının makroskobik incelemesi ihmal edilmemelidir. Böylece mukus varlığı gözlenebilir. Çünkü, eğer mukus varsa ookistlerin mukus içinden serbestleģmesini sağlayabilmek için örneğe potasyum hidroksit uygulanması gerekir. Örnek kalitesi de sonucu etkiler. Florayı etkileyen antibiyotikler ve klorokin gibi antimalaryal ilaçlar, bağırsak protozoonlarının yakalanma olasılığını azaltır. DıĢkıya idrar karıģmamıģ olmalıdır. DıĢkı örneklerinin parazitolojik inceleme için alınmasından önce hastaya baryum, kaolin, magnezi kalsine, antiasitler, bizmut, hint yağı, mineral yağı verilmemiģ olmalıdır. Baryum verilmesinden sonra en az bir hafta geçmelidir. DFA ve auramin-rodamin boyaları ile inceleme yapmak için floresan mikroskop gereklidir ve bu yöntemlerle canlılık belirlenemez. Antijen saptamaya yönelik testler ile de morfolojik doğrulama yapılamaz. Bazı hızlı tanı testlerinin kalite kontrolü ve güvencesinde sorunlar vardır. Moleküler yöntemler pahalıdır, ayrıca, en sık kullanılan örnek olan dıģkı hem, bilirubin ve safra tuzları gibi PCR inhibitörleri içerir. Bazı fiksatifler de PCR yi inhibe edebilir. Yıkama uygulanmalıdır. İlgili diğer UMS belgeleri Bu prosedür belgesi (Cryptosporidium Türlerinin Mikrobiyolojik Tanısı) ayrıca aģağıda listelenen UMS belgeleriyle de ilgilidir. Özellikle, uygun inceleme örneklerinin temini ve boyama iģlemine hazırlanması hakkında yeterli bilgi için bu belgelere bakılması önerilir: UMS, P-ÖY-01 DıĢkı örneklerinin parazitolojik incelemesi UMS, P-ÖY-02 Diğer intestinal örneklerin parazitolojik incelemesi UMS, P-TP-01 Mikroskop kalibrasyonu (oküler mikrometre ile) UMS, P-TP-03 DıĢkı örneklerinin yoğunlaģtırma yöntemleri UMS, P-TP-05 Modifiye Kinyoun asit-fast boyama UMS, GEN-OY-01 Enfeksiyöz maddelerin taģınması rehberi Kaynaklar 1 Aksoy U, Akisu C, Sahin S, Usluca S, Yalcin G, Kuralay F, Oral AM. First reported waterborne outbreak of cryptosporidiosis with Cyclospora co-infection in Turkey. Euro Surveill 2007;12(2):E (son eriģim tarihi: ) 2 BulaĢıcı Hastalıklar Sürveyans ve Kontrol Esasları Yönetmeliğinde DeğiĢiklik Yapılmasına Dair Yönetmelik. Resmi Gazete; (son eriģim tarihi: ) 3 Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern. Cryptosporidiosis (son eriģim tarihi: ) 4 T.C. Sağlık Bakanlığı (BulaĢıcı Hastalıkların Sürveyansı ve Kontrolü Projesi TR Avrupa Birliği ve Dünya Bankası desteği ile) (AkbaĢ E, Pr DanıĢmanı). Türkiye de BulaĢıcı Hastalıkların Tanısında Mikrobiyoloji Laboratuvar Kapasitesi Mevcut Durum Değerlendirmesi: Anket - LabKap2012. XXXV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, KuĢadası, 4 Kasım Sayfa 16 / 17 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları / Sürüm: 1.1 / P-MT-03 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Parazitoloji

17 5 Dirim Erdoğan D. Ġnsanlarda Cryptosporidiosis Tanısında DıĢkı Örneklerinde Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Yeri (Uzmanlık Tezi). Ege Üniversitesi, Ġzmir. 2003, p Eckert J. Protozoa. In: Kayser FH, Bienz KA, Eckert J, Zinkernagel RM (eds). Medical Microbiology. Thieme New York, USA. 2005, p Doğruman Al F. Cryptosporidiosis. In: Korkmaz M, Ok ÜZ (eds). Parazitolojide Laboratuvar. 1. baskı. Türkiye Parazitololoji Derneği Yayınları. Meta Basım, Ġzmir. 2011, p Prescott LM, Harley JP, Klein DA eds. Human Diseases Caused by Fungi and Protozoa: Cryptosporidiosis. In: Microbiology. 5th ed., The McGraw-Hill Companies, USA. 2002, p McHardy IH, Wu M, Shimizu-Cohen R, Couturier MR, Humphries RM. Clinical laboratory diagnosis of intestinal protozoa. J Clin Microbiol 2013, p Chalmers RM, Katzer F. Looking for Cryptosporidium: the application of advances in detection and diagnosis. Trends in Parasitology 2013;29(5): Turgay N. Özel Boyama Yöntemleri. In: Korkmaz M, Ok ÜZ (eds). Parazitolojide Laboratuvar. 1. baskı. Türkiye Parazitololoji Derneği Yayınları, Meta Basım, Ġzmir. 2011, p OIE. Cryptosporidiosis. Chapter In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (Terrestrial Manual). The World Organization for Animal Health (OIE). 2013, p (son eriģim tarihi: ) 13 BulaĢıcı Hastalıkların Ġhbarı ve Bildirim Sistemi, Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi, Sağlık Bakanlığı. Ankara abreh.pdf (son eriģim tarihi: ) 14 Garcia LS. Calibration of microscope with an ocular micrometer. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p Enfeksiyöz madde ile enfeksiyöz tanı ve klinik örneği taģıma yönetmeliği. Sağlık Bakanlığı, Ankara. Resmi Gazete Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 17 / 17 Parazitoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / P-MT-03 / Sürüm: 1.1 /