ALKOL DÜZEYİ BELİRLEME YÖNTEMİNİN VALİDASYONU VE TOPLUMUMUZDA ALKOL METABOLİZE EDEN ENZİM POLİMORFİZMİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ALKOL DÜZEYİ BELİRLEME YÖNTEMİNİN VALİDASYONU VE TOPLUMUMUZDA ALKOL METABOLİZE EDEN ENZİM POLİMORFİZMİ Şebnem Şefika ÇEÇEN DİSİPLİNLERARASI ADLİ TIP, ADLİ KİMYA VE ADLİ TOKSİKOLOJİ DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof.Dr.Tülin SÖYLEMEZOĞLU 2006-ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ALKOL DÜZEYİ BELİRLEME YÖNTEMİNİN VALİDASYONU VE TOPLUMUMUZDA ALKOL METABOLİZE EDEN ENZİM POLİMORFİZMİ Şebnem Şefika ÇEÇEN DİSİPLİNLERARASI ADLİ TIP, ADLİ KİMYA VE ADLİ TOKSİKOLOJİ DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof.Dr.Tülin SÖYLEMEZOĞLU Bu tez Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü tarafından Toplumumuzda Alkol Dehidrojenaz ve Aldehit Dehidrojenaz Polimorfizminin Toksik Etki Mekanizmaları ve Alkolizm Yönünden Araştırılması başlıklı ve numaralı proje kapsamında desteklenmiştir ANKARA

3

4 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz vii Simgeler ve Kısaltmalar viii Şekiller ix Çizelgeler xi 1. GİRİŞ Alkol Etanolün Ve Asetaldehitin Biyokimyasal Özellikleri Alkole Bağlı Gelişen Medikal Sorunlar Alkolün Lokal Etkileri Alkolün Sistemik Etkileri Alkolün Vücutta Dağılımı Etanol ve Asetaldehit Metabolizması Etanol Metabolizması Alkol Dehidrogenaz (ADH) Alkol Metabolizmasında ADH Gen Polimorfizminin Etkileri Gastrik ADH Alkol Metabolizmasında Bakteriel ve Barsak ADH ın Rolü Metabolik Değişiklikler Mikrozomal Etanol Oksitleyici Sistem (MEOS) Katalaz Asetaldehit Metabolizması Aldehit Dehidrogenaz (ALDH) Asetaldehit ve Asetatın Oluşturduğu Metabolik Değişiklikler Asetaldehitin Oluşturduğu Organ Toksisitesi Sito-genetik Etkileri Asetaldehit-Protein Adductları Alkol Metabolizmasında Rol Oynayan Faktörler Cinsiyet ve Beden Yapısı 27

5 iv Gıda ve Gıda Bileşenlerinin Etkisi Irkların ve Genetik Polimorfizmin Etkisi Kronik Alkol Tüketiminin Etkileri Alkol Ve Kanser Orofarinks ve Özafagus Kanseri Mide Kanseri Kalın Bağırsak Kanseri Kronik Alkol-İlaç Etkileşimleri Etanolün Ksenobiyotiklerle Akut Etkileşimleri Headspace Analiz Nedir? Headspace Analizin Genel İlkeleri Headspace Vialinde Fazlar Doğru Vialin ve Kapağın Kullanılması Inorganik Tuzların İlavesi Headspace Numune Hacmi Headspace Cihazı Basınçlı Döngü Sistemi Genetik Polimorfizm DNA Ekstraksiyonu Organik (Fenol-Kloroform) Ekstraksiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)-DNA Amplifikasyonu PCR Bileşenleri Isı Döngü Aygıtları (Thermal Cycler) PCR-CTPP (Polimerase Chain Reaction-Confronting Two Pair Primers) Yöntemi 52 2.GEREÇ VE YÖNTEM Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Araç ve Gereçler Deney Protokolü Yöntemler Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Gaz-Kromatografi Yöntemi 56

6 v Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Gaz- KromatografiYönteminin Koşulları Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Headspace Analizörü Koşulları Yöntem Validasyon Çalışmaları Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Standartlarının Hazırlanması Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Kalibrasyon Grafiklerinin Oluşturulması Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Tekrarlanabilirlik Çalışmaları Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Verim (Geri Kazanılabilirlik) Çalışmaları Hassasiyet Alkol Dehidrogenaz (ADH2) ve Aldehit Dehidrogenaz (ALDH2) Enzim Polimorfizminin Belirlenmesi Kan Örneklerinden DNA İzolasyonu PCR Amplifikasyonu Alkol Dehidrogenaz (ADH2) Enzim Polimorfizmi PCR Amplifikasyonu Aldehit Dehidrogenaz (ALDH2) Polimorfizmi PCR Amplifikasyonu DNA Elektroforezi DNA Elekrtoforez Jelinin Hazırlanması İstatistiksel Analiz BULGULAR Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Metod Validasyon Çalışması Sonuçları Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Kalibrasyon Grafikleri 68

7 vi Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Tekrarlanabilirlik Çalışmalarının Sonuçları Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmalarının Sonuçları Sudan Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmasının Sonuçları Kandan Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmasının Sonuçları İdrardan Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmasının Sonuçları Tükrükten Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmasının Sonuçları Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Hassasiyet Çalışması Sonuçları %40 lık Bir Alkollü İçeceğin %40 lık Olup Olmadığının Tespiti Toplumumuzda Alkol Dehidrogenaz (ADH2) ve Aldehit Dehidrogenaz (ALDH2) Polimorfizminin Belirlenmesi İçin Yapılan PCR-CTPP Çalışmalarının Sonuçları Alkol Dehidrogenaz (ADH2) Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan PCR-CTPP Çalışmalarının Sonuçları Aldehit Dehidrogenaz (ALDH2) Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan PCR-CTPP Çalışmalarının Sonuçları 87 4.TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 100 ÖZET 101 SUMMARY 102 KAYNAKLAR 103 EKLER 118 ÖZGEÇMİŞ 121

8 vii ÖNSÖZ Doktora öğrenimim ve tez çalışmalarım süresince beni her konuda yönlendiren, tez ve hayatla ilgili her konuda bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım, Ankara Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü Müdür Yardımcısı, danışman hocam Prof. Dr Tülin Söylemezoğlu na, Tez bulgularımın istatistiksel olarak değerlendirilmesinde yardımlarını esirgemeyen hocam Prof. Dr. İzzet Duyar a; Her zaman ve her durumda yanımda olduğunu bildiğim ve araştırmalarım için yardımlarını esirgemeyen Adli Toksikolog Dr. Banuçiçek Yücesan a, Yorucu laboratuvar çalışmaları boyunca beni yalnız bırakmayan canım dostlarım Uzm. Biyolog Zeliha Kayaaltı ve Uzm. Biyolog Ayşe Karakuş a ve Uzm. Biyolog Serap Yalçın a, Bana dürüstlüğün, çalışkanlığın, özgüvenin ve sabrın başarıyı getireceğini öğreten, maddi ve manevi destek ve güvenlerini her zaman hissettiğim tüm aileme sonsuz saygı ve şükranlarımı sunar teşekkür etmeyi bir borç bilirim.

9 viii SİMGELER VE KISALTMALAR DNA U A C T G Arg His Glu Lys ADH2 ALDH2 PCR bp PCR-CTPP IS AA dntp LOD LOQ SD CV RSD LPO GSH FPM ROT Deoksiribonükleik asit Urasil Adenin Sitozin Timin Guanin Arjinin Histidin Glutamat Lizin Alkol dehidrogenaz Aldehit dehidrogenaz Polimerase chain reaction (polimeraz zincir reaksiyon) Base pair (baz çifti) Polimerase chain reaction-confronting two pair primers İnternal standard (iç standart) Asetaldehit Deoksiribonükleozidtrifosfatlar Limit of detection (Deteksiyon limiti) Limit of Quantification (Kantitasyon limiti) Standard deviation (Standart sapma) Coefficient of variation Relative standard deviation (Rölatif standart sapma) Lipid peroksidasyon Glutatyon First pass metabolism (ilk geçiş etkisi) Reaktif oksijen türleri

10 ix ŞEKİLLER Şekil 1.1. Hepatik etanol metabolizması 10 Şekil 1.2. A) Alkol dehidrogenaz (ADH ve nikotinamide adenin dinükleotid (NAD + ) ile etanol oksidasyonu B) hepatik mikrozomal etanol oksitleyici sistem (MEOS; sitokrom P450 2E1 ve nikotinamide adenin dinükleotid fosfat (NADPH) ı içerir C) NADPH oksidaz ve katalaz kombinasyonu ile etanol oksidasyonu D) ksantin oksidaz ve katalaz ile etanol oksidasyonu 11 Şekil 1.3. Etanol metabolizmasına bağlı olarak gelişen hepatik metabolik değişiklikler 19 Şekil 1.4. Headspace vialindeki fazlar 39 Şekil 1.5. Headspace de basınçlı döngü sistemi ile enjeksiyon 42 Şekil 1.6. DNA izolasyonunda kullanılan organik (fenol-kloroform) Ekstraksiyonu 44 Şekil 1.7. PCR ın aşamaları 47 Şekil 1.8. PCR-CTPP yönteminin temel çalışma prensibi 53 Şekil 3.1. Metanol ve etanolün 50, 100, 200, 300, 400 mg/100 ml konsantrasyonlarında kalibrasyon grafiğinde kullanılma amacıyla hazırlanan stok çözeltilere ait kromatogramları 71 Şekil 3.2. Metanol kalibrasyon grafiği ve regresyon denklemi 73 Şekil 3.3. Cihazdan alınan metanol kalibrasyon grafiği 73 Şekil 3.4. Etanol kalibrasyon grafiği ve regresyon denklemi 74 Şekil 3.5. Cihazdan alınan etanol kalibrasyon grafiği 75 Şekil 3.6. Alkol kullanmış bir bireyin kan alkol düzeyinin valide edilmiş gaz kromatografik yöntemle tespiti 82 Şekil 3.7. İki primer çifti kullanılarak (PCR-CTTP) gerçekleştirilen ADH2 gen bölgesi polimorfizmine ait amplifikasyon ürün uzunluklarının ve baz değişimlerinin şematik gösterimi. 84

11 x Şekil 3.8. Homozigot ADH2*1/1 genotipli bireylerin jel görüntüleri (M = 100 bp ladder, 1, 2, 3, 4, 5, 6 = Arg/Arg homozigot genotipli bireylere ait jel görüntüleri; 459 bp = Common band, kontrol; 219 bp = Arg aleli) 84 Şekil 3.9. Heterozigot ADH2*1/2 genotipli bireylerin jel görüntüleri (M = 100 bp ladder; 1, 2 = Arg/His heterozigot genotipli bireylere ait jel görüntüleri; 459 bp = Common band, kontrol; 219 bp = Arg aleli; 280 bp = His aleli) 85 Şekil İki primer çifti kullanılarak (PCR-CTTP) gerçekleştirilen ALDH2 gen bölgesi polimorfizmine ait amplifikasyon ürün uzunluklarının ve baz değişimlerinin şematik gösterimi. 89 Şekil Homozigot ALDH2*1/1 genotipli bireylerin jel görüntüleri (M = 100 bp ladder, 1, 2 = Glu/Glu homozigot genotipli bireylere ait jel görüntüleri; 455 bp = Common band, kontrol; 296 bp = Glu aleli) 89 Şekil İki primer çifti kullanılarak (PCR-CTTP) gerçekleştirilen ALDH2 gen bölgesi polimorfizmine ait amplifikasyon ürün uzunluklarının ve baz değişimlerinin şematik gösterimi. 91 Şekil Homozigot ALDH2*1/1 genotipli bireylerin jel görüntüleri (M = 100 bp ladder; 1, 2 = Glu/Glu homozigot genotipli bireylere ait jel görüntüleri; 176 bp = Common band, kontrol; 119 bp = Glu aleli) 91

12 xi ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Etanol konsantrasyonlarının farklı birimlerdeki karşılıkları 4 Çizelge 1.2. İnsan alkol dehidrogenazlar 13 Çizelge 1.3. ADH2 ve ADH3 izozimlerinin özellikleri 13 Çizelge 1.4. ALDH2 eksikliği bulunan Japon alkolik bireylerde sindirim sistemi kanserine yakalanma sıklığı (RR) 33 Çizelge 1.5. Çeşitli biyolojik materyalden elde edilebeilecek DNA miktarları 46 Çizelge 1.6. Reaksiyon %100 verimlilikle çalıştığında PCR amplifikasyonu ile oluşan hedef DNA molekül sayısı 48 Çizelge 1.7. PCR primer dizaynı için genel kriterler 50 Çizelge 1.8. Tipi bir PCR amplifikasyonunun bileşenleri 51 Çizelge 2.1. Alkol dehidrogenaz (ADH2) polimorfizmini PCR-CTTP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primer dizilimleri 60 Çizelge 2.2. PCR-CTTP yöntemi ile alkol dehidrogenaz (ADH) polimorfizmini belirlemek için kullanılan primer çiftleri, oluşturdukları amplikon uzunlukları ve primerlere ait Tm değerleri. 61 Çizelge 2.3. Aldehit dehidrogenaz (ALDH2) polimorfizmini PCR-CTTP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primerler ve dizilimleri 63 Çizelge 2.4. Aldehit dehidrogenaz polimorfizmini (ALDH2) PCR-CTTP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primer çiftleri, oluşturdukları amplikon uzunlukları ve primerlere ait Tm değerleri. 64 Çizelge 2.5. Aldehit dehidrogenaz (ALDH2) polimorfizmini PCR-CTTP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primerler ve dizilimleri 65 Çizelge 2.6. Aldehit dehidrogenaz polimorfizmini (ALDH2) PCR-CTTP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primer çiftleri, oluşturdukları amplikon uzunlukları ve primerlere ait Tm değerleri. 66 Çizelge 3.1. Metanol, etanol ve IS (n-bütanolün) alıkonma zamanları, miktarları ve cihazdan alınan yanıtlar 69

13 xii Çizelge 3.2. Metanol ve etanol için tekrarlanabilirlik çalışması sonuçları 77 Çizelge 3.3. Sudan verim (geri kazanılabilirlik) çalışmalarının sonuçları 77 Çizelge 3.4. Kandan verim (geri kazanılabilirlik) çalışmalarının sonuçları 78 Çizelge 3.5. İdrardan verim (geri kazanılabilirlik) çalışmalarının sonuçları 78 Çizelge 3.6. Tükrükten verim (geri kazanılabilirlik) çalışmalarının sonuçları 79 Çizelge 3.7. Metanol ve etanol için bulunan observed (gözlenen) LOD ve LOQ değerleri 80 Çizelge 3.8. ADH2 gen polimorfizminde üç farklı genotipe bağlı olarak etkileşen primer çiftleri ile oluşturdukları PCR ürün uzunlukları 83 Çizelge 3.9. ADH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan yöntemle çalışılan populasyonda gözlenen üç farklı genotipin frekansı 85 Çizelge ADH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan yöntemle çalışılan populasyonda gözlenen alel frekansı 86 Çizelge ADH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan yöntemle çalışılan populasyonda gözlenen gen frekansı 86 Çizelge Çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olup olmadığının tespiti. 87 Çizelge ALDH2 gen polimorfizminde üç farklı genotipe bağlı olarak etkileşen primer çiftleri ile oluşturdukları PCR ürün uzunlukları 88 Çizelge ALDH2 gen polimorfizminde üç farklı genotipe bağlı olarak etkileşen primer çiftleri ile oluşturdukları PCR ürün uzunlukları 90 Çizelge ALDH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan iki farklı yöntemle, çalışılan populasyonda gözlenen üç farklı genotipin frekansı 92 Çizelge ALDH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan iki farklı yöntemle, çalışılan populasyonda gözlenen alel frekansı 92 Çizelge ALDH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan iki farklı yöntemle, çalışılan populasyonda gözlenen gen frekansı 93

14 1 1. GİRİŞ 1.1. Alkol Etanol çeşitli alkollü içecekler formunda binlerce senedir sosyal yaşantımızın bir parçası halindedir. Sosyal kabul edilebilirliği sayesinde sigara tüketimi ile birlikte ne yazık ki, Batı topluluklarında ve tabiki ülkemizde, en fazla suistimal edilen madde durumundadır. Modern toplumlarda artık halk sağlığını tehdit eden en önemli faktörlerden kabul edilmektedir. Aşırı alkol tüketimi, karaciğer yağlanması, hepatit ve siroz gibi ciddi karaciğer hastalıklarına neden olmasını yanı sıra, vücudun birçok organ ve sistemine de ağır hasarlar vermektedir. Alkol gelişmiş ülkelerde hastalıklara ve yaralanmalara neden olan en önemli on nedenden biridir. Dünya genelinde, alkol ölümlerin %3.27 (1.8 milyon) sine ve DALYS (Disability adjusted life years) ın %4 üne (58.3 milyon) neden olur. Gelişmiş ülkelerde, hastalıkların %9.2 sine alkol neden olarak gösterilmektedir (IAS Fact Sheet). Alkol, Avrupa da hastalığa bağlı her 10 ölümden birine neden olur ve bu ölümler genelde erken yaşta görülür. Alkol, sigaradan ve yüksek kan basıncından sonra genç ölümlere neden olan en önemli üçüncü risk faktörüdür. İnsan sağlığını tehdit etmesi açısından yüksek kolestrolden ve obeziteden daha önemli bir yer teşkil etmektedir. Ayrıca diyabetten üç kat, astımdan beş kat daha fazla, hastalığın gelişimi açısından tehlikelidir (IAS Fact Sheet). Avrupa ve Amerika da alkole bağlı gelişen ölümler ve hastalıklar kadınlara oranla (%2-4) daha fazla erkeklerde (%1,8-18) görülür (IAS Fact Sheet).

15 2 İntoksikasyon ve oluşturduğu bağımlılığın yanı sıra, alkol özafagus ve karaciğer kanserinin, sirozun gösterdiği doğrudan etkilerin, epilepsinin, cinayetlerin ve motorlu taşıt kazalarının %20-30 na neden olur. Alkole bağlı olarak gelişen kanserlerin (ağız, boğaz, karaciğer ve gırtlak) alkol kullanmayan orta yaşlı bireylerde 14/ iken, günde 4 veya daha fazla içki tüketen bireylerde bu oran 50/ e çıkar. Yine benzer şekilde alkol tüketmeyen bayanlarda meme kanseri riski 88/1000 iken, günde 6 birim, (1 şişe şarap) alkol tüketen bayanlarda bu risk 133/1000 e yükselir (IAS Fact Sheet). Günde üç birim alkol tüketmek, hiç alkol kullanmayana oranla aşağıda belirtilen sağlık sorunlarının oluşma riskini önemli derecede artırır: a) Ağız boşluğu, farinks, larinks, göğüs, karaciğer, kolon ve rektum kanserleri b) Karaciğer sirozu c) Ciddi hipertansiyon d) Kronik pankreatit e) Yaralanmalar ve şiddet Yukarıda belirtilen tüm sağlık sorunlarının oluşma riski tek bir birim alkol tüketmek ile başlar ve artan alkol tüketimi ile çoğalır. Az miktarda alkol tüketimi kalp krizi riskini azaltmasına rağmen, birçok alkol tüketen birey için aslında bu risk artmaktadır. Günde 2 birim içkiden fazlası kalp rahatsızlığına bağlı ölüm riskini artırır. Aynı şekilde ikiden fazla içki tüketimi de bu riski daha fazla artırır. Alkolün tüketilme yöntemi ve şekli, zararları ve kalp hastalığına faydası açısından önemli bir unsurdur. Az miktarlarda haftada birkaç defa tüketilen alkollü içeceğin kalbe sağlayacağı fayda, aynı miktarda alkolün bir anda tüketilmesinden çok daha fazladır (IAS Fact Sheet).

16 3 Şarap, bira veya çok kuvvetli bir içki, önemli olan alkolün tüketilmesidir. Bir bardak şarabın 250 ml biranın ve tek birim kuvvetli bir alkollü içeceğin sağlık üzerindeki etkisi aynıdır. Aşırı alkol tüketimi, üst sindirim yolu kanserlerine neden olan en güçlü risk faktörlerinden biridir. Yapılan epidemiyolojik çalışmalar ikna edici olmasına rağmen, etanol-kaynaklı kanserlerin mekanizması, etanolün kendisi karsinojen olmadığı için tam olarak aydınlatılamamıştır. Etanol oksidasyonunun ilk metaboliti olan AA, yapılan hücre kültürü ve hayvan çalışmalarında da bildirildiği gibi multipl karsinojenik etkilere sahiptir. Etanolün neden olduğu kanserlerin başlıca nedeni AA tir. Son yapılan epidemiyolojik çalışmalara göre, genetik olarak AA i tam olarak metabolize edemeyen ve bununla beraber aşırı alkol tüketen Asyalı bireylerin üst sindirim yolları kanserlerine yakalanma riskleri daha yüksektir Etanolün Ve Asetaldehitin Biyokimyasal Özellikleri Etil alkolün kimyasal formülü CH 3 CH 2 OH dür ve moleküler ağırlığı 46.1gr/mol dür. Etanol kimyasal olarak, litaratürde alkol ve alkollü içecekler olarak da adlandırılır. Ancak alkol terimi, metanol gibi daha birçok kimyasal yapısı alkol olan bileşik bulunduğundan yeterli değildir ve karışıklığa yol açabilir. Etanol doğal ürünlerin içinde bulunan karbonhidratların fermentasyonu ile elde edilir. Mutlak susuz etanolün araştırma amaçlı hazırlanması özel distilasyon prosedürlerini gerektirir. Mutlak etanolün 20 0 Cdeki yoğunluğu suyun (4 0 C deki oranla ) 0,789 dur. Mutlak etanolün erime noktası -114,1 0 C iken kaynama noktası 78,5 0 C dir. Etanolün önemli özellikleri arasında küçük molekül yapıda olması ve su içerisinde her oranda karışabilmesi gelmektedir. Ancak, etanol yağda çok az çözünür. Doku yağlarında etanolün aynı hacimde suda çözünürlüğü ile karşılaştırıldığında etanolün ancak %4 ünün çözünebildiği görülmüştür.

17 4 Vücut sıvılarında etanol konsantrasyonu ve/veya dozunu belirtmek amacıyla değişik birimler kullanılmaktadır. Alkollü içeceklerde etanol konsantrasyonunu tanımlamak amacıyla ağırlık yüzdesi (v/v) kullanılır. Deneklere uygulanacak dozlar g/kg vücut ağırlığı olarak gösterilir. Uygulanacak dozu belirlemek amacıyla kullanılan en iyi yöntem; içinde bilinen ağırlıkta etanol bulunan, sabit hacimli çözeltiler hazırlamaktır. En çok kullanılan sistem ağırlık hacim yüzdesidir (%w/v). Hacim /hacim yüzde oranı da kullanılabilir (%v/v). Vücut sıvılarında ve in-vitro inkübasyonlarda etanol konsantrasyonunu belirtmek için birçok birim bulunmaktadır. Konsantrasyon genellikle mmol/l(mm) olarak ifade edilir. Bazı çalışmalarda ise, kan alkol konsantrasyonu %mg olarak verilir (mg etanol/100 ml kan). Çizelge 1.1 de vücut sıvılarında etanol konsantrasyonlarının değişik birimlerdeki karşılıkları gösterilmiştir. Çizelge 1.1. Etanol konsantrasyonlarının farklı birimlerdeki karşılıkları Yüzde(%gr/100ml) mg/100ml mm Promil 0, , , , , ,7 1 0, ,4 2 0, ,1 3 0, ,8 4 0, ,5 5 0, ,2 6 0, ,9 7 Asetaldehitin kimyasal formülü CH 3 CHO dur ve moleküler ağırlığı 44.1gr/mol dür. Organik kimya endüstrisinde ortaya çıkan bir ara üründür. Motorlu taşıtların egzos gazlarında ve sigara dumanında da bulunur. Saf AA in 20 0 C deki

18 5 yoğunluğu 0.778, erime noktası C ve kaynama noktası C dir. Etanol gibi AA de su içinde homojen bir şekilde dağılır Alkole Bağlı Gelişen Medikal Sorunlar Sinir Sistemi: Akut İntoksikasyon: Kalıcı beyin hasarı : Serebrovasküler Hastalıklar: Yoksunluk Sendromu : Sinir ve Kas Hasarı: Göz kararması Wernike ensafalopati Karsakoff sendromu Serebral dejenerasyon Demans Genellikle gençlerde felç Kafa travmasından sonra subdural hematom Subaraknoid hemoraji Titreme, halüsinasyon,kriz Güçsüzlük, paraliz, ellerde ve ayaklarda yanma hissi Karaciğer: Karaciğerde yağlanma ile infiltrasyon Alkole bağlı hepatit oluşumu Siroz ve karaciğer yetmezliği Karaciğer kanseri Gatrointestinal Sistem: Özafagusa asit reflüsü Özafagusta yırtılma ve fıtık Özafagus kanseri Diyare ve gıdaların yetersiz absorbsiyonu Pankreasın kronik inflamasyonu

19 6 Beslenme: Yetersiz gıda alımına bağlı olarak beslenme bozukluğu, Barsaklarda alkolün toksik etkileri, Metabolizmanın bozulmasına bağlı olarak kilo kaybı, Ağır içiciliğin başlarında gelişen obezite. Kalp ve Dolaşım Sistemi: Aritmi, Yüksek kan basıncı Kronik kalp kası hasarına bağlı olarak gelişen kalp yetmezliği Solunum Sistemi: Üreme Sistemi: Kusmuk inhalasyonuna bağlı olarak gelişebilecek pnömoni Kortizolün aşırı üretimine bağlı olarak gelişen obezite, akne, yüzde tüylenme ve yüksek kan basıncı Tiroidin aşırı aktivite göstermesine benzer semptomlar: Kilo kaybı, terleme, titreme, endişe, çarpıntı Bazen komaya neden olabilecek kan şekerinde ciddi düşüş, Antidiyabetik ilaç kullanan birçok diyabet hastasında görülen yüz kızarması Erkeklerde libido kaybı, sperm oluşumunda azalma yada aspermi ve kısırlık, Kadınlarda menstral bozukluklar, göğüslerde küçülme

20 7 Çalışma Hayatı ve Kazalar: Çalışma performasında ve karar verme yetisinde azalma Kaza geçirme riskinde ve ciddi yaralanmalarda artış Fötus, Çocuklar ve Aile Yaşantısı: Fötusta hasarlar ve fetal alkol sendromu Gençlerde akut intoksikasyon sonucu oluşan hipotermi, kan şeker düzeyinde azalma, Solunum depresyonu Ebeveynleri kronik alkolik olan çocukların fiziksel gelişimlerinde ve davranışlarında bozukluklar. Bazı ilaçların istenmeyen yan etkilerinde artış Bazı ilaçların töropotik etkilerde azalma(ias Fact Sheet) 1.4. Alkolün Lokal Etkileri %20 nin üzerinde alkol ihtiva eden içeceklerin mukoz membranlar üzerinde lokal olarak zararlı etkileri bulunmaktadır. Bu durum artan hücre bölünmesine ve rejenerasyona neden olabilir. Kronik alkol tüketiminde sıklıkla hiperproliferasyona rastlanmasının nedeni de böylece açıklanabilir. Bu durum devamında DNA sentezinde replikasyon hatalarını tetikler (Cohen ve Ellwein, 1990). Alkol, karsinojenik bileşiklerin mukozaya penetrasyonunu artıran bir çözücü olarak rol oynar. Alkol doğrudan etkisiyle hasar görmüş veya moleküler yapısı değişmiş bileşiklere sahip hücre membranlarından sigara dumanı gibi çevresel karsinojenlerin alımını kolaylaştırır ve hızlandırır (Blot 1992). Bunun yanında kronik alkolizm atrofiye ve lipomatoz metamorfoza neden olarak, tükrük akışının fonksiyonunun bozulmasına ve vizkozitesinin artmasına neden olur. Bu nedenle mukozal yüzey yeterince temizlenemez ve bu yüzden daha yüksek

21 8 konsantrasyonlarda ve daha uzun süre lokal etki eden karsinojenlere maruz kalır. Diğer lokal mekanizmalar ise; a) yüksek konsantrasyonda alkollü içeceklerin epiteliuma doğrudan etkisi b) özafagusun alkolün etkisi ile değişen motilitesi (hareketliliği) c) özofaji ve metaplaziye neden olabilecek gastroözofagal reflünün artışı 1.5.Alkolün Sistemik Etkileri Kronik alkol kullanımı sindirim yolu kanser riskini indirekt olarak beslenme ile veya doğrudan metabolik olarak artırır. Kronik alkol tüketenler genelde kötü beslenirler. Bireylere göre daha az miktarda kanser oluşumunu önleyici meyveler ve sebzeler, çinko, selenium gibi iz elementler ve folik asit, riboflavin, retinol, askorbik asit ve alfa-tokoferol gibi vitaminler tüketirler. Aşırı alkol kullanımı başka bir sistemik mekanizma ile sitokrom P-450- bağımlı metabolik yolakları indükleyebilir. Bu durum prokarsinojenlerin karsinojenlere aktivasyonuna neden olur (Lieber 1999). Ancak sitokrom P-450 bağımlı mekanizmaların inhibisyonu, karsinojenik bileşiklerin daha az toksik metabolik ürünlere detoksifikasyonunu zayıflatır (Salaspuro 2003) Alkolün Vücutta Dağılımı Alkolün farmakokinetiği, kandaki konsantrasyonunun gözlemlenebilme süresini, organların maruziyet derecelerini ve ortaya çıkan etkilerini belirler. Alkolün absorbsiyonu, dağılımı ve eliminasyonu alkole karşı gelişen farmokodinamik cevapları belirleme açısından önemlidir (Ramchandani ve ark., 2001). Oral alımdan sonra, alkol neredeyse tamamen absorbe edilir ve dakika aralığı içerisinde pik konsantrasyonlara ulaşır. Düşük molekül ağırlığı, suda iyi çözünebilirliği ancak lipidlerde zayıf çözünürlüğü sayesinde etanol gastrointestinal yoldan basit difüzyonla absorbe edilir. Alınan alkolün yaklaşık %75 i proksimal ince bağırsak, duedonum ve üst jejenumdan, %25 i ise mideden absorbe edilir. Gastrik

22 9 boşaltımda gecikme etanol absorbsiyonunun hızını düşürür (Oneta ve ark., 1998). Örneğin yemek gastrik boşaltımı geciktirdiği için kan alkol düzeyleri yemekten sonra düşük pik konsantrasyonlarına ulaşır (Kalant 2000). Absorbsiyondan sonra, etanol dolaşım ve difüzyon ile vücudun diğer sıvılarına dağılır. Alkol hızlıca daha az yoğun vaskularizasyona sahip ve daha çok kanlanan beyin, akciğer ve karaciğer gibi organlarda dengeye gelir. Dinlenme halinde olan iskelet kaslarında etanolün dağılımı yavaştır. Çünkü kapillerlerin yalnızca bir kısmı fonksiyonel durumdadır. Alkolün vücutta dağılımı, organların ve dokuların su içeriğine göre faklılık gösterir. Çünkü özelllikle denge durumunda, etanol küçük bir moleküldür ve polardır. Özellikle su içerisinde tamamen çözülür. Alkolün dağılım hacmi vücutta bulunan total su oranına bağlıdır (Holford 1987; Marshall ve ark., 1983). Alkolün plazma proteinlerine bağlanması ile ilgili bir bilgi bulunmamaktadır (Ramchandani ve ark., 2001). Etanol lipidlerde düşük çözünürlüğe sahip olduğu için, doku lipidlerinde aynı hacim suda gösterdiği dağılımın ancak %4 ü görülür. Aynı miktarda alkol tüketen kadınlar erkeklere göre daha düşük total vücut su hacmine sahip oldukları için, ölçülen kan alkol düzeyleri daha yüksek olabilir. Vücudun total su hacmi yaş ilerledikçe azalır, tıpkı cinsiyet ayrımında görüldüğü gibi yaşlılarda aynı miktarda alkol tüketildiği halde daha genç bireylere göre daha yüksek kan alkol konsantrasyonları ölçülür. Etanolün vücutta gösterdiği dağılım organların ve dokuların total su içeriğine göre de farklılaşır. Alkol tüketiminden sonra terminal ileum, bağırsak ve oral boşlukta ölçülen etanol konsantrasyonları kandakiyle aynı olur. Bunun aksine idrarda ölçülen alkol düzeyi kandakine oranla daha yüksektir (Agarwall ve Goedde 1992; Bendtsen ve ark., 1999). Absorbe edilen alkolün yaklaşık %90-95 i vücut tarafından metabolize edilir ve karbondioksit ve su olarak atılır. Çok az bir kısmı ise hiç değişmeden solunum havası (%0.7), ter (%0.1), ve idrarla (%0.3) atılır (Holford 1987; Ramchandani ve ark., 2001).

23 Etanol ve Asetaldehit Metabolizması Etanol Metabolizması Etanol metabolizmasının önemli bir kısmının karaciğerde gerçekleştiği artık bilinmektedir. Normal koşullar altında, alkolün %75-90 ı karaciğer tarafından elimine edilir. Ciddi hepatik sirozlu bireylerde ekstrahepatik etanol eliminasyonu %40 lara ulaşabilir. Karaciğerde etanolün oksidasyonu üç metabolik yol ile gerçekleşir. a) Sitozolik alkol dehidrojenaz (ADH): Sitozolde bulunur. b) Mikrozomal etanol oksitleyici sistem (MEOS): Endoplazmik retikulumda bulunur. c) Katalaz: Peroksizomlarda bulunur (Caballeria 2003; Lieber 1997; Lieber 2000; Agarwall 2001). Şekil 1.1. Hepatik etanol metabolizması (MEOS: mikrozomal etanol oksitleyici sistem, Caballeria 2003).

24 11 Etanol oksidasyonu esnasında oluşan reaksiyonlar ise aşağıdaki şekilde gösterilmiştir (Şekil 1.2.) Şekil 1.2. A) Alkol dehidrogenaz (ADH ve nikotinamide adenin dinükleotid (NAD + ) ile etanol oksidasyonu B) hepatik mikrozomal etanol oksitleyici sistem (MEOS; sitokrom P450 2E1 ve nikotinamide adenin dinükleotid fosfat (NADPH) ı içerir C) NADPH oksidaz ve katalaz kombinasyonu ile etanol oksidasyonu D) ksantin oksidaz ve katalaz ile etanol oksidasyonu (Lieber 2004). Bu üç yolak arasında en önemlisi alkol dehidrojenaz yolağıdır. Tüm bu hepatik enzimler, son ürün AA in oluşumuna neden olur. Asetaldehit daha sonra özellikle mitokondride ALDH ile asetata dönüşür.

25 Alkol Dehidrogenaz (ADH) İnsan ADH ı dimerik yapıda çinko-bağımlı bir metaloenzimdir ve 7 gende (ADH1- ADH7) kodlanan beş sınıftan oluşur. Ancak alkol metabolizmasında önemli rol oynayan izoenzimler tip I, II ve IV dür. ADH, NAD + (NADP + )-bağımlı bir enzimdir ve farklı kinetik özelliklere ve substrat tercihlerine sahip birçok izoenzim ile ifade edilir. İnsan ADHları 5 ana grupta toplanabilir. Bu izoenzimler ana yapısal karakteristiklerine göre ayrılırlar. Fonksiyonel ADH enzimleri, aynı sınıfa ait iki aynı veya iki farklı subünite içeren dimer yapılardır. ADH lar daha çok hücrelerin sitozolik fraksiyonlarında bulunurlar (Thomasson ve ark., 1993). Sınıf I İzoenzimler: Etanol için düşük Km değerine sahiplerdir. Karaciğerde bulunurlar ve üç altünitesi (α, β, γ sırasıyla ADH1, ADH2 ve ADH3 için) olan homo ve heterodimerik formlar içerirler. Sınıf II ADH: Homodimerik ππ formdur (ADH4). Etanol için daha yüksek Km değerine (34 mm) sahiptir. Karaciğerde bulunur. Sınıf IV izoenzimi (ADH7): Homodimerik σσ formdur. Midede bulunur. Etanol için oldukça yüksek Km değerine sahiptir. Sınıf III izoenzimi (χadh, ADH5): Etanole affinitesi çok düşüktür. Bu yüzden karaciğerde gerçekleşen oksidasyonda rol oynamaz. Sınıf V izoenzimi (ADH6): Mide ve karaciğerde bulunur (Agarwall 2001; Thomasson ve ark., 1983; Agarwall 1997; Yoshida 1994). Vmax: Enzim konsantrasyonu sabit tutulduğunda substrat konsantrasyonuna bağlı olarak reaksiyonun ulaştığı maksimum hız noktasıdır. Km (Michaelis constant): V max/2 olduğu zamandaki substrat konsantrasyonudur. Enzim düşük Km değerine sahipse enzim-substrat afinitesi yüksektir.

26 13 Çizelge 1.2. İnsan alkol dehidrogenazlar (Thomasson ve ark., 1993; Bosron ve Li 1986; Agarwal 2001). Sınıf Gene Km etanol Doku dağılımı (mm) I ADH1 4 Karaciğer α Altünite ADH2 a Karaciğer, akciğer β ADH3 a Karaciğer, mide γ II ADH4 34 Karaciğer, kornea π III ADH5 >500 Tüm dokular χ IV Karaciğer, mide σ, µ V ADH Karaciğer, mide a Polimorfizm görülür. ADH2 ve ADH3 kodlayan farklı alellerin genetik varyasyonları bulunmaktadır. ADH2*1, ADH2*2 ve ADH2*3 alelleri sırasıyla β 1, β 2 ve β 3 altünitelerine sahiptir. ADH3*1 ve ADH3*2 alellerinin altüniteleri ise γ 1 ve γ 2 dir. Farklı ADH alellerinin görülme frekansı etnik varyasyonlarla ortaya çıkar (Agarwall 2001; Caballeria 2003; Iwahashi ve Suwaki1998). Çizelge 1.3. ADH2 ve ADH3 izozimlerinin özellikleri (Thomasson ve ark., 1993; Bosron ve Li 1986; Agarwal 2001). İzozim Km etanol (mm) Vmax (min -1 ) β 1 β β 2 β β 3 β γ 1 γ γ 2 γ

27 14 ADH2*1 aleli siyah ve beyaz ırkta baskınken, ADH2*2 aleli Asyalı bireylerde, ADH2*3 alel dağılımı ise siyah ırkın %25 inde görülür (Goedde ve ark., 1992). ADH3 gen polimorfizmi göz önüne alındığında, beyaz ırkta ADH3*1 ve ADH3*2 aynı frekansta gözlenirken, ADH3*1 aleli siyah ırkta ve Asyalılarda daha baskındır. Bu farklı izoenzimlerin alkole affiniteleri ve metabolik hızları farklı olduğundan alkolün farklı genetik varyasyonlarda gösterdiği etki de (örn: alkolik karaciğer hastalığı görülme sıklığı) faklı olacaktır (Caballeria 2003). Hepatik etanol eliminasyonunda rol alan en önemli enzim tip I ADH lardır. Bu enzimler etanol için düşük K m (1mM civarı) ve yüksek Vmax değerlerine sahiplerdir. Kanda alkolü sabit bir hızla çok düşük etanol konsantrasyonlarına elimine edebilme kapasitesine sahiplerdir. ADH ın AA için Km si 0.6 mm dır. ADH-tarafından sağa doğru yürütülen revers reaksiyonun devamlılığı için AA, etanol oksidasyonu ile beraber aynı anda hızlıca asetata okside edilmelidir. ADH tarafından katalizlenen etanolün AA e oksidasyonu, karaciğer NADH/NAD oranını artırır. Bu durum, karaciğerin redoks halinde belirgin azalmaya neden olur. Bunun sonucu olarak, hepatik glukonojenezin inhibisyonu, sitrik asit döngüsünün aktivitesinde azalma ve yağ asitlerinin oksidasyonunda bozukluklar gibi etanolün akut metabolik etkileri ortaya çıkar (Agarwall 1997; Lieber 1997). Bazı çalışmalarda, ADH3 genotipli hızlı metabolizasyona sahip bireylerin üst sindirim yolu kanserlerine yakalanma riskinin daha yüksek olduğu bildirilmiştir (Coutelle ve ark., 1997; Seitz ve ark., 2001). Gingival (diş eti iltihabı) ve dil mukazası tip III ve tip IV ADH izoenzimlerine sahiplerdir. Gingival ADH ın etanol için tahmin edilen Km değeri 27mM dır (Dong ve ark., 1996). Özafagus un ana ADH izoenzimi tip IV dür ve etanol için tahmin edilen Km değeri 12mM dir (Yin ve ark., 1993). Bu iki yüksek Km değeri de etanolün alkol alımı esnasında ve sonrasında ağızda ve özafagusta etanolün okside edildiğini göstermektedir. Bunun yanında özafagus sindirim yolundaki diğer organlar arasında

28 15 ADH aktivitesi en yüksek olandır. Karaciğerde bulunan aktivite ile aynı hızda, midedeki enzimlerden ise 4 kat daha hızlıdır. Midede birçok ADH izoenzimleri bulunmaktadır ancak bunlar aralarında en önemlileri tip I ve tip IV dür. Tip I ADH ların Km değerleri 1mM ve tip IV ün 40mM dür (Yin ve ark., 1993; Seitz ve Oneta 1998). Tip IV ADH üst sindirim yolu ve tip I kolon bağırsak yolağını karakterize ettiği için, mide bu tip ADH ların bir geçiş sınırıdır. Gastrik ADH ların etanol metabolizmasının ilk geçişinde önemli rol oynamaktadırlar. Bu teoriye göre, intragastrik etanol metabolizması oral veya intravenöz alkol uygulamasından, tüketilmesinden sonra kandaki etanol konsantrasyonlarının farklılığını açıklar (Julkunen ve ark., 1985). Bu teori uzun zamandır tartışılmaktadır ve total etanol eliminasyonundaki önemi hala tam olarak açıklanamamıştır. Seitz ve Pöschl (1997) etanolün ilk geçiş (first-pass) metabolizmasının, total etanol metabolizmasının %1-20 si kadarını oluşturduğunu bildirmişlerdir. Kalın ve ince bağırsakta ise daha çok tip I ADH lar bulunmaktadır ve etanol için Km değerleri 1-2 mm civarındadır. Bu değer alkol tüketimi esnasında bağırsaktaki etanol konsantrasyonuna tekabül eder. Barsak mukozasındaki ADH aktivitesi gastrik ADH aktivitesine benzerdir. Bu durum, etanolün barsak mukozasında da AA e efektif bir şekilde metabolize edildiğini gösterir (Seitz ve Oneta 1998) Alkol Metabolizmasında ADH Gen Polimorfizminin Etkileri ADH gen polimorfizmi ile alkol bağımlılığı arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak amacıyla birçok çalışma yapılmıştır (Tanaka ve ark., 1997; Sun ve ark., 1999; Vidal ve ark., 2004; Borras ve ark., 2000; Bosron ve Li, 1986). Asyalı alkolik bireylerde β 2 β 2 ve γ 1 γ 1 altüniteli ADH2*2 ve ADH3*1 izoenzim görülme sıklığı daha düşüktür (Shen ve ark., 1997). Bu izoenzimlerin alkol oksidasyon hızları daha yüksek olduğu için, bu bireylerde AA konsantrasyonları daha yüksektir ve AA in neden olduğu yüz kızarması, taşikardi gibi rahatsız edici yan etkilerden daha çok etkilenirler. Öte

29 16 yandan, aynı populasyonda özellikle hepatik organik lezyonların görülme sıklığı daha fazladır (Couzigou ve ark., 1994). Avrupalı bireylerde ADH3 alelinin dağılım frekansı homojendir. Bu izoenzime sahip kontrol grubu, karaciğer fonksiyonları normal alkolikler ve sirozlu alkolik bireylerin bulunduğu gruplar arasında bir farklılık bulunamamıştır (Borras ve ark., 2000). Bu sonuçlar ADH3 ün alkolünindüklediği sirozun gelişimine neden olmadığını göstermektedir. ADH2 ve ADH3 izoenzimlerinin kontrol ve alkolik bireylerde görülme sıklığında da bir farklılık bulunamamıştır. Beklenilenin aksine ADH2*1 ve ADH2*2 aleline sahip bireylerin alkol eliminasyon hızlarında bir farklılık gözlenmemiştir (Mizai ve ark., 1994). Bu yüzden ADH2*2 alelinin koruyucu etkisi tam olarak açıklanamamıştır. ADH2 geni birçok dokuda tanımlandığı için, ADH2*2 aleline sahip bireylerde ekstrahepatik alkol metabolizması daha yüksektir. Alkolün hepatik metabolizma ile, ekstra hepatik metabolizmaya oranla daha iyi metabolize edildiği kesindir. Bu hipotez de alkolün rahatsız edici etkilerini ve alkol bağımlılığına karşı koruyucu etkisini açıklar. ADH2 için üç farklı allelik form (ADH2*1, ADH2*2 ve ADH2*3) bulunurken ADH3 için iki tane allelik form (ADH3*1, ADH3*2) bulunmaktadır. Bu allelerin dağılımı ırka bağlı olarak değişir. Beyaz ırkın %35 i ADH2*1 alleline sahipken (Borras ve ark., 2000; Goedde ve ark., 1992; Agarwall ve Goedde 1992; Bosron ve Li 1986), bu oran Asya topluluklarının ancak %15 inde görülmektedir (Goedde ve ark., 1992; Bosron ve Li 1986). Asya kökenli topluluklarda ADH2*2 aleli daha baskındır. ADH3*1 in görülme frekansı beyaz ırkta yaklaşık olarak % iken Asyalı bireylerde bu oran %90 nın üzerindedir. ADH2*2 ve ADH3*1 alelleri protein altünitelerinin en aktif enzimatik formlarını kodlar. Örneğin ADH3*1/ *1 genotipli bireyler diğer ADH 3 genotiplilere göre 2,5 kat daha hızlı ve aynı şekilde ADH2*2/*2 genotipli bireylere göre etanolü AA e 40 kat daha hızlı metabolize ederler (Bosron ve Li 1986).

30 Gastrik ADH Midede sınıf I, III ve IV ADH izoenzimleri bulunduğu bildirilmiştir (Hernandez- Munoz ve ark., 1990; Moreno ve Peres 1991; Yin ve ark., 1990). Aynı miktarda alkol oral alındığında serum düzeyleri intravenöz uygulamaya göre daha düşük bulunmuştur. Bu farklılık alkolün first pass metabolizması (FPM) olarak adlandırılır. Önceleri, diğer maddelerde görüldüğü gibi FPM nın hepatik kaynaklı olduğu düşünülmüştür. Ancak daha sonra yapılan hayvan deneylerinde ve insan çalışmalarında midenin de FPM üzerinde önemli rol oynadığı gösterilmiştir (Julkunen ve ark., 1985). Gastrik mukozada ADH izoenzimi (σadh) bulunmaktadır. Bu izoenzimler yüksek alkol konsantrasyonlarında alkolü metabolize etme yeteneğine sahiplerdir. Irk ve cinsiyet farkının alkol metabolizmasını değiştirmesinin nedenlerinden biri de gastrik ADH lardır. Beyaz ırkta, σadh bulunurken, Asya kökenli bireylerde aktivite çok düşük hatta yoktur. Bu yüzden Asyalı bireylerde alkolün FPM sı çok azdır (Dohmen ve ark., 1996). Cinsiyete bağlı olarak da birçok farklılık bildirilmiştir. Aynı dozda alkol kadın ve erkeklere intravenöz uygulandığında serum alkol konsantrasyonlarında iki cinsiyet arasında bir farklılık gözlenmezken, bahsi geçen doz oral uygulanırsa, kadınlarda serum alkol düzeyleri erkeklere oranla daha yüksek bulunacaktır. Kadınlarda gözlenen FPM daki bu düşüş, gastrik ADH aktivitesinde azalma ile ilişkilidir. Alkolik kadınlarda, FPM tarafından sağlanan gastrik koruyucu bariyer neredeyse tamamen yok olur. Bu özellik kadınların alkolün toksik etkilerinden neden daha fazla etkilendiğini açıklayan parametrelerden biridir (Seitz ve ark., 1993; Baraona ve ark., 2001). Sıklıkla kullanılan aspirin histaminin H 2 reseptör antagonistleri gibi ilaçlar gastrik ADH aktivitesini azaltır ve/veya gastrik boşalmayı hızlandırır. Bu nedenle alkolün FPM sı azalır ve serum alkol konsantrasyonlarında artışlar gözlenirken

31 18 alkolün istenmeyen toksik etkilerinde de artışlar görülür (Caballeria ve ark., 1989; Hernandez-Munoz ve ark., 1990) Alkol Metabolizmasında Bakteriyel ve Barsak ADH ın Rolü ADH hem sıçan hem de insan barsak mukozasında bulunur (Pestelazzi ve ark., 1983). Birçok kolonik bakteri yüksek ADH aktivitesine sahiptir ve bu sayede etanolden AA oluşumuna neden olurlar (Jokelainen ve ark., 1996). Etanol bakterial ADH lar sayesinde barsaklarda AA dönüşür. Daha sonra barsak mukozasında bulunan veya bakteriyel ALDH lar ile AA, asetata dönüştürülür. Barsak içinde oluşan AA in bir kısmı portal damarla absorbe olur ve karaciğerde oksidasyona uğrar. Barsakiçi mukozasının ALDH aktivitesi düşüktür ve etanol absorbsiyonu esnasında bu yüzden AA barsak içinde birikir. AA akümülasyonu, alkole bağlı gelişen gastrointestinal semptomlara ve hastalıklara neden olur (Salaspuro 1996) Metabolik Değişiklikler ADH ın yer aldığı etanol oksidasyonu esnasında, hidrojen substrattan kofaktör nikotinamidadenindinükleotid e (NAD) transfer olarak redükte formunun (NADH) oluşumuna yol açar. Aşırı miktarda oluşan NADH, sitozolün redoks sisteminde değişikliklere yol açar. Bu durum laktat pirüvat oranında da değişikliğe neden olur. Oluşan bu redoks dengesizlik karaciğer hasarına neden olabilecek bir seri metabolik farklılaşmalara sebebiyet verir. Hiperlaktasidemi asidozise neden olur ve böbreklerin ürik asit atma kapasitesini de azaltarak hiperürisemiye yol açar. NADH/NAD oranında artış α-gliserofosfat konsantrasyonunda artışa neden olur. Bu artış da karaciğerde trigliserit miktarında artışa yol açar. Bunun yanı sıra, NADH miktarında artış yağ asitlerinin sentezini de tetikler. Sitrik asit döngüsünün aktivitesinde de azalma gerçekleşir. Yağ asitlerinin karaciğerde trigliserit formunda akümülasyonu karmaşıktır ve hepatik sentezin artışı, hepatik lipoprotein salınımının azalması, adipoz dokudan yağ asitlerinin mobilizasyonundaki artış, yağ asitlerinin

32 19 oksidasyonundaki azalma gibi birçok farklı metabolik değişikliklerle bağlantılıdır (Caballeria 2003). Glikojen depoları tükenen veya daha önceden karbonhidrat metabolizmasında anormallikler bulunan bireylerde alkol intoksikasyonu ciddi hipoglisemiye neden olabilir. Çünkü NADH/NAD oranındaki artış neoglukojenezi bloke edebilir. Bazı durumlarda ise alkol glukoneogenezis inhibe edeceğine indükleyebilir. Bu durumda ise hiperglisemiye neden olur ( Lieber 1991; Lieber 2000; Lieber 1997; Lieber 2004) (Şekil 1.3.). Şekil 1.3. Etanol metabolizmasına bağlı olarak gelişen hepatik metabolik değişiklikler (Caballeria 2003) Mikrozomal Etanol Oksitleyici Sistem (MEOS) Etanol ile endoplazmik retikulum ve hepatositlerin mikrozomal fonksiyonları arasındaki etkileşim, ratlarda ve hayvanlarda yapılan deneylerde alkol tüketilmesiyle düz (smooth) endoplazmik retikulumun proliferasyonun gözlemlenmesiyle açıklanmıştır. Bu sonuç Licber ve Decarli (1968) nin sitokrom P450 bağımlı sistemi bulmasını kolaylaştırmıştır. Sitokrom P450 bağımlı sistem etanolü asetaldehide aşağıdaki reaksiyon ile okside eder.

33 20 CH 3 CH 2 OH+ NADPH + +H +O 2 CH 3 CHO +NADP + +2H 2 O İnsanlarda, etanol oksidasyonundan sorumlu sitokrom fraksiyonuna CYP2E1 adı verilir. Daha sonra yapılan çalışmalarda başka CYP formlarının rol oynadığı bildirilmiş olsada, CYP2E1 izoenzimi insanlardaki MEOS sisteminin en önemli bileşenidir. MEOS terimi sadece 2E1 tarafından katalize edilen reaksiyonlar olarak düşünülmemelidir. MEOS mikrozomların etanol oksidasyonundaki total kapasitesidir (Lieber 1999; Asai ve ark., 1996). MEOS un etanol için Km değeri 7-10 mm olduğu için, çok yüksek kan alkol konsantrasyonlarında etanol eliminasyonuna katılır. Bu durum artan etanol konsantrasyonu ile artan etanol metabolizmasını açıklar. MEOS un total etanol eliminasyonuna katkısı tam olarak aydınlatılmamıştır. Tüm in vivo etanol metabolizmasının ancak %1-5 inin MEOS tarafından gerçekleştirdği düşünülmektedir. CYP2E1 in en belirgin rolü, sabit yüksek kan etanol düzeylerine verdiği yanıttır. Yüksek alkol konsantrasyonlarına gösterdiği bu metabolik uygunluk, kronik alkolizmde artan etanol metabolizmasını açıklar. Ancak bu metabolik adaptasyon, santral sinir sisteminin alkole gösterdiği adaptasyondan ayrılmalıdır. SSS in bu adaptasyonu kronik alkol kullanımı sonucu beynin etanolün etkilerine geliştirdiği direnç ile karakterize edilir (Lieber 1997; Lieber 1999). Etanol oksidasyonunda AA oluşumunun yanı sıra, MEOS ile süperoksit anyon radikali gibi reaktif oksijen türevlerinin de oluştuğu bildirilmiştir. Bu duruum, lipid peroksidasyonunu artırabilir ve böylelikle MEOS alkolik karaciğer hastalıklarının oluşumunda bir rol oynayabilir. Bunun yanında CYP2E1 nin de 80 nin üzerinde toksikolojik olarak önemli ksenobiyotiği, potansiyel hepatotoksik veya karsinojenik ürünlere aktive etme kapasitesine sahip olduğu bilinmektedir.

34 Katalaz Peroksizomlarda bulunan katalaz, hidrojen peroksit varlığında etanolü asetaldehide okside edebilir. CH 3 CH 2 OH+ +H 2 O 2 CH 3 CHO +2H 2 O Ancak yapılan çalışmalar katalaz inhibitörü olan aminotriazole un in vivo etanol metabolizmasını yavaşlatmadığını göstermiştir (Kato ve ark., 1987). Enzimatik reaksiyonun incelenmesi sonucu in vivo katalaz aktivitesinin H 2 O 2 nin varlığı ile sınırlı olduğu sonucuna varılmıştır. Karaciğerde H 2 O 2 üretiminin yavaş olması nedeni ile, katalazın hepatik etanol metabolizmasında çok az bir rolü olduğu söylenebilir (Lieber 1997) Asetaldehit Metabolizması Aldehit Dehidrogenaz (ALDH) Alkol metabolizmasındaki, ikinci reaksiyon olan AA in asetata oksidasyonu, aldehit dehidrojenaz enzimi (ALDH) ile katalize edilir. ADH gibi, ALDH da katalizör olarak reaksiyona katılabilmek için ortamda NAD + (NADP + ) bulunmalıdır. ALDH da tıpkı ADH gibi birçok izoenzim ile ifade edilir. İnsanlarda, en az 4-5 ALDH izoenzim tipi izole edilmiştir ve hücrelerin hem sitosolik hemde mitokondrial fraksiyonlarında bulunurlar. Asetaldehit oksidasyonundan genel olarak mitokondrial tip II ALDH (ALDH2) sorumludur, mikromolar (µm) düzeyde Km değerine sahiptir ve AA için yüksek affinite gösterir (Thomasson ve ark., 1993; Bosron ve Li 1986; Agarwall 2001). En önemli ALDH enzimleri ise: a) ALDH1: sitozolde bulunur. AA için yüksek Km değerine sahiptir. b) ALDH2: mitokondride bulunur. AA için düşük Km değerine sahiptir. AA metabolizmasında rol oynayan en önemli tiptir.

35 22 ALDH2 iki alel (ALDH2*1 ve ALDH2*2) ile bireylerarası genetik polimorfizm gösterir. Her iki alel için hem homozigot hem de heterozigot formlar bulunmaktadır (ALDH2*1/1, ALDH2*1/2 ve ALDH2*2/2) (Li ve ark., 2001). ALDH2*2/2 fizyolojik olarak inaktif formdur. ALDH2*2 homozigot bireylerde alkol eliminasyonunun yavaş olması, biriken AA e bağlı olarak ADH ın inhibisyonu olarak da açıklanabilir (Agarwall 2001; Iwahashi ve Suwaki 1998; Tanoka ve ark., 1997). ALDH2*1/1 homozigot bireylerde, ADH tarafından oluşturulan tüm AA mitokondrial ALDH tarafından okside edilebilir. Daha yavaş olsa da, ALDH2*1/2 heterozigot bireylerde AA i metabolize edebilecek yeterli miktarda mitokondrial ALDH bulunmaktadır. ALDH2*1/*2 genotipli heterozigot bireylerde ALDH 2*1/1 homozigot bireylerde görülen enzim aktivitesinin % si kadarı görülür (Crabb ve ark., 1989). ALDH2*2/2 homozigot bireylerde ise mitokondrial ALDH aktivitesi gözlenmez ve AA in oksidasyonu yalnızca ALDH1 ile gerçekleştirilir ki bu formun alkolü okside edebilme hızı ve okside edebildiği alkol miktarı yetersizdir. Heterozigot mutant allele sahip bireylerde normal ALDH2 aktivitesine sahip bireylere oranla kanda tespit edilen AA düzeyi 6 kat, homozigot mutant bireylerde ise 20 kat fazla olduğu bildirilmiştir (Yokoyama ve ark., 1996a). ALDH genotipi populasyonlar arası farklılık gösterir. Ancak beyaz ırkta ALDH2 polimorfizmi gözlenmezken (Borras ve ark., 2000; Goedde ve ark., 1992; Iwahashi ve Suwaki 1998; Agarwall ve Goedde 1992), bu oran Asyalı bireylerde %10-44 arası bir artış göstermektedir (Yoshida 1992; Crabb ve ark., 1989; Tamakoshi ve ark., 2003; Matsuo ve ark., 2001; Matsuo ve ark., 2006). ALDH2*2/2 homozigot bireylerde yüksek AA düzeyleri, çok az dozda etanol kullansalar dahi, dolaşım bozukluklarına, taşikardiye ve yüzde aşırı kızarmaya maruz kalırlar. Tüm bu yan etkiler Asyalı bireylerde, alkole ve alkolizme karşı doğal bir koruyucu etki ortaya çıkarır. Ancak Asyalı ALDH2*2/1 heterozigot bireylerde

36 23 alkolizm görülme sıklığındaki artış (Zintzaras ve ark., 2006; Watanabe ark., 2002; Wu ve ark., 2005), heterozigotizmin tam anlamıyla protektif etki göstermediğini açıklar. Bu genotipli bireylerde alkolizmin gelişiminde çevresel ve sosyokültürel faktörler rol oynar. Karaciğer, etanol oksidasyonunun gerçekleştiği ana organ olduğu için ALDH ların büyük kısmı bu organda bulunmaktadır. Ancak diğer organlarda da, ALDH izoenzimleri bulunmaktadır. Ağızda ALDH3, özafagusta ise hem ALDH 3 hemde ALDH 1 bulunduğu için bu organda AA oksidasyonunun gerçekleştiği düşünülmektedir. Duedonum da ALDH tip I ve tip II, barsak mukozasında ise tip I, II ve III ALDH lar bulunmaktadır Asetaldehit ve Asetatın Oluşturduğu Metabolik Değişiklikler Etanolün metabolitleri olan AA ve asetat yalnızca karaciğerde değil, kalp, kan damarları, adipoz doku ve beyin gibi diğer organ ve dokularda etanolün metabolik etkilerinden sorumludur. Lipid peroksidasyon, süperoksit anyonu ve hidroksil radikalleri gibi reaktif oksijen türevlerinin (ROT) neden olduğu bir degredatif durumdur. Serbest radikaller bir veya birden fazla eşlenmemiş e içeren moleküllerdir ve çok kısa yarılanma ömrüne sahip oldukları için oldukça reaktiflerdir. Bu reaktif moleküller doymamış yağ asitlerinden bir hidrojen koparır, LPO başlatma potansiyeline sahiplerdir. Lipidler biyolojik membranların ana bileşenleri olduğu için, membranları bütünlüğündeki peroksidatif kayıp doku hasarına neden olur. Hücreler serbest radikallerden özelikle, tüm hayvan hücrelerinde yüksek konsantrasyonlarda bulunan glutatyon (GSH) sayesinde korunur. GSH düzeylerindeki in vivo ciddi düşüş LPO yu artırır. LPO nun etanolün indüklendiği karaciğer harabiyetinde önemli rol oynadığı bildirilmiştir. Bu sav, AA in hepatik GSH düzeylerinde düşüşlere neden olmasına bağlı olarak açıklanabilir. Tabi ki GSH düzeylerinde azalma LPO yu indükler. Bu teori izole perfüze karaciğerde yapılan çalışmalarda da ispatlanmıştır. Bunun yanı sıra, sıçanlara uygulanan AA, in-vivo serbest radikal oluşumunu artırmıştır. LPO

37 24 ürünleri, DNA ile de reaksiyona girip hatalı kodlama potansiyelini artırarak kansere sebep olabilir. Aynı şekilde etanole bağlı olarak gelişen karsinojenezde LPO da önemli rol oynamaktadır (Haber ve ark., 2003; Grattagliano ve ark., 1996). Karaciğerde, AA lipid peroksidasyonunu (LPO) artırır ve oksidatif hasara neden olur. Özellikle kronik alkoliklerde, AA farklı hücresel membranların proteinlerine bağlanarak AA-protein komplekslerinin oluşumuna neden olur. Bu kompleks yapılar kendilerine karşı oluşturulan antikorların ortaya çıkmasına neden olurlar (Şekil 1.3.). Daha öncede belirtildiği gibi AA i metabolize eden mitokondrial ALDH dır. NAD ye kofaktör olan NADH ın tekrar oksidasyonu mitokondrial bütünlüğe bağlıdır. AA, mitokondrinin yağ asitlerini okside etme kapasitesini de yok eder. Bu mitokondrial disfonksiyon plazmada daha yüksek konsantrasyonlarda AA oluşumuna neden olurken karaciğerde oluşan hasarı da artırır Asetaldehitin Oluşturduğu Organ Toksisitesi Sito-genetik Etkileri Yapılan hücre kültürü ve hayvan çalışmalarında AA in hem mutajenik hemde karsinojenik etkilere sahip olduğu bildirilmiştir. Memeli kültür hücrelerinde kromozomal hasarı indükleyebilir, ve/veya mikroçekirdek veya kardeş kromatid değişimlerine neden olabilir. İnsan lenfositlerinde gen mutasyonlarına neden olduğu da belirtilmiştir. Tüm bu sitogenetik etkiler, AA in DNA-DNA ve /veya DNA protein çapraz bağları oluşturabilme özelliğine sahiptir. Etanol ve AA i metabolize eden enzimlerin genotipleri ve kanser oluşturma riski arasında son yıllarda yapılan epidemiyolojik çalışmalar AA in insanlar üzerindeki karsinojenik etkileri hakkında ayrıntılı bilgi sahibi olmamızı sağlamıştır. Bazı çalışmalarda, daha hızlı ve fazla AA oluşumuna neden olan hızlı metabolize edici özelliğe sahip olan ADH3*1/*1genotipli bireylerde gastrointestinal yolak

38 25 tümörleri görülme riski daha fazladır (Coutelle ve ark., 1997; Seitz ve ark., 2001). Bu genotipli bireylerin tükrüklerinde ise oldukça yüksek konsantrasyonda AA tespit edilmiştir (Liu ve ark., 2001). ALDH2 enzim polimorfizmi, daha fazla AA maruziyetine neden olduğu için, orafarenks, larenks, özofagus, mide, bağırsak ve akciğerlerde alkole bağlı olarak görülebilecek kanser riskini artırır (Tanabe ve ark., 1999; Yokoyama 1996a; Yokoyama 1998a). Bu etki yalnızca karaciğerde gözlenmez. Tüm bu sayılan organların bakterilerle çevrili olması da ilginç bir bulgudur. Ayrıca bu organlarda mikrobial etanol metabolizması ve AA oluşumu da gerçekleşmektedir (Miyakawa 1986; Homann 1997a; Homann 2000b). Bu yüzden bu bulgular, bu kanserlerin patogenezinde etanol lokal mikrobial yolunun AA oluşumununda etkili olduğunu desteklemektedir Asetaldehit-Protein Adductları Asetaldehidin yapısında bulunan karbonil grubundaki karbonun elektrofilik özelliği nedeni ile, bu bileşik potansiyel nükleofilik saldırılara çok yatkındır. Proteinlerde nükleofilik gruplar bulunduğundan birçok durumda AA için bir bağlanma hedefi oluştururlar. Asetaldehitin proteinlere bağlanması sonucu ortaya iki çeşit ürün çıkar: 1. Stabil (kararlı) AA protein adductları 2. Unsatabil (kararsız) AA protein adductları Unstabil (kararsız) olan yapılar ya tekrar AA ve protein olarak ayrışır, ya da NADH gibi redükleyici ajanları vasıtasıyla kararlı AA- protein yapılarına dönüşürler. Oluşan bu kararlı yapılar ise toksik etkilerin ortaya çıkmasında önemli rol oynarlar (Nicholls ve ark., 1992). Asetaldehit birçok hücresel ve hücre dışı proteinlere in vitro olarak bağlanabilir. Asetaldehit hemoglobin gibi proteinler ile in vivo multipl adduct (yapı)

39 26 oluşturur. Bu oluşumlar insanlarda ve hayvanlarda da karaciğerde gerçekleşir (Sillaznaukee ve Koivula 1990) Alkol Metabolizmasında Rol Oynayan Faktörler Alkolün plazma konsantrasyonu ve toksisitesi, üst gastrointestinal yolakta absorbsiyonuna, organizmada dağılımına ve hepatik metabolizmasına bağlıdır. Tüm bu kriterler genetik ve çevresel faktörlerden etkilenebilir. Gastrik boşalım ve etanol absorbsiyonu; - içecekteki alkol konsantrasyonuna - içme hızına - alkolün tek başına tüketilmesi kriterlerine bağlıdır. Bazı çalışmalar, gıda tüketiminin alkol eliminasyonunu %50 civarında artırdığını gösterirken bu artışın cinsiyetten ve tüketilen gıda maddelerinin muhteviyatından bağımsız olduğunu bildirmiştir. Tüketilen gıdaların FPM üzerinde gösterdiği etkilerin yanı sıra, hepatik kan akışındaki artış, enzim aktivasyonu ve NADH ın reoksidasyon kapasitesi ile de ilişkili olduğu bildirilmiştir. FPM gastrik ADH sayesinde gerçekleşir. Gastrik ADH midede yüksek konsantrasyonlarda bulunan alkolün oksidasyonunu gerçekleştirmek için yeterlidir. Asyalı bireylerde kadınlarda ve siroz hastası alkoliklerde FPM nın daha az olduğu bildirilmiştir. Tüm bu durumlarda aktivite çok azdır. Gastrik ADH aktivitesi ve FPM kullanılan ilaçlardan da büyük ölçüde etkilenir (Lieber 1997). Alkol vücutta bulunan suyun içinde homojen olarak dağılır. Alkolün plazma konsantrasyonu vücut suyunun ağırlığına ve miktarına bağlıdır. Bu yüzden kadınlarda erkeklere oranla alkolün dağılımı daha azdır. Yine kadınlarda bu kriterle birlikte FPM da daha düşük olduğundan, kadınlar alkolün toksik etkilerine daha fazla maruz kalırlar (Seitz ve ark., 1993; Baraona ve ark., 2001).

40 27 Alkol metabolizmasını etkileyen birçok faktör bulunmaktadır. Bunlar: a) Alkol tüketimi b) Gıdaları ve içeriği c) Diğer ilaçlar d) Cinsiyet e) Vücut ağırlığı f) Vücut kas/yağ oranı g) Alkol metabolize eden enzimlerin genetik farklılığı h) Karaciğer hacmi i) Irk Alkolün ve AA in hepatik metabolizması da birçok faktörden etkilenir. Bunlar; a) Çevresel faktörler b) Genetik faktörler c) Kronik alkol tüketimi d) Karaciğer hastalıkları olarak özetlenebilir (Caballeria ve ark., 2003) Cinsiyet ve Beden Yapısı Kadın ve erkekte alkolün absorbsiyonu, dağılımı ve metabolizması farklılık gösterir. Aynı ağırlıkta olan iki farklı cinsiyet karşılaştırıldığında, kadın bedeninde daha az oranda su bulunduğu görülmektedir. Bu yüzden bir erkekle aynı miktarda alkol tüketen bir kadında kan alkol konsantrasyonu daha yüksek bulunur. Yapılan diğer çalışmalar göstermektedir ki, aynı düşük doz alkol tüketen kadın ve erkekte gastrointestinal yolakta alkolün first-pass metabolizması farklılık gösterir (Baraona ve ark., 1998; Seitz ve ark., 1993). Bunun nedeni gastrik ADH aktivitesi ile açıklanabilir. Kadınlarda düşük gastrit ADH aktivitesine bağlı olarak alkolün firstpass metabolizması daha azdır. Bu sonuç da erkekler ile karşılaştırıldığında kadınlarda gözlenen daha yüksek sistemik konsantrasyonları açıklar. Ancak bazı araştırıcılarda kadınlar ve erkeklerde alkolün first-pass metabolizmasında farklılık

41 28 gözlemlememiş olup (Ammon ve ark., 1996), bu metabolizma farklılığın çok düşük dozda alkol tüketildiğinde ve gastrik boşalma hızının daha yavaş olduğu durumlarda ortaya çıktığını bildirmişlerdir. Alkol eliminasyon hızında da cinsiyetin önemli bir faktör olduğu bildirilmiştir. Bu durum alkol kullanımından sonra ortaya çıkan farklı kan alkol konsantrasyonlarına ve özellikle yüksek dozda alkol tüketildiğinde alkol farmakokinetiğinin lineer bir yol izlememesine bağlı olabilir. ADH2 genotipleri benzer erkek ve kadınlarda yapılan çalışmada β 60 (pseudo-zero order kaybolma hızı 60 dak içinde) ın kadınlardan daha yüksek olduğu bildirilmiştir (Thomasson ve ark., 1995). Bu farklılıklar, günlük tüketimine, seks hormonlarının etkisine (östrojen ve testesteron) ve vücut ağırlığına bağlı olarak değişen karaciğer boyutlarına bağlanmaktadır. Alkol neredeyse tamamen karaciğer tarafından metabolize edildiğinden, alkol eliminasyonunda karaciğerin büyüklüğü de önemli bir rol oynar. Menstral döngü, kontraseptiflerin alkol metabolizması üzerindeki etkileri de araştırılmıştır. Menstral siklusun alkolün farmakokinetiğini etkilemediği ve kadınlarda alkol eliminasyon hızını etkileyerek alkol metabolizmasında cinsiyet farklılığına neden olmadığı gösterilmiştir. Oral kontraseptif kullanan kadınlarda kullanmayanlara göre daha düşük pik kan alkol konsantrasyonları ve daha yavaş eliminasyon hızları gözlenir (Mumenthaler ve ark., 1999). Ancak farklı çalışmalarda oral kontraseptiflerin alkol farmakokinetiği üzerinde etkisi olmadığını bildirmişlerdir. Kadınlarda daha sıklıkla alkole bağlı gelişen karaciğer hastalığı riski ise araştırılması gereken konular arasındadır Gıda ve Gıda Bileşenlerinin Etkisi Tüketilen gıda maddesine ve cinsine bağlı olarak alkolün absorbsiyon hızında ve pik alkol düzeylerinde düşmeler gözlenebilir. Bunun nedeni alınan gıdaya bağlı olarak değişen gastrik boşalım hızıdır. Yapılan çalışmalar genellikle oral alkol kullanımı ile

42 29 ilgili olduğundan gıdaların absorbsiyon üzerindeki (biyoyararlanım) ve alkol metabolizması üzerindeki etkisi tam olarak aydınlatılamamıştır (Ramchandani ve ark., 2001). Yapılan bazı çalışmalarda alkol 530 kalorilik bir öğün ile tüketildiğinde, alkol eliminasyon hızında % artış gözlenmiştir (Ramchandani ve ark., 1999; Ramchandani ve ark., 2000). Aynı artış, yüksek-yağ-karbohidrat ve protein içeren öğünlerde alkol kullanılması ile de gözlenebilir (Rogers ve ark., 1987). Alkol eliminasyon hızındaki bu artış, tüketilen gıdalar ile birlikte artan karaciğer kan akış hızı ve ADH aktivitesindeki artış ile açıklanabilir. Ancak alkol eliminasyon hızında, alınan gıda ve türlerine bağlı değişiklikler üzerinde ileri çalışmalar yapılmaktadır (Ramchandani ve ark., 2001). Diğer ilaçların aksine, etanol vücuda yeterli miktarda enerji sağlar. İçerdiği enerji miktarı karbohidrat ve proteinlerin enerji içeriğinden dahi fazladır (7,1 kcal, 29,7 kcal/gr). Alkolik bir kişi günlük kalori ihtiyacının ortalama yarısını alkolden alır. Bu yüzden diğer gıdaların yerini alarak yetersiz beslenmeye neden olur. Folat, tiamin ve diğer vitamin eksikliklerine neden olur. Yetersiz beslenme sekonder olarak, gastrointestinal komplikasyona bağlı olarak ortaya çıkan yetersiz absorbsiyon sonucu da gözlenebilir. Bu komplikasyonlar arasında pankreatik yetersizlik ve gıdaların yetersiz hepatik metabolizması da bulunmaktadır (Lieber 1995). Bunun yanı sıra alkol A vitamini üzerinde gösterdiği etki gibi, gıdaların bozulmasını da (degradation) hızlandırır (Lieber 2004; Lieber 2000). Beslenmedeki yetersizliklerin karaciğer hasarına neden olduğu deneysel olarak ispatlandığı için, alkolik karaciğer hastalığının (ALD-alcoholic liver disease) da mekanizmasının da buna dayandığı bulunmuştur. Buna dayanarak en sık kullanılan terapilerden biri zenginleştirilmiş diyetlerle uygulanan gıdasal takviyedir. Ancak ne yazık ki bu uygulamalar, ALD nin ilk safhası olan karaciğer yağlanmasını önlemeye yetmez. Bu problem yetersiz beslenmeden bağımsız olarak alkolün karaciğer üzerinde doğrudan toksik etkisi

43 30 olabileceği sorusunu gündeme getirir. Önceleri bu hipotez reddedilmiştir. Bu hipotez, sıçanların içme sularına alkol katılarak ve yeterli beslenmeleri sağlanarak yapılan deneylerle kanıtlanmaya çalışılmıştır. Sonuç olarak gerçekten sıçanların karaciğerlerinde yağlanma tespit edilmiştir. Ancak bunun nedeninin daha sonra sıçanların yeterli sıvı tüketmemesi (su+alkol) ve bu yüzden kanlarında alkolün belirgin konsantrasyonlara ulaşamaması olduğu sonucuna varılmıştır. Daha sonra yapılan çalışmalarada, yeterli gıda tüketildiğinde dahi, intoksikasyona neden olmayacak konsantrasyonlarda karaciğer yağlanmasının görüldüğü bildirilmiştir (Leiber 2004) Irkların ve Genetik Polimorfizmin Etkisi Birçok çalışmada, alkol metabolize eden enzimler ADH ve ALDH2 ın polimorfizmine ve değişik ırklarda polimorfik allel rastlanma sıklığına bağlı olarak alkol metabolizmasında farklılıklar bulunduğu doğrulanmıştır. Polimorfik alleller tarafından kodlanan izoenzimlerin farklı katalitik özellikleri bulunmaktadır. Bu farklı özellik nedeniyle alkol farmakokinetiği kişisel farklılıklar gösterebilir. Afro-Amerikan kökenli bireylerde ADH1B*3 alelerinin, alkole bağlı oluşan doğum defektlerine karşı koruyucu olduğu bildirilmiştir. Bu etki bu allele sahip bireylerin özellikle yüksek kan alkol konsantrasyonlarında, alkolü daha iyi metabolize etmelerine bağlanmıştır (McCarver ve ark., 1997). Yapılan bir başka çalışmada ise, ADH1B*3 alleline sahip annelerin daha az alkol tüketikleri bildirilmiştir (Jacobson ve ark., 2000). Yerli Amerikalı bireylerde yapılan bir başka çalışmada ise, ADH1B*3 alleline sahip bireylerin ADH1B*1 aleline sahip bireylere göre alkol eliminasyon hızlarının daha yüksek olduğu bildirilmiştir (Wall ve ark., 1996). ADH1B*3 bu etnik grupta çok sıklıkla rastlanmamaktadır. (%7). Yapılan diğer birçok çalışmada ise, yerli Amerikalıların beyaz ırka göre alkol eliminasyon hızlarının daha yüksek olduğu bildirilmiştir. ALDH2 fonksiyonel polimorfizmi, mitakondriyal ALDH2 enziminin daha düşük aktiviteli formunu kodlayan ALDH2* 2 variyant alelinin oluşumuna neden

44 31 olur. Asyalı topluluklarda bu polimorfizmin alkolizmi engelleyici etkisi olduğu bildirilmiştir (Yoshida 1992; Crabb ve ark., 1989; Agarwall ve Goedde 1992). Homozigot ALDH2* 2 bireylerin alkol kullandıklarında homozigot ALDH2* 1 ve heterozigot ALDH2*1/*2 bireylere oranla, daha yüksek kan alkol ve kan AA düzeylerine sahip oldukları gösterilmiştir (Yokoyama ve ark., 1996a). Bu sonuçlar ALDH2* 2 homozigot olan bireylerin alkole karşı aşırı duyarlılık geliştirdiklerini ve kronik alkolik olamayacaklarını destekler. Alkol ve AA metabolizmasını düzenleyen diğer genetik ve çevresel faktörlerin araştırılması, yalnızca kişinin alkolik olup olmama risklerini değerlendirebilmekle kalmayıp alkole bağlı gelişebilecek organ hasarlarına karşı alınabilecek önlemlerin aydınlatılmasında da önemli bir adım olacaktır (Ramchandani ve ark., 2001) Kronik Alkol Tüketiminin Etkileri Alkolik bireyler alkole karşı tolerans geliştirirler. Bunun nedeni ise, santral sinir sisteminin adaptasyonu, etanol eliminasyon hızında artış ve metabolik toleransa bağlanabilir. Etanolün metabolik hızında artışa neden olan mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamasına rağmen, ortaya çıkan bu durumdan artan ADH aktivitesi, NADH ın mitokondrial reoksidasyonu, karaciğerde ortaya çıkan hipermetabolik durum, artan mikrozomal oksidasyon ve katalaza bağlıdır. Etanol Na, K ATPaz artışını indükler. Bunu takiben ATP ve oksijen tüketiminde artış gözlenir. Mitokondrial NADH reoksidasyonundaki artış ise karaciğerin hipermetabolik durumunun da temelini oluşturur (Cabelleria 2003) Alkol ve Kanser Aşırı alkol tüketimi üst sindirim yolu kanserlerinin en kuvvetli risk faktörlerinden biridir. Bunun yanında son yapılan çalışmalarda gastrointestinal (GI) sistemin diğer

45 32 kısımlarında da aşırı alkol tüketiminin kanser riskini artırdığı gösterilmiştir. Etanol oksidasyonunun ilk metaboliti AA in, yapılan hücre kültürü ve hayvan çalışmalarında multipl karsinojenik etkileri kanıtlanmıştır. Son yapılan çalışmalar göstermektedir ki, insanlarda normal barsak florası veya tükrük bezlerinde bulunan bakteriler tarafından alkol tüketimi sonrası oluşan AA lokal karsinojen olarak etki göstermektedir (Salaspuro 1997; Homann 2001). Ancak alkol bağımlılığı birçok indirekt tümör oluşumunu artıran etkenlerle de ilişkilendirilmektedir. Bunlar, diğer karsinojenlere maruziyet, prokarsinojenlerin karsinojenlere metabolik aktivasyonu, kuvvetli alkollü içeceklerin lokal etkileri ve kötü beslenme olarak özetlenebilir. Kanser riski doza-bağlıdır. Amerikan Kanser Topluluğu nun bir milyon kişi üzerinde yaptığı çalışmalara göre günde 6 veya daha fazla birim alkol tüketen kişilerde oral kanser rölatif riskinin (RR) 6.2, özafagus kanserinin rölatif riskinin ise 5.8 kat fazla olduğu gösterilmiştir (Boffeta ve Garfinkel 1990). Alkol ve sigaranın birlikte kullanımı daha fazla rölatif etkiye sahiptir. Günde 1.5 şişe veya daha fazla şarap ve birlikte sigara tüketen kişilerde özafagus kanserine yakalanam oranı 150 kat daha fazladır (Salaspuro 2003). Alkol kullanımı olmadan yalnızca az miktarda sigara kullanan ve sigara kullanımı olmadan yalnızca az miktarda alkol tüketen kişilerde, özafagus kanseri riski çok az veya gözardı edilebilecek orandadır. Ancak, kullanım miktarı az dahi olsa sürekli maruziyet (kronik kullanım) bu riski kadınlarda 19, erkeklerde 12 kat artırmaktadır (Salaspuro 2003). Genetik olarak, oluşan AA in detoksifikasyonunu tam olarak sağlayamayan, ALDH2 gen polimorfizmi bulunan kişilerde aşırı alkol tüketimi ile sindirim sistemi kanserlerine yakalanma riski arasındaki ilişki çok önemlidir. Son zamanlarda yapılan epidemiyolojik çalışmalara göre, ALDH2-enzim eksikliği bulunan Asyalı bireylerde alkole bağlı olarak gelişen sindirim sistemi kanserlerine yakalanma riski artmaktadır (Wu ve ark., 2005; Watanabe ve ark., 2002; Matsuo ve ark., 2006; Matsuo ve ark., 2001).

46 33 Çizelge 1.4. ALDH2 eksikliği bulunan Japon alkolik bireylerde sindirim sistemi kanserine yakalanma sıklığı (RR) (Salaspuro 2003) Kanser Tipi Oran Oropharyngolaryngeal 11.1 Özafagus 12.5 Mide 3.5 Kolon 3.4 Oropharyngolaryngeal ve/veya mide 54.2 kanseri ile birlikte gelişen özafagus kanseri İnsanlarda etanol eliminasyonu ve AA oluşumunda en önemli rol oynayan enzimler tip I alkol dehidrogenaz (ADH)lardır. Üç gen ile ifade edilirler. Bunlar ADHı, ADH2 ve ADH3 dür. ADH2 için 3 farklı, ADH3 için 2 farklı alelik form bulunmuştur (Zintzaras ve ark., 2006; Osier ve ark., 1999; Frenzer ve ark., 2002; Vidal ve ark., 1993). ADH2*2 ve ADH3*1 alelleri en aktif enzimatik formları kodlarlar. Örneğin, ADH3*I/*I genotipine sahip bireyler diğer ADH3 genotipine sahip bireylere oranla etanolü 2.5 kat daha hızlı AA e metabolize ederler. ADH2*2/*2 genotipli bireyler ADH2*I/*Igenotiplilere göre ise 40 kat daha hızlı etanol metabolize edicilerdir. Bazı çalışmalarda üst sindirim sistemi kanserlerine yakalanma riskinin artışı ile hızlı metabolize edici ADH3 genotipi ilişkilendirilmiştir. Ancak bulunan bu sonuçlar diğer çalışmalar açısından çelişkilidir (Olshen ve ark., 2001). Farklılıklar değişik çalışma dizaynları ile açıklanmıştır. Sonuç olarak şimdiye kadar yapılan epidomiyolojik çalışmalara göre ADH3*I ve üst sindirim sistemi kanser riski arasında ilişki bulunmaktadır ancak daha fazla birey içeren geniş populasyonlarda çalışmalar yapılmalıdır. Bazı çalışmalarda tüketilen alkollü içeceğin cinsi ile üst sindirim sistemi kanser riski arasındaki ilişki incelenmiştir. Ne yazık ki yapılan birçok çalışmada kullanılan alkollü içeceğin tipi ile ilgili kesin bilgi verilmemiş veya çalışmalar tek bir

47 34 merkez üzerine oturtulmuşlardır. Bu yüzden en fazla tüketilen içeceğin en fazla kanser riskine neden olduğu sonucuna varılmıştır. Yapılan bazı çalışmalarda kalvadosda bulunan AA konsantrasyonu diğer alkollü içkilere göre 100 kat daha fazla olabilir. Ancak yine de üst sindirim sistemi kanserlerinin patojenezinde alkollü içkinin çok az bir rol oynadığı düşünülmektedir de hipofarenks kanseri demir eksikliği ve Plummer-Winson Sendromu ile ilişkilendirilmiştir. Bazı çalışmalara göre düzenli meyve ve yeşil sebze tüketimi karsinojenik ajanlara maruziyet sonucu oluşacak kanser riskini azaltmaktadır. Asya nın bazı bölgelerinde özafagus kanserinin görülme sıklığı beslenme bozukluğu ile açıklanmıştır (Salaspuro 2003) Orofarinks ve Özafagus Kanseri Aşırı alkol tüketimi ve özafagus kanseri arasındaki ilişki 19. yüzyılın başlarında ortaya çıkarılmıştır. Yapılan birçok epidemiyolojik çalışma göstermektedir ki, aşırı alkol tüketimi üst sindirim sisteminde kanser oluşumu riskini artırmaktadır. GI sistem kanserlerinin %25-68 i kadarı alkol tüketimi ile ilişkilendirilmektedir. Ayrıca alkol ve sigara kullanımının bırakılmasının (abstinence durumu) oluşabilecek tümörlerin %80 inin önlenebileceği bildirilmiştir. Oral hijyene dikkat edilmemesi, beslenme bozukluklarıve papillomavirüs bu kanserlere neden olan diğer bağımsız faktörlerdir (Salaspuro 2003) Mide Kanseri Alkol tüketimi ile mide kanseri arasındaki ilişkiyi açıklayan epidemiyolojik çalışmalar tartışmalıdır. Yapılan çalışmalar sonucunda, her ne kadar az etkisinin olduğu düşünülse ve tam olarak ispat edilememiş olmasına rağmen alkolün mide kanserinde etyolojik rolü olabileceği görüşüne varılmıştır (Franceschi ve La Vecchia 1994). Bazı vaka-kontrol çalışmalarında aşırı alkol tüketiminin rölatif risk (RR)i kat arasında etkilediği sonucuna varılmıştır. Genetik olarak AA

48 35 detoksifikasyonunu tam olarak gerçekleştiremeyen Japon bireylerde bu değerin 3.5 e kadar yükseldiği bildirilmiştir (Yokoyama ve ark., 1998; Kato ve Matsumoto 1992) Kalın Bağırsak Kanseri Bu konu üzerindeki çalışmalarda tıpkı alkolün mide kanseri ile ilşkisi gibi tartışmalıdır. Kolon kanserlilerde yapılan çalışmalarda aşırı alkol tüketiminin RR i 1.1 e yükselttiği, rektal kanser riskinin ise daha fazla olduğu sonucuna varılmıştır (Kune ve Vitetta, 1992). WHO Ortak Karar Bildirisinde, epidemiyolojik çalışmalar sonucu alkollü içeceklerin çok az miktarda tüketimlerinde dahi kolorektal adenom ve kanser riskini artırdığı bildirilmiştir. Genetik olarak AA detoksifikasyonunu tam olarak gerçekleştiremeyen Japon bireylerde, aşırı alkol tüketimine bağlı olarak ortaya çıkan bu kanser tipinin RR değerinin yüksek olduğu bildirilmiştir (Himayama 1989; Salaspuro 2003) Kronik Alkol-İlaç Etkileşimleri Alkoliklerde etanolün dışında başka birçok ilaca da tolerans gelişir. Alkoliklerin gösterdikleri bu tolerans santral sinir sistemi adaptasyonu ile ilişkilendirilmektedir. Bunun yanı sıra metabolik adaptasyon da göz ardı edilmemelidir. Aslında alkoliklerde ilaçların kandan atılım hızlarının da yüksek olduğu bildirilmiştir. Yapılan çalışmalar göstermektedir ki, saf alkol verilen (uygun ve yeterli bir diyet varlığında) sıçanlarda da insanlarda da meprobamat, pentobarbital ve propranololün kandan temizlenme hızlarında artış görülmüştür. Benzer şekilde, antipirin, tolbutamid, warfarin, diazepam ve rifamisinin metabolizmasında da artışlar görülmüştür. Etanol tüketimi, ilaç metabolizmasını karaciğerde etkiler ve ilaç atılımındaki, dağılımındaki ve hepatik kan akışındaki tüm değişikliklerden bağımsızdır. Kronik alkol kullanımı MEOS aktivitesini indükler. Bu durum, karaciğer mikrozomlarında diğer ilaç-metabolize eden sistemleri etkileyerek bazı ilaçların metabolizmasında artışa neden olur.

49 36 Aşırı alkol tüketimi sitokrom P-450 enzimini de indükler ve hepatik mikrozomal ilaç-detoksifikasyonunu sağlayan enzimlerin aktivitesinde de artışa neden olur. Alkolün in vivo ilaç atılım hızını artırıcı etkisi de bu şekilde açıklanmaktadır. Bu yüzdendir ki daha önce alkol bağımlılığı hikayesi olan kişilere ilaç reçete edilirken doz uygulamasına çok dikkat edilmesi gereklidir. Çünkü yoksunluk sendromlarını atlatmış dahi olsa, alkol bağımlığı hikayesi olan bir hasta, alkol kullanmayan bir bireyle kıyaslandığında aynı dozda uygulanan ilaçtan farklı biyoyararlanım gösterirler. Terapötik düzeylerinde farklılıklar görülebilecek bu ilaçlar warfarin, difenilhidantoin, tolbutamid ve izoniaziddir. Hiç alkol kullanmayan bir bireye göre bu ilaçların yarı ömürleri alkol kullanımını bırakmış alkolizm hikayesi bulanan bireylerde %50 daha kısadır. Kronik etanol kullanımının bu etkileri, karbonhidrat, lipid ve proteinlerin diyet içindeki oranları değiştirilerek hafifletilebilir. Metabolik tolerans ise alkol tüketimi tamamen bırakıldıktan sonra günlerce veya haftalarca devam edebilir (Lieber 1997) Etanolün Ksenobiyotiklerle Akut Etkileşimleri Etanolün akut varlığı ilaç metabolizmasını inhibe eder. Ana mekanizmanın genel detoksifikasyon prosesinde, sitokrom P450 ile bağlanmanın yarışmalı olması ile açıklanabilir. Diğer mekanizmalar, bazı mikrozomal ilaç metabolize eden enzimlerin inhibisyonuna neden olan steroid hormanların salınımıyla da ilişkilendirilmektedir. Bazı durumlarda, etanolün oksidasyonu ile ortaya çıkan NADH, sitrik asit döngü aktivitesini inhibe edebilir ve sitozolik NADPH oluşumunu sağlayan ara ürünleri tüketebilir. Mikrozomal düzeyde etanol-ilaç etkileşimleri komplekstir. Örneğin bazı ilaç metabolize eden sistemler (örn:anilin hidroksilaz) düşük etanol konsantrasyonlarında, diğer bazı sistemler (örn:aminopyrine demethylase) yüksek alkol konsantrasyonlarında inhibisyona uğrarlar. Hatta ikinci durumda, düşük alkol konsantrasyonları mikrozomal ilaç-detoksifiye edici bu sistemleri elektron donorü olarak rol oynayan NADH ın üretiminde artışa neden olduğu için stimüle edebilir.

50 37 Ancak etanolün genel olarak ilaç metabolizmasında gösterdiği etki inhibisyondur. Etanol ve bazı ilaçlar birlikte kullanıldığında, ilaç metabolizma hızında in vivo düşüşler görülür. ABD de ölümcül trafik kazalarının %50 sine alkolün neden olduğu bildirilmiştir. Ancak unutulmaması gereken, etanol ile birlikte kullanılan ilaçların ve bu ilaç-alkol etkileşimlerinin, trafikte kişinin refleks kaybını ne derecede etkilediği konusudur (Lieber 1997) Headspace Analiz Nedir? Headspace kelime anlamı olarak kromatografi vialinde numunenin üzerindeki gaz fazı-gaz boşluğu- olarak tanımlanabilir. Headspace analizi bu yüzden bu gaz boşluğunun içinde bulunan bileşenlerin analizi olarak nitelendirilir. Headspace GC katı, sıvı ve gaz örneklerinde uçucu ve yarı uçucu organiklerin analizi için kullanılır. Son yıllarda bu yöntemin geçerliliği dünyada da kabul görmüştür. Sıklıkla kullanıldığı alanlar kanda alkollerin ve farmasötik ürünlerdeki artık çözücülerin tespiti amaçalıdır. Diğer genel uygulama alanları ise : Polimer yapılardaki monomerlerin, meşrubat ve yiyecek ürünlerinde plastik ve tatlandırıcı bileşiklerin, ve parfüm ve kozmetiklerdeki hoş kokulu maddelerin endüstriyel analizleridir. Bu yöntem daha çok katı veya sıvı matriks numuneden headspace gaz hacmi olarak etkin bir şekilde ayrılabilen numunedeki çok hafif uçucular için kullanılır. Yüksek kaynama derecesine sahip olan uçucu ve yarı-uçucular bu teknikle belirlenemez, çünkü headspace gaz hacmi içindeki dağlılımları az olacaktır. Headspace analizlerinde kalite kontrol ve numune görüntüleme işlemleri otomasyon sayesinde hem hızlı hem de güvenilirdir.

51 38 Doğrudan analizi mümkün olmayan ve numune ekstraksiyonu ve hazırlama aşamalarından geçmesi gereken kompleks numune matriksleri viale doğrudan konulup analize alınabilirler. Bu sayede hem zamandan hem de masraftan kar edilmiş olur Headspace Analizin Genel İlkeleri Vial içine hazırlanmış bir headspace numunesinde: (i)numune (ii)seyreltici çözücü (iii)matriks düzenleyici ve (iv)headspace (gaz fazı) bulunur. Kompleks numune karışımlarından uçucu olan bileşenler uçucu-olmayan numune bileşenlerinden ekstre edilip numune vialinin gaz veya headspace kısmında izole edilebilirler. Headspace in içinde bulunan gaz numunesi tüm uçucu bileşiklerin ayrımı için GC a enjekte edilir Headspace Vialinde Fazlar G= Gaz fazı (Headspace) Gaz fazı genel olarak headspace olarak adlandırılır ve yoğun numune fazının üzerinde bulunur. S= Numune Fazı Numune fazında analizi istenilen bileşen(ler) bulunur. Genel olarak katı veya sıvı formunda olur ve seyreltici çözücü ve matriks düzenleyici içerir.

52 39 Şekil 1.4. Headspace vialindeki fazlar Numune fazı viale konuşup ağzı kapatıldığı andan itibaren, uçucu bileşikler oklar yönünde dengeye ulaşıncaya kadar gaz fazına difüzlenirler. Böylece numune artık headspace kısmından alınabilir hale gelir Doğru Vialin ve Kapağın Kullanılması Headspace GC ile en iyi performansı elde etmek için, numune hazırlama esnasında ve cihazların kurulumunda maksimum özen gösterilmelidir. Headspace de en fazla dikkat edilmesi gereken konu vialler ve kapaklarıdır. Headspace viallerinin boyutları 6, 10 ve 20 ml dir. Kullanılacak vialler yeterli headspace hacmi sağlanabilecek ancak analizi istenilen bileşiklerin çok fazla seyrelmesini engelleyecek büyüklükte olmalıdır. Headspace vialleri yuvarlak veya düz altlı olabilir. Her ikiside kullanıma uygundur ancak yuvarlak altlıklı vialler daha kuvvetlidirler ve autosamplerin vialleri inkübatörün içine itip çekmesinedn en az düzeyde etkilenirler ve güvenle kullanılabilirler. Yuvarlak altlıklı vialler ayrıca daha yüksek basınçlara ve sıcaklıklara dayanabilir. Ayrıca türevleme reaksiyonlarının uygulanabilmesi için daha uygundur.

53 40 Headspace vialleri doğru kapatılmalıdır. Vial kapakları kapatıldıktan sonra etrafında dönmemelidir. Sistemin sıcaklığına uygun septa kullanılmalıdır. Zayıf septalar kaçağa yol açar ve headspace de kontaminasyona neden olurlar. Vialler temiz olmalıdır. Tüm vialler aynı değildir, kirli ve tekrar yıkanmış vialler hayalet piklere ve yanlış sonuçlara neden olurlar Inorganik Tuzların İlavesi Sulu çözeltilerde yüksek tuz konsantrasyonları, numune matriksindeki polar organik uçucuların çözünürlüğünü azaltır ve bu sayede headspace e geçişlerini sağlar ve kolaylaştırır. Sonuç itibari ile K değerleri de düşer. Tuzların K değeri üzerindeki etkisinin büyüklüğü her bileşik için aynı değildir. K değeri zaten çok düşük olan bileşiklerde sulu numune matriksine tuz eklemenin dağılım katsayısına etkisi çok az olacaktır. Genel olarak, polar matrikslerdeki (sulu çözelti) uçucu polar bileşiklerde en yüksek K değeri kaymaları gözlenir ve numune matriksine tuz ilavesi bu numunelerden alınan yanıtı artırır. Matriks etkisini azaltmak için kullanılan tuzlar: Amonyum klorür Amonyum sülfat Sodyum klorür Sodyum sitrat Sodyum sülfat Potasyum karbonat

54 Headspace Numune Hacmi Hassasiyeti artırmanın başka bir yöntemi ise numune vialinden headspace boşluğuna çekilip GC ye aktarılan hacmi artırmaktır. Numune boyutunu artırmak, kolon volumetrik akış oranına oranla numunenin kolona gidiş süresini artıracaktır. ( Headspace Cihazı Üç çeşit headspace autosampler ı vardır : Şırıngayla Enjeksiyon Dengelenmiş Basınç Basınçlı Döngü Basınçlı Döngü Sistemi Dengelenmiş basınç yönteminin aksine bu yöntemde bilinen miktarda numune kullanılır. Bu yöntemde altı-porta sahip bir valf sistemi bulunmaktadır. Diğer tekniklerde olduğu gibi, öncelikle vialin ısısı denetim altına alınır ve basınç uygulanır (Adım 1). Basınç uygulamaından sonra, valf açılır ve döngü (loop) numune ile doldurulur (Adım 2). Döngü dolduktan sonra, valf gaz akışını yeniden yönlendirmek ve numuneyi transfer hat üzerine püskürterek analitik kolona ulaşmasını sağlamak amacıyla yeniden açılır (Adım 3).

55 42 Adım 1 Numune Dengeye/basınca ulaşır Adım 2 Numune headspace den alınır. Adım 3 Numune enjekte edilir. Şekil 1.5. Headspace de basınçlı döngü sistemi ile enjeksiyon Bu sistemde yüksek sıcaklığın kullanılabiliyor olması avantajdır ancak dengelenmiş basınç yönteminde de görülen dezavantajlarla bu sistemde de karşılaşılır (bir önceki numune enjeksiyonundan arta kalanların bir sonrakine taşınması ve enjeksiyon bloğunun sürekli meşguliyeti nedeni ile manuel kullanıma elverişli olmamasıdır). ( Genetik Polimorfizm DNA üzerinde belirli bir alan kaplayan ve spesifik bir protein kodlayan bölgelere gen denir. Aynı gen üzerinde birden fazla alelin bulunmasına bağlı olarak, organizmada birden fazla fenotipin gözlenmesine neden olan değişikliklere polimorfizm denir. Populasyonda daha az sıklıkta gözlenen alel frekansı %1 in üzerinde olmalıdır. %1 in altında olan değişiklikler nadir varyant ya da mutasyon olarak değerlendirilir. Polimorfizm bir hastalığa neden olmaz veya üreme kapasitesini azaltmaz. Bu sebepten polimorfizm populasyon içerisinde çok yüksek oranlarda gözlenebilir. Genetik hasar ve mutasyonlar ciddi hastalıklara neden olarak populasyondaki bireylerin etkin üreme kapasitelerini düşürür. Bu şekilde genler bir sonraki jenereasyona aktarılamaz. Bu yüzden söz konusu durumda mutant genin populasyondaki frekansı %1 in üzerine çıkamaz. (Gonzalez, 1999). Bir populasyonda alel frekansları Hardy-Weinberg dengesinde bulunur. Belirli sabit şartlar altında her iki alelin frekansının ve genotipik oranının sabit kalması durumudur. Bu genetik dengenin koşulları ise;

56 43 a) Populasyon yeterince kalabalık olmalıdır. b) Mutasyon gözlenmemelidir. c) Göçmenlik durumu bulunmamalıdır. d) Üreme tamamen rastgele olmalıdır. Hardy-Weinberg dengesi ise aşağıdaki gibidir: p 2 + 2pq + q 2 = 1 p: birinci alelin frekansı q: diğer alelin frekansı. (Ayala ve Kiger 1980) DNA Ekstraksiyonu DNA molekülleri incelemeye alınmadan önce diğer hücresel materyalden ayrılmalıdır. DNA hücre ortamından korunmak amacıyla hücresel proteinlerle paketlenmiştir. Bu koruma kalkanı DNA analizlerini etkiler. Bu yüzden, DNA molekülünden diğer proteinleri ve hücresel materyalleri uzaklaştırmak amacıyla farklı DNA ekstraksiyon yöntemleri kullanılır. Bunu yanı sıra, elde edilen DNA nın miktarını ve diğer özelliklerini belirlemek amacıyla ileri analizler yapılabilir. DNA laboratuvarlarında DNA ekstraksiyonu için üç farklı yöntem kullanılmaktadır: a) Organik (Fenol-Kloroform) Ekstraksiyon b) Chelex Ekstraksiyon c) FTA Kağıt Laboratuvarımızda uygulanan yöntem organik (fenol-kloroform) ekstraksiyon yöntemidir. Aşağıdaki şekilde bu yöntem şematik olarak gösterilmiştir (Şekil 1.6.; bkz: daha ayrıntlı bilgi için 2.Gereç ve Yöntemler) DNA izolasyonunda kullanılacak doğru ekstraksiyon yöntemi biyolojik materyalin özelliğine de bağlıdır. Örneğin tam kan ile kan lekesi veya kemik dokusu farklı yöntemlerle ekstre edilmelidir.

57 44 Organik Ekstraksiyon Kan lekesi SDS,DTT, EDTA, Proteinaz K İnkübasyon (56 0 C) Sentrifüj Fenol,kloroform,izoamil alkol karışımı Vorteks Sentrifüj Üst faz yeni tüpe transfer edilir TE Tamponu Numune konsantrasyonu (Etanol presipitasyon yöntemi) Sentrifüj DNA miktar tayini, PCR Şekil 1.6. DNA izolasyonunda kullanılan organik (fenol-kloroform) ekstraksiyonu (Butler 2005). Ekstre edilen DNA saf su vaya TE (tris-edta) tamponu içinde C de saklanır. DNA nın daha uzun süre saklanması gerektiği durumlarda, nükleaz aktivitesini önlemek amacıyla C de bekletilmesi gerekir. Nükleazlar hücrelerde bulunan enzimlerdir (protein) ve DNA nın bozulmasına neden olurlar. Nükleazlar çalışabilmek için ortamda magnezyuma ihtiyaç duyarlar. Bu yüzden, nükleazların

58 45 DNA yı bozmalarını (sindirmelerini) engellemek amacıyla, kan mor-kapaklı koruyucu olarak EDTA içeren tüplere alınmalıdır. EDTA bir şelatör ajan olduğu için ortamda bulunan serbest magnezyumla bağlanır ve bu şekilde nükleazlar ortamda magnezyum bulunmadığı için toplanan kan örneğindeki DNA ya zarar vermez (Butler 2005) Organik (Fenol-Kloroform) Ekstraksiyon Organik ekstraksiyon birçok kimyasalın seri olarak eklenmesi ile gerçekleştirilir. a) Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve proteinaz K: Hücre duvarlarını yıkar. Kromozomlar içinde bulunan DNA yı koruyan proteinleri parçalar. b) Fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı: DNA yı proteinlerden ayırmak amacıyla kullanılır. DNA organik sıvı karışımın sulu kısmında daha çok çözünür. Santrifüj edildiğinde, istenmeyen proteinler ve hücresel debris sulu fazdan ayrılır ve çift sarmal DNA molekülleri bu sayede analiz için ayrıştırılabilir. Organik ekstraksiyon, yüksek moleküler ağırlıklı DNA nın izolasyonu için uygun bir yöntemdir. Ancak zaman alıcıdır ve sağlığa zararlı kimyasalların kullanıldığı bir yöntemdir. Ayrıca numune birkaç defa farklı tüpe alındığı için kontaminasyon riski fazladır. Ancak yöntem ucuzdur ve her DNA laboratuvarında dikkatlice uygulandığında yüksek verimlilikle kullanılabilir. Farklı biyolojik materyallerden elde edilebilecek DNA miktarları aşağıdaki çizelgede gösterilmiştir. Numunelerden elde edilen DNA miktarı ve kalitesi çevresel faktörlerden belirgin bir şekilde etkilenebilir.

59 46 Çizelge 1.5. Çeşitli biyolojik materyalden elde edilebeilecek DNA miktarları (Butler 2005) Numune DNA Miktarı Sıvı kan ng/ml Kan Lekesi ng/cm 2 Sıvı semen ng/ml Vajinal svap ng/svap Sıvı tükrük ng/ml Oral Svap ng/svap İdrar 1-20 ng/ml Kemik 3-10 ng/mg Doku ng/mg Koparılan saç (köklü) ng/kök Dökülmüş saç (köklü) 1-10 ng/kök Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)-DNA Amplifikasyonu PCR, herhangi bir organizmaya ait DNA daki dizisi bilinen herhangi bir bölgenin çoğaltılmasını sağlayan hücre-dışı bir DNA klonlama yöntemidir. DNA numunesinin kopyalanması gerçekleştirilemezse, bu amaçla yapılan hiçbir analiz sonuca ulaşamaz. Bu amaçla ısı döngü aygıtları (thermal cycler) kullanılarak DNA nın spesifik bir bölgesinin birçok defalar çoğalması (replikasyonu) sağlanır. DNA amplifikasyonu kısaca aşağıdaki basamaklardan oluşur: a) Denatürasyon: DNA numunesi C sıcaklığa kadar ısıtılarak DNA nın denatürasyonu sağlanır. Yani DNA çift sarmal yapısı bozularak DNA iplikleri (sarmalları) birbirinden ayrılır. Denatürasyon genellikle 1 dakika olarak programlanır. Ancak Amplitaq gold kullanılarak hot start PCR gerçakleştiriliyorsa ilk döngüde denatürasyon zamanı 10 dakika olarak uzatılmalıdır.

60 47 b) Annealing (Bağlanma): Sıcaklık C lere düşürülerek eklenilen primerlerin DNA zinciri üzerinde hedeflenen (amplifiye edilecek) bölgeye bağlanmaları sağlanır. c) Extension (Uza(t)ma): Genellikle 72 0 C de eklenen DNA polimeraz ile primerler DNA ya bağlandıkları bölgeden DNA yı 5 uçlarından 3 uçlarına doğru uzatırlar. Bu üç basamak defa tekrarlanır. Ortalama bir amplifikasyon (PCR) üç saat civarında seyreder. Her döngü koşullara bağlı olarak değişir ancak ortalama 5 dakikadır: 1 dakika denatürasyon (94 0 C), 1 dakika annealing (bağlanma, C), 1 dakika extention (uzama, 72 0 C); ısı döngü aygıtının bu üç sıcaklık arasında dengelenmeside ortalam 2 dakika alır= toplam 5 dakika/döngü (Şekil 1.7.). Şekil 1.7. PCR ın aşamaları Teorik olarak 30 döngüde DNA nın hedeflenen bölgesi milyar kez kopyalanmış olur (Çizelge 1.6.). Oluşan PCR ürününe amplikon denir. Oluşan bu ürün miktar olarak birçok teknikle ölçülebilir hale gelir.

61 48 Çizelge 1.6. Reaksiyon %100 verimlilikle çalıştığında PCR amplifikasyonu ile oluşan hedef DNA molekül sayısı (Hedef PCR ürünü tam anlamıyla üçüncü döngüden sonra forward ve reverse primerler tarafından tanınmaya başlar.) (Butler 2005) Döngü Sayısı Çift Sarmal Hedef Molekül Sayısı (Spesifik PCR Ürünü)

62 49 PCR genellikle µl numune hacmi ile gerçekleştirilir. Düşük hacimlerde, buharlaşma problemi görülebilir. Ayrıca reaksiyon bileşenleri çok düşük hacimlerde pipetleneceğinden, çok dikkatli pipetlemenin gerekmesi de başka bir problem olarak ortaya çıkar. Öte yandan çok yüksek hacimlerde termal dengenin sağlanabilmesi problemi ile karşılaşılabilir. Daha yüksek hacimli bir solüsyonda, çözeltinin merkezini ısıtabilmek daha uzun zaman gerektirir. Çünkü istenilen sıcaklığa ulaşılması için daha uzun süre bekleme süresi gerekmektedir. Bu durum da total termal döngü zamanını artırır. Birçok moleküler biyoloji protokolünde bu yüzden ortalam hacim µl olarak bildirilir µl amplikon genellikle 0.2 ml ince-duvarlı tüpler içine pipetlenir (Butler 2005) PCR Bileşenleri PCR ürünü, birçok bileşen eklenip, istenilen total hacim deiyonize su ile tamamlanarak hazırlanır. PCR ın en önemli bileşenlerinden biri primerlerdir. Primerler bir çift olarak tasarlanır (forward-reverse, sense-antisense primerler). Primerler, kısa DNA dizilimidirler ve yaklaşık olarak nükleotid uzunluğunda tasarlanırlar. Primerler DNA nın kopyalanacak kısmını hedefleyecek ve bu bölgeyi tanımlayacak şekilde genom üzerinde bağlanır. Kimyasal olarak sentezlenen oligonükleotidlerdir ve PCR reaksiyonuna DNA kalıbından daha yüksek konsantrasyonlarda eklenir. Doğru primer dizilimini belirlemek amacıyla, genom üzerinde kopyalanacak DNA dizilimi hakkında önceden bilgi sahibi olmak gereklidir. PCR verimi primerlerin bağlanma (annealing) karakteristiklerinden doğrudan etkilenir. PCR dan alınacak verimin yeterliğini sağlamak amacıyla, iki primerde hedeflenen bölgeye spesifik olmalıdır ve benzer bağlanma sıcaklığına sahip olmalıdırlar. Birbirleriyle veya her primer kendi içerisinde etkileşime girmemelidir. Aksi takdirde jel üzerinde primer dimer ler (50 bp uzunluğunda) gözlenir. İnternet üzerinden artık primer dizilimi gerçekleştirilebilmektedir. PCR ürününün uzunluğu, primer uzunluğu, istenilen bağlanma sıcaklığı (Tm) belirtilerek internet aracılığıyla en uygun PCR primer çifti seçilebilir.

63 50 Çizelge 1.7. PCR primer dizaynı için genel kriterler (Butler 2005). Parametre Optimal Değerler Primer uzunluğu baz Primer Tm C % GC içeriği % Kendine komplementer olmamlıdır 3 baz Diğer primere komplementer olmamalıdır (primer-dimer oluşumu) 3 baz (özellikle 3 uçlarında) Hedef dizilim üzerinde iki primer arası <2000 baz uzaklığı uzaklık Eşi olmayan oligonükleotid dizilim BLAST taraması ile en uygun seçim Forward ve reverse primer çiftinintm dereceleri arasındaki uzaklık 5 0 C Aynı bazın çok uzun tekrarlılığının olması <4 PCR ın önemli bileşenlerinden biri de ısıya dayanıklı polimerazlardır. En sıklıkla kullanılan Taq-DNA polimerazlardır. Taq, Thermus aquaticus adlı bakteriden üretilir. Taq-DNA polimerazın çalışabilmesi için en uygun sıcaklık 72 0 C dir. Kullanılacak polimeraz ile birlikte bu enzimin en uygun çalışacağı tampon çözeltisi ticari firmalar tarafından kullanıcıya ulaştırılmaktadır. PCR buffer (tamponu) içerisinde genellikle magnezyum tuzu da bulunur (10X PCR buffer including 15 mm MgCl 2 ). Taq ın aktivite gösterebilmesi için ortamda magnezyum iyonu bulunmalıdır. Ancak magnezyum ortamda bulunan serbest nükleotidlerle bağlanabilir. Bu durumda ise enzim aktivitesi gözlenemez. Bu yüzden Mg +2 iyonunun konsantrasyonu çok dikkatlice ayarlanmalıdır. DNA zinciri çoğaltılırken ortama eklenen dntpler (datp, dttp, dctp, dgtp) kullanılır. Ticari olarak yüksek konsantrasyonlarda bulunan dntp ler (deoksiribonükleozidtrifosfatlar) kullanılmadan önce seyreltilmelidir. Herbir PCR

64 51 tüpünde datp, dttp, dctp, dgtp konsantrasyonu eşit olmalıdır. Bir PCR tüpünd bulunması gereken PCR bileşenleri ve konsantrasyonları aşağıdaki çizelgede özetlenmiştir: Çizelge 1.8. Tipik bir PCR amplifikasyonunun bileşenleri (Butler 2005) Reaktif Tris-HCl, ph 8.3 (25 0 C) mm mm Optimal Konsantrasyon MgCl 2 Kcl 50 mm dntpler Herbiri (datp, dttp, dctp, dgtp) 200 µm DNA polimeraz U Primerler µm DNA 1-10 ng genomik DNA Isı Döngü Aygıtları (Thermal Cycler) DNA numunesini, PCR reaksiyonunun gerçekleşmesi için ısıtan ve soğutan cihazlara thermal cycler (ısı döngü aygıtı) denir. PCR ın gerçekleşebilmesi için numunenin tam belirtilen sıcaklıkta ısıtılması ve soğutulması gerekmektedir. Son dönemlerde geliştirilen ısı döngü aygıtlarının numune kapasiteleri oldukça fazladır ve gradient (optimum bağlanma sıcaklığını belirlemek için ayarlanabilir program özelliği) uygulamalıdır. Gradient, primerlerin bağlanabilmesi için en uygun sıcaklığın (annealing temperature) optimize edilmesinde önemli bir parametredir. Isı döngü aygıtı, dikey konumda bulunan 8 numuneyi de aynı bağlama sıcaklığında tutarken, yan dikey konumdaki 8 numuneyi de bir başka bağlama sıcaklığında tutabilir. Yani, bir defada 12 farklı bağlama sıcaklığı çalışılabilir. Bu da

65 52 kullanıcıya optimum bağlama sıcaklığının seçiminde kolaylık sağlar ve vakit kaybını önler. Modern ısı döngü aygıtlarında heated lid -ısınabilen kapak bulunmaktadır. Bu kapak sayesinde buharlaşıp PCR tüpünün kapağına yapışan amplikon kapağa uygulanan sıcaklık ile tekrar yoğunlaşıp PCR tüpünün içine düşer. Bu sayede PCR ın verimliliğinde azalma gözlenmez PCR-CTPP (Polimerase Chain Reaction-Confronting Two Pair Primers) Yöntemi Genetik polimorfizm çalışmalarında sonuçların istatistiksel olarak anlamlı olabilmesi için çalışmalarda çok sayıda numune kullanılır. Bu yüzden daha hızlı ve dah ucuz genotipleme teknikleri geliştirilmektedir. Tek nükleotid polimorfizmlerinde (SNPler)üç çeşit genotipleme tekniği kullanılmaktadır. Bunlar: a) PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism) b) DNA sekans yöntemi c) PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism) En sık kullanılan yöntem PCR-RFLP dir. Ancak ilk PCR gerçekleştirildikten sonra 3-24 saat inkübasyon gerektirdiği için oldukça zaman alıcı bir yöntemdir. Bu yüzden genotipleme çalışmalarında daha hızlı ve ucuz yeni yöntemler geliştirilmektedir. PCR-CTPP iki çift primer kullanılarak gerçekleştirilen yeni bir genotipleme tekniğidir. Herhangi bir inkübasyon zamanı gerektirmediği için diğer yöntemlere oranla oldukça hızlıdır. Birçok SNP nin genotipleme çalışmasında kullanılabilir. PCR-CTPP yönteminin prensibi aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Söz konusu X ve Y alelleri için iki-çift primer dizayn edilir (herbiri için forward ve reverse

66 53 olmak üzere 4 ayrrı primer dizaynı yapılır:f1, R1, F2, R2). Birinci primer çiftinin reverse primerinin 3 bazı, X bazına komplementerdir. Bu yüzden yalnızca X alelini amplifiye eder. Birinci forward primerise X alelinin 5 ucundan spesifik bölgeye bağlanır. İkinci primer çiftinin forward primerinin 3 bazı, Y bazına komplementerdir. Bu yüzden yalnızca Y alelini amplifiye eder. İkinci reverse primer ise Y alelinin 3 ucundan spesifik bölgeye bağlanır. Dört primerde aynı tüp içerisine eklenir. Oluşabilecek ürün uzunlukları ise a, b, c bp dir. XX genotipinde jel üzerinde a ve c bp gözlenirken, YY genotipinde ürün uzunlukları b ve c bp dir. Heterozigotluk durumunda jel üzerinde a, b ve c bp ürün uzunluklarına ait bandlar gözlenecektir. Primerler jel üzerinde a ve b bp uzunlukları açıkça ayrı ayrı gözlemlenebilecek şekilde ayarlanmalıdır (Hamajima ve ark., 2000; Tamakoshi ve ark., 2003; Hamajima ve ark., 2002). Şekil 1.8. PCR-CTPP yönteminin temel çalışma prensibi (Tamakoshi ve ark., 2003). Sonuç olarak; çalışmamızın amacı, headspace gaz kromatografi yöntemi ile kan, tükrük ve idrarda metanol ve etanol belirleme yöntemini validasyon çalışmaları ile güvenilir kılmak ve adli uygulamada rutine geçirmek; çok yeni bir yöntem olan PCR-CTPP yönteminin iki farklı çalışma grubunun geliştirdikleri yöntemler baz alınarak genetik laboratuvarımız koşullarında uygulanabilir hale getirilerek toplumumuzda ADH2 ve ALDH2 gen polimorfizmini araştırmaktır.

67 54 2.GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Etanol MERCK Metanol MERCK n-bütanol MERCK Agaroz PRONA Trizma Base MERCK Borik asit MERCK EDTA MERCK Etidyum Bromür APPLICHEM 10X loading çözeltisi QIAGEN Saf etanol SCHARLAU, DOP DNA s RNA s free water QIAGEN Taq DNA polimeraz FERMENTAZ Fenol-kloroform-izoamil alkol (25:24:1) APPLICHEM Sodyum dodesil sülfat (SDS) APPLICHEM Sodyum klorür (NaCl) MERCK Proteinaz K MERCK 100 bp ladder FERMENTAZ Primerler ALPHA DNA, MONTREAL Parafilm PECHINEY Alimünyüm folyo

68 Kullanılan Araç ve Gereçler Gaz Kromatografi cihazı HP AGILENT 6890 N Headspace Analizörü HP AGILENT 7694 E Kolon HP-INNOWAX Otomatik pipet ve uçları RAININ 20 ml headspeace supply kit high temp AGILENT 20 mmgray PTFE/ Black butyl molded septa AGILENT 20 mm one piece silver aluminum crimp cap AGILENT N 2 Tüpü HABAŞ Kuru Hava Tüpü HABAŞ Hidrojen Tüpü HABAŞ Elektrikli hassas terazi SCHIMADZU LIBROR Laminar flow ESCO Soğutmalı santrifüj cihazı HETTICH ZENTRIFÜGEN Mikrodalga fırın ARÇELİK Jel Görüntüleme cihazı SYNGENE Yatay elektroforez cihazı SCIE-PLAS Güç Kaynağı BIO-RAD PCR cihazı TECHNE TC 512 Su banyosu NÜVE BM 402 Vorteks karıştırıcı NÜVE NM 110 Manyetik Karıştırıcı ve ısıtıcı MIRAK THERMOLYNE ph metre METTLER TOLEDO Otomatik mikropipet THERMO FINNPIPETTE TIPOR-V (Orange Scientific) Otomatik mikropipet uçları FINNTIP (10, 100, 1000 µl filtreli, pyrogen free) 1.5 ve 0.2 ml lik apendorf steril tüpler AXYGEN GENUINE

69 Deney Protokolü Türk toplumundan rastgele seçilmiş gönüllü bireylerden alınan bir damla kan örneği gazlı bir beze emdirildi. Kontaminasyon riskini önlemek amacıyla tüm örnekler ayrı ayrı kurutularak paketlendi Yöntemler Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Gaz-Kromatografi Yöntemi Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Gaz-Kromatografi Yönteminin Koşulları Kolon : HP-INNOWAX PolyethyleneGlycol Capillary 30mx320µmx0.25µm Fırın Inlet : C (6 dak) Split : 10:1 Isıtıcı : C Basınç :5.28 Psi Total Akış:10.9 ml/dak FID (Flame Ionization) Dedektör Isıtıcı:250 0 C H 2 Akışı:35 ml/dak Hava Akışı:350 ml/dak N 2 : 10 ml/dak

70 Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Headspace Analizörü Koşulları Zone Temp: Vial Loop Tr Line : 80 0 C :90 0 C :110 0 C Event Times: GC cycle time : 7 Vial Equilibration Time :10 Pressurization Time :0.2 Loop Fill time :0.2 Loop Equilibration Time :0.05 Injection Time : Yöntem Validasyon Çalışmaları Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Standartlarının Hazırlanması Etanol ve metanolün aynı balon jojede konsantrasyonları 50 mg/100 ml, 100 mg/100 ml, 200 mg/100 ml, 300 mg/100 ml, 400 mg/100 ml olacak şekilde stok çözeltileri hazırlandı. Tüm stok çözeltiler su ile tamamlandı. 20 ml lik headspace viallerine 1 ml stok çözelti ve iç standart olarak konsantrasyonu 80 mg/100 ml olacak şekilde 100 µl n-bütanol eklendi Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Kalibrasyon Grafiklerinin Oluşturulması mg/100 ml konsantrasyonları arasında ( mg/100 ml)

71 58 tüm noktalar üçer defa enjekte edilerek, etanol ve metanol için beş noktalı bir kalibrasyon grafiği hazırlandı Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Tekrarlanabilirlik Çalışmaları Metanol ve etanolün bir düşük bir orta ve bir yüksek konsantrasyondaki (50, 200 ve 400 mg/100 ml) çözeltileri her bir konsantrasyon 5 defa analiz edilmek suretiyle, tekrarlanabilirlikleri % değişim katsayısı (%CV) ve rölatif standart sapma (RSD) hesaplanarak değerlendirilmiştir Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Verim (Geri Kazanılabilirlik) Çalışmaları 1ml boş su, tükrük, kan ve idrar içerisine konsantrasyonu 200 mg/100 ml olacak şekilde metanol ve etanol katılarak adı geçen biyolojik materyalden verim hesabı yapılmıştır. Her numuneye iç standard olarak 100 µl n-bütanol (80 mg/100 ml) eklendi Hassasiyet Hassasiyet çalışmaları iki analitik faktörle tanımlanır.bunlar; a) Limit of Detection (Dedeksiyon limiti; LOD) b) Limit of Quantification (Kantitasyon, miktarsal tayin limiti; LOQ) Bu amaçla en düşük konsantrasyonda hazırlanan stok geriye doğru seyreltilerek cihazın okuyabileceği (LOD) değeri ve LOQ= 3.3LOD denklemine göre yöntemin LOQ değeri hesaplandı (Thomsen ve ark., 2003).

72 Alkol Dehidrogenaz (ADH2) ve Aldehit Dehidrogenaz (ALDH2) Enzim Polimorfizminin Belirlenmesi Kan Örneklerinden DNA İzolasyonu Hücrelerde bulunan nüklear DNA yı açığa çıkarabilmek amacıyla organik (fenolkloroform) ekstraksiyon yöntemi kullanıldı. 1) Numunelerden 2-3 adet 1 cm uzunluğundaki iplikçik ependorf tüplere alındı ve üzerine; 45 µl NaCl (1 M) 40 µl SDS (%20 lik) 400 µl TE 5 µl proteinaz K eklendi ve kısaca vortekslendi. 2) 56 0 C lik su banyosunda saat inkübe edildi. 3) Fenol-kloroform-izoamil alkol karışımından 500 µl. ilave edildi ve kısaca vortekslendi. 4) rpm de 2-3 dakika santrifüj edildi. 5) Üst faz yeni bir ependorfa alındıktan sonra alt faz atıldı. 6) 1000 µl mutlak etil alkol ilave edildi. 7) rpm de 10 dakika santrifüj edildi. 8) Alkol oluşan pelete zarar vermeden atıldı. 9) 500 µl %70 lik oda sıcaklığında etil alkol ilave edildi. 10) rpm de 5 dakika santrifüj edildi. 11) Tüpün içerisinde bulunan tüm alkol dikkatlice atıldı. 12) Kalan alkol da tamamen uçurulduktan sonra yaklaşık olarak µl RNAse DNAse free su ilave edildi.

73 PCR Amplifikasyonu Alkol Dehidrogenaz (ADH2) Enzim Polimorfizmi PCR Amplifikasyonu ADH2 enzim polimorfizmini belirlemek amacıyla kullanılan iki çift primer dizilimi aşağıdaki çizelgede gösterilmiştir (Tamakoshi ve ark., 2003; Çizelge 2.1). Çizelge 2.1. Alkol dehidrogenaz (ADH2) polimorfizmini PCR-CTPP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primer dizilimleri Polimorfizm Primer Dizilimi F1: 5 GGG CTT TAG ACT GAA TAA CCT TGG ADH2 R1: 5 AAC CAC GTG GTC ATC TGT GC Arg47His F2: 5 GGT GGC TGT AGG AAT CTG TCA R2: 5 AGG GAA AGA GGA AAC TCC TGA A Altı çizili nükleotidler polimorfik bazı gösterir. ADH2 gen polimorfizmini göstermek amacıyla, kullandığımız primerlerin insan genomunda lokalizasyonları ile PCR-CTPP sonrası oluşturdukları amplikon uzunlukları ve söz konusu primerlerin Tm değerleri aşağıdaki çizelgede topluca özetlenmiştir (Çizelge 2.2).

74 61 Çizelge 2.2. PCR-CTPP yöntemi ile alkol dehidrogenaz (ADH2) polimorfizmini belirlemek için kullanılan primer çiftleri, oluşturdukları amplikon uzunlukları ve primerlere ait Tm değerleri ( Primer Çiftleri F1-R1 F2-R2 F1-R2 Amplikon uzunluğu (bp) Kromozom 4: bp GGGCTTTAGACTGAATAACCTTGGggataaactgaatctttcatatttag gaatagtagggattagtagcaaaaccctcaaatacattttagaaacacaa Tttcaggaatttgggtatgttaaattcatctagttacaatcttttctgaa tctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctgtaggaatctgtca CACAGATGACCACGTGGTT Kromozom 4: bp GGTGGCTGTAGGAATCTGTCacacagatgaccacgtggttagtggcaacc tggtgaccccccttcctgtgattttaggccatgaggcagccggcatcgtg gagagtgttggagaaggggtgactacagtcaaaccaggtacaggattcac actcagggaacacgtgtggttcaccatccaggatttcccagcctggataa ggaaaccaaggcaatgagagacgaaagtgcttgcacaaggtcaccgcgca gccaggacttcaggagtttcctctttccct Kromozom 4: bp GGGCTTTAGACTGAATAACCTTGGggataaactgaatctttcatatttag gaatagtagggattagtagcaaaaccctcaaatacattttagaaacacaa tttcaggaatttgggtatgttaaattcatctagttacaatcttttctgaa tctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctgtaggaatctgtca cacagatgaccacgtggttagtggcaacctggtgaccccccttcctgtga ttttaggccatgaggcagccggcatcgtggagagtgttggagaaggggtg actacagtcaaaccaggtacaggattcacactcagggaacacgtgtggtt caccatccaggatttcccagcctggataaggaaaccaaggcaatgagaga cgaaagtgcttgcacaaggtcaccgcgcagccaggacttcaggagtttcc TCTTTCCCT Primer Tm değerleri F1= C R1= C F2= C R2= C F1= C R2= C

75 62 50 µl lik amplifikasyon içeriği için, ng genomik DNA, her primerden 4 pmol, 0.5 ünite taq DNA polimeraz, 15 mm MgCl 2 içeren 10X PCR tamponu, 200 mm dntp mix, RNAse DNAse free su kullanıldı. Amplifikasyon programı; PCR-CTPP işleminde ADH2 enzim polimorfizmini belirlemek amacıyla kullandığımız amplifikasyon programı aşağıdaki gibidir: C de 10 dakika C de 1 dakika C de 1 dakika 35 döngü C de 1 dakika C de 5 dakika C de dakika Aldehit Dehidrogenaz (ALDH2) Polimorfizmi PCR Amplifikasyonu ALDH2 enzim polimorfizmini belirlemek amacıyla iki farklı çalışma grubunun yöntemleri karşılaştırmalı olarak çalışıldı (Matsuo ve ark., 2001; Tamakoshi ve ark., 2003). ALDH2 enzim polimorfizmini belirlemek amacıyla kullanılan iki çift primer dizilimi aşağıdaki çizelgede gösterilmiştir (Matsuo ve ark., 2001; Çizelge 2.3.).

76 63 Çizelge 2.3. Aldehit dehidrogenaz (ALDH2) polimorfizmini PCR-CTPP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primerler ve dizilimleri Polimorfizm Primer Dizilimi F1: 5 - TCA TGC CAT GGC AAC TCC AGC-3 ALDH2 R1: 5 - CCC ACA CTC ACA GTT TTC ACT TC-3 Glu487Lys F2: 5 -TAC GGG CTG CAG GCA TAC ACT A-3 R2: 5 -TGA TCC CCA GCA GGT CCT GAA-3 Altı çizili nükleotidler polimorfik bazı gösterir. ALDH2 gen polimorfizmini göstermek amacıyla, kullandığımız primerlerin insan genomunda lokalizasyonları ile PCR-CTPP sonrası oluşturdukları amplikon uzunlukları ve söz konusu primerlerin Tm değerleri aşağıdaki çizelgede topluca özetlenmiştir (Çizelge 2.4).

77 64 Çizelge 2.4. Aldehit dehidrogenaz (ALDH2) polimorfizmini PCR-CTPP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primer çiftleri, oluşturdukları amplikon uzunlukları ve primerlere ait Tm değerleri ( Primer Çitleri F1-R1 F2-R2 F1-R2 Oligonükleotid Uzunluğu (bp) Kromozom 12: bp TCATGCCATGGCAACTCCAGCctgggcaacagagaaagattctatctcaa Aaaaaaaaatttttttttaagttaaaaataaaataaagactttggggcaa tacagggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgc Aatctcgtttcaaattacagggtcaactgctatgatgtgtttggagccca Gtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcg AgtacgggctgcaggcatacactGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGG Kromozom 12: bp TACGGGCTGCAGGCATACACTgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgc tgggggctcagggcctgttggggcttgagggtctgctggtggctcggagc Ctgctgggggattggggtctgttgggggctcggggcctgccagaggttca GgacctgccggggactcagggcctgctggaagTTCAGGACCTGCTGGGGA TCA Kromozom 12: bp TCATGCCATGGCAACTCCAGCctgggcaacagagaaagattctatctcaa aaaaaaaaatttttttttaagttaaaaataaaataaagactttggggcaa tacagggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgc aatctcgtttcaaattacagggtcaactgctatgatgtgtttggagccca gtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcg agtacgggctgcaggcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacct gctgggggctcagggcctgttggggcttgagggtctgctggtggctcgga gcctgctgggggattggggtctgttgggggctcggggcctgccagaggtt caggacctgccggggactcagggcctgctggaagttcaggacctgctggg GATCA Primer Tm değerleri F1= C R1= C F2= C R2= C F1= C R2= C 50 µl lik amplifikasyon içeriği için, ng genomik DNA, her primerden 10 pmol, 0.5 ünite taq DNA polimeraz, 15 mm MgCl 2 içeren 10X PCR tamponu, 200 mm dntp mix, RNAse DNAse free su kullanıldı.

78 65 Amplifikasyon programı; PCR-CTPP işleminde ALDH2 enzim polimorfizmini belirlemek amacıyla kullandığımız amplifikasyon programı aşağıdaki gibidir: C de 10 dakika C de 1 dakika C de 1 dakika 40 döngü C de 1 dakika C de 5 dakika C de dakika ALDH2 enzim polimorfizmini belirlemek amacıyla kullanılan diğer iki çift primer dizilimi ise aşağıdaki tabloda topluca özetlenmiştir (Tamakoshi ve ark., 2003; Çizelge 2.5.). Çizelge 2.5. Aldehit dehidrogenaz (ALDH2) polimorfizmini PCR-CTPP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primerler ve dizilimleri (Tamakoshi ve ark., 2003) Polimorfizm Primer Dizilimi F1: 5 - TGC TAT GAT GTG TTT GGA GCC-3 ALDH2 R1: 5 - CCC ACA CTC ACA GTT TTC ACT TC-3 Glu487Lys F2: 5- GGG CTG CAG GCA TAC ACT A-3 R2: 5 -GGC TCC GAG CCA CCA-3 Altı çizili nükleotidler polimorfik bazı gösterir. ALDH2 gen polimorfizmini göstermek amacıyla, kullandığımız diğer primerlerin insan genomunda lokalizasyonları ile PCR-CTPP sonrası oluşturdukları amplikon uzunlukları ve söz konusu primerlerin Tm değerleri aşağıdaki tabloda topluca özetlenmiştir (Çizelge 2.6.).

79 66 Çizelge 2.6. Aldehit dehidrogenaz (ALDH2) polimorfizmini PCR-CTPP yöntemi ile belirlemek için kullanılan primer çiftleri, oluşturdukları amplikon uzunlukları ve primerlere ait Tm değerleri ( Primer Çitleri F1-R1 F2-R2 F1-R2 Oligonükleotid Uzunluğu (bp) Kromozom 12: bp TGCTATGATGTGTTTGGAGCCcagtcaccctttggtggctacaagatgtc ggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcaggcatacactgaag TGAAAACTGTGAGTGTGGG Kromozom 12: bp GGGCTGCAGGCATACACTgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgg gggctcagggcctgttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcc Kromozom 12: bp TGCTATGATGTGTTTGGAGCCcagtcaccctttggtggctacaagatgtc ggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcaggcatacactgaag tgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctgttggggct tgagggtctgctggtggctcggagcc Primer Tm değerleri F1= C R1= C F2= C R2= C F1= C R2= C 50 µl lik amplifikasyon içeriği için, ng genomik DNA, her primerden 10 pmol, 0.5 ünite taq DNA polimeraz, 15 mm MgCl 2 içeren 10X PCR tamponu, 200 mm dntp mix, RNAse DNAse free su kullanıldı. Amplifikasyon programı; PCR-CTPP işleminde ALDH2 enzim polimorfizmini belirlemek amacıyla kullandığımız amplifikasyon programı aşağıdaki gibidir: C de 10 dakika C de 1 dakika C de 1 dakika 40 döngü C de 1 dakika C de 5 dakika C de dakika

80 DNA Elektroforezi DNA Elekrtoforez Jelinin Hazırlanması %2 lik agaroz jel hazırlamak amacıyla; 2.4 gr agaroz tartıldı ve 120 ml 1X TBE çözeltisi içerisinde çözüldü. Mikrodalga fırında ağzı alimünyum folyo ile kapatılıp üzerinde delikler açılarak maksimum ayarda kaynatıldı. Oda sıcaklığında çözelti ısıya ulaşana kadar bekletildi. Üzerine 10µl EtBr eklendi ve hafifçe çözelti pembeleşip homojen karışım sağlanıncaya kadar erlen çalkalandı. Jel tarakları ve bariyerleri takıldıktan sonra agar kalıba döküldü. Oda sıcaklığında jel donması için dakika kadar bekletildi. Taraklar jelden çıkarılmadan önce jelin yırtılmaması amcıyla, jel 1X TBE çözeltisi ile ıslatıldı. Kalıp elektroforez tankına yerleştirildi. Tanka yetecek miktarda 1X TBE çözeltisinden eklendi. 6X loading ve amplikon parafilm üzerinde karıştırılarak jel kuyucuklarına yüklendi. 100 bp ladder her tarakta 2 farklı kuyuya yüklendi. Güç kaynağı 100 volt 70 ampere ayarlandı ve numuneler 85 dakika jel üzerinde yürütüldü. Jel görüntüleme cihazında sonuçlar değerlendirildi İstatistiksel Analiz ADH2 ve ALDH2 gen (alel) frekansları Hardy-Weinberg dengesi (eşitliği) kullanılarak hesaplanmıştır (Ayala ve Kiger, 1980; Rohlf ve Sokal 1981).

81 68 3. BULGULAR 3.1. Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Metod Validasyon Çalışması Sonuçları Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Kalibrasyon Grafikleri Standart alanı / Internal standart alanı değeri ordinatta (y ekseni), [standard] / [internal standard] değerleri apsiste (x ekseni) olmak üzere çizilen kalibrasyon eğrileri ve regresyon denklemleri ile korelasyon değerleri (R 2 ) Şekil 3.2., Şekil 3.3., Şekil 3.4. ve Şekil 3.5. de gösterilmiştir. Kalibrasyon eğrisi çizmek amacıyla etanolün ve metanolün sudaki 400, 300, 200, 100, 50 mg/100 ml lik stok çözeltileri hazırlandı. İnternal standard olarak 100 µl n-bütanol (80 mg/100 ml) eklendi. Konsantrasyon oranlarına karşı alan oranları (cihazdan alınan cevap) yerine konularak kalibrasyon grafiği çizildi. Çizelge 3.1. de metanol, etanol ve n-bütanolün alıkonma zamanları, konsantrasyonları ve bu konsantrasyona ait cihazın gördüğü pik alanları gösterilmiştir.

82 69 Çizelge 3.1. Metanol, etanol ve IS (n-bütanolün) alıkonma zamanları, miktarları ve cihazdan alınan yanıtlar Alıkonma Miktar Alan Miktar/Alan Zamanı (dak) Madde (mg/100 ml) Metanol Etanol

83 70 Alıkonma Miktar Alan Miktar/Alan Zamanı (dak) Madde (mg/100 ml) n-bütanol Kalibrasyon eğrisini belirlemek amacıyla hazırlanmış stok çözeltilere ait kromatogramlar aşağıdaki şekilde gösterilmiştir (Şekil 3.1.).

84 71 Şekil 3.1. Metanol ve etanolün 50, 100, 200, 300, 400 mg/100 ml konsantrasyonlarında kalibrasyon grafiğinde kullanılma amacıyla hazırlanan stok çözeltilere ait kromatogramları (IS olarak 80 mg/100 ml n-butanol kullanılmıştır.)

85 72 Kalibrasyon grafikleri relative response factor (RRF) kullanılarak da manuel olarak hesaplandı. Response S [IS] RRF= x Response IS [S] Response S= Standardın pik alanı Response IS= İç standardın pik alanı [IS] [S] = İç standardın konsantrasyonu = Standardın konsantrasyonu Her konsantrasyon için üç farklı RRF değeri hesaplandı ve ortalamaları (RRFav 50 ) alındı: Tüm konsantrasyonlarda RRFav hesaplandıktan sonra bu değerlerin ortalaması alınırsa kalibrasyon grafiğinin eğimi bulunur. Buna göre metanol için alınan sonuçlar; Metanol 50 mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 50 = RRF 3 = mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 100 = RRF 3 = mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 200 = RRF 3 = mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 300 = RRF 3 =0.1730

86 mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 400 = RRF 3 = RRFav total = Metanol Kalibrasyon Grafiği 1 St Resp/Ist Resp 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,1716x + 0,0008 R 2 = 0, [St]/[Ist] Şekil 3.2. Metanol kalibrasyon grafiği ve regresyon denklemi Area Ratio methanol, FID1 A Area Ratio = *AmtRatio Rel. Res%(1): Correlation: Amount Ratio Şekil 3.3. Cihazdan alınan metanol kalibrasyon grafiği

87 74 Etanol 50 mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 50 = RRF 3 = mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 100 = RRF 3 = mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 200 = RRF 3 = mg/dl; RRF 1 = RRF 2 = RRFav 300 = RRF 3 = mg/dl; RRF 1 =0.338 RRF 2 = RRFav 400 = RRF 3 = RRFav total = Etanol Kalibrasyon Grafiği 2 St Resp/ Ist Resp 1,5 1 0,5 0 y = 0,3427x - 0,0035 R 2 = 0, [St]/[Ist] Şekil 3.4. Etanol kalibrasyon grafiği ve regresyon denklemi

88 75 Area Ratio ethanol, FID1 A Area Ratio = *AmtRatio Rel. Res%(3): e Correlation: Amount Ratio Şekil 3.5. Cihazdan alınan etanol kalibrasyon grafiği Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Tekrarlanabilirlik Çalışmalarının Sonuçları Metanol ve etanolün bir düşük bir orta ve bir yüksek konsantrasyonda (50, 200 ve 400 mg/100 ml) çözeltileri 5 er defa enjekte edildi. Daha önce hazırlanan kalibrasyon grafiklerine göre analiz sonuçları değerlendirildi. Tekrarlanabilirlik, % değişim katsayısı (%CV) ve rölatif standart sapma (RSD) hesaplanarak değerlendirildi. Sonuçlar Çizelge 3.2. de topluca gösterilmiştir.

89 76 Metanol Etanol 50 mg/100 ml x = x = SD = 1.63 SD = 1.33 CV = CV = RSD = 3.1 RSD = mg/100 ml x = x = SD = 3.77 SD = 4.77 CV = CV = RSD = 1.8 RSD = mg/100 ml x = x = SD = 6.89 SD = 5.36 CV = CV = RSD = 1.7 RSD = 1.3

90 77 Çizelge 3.2. Metanol ve etanol için tekrarlanabilirlik çalışması sonuçları Gerçek Madde Değer (mg/100 ml) Metanol Bulunan Değer (mg/100 ml) SD CV RSD Etanol Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmalarının Sonuçları Sudan Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmasının Sonuçları Su içerisine 200 mg/100 ml konsantrasyonunda metanol ve etanol katılarak elde edilmiştir. Sonuçlar Çizelge 3.3. de gösterilmiştir. Çizelge 3.3. Sudan verim (geri kazanılabilirlik) çalışmalarının sonuçları Madde Verim ortalaması (%) * Aralık Metanol % % Etanol % % * 10 ayrı analiz yapılarak elde edilmiş sonuçlardır Kandan Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmasının Sonuçları 1ml boş kan içerisine konsantrasyonu 200 mg/100 ml olacak şekilde metanol ve etanol katılarak kandan verim hesabı da yapılmıştır. Her numuneye iç standard olarak 100 µl n-bütanol (80 mg/100 ml) eklendi. Sonuçlar Çizelge 3.4. de gösterilmiştir.

91 78 Çizelge 3.4. Kandan verim (geri kazanılabilirlik) çalışmalarının sonuçları Madde Verim ortalaması (%) * Aralık Metanol % % Etanol % % * 10 ayrı analiz yapılarak elde edilmiş sonuçlardır İdrardan Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmasının Sonuçları 1ml boş idrar içerisine konsantrasyonu 200 mg/100 ml olacak şekilde metanol ve etanol katılarak idrardan verim hesabı da yapılmıştır. Her numuneye iç standard olarak 100 µl n-bütanol (80 mg/100 ml) eklendi. Sonuçlar Çizelge 3.5. de gösterilmiştir. Çizelge 3.5. İdrardan verim (geri kazanılabilirlik) çalışmalarının sonuçları Madde Verim ortalaması (%) * Aralık Metanol 96.5 % %112.2 Etanol 97 % %105.5 * 10 ayrı analiz yapılarak elde edilmiş sonuçlardır Tükrükten Verim (Geri Kazanılabilirlik) Hesabı Çalışmasının Sonuçları 1ml boş tükrük içerisine konsantrasyonu 200 mg/100 ml olacak şekilde metanol ve etanol katılarak tükrükten verim hesabı da yapılmıştır. Her numuneye iç standard olarak 100 µl n-bütanol (80 mg/100 ml) eklendi. Sonuçlar Çizelge 3.6 de gösterilmiştir.

92 79 Çizelge 3.6. Tükrükten verim (geri kazanılabilirlik) çalışmalarının sonuçları Madde Verim ortalaması (%) * Aralık Metanol % %127 Etanol %89.5- %123.5 * 10 ayrı analiz yapılarak elde edilmiş sonuçlardır Biyolojik Materyalde Alkol Tespiti İçin Kurulan Yöntemin Hassasiyet Çalışması Sonuçları Cihaza kalibrasyonda kullanılan en düşük konsantrasyon olan 50 mg/100 ml den seyreltilmiş numuneler verildi. Bu seyreltmeler sonucunda metanol ve etanol piklerinin kromatogram üzerinde görülebildiği en son konsantrasyon LOD olarak hesaplandı. Bu konsantrasyonlar aşağıdaki gibi hazırlanmıştır * : 50 mg/100 ml 25 mg/100 ml 1:1 (50 mg/100ml den 1 ml al+ 1 ml su ile seyrelt) 1:1 (25 mg/100ml den 1 ml al+ 1 ml su ile seyrelt) 12.5 mg/100 ml 1:1 (12.5 mg/100ml den 1 ml al+ 1 ml su ile seyrelt) 6.25mg/100 ml 1:1 (6.25 mg/100ml den 1 ml al+ 1 ml su ile seyrelt) 3.125mg/100 ml 1:1 (3.125 mg/100ml den 1 ml al+ 1 ml su ile seyrelt) 1.56mg/100 ml

93 mg/100 ml 1:1 (1.56 mg/100ml den 1 ml al+ 1 ml su ile seyrelt) 1:1 (0.781 mg/100ml den 1 ml al+ 1 ml su ile seyrelt) 0.39 mg/100 ml mg/100 ml 1:1 (0.39 mg/100ml den 1 ml al+ 1 ml su ile seyrelt) * Tüm enjeksiyonlar 1ml çözelti+100 µl iç standard (n-bütanol) olarak yapılmıştır. Bulunan sonuçlar topluca Çizelge 3.7. de gösterilmiştir. Çizelge 3.7. Metanol ve etanol için bulunan observed (gözlenen) LOD ve LOQ değerleri Metanol Etanol LOQ* mg/100 ml mg/100 ml LOD 1.56 mg/100 ml mg/100 ml *LOQ= 3.3 LOD olarak hesaplanmıştır (Thomsen ve ark., 2003) %40 lık Bir Alkollü İçeceğin %40 lık Olup Olmadığının Tespiti 100 ml 40 ml etanol m = d X V 1 ml X m = X m = gr etanol Stok I : 1 ml al 100 ml ye dilue et mg/100 ml etanol

94 ml 40 ml etanol m = d X V 0.5 ml X m = X m = gr etanol x = 0.20 ml etanol Stok II : 0.5 ml 100 ml ye dilue et mg/100 ml etanol Stok I ve Stok II den 1 ml µl n-butanol viallere alınır mg gerçek değer % mg cihazın okuduğu değer X x = %39.55 liktir mg gerçek değer % mg cihazın okuduğu değer X x = %41.94 liktir x = = % lüktür 2

95 82 Ret. Time Area Amt/area Amount Name (mg/100ml) Etanol n-bütanol Şekil 3.6. Alkol kullanmış bir bireyin kan alkol düzeyinin valide edilmiş gaz kromatografik yöntemle tespiti 3.2. Toplumumuzda Alkol Dehidrogenaz (ADH2) ve Aldehit Dehidrogenaz (ALDH2) Polimorfizminin Belirlenmesi İçin Yapılan PCR-CTPP Çalışmalarının Sonuçları Alkol Dehidrogenaz (ADH2) Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan PCR-CTPP Çalışmalarının Sonuçları ADH2 geni 4. kromozomda bulunur ve enzimde meydana gelen mutasyon 3. ekzonun 47. kodonunda amino asit pozisyonunda ortaya çıkan tek nokta mutasyonu ile ilişkilidir. Bu pozisyonda normal (ADH2*1/1) genotipli bireylerde görülen arjinin (CGC), tek baz değişimi ile histidine (CAC) dönüşür. Amplikon 47Arg (ADH2*1/1) için 219 bp, 47His (ADH2*2/2) için 280 bp uzunluğundadır. ADH2 için common band (kontrol) uzunluğu 459 bp dir.

96 83 Çizelge 3.8. ADH2 gen polimorfizminde üç farklı genotipe bağlı olarak etkileşen primer çiftleri ile oluşturdukları PCR ürün uzunlukları Genotip Etkileşen Primer Çiftleri PCR Ürününün Uzunluğu ADH2*1/1 (Homozigot) F2-R2 F1-R2 219 bp 459 bp ADH2*2/2 (Homozigot mutant) F1-R1 F1-R2 280 bp 459 bp ADH2*1/2 (Heterozigot) F1-R1 F2-R2 F1-R2 280 bp 219 bp 459 bp Agaroz jelimizde tipik (ADH2*1/1) genotipli bireylerde kontrol bandı (common band, F1-R2) yanısıra, 219 bp (F2-R2) uzunluğunda amplifikasyon ürünü gözlenir. ADH2 gen bölgesi alelinde polimorfik özelliğe sahip bölgede timin bazı bulunduğunda bireyler tipik alele sahip olur ve F2-R2 primerleri DNA üzerine bağlanarak 219 bp uzunluğunda amplikon oluşturur. Homozigot atipik (ADH2*2/2, mutant) bireylerde ise yine 459 bp uzunluğunda kontrol bandının (F1-R2) yanısıra, 280 bp (F1-R1) uzunluğunda amplifikasyon ürünü bulunur. ADH2 gen bölgesi alelinde polimorfik özelliğe sahip bölgede guanin bazı bulunduğunda ise bireyler atipik alele sahip olur ve F1-R1 primerleri DNA üzerine bağlanarak 280 bp uzunluğunda amplikon oluşturur. (ADH2*1/2) genotipli heterozigot bireylerde kontrol bandı (common band, F1-R2) yanısıra, atipik ve tipik aleller birarada bulunacağı için 280 bp (F1-R1), 219 bp (F2-R2) uzunluğunda amplifikasyon ürünleri gözlenir.

97 84 Şekil 3.7. İki primer çifti kullanılarak (PCR-CTPP) gerçekleştirilen ADH2 gen bölgesi polimorfizmine ait amplifikasyon ürün uzunluklarının ve baz değişimlerinin şematik gösterimi. Aşağıdaki şekilde ADH2*1/1 (homozigot, tipik alel) genotipli bireylere ait elde edilen jel görüntüsü görülmektedir. 219 bp 459 bp M Şekil 3.8. Homozigot ADH2*1/1 genotipli bireylerin jel görüntüleri (M = 100 bp ladder, 1, 2, 3, 4, 5, 6 = Arg/Arg homozigot genotipli bireylere ait jel görüntüleri; 459 bp = Common band, kontrol; 219 bp = Arg aleli)

98 85 Aşağıdaki şekilde ise ADH2*1/2 (heterozigot) genotipli bireylere ait elde edilen jel görüntüsü görülmektedir. 219 bp 280 bp 459 bp M Şekil 3.9. Heterozigot ADH2*1/2 genotipli bireylerin jel görüntüleri (M = 100 bp ladder; 1, 2 = Arg/His heterozigot genotipli bireylere ait jel görüntüleri; 459 bp = Common band, kontrol; 219 bp = Arg aleli; 280 bp = His aleli) Tüm bireylere ait elde edilen jel görüntüleri değerlendirildikten sonra gözlenen/gözlenebilecek üç farklı genotip frekansı aşağıdaki çizelgede gösterilmiştir (Çizelge 3.9.). Çizelge 3.9. ADH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan yöntemle çalışılan populasyonda gözlenen üç farklı genotipin frekansı Gen Populasyon Genotip Frekans n 1*1 (%) 1*2 (%) 2*2 (%) ADH (%90.90) (%9.09) (%0)

99 86 Populasyonda gözlenen/gözlenebilecek üç farklı genotip frekansı incelendikten sonra toplumumuzdaki alel frekansı da hesaplanmıştır (Çizelge 3.10.). Çizelge ADH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan yöntemle çalışılan populasyonda gözlenen alel frekansı Gen Populasyon Alel Frekansı n 1 (%) 2 (%) ADH (%95.5) (%4.54) Toplumumuzda gözlenen gen frekansı ise aşağıdaki çizelgede özetlenmiştir (Çizelge 3.11.) Çizelge ADH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla kurulan yöntemle çalışılan populasyonda gözlenen gen frekansı Gen Populasyon Gen Frekansı ADH2 n ADH2*1 ADH2* Yapılan istatistiksel analizler sonucunda çalıştığımız populasyonun Hardy- Weinberg dengesinde olduğu bulunmuştur (χ 2 = , p 0.995) (Çizelge 3.12). Çizelge Çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olup olmadığının tespiti.

100 87 ADH2*1/1 ADH2*1/2 ADH2*2/2 Total Observed (Gözlenen) Expected (Beklenen) O-E (O-E) 2 4.9X X (O-E)/E 7.0X X Aldehit Dehidrogenaz (ALDH2) Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan PCR-CTPP Çalışmalarının Sonuçları Aldehit dehidrogenaz (ALDH2) enzim polimorfizmini belirlemek amacıyla iki farklı çalışma grubunun söz konusu genetik polimorfizmi belirlemek amacıyla kullandıkları yöntemler karşılaştırmalı olarak çalışıldı (Matsuo ve ark., 2001; Tamakoshi ve ark., 2003). ALDH2 enziminde meydana gelen mutasyonun görüldüğü bölge 12q24.2 dir kodonun aminoasit pozisyonunda normal (ALDH2*1/1) genotipli bireylerde görülen glutamat (GAA) tek baz değişimi ile lizine (AAA) dönüşür. Amplikon 487Glu (ALDH2*1) için 296 bp, 487Lys (ALDH2*2) için 203 bp uzunluğundadır. ALDH2 için common band (kontrol) uzunluğu 455 bp dir.

101 88 Çizelge ALDH2 gen polimorfizminde üç farklı genotipe bağlı olarak etkileşen primer çiftleri ile oluşturdukları PCR ürün uzunlukları Genotip ALDH2*1/1 (Homozigot) ALDH2*2/2 (Homozigot mutant) ALDH2*1/2 (Heterozigot) Etkileşen Primer Çiftleri F1-R1 F1-R2 F2-R2 F1-R2 F1-R1 F2-R2 F1-R2 PCR Ürününün Uzunluğu 296 bp 455 bp 203 bp 455 bp 296 bp 203 bp 455 bp Agaroz jelimizde tipik (ALDH2*1/1) genotipli bireylerde kontrol bandı (common band, F1-R2) yanısıra, 296 bp (F1-R1) uzunluğunda amplifikasyon ürünü gözlenir. ALDH2 gen bölgesi alelinde polimorfik özelliğe sahip bölgede guanin bazı bulunduğunda bireyler tipik alele sahip olur ve F1-R1 primerleri DNA üzerine bağlanarak 296 bp uzunluğunda amplikon oluşturur. Homozigot atipik (ALDH2*2/2, mutant) bireylerde ise yine 455 bp uzunluğunda kontrol bandının (F1-R2) yanısıra, 203 bp (F2-R2) uzunluğunda amplifikasyon ürünü bulunur. ALDH2 gen bölgesi alelinde polimorfik özelliğe sahip bölgede timin bazı bulunduğunda ise bireyler atipik alele sahip olur ve F2-R2 primerleri DNA üzerine bağlanarak 203 bp uzunluğunda amplikon oluşturur. (ALDH2*1/2) genotipli heterozigot bireylerde kontrol bandı (common band, F1-R2) yanısıra, tipik ve atipik aleller birarada bulunacağı için 296 bp (F1-R1), 203 bp (F2-R2) uzunluğunda amplifikasyon ürünleri gözlenir.

102 89 Şekil İki primer çifti kullanılarak (PCR-CTPP) gerçekleştirilen ALDH2 gen bölgesi polimorfizmine ait amplifikasyon ürün uzunluklarının ve baz değişimlerinin şematik gösterimi. 296 bp 455 bp M 1 2 Şekil Homozigot ALDH2*1/1 genotipli bireylerin jel görüntüleri (M = 100 bp ladder, 1, 2 = Glu/Glu homozigot genotipli bireylere ait jel görüntüleri; 455 bp = Common band, kontrol; 296 bp = Glu aleli)

103 90 Doğrulamak amacıyla kurulan diğer yöntemde, 487Glu (ALDH2*1/1) için 119 bp, 487Lys (ALDH2*2/2) için 98 bp uzunluğundadır. ALDH2 için common band (kontrol) uzunluğu 176 bp dir (Tamakoshi ve ark., 2003). Çizelge ALDH2 gen polimorfizminde üç farklı genotipe bağlı olarak etkileşen primer çiftleri ile oluşturdukları PCR ürün uzunlukları Genotip Etkileşen Primer Çiftleri PCR Ürününün Uzunluğu ALDH2*1/1 (Homozigot) F1-R1 F1-R2 119bp 176 bp ALDH2*2/2 (Homozigot mutant) F2-R2 F1-R2 98 bp 176 bp ALDH2*1/2 (Heterozigot) F1-R1 F2-R2 F1-R2 119 bp 98 bp 176 bp Agaroz jelimizde tipik (ALDH2*1/1) genotipli bireylerde kontrol bandı (common band, F1-R2) yanısıra, 119 bp (F1-R1) uzunluğunda amplifikasyon ürünü gözlenir. ALDH2 gen bölgesi alelinde polimorfik özelliğe sahip bölgede guanin bazı bulunduğunda bireyler tipik alele sahip olur ve F1-R1 primerleri DNA üzerine bağlanarak 119 bp uzunluğunda amplikon oluşturur. Homozigot atipik (ALDH2*2/2, mutant) bireylerde ise yine 176 bp uzunluğunda kontrol bandının (F1-R2) yanısıra, 98 bp (F2-R2) uzunluğunda amplifikasyon ürünü bulunur. ALDH2 gen bölgesi alelinde polimorfik özelliğe sahip bölgede timin bazı bulunduğunda ise bireyler atipik alele sahip olur ve F2-R2 primerleri DNA üzerine bağlanarak 98 bp uzunluğunda amplikon oluşturur. (ALDH2*1/2) genotipli heterozigot bireylerde kontrol bandı (common band, F1-R2) yanısıra, tipik ve atipik aleller birarada bulunacağı için 119 bp (F1-R1), 98 bp (F2-R2) uzunluğunda amplifikasyon ürünleri gözlenir.

104 91 Şekil İki primer çifti kullanılarak (PCR-CTPP) gerçekleştirilen ALDH2 gen bölgesi polimorfizmine ait amplifikasyon ürün uzunluklarının ve baz değişimlerinin şematik gösterimi. Aşağıdaki şekilde ALDH2*1/1 genotipli bireylere ait elde edilen jel görüntüsü görülmektedir. 119 bp 176 bp 1 2 M Şekil Homozigot ALDH2*1/1 genotipli bireylerin jel görüntüleri (M = 100 bp ladder; 1, 2 = Glu/Glu homozigot genotipli bireylere ait jel görüntüleri; 176 bp = Common band, kontrol; 119 bp = Glu aleli)