Hücre Zarı ve Duvarının Yapısına Giren Diğer Polisakkaritler ve Glikosilasyon Tipleri

Transkript

1 Hücre Zarı ve Duvarının Yapısına Giren Diğer Polisakkaritler ve Glikosilasyon Tipleri Yrd.Doç.Dr.Yosun MATER Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

2 Bakteri ve Alg Hücre Duvarlarında Bulunan Heteropolisakkaritler Yrd.Doç.Dr.Yosun MATER Glikoproteinler tüm ökaryot hücrelerde olmasına ve çalışılmasına rağmen bakterilerde genellikle (β 1 4) bağlı N-asetilglukozamin (NAG) ve N-asetilmuramik asit (NAM) birimleri şeklinde bulunur. Bu linear formda heteropolimerlerden oluşan yapıya Peptidoglikan adı verilir. Peptidoglikan tabakayı oluşturan NAM birimlerine bağlı, L-alanin, D- Glutamin, L- Lizin ve D- alaninden oluşan 4 amino asit (aa) içerir. Diğer N- asetilmuramik asitlere de bu aa üzerinden oluşturdukları çapraz peptit bağları ile bağlanırlar (Şekil 7.22).

3 Bakteri ve Alg Hücre Duvarlarında Bulunan Heteropolisakkaritler Lizozim enzimi yardımıyla bu şeker residüleri arasındaki (β 1 4) bağları kırılır ve birimler birbirinden ayrılarak bakteri hücre zarı parçalanır. Bu durum bakterinin ölümü ile sonuçlanır. Ör: Gözyaşında lizozim enzimi vardır. Göze bulaşan bakteriler gözyaşındaki lizozim nedeniyle parçalanır ve ölürler. Böylece göz enfeksiyondan korunmuş olur. Benzer etki yine bazı antibiyotiklerin özellikle Penisilin antibiyotiğinin ve türevlerinin hücre duvarının yapısını yıkması ile görülebilir. Böylece antibiyotikler bakterilerin doğrudan ölümüne ve/veya lizize hassas olmasına neden olabilir.

4 Bir kırmızı alg türü olan Agar agar dan elde edilen, ve günümüzde genellikle temel formu bakterilerin büyütme ortamında besiyeri katılaştırıcı olarak kullanılan agar ve farklı kimyasal bir formu DNA boyutunun belirlenmesi için elektroforez tekniğinde, DNA yürütülmesi için dolgu maddesi olarak kullanılan agaroz maddesi de bir heteropolisakkarit yapıdır. (Şekil 7.23).

5 N ve O- Bağlı Oligosakkaritlerin Yapıları 1.Giriş N-bağlı glikoproteinler tüm ökaryot hücrelerde olmasına ve çalışılmasına rağmen bakterilerin birkaçında bulunmuş ve çalışılmıştır. Şekerler proteinlere ve lipitlere bağlanarak genellikle hücre zarının dış yüzünde yerleşir ve zaman zaman sitoplazmada yer alır. Ökaryotlarda şekerler yaygın olarak üç farklı amino asite bağlanır. N bağlı şekerlerde bu bağlanma noktası asparagin in amid grubunun nitrojenidir. O - bağlı oligosakkaritlerin tipik yapısında bağlanma; serin ve threonin hidroksil gruplarından gerçekleşir.

6

7

8 Beş (5) sakkarit-şeker tipi her zaman N- bağlı oligosakkaritlerde bulunur. Yüksek mannoz içeren oligosakkaritler en az 3 mannoz içerir. Bazı protozoon ve mayalarda bu bölgede 60 mannoz birimine rastlanmıştır. O bağlı oligosakkaritler genellikle kısadır, genellikle dört şeker içerirler. Bununla beraber bazı O bağlı oligosakkaritler (A, B, 0 gibi kan grubu antijenleri) oldukça uzun yapılıdır. N bağlı oligosakkaritlerde genellikle bulunan beş tip şeker ve herzaman görülen N asetil glukozamin sayısı kadar mannoz olması karakteristiktir.

9 Çoğu sitosolik ve nüklear proteinler genellikle glikosilasyona uğramazlar. Bununla beraber nüklear por kompleksinde yer alan bir tür protein ve çeşitli transkripsiyon faktörleri glikosilasyona uğrar. Glikosilasyona uğrayan bu örnekler, tek bir N- asetilglukozamin, serin veya threonin hidroksil grubuna bağlanırlar. Hayvan hücrelerinde buna örnek olarak asparagine bağlı şeker molekülleri verilebilir. Bu şeker molekülü N-asetilglukozamin dir ve genellikle β bağları ile asparagine bağlanırlar.

10

11 2.N-bağlı Glikanların Sentezlenmesi N-bağlı şekerlerin sentezlenmesi 3 temel adımda gerçekleşir. Buna göre, 1.Lipid bağlı öncü oligosakkaritin oluşumu, 2.Oligosakkaritin blok halinde polipeptite taşınması 3.Oligosakkaritin işlenmesi Bu basamaklar hücrede farklı kısımlarda meydana gelirler. 1. ve 2. basamak Granüllü Endoplazmik Retikulum (GER) lümeninde oluşurken, 3. basmağın ilk trimleri (Şekillendirmesi) GER lümeninde, sonraki trimlemeler ve şekerlerin işlenmesi ise Golgi sahasında gerçekleşir. Bu trimleme aşamasında bazı şeker birimleri uzaklaştırılırken, bazı şekerlerde eklenir (Şekil 2.2).

12

13 3.Farklı N-Bağlı Oligosakkarit Parçalarının Esas Yapısal Özellikleri N bağlı oligosakkaritlerin bağlandığı proteinler oldukça farklı yapıya sahiptir. Kompleks N bağlı oligosakkaritlerin çoğu serum proteinleri ve viral proteinlerde bulunur. Bunlardan ilki; N asetilglukozamin, mannoz, fukoz, galaktoz ve N- asetilneuraminik asit içerirler. Bu glikoproteinlerin arasında farklar dallanma sayılarına ve N asetilneuraminik asit kalıntılarının sayılarına bağlı olarak ortaya çıkar. Bazı durumlarda N asetilneuraminik asidin 2 numaralı karbon atomunu galaktozun 3 numaralı karbon atomuna bağlanır (α 2 3), diğerlerinde bu 6 numaralı karbon atomuyla (α 2 6) olur. Bazı durumlarda, bu dallar α 2 8 bağlı N asetilneuraminik asidin uzun polimerlerine sahiptir. Diğer dallarda da yer alan ve tekrar eden disakkaritler de bu çeşitliliğe katkıda bulunur. Buna galaktoz β 1 4 N asetilglukozamin sınıfı örnek olarak verilebilir.

14 İkinci bir proteinlere bağlanan oligosakkarit sınıfı ise yüksek mannoz içeren N bağlı oligosakkaritlerdir. Sadece N asetilglukozamin ve mannoz içerirler. Bu sınıfın üyeleri esas olarak N asetilglukozamine bağlanan mannoz sayılarıyla farklılaşırlar. Bazı durumlarda, kompleks ve yüksek mannozlu oligosakkaritler benzer polipeptit de farklı asparagin kalıntılarına da bağlanabilirler. Yüksek mannozlanmış ve N bağlı oligosakkaritler, üç mannoz ve iki N asetilglukozamin kalıntısı içeren benzer alt birimlerden oluşmuş çok sayıda farklı proteinler ile aynı konfigürasyona sahiptir.

15 Bu bize N bağlı oligosakkaritler benzer ve sık rastlanan bir prekürsörden yapıldığını düşündürür. Bununla beraber farklı yapılara sahip glikoproteinlerin varlığı, farklı prekürsörlerin yardımıyla arka-arkaya çok sayıda işleme basamakları sonucu özelleşmiş şekerlerin ortaya çıktığını göstermiştir. GER da ve çeşitli Golgi alt birimlerinde lokalize olan çok sayıda enzim sonucunda bu prosesler gerçekleşir ve bu çeşitlilik oluşur.

16 4.Nükleotid Şekerler için Golgi Zarlarının Permeaz İçerikleri N asetilneuraminik asit ve galaktoz gibi şekerlerin proteinlere katılması Golgi lümeninde meydana gelir. Nukleosidik şeker yapıları, sitosoldeki nukleosit trifosfatlar ve şeker fosfatlarından oluşturulur. Golgi zarları CMP N asetilneuraminik asit ve UDP galaktoz gibi şeker nukleotidleri için özel taşıyıcılar içerir. Bunlar permeaz yapılı taşıyıcılardır (Antiport lardır). UDP ve CMP gibi nukleotidler, glikozil transferaz reaksiyonlarıyla düzenlenirler ve Golgi keseciklerinden dışarı taşınırlar.

17 İlk olarak UDP, UMP ve Pi la hidrolizlenme gerçekleşir. Burada yer alan UMP, UDP galaktoz, UDP N asetilglukozamin veya UDP N asetilgalaktozaminin birebir değişimi için Golgi keselerinden dışarı taşınır. Diğer antiportlar CMP için N asetilneuraminik asit ve GMP için UDP mannoz un birebir değişimini katalizler. Antiportlar ile katalizlenen bu değişimler oligosakkarit sentezi için bir ihtiyaçtır. Çünkü bu sayede Golgi keselerindeki nukleotid şekerlerin konsantrasyonunun değişmez bir seviyede korunması mümkün olur.

18 5. N- Bağlı Oligosakkaritlerin Yaygın bir Prekürsörden Sentezi ve Sonraki İşleyişi Tek hücreli ökaryotlar ve bitkilerdeki tüm N bağlı oligosakkaritlerin öncüllerinin yapısı 3 glukoz, 9 mannoz ve 2 N asetilglukozamin molekülü içeren dallı bir yapıdır. Bu öncül oligosakkarit yapısı doymamış uzun bir lipit zincirinden oluşan (7595 C atomu içerir). Dolikolde (Dolichole) 5 karbon atomundan oluşan 19 molekül uç uca birleşir (Şekil 2.3). Bu yapı fosforil kalıntılarıyla bağlanır. Lipit yapısı hidrofobik kısmını oluşturur ve uzun yağ zincirleri kuyrukları arasında katlanarak yer alır. Çoğunlukla ER zarında, bazen zarın iç tarafında serbest veya esterleşmiş olarak bulunur. Dağılımı göz önüne alınarak hem N-glikosilasyon da hem de zarlı yapıların biyogenezinde yer aldığı düşünülmüştür.

19

20 Dolikol-fosfat yapısı öncül oligosakkariti E.R da düzenler ve yönlendirir. Bu nedenle dolikolün parçaları E.R zarında ve E.R yüzeyinde oligosakkarit parçaları içine gömülmüştür. Bu prekürsörün biyogenezinde ve öncül şekere bağlanmasında GER in zarına bağlı enzimler görev alır. Oligosakkarit zincirin tamamı Asn X Ser veya Asn X Thr sırasını tanıyan tri-peptit sıraları vasıtasıyla, asparagin aminoasiti içeren polipeptide transfer edilir. Burada X prolin hariç tüm aminoasitler olabilir. Bu eklenme basamaklarına daha detaylı bakarsak; Öncü oligosakkaritler Dolikole iki aşamada bağlanır.

21 1.Aşamada Uridin difosfat (UDP) GlcNAc, Guanozin difosfat (GDP) nukleotid şeker vericilerinden enzimlerle 2 GlcNAc ve 5 Mannoz eklenir. Glikan daha sonra GER lümenine taşınır. 2.Aşamada GDP, UDPGlc, sitosol tarafında bağlanan nukleotid şeker vericilerinin (Dolikol fosfomonosakkaritler) GER lümenine taşınmasından sonra 4 Mannoz, 3 Glukoz eklenir. Bu sırada oluşan glikosidik bağlar için gerekli enerji şeker-fosfat bağlarından elde edilir. Ondört birimlik öncül şeker çekirdek yapısı şekillenirken Dolikole, ilk olarak iki GlcNAc sonra beş Mannoz ER zarının sitosole bakan tarafında eklenir.

22 Buradaki oluşan ara ürün bir taşıyıcı ile ER Lumenine atlar daha sonraki monosakkaritler ER lumeninde eklenir. Dolikole ilk fosfat CTP dan eklenir ve Dolikol-P oluşur. Bu yüksek enerji bağ sayesinde oligosakkaridin sonunda yer alan asparagin yan zincirine bağlanmak için aktifleşir. İlk GlcNAc lipit Dolikol-P a UDP-GlcNAc vericisinden, GlcNAc-I fosfotransferaz enzimiyle eklenir. İkinci GlcNAc, GlcNAc-transferaz enzimiyle eklenir. Arkadan beş mannoz GDP-Mannoz vericisinden, Mannoz-transferaz enzimiyle eklenir.

23 Sonraki aşamalarda ER lümeninde Mannoz vericisinden (Dolikol-P ve GDP-Mannoz dan oluşan yapı) dört Mannoz u Mannoz transferaz enzimi ile ekler. Son olarak, glukoz vericisinden (Dolikol-P ve UDP-Glukoz dan oluşan yapı), üç glukozu, glukoz transferaz enzimi ile ekler. Böylece sinyal gibi görülen bu son glukoz ekleme aşamasını takiben Dolikol-P oligosakkarit öncüsünün işlenmesi tamamlanır (Şekil 2.4).

24

25 Benzer şekilde ama farklı basamaklarda ve uzunlukta hemen tüm hücre zarı tanıma-tutunma glikoproteinleri diğer bir değişle ekstrasellüler matriks elemanları, E.R. ve Golgi de benzer yapılım ve trimleme işlemlerden geçerler. Bunları kabaca (Şekil 3.1) de ki gibi özetleyebiliriz.

26 6. Oligosakkaritlerin Polipeptide Blok Halinde Taşınması ve Oligosakkariltransferazlar Oligosakkaritlar GER lümeninde meydana gelir. GlcNAc-asparagin bağı oligosakkariltransferaz ile kurulur. Bu bağın oluşması için gerekli enerji glikan-fosfat bağının kırılmasından sağlanır. Fosfataz, Dolikol-fosfat oluşturmak için kullanılır.

27 Oligosakkariltransferaz (OST) bileşeni, ökaryotların ER zarlarında yer alan çok alt birimli bir protein bileşenidir. Lipide bağlı oligosakkarit öncüsünü asparagine taşınmasında görev alır. Mayalarda dokuz farklı bölge içerdiği belirlenmiştir. Tüm OST alt birimleri zarı yapısını geçebilen proteinlerdir. OST bileşeni lipide bağlı oligosakkaride bağlanır. Yüksek enerjili GlcNAc-P bağının kırılması ve Dolikol- fosfat ın, serbest bırakılmasıyla uzayan proteine oligosakkarit öncüsünü taşır. Oligosakkariltransferaz GER lümeninde riboforin proteinlerine yakın yer alır. Uzayan polipeptitte Ser/Thr dizisini tanır.

28 Katlanmamış polipeptide öncül oligosakkaritleri taşır. Asn-X-Ser/Thr dizisi polipeptidlerin yüzeyindedir. Polipeptidler hızlı katlanırlarsa OST ulaşamaz, glikozilasyon oligosakkarit öncüsünün bağlandığı diziler Asn-X-Thr/Ser sırasını taşır. X, Prolin dışında herhangi bir amino asit olabilir. Asn-X-Cys bazı durumlarda kullanılır.

29 7. N-Glikan Olgunlaşması Dolikol oligosakkarit öncüsünden oligosakkaridin kovalent bağla Asn e bağlanmasından sonra bir seri reaksiyon meydana gelir. İlk birkaç safha bütün ökaryot hücrelerde değişmeden korunur. Glikoprotein katlanmasının lizozomal trafiğin düzenlenmesinde anahtar rol oynar. Oligosakkaritlerin işlenmesinde, ekzoglikosidazlar, su (H 2 O) katılımıyla glikosidik bağı kırarlar.

30 7. N-Glikan Olgunlaşması (DEVAM) Üç glukoz kalıntısının uzaklaştırılması GER lümeninde meydana gelir. Glikosidaz I en uçta yer alan glukoz monosakkaridini koparır. Glikosidaz II diğer iki glukoz kalıntısını koparır. Üçüncü glukozun uzaklaştırılması GER dan taşınma sinyali oluşturulur. Sonuçta oluşan glikoproteinin katlanması, kalite kontroluyla bağlantılıdır. Yani eğer düzgün sentezlendiyse ve hata yapılmadıysa, düzgün katlanmayı yapar ve hücredeki fonksiyonunu gerçekleştirir.

31 8.N Bağlı Oligosakkaritlerin Modifikasyonunun Golgi Keseciklerinde Tamamlanması Protein sentezlendikten sonra, oligosakkarit eklenme prosesinin tamamı dakika içinde gerçekleşir. Bu sırada protein Golgi keseciklerinde lokalize olmuştur. Bu basamakta reaksiyonlar koordine edilir. 3 N asetilglukozamin, 3 galaktoz, 1 ila 3 adet arasında N asetilneuraminik asit ve 1 fukoz her bir zincire bu süre içinde katılır. Bir plazma zar proteininde, oligosakkaritin işlenmesi 10 dakika veya daha az bir zamanda gerçekleşir. Protein konformasyonu ve sonuçta aminoasit sıraları belirlenir.

32 Özellikle N bağlı oligosakkaritler kompleksleşmeye veya yüksek mannoz içermeye başlar. Bir organizmada bulunan özel hücre tiplerinde işlevsel enzimlerin özel bileşenlerini içerir. Tek hücre tiplerinde aynı proteinlerin farklı karbonhidratlardan oluşturulmasıyla benzer proteinler üretilir. Örneğin influenza virusunun HA glikoproteinlerin de, bulunan asparaginlerin eklediği kompleks oligosakkaritlere sahiptir. Virus bir hücre tipinde geliştiği zaman yüksek mannozlu oligosakkarit içeriyorsa, hücre başka bir hücre tipine gelişir.

33 Elektron mikroskobu ve otoradyografi çalışmaları farklı organeller de ve proteine katılan farklı şekerleri açıkça göstermiştir. Hücreler [H 3 ] lü mannozla karşılaştırıldığı zaman tüm radyoaktivite E.R içinde görülmüştür. [H 3 ] fukoz veya [H 3 ] galaktoz bunun tersi olarak trans Golgi de gözlenmiştir. Buna karşın galaktoziltransferazlar en fazla trans Golgi keselerinde ve sialitransferaz ise trans Golgi ve trans Golgi retikulumda bulunmuştur. Bunun için N bağlı oligosakkartiler bir otomobil gibi benzer modifikasyon geçirir, belli bir çizgide toplanırlar. Bu proteinler organelden organele taşınır. Her bir organelde geniş bir enzim setiyle karakteri belirlenir.

34 9.N Bağlı ve O Bağlı Oligosakkaritlerin Oluşturduğu Salgıların ve Zar Proteinlerinin Hataları Pek çok örnekte, N bağlı oligosakkaritler salınan proteinlerde veya plazma zarında glikoproteinlerin hareketi için gereklidir. Oligosakkarit lipit donörleri (Ör: dolikol vbg) oluşumunun ilk basamaklarında tunikamisin antibiyotiğiyle bloke edilebilir. Bu durumda polipeptit sentezlenir, fakat N bağlı şeker zincirlerini içermez. Şeker kısmını içermeyen protein katlanamaz ve görevleri için gerekli konformasyonları oluşturamazlar dolayısıyla çalışamazlar. Örneğin HA glikoprotein trimer yapısını oluşturamaz ve GER içinde kalır. N bağlı oligosakkaritlerin yokluğunda, çoğu proteinin salınması, IgG antibadileri veya α 1 antiprotezlarında olduğu gibi bloke edilir ve normal olmayan protein katlanmaları gerçekleşir. Bunlar E.R da seçilerek salınmaz.

35 Buna karşın bazı durumlarda yer alan proteinler N bağlı oligosakkaritler olmadan da salınabilir. Buna örnek olarak; glikosilat ve unglikosilatlı fibroblastlar ile onlara benzer yapıda olan fibronektinlerin salınma hızı ve oranı verilebilir. Bununla beraber unglikosil fibronektin doku proteazlarıyla parçalanmaya, normal glikosilat fibronektinden daha yatkındır. Bu nedenle karbonhidratların katılmasıyla hücre dışı matriks proteinlerinin daha kararlı bir yapıya sahip olduğu düşünülmektedir.

36 Proteinlerin kararlılığı ve konformasyonu O bağlı oligosakkaritlerin etkisiyle de olabilir. Buna örnek olarak da LDL reseptörleri verilebilir. Normalde 30 civarında LDL (=Low density lipoprotein) reseptörü vardır. O bağlı oligosakkaritlerin sentezinde oluşan hatalı ürünlere sahip hücrelerde LDL reseptörleri yapılır. Normal olarak glikosilat reseptörlerinin plazma zarına hareket etmesi, hücre yüzeyini proteazlara karşı ve hücrelerden ayrılmaya karşı koruması beklenir. Unglikosilat yapıdaki hatalı reseptörleri bunu gerçekleştiremezler.

37 Diğer bir değişle, hata durumunda, glikosilasyonun yokluğunda reseptörler görevini yapamaz. Değişime uğrar ve belirsizleşirler. Bu bulgular ışığında araştırıcılar şekerlerin hücre yüzey proteinlerinin hareketi için gerekliliğini incelemeye başlamışlardır. Bu konu üzerine yapılan çalışmalar karbohidratların ya doğru elektrik yüklenmesinde önemli olduğunu, ya doğru konformasyon oluşturmada ya da olgun proteinlerin kararlılığında rol oynadığını göstermektedir. Bazı proteinler için bu fonksiyonların hepsinde karbohidratların önemi belirlenmiştir.

38 Kullanılan Kaynaklar 1.Lehninger Principles of Biochemistry, D.L. Nelson and M.M. Cox, University of Wisconsin Madison, 4th Ed Introduction to Glycobiology; M.E. Taylor, K. Drickamer, 2nd Ed. Oxford Press, E.Ü. Fen Fak. Moleküler Biyoloji AD. Prof.Dr.Sabire Karaçalı Glikobiyoloji Ders Notları 4. Essential of Glycobiology, A. Varki et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1st.Ed.1999, 2nd Ed. 2009)