FARKLI KÖK KANAL YIKAMA SOLÜSYONLARI VE KANAL DOLGU PATLARININ BİYOUYUMLULUKLARININ HÜCRE KÜLTÜRÜNDE ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARKLI KÖK KANAL YIKAMA SOLÜSYONLARI VE KANAL DOLGU PATLARININ BİYOUYUMLULUKLARININ HÜCRE KÜLTÜRÜNDE ARAŞTIRILMASI Pedodonti (Dişhekimliği) Programı Doktora Tezi Diş Hekimi Candan GÜRBÜZ SARIGÖL DANIŞMAN Prof. Dr. Özant ÖNÇAĞ İZMİR 2007 i

2 DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ (Adı Soyadı) (İmza) Başkan (Danışman) : Prof. Dr. Özant ÖNÇAĞ... Üye : Prof. Dr. İsmet GÜRHAN... Üye : Prof. Dr. Sema BELLİ... Üye : Prof. Dr. Ali Rıza ALPÖZ... Üye : Prof. Dr. Ece EDEN... Doktora Tezinin kabul edildiği tarih:... ii

3 ÖNSÖZ Dişhekimliğinde çürük veya travma nedeniyle pulpası geri dönüşümsüz biçimde zarar görmüş dişlerin apeksifikasyon ve kök kanal tedavileri sırasında kullanılan kanal yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının biyouyumlulukları uzun yıllardır üzerinde çalışılan bir konudur. Özellikle son yıllarda moleküler biyoloji ve biyomühendislik alanlarındaki gelişmeler bu alana da yansımıştır. Farklı test yöntemleri ve hücre hatları kullanılarak bu materyallerin periapikal bölgede bulunan canlı hücreler üzerindeki olası sitotoksik ve genotoksik etkileri araştırılmıştır. Endodontik tedavilerde kullanılan farklı kanal yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının biyouyumluluklarının değerlendirilmesine yönelik yapılan bu in vitro çalışmanın in vivo çalışmalara ve uygulamalara ışık tutacağı düşünülmektedir. Bu çalışmanın planlanmasında ve yürütülmesinde desteklerini esirgemeyen doktora yöneticim Sayın Prof. Dr. Özant Önçağ a şükranlarımı sunarım. Değerli fikirlerinden yararlandığım, bu çalışmanın planlanmasında ve hücre kültürü işlemlerinin yürütülmesinde yol gösteren ve yardımcı olan Ege Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. İsmet Gürhan a ve araştırma görevlileri Sayın Ayşe Nalbantsoy, Sultan Gülçe ve Feyzan Özdal Kurt a en içten dileklerimle teşekkür ederim. Bu çalışmanın genotoksisite test aşamaları sırasında değerli fikirlerinden yaralandığım Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Genetik ve Teratoloji Bilim Dalı öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Ferdağ Özkınay a ve genotoksisite test işlemlerinin yürütülmesinde yardımcı olan Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Cumhur Gündüz ve araştırma görevlisi Çığır Biray Avcı ya çok teşekkür ederim. Çalışmanın istatistiksel değerlendirmelerini yapan Mühendislik Fakültesi Bilgisayar Mühendisliği, Biyoistatistik iii

4 Bölümü öğretim üyesi Sayın Doç Dr. Timur Köse ye ve bu çalışmanın yürütülmesinde yardımlarını esirgemeyen tüm pedodonti bölümü öğretim üyelerine, asistanlarına ve çalışanlarına en içten dileklerimle teşekkür ederim. Bu çalışmanın gerçekleştirilebilmesi için gerekli mali desteği sağlayan TÜBİTAK Sağlık Bilimleri Araştırma Grubu ve Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Şube Müdürlüğü ne teşekkür ederim. Her zaman yanımda olan aileme ve eşime şükranlarımı sunarım. İzmir, 2007 Dt. Candan Gürbüz Sarıgöl iv

5 İÇİNDEKİLER Önsöz..iii Tablo listesi IX Şekil listesi XII Kısaltmalar.XVII BÖLÜM 1 1 GİRİŞ ve AMAÇ.1 1.GENEL BİLGİLER Kök kanal tedavisi Apeksifikasyon tedavisi Apeksifikasyon ve kök kanal tedavisinde kullanılan yıkama solüsyonları Steril Serum Fizyolojik (SF) Sodyum Hipoklorit (NaOCl) Şelasyon Ajanları Klorheksidin Klorheksidin Glukonat artı Setrimid (CHX+setrimid) Apeksifikasyon tedavisinde kullanılan kanal dolgu patları Kalsiyum hidroksit (Ca(OH) 2 ) içerikli kanal dolgu patları Mineral Trioksit Agregat (MTA) Kök kanal tedavisinde kullanılan kanal dolgu patları Endometazon Diaket AH AHPlus Biyouyumluluk 35 v

6 1.6.1 Stres ve zararlı uyaranlara karşı oluşan hücresel cevaplar Biyouyumluluk testleri Apoptozis Apoptozisin saptanmasında kullanılan yöntemler.64 BÖLÜM II GEREÇ ve YÖNTEM Hücre kültürlerinin hazırlanması Kök kanal yıkama solüsyonlarının hazırlanması Kanal yıkama solüsyonlarının MTT ve NR testleri ile HPDLF ve 3T3 hücre kültürlerindeki sitotoksik etkilerinin belirlenmesi Kök kanal yıkama solüsyonlarının HPDLF hücre kültüründe akridin oranj/etidyum bromid yöntemi ile apoptotik etkilerinin belirlenmesi Kök kanal dolgu patlarının hazırlanması Kanal dolgu patlarının MTT ve NR testi ile HPDLF ve 3T3 hücre kültürlerinde sitotoksik etkilerinin belirlenmesi Kanal dolgu patlarının HPDLF hücre kültüründe akridin oranj/etidyum bromid yöntemi ile apoptotik etkilerinin belirlenmesi Testlerin istatistiksel analizi...96 BÖLÜM III BULGULAR Yıkama solüsyonlarının sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesi NaOCl in sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesi EDTA in sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesi CHX in sitotoksik etkisinin değerlendirilmesi 107 vi

7 3.1.4 CHX + setrimid in sitotoksik etkisinin değerlendirilmesi Eşit konsantrasyondaki farklı yıkama solüsyonlarının sitotoksik etkilerinin karşılaştırılması Apeksifikasyon ve kök kanal tedavisinde kullanılan kanal dolgu patlarının sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesi Kök kanal yıkama solüsyonlarının akridin oranj/etidyum bromid yöntemi ile apoptotik ve nekrotik etkilerinin değerlendirilmesi NaOCl in farklı konsantrasyonlarının apoptotik ve nekrotik etkilerinin değerlendirilmesi EDTA nın farklı konsantrasyonlarının apoptotik ve nekrotik etkilerinin değerlendirilmesi CHX ın farklı konsantrasyonlarının apoptotik ve nekrotik etkilerinin değerlendirilmesi CHX+setrimid in farklı konsantrasyonlarının apoptotik ve nekrotik etkilerinin değerlendirilmesi Eşit ve farklı konsantrasyondaki yıkama solüsyonlarının apoptotik ve nekrotik etkilerinin değerlendirilmesi Kök kanal dolgu patlarının akridin oranj/etidyum bromid yöntemi ile değerlendirilmesi BÖLÜM IV TARTIŞMA BÖLÜM V Sonuç ve Öneriler BÖLÜM VI..199 Özet vii

8 Abstract 201 BÖLÜM VII KAYNAKLAR EK-1 EK-2 Özgeçmiş viii

9 Tablo Listesi Tablo 1 : Kök kanal tedavisinde gütta-perka ile birlikte kullanılan kanal dolgu patları...5 Tablo 2: Endometazon kanal dolgu patının içeriği 30 Tablo 3: AH26 kanal dolgu patının içeriği...33 Tablo 4: AHPlus kanal patının içeriği...34 Tablo 5: Apoptozis ve nekrozisin karşılaştırılması...60 Tablo 6: Apoptozisi belirlemede kullanılan boyalar..66 Tablo 7: Sitotoksik ve apoptotik etkileri araştırılan kök kanal yıkama solüsyonları 71 Tablo 8: Sitotoksik ve apoptotik etkileri araştırılan kanal dolgu patları ve üretici firmaları...72 Tablo 9: Yıkama solüsyonlarının 96-gözlü plakalardaki yerleşimi..80 Tablo 10:Yıkama solüsyonlarının 24-gözlü plakalardaki yerleşimi..85 Tablo 11: Kanal dolgu patlarının 24-gözlü plakalardaki yerleşimi..90 Tablo 12: Kanal dolgu patlarının solüsyonlarının 96-gözlü plakalardaki yerleşim şeması...92 Tablo 13: Kanal dolgu patlarının 24-gözlü plakalardaki yerleşimi...94 Tablo 14: Kanal yıkama solüsyonlarının test yöntemleri ve hücre hatlarına ait canlı hücre oranları 97 Tablo 15: NaOCl solüsyonunun testler sonunda farklı konsantrasyonlarına ait canlı hücre oranları.98 ix

10 Tablo 16: EDTA solüsyonunun testler sonunda farklı konsantrasyonlarına ait canlı hücre oranları..103 Tablo 17: CHX solüsyonunun testler sonunda farklı konsantrasyonlarına ait canlı hücre oranları..108 Tablo 18: CHX+setrimid solüsyonunun testler sonunda farklı konsantrasyonlarına ait canlı hücre oranları..114 Tablo 19: Aynı konsantrasyondaki yıkama solüsyonlarının test yöntemleri ve hücre hatlarına ait canlılık oran değerleri.120 Tablo 20: %0.001 konsantrasyondaki test solüsyonlarının testler sonunda canlı hücre oranları Tablo 21: %0.01 konsantrasyondaki test solüsyonlarının testler sonunda canlı hücre oranları 123 Tablo 22: %0.1 konsantrasyondaki test solüsyonlarının testler sonunda canlı hücre oranları 126 Tablo 23: %1 konsantrasyondaki test solüsyonlarının testler sonunda canlı hücre oranları.128 Tablo 24: Kanal dolgu patlarının test yöntemleri ve hücre hatlarına ait canlı hücre oranları Tablo 25: Kök kanal dolgu patlarının testler sonunda canlı hücre oranları Tablo 26: Kök kanal yıkama solüsyonlarının MTT/HPDLF ve MTT/3T3 testlerinde konsantrasyonları arasındaki sitotoksik etki ilişkileri.151 Tablo 27: Kök kanal yıkama solüsyonlarının NR/HPDLF ve NR/3T3 testlerinde konsantrasyonları arasındaki sitotoksik etki ilişkileri 152 x

11 Tablo 28: Eşit konsantrasyondaki kök kanal yıkama solüsyonları MTT/HPDLF ve MTT/3T3 testlerinde sitotoksik etki ilişkileri Tablo 29: Eşit konsantrasyondaki kök kanal yıkama solüsyonları NR/HPDLF ve NR/3T3 testlerinde sitotoksik etki ilişkileri.153 Tablo 30: Kök kanal dolgu patlarının farklı süreler sonunda MTT/HPDLF testinde sitotoksik etki ilişkileri 153 Tablo 31: Kök kanal dolgu patlarının farklı süreler sonunda MTT/3T3 testinde sitotoksik etki ilişkileri Tablo 32: Kök kanal dolgu patlarının farklı süreler sonunda NR/HPDLF testinde sitotoksik etki ilişkileri 154 Tablo 33: Kök kanal dolgu patlarının farklı süreler sonunda NR/3T3 testinde sitotoksik etki ilişkileri 154 Tablo 34: Kök kanal dolgu patlarının sitotoksik etkilerinin MTT/HPDLF ve MTT/3T3 testlerinde süreler arasındaki ilişkisi 154 Tablo 35: Kök kanal dolgu patlarının sitotoksik etkilerinin NR/HPDLF ve NR/3T3 testlerinde süreler arasındaki ilişkisi Tablo 36: Kök kanal yıkama solüsyonlarının konsatrasyonları arasındaki apoptotik/nekrotik hücre oran ilişkileri.155 Tablo 37: Eşit konsantrasyondaki kök kanal yıkama solüsyonlarının apoptotik/nekrotik hücre oran ilişkileri.155 Tablo 38: Kök kanal dolgu patlarının apoptotik/nekrotik hücre oran ilişkileri xi

12 Şekil Listesi Şekil 1: Kök gelişimini tamamlamamış genç daimi diş..6 Şekil 2: Kök gelişimini tamamlamamış dişlerde gözlenen apeks formları..6 Şekil 3: Kök gelişimini tamamlamamış dişlerde uygulanan Ca(OH) 2 kanal patının görüntüsü...10 Şekil 4: Kök gelişimini tamamlamamış bir dişin MTA patı ile apeksifikasyon tedavisi...11 Şekil 5: a) EDTA nın kimyasal formülü b) EDTA nın Ca ++ ile şelasyonu 17 Şekil 6: Klorheksidin glukonatın kimyasal formülü.19 Şekil 7: Setrimidin kimyasal formülü 22 Şekil 8: Stres ve zararlı uyaranlara karşı hücresel cevap aşamaları..37 Şekil 9: Hücre hasarı ve ölümünün gelişim aşamaları..38 Şekil 10: 3T3 hücrelerinin ışık mikroskobunda görünümü...44 Şekil 11: HPDLF ların ışık mikroskobunda görüntüsü.46 Şekil 12: Hücrelerin MTT ile muamalesinden sonra oluşan formazan kristalleri Şekil 13: Sitotoksik materyal ile muamele edilmiş 3T3 hücrelerinin NR boyaması...54 Şekil 14: Apoptozis ve nekrozisin şematik görüntüsü...58 Şekil 15: Apoptoziste rol oynayan modülatörler ve efektörler.61 Şekil 16: A) Erken apoptotik dönemde olan hücre. B) Geç apoptotik dönemde olan hücre...67 Şekil 17: Laminar akışlı kabin...74 Şekil 18: İnkübatör.74 xii

13 Şekil 19: HPDLF hücrelerinin 18 günlük kültürünün ışık mikroskop görüntüsü.75 Şekil 20: HPDLF hücrelerinin 22 günlük kültürünün ışık mikroskop görüntüsü.76 Şekil 21: 3T3 fare fibroblast hücrelerinin 25 günlük kültürünün ışık mikroskop görüntüsü...77 Şekil 22: (a) Bürker lamının şematik görüntüsü (b) Işık mikroskobu..79 Şekil 23: Işık mikroskobunda formazan kristallerinin görüntüsü.81 Şekil 24: (a) Hücrelerin DMSO ile muamelesinden sonra oluşan renk değişikliği (b) Mikroplaka okuyuculu spektrofotometre...82 Şekil 25: Sitotoksik materyal ile muamele edilmiş 3T3 hücrelerinin NR boyaması..83 Şekil 26: Hücrelerin NR çözücü solüsyonuyla muamelesinden sonra oluşan renk değişikliği 84 Şekil 27: (a) Neubauer lamın hücre sayımı yapıldığı alanın şematik görüntüsü (b) Neubauer lamı...87 Şekil 28: Akridin oranj/etidyum bromid ile boyanan hücrelerin 40 büyütmede flouresan mikroskoptaki görüntüsü 87 Şekil 29: Kanal dolgu patlarının yerleştirildiği içi boş PTFE polimer çubuklardan elde edilen silindirler...88 Şekil 30: Kanal dolgu patlarının yerleştirildikleri membranlı özel hücre kültürü sistemleri 89 Şekil 31: Kanal dolgu patlarının 24-gözlü plakalardaki görüntüsü...90 Şekil 32: Hücrelerin MTT test solüsyonu ile muamelesinde, 3 saat sonunda gözlenen renk değişikliği Şekil 33: HPDLF hücrelerinin MTT testinde NaOCl ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları...99 xiii

14 Şekil 34: 3T3 hücrelerinin MTT testinde NaOCl ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları 100 Şekil 35: 3T3 hücrelerinin NR testinde NaOCl ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları 101 Şekil 36: HPDLF hücrelerinin NR testinde NaOCl ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları Şekil 37: HPDLF hücrelerinin MTT testinde EDTA ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları Şekil 38: 3T3 hücrelerinin MTT testinde EDTA ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları 105 Şekil 39: 3T3 hücrelerinin NR testinde EDTA ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları 106 Şekil 40: HPDLF hücrelerinin NR testinde EDTA ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları Şekil 41: 3T3 hücrelerinin MTT testinde CHX ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları 109 Şekil 42: HPDLF hücrelerinin MTT testinde CHX ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları Şekil 43: 3T3 hücrelerinin NR testinde CHX ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları 111 Şekil 44: HPDLF hücrelerinin NR testinde CHX ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları Şekil 45: 3T3 hücrelerinin MTT testinde CHX+setrimid ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları xiv

15 Şekil 46: HPDLF hücrelerinin MTT testinde CHX+setrimid ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları.116 Şekil 47: 3T3 hücrelerinin NR testinde CHX+setrimid ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları Şekil 48: HPDLF hücrelerinin NR testinde CHX+setrimid ile muamele edilmesini takiben farklı sürelerdeki canlılık oranları Şekil 49: 3T3 hücrelerinin kanal dolgu patları ile muamele edilmesini takiben farklı sürelere ait MTT testi ile belirlenen canlılık oranları. 131 Şekil 50: HPDLF hücrelerinin kanal dolgu patları ile muamele edilmesini takiben farklı sürelere ait MTT testi ile belirlenen canlılık oranları.134 Şekil 51: 3T3 hücrelerinin kanal dolgu patları ile muamele edilmesini takiben farklı sürelere ait NR testi ile belirlenen canlılık oranları. 137 Şekil 52: HPDLF hücrelerinin kanal patları ile muamele edilmesini takiben farklı sürelere ait NR testi ile belirlenen canlılık oranları. 139 Şekil 53: NaOCl nin akridin oranj/etidyum bromid yönteminde elde edilen HPDLF hücre oranları 141 Şekil 54: EDTA in akridin oranj/etidyum bromid yönteminde elde edilen HPDLF hücre oranları Şekil 55: CHX ın akridin oranj/etidyum bromid yönteminde elde edilen HPDLF hücre oranları Şekil 56: CHX+setrimid in akridin oranj/etidyum bromid yönteminde elde edilen HPDLF hücre oranları 145 Şekil 57: Kanal yıkama solüsyonlarının akridin oranj/etidyum bromid yönteminde elde edilen HPDLF hücre oranları xv

16 Şekil 58: Kanal dolgu patlarının akridin oranj/etidyum bromid yönteminde elde edilen HPDLF hücre oranları 150 xvi

17 Kısaltmalar HPDLF: İnsan periodontal ligament hücreleri DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole NaOCl: Sodyum hipoklorit CHX: Klorheksidin glukonat CHX+setrimid: Klorheksidin glukonat artı setrimid EDTA: Etilen diamin tetraasetik asit Ca(OH) 2 : Kalsiyum hidroksit SF: Serum fizyolojik ZOE: Çinko oksit öjenol HeLa: İnsan servikal karsinoma hücreleri U2OS: İnsan osteoblastik hücre hattı DMEM: Dulbecco s Modified Eagle Medium MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide XTT:(2,3)-bis(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamin)-karbonil]-2H-tetrazolium hidroksit NR: Nötral red, 3-amino-7-dimethyl-2-methylphenazine-hydro-chloride, Nötral red AIF: Apoptozis indükleyici faktör Apaf-1: Apoptotic protease activating factor-1 ICAD: Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease CAD: caspaseactivated deoxyribonuclease A.D: Anabilim Dalı DMEM/F-12: Dulbecco s Modified Eagle s medium/ham s Nutrient Mixture F-12 FBS: Fötal dana serumu DMSO: Dimetilsülfoksid xvii

18 HÜKÜK: Ankara Şap Enstitüsü Hücre Kültürü Koleksiyonu PTFE: Politetrafloroetilen sds: steril distile su g: gliserin Endo: Endometazon SS: standart sapma ORT: Ortalama LDH: Lactate dehydrogenase SCEs: Sister-Chromatid Exchange CHO: Chinese hamster ovary xviii

19 BÖLÜM 1 GİRİŞ ve AMAÇ Çocuklarda, erken yaşlarda diş kayıplarına bağlı olarak ortaya çıkabilecek, fonksiyonel, psikolojik, fonetik ve sindirim sistemi ile ilgili sorunların önüne geçmek amacıyla, apeksifikasyon ve/veya kök kanal tedavilerinin yapılması ayrı bir öneme sahiptir. Bu tedavilerin amacı, çürük veya travma gibi etiyolojik nedenlerle canlılığını kaybetmiş veya pulpası geri dönüşümsüz biçimde zarar görmüş dişlerde, periapikal dokularda ideal çevre şartlarının yaratılması sonucu dişin uzun yıllar boyunca ağızda fonksiyon görmesini sağlamaktır (17, 37). Her iki tedavi yönteminde de kök kanallarının kemomekanik olarak şekillendirilmesi sırasında bakterilerin eliminasyonu, pulpa doku artıkları ve debrislerinin uzaklaştırılması kök kanal yıkama solüsyonları aracılığı ile olur. Periapikal dokuların bütünlüğünü koruyup ideal iyileşme şartlarını yaratmak için ise farklı kök kanal dolgu patları kullanılarak apikal bölgenin biyolojik olarak tıkanması sağlanır (5, 37, 206). Özellikle apeksifikasyon işleminde, apeks oluşumu tamamlanmadığı için apikal açıklık geniştir. Esasen bu işlem kron ve kök pulpası canlı olmamasına rağmen, apikal bölgedeki hücrelerin fonksiyon görebilecekleri ideal ortamı sağlamaya yönelik vital bir tedavidir (5). Apeksifikasyon ve kök kanal tedavilerinde yıkama solüsyonları ile apikal kapanmayı uyaracak kanal dolgu patlarının, biyouyumlu olmalarına, periapikal doku hücreleri üzerinde sitotoksik ve genotoksik etkilerinin bulunmamasına veya düşük düzeyde olmasına dikkat edilmelidir (80). Endodontik tedavilerde kullanılan solüsyon ve kanal dolgu patlarının biyouyumluluğunu değerlendiren birçok çalışma mevcuttur (8, 31, 74, 116, 127, 136, 152, 171). Yapılan çalışmalarda yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının biyouyumlulukları; xix

20 hücre kültürü, hayvan çalışmaları ve klinik araştırmalar kullanılarak değerlendirilmiştir (41, 43, 51, 69, 74, 86, 97, 209). Özellikle son yıllarda endodontik tedavilerde kullanılan dental materyellerin biyouyumluluğunu hücre kültürü düzeyinde araştıran çalışmaların sayısı artmıştır (8, 31, 74, 116, 127, 136, 152, 171). Kök kanal yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının sitotoksik etkilerini hücre kültürü düzeyinde araştıran çalışmalarda birçok farklı primer ve/veya devamlı hücre hatları ve test yöntemleri kullanılmıştır. Çalışmalarda kullanılan devamlı hücre hatlarına örnek olarak, L929 fare deri fibroblastı (7, 35, 53, 116, 139, 151, 190, 196), 3T3 fare fibroblastı (21, 67, 74, 121, 127, 171, 175, 176), V79 çin hamster hücreleri (96, 141, 179, 188), Vero hücreleri ve HeLa servikal kanser hücreleri (139) verilebilir. Primer/diploid insan hücreleri olarak da insan periodontal ligament fibroblastları (HPDLF) (7, 14, 31, 67, 96, 111, 121, 175, 176) dişeti fibroblastları (136), insan osteoblastik hücre hatları (86) kullanılmıştır. Araştırmalarda sıklıkla kullanılan test yöntemileri ise, canlı hücre sayımı (14, 116, 127, 141, 139, 171), agar diffüzyon testi (35), protein sentezinin belirlenmesi (31, 83, 85), propidium iodide fluorescence testleri (31, 67), total nükleik asit içerik testi (188), MTT ve Nötral red gibi kolorimetrik yöntemlerdir (21, 42, 74, 96, 98, 111, 123, 175, 176). Bu çalışmalarda ki bulgular, test edilen yıkama solüsyonlarına veya kanal dolgu patlarına, kullanılan hücre hatlarına, seçilen test düzeneklerine (ekstraksiyon, bariyer, direkt uygulama) ve test yöntemlerine bağlı olarak farklı sonuçlar içermektedir (96, 139, 160, 188). Genotoksisite genel olarak, bir bileşiğin hücre DNA sı ile reaksiyona girmesi olarak tanımlanır ve bu durum mutajenite veya karsinojenite ile sonuçlanabilir (68, 194). Endodontik tedavilerde kullanılan materyallerin biyouyumluluklarını hücre kültürü düzeyinde araştıran çalışmalarda, sitotoksik etkinin yanı sıra materyallerin hücre DNA sında meydana getirdikleri hasarlar (genotoksisite) da farklı test yöntemleri kullanılarak incelenmiş ve kullanılan test yöntemlerine bağlı olarak farklı sonuçlar elde edilmiştir (74, 98, 100, 121, 122, 165, 194). xx

21 Apeksifikasyon ve kök kanal tedavilerinde kullanılan kanal yıkama solüsyonları veya kanal dolgu patlarının genotoksik etkilerini DNA hasarı sonucu oluşan apoptotik etkileri ile de belirlemek mümkündür. Biyomateryaller tarafından oluşabilecek apoptotik etkileri saptayabilmek için kullanılabilecek yöntemlere örnek olarak, morfolojik görüntüleme yöntemleri (etidyum bromür/akridin oranj, Hoechst ve boyaları, DAPI (4',6- diamidino-2-phenylindole), propidium iyodür) histokimyasal yöntemler (Anneksin V, TUNEL (Terminal deoxyribonucleotide transferase-mediated dytp-x-nick-end-labelling), M30, Kaspaz-3), biyokimyasal yöntemler (agaroz jel elektroforezi, western blotting, flow cytometry) verilebilir (54, 74, 107, 117, 122, 169, 193, 200). Bu çalışmanın amacı, apeksifikasyon ve kök kanal tedavilerinde kullanılan çeşitli yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının farklı temas süreleri sonunda MTT ve nötral red test yöntemleri ile devamlı hücre hattı olan 3T3 ve primer/diploid hücre hattı olan insan periodontal ligament fibroblast (HPDLF) hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerini değerlendirmek ve bu materyaller ile karşılaşan HPDLF hücreleri üzerinde oluşacak olası genotoksik etkileri akridin oranj/etidyum bromid DNA boyası kullanarak belirlemekti. xxi

22 1. GENEL BİLGİLER 1.1 Kök kanal tedavisi Kök kanal tedavisi, kron ve kök pulpasının çıkarılmasını takiben, kök kanallarının kemomekanik olarak genişletilip, mikroorganizmalardan arındırılması ve kök ucuna kadar biyouyumlu bir materyal ile doldurulması işlemidir (5). Kanal tedavilerinin başarısı bu işlemlerin tam ve eksiksiz bir biçimde yerine getirilmesine bağlıdır (206). Kök kanallarının yıkama solüsyonları kullanarak kanal eğeleri ile genişletilmesi ve doldurulması kanal tedavisinin prognozunu etkileyen en önemli faktörlerden biridir. Kök kanallarının genişletilmesi ve şekillendirilmesi ile bakterilerin eliminasyonu ve pulpa doku artıkları ve debrislerinin uzaklaştırılması sağlanmaktadır (37, 206). Çürük ve travma gibi etiyolojik nedenlerle oluşan pulpa hastalıklarında kron ve kök kanalları nekrotik veya vital pulpa dokusu, mumufiye doku parçaları ve doku sıvısı ile dolu olabilir. Bu zararlı ve enfekte materyalin biyomekanik preparasyonla apikal foramene itilmeden uzaklaştırılması gerekir. Bu yüzden kanalın mekanik preparasyon sırasında sık aralarla antimikrobial özellikte olan, nekrotik materyali çözücü ve periapikal dokularla biyouyumlu bir solüsyonla yıkanması gerekmektedir (17, 37, 206). Günümüzde endodontik tedavide en çok tercih edilen yıkama solüsyonları, steril distile su, steril serum fizyolojik, sodyum hipoklorit (NaOCl), şelasyon ajanları, klorheksidin (CHX) ve klorheksidin glukonat artı setrimid (CHX+setrimid) tir (37). Kök kanallarının genişletilmesi ve yıkanmasını takiben, kök kanal boşluğunun tamamı genelde gütta-perka ile tıkanıp, kalan boşluklar kanal dolgu patları ile doldurulur. Kanal dolgu patlarının çözünebilme, büzülme ve toksik özellikleri nedeniyle kök ucundan taşırılmamaları gerekir (5). xxii

23 İdeal kanal dolgu maddesi apekste sert doku oluşmasını teşvik edecek ve bu şekilde apikal bölgenin biyolojik olarak tıkanmasını sağlayarak periapikal dokuların bütünlüğünü koruyup ideal iyileşme şartlarını yaratacak dolgu maddesidir (5, 206). Günümüzde kök kanal tedavisinde gütta-perka ile birlikte kullanılan bazı kanal dolgu patları tablo 1 de görülmektedir (5, 17, 37, 41, 43, 206). Kanal Dolgu Patı İçerikleri Ürün Adı Çinko oksit-öjenol (ZOE) Endometazon, Tubli-seal, Roth 501 Formaldehit içerikli ZOE patları Plastik esaslı Poliketon Cam iyonomer Kalsiyum hidroksit Rezin esaslı Endometazon, N2 Diaket, AH26, AHPlus, Roeko-Seal Diaket-A Fuji ionomer, Ketac-Endo Sealapex, CRCS, Apexit FibreFill Tablo 2 : Kök kanal tedavisinde gütta-perka ile birlikte kullanılan kanal dolgu patları 1.2 Apeksifikasyon tedavisi Çocuklarda, kök gelişimini henüz tamamlamamış, genç bir dişin pulpayı etkileyen çürük veya travma sonucu yaralanmasında en sık görülen komplikasyon pulpa nekrozunu takiben kök gelişiminin durması ve diş köklerinin apeksinin fizyolojik olarak kapanmamasıdır (37, 46, 153) (Şekil 1). xxiii

24 Şekil 1: Kök gelişimini tamamlamamış genç daimi diş Bu tip olgularda uygulanması gereken tedavi yöntemi apeksifikasyondur (5, 46, 211). Apeksifikasyon tedavisi, uygun bir endodontik tedavi ile periapikal dokularda kanal dolgu patları ve yıkama solüsyonları kullanılarak, ideal çevre şartlarının yaratılması sonucu apikal açıklığın osteosement oluşumu veya benzeri bir sert doku ile kapanmasının teşvikidir (37, 69). Kök gelişimini tamamlamamış bir dişin pulpası geri dönüşümsüz olarak hastalandığında veya travmatik olarak yaralandığında apikale doğru açılan kök kanal duvarlarının ince ve apeksin çok geniş olması kanal dolgusunda güçlük yaratır (5). Bu dişlerin apeks bölgeleri gelişim dönemine bağlı olarak üç farklı formda izlenebilir. Kök kanal duvarları kök ucuna doğru daralır (Şekil 2a), birbirine paralel konumda olabilir (Şekil 2b) veya kök ucuna doğru genişleyebilir (Şekil 2c) (37, 46). a b c Şekil 2: Kök gelişimini tamamlamamış dişlerde gözlenen apeks formları. a) Kök ucuna doğru daralan b) Paralel konumda c) Kök ucuna doğru genişleyen. Kron ve kök pulpası canlı olmasa da apeksifikasyon esasen, apikal bölgedeki hücrelerin fonksiyon görebilecekleri ideal ortamı sağlayan vital bir endodontik tedavidir (5). Bu nedenle, apeksifikasyon tedavisi sırasında kullanılacak olan yıkama solüsyonlarının ve apikal xxiv

25 kapanmayı uyaracak kanal dolgu patlarının, biyouyumlu olmaları, periapikal doku hücreleri üzerinde sitotoksik ve genotoksik etkilerinin bulunmaması büyük önem taşır (80). Kök ucu gelişimi, Hertwing epitel kınının canlılığını devam ettirmesine bağlıdır. Hertwing epitel kını her zaman geriye dönüşsüz olarak zarar görmez. Periapikal enflamasyona rağmen canlılığını koruyabilecek kadar dayanıklı bir dokudur. Enflamasyon elimine edildikten sonra da kök gelişimindeki rolüne devam eder (5, 46, 153). Whittle (207), bu durumu genç ve apikal oluşumu tamamlanmamış dolayısıyla kanlanmanın fazla olduğu dişlerde Hertwing epitel kınının zarar görmemesine veya apikal bölümde geride kalan odontojenik hücrelerin canlı ve aktif kalmasına bağlamıştır. Parashos (153) ise, Hertwing epitel kınının cerrahi periapikal kürataj sonucunda ortadan kalktığı durumlarda da apikalde apeksifikasyon tedavisinden sonra Malassez epitel artıklarında bulunan canlı hücrelerin yardımıyla sert doku oluşabileceğini bildirmiştir (153). Histolojik incelemeler, apeksifikasyon tedavisinde, kanal dolgu patlarının uygulanması sonucu oluşan kalsifik yapının osteosement, osteodentin ve kemik veya her üçünün bir kompozisyonu tarzında oluşabildiğini göstermiştir. Birçok olguda apikal kapanma düzensiz olup, kalsifik yapının yanı sıra aralarında yumuşak bağ dokusu adacıkları bulunabilir (5, 37, 211). Apeksifikasyon tedavisi sonrasında, apikal açıklık değişik tip, biçim ve düzeyde kapanarak oluşabilmektedir (37, 5, 46). Apikal tıkanma, kökün ucundan birkaç milimetre kısa (125), kökün uç noktasında (180) veya kökün 1/3 apikalinde tam veya tamamlanmamış sert doku köprüsü şeklinde meydana gelebilir. Farklılıklar, kullanılan kanal dolgu patının özelliğine ve yerleştirildiği yere bağlıdır. Apeksifikasyon tedavisi sonucu oluşan kalsifik birikim poröz yapıdadır (5, 37, 211). Bu nedenle, apeksifikasyon tedavisinin son basamağı olan kanal dolgu patları ve gütta-perka ile doldurma işleminde kanal patları kompaksiyon basıncı ile bir miktar kanal dışına taşabilmektedir (5, 37). xxv

26 Apeksifikasyon tedavisi uygulanacak bir dişin, prognozunun uzun süre başarılı olabilmesi için tedavi basamakları eksiksiz ve doğru uygulanmalıdır. Geleneksel apeksifikasyon tedavisinin basamakları aşağıdaki gibi özetlenebilir; Rubber dam izolasyonu: Endodontik tedavi sırasında enfekte olmayan bir dişi enfekte etmekten kaçınmak ve enfekte bir kanalı tedavi ederken başka mikrooganizmaların işe karışmasını en aza indirmek amacıyla uygulanır (46, 125, 206). Giriş kavitesi: Pulpa boynuzları ve ön dişlerin singulumlarındaki dentin giriş kavitesine katılmalıdır. Pulpa ekstirpasyonu: Kök kanalı geniş olduğundan iki tirnerf birlikte kullanılarak ve döndürülerek iltihaplı veya nekrotik pulpa artıklarının çıkartılmasıyla gerçekleşir. Çalışma boyu: Radyografik apekse kadar veya 1-2 mm kısadır (5, 37, 51, 125). Kök kanalların genişletilmesi: Çevresel eğeleme ile gerçekleştirilir. Kök kanallarının yıkanması: Apeksi açık olan dişlerde kök kanallarının yıkama işlemi vital periodontal dokular düşünülerek basınçsız uygulanmalıdır. Vital dokular ile temas yüzeyi dikkate alınarak kök kanal yıkama solüsyonlarının biyouyumlu olmalarına özen gösterilmelidir (80). Günümüzde apeksifikasyon tedavisinde kullanılan kök kanal yıkama solüsyonları, serum fizyolojik (5, 37, 51, 125), %5-0.5 NaOCl (46, 51, 69, 125, 129, 153) ve etilen daimin tetra asetik asit (EDTA, 153) dır. Yapılan çalışmalarda, kök kanal yıkama solüsyonlarından olan CHX ve CHX+setrimid inin apeksifikasyon tedavisinde kullanımına ait bilgiye rastlanılmamıştır. Kök kanal dolgu patlarının uygulanması; Kök kanal dolgu patı uygulamadan önce kanallar kurulanmalıdır. Kağıt konlar çalışma boyunda ölçülür ve apeks dışına taşarak irritasyon oluşturmamasına dikkat edilmelidir. Kanalın kuru olduğundan emin olduktan sonra kanal dolgu patı lentilo, amalgam taşıyıcısı, plastik veya teflon pistonlu şırıngalar ile yerleştirilebilir (5, 37). Pat yerleştirildikten sonra kuru pamuk pelet yardımıyla kondanse xxvi

27 edilir ve dolgu maddesine kuru bir zemin hazırlamak için kuru pamuk pelet giriş kavitesine yerleştirilir (46, 125). Giriş kavitesi en az 4 mm kalınlığında geçici dolgu materyali ile kapatılır (46, 125, 153). Şiddetli enfeksiyon görülen olgularda enfeksiyon geriletilinceye kadar 1 haftalık aralarla, daha sonra 4-6 hafta ve 3 aylık aralarla kontrollere çağrılır. Kanal dolgu patı apikal kapanma sağlanıncaya kadar yapılan kontrol seanslarında yenilenir (46, 51, 125, 180) (Şekil 3). Araştırmacılar apikalde sert doku oluşumunun 5-24 ay içinde gerçekleştiğini bildirmiştir (46, 125, 180). Bu sürenin uzunluğu apikal açıklığın genişliğine bağlıdır (46). Geleneksel apeksifikasyon tedavisinde kanal dolgu patı olarak Ca(OH) 2 +distile su (Ca(OH) 2 +sds) kullanılır (37, 46, 51, 153, 180). Ca(OH) 2 tozunun antibakteriyel etkisinden dolayı taşıyıcı olarak germisid bir madde gerektirmez. Ca(OH) 2 ile birlikte kullanılan taşıyıcı dokuyla uyumlu ve kanal dışına taştığı zaman çevre dokuları irrite etmemelidir (5). Bu amaçla saf su veya gliserin kullanılmaktadır (5, 37, 46, 51). a b c d Şekil 3: Kök gelişimini tamamlamamış dişlerde uygulanan Ca(OH) 2 kanal dolgu patının görüntüsü. a, c) kök kanal boyu tespiti. b, d) Ca(OH) 2 kanal dolgu patı. Kök kanal sisteminin son dolgusu: Ca(OH) 2 patı kanaldan serum fizyolojik veya distile su (5, 37, 51, 69) yardımıyla çıkarıldıktan sonra, son yıkama işlemi % 17 EDTA yı takiben %5 NaOCl (112, 184) ile yapılır ve kanal kağıt konlar yardımıyla kurutulur. Böylece kanal xxvii

28 patlarının dentin tübüllerine daha iyi penetrasyonu sağlanmış olur. Kök kanalı, tercih edilen bir teknik ile güta-perka ve kanal patı ile doldurulur (125). Apikal bölgede oluşan kalsifik bariyer pöröz yapıda olduğundan, doldurma sırasında kullanılacak kanal patının biyouyumluluğuna ve aşırı kompaksiyon basıncı uygulanmamasına dikkat edilmelidir (5, 37). Çok seanslı klasik apeksifikasyon tedavisinin, hastaların seanslara gelme zorlukları, estetik eksikliğin yarattığı psikolojik sorunlar ve ekonomik zorluklar gibi dezavantajları vardır (46, 37, 211). Bu nedenle, son yıllarda tek seansta apeksin tıkanmasını sağlayan mineral trioxide agregate (MTA, ProRoot, Dentsply, Tulsa, OK, ABD) piyasaya sürülmüştür. MTA nın endikasyonları arasında apeksifikasyon tedavisi de yer almaktadır (33, 88, 174). MTA nın, sement ve kemik oluşumuna ve periodontal ligament rejenerasyonuna olanak tanıdığı belirtilmiştir (129, 174). Apeksifikasyon tedavisinde MTA nın uygulama basamakları şu şekilde özetlenebilir: Anestezi sonrası, rubber dam uygulandıktan ve giriş kavitesi açıldıktan sonra, kök kanal sistemi kanal aletleri ile temizlenir ve %0,5-5,25 NaOCl ile irrige edilir (51, 129). Kök kanalının dezenfeksiyonu için kanal bir hafta Ca(OH) 2 ile bekletilir. Ca(OH) 2 kanaldan %17 EDTA yı takiben %5 NaOCl yardımıyla uzaklaştırılıp, kağıt konlarla kanal kurutulduktan sonra, MTA tozu steril distile su ile karıştırılır ve karışım amalgam taşıyıcı ile kanala yerleştirilir (112, 184). MTA kökün apikal kısmına plugger veya kağıt konlar yardımıyla kondanse edilirek, 3-4 mm kalınlığında, apikal tıkaç olarak hazırlanır ve radyografi ile kontrol edilir. Eğer uygulama başarısız olmuş ise MTA, kanal içinden steril distile su ile temizlenir ve işlemler tekrarlanır (51, 69, 129). MTA uygulandıktan sonra, nemli bir pamuk kanala yerleştirilir ve giriş kavitesi geçici bir restorasyon ile 3-4 saat için kapatılır (203). xxviii

29 4 a 4b 4c Şekil 4: Kök gelişimini tamamlamamış bir dişin MTA patı ile apeksifikasyon tedavisi (69): a) Tedavi öncesi radyografi b) Tedaviden 6 ay sonra kontrol radyografisi c) Tedaviden 12 ay sonra kontrol radyografisi Üçüncü seansta MTA nın apikalde sertleşip sertleşmediği kontrol edilir ve sertleşmiş ise gütta-perka ve kanal dolgu patı ile doldurulur. Dişin daimi restorasyonu yapıldıktan sonra, diş düzenli kontroller altında tutulur (51, 69, 129) (Şekil 4). 1.3 Apeksifikasyon ve kök kanal tedavisinde kullanılan yıkama solüsyonları Yıkama solüsyonları, kök kanallarında mekanik temizleme sırasında oluşan debrisi uzaklaştırmak, organik doku artıklarını çözmek, antimikrobial etki ile mikroorganizmaları yok etmek, smear tabakasını uzaklaştırmak, mekanik preparasyon ile kök kanalı içindeki ulaşılamayan alanları temizlemek ve kanal aletleri ile çalışma sırasında kayganlık sağlamak amacıyla kullanılır (5, 17, 37, 206). Kök kanal sisteminde etkin bir dezenfeksiyon için yıkama solüsyonlarında bulunması gereken özellikler şunlardır (5, 37, 206): 1. Kök kanal dentininin organik ve inorganik yapılarını etkileyerek smear tabakasını kaldırmalıdır, 2. Düşük yüzey gerilimi göstererek dentin tübüllerine penetre olabilmeli ve dezenfekte edebilmelidir, 3. Etkinliği açısından kanalda kolay nötralize olmamalı ve kullanımından sonra kalıcı antibakteriyel aktivitesini sürdürebilmelidir, xxix

30 4. Dişin çevre dokularına antijenik, toksik, ve karsinojenik etki göstermemelidir, 5. Açıktaki dentin dokusunun fiziksel özelliklerine olumsuz etkisi olmamalıdır, 6. Kök kanal dolgu maddesine olumsuz etkisi olmamalıdır, 7. Daimi koroner restorasyonlarının pulpa odası duvarına bağlanma kuvvetine olumsuz etki göstermemelidir, 8. Dişin rengini değiştirmemelidir, 9. Uygulanması kolay olmalıdır, 10. Maliyeti düşük olmalıdır, 11. Raf ömrü uzun olmalıdır, 12. Saklanma kolaylığı olmalıdır. Sıklıkla kullanılan kök kanal solüsyonları; I. Steril serum fizyolojik II. Sodyum hipoklorit III. Şelasyon ajanları IV. Klorheksidin V. Klorheksidin glukonat artı setrimid tir Steril serum fizyolojik (SF) Steril SF, %0.9 luk NaCl (sodyumklorür, sofra tuzu) çözeltisidir. Vücut sıvıları ile aynı ozmolariteye sahiptir (63). Apeksifikasyon ve kök kanal tedavisinde yıkama solüsyonu olarak kullanılır (69, 125, 152, 201). Geleneksel apeksifikasyon tedavisinde ilk seansta nekrotik doku artıklarını eritme özelliği olan %0.5-%5.25 lik NaOCl kullanıldıktan sonra, diğer seanslarda canlı periapikal dokulara zarar vermemek için steril SF kullanımı önerilmiştir (51, 69, 125). xxx

31 Yapılan çalışmalar, steril SF in diğer kök kanal yıkama solüsyonları ile karşılaştırıldığında antibakteriyel etkinliğinin olmadığını belirtmişlerdir (12, 82, 152, 201). Steril SF te bulunan klorid iyonunun büyük bakteri kolonilerini parçalayıp sayıca fazla küçük bakteri kolonileri oluşturduğu ve CFU (colony-forming units) değerlerinde artışa neden olduğu saptanmıştır (201). Bu nedenle son yıllarda sadece kanal yıkama özelliği göz önünde bulundurularak steril SF yerine steril distile su kullanımı önerilmektedir. Çalışmalar steril SF in kök kanallarının genişletilmesi sırasında eğeleme hareketinden dolayı oluşan smear tabakasını kaldırmada etkili olmadığını belirtmişlerdir (18, 66, 210). Yıkama solüsyonları içinde steril SF dokuya uyumlu bir ajandır (151, 152) Sodyum hipoklorit (NaOCl) NaOCl, dilue kostik sodada sıvı veya gaz halinde bulunan klorinin su ile reaksiyona girmesi sonucu oluşan yeşilimsi renkli bir sıvıdır. Cl 2 + 2NaOH (aq) NaOCl (aq) + H 2 O + ısı En çok çamaşırların beyazlatılmasında kullanılmaktadır. Tekstil, deterjan, kağıt ve gıda sanayisinde de kullanım alanları vardır. Su ve atık suların arıtılmasında da dezenfektan olarak kullanılmaktadır (37). Dişhekimliğinde apeksifikasyon (46, 51, 69, 125, 129, 153) ve kök kanal tedavisi (56, 70, 83, 202) sırasında yıkama solüsyonu olarak kullanılır. Endodontik tedavilerde kullanılan NaOCl solüsyonlarının aktif klor içerikleri % arasında değişmektedir (37). ph sı ise dir (80). Solüsyon kanal içinde etkin bir şekilde kullanılabilmesi için taze hazırlanmalı ve sulandırılmasında steril distile su kullanılmalıdır (37). NaOCl doku çözücü özelliği ile birlikte endodontik floraya karşı etkin bir antimikrobial ajandır (18, 56, 80, 144, 191, 202, 204). Bu solüsyonun antimikrobiyal etkinliği; hücre proteinlerini okside ve hidrolize etme yeteneğine ve hipertonikliğinden dolayı bir miktar xxxi

32 hücre içi sıvısının osmotik olarak hücre dışına çıkmasına bağlıdır. NaOCl doku proteinleri ile temasa geçtiğinde, yüksek ph düzeyinden (ph 11-12) dolayı, kısa süre içinde nitrojen, formaldehit ve asetilaldehit oluşur. Proteinlerin çözülmesi sonucu peptid bağları kırılır. Bu süreç içinde hidrojen ve amin grupları (-HN - ), klorin (-NCl - ) ile yer değiştirir ve solüsyonun antimikrobial etkinliğinde önemli rolü olan kloramin oluşur (37, 80). Böylece nekrotik doku ve cerahat çözünür ve antimikrobial ajan enfekte alanlara daha rahat ulaşıp, dezenfekte eder. Solüsyonun ısısının artması, NaOCl in antimikrobiyal ve doku çözücü etkisini de arttırmaktadır (186). Endodonti pratiğinde, NaOCl, %0.5-%5 arasındaki çeşitli konsantrasyonlarda kullanılmaktadır (58, 201, 202, 204). NaOCl in hangi konsantrasyonda daha etkin antimikrobial aktivite gösterdiğine dair ortak görüş bulunmamaktadır. Bazı çalışmalar %0.5 ile %5 konsantrasyonları arasında antimikrobiyal etkinlik açısından bir fark olmadığını belirtirken (81, 204) diğer çalışmalar sulandırıldığında etkisinin azaldığını ileri sürmektedirler (12, 202). Kanal yıkama solüsyonunun antimikrobiyal etkisinin büyük oranda yüksek konsantrasyona bağlı olduğu düşünülmesine rağmen düşük konsantrasyonlu solüsyonlarla bol irrigasyon yapmanın da aynı etkiyi gösterdiği bildirilmiştir (25, 26, 80). Yıkama solüsyonlarının smear tabakasını kaldırabilmeleri ve enfekte dentin kanallarına penetrasyonları solüsyonların etkinlikleri açısından önemli bir özelliktir (37). NaOCl in kanal genişletme sırasında kanal duvarında oluşan smear tabakasını uzaklaştıramadığı saptanmıştır (18, 64, 144, 191, 210). NaOCl, yüksek konsantrasyonlarda oldukça sitoksiktir (189). Temas ettiği dokularda irritasyona ve allerjik reaksiyonlara neden olur (101). İrrigasyon sırasında periapikal dokulara sızdığında sitotoksik etkisi olduğu ve dokularda nekroz oluşturduğu gözlenmiştir (101, 152). NaOCl in bu zararlı etkilerinin ortaya çıkmasının birincil nedeni, ph ının olması ve temasa geçtiği dokuların proteinlerinde oksidasyona sebep olmasıdır (101). xxxii

33 Heggers ve ark. ları (81) NaOCl irrigasyonunun antibakteriyel özelliklerinin yara iyileşmesi üzerine olan etkisini in vitro ve in vivo modellerde incelemişler, %0.025 NaOCl in bile bakterisidal etki gösterdiği ve dokularda toksik olmayan en uygun konsantrasyon olduğunu ileri sürmüşlerdir. Kabul edilebilir sitotoksik seviye için %0.5-%1 NaOCl tavsiye edilmektedir (25, 56). NaOCl in antimikrobiyal etkinliği ve doku çözücü özelliği konsantrasyonu ile doğru orantılıdır (56, 147). Biyouyumluluğu ise konsantrasyonu ile ters orantılıdır (56) Şelasyon Ajanları Şelat (Chelate) terimi, Yunancada yengeç kıskacı anlamına gelen chele kelimesinden köken almaktadır. Şelatlar yüzük-şekilli bağlar sonucunda metal iyonları ile organik maddeler arasında oluşan kısmen kararlı komplekslerdir. Bu kararlılığın sebebi birden fazla bir çift serbest elektrona sahip şelatör ile merkez metal iyonu arasında oluşan bağdır (102). Endodonti pratiğinde, şelasyon ajanları içerisinde en sık kullanılan etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) tir. Kanalların kemomekanik genişletilmesinin etkinliğini arttırmak (lubrikasyon), smear tabakasını uzaklaştırmak ve dentin duvarlarının dezenfeksiyonu amacıyla kullanılır (38, 80, 205). EDTA, etilendiamine bağlı dört asetik asit grubu içerir (Şekil 5). EDTA nın tuzları metabolize olmadığından dentindeki Ca ++ iyonları ile birleşerek şelat tuzları oluşturur ve dentinden Ca ++ iyonlarını uzaklaştırır (Şekil 5). Bu etkileşimin kanal duvarlarının enstrümantasyona daha az direnç göstermesini sağlayabileceği düşünülmüştür (5, 37). xxxiii

34 a b Şekil 5: a) EDTA nın kimyasal formülü b) EDTA nın Ca ++ ile şelasyonu (92, 94) (5, 37): Sıklıkla EDTA nın disodyum tuzu kullanılır. Bu solüsyonun formülü aşağıdaki gibidir EDTA nın disodyum tuzu Distile su 5N Sodyum hidroksit 17 gr 100 ml 9.25 ml. EDTA solüsyonun saf formuna, fiziksel ve bakterisidal kapasitesini arttırmak için çeşitli deterjanlar eklenmiştir (102). Bu yeni oluşturulan preparatlar, sıvı ve pasta tipi şelatörler olarak ikiye ayrılabilir. Sıvı şelatörlere örnek olarak Calcinas: (lege artis, Dettenhausen, Germany), REDTA (Roth International, Chicago, IL, USA), EDTAC, EDTA-T (Formula & Açao Farmaçia, Sao Paulo, Brazil) ve EGTA verilebilir. Pasta şelatörlere ise Calsinase slide (Lege artis, Dettenhausen, Germany), RC-Prep (Premier Dental, Philadelphia, PA, USA), Glyde file (DeTrey Densply, Konstanz, Germany) verilebilir (102). EDTA solüsyonunun yüksek oranda dentini demineralizasyon etkisi vardır (45, 66, 172). Dentin tübüllerini genişletir, dentinin yumuşamasına ve kollagen liflerin denatürasyonuna neden olur (38). EDTA nın bu etkilerinden dolayı kök kanallarına uygulama süresi önemlidir. Uzun süreli uygulamalar, kanal patlarının kök kanal duvarlarına adaptasyonunda zorluklara yol açabilir (38). EDTA uygulamasını takiben kök kanallarında dentin geçirgenliğinde değişmeler meydana gelir (210). Kök dentininin geçirgenliğini smear xxxiv

35 tabakası ve kanal enstrümantasyonundan sonra kalan dentin kalınlığı direkt olarak etkiler. Smear tabakası diffüzyon bariyeri gibi davranarak dentin geçirgenliğini azaltır (37). Dentinin inorganik komponentlerinin başında kalsiyum ve fosfor gelmektedir. Bu iki iyon oranının değişmesi, dentinin organik ve inorganik komponentleri arasındaki dengeyi etkileyebilir ve dentinin geçirgenliği ve çözünürlüğünde artışa neden olabilir (45, 172). Çalışmalar NaOCl i takiben kullanılan EDTA nın kök kanallarının genişletilmesi sırasında eğeleme hareketinden dolayı oluşan smear tabakasını kaldırmada etkili olduğunu göstermiştir (18, 38, 45, 64, 205, 210). EDTA nın sınırlı antibakteriyel etkisi vardır (82). Bunun bakterilerin dış membranındaki katyonların şelasyonu nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Kuvvetli bir bakterisit değildir. Gram (+) türler üzerinde bir etkisi yoktur. EDTA nın antibakteriyel özellikleri solüsyonun ph ve konsantrasyonuna bağlıdır (37). Apikal foramenden taşan şelasyon ajanlarının ne dereceye kadar enflamatuar doku reaksiyonuna neden olabileceği hakkında birçok araştırma mevcuttur (102, 116, 127, 171). Yapılan klinik bir çalışmada ise EDTA nın yıkama solüsyonu olarak kullanıldığı 200 klinik olguda hiçbir doku iritasyonu ve hasarı meydana gelmediği belirtilmiştir (102). Klinik bulguların aksine yapılan hücre kültürü çalışmalarında EDTA solüsyonlarının sitotoksik oldukları saptanmıştır (36, 116, 127, 171). Collet ve ark. ları (36) %15 Na-EDTA solüsyonunun in vitro koşullarda toksik etkisi olduğunu ve EDTA-T nin hücre büyümesini tamamen engellediğini tespit etmişlerdir. %17, %15 ve %1 EDTA, %2.25 ve %1 NaOCl in L929 fare fibroblastları üzerinde oluşturdukları sitotoksik etkilerinin değerlendirildiği çalışmada, L929 hücre hattında %15 ve %17 EDTA, %2.25 NaOCl solüsyonlarının ciddi sitotoksik etkilerinin olduğunu saptamışlardır. Buna rağmen her iki ajanın %1 lik konsantrasyonlarının sadece orta derece reaksiyonlara neden olduğu tespit edilmiştir (116). xxxv

36 1.3.4 Klorheksidin Sentetik bir kemoterapötik ajan olan klorheksidin (C 22 H 30 CL 2 N 10 ), periodontal tedavide dental plağın kimyasal kontrolünde, diş çürüklerinin önlenmesinde, endodontik tedavide yıkama solüsyonu ve medikament (jel formunda) olarak kanal içi mikroorganizmaların eliminasyonunda ve genel olarak oral enfeksiyonlarda kullanılır (5, 37, 72, 170). Kimyasal adı 1,1-hexamethylenebis (5-(4-chlorophenyl) bisguanide olan klorheksidin in, tuzları stabildir. Bu nedenle piyasada en çok dihidroklorit, diasetat ve diglukonat tuzları şeklinde bulunur (5, 37, 170). Dişhekimliğinde daha çok klorheksidin diglukonat formunda kullanılır. Diğer klorheksidin tuzlarının aksine suda serbestçe çözünebilen klorheksidin diglukonat, fizyolojik ph larda pozitif yüklü klorheksidin bileşenlerine ayrışır (37). Klorheksidin diglukonatın kimyasal formülü; C 22 H 30 CL 2 N 10,2C 6 H 12 O 7 dir (Şekil 6). Solüsyonu açık sarı renkte bir sıvıdır (95). Şekil 6: Klorheksidin diglukonatın kimyasal formülü (95). Klorheksidin, ph sı 5.5 ile 8 arasında değişen, kuvaterner amonyum yapılı katyonik bisguanidir (5, 30, 37). Etkinliği ph 7-8 arasında en fazla iken, 5.2 nin altında oldukça azalır (93). Aerob ve anaeroblar dahil olmak üzere hem Gram (+) hem de Gram (-) bakterilere, bakteriyel sporlara, lipofilik virüslere, dermatofitlere, mayalara ve mantarlara karşı etkilidir (5, 30, 37, 58,170). Mikobakteriyumlar, sporlu bakteriler ve bazı virüslere karşı ise etkisizdir (30). Düşük konsantrasyonda bakteriyostatik ve yüksek konsantrasyonda bakterisit etki gösterir (5, 37). Pozitif yükü nedeniyle katyonik özellik taşır ve bakteri hücre duvarı, xxxvi

37 ekstrasellüler polisakkaritler, hidroksiapatit, pellikıl, tükrük müsinleri ve oral mokoza gibi negatif yüklü yüzeylere afinite gösterir (113). Klorheksidin i diğer antiseptiklerden ayıran en önemli özelliği organik ve inorganik yapılara bağlanma yeteneğidir (5, 137, 146). Klorheksidin in uzun süreli salınım özelliği hidroksiapatit ve tükrük müsinleri gibi yapılara adsorbsiyonuna bağlıdır (170). Klorheksidin, bağlandığı bu dokulardan yavaşça salınarak antibakteriyel etkinliğini uzun süre devam ettirir (37, 137, 146). Klorheksidin glukonat (CHX) bipolar molekül yapısına sahiptir. Katyonik gruplardan biri diş veya mukozaya bağlanırken, ikincisi bakteri hücre duvarı üzerinde tahrip edici etki gösterir (170). Klorheksidin in pozitif yüklü molekülleri, negatif yüklü hücre duvarına bağlanarak, mikroorganizmanın yüzey özelliklerini değiştirir ve bakterisit etki gösterir. Düşük konsantrasyonlarda hücre membran enzimlerini inhibe eder ve membranın geçirgenliğini artırır. Bu etki bakteriyostaz olarak adlandırılır. Yüksek konsantrasyonlarda sitoplazmik organellerin presipitasyonuna yol açarak bakterisidal etki gösterir (105, 113, 170). Bakteri hücre duvarının bozulmasına, bakteri hücre membranının geçirgenliğinin değişmesine ve hücre içi komponentlerin hücre dışına çıkıp koagüle olmasına neden olur (72, 105, 113, 170). Klorheksidin in tadı ve kokusunun hastalar tarafından tolere edilebilir olmasından dolayı NaOCl e alternatif yıkama solüsyonu olarak kullanımı yaygınlaşmıştır. Yapılan çalışmaların bir kısmı %2 CHX ve %5.25 NaOCl in eşit antibakteriyel etkinliğe sahip olduklarını (64, 70, 202), bir kısmı ise %2 CHX ın daha etkin antibakteriyel ajan olduğunu belirtmektedir (52, 137, 146, 152). Klorheksidin in avantajları yanında dezavantajları olarak organik dokuları çözememesi ve smear tabakasını uzaklaştıramaması gösterilmektedir (64, 144, 147, 210). Klorheksidin in insan hücrelerine sitotoksik etkisi olduğu saptanmıştır. Chang ve ark. larının (31), insan periodontal ligament hücreleri kullanarak yaptıkları çalışmalarında %0.4 NaOCl ile %0.1 klorheksidin in sitotoksisitelerinin eşit olduğu saptanmıştır. Tanomaru xxxvii

38 ve ark. ları (195) fare peritoneal dokularında yaptıkları çalışmalarında, %0.5 NaOCl in %2 CHX a göre daha fazla toksik etki ve şiddetli enflamatuar cevap gösterdiğini bildirmişlerdir. Klorheksidin in uzun süreli kullanımına bağlı tat alma duyusunda bozulma, metalik tat, dil ve dişte renklenme, eritem, ürtiker, nasal konjesyon, bronkospazm, öksürük gibi aşırı duyarlılık semptomları, stomatit, glosit, konjiktiva ve muköz membran iritasyonları bildirilen yan etkileridir (72, 93) Klorheksidin glukonat artı setrimid (CHX+setrimid) Yüzey aktif ajanların ilavesi pek çok antiseptik ajanın antimikrobial etkisini arttırmaktadır (5). Dörtlük bir amonyum bileşiği, katyonik ve yüzey aktif bir deterjan olan setrimid (tritrimethyltetradecylammonium bromide), pek çok Gram (+) ve Gram (-) bakteri ve mantarlar üzerinde etkilidir (91, 152). Kimyasal formülü C 17 H 38 NBr dir (91) (Şekil 7). Şekil 7: Setrimidin kimyasal formülü (91) Setrimid suda çözünür ve kimyasal olarak sabunlarla geçinemez. Katyonik bir molekül olan klorheksidin ile geçimlidir (5). Son yıllarda klorheksidin glukonata setrimid ilavesiyle yeni bir solüsyon elde edilerek klorheksidin glukonatın tek başına sahip olduğu antibakteriyel etkinin arttırılması ve yüzey gerilimini düşürerek kanal boyunca akışının ve derinlere penetrasyonunu kolaylaştırmak hedeflenmiştir (5, 37). Bu amaçla %0.2 CHX ve %0.2 setrimid içeren bir yıkama solüsyonu, Cetrexidin (Vebas Company, Milano, İtalya) adı xxxviii

39 altında piyasaya sürülmüştür (5, 37). Üretici firma bu solüsyonun yıkamadan sonra olguların % 80 inde kesin bir dezenfeksiyon sağlandığını, sitotoksik olmadığını ve smear tabakasını ortadan kaldırdığını iddia etmektedir (5, 152, 197). Türkün ve ark. ları (197) yaptıkları çalışmalarında CHX ve CHX artı setrimidin toksik ve nekrotik doku çözücü etkilerini %5.25 ve %0.5 NaOCl den düşük olduğunu gözlemlemişlerdir. %5.25 NaOCl in 48 saat ve 2 hafta sonra bile şiddetli doku reaksiyonu oluşturduğunu, %0.5 NaOCl, CHX ve CHX artı setrimid solüsyonlarında 48 saatte orta derecede doku cevabı ile karşılaşıldığını, iki hafta sonra ise enflamasyonun şiddetinin giderek azaldığını belirtmişlerdir (197). Önçağ ve ark. larının (151) hücre kültürü düzeyinde, CHX ve CHX artı setrimid in, 1, 2, 4 saat sonunda, farklı konsantrasyonlarındaki (%0.1, %0.01, %0.001) sitotoksik etkilerini, L929 fibroblast hücre hattında MTT test yöntemi kullanarak karşılaştırdıkları çalışmalarında ise, CHX ve CHX artı setrimid in %0.001 den daha yüksek konsantrasyonlarında sitotoksik etki gözlendiği ve setrimid içermeyen CHX solüsyonunun sitotoksik etki bakımından üstün olmadığı saptanmıştır. 1.4 Apeksifikasyon tedavisinde kullanılan kanal dolgu patları Apeksifikasyon tedavisi, kanal dolgu patları ve yıkama solüsyonları kullanılarak, periapikal dokularda ideal çevre şartlarının yaratılması sonucu apikal açıklığın osteosement oluşumu veya benzeri bir sert doku ile kapanmasının teşvikidir (5, 37, 69). Bu nedenle, apikal kapanmayı indükleyecek kanal dolgu patlarının, biyouyumlu olmalarına, periapikal doku hücreleri üzerinde sitotoksik ve genotoksik etkilerinin bulunmamasına dikkat edilmelidir (80). Apeksifikasyon tedavisinde kanal patı olarak sıklıkla kalsiyum hidroksit (Ca(OH) 2 )+steril distile su, Ca(OH) 2 +gliserin veya bir kanal dolgu materyali olan MTA kullanılmaktadır (46, 51, 69, 129, 153, 180). xxxix

40 1.4.1 Kalsiyum hidroksit (Ca(OH) 2 ) içerikli kanal dolgu patları Ca(OH) 2, süt ve sürekli dişlerde, pulpa kuafajı, amputasyon, apeksifikasyon ve kanal tedavilerinde, pulpa örtüleme materyali, kanal medikamenti veya kanal dolgu patı olarak kullanılmaktadır. (3, 41, 63, 80, 125, 145, 163, 167, 180, 212). Ca(OH) 2 patları donan ve donmayan materyaller olarak sınıflandırılabilir. Donmayan Ca(OH) 2 patları kanal içi medikament olarak kullanılırken, donan patlar kavite astarı veya endodontik kanal dolgu patı olarak kullanılır (80). Ca(OH) 2 yoğunluğu 2.1 olan, beyaz kokusuz bir tozdur (5, 37, 63). ph sı dir (63). Kimyasal olarak güçlü baz sınıfına girer (63, 76). Suda çözünürlüğü azdır. Düşük çözünürlük klinik olarak iyi bir özellik olarak değerlendirilir. Bunun nedeni, vital dokularla temas halinde iken doku sıvılarında çözünmesi için uzun bir periyoda ihtiyaç duymasıdır (37, 63, 76). Ca(OH) 2 gliserinde erir, alkolde erimez (5, 37, 63). Çalışmalar Ca(OH) 2 in çeşitli mikroorganizmalara karşı yavaş etki gösteren kanal içi antibakteriyel ajan olduğunu belirtmişlerdir (55, 63, 76, 80, 145, 154, 212). Ca(OH) 2 in antibakteriyel etki göstermesinin başlıca nedeni yüksek ph ya ( ) sahip oluşudur (60, 80, 145). Antibakteriyel etkisi hidroksil iyonu konsantrasyonuna bağlıdır. Bu etki Ca 2+ ve OH - iyonlarının ayrılması ile oluşur (17, 63, 145). Bakterilerin stoplazmik membranlarında, enzimatik aktivilerinde ve DNA larında hasar meydana getirerek antibakteriyel etkinlik sağlar (60). Ayrıca doku çözücü özelliği vardır (5, 17, 212). Çalışmalar Ca(OH) 2 in sert doku oluşumunu indüklediğini ve periapikal dokuların iyileşmesini hızlandırdığını belirtmişlerdir (46, 57, 59, 60, 63, 109, 120, 125). Ca(OH) 2 uygun bir taşıyıcı ile karıştırıldığında bir pat oluşur. Ana kompanenti Ca(OH) 2 olduğu için bunlar yüksek ph larından dolayı alkalin patlar olarak sınıflandırılır (37, 63). Ca(OH) 2 patı elde etmenin en kolay yolu Ca(OH) 2 i istenen kıvam elde edilene kadar steril xl

41 distile su ile karıştırmaktır (37, 63). Ca(OH) 2 ile birlikte kullanılacak taşıyıcı, pattan periodontal dokulara iyon salınım (Ca 2+ ve OH - ) hızını belirleyeceği için önem taşımaktadır (63). Genel olarak üç tip taşıyıcı kullanılır. Bunlar aköz, visköz ve yağlı tip taşıyıcılardır (63). Su aköz tip, gliserin ise visköz tip taşıyıcıdır (37). Ca(OH) 2 su ile karıştırıldığında, oluşan pat doku sıvıları ile direkt temasta kaldığı sürece yüksek derecede çözünürlük özelliği kazanır (63). Ca(OH) 2 gliserin ile karıştırıldığında ise, patta daha yavaş çözünme gözlenir ve canlı dokular ile daha uzun süre direkt temasta kalır (37, 63). Estrela ve ark. ları (57) Ca(OH) 2 in aköz tip taşıyıcılar ile birlikte kullanılmasını önermişlerdir. Histolojik bir çalışmada, Ca(OH) 2 ile yapılan pulpa kuafajından sonra, Ca(OH) 2 in altındaki pulpa dokusunda üçüncü aya kadar akut ve kronik enflamasyon sahaları ile hiperemi gözlenmiş, dördüncü ayda 0.04 mm kalınlığında düzensiz köprü oluşumu saptanmıştır (3). Ranade ve ark. ları (162) Ca(OH) 2 patını domuz sırtına yerleştirdikten 7 gün sonra örneklerin %50 sinde orta ve şiddetli derecede enflamasyon gözlediklerini, 180 günün sonunda enflamasyonun şiddetini azalttığını ve 60 günün sonunda da kalsiyum tuzlarının depolanması ile birlikte ılımlı derecede enflamasyon izlendiğini belirtmişlerdir. Yapılan hücre kültürü çalışmasında ise Ca(OH) 2 patının çinko oksit öjenol içerikli kanal patına göre daha az sitotoksik olduğu saptanmıştır (74). De Moor ve ark. ları (43) Ca(OH) 2 in kök kanalından taşması sonucu ılımlı ve kısa süreli doku reaksiyonu oluşturduğunu saptamışlardır. De Bruyne ve ark. ları (41) ise Ca(OH) 2 in perforasyon sahasından taşması sonucu gingivada nekroz oluştuğunu gözlemlemişlerdir Mineral Trioksit Agregat Mineral trioksit agregat (MTA; Denstply, Tulsa, OK, USA) son yıllarda geliştirilen ve endodontik tedavide birçok kullanım alanı olan bir materyaldir. Cerrahi kök xli

42 rezeksiyonlarında, apeksifikasyon tedavisinde, vital pulpa tedavilerinde (direkt pulpa kuafajı, amputasyon), kök perforasyonlarında, internal ve eksternal kök rezorbsiyonlarında kullanılabildiği belirtilmiştir (3, 33, 69, 79, 87, 129, 164). Piyasada gri ve beyaz renkte iki çeşit MTA tozu bulunmaktadır. Yapılan çalışmalarda bu iki çeşit patın içeriklerinin ve biyolojik özelliklerinin benzer olduğu belirtilmiştir (6, 8, 88, 185). Gri MTA tozu, kalsiyum oksit, trikalsiyum silikat, bizmut oksit, dikalsiyum silikat, trikalsiyum alüminat, tetrakalsiyum aluminoferrit, kalsiyum sülfat, trikalsiyum oksit ve silikat oksitin saf hidrofilik partiküllerinden oluşmaktadır (6, 174). Beyaz MTA ise, gri MTA da bulunan tetrakalsiyum aluminoferrit i içermez (6). MTA nın likiti steril distile sudur (87, 129). Tozun su ile karıştırılması kolloidal bir jel haline dönüşmesini sağlar (33, 174). Patın tam olarak sertleşebilmesi için neme ihtiyacı vardır (33, 203). Pat yaklaşık 4 saat içinde sertleşir (129). MTA hazırlandıktan sonra ph sı Ca(OH) 2 e benzer şekilde 12.5 tir. Çalışma mekanizmasının Ca(OH) 2 e benzediği belirtilmiştir (62). Yapılan klinik çalışmalarda, apeksifikasyon tedavisinde apikal bariyer olarak kullanılan MTA komşuluğunda periradiküler periodonsiyumda rejenerasyon ve periapikal bölgede yeni sert doku oluşumu gözlenmiştir. Apeksifikasyon tedavisinde Ca(OH) 2 e göre en önemli avantajı tedavinin tek seansta bitirilmesidir (51, 69, 129). Yapılan hayvan çalışmalarında ise, MTA nın biyouyumlu bir materyal olduğu ve komşuluğunda sert doku oluşumu gözlendiği belirtilmiştir (62, 87, 88, 185, 199). Direkt pulpa kuafajı ve pulpotomi tedavisinde örtüleme materyali olarak kullanıldığında enflamasyon, hiperemi ve nekrozun çok az izlendiği, osteotipik formda kalın tübüler dentin köprüsü, odontoblastik tabaka oluşumu gözlendiği saptanmıştır (3, 62, 87, 199). Hücre kültürü çalışmalarında da MTA nın sitotoksik bir materyal olmadığını belirten ve test edilen materyaller arasında en az sitotoksik etki gösteren materyal olduğunu saptayan çalışmalar vardır (8, 42, 111, 136). De Deus ve ark. (42) MTA nın zaman içinde azalan bir xlii

43 sitotoksisitesi olduğunu saptamışlardır. Asrari ve ark. ları (10) MTA nın nörotoksik olmadığını belirtmişlerdir. Çalışmalar, insan alveolar kemik hücrelerinin ve sementoblastların 24 saat içinde MTA yüzeyine yapıştıkları ve yayılma gösterdiklerini saptamışlardır (8, 149). Yapılan çalışmalarda, MTA nın diğer kök kanal dolguları ile karşılaştırıldığında sızdırma değerlerinin arasında fark olmadığı veya daha az sızdırdığı belirtilmiştir (1, 65, 128, 131, 168). Asidik ortamın MTA nın sızdırmazlığını azalttığı saptanmıştır (168). Estrela ve ark. (55) MTA ın sınırlı antibakteriyel etkisi olduğunu tespit etmişlerdir. Pseudomonas aeruginosa ve Enterococcus faecalise karşı MTA ın antibakteriyel bir materyal olduğu belirtilmiştir (49). Yüksek konsantrasyonlarında (50 mg/ml, 25 mg/ml) Candida albicans a karşı yedi gün boyunca etkili olduğu ve antifungal etkinliklerinin konsantrasyonu ile doğru orantılı olduğu saptanmıştır (6, 49). 1.5 Kök kanal tedavisinde kullanılan kanal dolgu patları Başarılı bir endodontik tedavinin amacı, kanalların mekanik olarak temizlenmesini takiben irritan özellik taşımayan bakterisit ilaçlarla yıkanması ve yine toksik olmayan, boyutsal olarak kararlı bir kanal dolgu materyali ile apikal foramene kadar sızdırmaz bir şekilde üç boyutlu olarak doldurmasıdır (5, 37). Genelde kök kanal boşluğu gütta-perka konları ve kök kanal dolgu patı kullanılarak doldurulur (5). Kök kanal dolgu patlarının kök ucundan taşırılmamasına dikkat edilmelidir. Patlar kalan pulpa dokusu veya periapikal dokuyla minimal miktarda temasta bulunmalıdır. Kök kanallarının doldurulması sırasında kullanılan patlar ve gütta-perka nın biyolojik özelliklerine bakıldığında çok sayıda faktör dikkate alınmalıdır. En önemli özellik kimyasal toksisitedir. Bu özelliğe bağlı olarak periapikal bölgede doku yaralanmaları ve irritasyon oluşabilir. Buna ek olarak antimikrobiyal etki göz önünde bulundurulmalıdır. (5). Kök kanal dolgu patlarından beklenen özellikler şunlardır (5, 37): xliii

44 1. Kolaylıkla doldurulabilmeli, yeterli çalışma zamanı tanımalı ve gerektiğinde kolayca kanaldan çıkarılabilmelidir, 2. Kanal içine yerleştirildikten sonra genleşerek yavaşça sertleşmelidir, 3. Boyutsal olarak kararlı olmalı, sertleşme sırasında veya sonrasında büzüşmemelidir, 4. Doku sıvılarında erimemeli, nemden etkilenmemelidir, 5. Kanal duvarlarına ve katı materyallere (güta-perka) yapışmalı, dentin kanalcıklarına derin penetrasyon göstermelidir, 6. Poröz olmamalıdır, 7. Periapikal dokuya taştığında rezorbe olabilmeli, ancak kanal içinde rezorbe olmamalıdır. 8. Steril olmalı veya steril edilebilmelidir, 9. Bakterisit veya bakteriyostatik olmalıdır, 10. Radyoopak olmalıdır, 11. Diş dokularında veya yumuşak dokularda renklenmeye sebep olmamalıdır, 12. Hasta ve personelde genel sağlık problemleri veya allerjiler meydana getirmemelidir, 13. Periapikal dokulara zarar vermemelidir, 14. Mutajenik ve karsinojenik olmamalıdır, 15. İçeriklerindeki materyaller (civa, çinko, baryum, bizmut, titanyum gibi) toksik sınır seviyesini aşmamalıdır, 16. Bozulmadan uzun süre saklanabilmelidir. Kanal patları, içerdikleri maddelere, sertleşmelerine, fiziksel özelliklerine veya rezorbe olabilmelerine göre sınıflandırılabilirler. İçeriklerine göre kanal patlarının sınıflandırılması tablo 1 de görülmektedir (37). Bu çalışmada, paraformaldehit içerikli çinko oksit-öjenol (ZOE) patlarından Endometazon (Septodont, Paris, Fransa), plastik esaslı patlardan AH26 ve xliv

45 AHPlus (Detrey Denstply, Kontanz, Almanya) ve Diaket (Espe, Premier, Norristown, PA, ABD) kullanılmıştır Endometazon Endometazon (Septodont, Paris, Fransa), paraformaldehit içeren ZOE patıdır (37). Bu pata deksametazon ve hidrokortizon asetat ilavesi ile antienflamatuar ve analjezik özellikler katılmıştır (5, 37). Patın içeriği tablo 2 de görülmektedir. ZOE esaslı kanal patları nemli ortamda ZOE şelat bileşikleri oluşturarak sertleşir (206). Suyun yardımıyla öjenol ve çinko oksit arasında sınırlı oranda şelat bağları oluşur ve çinko oksit öjenol kristallerinden yapılı bir matriks ortaya çıkar (37). Bu karışım 24 saat içinde donar. Ancak donma reaksiyonu geriye dönüşümlüdür. Sulu ortamda öjenol ve çinko iyonları salınır (206). Bu durum patın fiziksel özelliklerinin azalmasına yol açar (37). Endometazon un likiti olan öjenol, antibakteriyel etkinin aktif maddesidir (50, 206). Aynı zamanda patın sitotoksik etki göstermesine neden olan bileşenlerinden biridir (33, 74, 86). Öjenolün doza bağlı olarak insan osteoblast hücrelerinde sitotoksik etki gösterdiği, büyüme ve proliferasyonu engellediği belirtilmektedir (86). Ayrıca 0.01 mmol L -1 den yüksek konsantrasyonlarında hücrelerin dehidrogenaz aktivitelerini azalttığı ve 1 mmol L - 1 den yüksek konsantrasyonlarda ise DNA sentezini tamamen durdurduğu saptanmıştır (86). Yapılan hayvan denemelerinde Endometazon un minimum veya şiddetli doku reaksiyonları oluşturduğu saptanmıştır (19, 108). Hücre kültürü biyouyumluluk çalışmalarında ise, çeşitli hücre hatlarında sitotoksik etki gösterdiği belirtilmiştir (22, 96, 155, 176). Endometazon kanal dolgu patının immun sistemin önemli komponentlerinden olan T lenfosit hücrelerinin sayılarını anlamlı derecede azalttığı ve enflamatuar süreçte makrofajlar tarafından salgılanan tümör nekroz faktör-α (TNF-α) miktarını arttırdığı saptanmıştır (22, 155). xlv

46 Toz Likit Miktar (gr) Deksametazon 0.01 Hidrokortizon asetat 1 Diyodotimol 25 Trioksimetilen 2.20 Öjenol Çinko oksit Timoliyodür 25 Baryum sülfat Magnezyumstearate Minium 5.00 Tablo 2: Endometazon kanal dolgu patının içeriği (5) Kök kanal tedavilerinde kullanılacak kanal dolgu patlarının seçiminde antimikrobiyal etkinliklerinin olması ve sızdırmazlık özellikleri göz önünde bulundurulan faktörlerdendir. Çalışmalar, Endometazon un antimikrobiyal etkinliğinin olduğunu göstermiştir (20, 71, 157). Patın zaman içinde antibakteriyel etkinliğinin azaldığı belirtilmiştir (157). ZOE içerikli kanal patlarının sızdırmazlık özellikleri karşılaştırıldığında ise diğer kanal dolgu patlarına göre daha fazla sızdırdığı veya bir üstünlük sağlamadığı saptanmıştır (2, 21, 39, 132) Diaket Diaket (3M ESPE AG, Seefold, Almanya), polivinil yapısında plastik esaslı kanal dolgu patıdır (37). Poliketon taşıyıcıda bulunan polivinil reçine içerir. Sertleşme reaksiyonu sonucunda çinko oksit ile diketon arasında reçine destekli polivinil şelat bağları oluşmaktadır (33). Diaket çok ince toz ve koyu visköz bir likitten oluşmuştur. Karıştırılması sonucu oluşan xlvi

47 resin yapısı oldukça yapışkandır. Diaket in yapısını oluşturan tuz ve metal oksitlerin nötral organik ajanlarla reaksiyona girmesi sonucu poliketonlar oluşur. Bu poliketonlar materyaldeki metalik bağlarla birleşerek siklik kompleksleri meydana getirir (5). Diaketin özellikleri şu şekilde sıralanabilir (5, 33); Sertleşirken hacim kaybına uğramaz ve kanal duvarlarına iyi adapte olur, Uygulanması ve gerektiğinde kanaldan uzaklaştırılması kolaydır, Çabuk donar; cam üzerinde karıştırıldığında 6 dakikada, kök kanalında ise daha kısa sürede sertleşir, Radyoopaktır, Nemden, kandan, sekresyondan etkilenmez, Bakteriyostatiktir. Yapılan çalışmalar Diaket in örtüleme yeteneğini tatmin edici bulmuşlardır (2, 140, 142, 148). Ayrıca E. faecalis e ve P. aeruginosa ya karşı da Diaket in antimikrobial etkinliği olduğu belirtilmektedir (20, 50). Yapılan biyouyumluluk çalışmalarında Diaket in çeşitli hücre hatlarına sitotoksik olduğu saptanmıştır (10, 139, 190). Diaket ile temas eden hücrelerde değişik morfolojiler izlendiği, bazı hücrelerin yuvarlaklaştıkları bazılarının ise çizgi halini aldıkları gözlemlenmiştir (139). Asrari ve ark ları (10) Diaket in nörotoksik olduğunu belirtmişlerdir. Hayvan çalışmalarında ise, Diaket in kök kanal dolgu materyali olarak kullanıldığında, periradiküler doku rejenerasyonuna olanak sağladığı saptanmıştır (33, 164, 209). Çevresinde kemik apozisyonu, periodontal ligament rejenerasyonu ve yeni sement depolanması gözlemlenmiştir (164, 209) AH26 xlvii

48 AH26 (DeTrey Denstply, Konstanz, Almanya), plastik esaslı, epoksi reçine kökenli bir pattır (37). Tozunda bizmut oksit, heksametilen tetramin, titanyum oksit ve gümüş bulunmaktadır. Likiti ise bisfenol diglisidil eter ve epoksibisfenol-resinden oluşmaktadır (5, 61). Likitinde bulunan bisfenol diglisidil eter, bir katalizör olan ve patın tozunda bulunan hekzametilen tetraminle birleşerek polimerizasyonu başlatır. Açığa çıkan formaldehit, patın antiseptik özellik göstermesini sağlar (5, 37, 61). AH26 kanal patının içeriği tablo 3 de görülmektedir. AH26 nın özellikleri şu şekilde sıralanabilir (5, 37, 61, 182); Yavaş donan bir pattır, vücut sıcaklığında saat arasında sertleşir, Kitle hacmi sabit kalır, Nemli ortamda bile polimerize olabilir, Dentine yüksek oranda adaptasyon yeteneği vardır, Sertleşirken bir miktar genleşme gösterir, Gümüş içeriğinden dolayı siyah gümüş sülfit oluşumu ile dişlerde boyanmaya neden olur, Karıştırma oranı toz/likit 3/1 dür. Son yıllarda piyasaya gümüş içermeyen AH26 çıkarılmıştır. Yeni formülünde titanyum dioksit de bulunmamaktadır. Bunun nedeni metalin koyu renginin gölgelenmesine gerek kalmamasıdır (37). Toz Likit İçerik Oran (%) Epoksibisfenol Gümüş Tozu 10 Bizmut oksit 60 xlviii

49 Heksametilentetramin 25 Titan(IV)-oksit 5 Tablo 3: AH26 kanal dolgu patının içeriği (5) Yapılan çalışmalar AH26 nın sızdırmazlık değerlerinin tatmin edici olduğunu belirtmektedir (2, 140, 142, 158, 182). Patın, dentin tübüllerine penetrasyonu ve dentin duvarlarına adaptasyonunun iyi olduğu saptanmıştır (182). Kanal dolgu patlarının antibakteriyel etkinlikleri ile ilgili çalışmalarda ise, AH26 kanal dolgu patının diğer kanal patlarına göre daha az veya eşit antibakteriyel etki gösterdiği belirtilmiştir (20, 50, 118). Çeşitli hücre hatları kullanılarak yapılan biyouyumluluk çalışmalarında AH26 kanal dolgu patının hücreler üzerinde sitotoksik etkisinin olduğu gözlenmiştir (14, 35, 67, 96, 141, 196). AH26 ile temas eden hücrelerin normal morfolojilerinden saptığı, bir kısmının yuvarlaklaştığı bir kısmının ise çizgi halinde gözlendiği bildirilmiştir. 24 saat içinde de tüm hücrelerin öldüğü saptanmıştır (139). İmmun sistemin önemli komponentlerinden olan T lenfosit hücrelerinin sayılarında ise anlamlı derecede azalma gözlenmiştir (22). Çalışmalar AH26 kanal patının genotoksik etkisi olduğunu, hücrelerde DNA hasarı meydana getirdiğini göstermiştir (53, 97, 98, 178, 194) AHPlus Plastik esaslı, epoksi reçine kökenli bir pattır (37). AHPlus (DeTrey Denstply, Konstanz, Almanya), AH26 nın epoksi amin kimyası korunarak, renklenme eğilimi ve formaldehitin açığa çıkışı azaltılarak geliştirilmiştir (5, 37, 110). Pata gerektiğinde sökülebilmesi için termoplastik özellik kazandırılmıştır. AH26 daki toz/likit sistem yerine eşit hacimde kullanılan çift patlı sistem şeklinde sunulmuştur. Çalışma süresi 23 C de minimum 4 saattir. Donma süresi 37 C de 8 saattir. Radyoopasitesi AH26 ya göre arttırılmıştır (206). Patın içeriği tablo 4 te görülmektedir. Diepoksiye ilave olarak radyoopak doldurucular ve xlix

50 aerosil içermektedir (5). AHPlus ağırlık olarak %76 doldurucu içerir (5). Patın büzülmesi ve erirliği AH26 ya göre azaltılmış olup, AHPlus ın, çözünürlüğünün kalsiyum hidroksit içerikli patlara göre az olduğu gösterilmiştir (173, 135). Epoksid Patı Diepoksid Kalsiyum tungstat Zirkonyum oksit Aerosil Pigment Aerosil Amin Patı 1-adamantane amin N,N'-dibenzyl-5-oxa-nonandiamin-1,9 TCD-Diamin Kalsiyum tungstate Zirkonyum oksit Silikon yağı Tablo 4: AHPlus kanal patının içeriği (5) Yapılan sızdırmazlık çalışmalarında AHPlus ın dentine adaptasyonunun ve örtüleme yeteneğinin iyi olduğu saptanmıştır (140, 142, 183). Patın antibakteriyel etkinliği konusunda yapılan bazı araştırmalar çeşitli bakteriler üzerinde etkin olduğunu savunurken, bazıları ise antibakteriyel etkinliğinin olmadığını yada çok az olduğunu ileri sürmüştür (71, 110, 119, 138, 157). AHPlus kanal dolgu patının biyouyumluluğunu araştıran bazı çalışmalar, bu patın, çeşitli hücre hatlarında sitotoksik ve genotoksik etkilerinin olduğunu saptarken, bazı çalışmalar ise AHPlus ın genotoksik etkisinin olmadığını belirtmişlerdir (35, 96, 97, 98, 121, 139, 141, 175, 176, 177, 194). AHPlus ın ve A (epoksi patı) ve B (amin patı) patlarının hücre canlılığını azalttığı saptanmıştır (179). 1.6 Biyouyumluluk l

51 Biyouyumluluk; canlı dokuya yerleştirilen bir maddenin, çevresindeki dokunun yada organizmanın yaşamını veya sağlığını kötü yönde etkilemeden kullanım amacına uygun fonksiyon gösterme kabiliyeti olarak tanımlanabilir (80). Bir malzemenin biyouyumluluğuna etki eden birçok faktör bulunmaktadır. Bu etkenler; malzemenin fiziksel ve kimyasal yapısı, doku ile temasının şekli, yeri ve dokunun özellikleridir. Aynı zamanda bir malzemenin biyouyumluluğu; genotoksisite, mutajenite, karsinojenite, sitotoksisite veya mikrobiyal etkenler gibi birçok parametre ile karakterizedir (37, 80). Apeksifikasyon ve kök kanal tedavisinde kök kanallarının yıkanması ve doldurulması sırasında farklı içerikli birçok materyal kullanılmaktadır. Bu materyallerin biyouyumlu olmaması, temasta olduğu bölgedeki hücrelerin yapısında, proliferasyonunda, adezyonunda, enzim sistemlerinde ve dolayısıyla tüm yaşamsal fonksiyonlarında dejenerasyonların meydana gelmesine neden olmaktadır (37) Stres ve zararlı uyaranlara karşı oluşan hücresel cevaplar Normal bir hücrenin, fonksiyon ve yapısı metabolizmanın genetik programı tarafından oldukça sınırlandırılmıştır. Farklılaşma ve özelleşme, komşu hücrelerin etkisi ve metabolik substratların kullanılabilmesi ile ortaya çıkmaktadır. Ciddi fizyolojik stresler ve patolojik uyaranlar, fizyolojik ve morfolojik hücresel adaptasyonlara yol açabilirler (117). Bu adaptasyonlar hücre sayılarında artış, hücre sayılarında ve fonksiyonlarında azalma veya hücre boyutunda artış şeklinde olabilir. Bu şekilde de hücreler canlılıklarını ve fonksiyonlarını sürdürürler (117, 193). Eğer uyaran, hücrenin adaptasyon yeteneğinin sınırlarını aşıyorsa veya hücre zararlı ajana doğrudan maruz kalmışsa hücre hasarı meydana gelir. Hücre hasarı birçok nedenle oluşabilir: li

52 1. Oksijen seviyesinde azalma 2. Fiziksel ajanlar 3. Kimyasal ajanlar ve ilaçlar 4. Enfeksiyon ajanları 5. İmmunolojik reaksiyonlar 6. Genetik bozukluklar 7. Besin dengesizlikleri Hücre hasarından sorumlu biyokimyasal mekanizmalar oldukça karmaşıktır. Hücre hasarını biçimlendiren prensipler şunlardır: 1. Zedeleyici uyarana karşı verilen hücresel yanıt, hasarın tipine, süresine ve şiddetine bağlıdır. 2. Hücre hasarının sonuçları, hasar gören hücrenin tipine, durumuna ve adapte olabilme yeteneğine bağlıdır. 3. Hücre hasarı, bazı önemli hücresel komponentlerde meydana gelen fonksiyonel ve biyokimyasal anormallikler sonucunda oluşabilir. Bu komponentlere örnek olarak, mitokondride gerçekleştirilen ATP sentezi, hücrenin iyonik ve ozmotik dengesini koruyan hücre membranı, protein sentezi ve hücrenin genetik aparatının bütünlüğü verilebilir (117). Hücre hasarı bir noktaya kadar geriye dönüşümlüdür. Bu tür hücre hasarı, fonksiyonel ve morfolojik değişiklikler şeklinde kendini gösterir. Hücre içinde oksijen seviyesi azalır, ATP sentezi baskılanır ve iyon dengesinin bozulmasına bağlı olarak hücre içine su girer ve hücrenin şişmesine neden olur. Uyaran kalıcı veya başlangıçtan beri şiddetli ise geriye dönüşümsüz hücre hasarı oluşur ve hücre iyileşemez. Bu tür hücre hasarında, tüm hücresel membranlar hasara uğrar, lizozomlar şişer ve ATP sentezi azalması ile birlikte mitokondrinin vakuolizasyonu meydana lii

53 gelir. Ekstrasellüler kalsiyum hücre içine girer ve intrasellüler kalsiyum depoları serbest kalır. Bu durum membranları, proteinleri, ATP yi ve nükleik asitleri parçalayan enzimlerin açığa çıkmasına neden olur. Sonuç olarak hücre hasarı sonucu hücre ölümü meydana gelir (Şekil 8) (117, 193). Apeksifikasyon ve kök kanal tedavilerinde kullanılan kanal yıkama solüsyonları ve kök kanal dolgu patları periapikal hücrelerde stres ve zararlı uyaran oluşturan materyallerdir. NORMAL HÜCRE Stres ADAPTASYON Adapte olamama Zararlı uyaran HÜCRE HASARI HÜCRE ÖLÜMÜ Şekil 8: Stres ve zararlı uyaranlara karşı hücresel cevap aşamaları (117) Hücre ölümünün gerçekleşmesi iki yolla olur. Bu yollar apoptozis ve nekrozistir. Nekrozis, kimyasal hasar ve iskemi gibi anormal stresler sonrasında oluşan hücre ölümü tipidir ve her zaman patolojiktir. Apoptozis ise, hücre içinde kontrol edilen intihar programının işlevsel hale gelip hücrenin ölmesi ile meydana gelir. Bu hücre ölümü tipi embriyogenezis ve fizyolojik süreçler sırasında istenmeyen hücrelerin elimine edilmesi için dizayn edilmiştir. Aynı zamanda tamir edilemeyecek kadar zarar görmüş hücrelerde ve özellikle hasar, hücrenin çekirdeksel DNA sında meydana gelmiş ise apoptozis oluşur (Şekil 9) (117, 193). ZARARLI UYARAN GERİYE DÖNÜŞÜMLÜ HÜCRE HASARI Geriye dönüşümsüz nokta liii Geriye dönüşümlü aşama?

54 NEKROZİS APOPTOZİS Şekil 9: Hücre hasarı ve ölümünün gelişim aşamaları (117) Bazı tip uyaranlar apoptozis veya nekrozisi indükleyebilir. Bu durum uyaranın yoğunluğuna, süresine, ölüm sürecinin hızına ve hasarlı hücredeki biyokimyasal düzenin bozulmasının indüklenmesine bağlıdır. Eğer uyaran hücresel membranlarda ciddi hasar oluşturmuş ise, lizozomal enzimler sitoplazma içine dağılır. Asit hidrolazlar, intrasellüler ph ı düşürür, sitoplazmik ve nüklear komponentleri parçalar. Hasarlı hücre çözünür ve hücresel içerik dışarıya sızar. Hücre ölümü nekrozis ile sonuçlanır (117). Hücrede DNA hasarı meydana getiren bazı zararlı uyaranlar da apoptozisi indükler. Bu ölüm şekli, hücrenin membran bütünlüğü bozulmaksızın meydana gelen nuklear bozulma ile karakterizedir. Nekrozis her zaman patolojik bir süreç olmasına rağmen, apoptozis birçok normal fonksiyonlarını yerine getirebilen ve her zaman hücre hasarı ile birlikte olmayan bir süreçtir (117, 193) Biyouyumluluk testleri İn vitro biyouyumluluk testlerinin amacı, vücut dokuları üzerine veya içine yerleştirildiklerinde malzemelere karşı oluşacak biyolojik reaksiyonun test ortamında oluşturulmasıdır (96). Biyomateryallerin biyouyumluluk özelliklerini taşıyıp taşımadıklarını test edebilmek için bir takım standart test yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntemlerle genel anlamda biyomateryallerin insan ve hayvan sağlığı bakımından güvenilirliği test edilmektedir. ISO Medikal Cihaz Test Yönetmeliğ inde medikal cihazların biyouyumluluğu birkaç başlık altında test edilmektedir. Test yöntemleri genel olarak; genotoksisite, karsinojenisite, üreme liv

55 toksisitesini, materyalin kan ile uyumluluğunu, in vitro sitotoksisitesini, implantasyon sonrası lokal etkilerini, etilen oksit sterilizasyonu sonrası kalıntıları, materyalin irritasyon özelliğini, sistemik toksisiteyi, polimer yapılı materyallerin degredasyon ürünlerini belirlemek üzere tasarlanmışlardır (23). ISO10993 standartlarına göre bir malzemenin klinik kullanımından önce aşağıdaki testlerin yapılması gerekmektedir (23): 1. Başlangıç değerlendirme testleri; Bu testler, sitotoksisite, duyarlılık, irritasyon, sistemik toksisite (akut toksisite), intrakutanöz reaktivite, subkronik toksisite, genotoksisite, implantasyon ve kan biyouyumluluk testlerini kapsamaktadır. 2. Ek değerlendirme testleri; Bu testler ise, kronik toksisite, karsinojenite, üreme ve gelişimsel toksisite ve biodegradasyon testleridir (23). Sitotoksisite testleri, test malzemesinin uygun hücre kültüründeki hücre büyüme oranı ve morfolojik özellikleri üzerine etkisinin negatif ve pozitif kontrol grupları kullanılarak değerlendirildiği in vitro testlerdir (23). Dental malzemelerin biyouyumluluklarının araştırılması, materyal komponentlerinin hücre sistemi üzerindeki etkilerini bulmaya olanak tanır (67, 86, 96, 179). Bu testleri gerçekleştirebilmek için çeşitli devamlı ve primer hücre hatları kullanılır (67, 96, 116, 179). Sitotoksisite testlerinde genellikle materyallerin (31, 122, 139, 141, 160, 179); 1. Hücre sayısı veya büyümesi 2. Hücre membran bütünlüğü 3. Biyosentez veya enzim aktivitesi 4. Hücre morfolojilerindeki değişiklikler 5. Hücre genetik malzemesi üzerindeki etkileri ölçülür. Hücre kültürü, bir dokudan spontan migrasyonla ya da mekanik veya enzimatik yöntemlerle ayrılmış, in vitro şartlarda yaşatılan ve üretilen tek tip hücre topluluğudur (47, lv

56 124). Hücre kültürleri, canlı hücrelerin vücut dışında yaşatılmasını, sürekli üretimini ve gelişimini ifade etmektedir. İzole hücre popülasyonlarının pek çok fiziko-kimyasal ve fizyolojik değişkenlerden uzak olarak incelenebildiği bir araçtır (134). Canlı yapılardan elde edilen hücreler, ısı, oksijen ve karbondioksit konsantrasyonu, ph, osmolarite ve besin gibi in vivo koşulları taklit eden hücre kültür ortamlarında çoğaltılmaktadır (48). Hücrelerin çoğalabilmek için ihtiyaç duydukları besinler besiyerleri tarafından sağlanır. Besiyerleri, hücresel ihtiyaçları karşılayan ve hücrelerin üremesine izin veren komponentlerden oluşmaktadır (29, 48). Bu komponentler; dengelenmiş tuz solüsyonları, tamponlama sistemleri, karbonhidrat gibi enerji kaynakları, nükleik asitlerin sentezlenebilmesi için amino asitler, hormonlar ve büyüme faktörleri, proteinler ve peptidler, yağ asitleri ve lipidler, demir, çinko, bakır ve selenyum gibi iz elementler, antibiotikler ve embriyo kaynaklı doku ekstratlarıdır (29). Hücre kültürleri temel olarak hücre yapısı, çoğalma ve tamir mekanizmalarının değerlendirilmesinde kullanılmaktadır. Bunların yanı sıra moleküler biyoloji, viroloji ve toksikolojide farklı maddelerin etkinliklerinin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılır. Tıp alanında, farmatoksikolojide ilaçların hücreler üzerindeki etkilerinin belirlenmesinde, kanser ve nörolojik hastalıkların mekanizmalarının anlaşılabilmesinde ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde yararlanılmaktadır (208). Dişhekimliğinde ise sıklıkla, dental materyallerin hücreler üzerinde meydana getirdikleri sitotoksik ve genotoksik etkileri araştırmak için kullanılır (80). Hücre kültürlerinin biyouyumluluk çalışmalarında kullanılma nedenleri (29, 67, 68, 80, 96, 160, 213); Isı, ph, osmotik basınç, oksijen ve karbondioksit tansiyonu gibi çevre şartlarının kontrol altında olması. Aynı pasaj düzeyindeki hücreler kullanılarak homojen materyal kaynağı sağlanması, lvi

57 Düşük dozda ve kesin konsantrasyondaki test edilen ajanla hücrenin doğrudan temas edebilmesi, Bireysel faktörlerden etkilenmemeleri, Tekrarlanabilme özellikleri, Ara aşamalarında kontrollerinin kolay olması, Malzemeler arasında parametrik karşılaştırmalara olanak tanımaları, Hayvan deneylerinde olduğu gibi canlı varlıkların öldürülmemesidir. İn vivo şartlarda ise, test edilen ajanı, hücre kültürlerinde olduğu gibi, direkt olarak belli bir hücre tipine, belli bir konsantrasyonda uygulamak ve cevabını değerlendirmek zordur. Ancak hücre kültürü yöntemlerinin bazı dezavantajları vardır (124, 208); İn vivo hücreler diğer tip hücrelerle ilişki ve etkileşim içindeyken in vitro şartlarda bu hücrelerden izole edilmişlerdir, Büyük miktarlarda hücre üretmek çok zaman alır ve pahalıdır, Hücre kültürlerinin bakteriler tarafından kontamine olmaması için belirli kurallara uyularak çok titiz çalışılması gerekir. Farklı dokulardan üretimi sağlanan hücre kültürleri devamlı ve primer hücre kültürleri olarak iki ana grup altında toplanabilir (134). Primer/diploid hücre kültürleri, bütün veya ayrılmış doku veya organ parçalarından elde edilirler. Kültüre edilecek hücrelerin durumu ve kültürdeki davranışları üretilecekleri doku kaynağından etkilenirler. Bu nedenle primer/diploid kültürlerin hangi doku kaynağından elde edileceği önemlidir. Primer/diploid hücre kültürleri; 1. Normal (sağlıklı) veya tümöral dokulardan 2. Yetişkin veya embriyo dokularından 3. İnsan veya hayvan dokularından elde edilirler. lvii

58 Tümoral doku kaynaklı primer/diploid hücre kültürleri patolojik değişikliklere açık olan kültürlerdir. Hücresel cevaplar sağlıklı hücrelerden farklı olacaktır. Bu nedenle araştırmalar için sağlıklı dokudan üretilen primer kültürler daha uygun olmaktadır. Embriyo dokularından elde edilen primer/diploid kültürdeki hücrelerin yüksek bölünme, üreme potansiyeli vardır. Ancak bazı durumlarda yetişkin ve embriyodan alınan aynı doku örneklerinden (örn: karaciğer) üretilen hücrelerin fenotipleri farklıdır. Bu nedenle aynı dokudan üretilmelerine rağmen kültürde farklı davranışlar sergilemektedirler. Aynı zamanda insan fötal dokuları ile çalışmak etik açıdan çok zordur. Bu sebeplerle yetişkin kaynaklı dokular ile çalışmak daha uygundur. Birçok araştırmacı, daha fazla materyal elde etmek, etik yaklaşımlar ve çalışma şartlarının daha kolay olmasından dolayı insan kaynaklı primer/diploid hücreler ile çalışmaktansa, hayvan kaynaklı hücreler ile çalışmayı tercih etmektedir. Ancak farklı türlerden (insan veya hayvan) elde edilen hücrelerin biyokimyasal karakterleri de farklı olmaktadır (124). Araştırmacı, çalışmasında insan hücrelerinin davranışlarını araştıracak ise insan kaynaklı primer hücre kültürleri daha uygun olacaktır (31, 80, 96, 124). Primer/diploid hücre kültürleri yaşam süreleri sınırlı hücre hatlarıdır. Belli bir zaman periodunda çoğalma yetenekleri vardır. Bu zaman periodunun uzunluğu hücrelerin tipine, vericinin yaşına ve açıklanamayan birçok nedene bağlıdır. Primer hücre kültürleri ilk pasajdan sonra bir kültür ortamından diğerine taşınırlar. Bu işleme subkültür adı verilir. Yeni üretilen hücre kültürleri aynı fonksiyonel özelliklere sahip hücre hatlarını oluştururlar. Hücreler üredikçe ve pasaj sayıları arttıkça özelliklerini yitirirler ve ölürler (124, 134). Bu nedenle çalışmalarda sınırlı pasajlar arasındaki hücre kültürleri kullanılır (31, 67, 96, 111). Primer/diploid kültürlerin en büyük avantajı, dokunun fizyolojik durumunu yansıtmaları, genotip ve fenotip olarak orijinal doku hücresi ile aynı özellikleri içermeleridir. Ancak üretilmeleri pahalı, zaman alıcı ve yaşam süreleri kısadır (124). lviii

59 Devamlı hücre kültürleri, limitsiz yaşam süreleri olan ölümsüz hücre popülasyonlarıdır. Devamlı olarak kültüre edilebilirler. Transformasyonları nedeniyle fizyolojik ve genotipik özelliklerinin tümünü koruyamazlar (134). Apeksifikasyon ve kök kanal tedavilerinde kullanılan yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının hücre kültürleri üzerindeki sitotoksik ve genotoksik etkilerini değerlendirmek için birçok farklı devamlı ve primer/diploid hücre hatları kullanılmıştır. Çalışmalarda kullanılan devamlı hücre hatlarına örnek olarak; L929 fare deri fibroblastı, 3T3 fare fibroblastı, V79 çin hamster hücreleri, insan servikal karsinoma hücreleri (HeLa), primer insan hücrelerine örnek olarak da; insan periodontal ligament fibroblastları (HPDLF) dişeti fibroblastları, insan osteoblastik hücre hatları (U2OS) verilebilir. (21, 35, 67, 86, 96, 116, 139, 176, 190, 196). 3T3 hücre hattı: Hücre kültürü biyouyumluluk çalışmalarında sıklıkla kullanılan, fare embriyolarından elde edilen devamlı hücre hattıdır (34, 74, 121, 127, 171, 175). Bu hücreler kültür kabı tabanında tek tabaka halinde yayılırlar ve kültür kabı tabanına yapışarak ürerler (monolayer kültür). Bu hücre hattı sarkoma ve lösemi virüslerine karşı hassastır. DNA transfer çalışmalarına uygundur. Hepatit B yüzey antijenin tanımlanmasında kullanılmıştır (34, 134). Yağ depolama yetenekleri vardır (134). Bu hücreler farmatoksikoloji çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. 3T3 hücreleri, içinde, %10 fötal dana serumu olan DMEM (Dulbecco s modified Eagle medium) besiyerinde kültüre edilirler (34). lix

60 Şekil 10: 3T3 hücrelerinin ışık mikroskobunda görünümü (10X büyütme, Olympus, Japonya) İnsan periodontal ligament hücreleri (HPDLF): Periodontal ligament, diş kökünü saran ve kemiğe bağlayan bir bağ dokusudur. Dişeti bağ dokusu ile devam eder ve kemiğin içindeki vasküler kanallarla birleşir. Bu doku; hücreler, bağ dokusu fibrilleri, hücreler arası madde, kan ve lenf damarları ve sinirlerden oluşmuştur. Periodontal ligament hücreden zengin bir dokudur. Periodontal boşlukta bulunan hücrelerin çoğu aktif ve fonksiyonel durumdadır. Fibrilogenesis, sementogenesis ve osteogenesisde rol oynarlar. En fazla bağ dokusu hücreleri olmak üzere epitel, savunma ve nörovasküler hücreleri içerir. Periodontal ligamenttedeki bağ dokusu hücreleri; fibroblastlar, osteoblastlar, osteoklastlar ve sementoblatlardır. Periodontal ligamentin ana hücreleri olan fibroblastlar tip I kollagen, kollagen olmayan protein, proteoglikan ve glikosaminoglikan sentezinden sorumludur. Kollagen, farklı aminoasitler içeren bir proteindir. İçeriğinde bulunan en önemli aminoasitler glisin, prolin, hydroksilin ve hydroksiprolin dir. Fibroblastlar uzun aksları kollajen fibrillere paralel olacak şekilde konumlanmışlardır (15, 28, 130). Periodontal ligamentte bulunan fibroblastların farklı fenotipte ve farklı fonksiyonları olan birçok alt grubu vardır. Bu özellikleri ile diğer bağ dokusu hücrelerinden ayrılırlar. Işık ve elektron mikroskobu altında benzer görünmelerine rağmen farklı tipte kollagen sentezi gibi fonksiyonları vardır. Bu hücrelerin bir tipi klasik yumuşak doku fibroblastları gibidir; dermis lx

61 ve gingiva fibroblastlarına benzer. İkinci tipi ise osteoblast benzeridir; Yüksek alkalen fosfat içerir ve kültürde mineralize doku oluşturabilme yeteneğindedir. Osteoblastik fenotipte olanlar özellikle önemlidir. Sementoblastlara dönüşüp Sharpey lifi üretebildikleri düşünülür (28). Periodontal ligamentin rejenerasyon yeteneği vardır. Fibroblastlar ligamentin devamlılığını ve tekrar biçimlendirilmesini sağlarlar (130). Çalışmalarda HPDLF ların kollagen, protein ve fibronektin ürettikleri in vitro olarak gösterilmiştir (130, 187). Ayrıca alkalen fosfat seviyelerinin yüksek olduğu saptanmıştır (73). HPDLF hücreleri hücre kültürü ortamında birbirine paralel, bipolar iğ şeklinde görülmektedir. Monolayer üreme gösterirler (15). Şekil 11: HPDLF ların ışık mikroskobunda görüntüsü (40X büyütme, Olympus, Japonya) HPDLF hücrelerinin in vitro üretilmesinde iki temel teknik vardır. Birinci teknikte, kök yüzeyinden alınan periodontal ligament dokusunun enzimle muamele edilmesiyle hücrelerin yüzeyden ayrılması sağlanır; ikinci teknikte ise, kök yüzeyinden kazınan periodontal ligament dokusu daha küçük parçalara ayırılır ve besiyerinde bekletilerek çoğaltılır (124, 187). Mekanik ayırma, enzimatik ayırmaya göre daha hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Ancak hücrelere lxi

62 daha fazla zarar verir ve sonuçta hücrelerin iyileşme oranı düşer (124). HPDLF larıyla oluşturulan primer/diploid kültürler monolayer ve yaşam süresi sınırlı kültürlerdir. Araştırmacılar, dental materyallerin biyouyumluluklarının araştırılmasında hedefe yönelik hücre hatları kullanılması gerektiğini belirtmişlerdir. Bu nedenle primer/diploid hücre kültürlerinin, devamlı hücrelere oranla dental materyallerinin sitotoksisitelerinin değerlendirilmesinde daha etkili olacağı düşünülmektedir (68, 80, 124). Dental materyallerin biyouyumluluklarını değerlendirmek için kullanılacak hücre hatlarının seçiminin yanı sıra, test edilecek biomateryal için hazırlanacak test düzeneğinin belirlenmesi ve kullanılacak hücre kültürü sitotoksisite testlerinin seçimi önemlidir (190). Yapılan çalışmalarda, kanal yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının biyouyumluluklarının değerlendirilmesinde farklı test düzenekleri kullanılmaktadır. Bu test düzenekleri (103, 190, 213) : 1. Ekstraksiyon yöntemi 2. Bariyer yöntemleri 3. Test edilecek materyalin direkt hücre kültürü ortamına uygulanmasıdır. Ekstraksiyon yöntemi; Kanal dolgu patları gibi katı materyaller için uygun bir yöntemdir. Test edilecek kanal dolgu patları belirlenen miktarlarda hazırlanıp hücre besiyerinde belirlenen sürelerde (örn: 1, 24 saat, 3 gün) %5 CO 2 içeren rutubetli etüvde 37 C de bekletilir. Böylece katı materyeller içindeki sitotoksik komponentlerin çözülerek besiyerinde birikmesi sağlanır. Test sürelerinin sonunda elde edilen katı materyel ekstraktları hücreler üzerine uygulanır ve belirlenen sürelerde %5 CO 2 içeren rutubetli etüvde 37 C de bekletilir. Bu süre sonunda da seçilen bir test yardımıyla materyalin hücre aktivitesi üzerindeki etkisi saptanır (103). Ancak bu yöntemde her zaman hücre besiyerinde çözünmeyen materyel komponentleri bulunabilir. Bu nedenle etanol, alkol gibi farklı lxii

63 çözgenler kullanılması gerekebilir. Bu çözgenlerin de hücreler üzerinde sitotoksik etkisi gözardı edilmemelidir (190). Bariyer yöntemleri; Bu yöntemlerde hücreler ve test edilecek materyeller arasında bir bariyer bulunmaktadır. Amaç benzer in vivo koşullar yaratmaktır. Sıklıkla kullanılan bariyerler agar veya agarose ve değişik boyutlarda porlar içeren polikarbonat membranlı özel hücre kültürü sistemleridir (134, 103). Agar/agarose testleri kanal dolgu patları gibi katı ve yıkama solüsyonları gibi sıvı materyeller için kullanılır. Bu yöntemde sıvı materyellerin etkileri filtre kağıdına emdirilmeleri ve agar/agarose içine yerleştirilmeleri ile belirlenir. Membranlı özel hücre kültürü sistemleri ise katı materyeller için uygundur. Her iki yöntemde de test edilecek materyel belirlenen miktarda hazırlanıp bariyerler üzerine yerleştirilir. Test süresinin sonunda herhangi bir test yöntemi ile materyellerin hücre aktiviteleri üzerine olan etkileri saptanır (103, 134). Test edilecek materyelin direkt hücre kültürü ortamına uygulanması; Bu yöntem sıvı ve katı materyaller için uygundur. Katı materyeller belirlenen miktarlarda hazırlandıktan sonra ya direkt daha önceden hücre kültürü kaplarına ekilmiş olan hücreler üzerine yerleştirilir ya da önce materyel hazırlanıp kültür kabı tabanına yerleştirilir ve üzerine hücreler ekilir (103). Sıvı materyeller ise test edilecek konsantrasyonlarına sulandırılarak getirilip daha önceden kültüre edilmiş olan hücreler üzerine tatbik edilir (127, 171, 213). Yapılan çalışmalarda yıkama solüsyonlarının sulandırılmasında hücre besiyeri ve steril distile su kullanılmıştır (127, 171, 213). Hücre kültürü sitotoksisite testlerinin temeli, hücrenin bir materyale karşı canlılık ve yaşamını sürdürme (survival) belirtilerine dayanır. Canlılık, hücrelerin yaşamını sürdürebilecekleri düşüncesine dair anlık parametredir. Hücrelerin yaşamını sürdürmeleri ise, üremelerini devam ettirebilmeleri şeklinde tanımlanır. Bir materyelin sitotoksik etkisini belirlemek için kullanılan testler (24); lxiii

64 Tekrarlanabilir olmalı, Test edilen konsantrasyonların doz-cevap eğrisini vermeli, Hücre sayısı ve test cevabı arasında doğrusal ilişki olmalı, Test sonucunda ortaya çıkan doz-cevap eğrisi in vivo koşullara yorumlanabilmelidir. Dental materyallerin sitotoksisite testlerinde sıklıkla monolayer kültürler kullanılmaktadır. Bu yöntemin avantajı, diğer teknikler ile karşılaştırıldığında oldukça az sayıda hücre ile uygulanabilmesidir. Ayrıca geniş konsantrasyon aralıklarının test edilmesine olanak tanıyan mikrotitrasyon testlerinde kolaylıkla kullanılır. Materyallerin sitotoksik etkileri mikrotitrasyon plaka okuyucuları kullanarak spektrofotometrik olarak değerlendirilir (24). Hücre kültürü çalışmalarında apeksifikasyon ve kök kanal tedavilerinde kullanılan yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının sitotoksik etkilerini değerlendirmek amacı ile hücre canlılığına dayalı birçok sitotoksisite test yöntemi kullanılmaktadır. Canlılık testleri, toksik etki sonucu kültürde canlı kalan hücrelerin oranını belirler (24). Bu tip testlerde genellikle vital boyalar veya izotoplar kullanılır. Testlerde, eosin, nigrosin, tripan mavisi gibi bazı boyaların canlı hücre içine girememe yeteneklerinden, nötral red, diasetil floresan gibi bazı boyaların ve 51 Cr izotopunun canlı hücre içine girebilme yeteneklerinden yararlanılır (14, 24, 116, 127, 139, 141, 171). Boya almama yöntemi: Eosin, nigrosin, tripan mavisi gibi bazı vital boyalar canlı hücre içine giremez. Bu testlerde hücreler boya ile muamale edildikten sonra hemositometre kullanılarak optik mikroskopta incelenir. Boyanmamış hücreler (canlı) tüm hücre popülasyonunun yüzde oranı olarak ifade edilir (24, 127, 171). Bu yöntem, ölü hücreler kültür kabı tabanından ayrıldığı için, monolayer kültürlerdense süspansiyon kültürleri için uygundur (24). Boya alma yöntemi: Nötral red gibi bazı vital boyalar canlı hücre içine girebilir. Bu testlerde de hücreler boya ile muamale edildikten sonra hemositometre kullanılarak optik lxiv

65 mikroskopta incelenir. Boyanmış hücreler (canlı) tüm hücre popülasyonunun yüzde oranı olarak ifade edilir. Bu yöntem akış sitometrisi ve mikrotitrasyon plakaları için adapte edilebilir. Örneğin nötral red boyasının kültürdeki canlı hücreler içine girebilme özelliğinden yararlanılarak mikrotitrasyon plaka okuyucuları kullanarak spektrofotometrik olarak test materyellerinin sitotoksik etkileri değerlendirilir (24). Floresans methodu: Diasetil floresan canlı hücreler içine girebilen ve floresana hidrolize olabilen bir boyadır. Bu yöntemde, canlı hücreler floresan yeşili, ölü hücreler ise etidyum veya propidium bromide kullanılarak floresan kırmızısı olarak izlenir. Canlılık aşağıdaki formül ile hesaplanır (24). % Canlılık = Canlı hücre sayısı Canlı+Ölü hücre sayısı X 100 Ancak bu yöntemde, floresan ve propidium iodide yi belirleyebilecek ışık kaynağına ve filtrelere sahip floresan mikroskobu veya akış sitometri cihazı gereklidir (24). Boya salma yöntemleri: Nötral red boyası gibi hücre içine girebilen vital boyalar ile yapılan bir testtir. Bu yöntemde hücre kültür kabı tabanını tümüyle kaplayan monolayer hücreler boya ile doyurulur ve besiyeri boya içermeyen besiyeri ile değiştirilir. Daha sonra hücreler test materyelleri ile 1 dakika boyunca temas ettirilir ve serbest boya uzaklaştırılır. Fiksasif ajan ilave edildikten sonra gözler içindeki solüsyonun optik yoğunluğu spektrofotometre yardımıyla ölçülür. Bu test, hücre membranında kısa sürede meydana gelen etkileri ölçmek için uygundur (24). İzotop salma yöntemleri: İndirgenmiş 51 Cr 3+ canlı hücreler tarafından alınıp, oksidasyon sonucu 51 Cr 2+ a dönüşür. Krom canlı hücrelerde proteinler içindeki aminoasitler ile kovalent bağlar yapar. Ölü hücreler 51 Cr 2+ mu serbest bırakır. Hücrelerin test materyelleri ile muamelesinden ve Na 51 2 CrO 4 ile işaretlenmesinden sonra besiyerinde 51 Cr salınımını tespit etmek için γ-sayımı yapılır. Toksisite, hücre ve besiyerindeki toplam γ-sayımının yüzde oranı lxv

66 olarak ifade edilir. Bu yöntem kesin olarak materyellerin sitotoksisiteleri hakkında bir sonuç vermez. Ancak test materyalleri arasında karşılaştırma yapmayı sağlar. Ayrıca bu yöntemlerde kullanılan radyoizotopların elde edilmesi güç olduğundan boya salma yöntemleri daha pratiktir (24). Genellikle hücrelerin bir materyele karşı sitotoksik cevap oluşturması için belli bir süre (saatler, günler) geçmesi gerekmektedir. Bu nedenle uzun dönemde hücrelerin canlılık durumlarını saptayabilmek için metabolizma testlerine ve protein içerik testlerine ihtiyaç duyulur. Bu testler, kısa dönem toksisiteden ziyade uzun dönemde oluşacak zararı anlamak için hücrelerin metabolik veya proliferatif kapasitelerini ölçerler (24). Protein içerik testleri: Bu testler, total hücresel materyelin ölçümü için uygundur. Aktif hücre sayısını vereceği düşünülür. Ancak hücre içindeki protein miktarı hücrenin hacmi ve hücre döngüsünde bulunduğu evreye bağlı olarak değişkenlik gösterir. Proteinin optik yoğunluğu 280 nm de direkt olarak belirlenebildiğinden kolorimetrik testlerin kullanılması daha uygundur. Protein içeriğini belirlemek içi sıklıkla [ 3 H]leucine veya [ 35 S]methionine gibi işaretlenebilen aimino asitler kullanılır (24). Metabolizma testleri: Hücre metabolizmalarında oluşan değişikliklerin tespit edilebildiği testlerdir. Toksik materyaller nedeniyle, solunum ve glikolizis metabolizmasında kullanılan oksijen ve üretilen karbon dioksit miktarında meydana gelen değişiklikler manometre kullanılarak belirlenebilir. Ancak bu testler çok zaman alıcıdır (24). Bunun yerine daha hızlı ve hücre sayısını indirekt olarak verebilen metabolizma testlerinin kullanımı daha uygundur. Metabolizma testlerinde 96-gözlü plakalara yerleştirilmiş hücrelerin canlılıkları mikroplaka okuyuculu spektrofometre yardımıyla tespit edilir. Bu yöntemler çok sayıda örneğin incelenmesine olanak veren, hızlı, besiyeri ortamı ve kullanılan plastik malzeme miktarını azalttığı için ucuz yöntemlerdir. Bu sitotoksisite test sistemlerinde kolorimetrik lxvi

67 yöntemler kullanılmaktadır (34). Bunlara örnek olarak MTT, NR ve XTT testleri verilebilir (24, 89, 159, 175, 214). MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) testi: MTT testi, hücresel proliferasyon, canlılık ve materyallerin sitotoksisite ölçümleri için geliştirilmiş kantitatif kolorimetrik bir testtir (89). Bu test; sarı renkte, suda çözünebilen tetrazolium tuzlarının (MTT) metabolizmaları aktif olan canlı hücreler tarafından alınması ve mitokondrial bir enzim olan succinate dehidrogenase tarafından parçalanarak mor suda çözülmeyen tetrazolium formazan yan ürünü salınması esasına dayanır (24, 89, 214). Formazan oluşumunun miktarı ile hücre hatlarındaki hücre sayısı doğru orantılı olduğundan, dental materyallerin hücreler üzerinde oluşturdukları sitotoksik etki sonucu geriye kalan canlı hücre sayıları MTT testi ile belirlenebilir (21, 42, 96, 98, 111, 214) (Şekil 12). Suda çözülmeyen formazan kristalleri DMSO (dimetilsülfoksit) veya başka bir organik çözgen (örn: isopropanol) içinde çözünebilir ve çözünen materyallerin optik yoğunlukları (absorbans) spektrofotometre ( nm) yardımı ile ölçülür. Elde edilen değer, hücre hattında metabolizmaları aktif olan hücre sayısı ile doğru orantılıdır (89, 214). Formazan kristalleri Formazan kristalleri Canlı hücre Ölü hücre Şekil 12: Hücrelerin MTT ile muamalesinden sonra oluşan formazan kristalleri (10X büyütme, Olympus, Japonya) lxvii

68 MTT testinde oluşan formazan kristallerinin yoğunluğu hücre hatlarına ve kültürün yaşına göre değişkenlik göstermektedir. Bu nedenle her hücre hattı için optimize edilmelidir. Ayrıca test, ph ve besiyeri glukoz değişimlerine hassas olduğundan titiz çalışılması gerekmektedir (214). Sitotoksisite testlerinde kullanılabilen diğer bir tetrazolium tuzu ise (2,3)-bis(2metoksi- 4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamin)-karbonil]-2H-tetrazolium hidroksit (XTT) dir. XTT koenzim-q ile hazırlanan solüsyonunun metabolizasyonu sonucu oluşan formazan, ek işlemler gerektirmeden suda çözünebilir yapıdadır. MTT testinde olduğu gibi spektrofotometre yardımıyla optik yoğunluk kolorimetrik olarak tespit edilir (85, 175, 176). Nötral red ( 3-amino-7-dimethyl-2-methylphenazine-hydro-chloride; NR) testi: NR, suda çözünebilen, zayıf katyonik, supravital bir boyadır (13, 159). Boyanın hücre içine girmesi plazma membranından pasif diffüzyon yolu ile olur (159). Canlı hücrelerin lizozomlarında birikme özelliği vardır. NR in lizozomlarda birikmesi; lizozomal matriks içindeki polisakkaritlere bağlanması veya lizozomal asitler tarafından tutulması ile oluşur. Zarar görmüş veya ölü hücrelerde NR sitoplazmik vokuollerde daha fazla tutunamaz ve plazma membranı NR i hücre içinde tutmak için bariyer görevi yapamaz (13, 214) (Şekil 13). Bu test aktif olarak üreyen hücreler için uygundur. Üremesi yavaşlayan kültürlerde lizozomal aktivitenin azalması nedeniyle hücre içine NR alınımı da azalacaktır (214). NR lizozomal enzim olan hexoseaminidase ın hücresel içeriğini ölçerek hücre sayısını belirler (134). lxviii

69 Canlı hücre Ölü hücre Şekil 13: Sitotoksik materyal ile muamele edilmiş 3T3 hücrelerinin NR boyaması (10X büyütme, Olympus, Japonya) Bu test, başlangıçta viral sitopatojenite ve immünotoksisite alanlarında kullanılmak üzere geliştirilmiş ve daha sonra hızlı, kolay, ekonomik, tekrarlanabilir ve hassas bir test olması nedeniyle in vitro sitotoksisite çalışmalarında hücre canlılığı ve hücrelerin kimyasal hassasiyetlerini değerlendirmek amacıyla kullanılmaya başlanmıştır (13, 159, 214). NR testi, test ajanlarının sitotoksik, sitostatik ve proliferatif etkilerini ölçebilir. Hücreler test ajanları ile muamele edildikten sonra NR içeren besiyeri ile değiştirilir ve canlı hücrelerin boyayı almaları için belli bir süre inkübatörde bekletilir (13). Ancak inkübasyon zamanı farklı hücre hatları için değişebilir. Bunun nedeni farklı doku kaynaklı hücrelerin lizozom sayılarının de farklı olmasıdır. Genel olarak 3±1 saat yeterli olmaktadır (214). Daha sonra NR içeren besiyeri uzaklaştırılıp hazırlanan çözgen solüsyon ile hücreler yıkanır ve mikroplaka okuyuculu bir spektrofometre yardımıyla 540 nm de optik yoğunluk ölçülür. Okunan optik yoğunluk canlı hücre sayısı ile orantılıdır (13) Apoptozis Hücre ölümüne yol açan iki ana mekanizmadan biri olan apoptozis (fizyolojik hücre ölümü ya da proglamlanmış hücre ölümü) organizmada fizyolojik koşullarda pek çok sistemin hemostazını (düzenini) sağlayan önemli bir mekanizmadır. Hücrelerin kendi kendilerini yok lxix

70 ettikleri programlı, aktif RNA/protein sentezine ve enerjiye gereksinim gösteren bu fizyolojik ölüm formu, patolojik bir hücre ölümü olan nekrozdan tamamen farklıdır. Apoptozis, yunancada apo (=ayrı) ve ptozis (=düşen) kelimelerinden oluşur ve sonbaharda yaprak dökümünü tanımlayan bir kelimedir. Embriyogenez ve farklılaşmanın yanı sıra normal hücre dönüşümü sırasında da meydana gelen apoptozis ekstrasellüler çevreden etkilenen bir biyokimyasal ve genetik olaylar dizisi olarak da tanımlanabilir. Apoptozisin önemi, çeşitli biyolojik olaylarda gereksiz, hasarlı ya da zararlı hücrelerin yok edilişini sağlamasından ve organizmanın iç dengesinin devamlılığına katkıda bulunmasından ileri gelmektedir. Her saniye yaklaşık bir milyon hücre apoptozisle vücuttan uzaklaştırılmakta ve bunların yerine yenileri yapılmaktadır. Yapım (mitozis) ile yıkım (apoptozis) arasında kontrollü bir denge vardır. İşte bu dengenin apoptozisin lehine veya aleyhine bozulması birçok önemli hastalığın patogenezine katkıda bulunur. Olmaması gerekirken gerçekleşen apoptozis veya hızlanmış ya da tam tersine yavaşlamış apoptozis organizma için tehlikelidir. Apoptozisin gereksiz yere oluştuğu veya hızlandığı hastalıklara örnek olarak AIDS, nörodejeneratif hastalıklar, insüline bağımlı tip diyabet, hepatit C infeksiyonu, miyokard enfarktüsü, ateroskleroz gibi hastalıklar verilebilirken; apoptozisin yavaşladığı hastalıklara örnek olarak ise otoimmün hastalıklar ve kanser verilebilir (54, 200) Tıp alanında apoptozisin uyarılması ya da baskılanmasıyla geliştirilebilecek değişik tedavi olanakları araştırılmaktadır. Örneğin, kronik enflamasyonda apoptozisin ilaç veya sitokinlerle regülasyonu sonucu lökosit yükünün kontrol altına alınması planlanmaktadır. Kanser kemoterapisinde tümör hücresi apoptozisinin desteklenmesi gelecekte önemli bir tedavi seçeneği olarak karşımıza çıkmaktadır. AIDS te lenfosit apoptozisinin engellenmesi bir tedavi şansı olabilir. Nöron hasarı veya artmış nöron ölümü ile birlikte seyreden nöroljik hastalıklarda yine apoptozu bloke ederek tedavi şansı aranabilir (54, 107). lxx

71 Apoptotik hücre ölümüne hem fizyolojik hem de patolojik etkenler yol açabilmektedir. Fizyolojik durumlarda meydana gelen apoptozis, gelişim sırasında ihtiyaç olmayan hücrelerin elimine edilmesinde kullanılan normal bir durumdur. Apoptozis aşağıdaki fizyolojik durumlarda karşımıza çıkmaktadır (107, 117, 193); 1. Embriyogenezis sırasında hücrelerin programlı yıkımı; örn: fetusun implantasyonu, organogenezis ve gelişim sürecinde yaşanan inovülasyon, 2. Yetişkinde hormanlara bağlı oluşan hücresel yıkım; örn: menüstrial döngü sırasında endometrial hücrelerin kopması, menapozda follikül atrezisi, laktasyonun kesilmesinden sonra meme bezlerinin regresyonu 3. Üreyen hücre populasyonlarında hücre sayılarını sabit tutmak için oluşan hücre yıkımı; örn: ince bağırsaktaki kripta epitel hücrelerinin belirli sayıda tutulması 4. Görevlerini tamamlamış konak hücrelerin ölümü; örn: akut enflamatuar cevapta görev alan nötrofiller, immun cevapta görev alan lenfositler. 5. Sitotoksik T hücreleri tarafından indüklenen hücre ölümü; virüs ve tümörlere karşı korunma mekanizmasıdır. Bu hücreler virüs tarafından enfekte olan ve neoplastik hücreleri yok ederler. Apoptozisin meydana geldiği patolojik durumlar ise şunlardır (107, 117, 193); 1. Çeşitli incitici etkenlerle oluşan hücre ölümü; örn: hipertermi, radyasyon, sitotoksik antikanser ilaçlar ve hipoksi. Radyasyon veya sitotoksik antikanser ilaçlar DNA ya hasar verir. Bu gibi durumlarda hücrenin eliminasyonu (apoptozis), hasarlı DNA da oluşacak mutasyon ve translokasyonları önlemek için meydana gelir. 2. Viral hastalıklarda oluşan hücre hasarı; örn: viral hepatit, 3. Kanal tıkanması sonucu parankimal organlarda patolojik atrofi; örn: pankreas, tükrük bezleri ve böbrekler. lxxi

72 4. Tümörlerde hücre ölümü; Sıklıkla gerileme fakat aynı zamanda aktif olarak büyüyen tümörlerde. Apoptozise giden hücrelerde birçok morfolojik değişiklikler meydana gelir ve en iyi şekilde elektron mikroskobu ile görüntülenebilir. Bu değişiklikler (107, 117, 150, 151) (Şekil 14); 1. Yüzey organellerinin kaybı: Mikrovilluslar, bağlantı noktaları gibi özelleşmiş yapılar ortadan kalkar ve yüzeyi yuvarlaklaşan hücrenin komşuları ile bağlantısı kesilir. 2. Hücre büzülmesi: Apoptotik hücre komşu normal hücreye göre daha küçük, sitoplazması daha yoğundur. Organelleri normal görünüşte olmakla birlikte daha sıkışık biçimde bir araya gelmiştir (Şekil 14). 3. Kromatin yoğunlaşması: Apoptozisin en karakteristik bulgusudur. Kromatin periferde nükleus membran altında toplanır, değişik boyut ve şekillerde iyi sınırlı yoğun kitleler haline gelir. Nukleus parçalanarak birkaç bölüme ayrılır. 4. Sitoplazmik baloncuklar ve apoptotik cisimlerin oluşması: Apoptotik hücrede önce yüzeye doğru tomurcuklanmalar olur, bunlar ayrılarak bazıları nükleus parçacıklarını da barındıran sitoplazma ve sıkı biçimde paketlenmiş organellerden oluşan membranla sarılı apoptotik cisimlere dönüşür (Şekil 14). Taramalı elektron mikroskop ile genişleyen düz endoplazmik retikulumun hücre yüzeyi ile birleştiği ve derin yarıklar oluştuğu gözlenir. 5. Apoptotik hücre ve cisimciklerin fagositozu: Komşu normal parankimal hücreler yada makrofajlarda gerçekleşir (Şekil 14). Parçalanma işlemi lizozomlarda süratle olur ve komşu hücre boşluğu doldurmak üzere yer değiştirir. lxxii

73 Apoptotik cisim Enzimatik sindirim ve hücresel içeriğin dışarı sızması NEKROZİS Fagosit APOPTOZİS Apoptotik hücre ve fragmanların fagısitozu Şekil 14: Apoptozis ve nekrozisin şematik görüntüsü (189) Apoptozisin son safhalarına kadar plazma membranları bütünlüklerini korurlar. Bu klasik tanım fizyolojik durumlarda ortaya çıkan apoptozis için doğrudur (Şekil 14). Bazı durumlarda uyarının özelliğinden çok, şiddeti hangi hücre ölümü tipinin gerçekleşeceğini belirler. Eğer nekrotik özellikler belirgin ise, erken dönemde plazma membranında hasar oluşur ve hücre büzülmesinden çok hücre şişmesi görülür (117). Genellikle patolojik etkenlerden kaynaklanan nekrotik ölümde hücre membranı ileri derecede hasar sonucu seçici geçirgenliğini kaybetmekte, hücre hızla şişip parçalanmakta, çevreye yayılan hücre bileşenleri inflamasyona yol açmaktadır. Nekrotik hücre ölümünün aksine, apoptotik hücrelerde mitokondrialar olağan görünümdedir ve bir akut inflamatuar yanıta yol açmazlar (107, 151). lxxiii

74 (Şekil 14). Apoptotik hücre özellikleri nekroz ile karşılaştırmalı olarak tablo 5 te sunulmuştur (107) ÖZELLİK NEKROZ APOPTOZİS Dağılım Komşu hücre grupları Dokuda tek tek dağılmış hücreler Nedenler Daima patolojik Fizyolojik-patolojik Eksüdatif yangı Yoktur, apoptozis hücresel ve Genellikle görülür immunite ile uyarılmışsa nötrofil makrofajlar bulunabilir. infiltrasyonu Erken: Kromatin kenarda Hücre sınırları düzensiz, bazofili yoğunlaşır. Bazılarında hücre, Işık mikroskobu kaybı, nükleusta piknoz, karyoreksis nukleus kalıntıları bulunan oval ya özellikleri ve karyolizis da yuvarlak eosinofilik partiküllere dönüşür. Kromatinin nükleus membranında yoğunlaşması, sitoplazmik Elektron mikroskobu özellikleri Hücre komponentlerinde şişme, organel ve plazma membranında parçalanma kromatin erime ve kaybı yoğunlaşma, hücre yüzeyinde kabartılar, nükleusun parçalanması, membranda tomurcuklanma ve organel içeren apoptotik cisimciklerin oluşması Mononükleer fagositik sistem Apoptotik cisimler, komşu hücreler tarafından fagositoz ve parçalanma, Hücre tarafından hızla alınır ve parçalanır. temizlenme süresi nekroz alanının kalıntılarının EM ile görülen apoptotik cisimlerin genişliği, mikrosirkülasyonun temizlenmesi çoğunda parsiyel degradasyon sürekliliği ve fagositlerin miktarına vardır. Yangısal reaksiyon yoktur. bağlıdır. Hücre bütünlüğünü sağlayan Mekanizma mekanizmaların incinme ile Makromolekül sentezini gerektiren bozulmasına bağlı ilerleyici kimyasal aktif hücresel yıkım olayı ve yapısal parçalanma Tablo 5: Apoptozis ve nekrozisin karşılaştırılması (189) lxxiv

75 Apoptozisin indüklendiği durumlar şunlardır (117, 200) ; 1. Hücre yüzey ölüm reseptörlerinin aktivasyonu, 2. Granzimlerin hücre ile etkileşime girmesi, 3. Büyüme faktörlerinin eksikliği, 4. Hücre DNA sının hasarlanması, Hücrede apoptozis çok sayıda ve çeşitte mediatörler (arabulucular) tarafından düzenlenir. Bunlar arasında, bazı iyonlar (kalsiyum), moleküller (seramid), genler (c-myc), proteinler (p53) ve hatta organeller (mitokondri) bulunmaktadır (117, 200) (Şekil 15). Şekil 15: Apoptoziste rol oynayan modülatörler ve efektörler (200). Bcl-2 ailesi, üyelerinin bir kısmının apoptozisi indüklediği (Bax, Bad, Bid, Bcl-Xs), bir kısmının ise inhibe ettiği (Bcl-2, Bcl-Xl) geniş bir ailedir. Hücrenin yaşayabilirlik durumu bu ailenin pro-apoptotik ve anti-apoptotik üyelerinin oranına bağlıdır. Oranın artması ya da azalması apoptozisin inhibisyonu veya aktivasyonu ile sonuçlanır. Bcl-2 özellikle mitokondri lxxv

76 dış membranında bulunmakta ve iyon geçişini düzenlemektedir. Bax sitozolde bulunur ve apoptotik uyarı alınması halinde mitokondri membranına bağlanır, burada küçük gözenekler pore oluşumunu indükler, böylece mitokondrinin selektif iyon permeabilitesi kaybolur, sonuçta sitokrom c ve apoptozis-indükleyici faktör olarak bilinen AIF ün mitokondriden sitozole çıkmasını sağlar (200). p53, hücrede bir şekilde (radyasyon, kemoterapi etkisiyle) DNA hasarı oluştuğunda, eğer hasar onarılabilecek düzeyde ise hücre siklusunu G1 fazında durdurur ve hücreye DNA sını tamir edebilmesi için zaman kazandırır. Eğer DNA hasarı tamir edilemeyecek kadar büyükse bu durumda p53 apoptozisi indükler. (200). Sitokrom c, mitokondri iç membranında bulunan elektron transport zincirinin bir proteinidir. Sitokrom c nin mitokondriden sitoplazmaya salıverilmesi apoptozis yoluna girmiş bir hücrede geriye dönüşümsüz bir döneme girildiğini işaret eder. Sitokrom c, mitokondriden apoptozis indükleyici faktör (AIF, apoptosis-inducing factor) ile birlikte sitoplazmaya salınır, sitoplazmik protein olan Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1) e bağlanır ve onu aktive eder, ardından ATP nin de katılımıyla apoptozom adı verilen bir kompleks oluşur. Bu kompleks inaktif olan prokaspaz-9 un aktif kaspaz-9 haline dönüşmesini sağlar. Aktif kaspaz- 9 ise efektör kaspazlardan prokaspaz 3 ü aktive eder. Aktif kaspaz 3, kaspazla aktifleşen deoksiribonükleaz inhibitörünü (ICAD, inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease) inaktifleştirir, böylece ICAD ünün bağladıgı kaspazla-aktifleşen deoksiribonükleaz (CAD, caspaseactivated deoxyribonuclease) serbestleşir ve bu da apoptozisin karakteristik bulgularından biri olan kromatin kondansasyonuna ve oligonükleozomal DNA fragmantasyonuna neden olur. Bcl-2 ve Bcl-x in hücrelerden salıverilmesi de direkt olarak Apaf-1 in aktive olmasını sağlayabilir (117, 200). Kaspaz ( caspase ) lar, inaktif olarak sitoplazmada bulunan ve aktif merkezlerinde sistein yer aldığından sistein proteazlar olarak adlandırılan bir grup enzimlerdir. Proteolitik lxxvi

77 olarak birbirlerini aktiflerler. Apoptozisde hücreyi parçalayan yani apoptotik morfolojinin oluşumunu sağlayan etkenler efektörler olarak bilinirler. Şimdiye kadar 14 tanesi tanımlanmıştır ve çoğu apoptozisde rol almaktadır. Kaspazlar birbirlerini aktifleştirerek proteolitik bir kaskad (şelale tarzı reaksiyon dizisi) a neden olurlar. Bazıları (Kaspaz 2, 8, 9, 10) başlatıcı kaspazlar olarak bilinirken bazıları da (Kaspaz 3, 6, 7) efektör kaspazlar olarak bilinir. Başlatıcı kaspazlar apoptotik uyarıyla başlayan ölüm sinyallerini efektör kaspazlara naklederler. Efektör kaspazlar ise ilgili proteinleri indükleyerek, apoptotik hücre morfolojisinin meydana gelmesine neden olurlar. Kaspaz kaskadı, sitokrom c nin sitoplazmaya salıverilmesiyle prokaspaz 9 un aktivasyonu yoluyla aktifleştirildiği gibi, kaspazlar da sitokrom c nin salıverilmesine neden olabilirler. Granzim (Granzyme) ler, patojenle enfekte edilmiş hücrelerin veya tümör hücrelerinin ortadan kaldırılmasında etkin rol alırlar.(117, 200). Apoptozisi başlatan yolların kesiştiği kavşak noktanın mitokondri olduğu görülmektedir. Bu yüzden mitokondrinin aktivasyonu (sitokrom c nin mitokondriden sitoplazmaya salıverilmesi) apoptotik süreçte geri dönülmez noktayı gösterir. Mitokondrinin aktivasyonuna yol açan en önemli faktör bcl-2 ailesidir. Hem pro-apoptotik hem de antiapoptotik üyeleri olan bu ailenin üyelerinin mitokondri üzerindeki etkileriyle ya sitokrom c nin sitoplazmaya salıverilmesi gerçekleşir (apoptozisin başlaması) veya sitokrom c nin sitoplazmaya salıverilmesi baskılanır (apoptozisin inhibisyonu) (117). Apoptozisin belli başlı aşamaları şu şekilde özetlenebilir (200); Apoptozisin indüksiyonu Hücre yüzey ölüm reseptörlerinin uyarılması Sitokrom c nin salıverilmesi Apoptozom oluşumu (sitokrom c+apaf-1 +kaspaz-9) Mitokondriyal transmembran potansiyelin degişmesi lxxvii

78 Kaspazların aktivasyonu Fosfatidilserinin hücre membranının iç yüzünden dış yüze transloke olması DNaz ın aktivasyonu sonucu DNA nın fragmantasyonu (internukleozomal DNA fragmentasyonu) Yapısal proteinlerin yıkılmasına bağlı olarak apoptozise özgü morfolojik değişikliklerin meydana gelmesi Apoptozisin saptanmasında kullanılan yöntemler Apoptozisi saptamak için çok çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Günümüzde morfolojik değerlendirmenin yanı sıra apoptozise özgü olduğu bilinen bazı aktivasyonların (örn. aktif kaspaz-3 tayini) moleküler düzeyde belirlenmesiyle de saptanabilmektedir. Apoptozisin belirlenmesinde kullanılan yöntemler aşağıda sıralanmıştır (169, 200): 1. Morfolojik görüntüleme yöntemleri 2. İmmunohistokimyasal yöntemler 3. Biyokimyasal yöntemler 4. İmmunolojik yöntemler 5. Moleküler biyoloji yöntemleri Morfolojik görüntüleme yöntemleri: Morfolojik olarak apoptozun saptanmasında ışık, floresan, elektron veya faz kontrast mikroskopları kullanılabilir. Işık mikroskobunda yapılacak incelemelerde hemotoksilen veya Giemsa boyaları kullanılır. Morfolojik görüntüleme yöntemleri içinde en ucuz ve kolay olanı hematoksilen ile boyamadır. Hematoksilen ile boyanan preparatlar ışık mikroskobu ile incelenir. Hem hücre kültürü çalışmalarında hem de doku boyamalarında kolaylıkla kullanılabilir. Hematoksilen boyası kromatini boyadığından apoptotik hücreler nukleus morfolojisine göre değerlendirilir. Bazı durumlarda mitotik hücreler ile apoptotik hücreler karıştırılabilir. Gözlenebilen değişiklikler, lxxviii

79 hücre küçülmesi veya sitoplazmik küçülme, kromatinin kondanse olması ve nukleus zarının periferinde toplanması, nukleusun küçülmesi veya parçalara bölünmesidir. (200). Giemsa ile boyamada hematoksilenle boyamada olduğu gibi nukleus morfolojisi esas alınarak apoptotik hücreler tanınır. Sitoplazma sınırları hematoksilen boyamaya göre daha iyi seçilebilmekle birlikte hematoksilen boyamaya belirgin bir üstünlüğü yoktur. Floresan mikroskobunda yapılacak incelemede hücre DNA sını boyayabilen floresan maddeler kullanılır. Floresan boyalar DNA ya bağlanabildiklerinden hücrenin kromatini dolayısıyla nukleusu görünür hale gelebilir. Floresan sistemler ışık mikroskopuna göre çok daha pahalıdır. Fakat, eğer hücre kültürü çalışmasında kullanılırlarsa, canlı hücre ile yaşayan hücrenin ayırımına ve hücrenin nekroz veya apoptoz sonucu öldüğünü anlamaya olanak tanır. Oysa, hematoksilen ya da Giemsa boyamanın kullanıldığı örneklerde hücrelerin tamamı yöntemin prensibi gereği zaten ölmektedirler. En sık kullanılan floresan DNA boyaları Hoechst boyası, DAPI, propidium iyodür, akridin oranj ve etidyum bromid tir (Tablo 6). Canlı ve ölü hücre ayrımını yapabilmek için, canlı veya ölü tüm hücreleri boyayabilen bir boya (örn. Akridin oranj) ile sadece ölü hücreleri boyayabilen bir başka boya (örn. etidyum bromid) beraber kullanılır. DNA ya Boyanın Girişi Boyanın Rengi Bağlanan Canlı Ölü Nükleus Sitoplazma Boyalar hücreler hücreler (DNA) (RNA) Akridin oranj + + Yeşil Kırmızı-turuncu Hoechst Mavi - Hoechst Mavi - DAPI - + Parlak mavi - Etidyum Bromid - + Turuncu Kırmızı Propidyum Iodid - + Kırmızı - Tablo 6: Apoptozisi belirlemede kullanılan boyalar (192, 200) Hücrelerdeki apoptotik değişiklikleri floresan mikroskop altında, akridin oranj etidyum bromid boyası kullanılarak göstermek mümkündür. Bu boya canlı ve ölü hücreler ile nukleusta ve hücre membranındaki nekroz veya apoptozise bağlı değişiklikler hakkında bilgi lxxix

80 vermektedir. Vital bir boya olan akridin oranj hem canlı hem ölü hücreleri, etidyum bromid ise sadece membran bütünlüğü bozulmuş hücreleri boyamaktadır. Canlı hücreler morfolojik olarak üniform yeşil renkli boyanırlar. Apoptozisin erken dönemindeki hücreler de yeşil renkli boyanmaktadırlar. Ancak, nükleuslarında parlak turuncu renkli noktalanmalar içerirler. Bu noktalanmalar, nukleustaki kromatin kondansasyonunu ve nuklear fragmantasyonu gösterir. Geç apoptotik dönemdeki hücreler de nekrotik hücreler gibi etidyum bromid ile turuncu renkli boyanırlar. Ancak nekrotik hücrelerden farklı olarak, geç apoptotik dönemdeki hücrelerde parlak yeşil renkli görülen noktalanmalar vardır. Erken apoptotik hücrelerde olduğu gibi bu noktalanmalar, nukleustaki kromatin kondansasyonunu ve nüklear fragmantasyonu gösterir. Nekrotik hücreler turuncu renklidirler ama morfolojik olarak canlı hücrelere benzerler. Nukleuslarında kondanse kromatin gözlenmez (192, 200) (Şekil 16). Şekil 16: A) Erken apoptotik dönemde olan hücre. B) Geç apoptotik dönemde olan hücre (192) A Elektron mikroskobu ile değerlendirme apoptozisde en değerli yöntem olarak düşünülmektedir. Morfolojik değişikliklerin en doğru olarak gözlendiği bir yöntemdir. Üstelik subsellüler detaylar (örn. mitokondrinin durumu, hücre zarı ya da nukleus membranının bütünlüğünün bozulup bozulmadığı gibi) da incelenebilir. lxxx

81 Faz kontrast mikroskobu sadece hücrelerin kültür ortamında, flask veya plate lerde büyütüldüğü çalışmalarda, hücreyi veya hücre topluluğunu incelemek amacıyla kullanılır. Bu hücreler faz kontrast mikroskobu ile gözlenebilirler. Mitozise giden hücreler de faz kontrast mikroskopuyla gözlenebilirler fakat bu hücreler aynı zamanda apoptotik hücrelerin erken evredeki görüntüleri ile karışabilirler. O yüzden ayrımları hemen hemen imkansızdır (200). Histokimyasal yöntemler: Anneksin V, TUNEL, M30, Kaspaz-3 yöntemleri histokimyasal yöntemlerdir. Anneksin V yönteminde, normal hücrelerde hücre zarının sitoplazmik yüzünde fosfatidilserin (PS) bulunmaktadır. Eğer hücre apoptozise giderse normalde iç yüzde yerleşmiş olan PS molekülleri hücre zarının dış yüzüne transloke olurlar. Dış yüze transloke olan PS ler, floresan bir madde (örn. FITC) ile işaretlenmiş Anneksin V kullanılarak görünür hale getirilirler. Böylece apoptotik hücreler saptanmış olur (200). TUNEL yöntemi, DNA kırıklarının in situ olarak tanınmasını sağlar. Parafin bloklar, donmuş kesitler, kültürü yapılmış solüsyon halindeki veya plate lere ekilmiş, ya da lameller üzerinde büyütülmüş hücrelerde apoptozisin varlığı bu yöntemle saptanabilir (169). M30 yönteminde apoptotik hücreler sitokeratin 18 in kaspazların etkisiyle kırılması sonucu ortaya çıkan yeni antijenik bölgenin immunohistokimyasal yöntemle boyanması prensibine göre belirlenir. Sadece sitokeratin 18 i eksprese eden dokularda kullanılması mümkündür. Bu dokular epitelyal kaynaklı dokulardır (200). Kaspaz-3 yöntemi ile sadece apoptotik hücrelerde oluşan aktif kaspaz-3 belirlenebilir. Bunun için, dokunun kaspaz-3 eksprese ettiğinin bilinmesi yada çalışılan dokuda apoptozise yol açan ajanın kaspaz-3 ü kırıp kırmadığının bilinmesi gerekir. Ancak, bu bilinirse apoptotik hücreler bu yöntemle tespit edilebilirler (200). Biyokimyasal yöntemler: Biyokimyasal olarak apoptozun saptanmasında agaroz jel elektroforezi, comet, western blotting, akış sitometrisi yöntemleri kullanılabilir. (169, 200). lxxxi

82 Agaroz jel elektroforezi, DNA kırıklarının gösterilebildiği bir başka yöntemdir. Apoptoziste DNA, 180 baz çifti ve bunun katlarına karşılık gelen noktalardan (internukleozomal bölgelerden) kırıldığı için merdiven görüntüsü ladder pattern oluşur. Bu bulgu apoptozisin karakteristik özelliğidir ve nekrozisde görülmez. O yüzden apoptozisi nekrozisden ayırmada faydalı yöntemlerden biridir. (169) Western blotting yöntemi yardımıyla apoptozise özgü bazı proteinlerin eksprese olup olmadıklarının (örn. bcl-2) ya da kırılıp kırılmadıklarının (örn. kaspaz-3) saptanması mümkündür. Sitokrom c nin mitokondriye çıkıp çıkmadığının belirlenmesi de bu yöntemle belirlenebilir. Yanlız, sitokrom c tespitinde önce alt-fraksiyonlama yapılarak hücrelerin mitokondriyal ve sitoplazmik fraksiyonları ayrılır. Ardından, normalde sitoplazmik fraksiyonda bulunması beklenmeyen sitokrom c nin bu fraksiyonda tespit edilmesi halinde hücrelerin apoptozise gittikleri anlaşılır. (200). Akış sitometri yöntemi yardımıyla floresan bir madde ile işaretlenmiş antikor kullanılarak apoptozisde eksprese olduğu bilinen herhangi bir hücre yüzey proteininin saptanması mümkündür. Böylece apoptotik hücreler belirlenebilir. Kolay uygulanabilir olması, aşırı uzun zaman almaması ve kantitatif sonuç verebilmesinden dolayı klinikte apoptozis belirlenmesi için kullanışlıdır (54, 169). İmmunolojik yöntemler: İmmunolojik olarak apoptozun saptanmasında ELISA ve fluorimetrik yöntemler kullanılmaktadır. ELISA ile gerek kültürü yapılmış hücre populasyonlarında gerekse insan plazmasında DNA fragmentasyonunu tespit etmek mümkündür. Aynı şekilde M30 düzeylerinin ölçümü de mümkündür. Fluorimetrik yöntem kültürü yapılmış hücrelerde kaspaz aktivitesinin tayin edilmesinde kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemde ilgili kaspazın antikorunun bulunduğu plate lere hücre lizatlarının konulması ile kaspaz molekülleri tutulur, ve sonra ortama kaspazların parçaladığı ve kendisine floresan lxxxii

83 bir maddenin tutunduğu bir substrat ilave edilir. Ortamdaki kaspaz aktivitesiyle orantılı olarak ortaya çıkan floresanın şiddeti fluorimetre ile ölçülerek kaspaz aktivitesi saptanır. (200). Moleküler biyoloji yöntemleri: Moloküler biyolojik olarak apoptozun saptanmasında DNA Microarrays yöntemi kullanılmaktadır. DNA microarray teknolojisi henüz çok yeni ve çok pahalı bir yöntemdir. Bu teknoloji ile aynı anda ve kısa bir süre içinde (önceden aylarca sürerken) yüzlerce hatta binlerce genin ekspresyon derecelerinin (mrna larının) tespiti mümkün olabilecektir. Böylece, apoptozise özgü hücre yüzey ölüm reseptörlerinin ekspresyon durumları hakkında geniş bilgi edinme olanağı doğacaktır (200). lxxxiii

84 BÖLÜM II 2. GEREÇ ve YÖNTEM Bu çalışmada, apeksifikasyon ve kök kanal tedavisi sırasında kullanılan yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının primer/diploid HPDLF ve devamlı 3T3 fare fibroblast hücre hatları üzerindeki zamana bağlı sitotoksik etkileri MTT ve NR testleri kullanılarak araştırıldı. DNA hasarı sonucu oluşan apoptotik etkileri ise HPDLF hücre hattında etidyum bromid/akridin oranj yöntemi ile in vitro koşullarda saptandı. Çalışmada sitotoksik ve apoptotik etkileri araştırılan kanal yıkama solüsyonları ve konsantrasyonları tablo 7 de, kanal dolgu patları ise tablo 8 de görülmektedir. Kök Kanal Yıkama Solüsyonları %5 sodyum hipoklorit (NaOCl) %15 nötral etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) %20 klorheksidin glukonat (CHX) stok solüsyonu %20 klorheksidin glukonat stok solüsyonu artı %20 setrimit (CHX+setrimid) stok solüsyonu Konsantrasyonlar %1, %0.1, %0.01, %0.001 %1, %0.1, %0.01, %0.001 %0.1, %0.01, %0.001 %0.1, %0.01, %0.001 Üretici Firma Wizard, Rehber Kimya San., İstanbul, Türkiye Wizard, Rehber Kimya San., İstanbul, Türkiye Drogsan, Ankara, Türkiye Drogsan, Ankara, Türkiye Serum fizyolojik %0.9 Eczacıbaşı-Baxter, Hastane Ürünleri San. ve Tic A.Ş, Ayazağa, İstanbul Tablo 7: Sitotoksik ve apoptotik etkileri araştırılan kök kanal yıkama solüsyonları lxxxiv

85 Kanal Dolgu Patları Ca(OH) 2 + steril distile su Ca(OH) 2 + gliserin Mineral trioksit agregat (MTA) AH26 AHPlus Endometazon Diaket Üretici Firma Kalsin, Aktu, İzmir, Türkiye Kalsin, Aktu, İzmir, Türkiye Denstply, Tulsa, OK, ABD DeTrey Denstply, Konstanz, Almanya DeTrey Denstply, Konstanz, Almanya Septodont, Paris, Fransa 3M ESPE AG, Seefold, Almanya Tablo 8: Sitotoksik ve apoptotik etkileri araştırılan kanal dolgu patları ve üretici firmaları Çalışmada farklı kök kanal yıkama solüsyonları ve kanal dolgu patlarının HPDLF ve 3T3 hücre hatlarına olan sitotoksik ve apoptotik etkilerinin değerlendirilmesinde aşağıda belirtilen işlemler sırasıyla gerçekleştirildi: Ortodontik çekim endikasyonu konulmuş dişlerden elde edilen HPDLF ların hücre kültürü ortamında üretilerek uygun pasajların alınması ve stoklanması, Ankara Şap Entitüsü Hücre Kültürü Koleksiyonundan (HUKUK) elde edilen 3T3 hücrelerinin üretilerek uygun pasajların alınması ve stoklanması, Kök kanal yıkama solüsyonlarının hazırlanması, Kök kanal yıkama solüsyonlarının MTT testi ile HPDLF ve 3T3 hücre kültüründe sitotoksik etkilerinin belirlenmesi, Kök kanal yıkama solüsyonlarının NR testi ile HPDLF ve 3T3 hücre kültüründe sitotoksik etkilerinin belirlenmesi, Kanal yıkama solüsyonlarının HPDLF hücre kültüründe apoptotik etkilerinin etidyum bromid/akridin oranj yöntemi ile belirlenmesi, Kök kanal dolgu patlarının hazırlanması, Kök kanal dolgu patlarının MTT testi ile HPDLF ve 3T3 hücre kültüründe sitotoksik etkilerinin belirlenmesi, lxxxv

86 Kök kanal dolgu patlarının NR testi ile HPDLF ve 3T3 hücre kültüründe sitotoksik etkilerinin belirlenmesi, Kök kanal dolgu patlarının HPDLF hücre kültüründe apoptotik etkilerinin akridin oranj/etidyum bromid yöntemi ile belirlenmesi, Bu çalışmada dişlerin çekimi Ege Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Ağız-Diş Hastalıkları ve Çene Cerrahisi Anabilim Dalı nda, HPDLF ve 3T3 hücrelerinin üretilmesi, stoklanması, MTT ve NR testleri, Ege Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü, Hayvan Hücre Kültürü Laboratuvarı nda, etidyum bromid/akridin oranj testi ise Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Genetik ve Teratoloji Bilim Dalı nda yürütüldü. Çalışma başlamadan önce E.Ü Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu ndan onay alındı. Etik kurul onayına ait karar numarası 04-2/31 dir (Ek 1). 2.1 Hücre kültürlerinin hazırlanması İnsan periodontal ligament fibroblast (HPDLF) hücre kültürünün hazırlanması; Çalışmada kullanılan HPDLF hücreleri; yaşındaki, herhangi bir sistemik rahatsızlığı bulunmayan, ağzında çürük lezyonu ve periodontal hastalığı olmayan ve E.Ü Dişhekimliği Fakültesi Ortodonti A.D na başvurmuş, ortodontik tedavi planlamasında sürekli birinci veya ikinci premolar dişlerine çekim endikasyonu konulmuş hastaların sağlıklı premolar dişlerinden elde edildi. Helsinki Bildirgesi uyarınca hastaya ve velisine açıklama yapılıp yazılı onayları alındıktan sonra hastalara, ağız florasını düzenlemek, çekim sırasında olası kontaminasyonları ortadan kaldırmak amacı ile 5 gün süresince klorheksidin içerikli bir ağız gargarası (Klorhex, Drogsan, Ankara, Türkiye) kullandırıldı. Diş çekimleri, Ege Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Ağız-Diş Hastalıkları ve Çene Cerrahisi Anabilim Dalı nda, mümkün olduğunca kök yüzeyine zarar vermeden yapıldı. lxxxvi

87 Hücrelerin elde edilmesinde değişiklikler yapılarak Somerman ın 1988 yılında kullandığı yöntem uygulandı (187). Çekilen dişler, daha önceden hazırlanmış ve + 4ºC de saklanan Dulbecco s Modified Eagle s medium/ham s Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12; Biochrom, Berlin, Almanya), %5.5 sol. NaHCO 3 (%0.1), penisilin (400 U/ml)/streptomisin (400 µg/ml) (Biochrom, Berlin, Almanya) ve amfoterisin B (%0.1) (Biochrom, Berlin, Almanya ) içeren taşıma solüsyonuna konuldu. Şekil 17: Laminar akışlı kabin Şekil 18: İnkübatör En geç 2 saat içinde laminar akışlı kabin (Heraeus, Berlin, Almanya) içerisinde kökün orta 1/3 lük kısmından periodontal ligament dokuları steril cerrahi bistüri ile kazındı (Şekil 17) ve 35 mm çaplı kültür kaplarına alındı. Dokuların üzerine 0.5 ml penisilin/streptomisin (%0.4), amfoterisin B (%0.1) ve fötal dana serumu (FBS; Biochrom, Berlin, Almanya) ndan oluşan besiyeri ilave edilerek nemli %5 CO 2 li inkubatörde (Heraeus, Berlin, Almanya) 37 C de inkube edildi (Şekil 18). Dört gün boyunca aynı besiyeri periodontal dokular üzerine eklendi. Dokuların kültür kabı tabanına yapışması izlendi. Dört günün sonunda kültür kabında birikmiş olan 2 ml besiyeri pipet yardımıyla çekildi ve FBS (%20), %5,5 konsantrasyonunda NaHCO 3 (%2), %1 L-glutamin (Biochrom, Berlin, Almanya), penisilin (400 U/ml)/streptomisin (400 µg/ml) ve amfoterisin B (0.25 µg/ml) içeren DMEM F/12 besiyeri kültür kaplarına konuldu. Her gün hücre yoğunlukları ve hücre besiyeri ph sı kontrol edildi ve 48 saatlik periodlarla besiyeri değişikliği yapıldı. HPDLF hücreleri kültür kabı yüzeyini lxxxvii

88 kapladıktan sonra tripsin (%0.25) etilendiamin tetraasetik asit (%2) (EDTA; Biochrom, Berlin, Almanya) solüsyonu kullanılarak hücreler yüzeyden ayrıldı ve 25 cm² kültür kaplarına aktarılarak pasajlandı (Şekil 19, 20). Pasajlama işlemine 5. pasaja kadar devam edildi. Üçüncü ve 5. pasajlarda hücreler, %10 dimetilsülfoksid (DMSO; Biochrom, Berlin, Almanya) ve %90 FBS içeren dondurma besiyeri kullanılarak -196 C de sıvı azot içinde dondurularak saklandı. Çalışmada pasajlar arası hücreler kullanıldı. Şekil 19: HPDLF hücrelerinin 18 günlük kültürünün ışık mikroskop görüntüsü (10X büyütme, Olympus, Tokyo, Japonya, Model No: CK40) lxxxviii

89 Şekil 20: HPDLF hücrelerinin 22 günlük kültürünün ışık mikroskop görüntüsü (10X büyütme, Olympus, Tokyo, Japonya, Model No: CK40) HPDLF hücrelerinin üretilmesi ve testleri sırasında kullanılan besiyeri: %20 FBS, %2 NaHCO 3 (%5.5 sol.), % 1 L-glutamin, 4X (X: 100ml de 0,1 ml) penisilin (400 IU/ml)/streptomisin (400 µg/ml) ve X amfoterisin B (0.25 µg/ml) içeren DMEM F/12. 3T3 fare fibroblast hücre kültürünün hazırlanması; Araştırmada kullanılan 3T3 devamlı hücre hattı Ankara Şap Enstitüsü Hücre Kültürü Kolleksiyonu (HÜKÜK) ndan elde edildi. Sitotoksisite testlerinde kullanılmak üzere, içeriğinde, DMEM/F12, %10 FBS, % 1 L-glutamin, %2 NaHCO 3 (%5,5 konsantrasyonda), 4X penisilin (400 IU/ml)/streptomisin (400 µg/ml) ve X amfoterisin B (0.25 µg/ml) olan hücre besiyerinde üretilerek uygun pasajlara getirildi. Kültürler % 5 CO 2 içeren rutubetli etüvde 37 C de bekletildi ve her gün hücre yoğunlukları ve hücre besiyeri ph sı kontrol edildi. En geç 48 saat sonra hücre besiyeri taze besiyeri ile değiştirildi. 3T3 hücreleri kültür kabı yüzeyini kapladıktan sonra, tripsin/edta solüsyonu kullanılarak hücreler yüzeyden ayrıldı ve 75 cm² kültür kaplarına aktarılarak pasajlandı. Testler için yeterli hücre sayısı elde edilinceye kadar pasajlama işlemine devam edildi (Şekil 21). Elde edilen hücreler daha sonra lxxxix

90 testlerde kullanılmak üzere %10 DMSO ve %90 FBS içeren dondurma besiyeri kullanılarak -196 C de sıvı azot içinde dondurularak saklandı. Şekil 21: 3T3 fare fibroblast hücrelerinin 25 günlük kültürünün ışık mikroskop görüntüsü (10X büyütme, Olympus, Tokyo, Japonya, Model No: CK40) 3T3 hücrelerinin üretilmesi ve testleri sırasında kullanılan besiyeri: DMEM/F12, %10 FBS, % 1 L-glutamin, %2 NaHCO 3 (%5,5 sol.), 4X penisilin (400 IU/ml)/streptomisin (400 µg/ml) ve X amfoterisin B (0.25 µg/ml) içermekteydi. 2.2 Kök kanal yıkama solüsyonlarının hazırlanması Tüm yıkama solüsyonları testlerden hemen önce taze olarak hazırlandı. Kanal yıkama solüsyonları, test edilecek konsantrasyonlarına, her hücre hattına (HPDLF ve 3T3) ait besiyerleri ile dilue edilerek getirildi. Yıkama solüsyonlarından %5 NaOCl ve %15 EDTA, test edilecek konsantrasyonlarına (%1, %0.1, %0.01, %0.001) yukarıda belirtildiği gibi hücre hatlarına ait besiyerleri ile dilue edilerek ulaştırılırken, %20 CHX stok solüsyonu; ilk önce steril distile su ile dilue edilerek %2 lik konsantrasyona getirildi. Test edilecek konsantrasyonlarına (%0.1, %0.01, %0.001) ulaşabilmek için ise her hücre hattına ait xc

91 besiyerileri ile dilue edildi. %20 CHX+%20 setrimid; %20 CHX ne %20 setrimid ilave edilerek elde edildi. Solüsyon, distile su ile %2 lik konsantrasyona getirildi. Test edilecek konsantrasyonları (%0.1, %0.01, %0.001) yukarıdaki gibi hücre besiyerleri içindeki dilüsyonlarından hazırlandı. 2.3 Kanal yıkama solüsyonlarının MTT ve NR testleri ile HPDLF ve 3T3 hücre kültürlerindeki sitotoksik etkilerinin belirlenmesi Çalışmada kullanılmak üzere -196 C de sıvı azot içinde dondurularak saklanan HPDLF ve 3T3 hücre hatlarından, testler için 3. pasajdaki HPDLF hücreleri ve 3T3 hücreleri kullanıldı. MTT ve NR testleri sırasında, testlerin yapıldığı hücre hattına ait besiyeri kullanıldı. Test prosedürleri ise her hücre hattı için aynı aşamalar izlenerek uygulandı. Dondurularak saklanan hücreler, 37 C deki su banyosunda çözdürülüp, içinde 5ml FBS bulunan 15 ml lik santrifüj tüplerine aktarıldı ve 800 rpm/dk da 5 dk., 4 C de santrifüj edildikten sonra üst sıvı döküldü. Tüplerin altına hafifçe vurularak hücrelerin yüzeyden ayrılmaları sağlandı. Santrifüj tüpleri içine 2 ml besiyeri konulup hücrelerin homojen süspansiyonunu sağlamak için pipetleme işlemi yapıldıktan sonra hücreler 35 mm çaplı kültür kabına aktarılarak, %5 CO 2 içeren nemli inkubatörde 37 C de inkube edildi. Her gün hücre yoğunlukları ve hücre besiyeri ph sı kontrol edildi. 48 saatlik periodlarla besiyeri değiştirildi. Hücreler 35 mm çaplı kültür kabı yüzeyini kapladıktan sonra, tripsin/edta solüsyonu kullanılarak yüzeyden ayrılmaları sağlandı ve 25 cm² kültür kaplarına aktarılarak pasajlandı. Testlerde 3., 4., ve 5. pasajdaki HPDLF hücreleri kullanıldı. Hücreler istenilen yoğunluğa ulaştığında, tripsin/edta solüsyonu ile tutundukları kültür kaplarından kaldırılarak santrifüj tüplerinde toplandı. Tripsin/EDTA solüsyonunu hücrelerden uzaklaştırmak için 800 rpm de 5 dk., 4 C de santrifüj edildi. Bu işlemden sonra üst sıvı döküldü ve 5 ml vasat eklenip, pipetleme işlemi yapılarak besiyeri içerisinde xci

92 hücrelerin homojen bir şekilde dağılması sağlandı. Bu karışımdan 100 µl (hücre+besiyeri) alınarak içinde 100 µl tripan mavisi bulunan Ependorf tüpüne aktarıldı ve hücrelerin boyanması sağlandı. Boyanan hücreler Bürker lamında, ışık mikroskobu (Olympus, Tokyo, Japan, Model No: CK40) kullanılarak sayıldı (Şekil 22). 22 (a) 22 (b) Şekil 22: (a) Bürker lamının şematik görüntüsü (b) Işık mikroskobu (Olympus, Tokyo, Japonya, Model No: CK40) Sayımdan elde edilen değer kullanılarak toplam hücre sayısı hesaplandı. 1 ml hücre besiyerinde 10 5 hücre (1 x 10 5 hücre/ ml) olacak şekilde 96- gözlü plakaların, her yıkama solüsyonuna ait 6 gözünün 4 üne 200 µl aktarıldı. Diğer iki göze ise hücre içermeyen 200 µl besiyeri eklendi. Hücreler, %5 CO 2 içeren rutubetli etüvde 37 C de, 24 saat bekletildi. 24 saat sonunda hücrelere ve sadece besiyeri içeren gözlere belirtilen konsantrasyonlarda yıkama solüsyonları eklendi. Yıkama solüsyonlarının 96-gözlü plakalardaki yerleşimi tablo 9 da gösterilmektedir. CHX CHX CHX CHX+ CHX+ CHX+ C SF Kontrol Kontrol Kontrol C 1 %0.1 2 % % %0.1 5 % % A CHX CHX CHX CHX+ CHX+ CHX+ D SF Kontrol Kontrol Kontrol AD CHX %0.1 %0.01 CHX %0.001 CHX CHX+ %0.1 CHX+ %0.01 %0.001 CHX+ B SF Kontrol Kontrol Kontrol B E %0.1 Kör %0.01 Kör %0.001 Kör %0.1 Kör %0.01 Kör %0.001 Kör Kör Kör K. Kör K. Kör K. E F Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör K. Kör K. Kör K. F xcii

93 G Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör K. Kör K. Kör K. G H H A B C D NaOCl %1 NaOCl %1 NaOCl %1 NaOCl %0.1 NaOCl %0.1 NaOCl %0.1 NaOCl %0.01 NaOCl %0.01 NaOCl %0.01 NaOCl %0.001 NaOCl %0.001 NaOCl %0.001 EDTA %1 EDTA %1 EDTA %1 EDTA %0.1 EDTA %0.1 EDTA %0.1 EDTA %0.01 EDTA %0.01 EDTA %0.01 EDTA %0.001 EDTA %0.001 EDTA %0.001 A Kontrol Kontrol B Kontrol Kontrol C Kontrol Kontrol D E Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör K. Kör K. E F Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör K. Kör K. F G Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör Kör K. Kör K. G H H Tablo 9: Yıkama solüsyonlarının 96-gözlü plakalardaki yerleşimi, CHX: Klorheksidin glukonat; CHX+: Klorheksidin glukonat+setrimid; SF: Serum fizyolojik; Kontrol: 1x10 5 hücre/ml+hücre besiyeri; Kör: Aynı konsantrasyonlardaki hücresiz yıkama solüsyonları; Kör K: Hücre besiyeri. 1, 2 ve 4 saat sonunda test solüsyonları tüm gözlerden uzaklaştırıldı ve hemen sonra MTT (Sigma, Münih, Almanya) veya NR (Biochrom, Berlin, Almanya) test solüsyonu eklendi. MTT testi: MTT test solüsyonu, daha önceden hazırlanmış ve -20 C de bekletilen MTT stok solüsyonu ve her hücre hattına ait besiyeri kullanılarak hazırlandı. MTT stok solüsyonu, testlerden önce 10 ml Ca 2+ ve Mg 2+ içermeyen fosfat tamponlu serumda (PBS, Sigma, Münih, Almanya) 50 mg MTT tozunun çözdürülmesi ile elde edildi ve testlerde kullanılmak üzere -20 C de bekletildi. Test sürelerinin tamamlanmasından hemen önce MTT stok solüsyonu oda sıcaklığında, karanlık ortamda çözdürüldü ve 9 ml hücre besiyerine 1 ml MTT stok solüsyonu eklenerek gerekli miktarda MTT test solüsyonu xciii

94 hazırlandı. 1, 2 ve 4 saat sonunda, test solüsyonları tüm gözlerden uzaklaştırıldı ve her göze 200 µl MTT test solüsyonu eklendi. MTT test solüsyonu içeren 96-gözlü plakalar, % 5 CO 2 içeren % 99 nemli etüvde 37 C de 3 saat bekletildi (89). Bu süre içerisinde canlı hücreler mitokondrial dehidrogenaz enzimi vasıtasıyla MTT yi metabolize ettiği için ortama sarı turuncu renkli, suda çözünebilen tetrazolyum formazan yan ürününü saldı. Bu süre sonunda ışık mikroskobunda formazan kristal oluşumları izlendi (Şekil 23). Şekil 23: Işık mikroskobunda formazan kristallerinin görüntüsü (10X büyütme, Olympus, Tokyo, Japonya, Model No: CK40) Üç saat sonunda, kristallerin çözülmesi için her göze 200 µl DMSO eklendi. Plaka, orbital çalkalayıcıda (Titramax 100, Berlin, Almanya) 650 devir/dk. da 3 dakika çalkalandıktan sonra mikroplaka okuyuculu spektrofotometrede (Moleculer Devices, Kaliforniya, ABD) 690 nm referans filtreye karşı 570 nm de okutuldu (Şekil 24). MTT testi, her hücre hattında üç kez tekrarlandı. Tüm işlemler laminar akışlı kabin içerisinde gerçekleştirildi. xciv

95 (a) (b) Şekil 24: (a) Hücrelerin DMSO ile muamelesinden sonra oluşan renk değişikliği (b) Mikroplaka okuyuculu spektrofotometre (Moleculer Devices, Kaliforniya, ABD) NR testi: HPDLF ve 3T3 hücre hatları yukarıda anlatıldığı gibi kendi besiyerleri kullanılarak NR testi için hazırlandı ve 1 ml hücre besiyerinde 10 5 hücre (1 X 10 5 hücre/ ml) olacak şekilde 96- gözlü plakaların, her yıkama solüsyonuna ait 6 gözünün 4 üne 200 µl aktarıldı. Diğer iki göze ise hücre içermeyen 200 µl besiyeri eklendi. Hücreler, %5 CO 2 içeren rutubetli etüvde 37 C de, 24 saat bekletildi. 24 saat sonunda hücrelere ve sadece besiyeri içeren gözlere belirtilen konsantrasyonlarda yıkama solüsyonları eklendi. Yıkama solüsyonlarının 96-gözlü plakalardaki yerleşimi tablo 9 da gösterilmektedir. NR testi için gerekli olan, NR test solüsyonu ve NR çözücü solüsyonu testlerden hemen önce taze olarak hazırlandı. NR test solüsyonu, %5 FBS, %4 L-glutamin, 100 µl penisilin (400 IU/ml)/streptomisin (400 µg/ml) ve DMEM F/12 içerikli besiyerine, %0.758 oranında NR (Biochrom, Berlin, Almanya) boyasının (0.3mg/ml) eklenmesi ile elde edildi. Elde edilen solüsyon mikro filtreden geçirilerek içinde kalan büyük boya partiküllerinden arındırılması sağlandı. Kullanılıncaya kadar 37 C de bekletildi ve kullanımından 15 dakika önce oda sıcaklığına çıkarıldı. NR çözücü solüsyonu ise; %1 glasiyal asetik asit solüsyonu (Biochrom, Berlin, Almanya), %50 etanol (Merck, Darmstadt, Almanya) ve %49 distile su karıştırılarak elde elde edildi (188). 1, 2 ve 4 saat sonunda test solüsyonları 96 gözlü plakaya ait gözlerden uzaklaştırıldı ve gözler 250 µl PBS ile yıkandı. PBS uzaklaştırıldıktan sonra, gözlere 250 µl NR test xcv

96 solüsyonu konuldu. NR test solüsyonu içeren 96-gözlü plakalar, % 5 CO 2 içeren % 99 nemli etüvde 37 C de 4 saat bekletildi (188). Bu süre sonunda ışık mikroskobunda canlı kalan hücrelerin NR boyası ile boyandıkları izlendi (Şekil 25). Ölü hücre Canlı hücre Şekil 25: Sitotoksik materyal ile muamele edilmiş 3T3 hücrelerinin NR boyaması (10X büyütme, Olympus, Tokyo, Japonya, Model No: CK40) NR test solüsyonu gözlerden uzaklaştırıldı ve tüm gözler tekrar 250 µl PBS ile yıkandı. NR boyasının çözünmesi için her göze 100 µl NR çözücü solüsyonu eklendi ve 96-gözlü plaka, orbital çalkalayıcıda 650 devir/dk. da 20 dakika çalkalandı. Çalkalama işlemi bittikten sonra plakalar 5 dakika bekletildi ve mikroplaka okuyuculu spektrofotometrede (Moleculer Devices, Kaliforniya, ABD) 690 nm referans filtreye karşı 540 nm de okutuldu (Şekil 24(b), 26) (159, 188). NR testi, her hücre hattında üç kez tekrarlandı. Tüm işlemler laminar akışlı kabin içerisinde gerçekleştirildi. xcvi

97 Şekil 26: Hücrelerin NR çözücü solüsyonuyla muamelesinden sonra oluşan renk değişikliği: Açık renkli solüsyon, koyu renkli solüsyonlara göre daha az hücre içermektedir. 2.4 Kök kanal yıkama solüsyonlarının HPDLF hücre kültüründe akridin oranj/etidyum bromid yöntemi ile apoptotik etkilerinin belirlenmesi Serum fizyolojik dışındaki kök kanal yıkama solüsyonlarının apoptotik etkileri, 2 saat sonunda HPDLF hücre hattında akridin oranj/etidyum bromid yöntemi kullanarak belirlendi. Serum fizyolojik bu teste dahil edilmedi. Tüm yıkama solüsyonları testlerden hemen önce taze olarak, MTT ve NR testlerinde anlatıldığı gibi hazırlandı. HPDLF hücre hattı da, daha önce MTT ve NR testleri için çözdürülüp uygun pasajlara getirilen hücrelerden yararlanılarak hazırlandı ve akridin oranj/etidyum bromid testi için mililitrede 10 5 hücre olacak şekilde 24 gözlü plakaların tüm gözlerine aktarıldı. Plakalar, %5 CO 2 içeren nemli etüvde 37 C de, 24 saat bekletildi. Bu süre sonunda kanal yıkama solüsyonları kendilerine ait 3 gözün 2 sine 1 ml olacak şekilde aktarıldı. Geriye kalan 1 gözün ise besiyeri değiştirildi ve kontrol grubu olarak bırakıldı. Kanal yıkama solüsyonlarının 24 gözlü plakalara yerleşimi tablo 10 da görülmektedir. Plakalar, %5 CO 2 içeren nemli etüvde 37 C de, 2 saat bekletildi. xcvii

98 A NaOCl %1 NaOCl %1 Kontrol EDTA %1 EDTA %1 Kontrol B NaOCl %0.1 NaOCl %0.1 Kontrol EDTA %0.1 EDTA %0.1 Kontrol C D NaOCl %0.01 NaOCl %0.001 NaOCl %0.01 NaOCl %0.001 Kontrol Kontrol EDTA %0.01 EDTA %0.001 EDTA %0.01 EDTA %0.001 Kontrol Kontrol A B C D CHX %0.1 CHX %0.1 Kontrol CHX+ %0.1 CHX+ %0.1 Kontrol CHX %0.01 CHX %0.01 Kontrol CHX+ CHX+ Kontrol CHX CHX Kontrol CHX+ CHX+ Kontrol BOŞ BOŞ BOŞ BOŞ BOŞ BOŞ Tablo 10:Yıkama solüsyonlarının 24-gözlü plakalardaki yerleşimi, CHX: Klorheksidin glukonat; CHX+: klorheksidin glukonat+setrimid; Kontrol: 1X10 5 hücre/ml+hücre besiyeri Akridin oranj/etidyum bromid yöntemi Bu test için gerekli olan akridin oranj/etidyum bromid stok solüsyonu 50 mg etidyum bromid (Sigma, Münih, Almanya) ve 15 mg akridin oranjın (Sigma, Münih, Almanya) 1ml %95 etanol içinde çözdürülmesi ve bu karışıma 49 ml distile su eklenmesi ile elde edildi. Elde edilen bu karışım iyice karıştırılıp her Eppendorf tüpünde 1ml olacak şekilde bölündü ve - 86 º C de donduruldu. Testin yapılmasından hemen önce gerekli miktarda stok solüsyonu çözdürüldü. PBS te 1/100 oranında dilue edilip iyice karıştırılarak çalışma solüsyonu elde edildi. İki saat sonunda kanal yıkama solüsyonları ve besiyerleri 24 gözlü plakaya ait gözlerden uzaklaştırıldı ve her göze 0.5 ml tripsin/edta solüsyonu konarak hücrelerin tutundukları alandan kaldırılarak her yıkama solüsyonuna ait farklı santrifüj tüplerinde toplandı. Hücreler, 1200 rpm de 5 dakika santrifüj edilerek canlı kalan hücrelerin, tüplerin tabanında toplanması xcviii

99 sağlandı. Santrifüj tüpleri içindeki tripsin/edta solüsyonu boşaltıldı ve hücreler PBS ile muamele edildi. Bu hücre süspansiyonlarından ve hazırlanmış olan çalışma solüsyonundan 25 µl alınarak her kanal yıkama solüsyonuna ait Eppendorf tüplerine aktarıldı. Elde edilen karışımdan 25 µl alınarak, floresan mikroskopta (Olympus, Tokyo, Japonya) incelenecek hücrelerin sayılması için Neubauer lama (Sigma, Münih, Almanya) konuldu (Şekil 27) hücreler 10X ve 40X objektifle, üçlü bant filtreye sahip, floresan mikroskopta (Olympus, Tokyo, Japonya) incelendi. (a) (b) Şekil 27: (a) Neubauer lamın hücre sayımı yapıldığı alanın şematik görüntüsü (b) Neubauer lamı Akridin oranj boyası ile canlı hücreler yeşil, etidyum bromid ile ölü hücreler turuncu olarak gözlendi (Şekil 28). xcix

100 C EA GA N Şekil 28: Akridin oranj/etidyum bromid ile boyanan hücrelerin flouresan mikroskoptaki görüntüsü. C: Canlı hücre; N: Nekrotik hücre; EA: Erken apoptotik hücre; GA: Geç apoptotik hücre (40X büyütme, Olympus, Tokyo, Japonya) Her alandan 450 hücre sayıldı. Canlı, nekrotik ve apoptotik hücre sayıları hazırlanmış olan tabloya yazıldı. Testler üç kez tekrarlandı. 2.5 Kök kanal dolgu patlarının hazırlanması Apeksifikasyon ve kanal tedavisinde kullanılan kanal dolgu patlarının sitotoksik etkileri, 1 saat, 24 saat ve 7 gün sonunda MTT ve NR testi kullanılarak belirlendi. Çalışmada kullanılan kanal dolgu patları tablo 8 de (Sayfa 73) görülmektedir. Kanal dolgu patları testlerden hemen önce, laminar akışlı kabin içinde, üretici firmaların önerileri doğrultusunda karıştırılıp, içi boş politetrafloroetilen (PTFE) polimer çubuklardan özel olarak yaptırılan, iç çapı ve yüksekliği 4 mm olan silindir kalıplara yerleştirildi (90) (Şekil 29). Silindirler ve kanal dolgu patlarının hazırlanması için kullanılan siman spatülü, siman camı testlerden hemen önce 121º C de 20 dakika otoklavda (Charisma Vacuum, Grup Dental, İstanbul, Türkiye) sterilize edildi. Kanal dolgu patları test sürelerine göre iki gruba ayrıldı; I. Grup: 1saat II. Grup: 24 saat ve 7gün c

101 2mm 4mm 4mm Şekil 29: Kanal dolgu patlarının yerleştirildiği içi boş PTFE polimer çubuklardan elde edilen silindir kalıplar İkinci grup kanal dolgu patları silindirler kalıplara yerleştirildikten sonra UV altında bir saat bir yüzü, bir saat diğer yüzü olmak üzere toplam 2 saat sterilize edildi. I. grup kanal patlarının test süresinin kısa olmasından ve bu süreler içerisinde hücre kültürlerinde bakteri veya mantar kontaminasyonu oluşturmayacağından steril edilmedi. Kanal dolgu patlarından her test için üçer örnek hazırlandı. İki örnek hücrelerin içinde bulunduğu gözler için, bir örnek ise içinde yalnızca besiyeri olan göz için kullanıldı. Testlerde kullanılmak üzere hazırlanan kanal patlarının hacmi yaklaşık mm 3 ve temas yüzeyi mm 2 idi. 2.6 Kanal dolgu patlarının MTT ve NR testi ile HPDLF ve 3T3 hücre kültürlerinde sitotoksik etkilerinin belirlenmesi HPDLF ve 3T3 hücre hatları, MTT ve NR testleri için, kanal yıkama solüsyonlarında anlatıldığı gibi hazırlandı. Bir saat ve 24 saatlik test süreleri için her iki hücre hattından da bir mililitre besiyerinde 10 5 hücre (1x10 5 h/ml) ve 7 günlük test süresi için ise 5x10 3 h/ml, 24- gözlü plakalar içine aktarıldı. Her kanal dolgu patı için 3 göz kullanıldı. İki göze belirlenen sayılarda bir mililitre hücre içeren besiyeri ve bir göze ise yalnızca bir mililitre besiyeri konuldu. Hücreler %5 CO 2 içeren nemli etüvde 37 C de 24 saat bekletildi. 24 saat sonunda gözlerden 0,5 ml besiyeri pipet yardımıyla çekildi ve 24-gözlü plakalara uyacak şekilde dizayn edilmiş, polikarbonat membranlı ve membran üzerinde 0.4 µm çapında porlar içeren, özel hücre kültürü sistemleri (Nunc Cell Culture Inserts, Roskilde, Danimarka) gözlere yerleştirildi (Şekil 30). ci

102 Polikarbonat membran Şekil 30: Kanal dolgu patlarının yerleştirildikleri membranlı özel hücre kültürü sistemleri Membranlı özel hücre kültürü sistemleri yerleştirildikten sonra kanal dolgu patları taşıyıcılar içine konuldu ve üzerlerine 0.5 ml besiyeri ilave edildi. Kanal dolgu patlarının 24- gözlü plaka üzerindeki yerleşimi tablo 11 ve şekil 31 de gösterilmiştir. Ca(OH) A 2 +g 1 B Ca(OH) 2+sds Ca(OH) 2 +g 2 Ca(OH) 2 +sds 2 Ca(OH) 2 +g Kör Ca(OH) 2 +sds Kör AH26 1 AH26 2 AHPlus 1 AHPlus 2 AH26 Kör AHPlus Kör C MTA 1 MTA 2 MTA Kör Endo 1 Endo 2 Endo Kör Kontrol D Diaket 1 Diaket 2 Diaket Kör Kontrol 1 Kontrol 2 Kör Tablo 11: Kanal dolgu patlarının 24-gözlü plakalardaki yerleşimi. sds: steril distile su; g: gliserin; Endo: Endometazon cii

103 Şekil 31: Kanal dolgu patlarının 24-gözlü plakalardaki görüntüsü. Test süreleri 7 gün olan örneklerin besiyerleri, test süresinin sonuna kadar, 48 saatte bir değiştirildi. Bir saat, 24 saat ve 7 gün sonunda kanal dolgu patları gözlerden uzaklaştırıldı ve hemen sonra MTT veya NR test solüsyonu eklendi. MTT testi: MTT test solüsyonu, daha önceden hazırlanmış ve -20 C de bekletilen MTT stok solüsyonu ve her hücre hattına ait besiyeri kullanılarak hazırlandı. MTT stok solüsyonu, testlerden önce 10 ml PBS (Ca 2+ ve Mg 2+ içermeyen) içinde 50 mg MTT tozunun çözdürülmesi ile elde edildi ve testlerde kullanılmak üzere -20 C de bekletildi. Test sürelerinin tamamlanmasından hemen önce MTT stok solüsyonu oda sıcaklığında, karanlık ortamda çözdürüldü ve 9ml hücre besiyerine 1ml MTT stok solüsyonu eklenerek gerekli miktarda MTT test solüsyonu hazırlandı. 1, 24 saat ve 7 gün sonunda, kanal dolgu patları taşıyıcılar ile birlikte tüm gözlerden uzaklaştırıldı ve her göze bir mililitre MTT test solüsyonu eklendi. MTT test solüsyonu içeren 24-gözlü plakalar, %5 CO 2 içeren %99 nemli etüvde 37 C de 3 saat bekletildi (89) (Şekil 32). ciii

104 Şekil 32: Hücrelerin MTT test solüsyonu ile muamelesinde, 3 saat sonunda gözlenen renk değişikliği. Üç saat sonunda, kristallerin çözülmesi için her göze bir mililitre DMSO eklendi. Plakalar, orbital çalkalayıcıda 650 devir/dk. da 3 dakika boyunca çalkalandıktan sonra renk değişikliklerinin mikroplaka okuyuculu spektrofotometrede 690 nm referans filtreye karşı 570 nm de okutulabilmesi için, her kanal dolgu patına ait solüsyonlar daha önceden planlanmış şekilde 24-gözlü plakalardan 96-gözlü plakalara aktarıldı (Tablo 12). MTT testi, her hücre hattında üç kez tekrarlandı. Tüm işlemler laminar akışlı kabin içerisinde gerçekleştirildi A A 1 K+g 2 K+g 3 K+sds 4 K+sds 5 MTA 6 MTA 7 Diaket 8Diaket Kontrol 9 10 Kontrol A B B A B Endo K+g Endo K+g AH26 K+sds AH26 K+sds AHPlus MTA MTA AHPlus Diaket Kontrol Diaket Kontrol Kontrol C BOŞ Kontrol BOŞ CB C Endo K+g Endo K+g AH26 K+sds AH26 K+sds AHPlus MTA MTA AHPlus Diaket Kontrol Diaket Kontrol Kontrol Kontrol D BOŞ BOŞ D C D Endo Endo AH26 AH26 AHPlus AHPlus Kontrol Kontrol K+g K+g K+sds K+sds MTA MTA Diaket Diaket Kontrol BOŞ Kontrol BOŞ D E Kör Kör E Kör 2 Kör E Endo Endo AH26 AH26 AHPlus AHPlus K+g K+g K+sds K+sds MTA MTA Diaket BOŞ Diaket BOŞ BOŞ BOŞ E F BOŞ BOŞ F F Endo Endo AH26 AH26 AHPlus AHPlus K+g K+g K+sds K+sds MTA MTA Diaket BOŞ Diaket BOŞ BOŞ BOŞ F G BOŞ BOŞ G 1Kör 2 Kör 1 Kör 2 Kör 1 Kör 2 Kör 1 Kör 2 Kör G Endo Endo AH26 AH26 AHPlus AHPlus BOŞ BOŞ BOŞ BOŞ G H Kör Kör Kör Kör 1 Kör 2 Kör H H H Tablo 12: Kanal dolgu patlarının solüsyonlarının 96-gözlü plakalardaki yerleşim şeması. K+g: Ca(OH) 2 +gliserin, K+sds: Ca(OH) 2 +steril distile su, Endo: Endometazon civ