İÇİNDEKİLER. Kabul ve Onay İçindekiler Şekiller. Çizelgeler Semboller ve Kısaltmalar

Transkript

1 i

2 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Şekiller Tablolar Çizelgeler Semboller ve Kısaltmalar I II V VIII IX X 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER Biyosensörler Elektrokimyasal Esaslı Biyosensörler Potansiyometri esaslı biyosensörler Amperometri Esaslı Biyosensörler Enzimler Enzim Tabanlı Elektrotlar Enzim İmmobilizasyonu Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri Taşıyıcı Bir Yüzeye Bağlama Adsorbsiyon Kovalent bağlama Tutuklama Çapraz Bağlama Dış Membrana Tutuklama Ağ Deseni Tek Tabaka İçerisine Enzim Yerleştirme İmmobilizasyon Yöntemlerinin Kıyaslanması Glikoz Oksidaz Enzimi Kitin ve kitosan Kitin ve kitosanın uygulamaları Nanopartiküller Nanopartiküllerin Uygulama Alanları Biyosensör Uygulamalarında Nanopartiküllerin Yüzey Modifikasyonu Biyosensörlerin Performans Faktörleri Deneysel Teknikler Elektrokimya Kronoamperometri Dönüşümlü Voltametri 32 3.GEREÇ VE YÖNTEMLER Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Cihazlar ve Gereçler Kullanılan Çözeltiler Fe 3 O 4 Nanopartikül Sentezi Fe 3 O 4 Nanopartikül Karakterizasyonu 36 ii

3 3.5. Kitosan Film Kaplı Fe 3 O 4 Nanopartikül Sentezi Kitosan Film Kaplı Fe 3 O 4 Nanopartikül Karakterizasyonu Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Sentezi Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Karakterizasyonu Karbon Çubuk Yüzeyine Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Modifiyesi Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartiküllerinin Karbon Çubuk Yüzeyine Fiziksel Yöntemle Modifiyesi Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin fiziksel yöntemle modifiye edildiği karbon çubuğun karakterizasyonu Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartiküllerin Fiziksel Yöntemle Modifiye Edildiği Karbon Çubuğa GOx Bağlanması GOx Enzimi Modifiye Edilmiş Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül İçeren Karbon Çubuk Elektrotun Karakterizasyonu GOx ve Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül İçeren Biyosensör İçin En İyi Çalışma Koşullarının Araştırılması Çözelti ph nın Etkisi Partikül Miktarının Etkisi Uygulanan Potansiyel Etkisi Glikoz Derişiminin Etkisi Girişim Yapan Maddelerin İncelenmesi Enzim Elektrodunun Tekrar Kullanılabilirliğinin Belirlenmesi Enzim Elektrodunun Raf Ömrünün Belirlenmesi Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Modifiye Edilmiş Karbon Çubuk Elektrota GOx Enziminin Modifiyesi ve Glikoz Derişiminin Etkisi Biyosensör Çalışmaları BULGULAR Fe 3 O 4 Kimyasal Sentezi ve Karakterizasyon Çalışmaları Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Sentezi ve Karakterizasyon Çalışmaları Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartiküllerinin Boyut Dağılımları ve Zeta Potansiyelleri Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartiküllerinin Manyetik Özellikleri Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül İle Kaplanmış Karbon Rod Elektrota GOx Enziminin Modifiyesi GOx Enzimi Modifiye Edilmiş Fe3O4-Ch-Au Nanopartikül ile Kaplanmış Karbon Rod Elektrot İçeren Biyosensör için En İyi Çalışma Koşullarının Araştırılması Çözelti ph ının Glikoz Cevabına Etkisi Partikül Miktarının Etkisi Uygulanan Potansiyel Etkisi Glikoz Derişiminin Etkisi Enzim Elektrodun Tekrar Kullanılabilirliği Enzim Elektrodun Raf Ömrünün Belirlenmesi Girişim Yapan Maddelerin İncelenmesi Kan Matriksinde Glikoz Tayini 67 iii

4 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Kaynak Taraması Altın nanopartikül kullanılarak yapılan glikoz biyosensör çalışmaları Altın nanopartikül kullanılmadan yapılan glikoz biyosensör çalışmaları Sonuç ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER ÖZGEÇMİŞ 94 iv

5 ŞEKİLLER Sayfa no Şekil 1. Biyosensörün genel şematik gösterimi 1 Şekil 2. Potansiyometrik esaslı biyosensörün şematik 9 gösterimi Şekil 3. Taşıyıcı yüzeye bağlı enzimin şematik gösterimi 15 Şekil 4. Tutuklanmış enzimlerin şematik gösterimi 17 Şekil 5. Bazı bifonksiyonel reaktiflerin kimyasal formülleri 18 Şekil 6. Dış membran tutuklama yöntemiyle hazırlanmış ticari glikoz sensör 19 Şekil 7. Kitinin yapısı 23 Şekil 8. Kısmi deasetillenmiş kitosan yapısı 24 Şekil 9. Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au UV-görünür spektrumları 45 Şekil 10. Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin XRD spektrumu 46 Şekil 11. Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül TEM fotoğrafı 47 Şekil 12. Karbon çubuk elektrodun farklı büyütmelerle alınmış SEM fotoğrafları 48 Şekil 13. Şekil 14. Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül modifiye karbon çubuk elektrodun SEM fotoğrafları Farklı miktarlarda Fe 3 O 4 nanopartikül kullanılarak elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au (1 mg, 4 mg, 7 mg, 10 mg, 13 mg) nanopartiküllerin UV-görünür v

6 spektrumları Şekil 15. Farklı miktarlarda (10-3 M, M, M, M) altın çözeltisi eklenerek elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül UV-görünür spektrumları Şekil 16. Farklı miktarlarda NaOH (1 M ve 2.5 M) kullanılarak elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin UV-görünür spektrumları Şekil 17. Şekil 18. Şekil 19. Şekil 20. Şekil 21. Şekil 22. Şekil 23. a) Fe 3 O 4 -Ch film b) Ch film ve c) Fe 3 O 4 -Ch-Au film FTIR spektrumlar Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerine ait hidrodinamik çaplar Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerine ait zeta potansiyel değeri Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin histerisis eğrileri Dış manyetik alan olmadığında ve dış manyetik alan uygulandığında Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerin çözeltiden toplanması 100 mv/s tarama hızında a) karbon çubuk elektrot, b) Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül ve c) Fe 3 O 4 -Ch-Au-GOx modifiye edilmiş elektrot için taramalı voltamogramı GOx ile modifiye edilmiş Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül ile kaplanmış karbon rod elektrotun glikoza duyarlılığına ph nın etkisi vi

7 Şekil 24. Şekil 25. Şekil 26. GOx ile modifiye edilmiş Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül ile kaplanmış karbon rod elektrodun glikoza duyarlılığına partikül miktarının etkisi GOx ile modifiye edilmiş Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül ile kaplanmış karbon rod elektrodun glikoza duyarlılığına uygulanan potansiyelin etkisi Glikoz eklenmesiyle Fe 3 O 4 -Ch-Au /GOx karbon çubuk elektrot için 0.1 M ph 6.0 fosfat-asetat tampon içerinde elde edilen amperometrik cevap Şekil 27. Fe 3 O 4 -Ch-Au /GOx biyosensörünün aktivitesi 63 üzerine glikoz derişiminin etkisini gösteren Lineweaver Burke grafiği Şekil 28 Enzim elektrodunun tekrar kullanılabilirliğinin incelenmesi (0.1 M ph=6.0 olan fosfat-asetat tamponu, 25ºC) 64 Şekil 29 Enzim elektrodunun raf ömrünün incelenmesi (0.1 M ph=6,0 olan fosfat-asetat tamponu, 25 ºC) 65 Şekil 30 Fe 3 O 4 -Ch-Au/GOx biyosensör için ph 6.0 fosfatasetat tampon çözeltisine mm ürik asit, mm dopamin, mm askorbik asit ve 15 mm glikoz eklendikten sonra elde edilen tipik akım zaman eğrisi 66 Şekil 31 Glikoz biyosensörünün kalibrasyon grafiği (0.1 M ph=6.0 olan fosfat-asetat tamponu, 25 ºC) 67 vii

8 TABLOLAR Sayfa no Tablo 1. Uygun reseptör-transduser bileşenleri ve günümüzdeki durumları 2 Tablo 2. Fe 3 O 4 -Ch-Au /GOx biyosensörü için analitik parametreler 63 Tablo 3. Kan numunelerinin biyosensör ve ticari sensör sonuçları 68 Tablo 4. Altın nanopartikül kullanılarak yapılmış glikoz 69 biyosensör çalışmaları Tablo 5. Altın nanopartikül kullanılmadan yapılmış glikoz 73 biyosensör çalışmaları viii

9 ÇİZELGELER Sayfa no Çizelge 1. İmmobilizasyon yöntemlerinin karşılaştırılması 14 Çizelge 2. İmmobilizasyon yöntemlerinin kıyaslanması 22 ix

10 SEMBOLLER VE KISALTMALAR UV : Ultraviyole TEM : Geçirgenli elektron mikroskopisi Fe 3 O 4 : Demir GOx : Glikoz oksidaz enzimi nm : Nanometre Fe 3 O 4 -Ch-Au : Kitosan ve altın kaplı demir Ch : Kitosan CV : Dönüşümlü voltametri SEM : Taramalı elektron mikroskobu cm : Santimetre s : Saniye Km : Michaelis-Menten sabiti Fe 3 O 4 -Au : Çekirdek-kabuk yapısında demir-altın M : Molar 0 C : Santigrad derece h/h : Hacim/hacim mm : Milimolar Au : Altın ml : Mililitre µl : Mikrolitre rpm : Dakikada dönüş sayısı mv : Milivolt x

11 V : Volt IU : International Unit LOD : Gözlenebilme sınırı LOQ : Tayin alt sınırı dak : Dakika mm : Milimetre µm : Mikrometre %RSD : Yüzde bağıl standart sapma GCE : Camsı karbon elektrot LED : Işık yayan diyot CNT : Karbon nanotüp CR : Karbon çubuk elektrot AuNPs : Altın nanopartikül XRD : X-ışını kırınımı ZETA : Zeta potansiyeli K : Kelvin xi

12 1. GİRİŞ Biyolojik öneme sahip moleküllerin tayini tıp, çevre, ilaç ve gıda endüstrisinde büyük önem taşımaktadır. Hedef biyomolekül tayinini, genel olarak biyolojik tanıma mekanizmalarından (antijen-antikor, enzimsubstrat vb.) yararlanarak yapılmaktadır. Hedef molekülün seçici bir şekilde tayini için hızlı, yüksek hassasiyetli, düşük tayin sınırlarına sahip yeni analitik yöntemlerin geliştirilmesi gerekmektedir. Ayrıca biyolojik ajan tayininde hedef biyolojik molekülün bağlandığı ve tayin edilebilir bir sinyal oluşumu sağlayan bir sensöre ihtiyaç duyulmaktadır. Platform tasarımına bağlı olarak sensör ile hedef ajanın etkileşmesi ile kütle, kapasitans, iletkenlik, yüzey plazmon rezonansında gözlenen fiziksel değişmeler kolaylıkla takip edilebilmektedir. 1 Biyosensörler, genel olarak analizlenecek madde ile seçimli bir şekilde etkileşime giren biyoaktif bir bileşenin, bu etkileşim sonucu ortaya çıkan sinyali ileten bir iletici sistemle birleştirilmesi ve bunların bir ölçüm sistemiyle kombinasyonuyla oluşturulurlar (Şekil 1). Şekil 1: Biyosensörün genel şematik gösterimi 1

13 Biyosensörlerde biyokomponent olarak enzimler yanında doku kültürleri, mikroorganizmalar, organeller, antikorlar ve nükleik asitler de kullanılabilmekte olup ölçüm tekniğine göre amperometrik, potansiyometrik, termal, piezoelektrik, akustik veya optik sensörler olarak adlandırılırlar. 2 Teorik olarak reseptör ve transduserlerin birçok değişik şekilde birleştirilmesi mümkün olmasına rağmen bu bileşimler bir elektrik sinyali oluşturamazlarsa biyosensör işlem gösteremez. Örneğin; transduser olarak bir termistörün kullanılması durumunda substratın dönüşüm reaksiyonu sonucu entalpide bir değişim olmaz ise biyosensör çalışmaz. Tablo 1 de uygun reseptör-transduser bileşimleri ve günümüzdeki durumları hakkında bilgi verilmektedir. 3 Tablo 1: Uygun reseptör-transduser bileşenleri ve günümüzdeki durumları RESEPTÖR TRANSDUSER Enzimler Mikroorganizmalar Organaller Antikorlar Doku Kesiti Nükleik Asitler Kimyasal Reseptörler Elektrotlar a)amperometrik XXX XX XX XX X b) Potansiyometrik XXX XX XX XX X X Transistörler XX X Termistörler X X Optik Fiberler X X Piezoelektrik Kristaller X X X (X) (XX) (XXX) Araştırma aşaması Araştırma ve prototip geliştirme aşaması Araştırma ve ticari üretim aşaması Elektrokimyasal yöntemler, geleneksel olarak organik ve inorganik örnek analizlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Çok daha ucuz ve yüksek seçiciliğe sahip analizlere talep arttıkça spektrofotometri, 2

14 kromatografi gibi iyi bilinen yöntemlerin yanında elektrokimyasal sensörler kullanılmaya başlanmıştır. Biyosensörler, elektrokimyasal sensör araştırmalarının büyük bir kısmını oluşturan gerek organik gerek inorganik örnek analizlerinde kullanım sahaları sürekli artan cihazlardır. Enzim elektrotlar, biyokatalizör olarak enzim ile çevirici olarak elektrodu birleştiren, elektrokimyasal sistemlerin ana bileşenidir. Bu konuda yapılan araştırmalarda ilk olarak, diyabet hastalarına yönelik kandaki glikoz takibi amacıyla glikoz oksidaz (GOx) enzimi ile platin elekrodunu birleştiren bir tasarım gerçekleştirilmiş ve enzim elektrodu olarak isimlendirilmiştir. 4 Glikoz oksidaz enzimi kullanılarak inşa edilen kan glikoz seviyesini amperometrik olarak ölçen elektrokimyasal sensör günümüzde büyük bir ticari başarı sağlamıştır. Bu amaçla, fizyolojik ortamlar ve fermantasyon proseslerinde bulunan glikozun tayini için geliştirilen enzim elektrot tasarımlarında, ucuz ve kolay temin edilebilir olması nedeniyle de birçok çalışmada model enzim olarak GOx, elektrot tasarımlarında kullanılmaktadır. Çok sayıda diyabet hastasının varlığı, kan şekerini ölçebilen ucuz ve basit glikoz tayini yapabilen glikoz elektrotları ihtiyacını doğurmuştur. Ayrıca, glikoz elektrotları, fermantasyon endüstrisi gibi glikoz miktarının kontrol edilmesi gereken alanlarda ve biyoyakıt pillerinde anot bileşeni olarak glikozun yükseltgenmesinde görev almaktadır. Biyosensör olarak kullanılan enzim elektrotlarda kısa sürede, yüksek seçicilikte ve hassasiyette analiz yapabilme özelliği, biyoyakıt pilinde ise anot olarak kullanımında yüksek akım yoğunluğuna sahip olması istenen özelliklerdir. Günümüzde kandaki glikozun kantitatif tayini halen en aktif araştırma konusudur ve geniş ilgi görmektedir. 5 Glikoz miktarının tespiti spektroskopik 6,7 ve elektrokimyasal 8 olarak sağlanmaktadır. Katı elektrotların yüzey özelliklerinin kontrolü, glikozun tayini için elektrokimyasal yöntemlere yeni yaklaşımlar sağlamaktadır. 3

15 Elektrokimyasal yöntemlerin basitliği glikozun tayini için çok avantajlı yaklaşımlar sağlamaktadır. 9 Nano boyutlu partiküller, yüksek yüzey alanları, farklı optik ve elektronik özelliklere sahip olduklarından dolayı modern teknolojik sistemlerde kullanılabilirliklerinin araştırılması önem kazanmıştır. Nanopartiküller sadece yapısal özellikleri ile değil fonksiyonel özellikleri ile de üstün malzemelerdir. Çeşitli yöntemler kullanarak yığın özelliklerinin yanında fonksiyonel özelliklerinin değiştirilmesi sağlanabilir. Nanopartiküllerin elektronik 10, optik 11 ve katalitik 12 özellikleri, onların kuantum 13 seviyesindeki boyutlarından kaynaklanmaktadır. Çok farklı uygulamalar için polimerik polistiren (PS), polimetilmetakrilat (PMMA), vb. 14 inorganik PbS, Ag 2 S, CdSe, Ti0 2, vb. 15 ve metalik Au, Ag, vb. 16 nanopartiküller üretilmiştir. Bu partiküller, mikroemülsiyon, ters-misel oluşumu, elektrobiriktirme vb. iyi tanımlanmış çok basit sistemlerde üretilebilmektedir. Bu partiküller çeşitli substrat yüzeylere metalik Au, Al, cam, silika, vb. farklı fiziksel, kimyasal veya kendiliğinden yerleşme yöntemleriyle nano düzenli yapılar oluşturmak üzere yerleştirilebilmektedir. Metal nanopartiküller arasındaki yüzey modifiye edilebilmektedir. Nano yapıların bu özellikleri sayesinde çeşitli analitlerin miktar tayini analizleri yapılmıştır. Bunların içinde modifikasyon için en uygun olan altın nanopartiküllerdir. 17 Yürütülen tez çalışması kapsamında, glikozun tayini için manyetik altın nanoküre-kitosan polimer (Fe 3 O 4 -Ch-Au) karışımından oluşan filmin kullanıldığı yeni bir amperometrik biyosensör hazırlanmıştır. Yeni bir sentez yöntemiyle hazırlanan manyetik nanopartiküller kitosan matriksi ile karbon elektrot üzerinde film oluşturulmuştur. Bu nanopartikül film yüzeyine glikoz oksidaz (GOx) enzimi glutaraldehit kullanılarak immobilize edildikten sonra nanopartikül-kitosan filmi elektrodun dış yüzeyine kaplanarak seçici bir elektrot inşa edilmiştir. Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül film enzim immobilizasyonu için büyük yüzey alanı ve elektrik 4

16 iletkenliğe sahiptir. Geliştirilen elektrodun karakterizasyonu için dönüşümlü voltametri (CV) ve taramalı elektron mikroskopu (SEM) kullanılmıştır. Enzimin optimum çalışma koşullarının belirlenmesi için, film kalınlığı, ph ve uygulanan potansiyel-akım değerleri araştırılmıştır. Ayrıca enzim elektrotunun raf ömrü, kararlılığı ve girişim yapan türlerin etkisi de incelenmiştir. Geliştirilen elektrodun analitik performansı, kan referans standartlarında glikoz seviyesi ölçülerek test edilmiş, sonuçlar ticari glikoz sensörü ile karşılaştırılmıştır. 5

17 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Biyosensörler Biyosensör teknolojisinin tarihsel geçmişine bakıldığında bu alandaki ilk çalışmaların enzim sensörleriyle başladığı görülmektedir. Biyosensörlerin tarihi 1950 li yılların ortalarında L.C. Clark ın Cincinnati Hastanesinde (Ohio, ABD) ameliyat sırasında kanın oksijen gaz miktarını bir elektrot ile izlemesiyle başlar yılında Clark ve Lyons ile 1967 de Updike ve Hick tarafından yayınlanan glikoz tayinine yönelik glikoz oksidaz enzim elektrotları bu konudaki ilk örnekleri oluşturmuştur İlk ticari olarak üretilmiş biyosensör Spring Instruments (Yellow Springs, OH, USA) tarafından 1975 yılında piyasaya sürülmüştür. Böylece, Clark ve Lyons glikoz oksidaz enzimini oksijen elektrotu ile birleştirerek kanın glikoz düzeyini ölçmeyi başarmışlardır. Bu sistem bir yandan biyolojik sistemin (enzim) yüksek seçimliliği diğer taraftan ise fiziksel sistemin (elektrot) tayin duyarlığını birleştirmiş ve geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Literatürde ilk biyosensör kelimesi ise Cammann ve arkadaşları tarafından 1977 de enzimle modifiye edilmiş iyon seçimli elektrotlar için kullanılmıştır. 21 Biyosensörler; genel anlamda bir biyoaktif tabaka, sinyal iletici sistem ve kaydediciden oluşur. Biyoaktif tabaka; uygun bir sinyal iletim sistemiyle ya da diğer bir değişle uygun bir sensörle birleştirilen ve analizlenecek maddeyi tanıma veya spesifik olarak dönüşüme uğratma yeteneğine sahip biyolojik kökenli yapılardır. Geliştirilen birinci nesil biyosensörlerde elektron alıcı olarak oksijen kullanılırken, ikinci nesil biyosensörlerde elektron alıcı olarak redoks medyatörleri kullanılmaya başlanmıştır. Üçüncü nesil biyosensörlerde enzimin indirgenme yükseltgenme merkezi ile elektrot yüzeyi arasında doğrudan elektriksel iletişim sağlanmış ve indirgenme yükseltgenme medyatörlerine gereksinim kalmamıştır. 22 6

18 Biyosensör tanımına ait en iyi bilinen örnek elektrokimyasal glikoz biyosensörleridir Burada biyokimyasal çevirici olan GOx, analizi yapılan glikoz molekülleriyle etkileşmekte ve bir biyolojik sinyal (ürün) olan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) oluşturmaktadır. Fiziksel çevirici olan elektrot (genellikle amperometrik) ise analizi yapılan glikoz derişimi ile doğru orantılı miktarda oluşan hidrojen peroksidi uygun çalışma potansiyelinde yükseltgeyerek yanıt akımının oluşmasını sağlamaktadır. Böylece elde edilen akım değerleri analizi yapılan glikoz derişimi ile doğru orantılı olmakta ve miktar tayini olanaklı olabilmektedir. Biyosensörler uygulama alanı olarak; tıp, tarım, gıda, eczacılık, çevre kirliliği, savunma ve pek çok endüstriyel aktivitede özellikle otomasyon, kalite kontrolü, durum tesbiti ve enerjinin saklanmasında çok önemli rol oynarlar. Biyosensör sistemler için olası uygulama alanları genel olarak, klinik teşhis, biyomedikal sektör, proses kontrolü, biyoreaktör kontrol ve analitiği, gıda üretimi ve analizi, tarım sektörü ve veterinerlik, bakteriyal viral teşhis, ilaç analizi, endüstriyel atık ve su kontrolü ve askeri uygulamalardır. Bugüne kadar 180 den fazla farklı madde için biyosensör hazırlanmış olup, bunlardan ancak 25 kadarı ticari olarak üretilmektedir. 32 Biyoteknoloji ve gıda endüstrisinde başta glikoz olmak üzere birçok monosakkarit, amino asitler, organik asitler (laktik asit), üre ve alkol tayinlerinde enzim sensörleri kullanılmaktadır. Ayrıca gıdalardaki yabancı maddeler (pestisitler, toksinler ve yabancı hormonlar vb.) yanında aroma ve tazelik kontrolü gibi kompleks parametreler için de biyosensörler hazırlanabilir. 33, Elektrokimyasal Esaslı Biyosensörler Elektrokimyasal esaslı biyosensörler yaklaşık elli yıldır uygulamalı araştırmanın temel konusu olmuştur. Son 20 yıldır ise bu 7

19 sensörlerle ilgili araştırma ve geliştirme çalışmaları gerek finansal yatırım gerekse yayın açısından oldukça artmıştır. Enzim elektrotlar ince bir enzim tabakası ile kaplanmış elektrokimyasal sensörden oluşmuştur. Genellikle ya enzim tabakası ile analiz çözeltisi arasına, ya enzim tabakası ile elektrot arasına ya da her ikisine birden yarı geçirgen bir zar tutturulmuştur. Elektrot analiz çözeltisine daldırıldığında substrat enzim tabakası içine difüzlenir. Enzimatik reaksiyonların sonucunda hem substratın hem de ürünün derişimleri değişir. Verilen bir zaman periyodunda substrat tüketilme hızı ile ürünün oluşma hızının eşit olduğu bir yatışkan hal durumuna ulaşılır. Elektroaktif türün bu değişen derişimi ya potansiyometrik 35 ya da amperometrik 36 olarak gözlenir Potansiyometri esaslı biyosensörler Akımın çok az geçtiği veya hiç geçmediği sistemlerde, indikatör elektrotun referans elektrota karşı gösterdiği, derişim değişimine bağlı olarak değişen potansiyelin ölçüldüğü tayin yöntemine potansiyometri denir. Potansiyometrik ölçümler, akımın olmadığı şartlar altında veya akım ihmal edilebilir düzeyde iken bir hücrede potansiyel ölçümünü esas alır. Potansiyeldeki değişme, referans elektrot ile analit madde arasında ölçülen aktivite ile orantılıdır. Numune potansiyometrik sensöre yavaşça difüzlenir ve herhangi bir değişime uğramadan ayrılır. Potansiyometrik biyosensörlerde kullanılan temel sensörler ph ya da tek değerlikli iyonlara duyarlı cam elektrotlar, anyon veya katyonlara duyarlı iyon seçimli elektrotlar ve karbondioksit ya da amonyağa yönelik gaz duyarlı elektrotlardır. Potansiyometrik iyon seçici elektrotlar arasında en kullanışlı olanı gaz problarıdır ve iyon seçici elektrotun gaz seçici membranla yer değiştirmesiyle yapılır. Potansiyometrik esaslı bir gaz probu şematik olarak Şekil 2 de gösterilmiştir. 8

20 Şekil 2: Potansiyometrik esaslı biyosensörün şematik gösterimi Amperometri esaslı biyosensörler Amperometri genel anlamda belli bir potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümünü esas alır. Amperometrik biyosensörlerde iki veya üç elektrotlu sistemler kullanılmaktadır. İki elektrotlu sistem çalışma ve referans elektrottan oluşmaktadır. Uygulanan potansiyel iki elektrot arasındaki potansiyel farkıdır. Üç elektrotlu sistem çalışma, referans ve karşıt elektrottan oluşmaktadır. Amperometrik sensörlerde substrat konsantrasyonuyla doğru orantılı bir yanıt elde edilir. Bu enzim elektrotlarında, ya susbtrat ya da enzimatik tepkimenin ürünü elektrot yüzeyinde elektroaktif (yükseltgenebilir veya indirgenebilir) olmalıdır. Söz 9

21 konusu akım yoğunluğu çalışma elektrodunda yükseltgenen ya da indirgenen elektroaktif türlerin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak tanımlanır. Kalibrasyondan sonra, akım yoğunluklarından ilgili türlerin konsantrasyonlarının belirlenmesinde yararlanılır. 37 İletici sistem olarak bir amperometrik sensörün kullanılması durumunda potansiyometrik sensörlerden en büyük fark, ürünlerden sinyal oluşturan türün elektrot yüzeyinde tüketilmesidir. Oksijen tüketimine ilişkin reaksiyonlar aşağıda verilmiştir. Katodik reaksiyon; O 2 + 2H 2 O + 2e - H 2 O 2 + 2HO - H 2 O 2 + 2e - 2HO - Anodik reaksiyon; Ag + Cl - AgCl + e - Toplam reaksiyon; 4Ag + O 2 + 2H 2 O + 4Cl - 4AgCl + 4HO - Amperometrik biyosensörlerde iki veya üçlü elektrot sistemleri kullanılabilmektedir. İki elektrotlu sistem referans ve çalışma (immobilize olmuş biyotanıma bileşeni içeren) elektrotlarından oluşur. İki elektrotlu sistemin en büyük dezavantajı yüksek akımlarda çalışma elektrot yüzeyine potansiyelin sınırlı kontrolüdür ve bundan dolayı, lineer aralık kısa kalmıştır. Bu problemi çözmek için, üçüncü bir karşıt elektrot devreye girer. Potansiyel, referans ve çalışma elektrot arasında uygulanır ve akımın çalışma ve karşıt elektrot arasında akışı gözlenir. 38 Amperometrik biyosensörler genelde glikoz, laktat 39 ve salisilik asit 40 gibi analitler için kullanılır. Aynı zamanda, model Bacillus cereus ve Mycobacterium smegmatis 41, Francisella tularensis in serolojik teşhisi 42 ve pestisitlerin tayininde 43 de kullanılmaktadır. Amperometrik biyosensörler aynı zamanda 16S rrna ölçümü için kullanılan patojenler 10

22 gibi biyotanıma bileşenleri veya bir belirteç (marker) olarak davranan nükleik asitler için de kullanılmaktadır Enzimler Enzimler, canlı için yaşamsal önemi olan pek çok fonksiyonun kontrolünde rol alan, bir yandan da organizmada hemen hemen bütün kimyasal tepkimelere katılan ve bu tepkimelerin oluşumlarını inanılmaz boyutlarda hızlandıran biyolojik katalizörlerdir. Çok defa renksizdirler, bazen sarı, yeşil, mavi, kahverengi ya da kırmızı olabilirler. Suda ya da tuz çözeltisinde çözülebilirler. Her enzim bir biyokatalizördür. Başka bir deyişle, enerji açısından normal koşullarda hiç gerçekleşemeyecek ya da çok yavaş gerçekleşebilecek kimyasal tepkimelere katılarak, kendileri bir değişikliğe uğramadan, bu tepkimelerin çok hızlı bir şekilde gerçekleşmesini sağlarlar Enzim Tabanlı Elektrotlar En genel anlamda bakıldığında diğer biyosensörlerde olduğu gibi enzim sensörleri de biyoaktif tabaka, iletici ve ölçüm sisteminden oluşur. Diğer biyosensörlerden tek fark biyoaktif tabakada biyomolekül olarak enzimlerin yer almasıdır. Buna karşılık diğer biyosensörlerde olduğu gibi biyoaktif tabakanın iç ve dış yüzeylerinde membranlar, iletici ile ölçüm düzeneği arasında sinyal yükselticiler, mikroişlemciler veya ölçüm düzeneğiyle bağlantılı kaydedici veya bilgisayar sistemleri gereksinimlere göre eklenen unsurlardır. 37,45,46 11

23 Enzim İmmobilizasyonu Biyosensörler ve enzimatik yakıt pilleri alanındaki gelişmeler arttıkça enzim aktivitesi kaybı, enzim ömrü ve stabilitesiyle ilgili problemler de artmaktadır. Bunlara ek olarak enzimatik cevap süresinin kısalığı ve tek kullanımlık cihazlara olan ihtiyacın artması da söz konusudur. Bu problemlerin üstesinden gelebilmek için farklı immobilizasyon yöntemleri geliştirilmiştir. İletken bir yüzey üzerine enzim immobilizasyonu yapılırken uygulanan yöntem, oluşturulan elektrokimyasal cihazın performansıyla birinci dereceden ilişkilidir. 47 Bu sebeple enzim molekülünün etkin bir şekilde yüzeyde tutunabilmesi için uygulanan immobilizasyon yönteminin; Enzimin çevirici yüzey üzerine etkili ve kararlı bir şekilde tutunmasını sağlaması, Enzimin biyolojik özelliklerini etkilememesi, Biyouyumlu ve kimyasal olarak inert olması gerekmektedir. Enzim, bir yüzey üzerine immobilize edilirken, seçilen yöntem çok önemlidir. Uygulanan yöntem enzimin aktif merkezindeki kimyasal yapıyı ya da reaktif grupları değiştirerek enzim aktivitesinde bir kayba sebep olmamalıdır. Bir başka deyişle enzim immobilizasyonu enzime olabildiğince az hasar vererek yapılmalıdır. Enzimin aktif merkezi hakkındaki bilgilerin fazla olmasıyla bu hasar minimuma indirilebilir Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri Enzimler suda çözünmeyen bir taşıyıcıya fiziksel veya kimyasal olarak bağlanarak, suda çözünmeyen bir kopolimere enzim molekülünün monomer gibi katılması sağlanarak ve suda çözünmeyen mikro kapsüllerde tutuklanarak immobilize edilirler. İmmobilize enzimin 12

24 serbest enzime göre avantajları: Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir (süzme, santrifüjleme), çevre koşullarına (ph, sıcaklık v.s) karşı dayanıklıdır, birçok kez ve uzun süre kullanılabilir, sürekli işlemlere uygulanabilir, doğal enzime kıyasla daha kararlıdır ve ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir, birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur, bazı durumlarda serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterilebilir, enzimin kendi kendini parçalaması olasılığını azaltabilir ve mekanik çalışmalar için uygundur. 48 İmmobilize edilmiş enzimlerin hareketleri sınırlandırılmış olmakla birlikte tam olarak hareketsiz hale getirilememektedir. İmmobilizasyon, biyosensörlerin kararlılığı ve tekrar kullanımı açısından büyük avantaj sağlamaktadır. Çizelge 1 de sırasıyla immobilizasyon yöntemlerinin karşılaştırılması ve immobilizasyon yöntemi, taşıyıcı ve reaktör seçimini etkileyen faktörler gösterilmiştir

25 Çizelge 1: İmmobilizasyon yöntemlerinin karşılaştırılması 22 Taşıyıcıya Bağlama Yöntemi Karakteristik Kovalent Adsorpsiyon İyonik Çapraz Tutuklama Bağlama Bağlama Bağlama Yöntemi Yöntemi Hazırlama Zor Kolay Kolay Zor Zor Enzim aktivitesi Yüksek Düşük Yüksek Orta Yüksek Substrat spesifikliği Değişebilir Değişmez Değişmez Değişebilir Değişmez Rejenerasyon Mümkün Mümkün Mümkün Mümkün Mümkün değil değil değil Genel uygulanabilirlik Orta Düşük Orta Düşük Yüksek İmmobilizasyon Yüksek Düşük Düşük Orta Düşük maliyeti Bağ gücü Kuvvetli Zayıf Orta Kuvvetli Kuvvetli Taşıyıcı bir yüzeye bağlama Taşıyıcıya bağlama en eski immobilizasyon yöntemidir. Bu yöntemde bağlanan enzim miktarı ve immobilize enzim aktivitesi taşıyıcı yüzeyin özelliklerine bağlıdır. Şekil 3, taşıyıcı yüzey üzerine bağlı enzim molekülünü şematize etmektedir. 49,50 14

26 Şekil 3: Taşıyıcı yüzeye bağlı enzimin şematik gösterimi Adsorbsiyon İmmobilizasyonda kullanılan en eski ve basit yöntemdir. 37 Katı matriks üzerine enzim kolay ve hızlı bir şekilde fiziksel adsorbsiyon yöntemi kullanılarak immobilize edilmektedir. Yöntem yüzey aktif, suda çözünmeyen bir adsorbanın enzim çözeltisi ile karıştırılması ve enzimin aşırısının iyice yıkanarak uzaklaştırılması temeline dayanır. Bu yöntemde enzim ile matriks arasında Van der Waals gibi zayıf bağlar ile hidrofobik, hidrofilik veya iyonik etkileşimler meydana gelmektedir. Enzimin aktif bölgesi bu bağlanmadan etkilenmez ve aktivitesini korur. 51 Enzim immobilizasyonunda en çok kullanılan adsorbanlar aktif karbon, gözenekli cam, diatome toprağı, CaCO 3, kül, silikajel, bentonit, hidroksiapatit, nişasta, glüten ve kalsiyum fosfattır. Birçok enzimin immobilizasyonu adsorbsiyon yöntemine göre gerçekleştirilmektedir. Çözünmeyen enzimler için adsorbsiyon yönteminin temel avantajı kimyasal madde kullanmaya gerek olmaması ve hazırlanması basit birkaç adımda gerçekleştirilebilmesidir. Sonuç olarak 15

27 adsorbsiyon ucuz, kolay uygulanabilir ve enzimleri etkilemeyen bir yöntemdir. 52 Zayıf bağlar nedeniyle protein desorbsiyonu (ph, sıcaklık ve iyon yükünün değişmesinden kaynaklanan) problem olarak görülmektedir. Diğer bir dezavantajı ise spesifik bir adsorbsiyon olmadığından diğer protein yapıdaki biyolojik maddelerde yüzey de girişim yapabilmektedir Kovalent bağlama Biyoalgılayıcının iletici yüzeyine kimyasal bir reaksiyon sonucu bağlanmasıdır. Enzimlerin reaktif taşıyıcılara kovalent bağlanması protein kimyasında genelde bilinen yöntemlerle ve çoğunlukla sulu ortamda gerçekleştirilir. Enzimler doğrudan dönüştürücüye veya önceden uygun bir film veya tabaka ile kaplanmış dönüştürücüye kovalent olarak bağlanabilirler. Enzimler aktifleştirilmiş dönüştürücü yüzeylerine bağlanabileceği gibi önceden uygun bir malzemeye kovalent bağlanarak immobilize edilen enzim preparatının dönüştürücü yüzeyinde bir film veya tabaka oluşturmasıyla da biyosensörler hazırlanabilir. 37 Enzimlerin kovalent bağlanmasında dikkat edilecek önemli nokta, bağlanmanın enzim aktivitesi için aktif merkezdeki amino asitler üzerinden gerçekleşmemesi ve bu grupların sterik olarak rahatsız edilmemesidir. Kovalent bağlanma enzim molekülü üzerindeki fonksiyonel gruplar üzerinden gerçekleşir. 37 Enzimin bir substrat yüzeyine kovalent bağlanması için etil(dimetilaminopropil) karbodiimid etil(dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC)-N-hidroksisüksinimid (NHS) katalizörü varlığında karboksilat grubu ile primer amin grubu arasında amid bağı ile gerçekleştirilir. Bu reaksiyon için suda çözünebilir özellikteki karbodiimidler; karboksil grubu ile aktif ester ara ürünü olusturmak için suda çözünebilen sülfo-nhs ile birlikte kullanılırlar

28 Tutuklama Prensip olarak tutuklama enzim molekülünü belirli bir mekânda kalmaya zorlamaktır. Başka bir tanımla enzim tutuklama yöntemi, enzim molekülünün polimer ya da membran matrisinin örgü yapısının içerisine sabitlenmesini temel almaktadır. Bu tutuklama işlemi enzim substratının difüzyonuna izin verecek şekilde yapılır. Difüzyonu sağlayan bu yapı kafes (lattice) ve mikro kapsül olmak üzere ikiye ayrılır. Şekil 4 de tutuklanmış enzim molekülleri şematik olarak gösterilmiştir. Bu yöntem, enzimin bir jel ya da membran matrisine bağlanmamasından dolayı kovalent bağlama ve çapraz bağlamaya göre farklılık göstermektedir. Bu da geniş kullanım alanı sağlamaktadır. Ancak kimyasal polimerizasyon reaksiyonlarında uygulanan koşullar enzim aktivitesini düşürebilmektedir. Bundan dolayı enzim immobilizasyonu için uygun koşulların sağlanması çok önemlidir. Bu yöntem enzimler yanında organeller, hücreler ve antikorlar için de uygulanabilir. Elektrokimyasal polimerleşme diğer bir tutuklama yöntemidir. 55 Şekil 4: Tutuklanmış enzimlerin şematik gösterimi Çapraz Bağlama Bu yöntemde tutuklama ve kovalent bağlama yöntemlerinin birlikte uygulanmasıyla biyosensör hazırlanır. Yöntemde enzim immobilizasyonu, enzim proteinlerinin diğer protein moleküllerine ya da 17

29 fonksiyonel gruplara moleküller arası çapraz bağlanmasıyla gerçekleşir. Çapraz bağlanma derecesi ve immobilizasyon, protein ve reaktif derişimine, ph ya ve immobilize edilecek enzimin özelliklerine çok bağlıdır. Çapraz bağlamada sık olarak kullanılan kimyasallar; glutaraldehit, 1,5 difloro-2,4 dinitrobenzen, 2-izosiyanato-4- izotiyosiyanato-toluen, hekzametilen diizosiyanat ve disüksinil suberattır. 52 İki fonksiyonlu reaktifler enzimler yanında organeller, hücreler ve antijenlerin immobilizasyonunda da uygulanır. Bazı çapraz bağlayıcıların formülleri Şekil 5 de verilmiştir. 37 Şekil 5: Bazi bifonksiyonel reaktiflerin kimyasal formülleri Çapraz bağlamada bu reaktifler arasında en sık kullanılan bağlayıcı ajan glutaraldehittir. Bağlanma reaksiyonları ağır koşullarda gerçekleşir. Bu koşullar enzimin aktif bölgesinde konformasyon 18

30 değişikliklerine yol açabileceği gibi enzim aktivitesine de sebep olabilmektedir Dış membrana tutuklama Bu yöntem elektrot yüzeyindeki membran içerisine enzimin hapsedilmesiyle gerçekleştirilir. Membran içerisinde kalan uygun boşluklardan substrat difüze olur ve reaksiyon gerçekleşir. Çok çeşitli sayıda membran bulunmaktadır. Örneğin naylon, selüloz nitrat, selüloz asetat, epoksi reçinesi, kollagen, polisülfonlar, poliakrilatlar ve polikarbonatlar v.s. Bu yöntemin dezavantajları substratların, oluşan ürünlerin ve membranda bulunan inhibitörlerin hareketi ile ilişkilidir. Bu maddeler enzim tabakasının inhibisyonuyla hatalı ölçüm almasına sebep olabilirler. 56 Şekil 6 da bu yöntemle hazırlanmış bir ticari glikoz sensör şematize edilmiştir. Şekil 6: Dış membran tutuklama yöntemiyle hazırlanmış ticari glikoz sensör 56 19

31 Ağ deseni Glutaraldehit enzim moleküllerini ağ deseni şeklinde sararak onları çözünmez ve dayanıklı hale getirmektedir. İmmobilize olan enzimin kararlılığını artırmak için ağ deseni yöntemi inert proteinlerin bulunduğu ortamlarda yapılır. Bu immobilizasyon yönteminin avantajları enzim-enzim ve enzim-protein bağlanmasını oluşturmaktadır. Ağ deseni yöntemi difüzyona engel olabilecek yapılar oluşturabildiği gibi bu yöntemle hazırlanan biyosensörün cevap zamanı yüksek olabilmektedir Tek tabaka içerisine enzim yerleştirme Bu yöntem son zamanlarda biosensör yapımında sık kullanılmaktadır. Bu yöntem kontrollü ve odaklamalı enzim immobilizasyonuna imkân sağlamaktadır. Böylece altın, platin ve gümüş gibi metalik elektrotların üzerine istenilen şekilde enzim immobilizasyonu yapılabilmektedir. 52 Pratik olarak bazı moleküller (tiyoalkanlar, silanlar vb. gibi) elektrot yüzeyinin aktivasyonunda ve tek tabaka şeklinde elektrotun yüzeyinde yer alırlar. 56 Enzim immobilizasyonu için spesifik moleküller kullanılarak hazırlanan bazı tek tabakalar kovalent bağlanma ya da spesifik bağ (enzim affinitesi ya da protein-ligand tanıma işlemi) oluşturabilmektedir. Bu yöntemle asit grupları, süksinimid ve karbonamid grupları ile amin grupları ise glutaraldehitle aktifleştirilir. Özetle enzim immobilizasyonu için; tutuklama 57, çapraz bağlama 58,59, adsorpsiyon 60 ve alternatif olarak bu metodolojilerin kombinasyonuna 61 literatürde yer verilmiştir. 20

32 İmmobilizasyon Yöntemlerinin Kıyaslanması Enzimlerin çoğuna uygulanabilen çok sayıda immobilizasyon tekniği geliştirilmesine karşın, enzimlerin bileşenlerinin ve kimyasal özelliklerinin oldukça geniş, ürünlerin ve substratların farklı özelliklerde olmaları nedeniyle bütün enzimler veya uygulamalar için geçerli tek bir yöntem belirlemek mümkün değildir. Bu nedenle immobilizasyonu düşünülen her farklı enzim için ve her farklı durumda bir veya birkaç değişik yöntem önerilebilir. Çizelge 2 de immobilizasyon yöntemlerinin kıyaslanmaları gösterilmiştir. 62 Çizelge 2: İmmobilizasyon yöntemlerinin kıyaslanması 62 Karakteristik Karşı Bağlanma Fiziki Adsorpsiyon İyonik Bağlanma Şelat veya Metale Bağlama Kovalent Bağlanma Tutuklama Hazırlama Orta Kolay Kolay Kolay Zor Zor Bağlanma Gücü Güçlü Zayıf Orta Orta Güçlü Orta Enzim Aktivitesi Düşük Orta Yüksek Yüksek Yüksek Düşük Desteğin Tekrar Kullanılabilirliği İmmobilizasyon Maliyeti İmkansız Mümkün Mümkün Mümkün Nadiren İmkansız Orta Düşük Düşük Orta Yüksek Orta Kararlılık Yüksek Düşük Orta Orta Yüksek Yüksek Genel Uygulanabilirlik Enzimin Mikrobiyal Ataklara Karşı Korunabilmesi Hayır Evet Evet Evet Hayır Evet Mümkün Hayır Hayır Hayır Hayır Evet 21

33 2.3. Glikoz Oksidaz Enzimi Glikoz Oksidaz enzimi (GOx) (EC , β-d-glikoz:oksijen oksidoredüktaz), β-d-glukopiranoz a (6 karbonlu glikozun hemiaketal formu) bağlanır ve şeker molekülünün moleküler oksijen ile yükseltgenip glukono-δ-lakton (glukono-1,5-lakton) ve hidrojen peroksidin (H 2 O 2 ) oluştuğu reaksiyonun katalizlenmesini sağlar. 63 Lakton sulu ortamda herhangi bir enzime ihtiyaç duymaksızın hidroliz olarak glukonik asite dönüşür. Reaksiyon flavoenzimin önce indirgendiği ve sonra da yükseltgenmesinin meydana geldiği iki basamak üzerinden yürür. İndirgenme yarı basamağında glikoz iki proton ve elektronu enzime aktarıp glukonolaktona dönüşür. Yükseltgenme yarı basamağında ise enzim moleküler oksijen ile yükseltgenir ve hidrojen peroksit oluşur. 64 Verilen tepkime GOx enziminin bünyesinde bulunan FAD grubu üzerinden yürümektedir. 63 FAD nin indirgenme özelliği riboflavin molekülünün indirgenmesi esasına dayanır. FAD elektron akseptörü olarak davranarak glikozu yükseltger; ardından moleküler oksijeni indirgeyerek hidrojen perokside dönüştürür ve kendisi tekrar oksitlenmiş formuna dönüşür. 63 Reaksiyon tepkime mekanizma şu şekilde gösterilebilir: 22

34 2.4. Kitin ve kitosan Kitosanın tarihi 1859 yılında Rouget in kitinin deasetilasyon formunu oluşturmasına dayanır. 65 Kitin, β(1 4)-bağlı 2-asetamit-2-deoksiβ-D-glikoz 66 (N-asetilglikozamin) den oluşan ve dünya üzerinde selülozdan sonra en sık rastlanan doğal polisakkarittir. (Şekil 7) Şekil 7: Kitinin yapısı Kitin, selüloz üreten organizmalarda meydana gelmese de genelde bir selüloz türevi olarak gösterilir. Yapı olarak selüloz ile aynıdır 23

35 fakat kitin, C-2 pozisyonlarında asetamit gruplarına (-NHCOCH 3 ) sahiptir. Benzer olarak kitinin temel türevi, kitosan, α(1 4)-bağlı 2-amin-2-deoksiβ-D-glikopiranoz un bir lineer polimeridir ve kolaylıkla N-deasetilasyon ile sentezi gerçekleştirilebilir. Sonuç olarak kitosan N-asetilglikozamin ve glikozaminin kopolimeridir (Şekil 8). Kitosan biyoparçalanabilir, antimikrobiyal karakteristiğe sahiptir ve toksik değildir. 67 Kitinin yıllık üretimi selüloz kadar fazladır. Kitin, sadece az kullanılan bir kaynak olduğu için değil, aynı zamanda oldukça öneme sahip kitin kimyasında da yeni gelişmelere ve çeşitli alanlarda yüksek potansiyele sahip yeni fonksiyonel biyomateryal olması açısından ilgi çekici olmuştur. Şekil 8: Kısmi deasetillenmiş kitosan yapısı Kitin omurgasızların içyapısının yanı sıra kabuğunda bulunan beyaz, sert, elastik olmayan, azotlu polisakkaritlerdir. Bu tür doğal polimerlerin atığı kıyı bölgelerde yüzey kirliliğinin ana kaynağıdır. Kitosan kabuklu hayvanların kabuğundan üretimi veya karotenoidlerin geri dönüşümünü içeriyorsa ekonomik olarak uygundur. 68 Doğal olarak bol bulunan ve yenilenebilir polimerlerden olan kitin ve kitosan; adsorpsiyon, toksik olmamak, biyouyumluluk, biyoparçalanabilme gibi mükemmel özelliklere sahiptir. 69 Kitosanın reaksiyonu amin gruplarının varlığından dolayı selüloz reaksiyonlarına göre daha geniş yelpazeye sahiptir. Kitosanın fonksiyonel türevlerini 24

36 kimyasal modifikasyon, 70 aşı reaksiyonları, iyonik etkileşimler yoluyla hazırlamak için bir çok çalışma yapılmıştır. 71 Kitosan sadece bazı asitlerin sulu çözeltilerinde çözünür. Çeşitli suda çözenebilen 73 ve yüksek şişme özelliğine 72 sahip türevleri elde edilmesine rağmen bu yöntemler kullanılarak yaygın organik çözücülerde çözünürlüğünü geliştirmek zordur. Diğer taraftan, çalışmaların bir kısmı ise kitin/kitosanın biyomedikal uygulamaları üzerine yapılmış, fakat uygulamaların tam kapsamlı araştırılması henüz tamamlanmamıştır. Birincil amino grupları kitosana, çok sayıda anyonlarla ve diğer negatif yüklü moleküller ile reaksiyona girebilecek imkânı sağlarken katyonik gruplar ise, suda çözünebilirlik ve hemokompatibilite gibi bazi spesifik özellikler sunar. Hidroksil grupları ise diğer molekül ve polimerlere modifikasyon bölgeleri sağlamaktadır. 77 Selüloz, dekstrin, pektin, alsinik asit, agar, agaroz ve karanejan gibi doğal olarak meydana gelen polisakkaritlerin çoğu doğal ve doğada asidik olarak bulunurken kitin ve kitosan çok yüksek bazik özelliğe sahip polisakkaritlere örnektir. Kitin ve kitosanın bu özelliği; çeşitli çözelti ve farklı viskoziteye sahip ortamlarda çözünebilirlik, polielektrolit davranışı, polioksintuzların oluşumu, film oluşturabilme özelliği, metal şelasyonu, optik ve yapısal karakterizasyonu sağlamaktadır. 78 Kitinin β(1 4)-anhidroglikozidik bağı selüloz içerisinde de bulunmasına rağmen kitin/kitosanın karakteristik özelliği selülozda bulunmaz. 79 Kitosan 6,3 den daha yüksek ph değerlerinde çözünmez. 80 Kitin yüksek hidrofobisiteye sahiptir ve suda ve çoğu organik çözücüde çözünmez. Kitin, %5 lityum klorür (LiCl), dimetilasetamit (DMAc) ve mineral asitlerin sulu çözeltileri ile birlikte hekzafloroizopropanol, hekzafloroaseton ve kloroalkoller içerisinde çözünür. Dutta ve arkadaşları son çalışmalarında N-metil morfolin-n-oksit (NMMO)/H 2 O içerisinde kitosanın çözünürlüğünü göstermişlerdir. 80,81 Sıkı şartlar altında ise derişik 25

37 asitlerle kitinin hidrolizi ile saf amino şeker olan D-glikozamin üretimi sağlanır. Doğal bir polimer olan kitosan biyobozunabilme, biyouyumluluk, biyoadhesiflik, yüksek geçirgenlik özelliklerine sahiptir ve antibiyotik, antitümör gibi özelliklere sahip film, hidrojel ve partikül yapımlarında kullanılmaktadır. Bunların içerisinde kitosan mikropartiküllerin ilaç dağılımı gibi eczacılık uygulamaları bulunmaktadır. 82 Nano ölçeğe inildiğinde ise, kitosan nanopartiküller kitosan mikropartiküllere nazaran biyotıp ve biyofarmasötik gibi daha ilgi çekici özelliklere sahiptir Kitin ve Kitosanın Uygulamaları Kitine olan ilgi insan vücut sıvılarında bulunan bir enzim olan lizozomun kimyasal karakteristiği ve davranışından kaynaklanmaktadır. 78 Kitin ve kitin türevleri geniş bir yelpazedeki medikal uygulamaları 30 yıldır süregelmektedir. 84 Kitosanın yara iyileşmesinde fibroplazi inhibe etmek ve doku kültüründe doku büyümesini ve farklılaşmasını teşvik etmek için kullanılabilir olduğu ileri sürülmüştür. Kitinin düşük çözünürlüğe sahip olması, yapı ve özelliklerinin araştırılması ve kullanılması açısından büyük bir sınırlandırıcı faktör oluşturmuştur. Bu sınırlamalara rağmen, kitin ve modifiye kitinlerin yapay elyaflar için hammadde olarak kullanımı gibi çeşitli uygulamalar literatürde yer almaktadır. 66,85 Kitin ve kitosandan yapılan elyaflar yara bantlarında ve absorplanabilir dikiş malzemelerinde kullanılır. 69,78,86 Medikal uygulamalarının yanı sıra, kitin ve kitosan elyaflar, atık su arıtılmasında da kullanılan bir yöntem olan şelasyon ile ağır metal iyonlarının uzaklaştırılması gibi çeşitli uygulamarda da yer almaktadır. 87,88 Tekstil endüstrisinde uzun vadeli kullanımı da hayata geçirilebilir. 89 Fiziksel ve kimyasal özelliklerinden dolayı kitosan, kozmetiklerde 90, atık su arıtımı, 91,92 kağıt endüstrisinde, 1 tekstil 26

38 endüstrisinde, 66 gıda proseslerinde, 91 tarımda, 91 fotağrafçılıkta, 66 kromatografik ayrımda, 93 katı-hal bataryalarında, 94 LED için kitosan jel uygulamalarında 95 kullanılmaktadır. Farklı uygulamalarda, kitosanın farklı özelliklerine ihtiyaç duyulmaktadır (asetilasyon derecesi ve molekül ağırlığı gibi). Suni böbrek sistemlerinin dizaynı, tekrarlanabilen hemodiyaliz ve kronik böbrek yetmezliği hastalarının sürdürülebilir bir yaşam sürmesine olanak sağlamıştır. Kitosan membranlar yüksek gerilme direnci ve uygun geçirgenliklerinden dolayı suni böbrek membranları olarak kullanılmaktadır. Kitin ve türevlerinden hazırlanan bir seri, membran diyaliz özelliklerini göstermiştir. 66 Suni membranları kullanmanın en büyük problemlerinden birisi kan heparinizasyon pıhtılaşmasını önlemek için ihiyaç duyulan yüzey trombozu ve iç kanama geçiren insanların büyük bir risk altında diyaliz edilmesidir. Kitosan, suni membran kullanımında hemostatik bir rol üstlenerek bu problemin aşılmasını sağlamaktadır Nanopartiküller Nanoteknolojide kullanılan nanopartiküller; "American Society for Testing and Materials (ASTM)"ın standart tanımlamasına göre partikül boyutları iki ya da üç boyutlu olarak nm uzunlukta olan parçacıklar olarak tanımlanmaktadır. 96 Farklı özelliklerine göre farklı sınıflamalar bulunmakla birlikte basit olarak şu şekilde sınıflandırılabilir; Karbon bazlı nanopartiküller (fullerenes, çok duvarlı karbon nanotübler vb.), 2. Metal bazlı nanopartiküller (altın kolloidler, nanokabuklar, nanoçubuklar, süperparamagnetik demiroksit nanopartiküller vb.), 3. Yarı iletken bazlı nanopartiküller (kuantum noktaları vb.). 27

39 1970 lerden beri bilim insanları nanopartikülleri incelemekte ve özelliklerini belirlemeye çalışmaktadır. Çalışmalar başlangıçta optik ve elektronik cihazlar üzerinde yoğunlaşmışken, şimdi biyoölçümler üzerinde çok sayıda araştırma yapılmaktadır Nano boyuttaki yapıların çeşitliliği ve tasarım teknikleri oldukça etkileyicidir. Bu alandaki araştırmalar yeni kolloidal yapıların ve yeni yüzey fonksiyonlarına sahip yapıların sentezlenmesine yoğunlaşmıştır. İki boyutlu kolloit yapısı ile ilgili birçok çalışma mevcuttur. Bu iki boyutlu kolloitlerden yola çıkarak çok karmaşık üç boyutlu sistemlerin sentezlenme yöntemleri bulunmaktadır. Bu partiküllerin farklı elementler, farklı boyutlar veya farklı yüzey fonksiyonel gruplar içermesi mümkündür. Nanopartiküller oldukça kararsızdırlar bu yüzden bulundukları çözelti içerisinde topaklanmaya uğramaları muhtemeldir. Çözelti içinde çökmelerini engellemek için farklı sentez ve yüzey modifikasyonu stratejileri geliştirilmiştir. Yüzey aktif maddelerin kullanımı, topaklanma oluşumunu engelleyen çözümlerden birisidir. Çoğu nanopartiküllerin sentezi esnasında sitrat, etilen glikol ve polivinilpirolidon gibi stabilizatör görevi gören kimyasallar kullanılmaktadır. Stabilizör ajanlar partiküllerin yüzeyleriyle etkileşerek nanopartiküller süspanse haldeyken partikül yüzeyini kaplamakta ve aynı yüklü partiküllerin elektrostatik olarak birbirini itmesi sonucu partikül topaklanmasını engellemektedir Nanopartiküllerin Uygulama Alanları Nanopartiküller birçok alanda uygulama imkânı bulmuştur. Özellikle nanopartiküllerin optik özelliklerinden yararlanılarak analitik 28

40 amaçlı sensör uygulamaları son yıllarda oldukça artmıştır. Nanopartikül tabanlı sensörler ile tarım ve gıda sistemlerinde çok düşük miktarlardaki kimyasal kontaminasyonun veya patojenlerin tespit edilmesi mümkün olabilmektedir. Gıda maddelerinin ambalajlanmasında kullanılacak bu sistemler sayesinde gıda ürünlerinin mikrobiyal kontaminasyonunun önceden tespiti ve kendi kendini koruma mekanizmaları yardımıyla önlenmesi ve böylece gerek depolama gerekse dağıtımda oldukça önemli kolaylıklar ve tasarruflar sağlanabilecektir. Özetle, nanopartikül kullanımı ile geliştirilen sensörler ile metal, protein, DNA, virüs analizleri gerçekleştirilmektedir. Gıda ve su ürünlerinde bakteri tespiti, nanopartiküller ile fonksiyonel hale getirilmiş yüzeylerden Raman sinyali alınması ile gerçekleştirilmektedir. 102 Üzerinde çeşitli moleküllerin tutunabilmesi veya bağlanabilmesini sağlayan seçici yüzeylerin hazırlanması, bu yüzeylerin sensör ve biyosensör uygulamalarında kullanımları, hızlı, kolay ve ucuz analitik bir teknik olarak karşımıza çıkmaktadır Biyosensör Uygulamalarında Nanopartiküllerin Yüzey Modifikasyonu Kolloidal metal nanopartiküller ister sentez sırasında ister sentez sonrasında modifiye edilebilirler. Düz yüzey üzerine kendiliğinden düzenlenmiş biyomoleküllerin immobilizasyonuna benzer şekilde nanopartiküllerin üzerine biyomoleküllerin immobilizasyonu da çeşitli basamaklarda yapılabilir. Biyomoleküller tiyoller, aminler vb. ligandlarla kimyasal bağ oluşturarak veya kafes iyon etrafında bulunarak nanopartiküllerle elektrostatik etkileşim oluştururlar. Altın nanopartiküller, biyouyumlulukları ve biyokonjugasyon öncesi herhangi bir kimyasal modifikasyona gereksinim duyulmamasından dolayı sensör yüzeylerinin hazırlanmasında sıkça kullanılmaktadır. 103 Altın nanopartiküller, iletkenlik 29

41 özelliğinden 104,105 dolayı DNA biyosensörleri, immunosensörler ve enzimatik biyosensörlerin üretiminde de kullanılmıştır. 104 Xue ve arkadaşları, 106 karbamitler ile CNT üzerine GOx ın kovalent bağlanmasını sağlayarak immbobilizasyonu sağlamıştır. Gupissi- Eli (2002) CNT lerin yığın özelliklerinin avantajı sayesinde CNT elektrot üzerine GOx ın fiziksel adsorbsiyonu ve enzim aktivitesini çalışmıştır. Lin (2004) glikozun seçimli tayini için nanoelektrot Ensembles e (NEEs) dayalı karbon nanotüp kullanarak glikoz biyosensörünü geliştirmiştir Biyosensörlerin Performans Faktörleri Biyosensörlerin performans faktörleri; seçicilik, kullanım ömrü, kalibrasyon gereksinmesi, geniş ölçüm aralığı, hızlı cevap zamanı, tayin sınırı, basitlik ve ucuzluktur Deneysel Teknikler Elektrokimya Maddenin elektrik enerjisi ile etkileşmesi sonucu ortaya çıkan kimyasal dönüşümler ile fiziksel değişiklikleri ve kimyasal enerjinin elektrik enerjisine çevrilmesini inceleyen bilim dalıdır. Elektrokimyasal tepkimeler, yükseltgenme indirgenme tepkimeleridir. Elektrokimyasal tepkiler, elektrokimyasal hücre adını alan bir düzenekte yürütülür. Elektrokimyasal hücre, incelenen maddeyi içeren bir çözelti veya çözünmüş tuz, maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrotlar ve bu elektrotları birbirine bağlayan bir dış devereden oluşur. Hücrede bulunan iyon veya molekül halindeki madde katot adı verilen elektrottan elektron alarak indirgenir. Bu indirgenme ile paralel bölünmüş hücrenin karşıt kompartımanında yürüyen bir de yükseltgenme tepkimesi vardır. Anot adı verilen ikinci elektrotta 30

42 ortaya çıkan yükseltgenme tepkimesi sırasında iyon veya molekül halindeki madde ya da elektrot malzemesinin kendisi elektron salıverir. Böylece elektrotlarda tepkimeye giren her bir tür, dış devrede belli sayıda elektronun iletilmesine neden olur. Elektrik akımı elektrik yükünün akışıyla oluşur. Elektrotları birbirine bağlayan devredeki metalik kısımlarda elektrik yükü elektronlar tarafından taşınır. Metallerde bulunan değerlik elektronları, bir örgü düzeni içinde bulunan ve belli bir frekans ile titreşen metal iyonları arasında serbestçe hareket ederek yükü taşırlar. Çözeltide ya da çözünmüş tuz içinde ise elektrik yükünün taşınması bu ortamda bulunan iyonlar tarafından gerçekleştirilir Kronoamperometri Çalışma elektrotunun potansiyelinin faradayik bir reaksiyon olmasına yetmeyecek bir potansiyelden (E1), elektron aktarım hızının çok yüksek olduğu bir potansiyele (E2) ani olarak değiştirilmesi ile durgun ortamda akım-zaman ilişkisinin incelenmesine dayanan tekniğe kronoamperometri (CA) tekniği adı verilir. 108 Başlangıçta çözeltide O maddesinin olduğu ve O + ne - R reaksiyonunun gerçekleştiği durumda, öncelikle çalışma elektroduna herhangi bir redoks reaksiyonunun olmadığı E 1 potansiyeli uygulanır. Sonra aniden elektrodun potansiyeli E 2 ye değiştirilir. CV voltamogramının pik potansiyelinin ötesinde bir potansiyelde E 2 potansiyeli seçilir. Potansiyel E 2 de sabit tutulur. Bu potansiyelde oluşan akımın zamanla değişimine bakılır. Oluşan akım Cottrell eşitliği ile verilir. 109 Cottrell eşitliğine göre; Bu denlemde, i: akım, F: Faraday sabiti, D: difüzyon katsayısı, C j : indirgenecek türün derişimi ve t: zaman dır. Cottrell Eşitliği nden de 31

43 görüldüğü gibi, akım t -1/2 ile doğru orantılı olarak değisir. i değerleri t -1/2 ye karşı grafiğe geçirildiğinde orijinden geçen bir doğru elde edilir Dönüşümlü Voltametri Dönüşümlü voltametri (CV) tekniği elektrokimyasal teknikler içinde en yaygın kullanılan tekniktir. Bu teknikte potansiyel, zamanla doğrusal olarak değiştirilir. Potansiyelin zaman ile değişmesi tarama hızı olarak adlandırılır. Elektrot mekanizmalarının incelenmesinde, adsorpsiyon olayının araştırılmasında ve kinetik çalışmalarda CV tekniği çok kullanılır. Elektroda hızlı bir potansiyel taraması uygulandığı zaman potansiyel, standart indirgenme potansiyeli değerine yaklaşınca madde indirgenmeye başlar. Potansiyel negatife kaydıkça elektrot yüzeyindeki maddenin indirgenme hızı ve buna bağlı olarak akım artar. İndirgenme hızı yeterince büyükse akımı, elektrot yüzeyine difüzyonla gelen madde miktarı kontrol eder. Zamanla difüzyon tabakası kalınlaşacağından difüzyon hızı azalır ve akım da azalmaya başlar. CV de elde edilen pik akımının büyüklüğü elektroaktif maddenin konsantrasyonu, aktarılan elektron sayısı, elektrot yüzey alanı ve difüzyon katsayısı ile değişir. 109 Dönüşümlü voltametrinin bir diğer avantajı ise yöntemin değişik tarama hızlarında uygulanabilir olmasıdır. Böylece elektrot tepkimesiyle oluşan ara ürünlerin kararlılıklarıyla ilgili bilgi alınır. Bağlaşık kimyasal tepkimelerle ya da başlangıçta oluşan ara ürünlerin tekrar yükseltgenmesine karşı gelen iki veya daha çok elektron aktarımını içeren voltametrik yükseltgenmeler, düşük tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramlarda gözlenebilir. Ayrıca gerilim tarama hızını artırarak kimyasal adımlar saf dışı edilebilir ve böylece ilk ürünün ya da katyon radikalinin indirgenme pikini gözlemek olanağı doğar. Dönüşümlü voltametri yöntemiyle elde edilen veriler ışığında birçok katyon radikalinin 110, 111 kararlılığı üzerine yarı nicel görüşler öne sürülmüştür. 32

44 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler Çalışmada kimyasal madde olarak, sodyum asetat (CH 3 COONa), hidrojen tetrakloro Au(III) (%30 seyreltik hidroklorik asit çözeltisinde 99.99,HAuCl 4 ), potasyum klorür (KCl), disodyum hidrojen fosfat (Na 2 HPO 4 ), sodyum dihidrojen fosfat (NaH 2 PO 4 ), L-Askorbik asit, glikoz oksidaz, ürik asit (C 5 N 4 O 3 H 4 ) Sigma Aldrich (St.Lois-A.B.D), demir(ii)sülfat heptahidrat (FeSO 4.7H 2 O), etanol (%99.9), kitosan, hidroklorik asit (HCl), perklorik asit (HClO 4 ), dopamin, glutaraldehit (C 5 H 8 O 2 ), asetonitril Merck (Darmstadt-Almanya), demir(iii) klorür (FeCl 3 ) Fluka, β-d-glikoz (C 6 H 12 O 6 ) Riedel.de Haen firmasından sağlanmıştır Kullanılan Cihazlar ve Gereçler Deneyler sırasında; elektrokimyasal analiz cihazı (GAMRY POTENTIOSTAT, MODEL REFERENCE 600, USA), X-Işını kırınımı cihazı (PHILIPHS PW-1140), SEM analiz cihazı (JSM-6400), TEM analiz cihazı (JEOL JEM 1400), Zeta Sayıcı (lazer boyut analizörü) (MALVERN HPPS), FTIR Spektrometre (THERMO SCIENTIFIC NICOLET 6700), UV-görünür spektroskopisi cihazı (SPECTRONIC GENESYS), santrifüj cihazı (JOUAN MR 1822), deiyonize su cihazı (MILLPORE SIMPLICITY 185), ultrasonik banyo cihazı (BANDELIN SONOREX), hassas terazi (SHIMADZU), Mikropipet (1-10,10-100, µl), ph metre (SX-610 PEN TYPE) ve beher ( ml) kullanılmıştır. 33

45 3.3. Kullanılan Çözeltiler Hidrojen tetrakloro Altın(III) (HAuCl 4 ) çözeltisi: Stok sıvı HAuCl 4 den 35 µl, 10 ml lik balonjojeye aktarılır ve hacmine deiyonize su ile tamamlanarak 0.01M HAuCl 4 çözeltisi hazırlanır. Kitosan Çözeltisi Belli bir miktar kitosan, %1 asetik asit içeren deiyonize suda çözüldükten sonra %1 lik kitosan çözeltisi hazırlanır. Glutaraldehit (C 5 H 8 O 2 ) çözeltisi: Belli bir miktarda katı C 5 H 8 O 2 tartılarak deiyonize suda çözüldükten sonra % 0.1 lik C 5 H 8 O 2 çözeltisi hazırlanır. Enzim çözeltisi: Toplam aktivitesi 100U olan glikoz oksidaz enziminden belli bir miktarda tartılarak deiyonize suda çözüldükten sonra derişimi 10 U/ml olan glikoz oksidaz çözeltisi hazırlanır. Deney sırasında kullanılacak olan enzim çözeltisi buzdolabında bekletilir, uzun süre kullanılmadığı durumlarda çözelti derin dondurucuda saklanır. Tampon Çözeltisi: Tampon çözeltisinin hazırlanmasında 0.05 M CH 3 COONa, 0.1 M KCl, 0,05 M Na 2 HPO 4 ve KH 2 PO 4 çözeltileri karıştırılarak ph değeri 6.0 olan fosfat-asetat tamponu hazırlanmıştır. Glikoz (C 6 H 12 O 6 ) çözeltisi: 34

46 Belli bir miktarda katı C 6 H 12 O 6 tartılarak deiyonize suda çözüldükten sonra derişimi 500 mm olan stok C 6 H 12 O 6 çözeltisi hazırlanır ve bir gece buzdolabında bekletilir. Diğer derişimdeki glikoz çözeltileri, stok glikoz çözeltisinden belli hacimlerde alınarak deiyonize su ile seyreltilerek hazırlanır. Askorbik asit çözeltisi: Belli bir miktarda katı askorbik asitten tartılarak deiyonize su ile çözüldükten sonra derişimi 0.5 M olan askorbik asit çözeltisi hazırlanır. Ürik asit çözeltisi: Belli bir miktarda katı ürik asit tartılarak 0.1 M sodyum hidroksit çözeltisinde çözüldükten sonra derişimi 0.5 M olan ürik asit çözeltisi hazırlanır. Dopamin çözeltisi: Belli bir miktarda katı dopamin tartılarak deiyonize su ile çözüldükten sonra derişimi 0.5 M olan dopamin çözeltisi hazırlanır Fe 3 O 4 Nanopartikül Sentezi Tez çalışması kapsamında manyetik demir nanopartikülleri elde etmek için literatürdeki metotlar modifiye edilmiştir. Fe +3 ve Fe +2 karışımını kullanarak oda koşullarında, basit reaksiyon düzeneği ile manyetik nanopartikül sentezi gerçekleştirilmiştir. Sentez işlemine 1 ml 1.28 M FeCl 3 ve 1ml 0.64 M FeSO 4.7H 2 O, 2 dakika boyunca karıştırılarak başlanmıştır. Daha sonra bu çözelti üzerine 25 ml 1 M NaOH eklenerek 4 saat oda sıcaklığında azot atmosferi altında karıştırıldı. NaOH eklenmesiyle oluşan demir tuzlarının ileri derecede yükseltgenmesini önlemek için, reaksiyon inert bir atmosferde (azot gazı altında) 35

47 gerçekleştirilmiştir. Elde edilen demir tuzları üç defa santrifüj işlemi (4000 rpm de 5 dakika boyunca) uygulanmasının ardından, demir tuzları üzerine 3 ml 2 M HClO 4 çözeltisi konularak 24 saat bekletilmiştir. Daha sonra rpm de 20 dakika santrifüj işlemi üç defa tekrar edilerek oluşan açık kahverengi renkte demir nanopartiküllerinin üzerindeki fazla miktardaki asit uzaklaştırılmıştır. Oluşan demir hidrosit tuzlarının kontrollü bir şekilde yükseltgenmesiyle kendiliğinden manyetik özellik gösteren demir nanopartikülleri oda koşullarında sentezlenmiştir Fe 3 O 4 Nanopartikül Karakterizasyonu Sentezlenen partiküllerin TEM fotoğrafları alındı. Manyetik doygunluğu ölçmek için manyetometri cihazında histerisis eğrileri elde edildi. X-ışınımı kırınımı cihazıyla yüzey kimyası incelendi. Ultraviyolegörünür bölge moleküler absorbsiyon spektrometresi ile spektrumları alındı Kitosan Film Kaplı Fe 3 O 4 Nanopartikül Sentezi Kitosan film kaplı demir nanopartikül-kitosan (Fe 3 O 4 -Ch) nanopartikül sentezi için yaklaşık 1x10 14 tane Fe 3 O 4 nanopartikülü 2 ml suda süspansiyon oluşturarak sonikatörde 2 dakika süresince bekletildi. Daha sonra 3 ml %1 lik kitosan çözeltisi ilave edilerek tekrar sonikatörde 2 dakika süresince bekletildi. Sonikatörde bekletilen çözelti üzerine 3 ml %10 luk NaOH çözeltisi kitosanın bazik hidrolizi için eklendi. Bu şekilde 15 dakika ultrasonik banyoda tutulan çözelti 1 gece oda sıcaklığında beklemeye bırakıldı daha sonra kitosan kaplanan ve kaplanmayan demir nanopartikülleri bir mıknatıs yardımıyla nanopartiküllerden izole edilerek kitosan kaplı demir nanopartiküllerin ayırma işlemi gerçekleştirildi. Çözeltiye uygulanan manyetik alanla toplanan nanopartiküller ile karakterizasyon çalışmalarına devam edilmiştir. 36

48 Kitosan Film Kaplı Fe 3 O 4 Nanopartikül Karakterizasyonu Kitosan film kaplı Fe 3 O 4 nanopartikül karakterizasyonunda parçacıkların boyutunu ölçmek için, geçirgenli elektron mikroskopu ile görüntü alındı. X-ışınımı kırınımı cihazıyla yapı analizi yapıldı. Yüzey kimyası için elektron spektroskopisi ile analizi yapıldı. Manyetik doygunluğu ölçmek için manyetometri cihazında histerisis eğrileri alındı. Ultraviyole-görünür bölge moleküler absorbsiyon spektrometresiyle spektrumları alındı Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Sentezi Çekirdek-kabuk yapısında Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül sentezi için yaklaşık 10 mg Fe 3 O 4 -Ch nanopartikülü 3 ml suda süspansiyon oluşturarak sonikatörde 2 dakika süresince bekletildi. Daha sonra 3 ml 0.01M HAuCl 4 çözeltisi ilave edilerek tekrar sonikatörde 2 dakika süresince bekletildi. Sonikatörde bekletilen çözeltiye daha sonra su banyosunda 15 dakika boyunca Au +3 ün indirgenmesi için 100ºC sıcaklık uygulandı ve daha sonra manyetik nanopartiküller bir mıknatıs yardımıyla izole edilerek ayırma işlemi gerçekleştirildi. Çözeltiye uygulanan manyetik alanla toplanan nanopartiküller ile karakterizasyon çalışmalarına devam edilmiştir Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Karakterizasyonu Sentezlenen Fe 3 O 4 -Ch-Au çekirdek-kabuk nanopartikül karakterizasyonunda diğer sentezlenen nanopartiküllere uygulanan karakterizasyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. 37

49 Modifiyesi 3.7. Karbon Çubuk Yüzeyine Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartiküllerinin Karbon Çubuk Yüzeyine Fiziksel Yöntemle Modifiyesi Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikülü, fazla Au çözeltisinden uzaklaştırmak için manyetik alan uygulanarak, deiyonize su ile yıkandı ve bu işlem üç defa yapıldı. Sonra 3 ml kaplanmamış altından uzaklaştırılmış nanopartikül çözeltisinden 2 µl alınarak cm 2 lik karbon çubuk üzerine damlatıldı ve oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin fiziksel yöntemle modifiye edildiği karbon çubuğun karakterizasyonu Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerle modifiye edilmiş karbon çubuğun SEM görüntüleri alındı. 3.8 Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartiküllerin Fiziksel Yöntemle Modifiye Edildiği Karbon Çubuğa GOx Bağlanması Hazırlanan nanopartikül modifiye karbon çubuk üzerine 3 µl 10 mg/ml lik enzim çözeltisi damlatıldı ve yüzeyin kuruması beklendi. Aynı işlem 2 kez daha tekrarlandı. Elektrot yüzeyi iyice kuruduktan sonra GOx enzimini kovalent olarak bağlayabilmek için elektrot % 0,1 lik glutaraldehit çözeltisi buharında +4 º C de 1 gece boyunca bekletildi. Elde edilen elektrot deiyonize su ile yıkanarak yüzeye tutunmayan enzimler uzaklaştırıldı ve kullanılmadığı zamanlarda buzdolabında 0.1 M ph 6.0 fosfat-asetat tamponunda bekletildi. 38

50 GOx Enzimi Modifiye Edilmiş Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül İçeren Karbon Çubuk Elektrotun Karakterizasyonu Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküller içeren karbon çubuk elektrotun ve GOx ile modifiye edilmiş Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküller içeren karbon çubuk elektrotunun SEM fotoğrafları alındı. Ayrıca dönüşümlü voltamogramları kullanılarak karakterizasyonu yapıldı GOx ve Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül İçeren Biyosensör İçin En İyi Çalışma Koşullarının Araştırılması Çözelti ph nın Etkisi Bölüm 3.8 e göre hazırlanan biyosensörün amperometrik cevap akımı üzerine ph nın etkisini incelemek için ph sı 2.0, 2.4, 3.0, 3.5, 4.0, 5.2, 6.0, 6.4, 6.8, 7.0 olan farklı tampon çözeltiler hazırlandı. 15 mm glikoz eklendiğinde her bir ph değerine karşı elde edilen akım değerleri grafiğe geçirildi ve en uygun ph değeri belirlendi Partikül Miktarının Etkisi Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül/enzim elektrotlarının substrata verdikleri amperometrik yanıtları üzerine partikül miktarı değişiminin etkisini incelemek amacıyla çözeltideki diğer bileşenler sabit tutulup elektrot üzerine immobilize edilen partikül derişimi değiştirilerek bir seri elektrot hazırlandı. 0.1 M ph sı 6.0 olan fosfat-asetat tampon çözeltisinde 0.60 V potansiyelde her bir elektrot için glikoz eklemesi yapılarak akım değerlerine bakıldı. Elde edilen grafikten kullanılacak elektrodun en uygun partikül miktarı belirlendi. 39

51 Uygulanan Potansiyel Etkisi Uygun çalışma potansiyelinin bulunması için kullanılacak elektrotlar Bölüm 3.8 deki gibi hazırlanmıştır ve amperometrik analizler (0.30)-(0.70) V aralığında potansiyeller uygulanarak glikoz ilavesi yapılmış ve akım değerlerdeki değişimler gözlenmiştir Glikoz Derişiminin Etkisi Bölüm 3.8 e göre hazırlanan biyosensörün glikoz derişiminin optimum şartlarda etkisini incelemek için önce biyosensör 0.60 V da dengeye getirildi. Sonra biyosensörün glikoza cevabının ve çalışma aralığının belirlenmesi için 5 mm - 30 mm glikoz derişimi aralığında amperometrik cevap akımları ölçüldü ve bulunan değerler grafiğe geçirildi (Michaelis-Menten eğrisi). Bu grafikten yararlanılarak biyosensörün çalışma aralığı belirlendi. Ayrıca enzim sabiti Km, gözlenebilme sınırı (LOD), tayin alt sınırı (LOQ), doğrusal aralık, eğrinin korelasyon katsayısı, % bağıl standart sapma (%RSD) değerleri hesaplandı Girişim Yapan Maddelerin İncelenmesi Bölüm 3.8 e göre hazırlanan ve dengeye getirilen biyosensörün optimum şartlarda mm ürik asit, 0167 mm dopamin ardından mm ürik asit eklenerek zamana karşı akım değerleri ölçüldü. Belirlenmesi Enzim Elektrodunun Tekrar Kullanılabilirliğinin Bölüm 3.8 e göre hazırlanan ve dengeye getirilen biyosensörün optimum şartlarda tekrar kullanılabilirliğini belirlemek için 15 mm derişiminde glikoz çözeltileri ile arka arkaya ölçümler yapıldı. Bu ölçümler sonucunda elde edilen amperometrik cevap akımlarına karşı 40

52 ölçme sayısı grafiğe geçirildi ve bu grafikten ölçülen akım değişiklikleri kullanılarak elektrodun tekrarlanabilir sonuçlar verdiği belirlendi Enzim Elektrodunun Raf Ömrünün Belirlenmesi Hazırladığımız biyosensörün amperometrik cevap akımı 15 gün boyunca değişik aralıklarla 15 mm glikoz derişiminde ölçüldü. Bu süre esnasında biyosensör +4ºC de buzdolabında bekletildi. Yapılan ölçümler sonucunda elde edilen amperometrik cevap akımları saklama süresine karşı grafiğe geçirilerek enzim elektrodun raf ömrü belirlendi. Raf ömrünü belirleme süresince buzdolabında fosfat-asetat tamponu içinde bekletilen enzim elektrodundan zaman geçtikçe enzimin sızıp sızmadığı kontrolü yapıldı. Bu amaçla elektrodun saklandığı fosfat-asetat tamponuna glikoz ilaveleri yapılarak akımda değişiklik olup olmadığı gözlendi Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Modifiye Edilmiş Karbon Çubuk Elektrota GOx Enziminin Modifiyesi ve Glikoz Derişiminin Etkisi Bölüm 3.7 ye göre hazırlanan Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül modifiye edilmiş karbon çubuk elektrotun yüzeyine, nanopartikül ile GOx enziminin kovalent olarak bağlayabilmek için elektrot üzerine 3 µl 10 mg/ml lik enzim çözeltisi damlatıldı ve yüzeyin kuruması beklendi. Aynı işlem 2 kez daha tekrarlandı. Elektrot yüzeyi iyice kuruduktan sonra GOx enzimi % 0.1 lik glutaraldehit çözeltisi buharında +4ºC de 1 gece boyunca bekletildi. Elde edilen elektrot deiyonize su ile yıkanarak yüzeye tutunmayan enzimler uzaklaştırıldı ve kullanılmadığı zamanlarda buzdolabında ph 6.0 fosfat-asetat tamponunda bekletildi. Hazırlanan bu biyosensörün glikoz derişiminin optimum şartlarda etkisini incelemek için önce biyosensör 0.60 V da dengeye 41

53 getirildi. Sonra biyosensörün glikoza cevabının ve çalışma aralığının belirlenmesi için 5.0 mm 30 mm glikoz derişimi aralığında amperometrik cevap akımları ölçüldü ve bulunan değerler grafiğe geçirildi (Michaelis- Menten eğrisi). Bu grafikten yararlanılarak biyosensörün çalışma aralığı belirlendi. Ayrıca enzim sabiti olan Km, LOD, LOQ, %RSD, eğrinin korelasyon katsayısı ve doğrusal aralık değerleri hesaplandı Biyosensör Çalışmaları Karbon çubuk (CR) elektrotu kullanılarak hazırlanan glikoz biyosenörünün tüm ölçümleri amperometrik olarak alındı. Bunun için sabit tutulan potansiyelde arka arkaya glikoz çözeltisi eklemeleri yapıldı ve akım değişimi ölçüldü. Böylece glikoz için kalibrasyon eğrisi elde edildi. Ölçümlerde üç elektrotlu sistem kullanıldı. Çalışma elektrotunun yanı sıra referans ve karşıt elektrot kullanıldı. Sisteme uygulanan potansiyel, çalışma elektrotu ile referans elektrot arasında oluştu. Uygulanan potansiyelin sabit kalmasını sağlayan karşıt elektrot olarak platin kullanılmıştır. En uygun çalışma potansiyeli, uygun partikül konsantrasyonu ve ph değişiminin yanıt akım üzerine etkileri amperometrik olarak ölçüldü. Amperometrik çalışmaların tümünde, 5 ml fosfat-asetat tampon çözeltisi içeren hücrede eklemeler yapıldı. Hücrenin içindeki bu çözelti dakikada 100 devirde dönen manyetik karıştırıcı ile sürekli karıştırıldı. Dönüşümlü voltametri (CV) çalışmaları yine 5 ml durgun çözelti içeren hücrelerde yapıldı. Elde edilen sonuçlar bulgular ve tartışma bölümünde ele alınmıştır. 42

54 4. BULGULAR 4.1. Demir Nanopartikül Kimyasal Sentezi ve Karakterizasyon Çalışmaları Tez çalışmasında ilk olarak Fe 3 O 4 manyetik nanopartiküllerin sentezi ile ilgili çalışmalar yürütülmüştür. Bu bağlamda, araştırma grubumuzda daha önce sentezlenen Fe 3 O 4 nanopartikülleri benzer şekilde bazik hidroliz yöntemi ile sentezlenmiştir. Kısaca, Fe +3 : Fe +2 (2:1 molar oranı) karışımı ile bazik ortamda demir tuzları oluşturulmakta ve bu tuzların kontrollü bir şekilde yükseltgenmesiyle demir oksit nanopartikülleri elde edilmektedir Genel bir reaksiyon aşağıdaki şekilde gösterilebilir: Fe Fe OH - Fe 3 O 4 + 4H 2 O Ayrıca, literatürde yüksek sıcaklıkta Fe(CO) 5 gibi demir tuzlarının ısısal bozunması ile de demir nanopartikül eldesi sıkça kullanılmaktadır. Demir nanopartikül sentezinde bir diğer yöntem, demir tozlarının bir misel çözeltisi içerisinde indirgenmesi ve misel boyutu ile demir nanopartikül boyutunun kolayca ayarlanabilmesidir. Isısal bozunma işlemlerinin yüksek sıcaklıkta gerçekleştirilmesi, oluşan partikül yüzeyinde istenmeyen deformasyon yapılarının oluşması ve homojen olmayan bir ürün dağılımına neden olmaktadır. Misel oluşturarak gerçekleştirilen nanopartikül sentezinde ise yüzey aktif maddelerin partikül yüzeyinden uzaklaştırılması zaman almakta ve maliyeti artırmaktadır. Sentezlenen demir nanopartiküllerinin karakterizasyonunu için SEM, TEM, XRD, ZETA potansiyel ölçümleri gerçekleştirilmiştir. 43

55 Kimyasal sentez sonucu elde edilen siyah renkli demir nanopartikülleri kendiliğinden manyetik özellik göstermekte ve sulu çözeltide bu manyetik etkiden dolayı topaklanma gözlenmektedir. Grubumuzun daha önceki çalışmalarında, oda koşullarında sentezlenen demir nanopartiküllerinin daha detaylı olarak görüntülerini almak ve ayrıca partikül boyutunun belirlenmesi amacıyla TEM ölçümleri gerçekleştirilmiştir. TEM görüntülerinden yüzey merkezli kübik (fcc) yapısındaki partikül boyutu 9.5 ± 3.0 nm olduğu bulunmuştur Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartikül Sentezi ve Karakterizasyon Çalışmaları Soy metallerde iletkenlik bandındaki elektronların toplam salınım hareketi yüzeyde büyük bir elektrik alanı oluşturur. Bu alan altın nanopartikül elektromanyetik radyasyonla rezonansa girdiğinde nanopartikülün ışığı absorplama ve saçılma özelliği büyük ölçüde artmaktadır. Gözlenen bu durum nanopartikülün absorpsiyon özelliğini en kuvvetli absorplama özelliği olan moleküllerden onlarca kat daha fazla olmasını sağlar. 1 Sentezlenen nanopartikülün UV görünür spektrumundan görüldüğü gibi 545 nm de görülen bant tipik küresel altın nanopartiküllerine ait absorbsiyondan kaynaklanmaktadır. Şekil 9 da Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin UV-Vis spektrumları karşılaştırıldığında 565 nm de görülen absorpsiyon bandı demir nanopartikülünün üzerine altın tabakasının kaplandığının ayrıca pikin daha yüksek dalgaboyuna kayması da kitosan varlığının ayrı bir kanıtıdır. 44

56 Şekil 9: Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au UV-vis spektrumları UV-vis spektrumunda demir nanopartikülüne ait herhangi bir pik gözlenmemektedir. Gerçekleştirilen bu deneyde demir nanopartiküllere altın kaplandıktan sonra çözeltide altın nanopartiküllerin kalmamasına dikkat edildi. Bunun için manyetik nanopartiküller manyetik alan altında toplama işlemi üç defa tekrar edilerek manyetik özellikte olmayan altın nanopartiküllerinden ayırma işlemi gerçekleştirildi. UV görünür spektrumunda gözlenen band yalnızca altın kaplanmış demir nanopartiküllerine ait absorbansdan ileri gelmektedir. Benzer sonuçlar araştırma grubumuzda daha önceki çalışmalarda da elde edilmiştir. 112 Grubumuzun daha önceki çalışmalarında oda koşullarında sentezlenen demir nanopartiküllerinin kristal yapısının aydınlatılması ve ayrıca partikül boyutunun belirlenmesi amacıyla XRD ölçümleri gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen Fe 3 O 4 nanopartikülerinin XRD spektrumu, partikül boyutunun 7.4 nm olduğunu göstermektedir. 112 Hesaplanan partikül çapı sonucu, TEM görüntülerinden elde edilen sonuçlarla uyum halindedir. 45

57 Kimyasal olarak sentezlenen demir nanopartiküllerinin yüzeyinin kitosan film oluşturulması ve ardından altın tabakası ile kaplandığı ayrıca XRD spektrumu ile de kanıtlanmıştır. Şekil 10 da Fe 3 O 4 nanopartiküllerinin yüzeyinin bütünüyle altın tabakası tarafından kaplandığı gözlenmektedir. Şekil 10: Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin XRD spektrumu Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin XRD spektrumunda görüldüğü gibi 38.14º, 44.36º, 64.58º de görülen pikler Fe 3 O 4 Au nanopartiküllerinin (111), (200), (220) kristal yapılarını göstermektedir. Referans olarak JCPDS card No: ile gözlenen spektrum tam uyum içindedir. Altın tabaka kaplı Fe 3 O 4 nanopartikülerinin XRD spektrumuna bakıldığında partikül boyutu 10.5 nm olarak hesaplanmıştır. Hesaplanan partikül çapı sonucu, TEM görüntülerinden (Şekil 11) elde edilen sonuçlarla uyum halindedir. 46

58 Şekil 11: Fe3O4-Ch-Au nanopartikül TEM fotoğrafı Şekil 12 de karbon çubuk elektrodun farklı büyütmelerle alınmış SEM fotoğrafları gösterilmiştir. Şekil 13 de elde edilen Fe3O4-ChAu nanopartiküllerinin karbon çubuk elektrot üzerine modifiyesi sonrası SEM fotoğrafı görülmektedir. Gözenekli yapılar içerisine farklı oranlarda yakınlaşıldığında nanopartiküllerin varlığı gözlenmektedir. 47

59 Şekil 12: Karbon çubuk elektrodun farklı büyütmelerle alınmış SEM fotoğrafları 48

60 Şekil 13: Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül modifiye karbon çubuk elektrodun SEM fotoğrafları 49

61 Şekil 14 de M altın çözeltisi ve farklı miktarlarda Fe 3 O 4 nanopartikül kullanılarak elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerin (1mg, 4mg, 7mg, 10mg, 13mg) UV-görünür spektrumları görülmektedir. Ayrıca başlangıçta kullanılan Fe 3 O 4 miktarı değiştikçe kaplanan Au miktarı da değişmektedir, Fe 3 O 4 çok düşük miktarlarda kullanıldığında kaplanan altın miktarı az iken çok yüksek miktarlarında ise manyetikliği azalmakta ve kaplanan altın miktarı da azalmaktadır. Görüldüğü gibi optimum Fe 3 O 4 miktarı 10 mg kullanıldığında elde edilen partiküldür. Şekil 14: Farklı miktarlarda Fe 3 O 4 nanopartikül kullanılarak elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au (1 mg, 4 mg, 7 mg, 10 mg, 13 mg) nanopartiküllerin UV-görünür spektrumları Şekil 15 de 10 mg Fe 3 O 4 nanopartikülü kullanılarak ve 10-3 M, M, M, M altın çözeltisi eklenerek elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül UV-görünür spektrumları görülmektedir. Bölüm 50

62 3 de görülmektedir ki Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküller sentezlenmiştir. Ayrıca başlangıçta kullanılan altın çözeltisi miktarı değiştikçe kaplanan altın miktarı da değişmektedir. Altın çözeltisi çok düşük miktarlarda kullanıldığında kaplanan miktarı az iken çok yüksek miktarlarında ise manyetikliği azalmakta ve kaplanan altın miktarı da azalmaktadır. Görüldüğü gibi optimum altın çözeltisi miktarı M kullanıldığında elde edilen partiküldür. Şekil 15: Farklı miktarlarda (10-3 M, M, M, M) altın çözeltisi eklenerek elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül UV-görünür spektrumları Şekil 16 da 1 M NaOH eklenerek elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerin (1.0 M-NaOH) ve 2.5 M NaOH eklendiğinde elde edilen Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerin (2.5 M-NaOH) UV-görünür spektrumları görülmektedir. Şekil 15 de görülmektedir ki Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartikül sentezlenmiştir. Ayrıca eklenen NaOH konsantrasyonu arttıkça oluşan 51

63 kitosan film oluşumuna bağlı olarak indirgenen altın miktarının da arttığı gözlenmiştir. Şekil 16: Farklı miktarlarda NaOH (1.0 M ve 2.5 M) kullanılarak elde edilen Fe 3 O 4 -Ch- Au nanopartiküllerinin UV-görünür spektrumları FTIR çalışmasında kitosan filmi, Fe 3 O 4 -Ch filmi ve Fe 3 O 4 -Ch- Au filmlerinin karakteristik pikleri incelenmiştir (Şekil 17). Kitosan filmi, kitosanın belirli derişimdeki NaOH ile etkileştirilmesiyle hazırlanmış ve kurutulup FTIR spektrumu elde edilmiştir. FTIR spektrumunda asetik asit varlığını, 1330 ve 1400 cm -1 de ki şiddetli ve keskin pik şeklinde görülmektedir. Spektrum incelendiğin 700 cm -1 deki küçük pik Fe-O titreşimini göstermektedir. Kitosan filmin yapısına Fe 3 O 4 girdiğinde, kitosana ait amin ve hidroksil gruplarının Fe 3 O 4 molekülünün oksijen atomlarıyla etkileşmesi sonucu 3200 cm -1 civarındaki geniş pik 52

64 azalmaktadır. Kitosan polimer filminin spesifik glikozit bağındaki C-O-C gerilimi 1010 cm -1 de görülmektedir. Kitosan filminin spesifik N-H titreşim piki üzerine Au partiküllerinin indirgenmesi ile etkileşimden dolayı artırmaktadır. 120 Şekil 17: a) Fe 3 O 4 -Ch film b) Ch film ve c) Fe 3 O 4 -Ch-Au film FTIR spektrumlar 4.3. Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartiküllerinin Boyut Dağılımları ve Zeta Potansiyelleri Partiküller kararlılık için ve ayrıca düz, homojen bir altın tabakası sağlamak için, yüksek sıcaklıkta (90ºC) sulu ortamda indirgenmişir. 53

65 Çalışma grubumuz tarafından daha önce sentezlenen demir nanopartikül 112 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküle ait hidrodinamik çaplar sırasıyla 177 nm ve 507 nm olarak bulunmuştur. Şekil 18 de Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllere ait hidrodinamik çaplar görülmektedir. Hidrodinamik çaplar Malvern HPPS lazer boyut analizörü ile belirlenmiştir. Şekil 18 de görüldüğü gibi yeni geliştirilen sentez metodu ile monodispers partiküller elde edilmiştir. Şekil 18: Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerine ait hidrodinamik çaplar Şekil 19 da ise Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerine ait zeta potansiyel değeri görülmektedir. Yalnızca Fe 3 O 4 naopartikülünün zeta potansiyeli 19.3 mv 112 iken, kitosan ve altın kaplanmasıyla oluşturulan demir nanopartiküllere ait zeta potansiyel değeri 29.6 mv olarak bulunmuştur. 54

66 Şekil 19: Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerine ait zeta potansiyel değeri Demir nanopartikülünün kısmi yükseltgenmesini sağlamak amacıyla kullanılan perklorik asit nedeniyle Fe 3 O 4 manyetik partiküllerinin yüzeyinde pozitif yük oluşmaktadır. Manyetik demir nanopartikül yüzeyinin altın kaplanması sonrasında ise yüzeydeki pozitif yük miktarı artmaktadır. Özellikleri 4.4. Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au Nanopartiküllerinin Manyetik Sentezlenen manyetik nanopartiküllerin manyetik özellikleri oda sıcaklığı manyetizma eğrileri ile incelenmiştir. Titreşimli örnek magnetometre kullanılarak yalnızca Fe 3 O 4 ve kitosan-altın kaplı demir nanopartikülleri için histerisis eğrileri Şekil 20 de görülmektedir. Şekil 20 de manyetizma eğrilerinde görüldüğü gibi Fe 3 O 4 nanopartikül için doygunluk manyetizma değeri 56.6 emu/g, altın-kaplı demir nano partikülü için ise 18.2 emu/g olarak bulunmuştur. Manyetizma özellikleri 300 K de incelenmiştir. Doygunluk manyetizmasında azalış demir nanopartiküllerinin kitosan film ve altın tabaka ile kaplanması nedeniyle azalmaktadır. Ayrıca, manyetizmadaki azalış homojen altın kaplanmasını göstermektedir. 55

67 Şekil 20: Fe 3 O 4 ve Fe 3 O 4 -Ch-Au nanopartiküllerinin histerisis eğrileri Sentezlenen altın-kaplı manyetik nanopartiküllerin biyoayırım için yüksek manyetiklik göstermesi istenmemektedir. Şekil 21 de görüldüğü gibi dışarıdan manyetik alan uygulandığında çok kısa sürede (yaklaşık 10 sn) partiküller reaksiyon ortamından toplanabilmektedir. 56

68 Şekil 21: Dış manyetik alan olmadığında ve dış manyetik alan uygulandığında Fe3O4-Ch-Au nanopartiküllerin çözeltiden toplanması Fe3O4-Ch-Au Nanopartikül İle Kaplanmış Karbon Rod Elektrota GOx Enziminin Modifiyesi Glutaraldehit, ağırlıklı olarak proteinlerin modifikasyonunda kullanıldığı bilinen bir bifonksiyonel bileşiktir. Polimere immobilize edilmiş glutaraldehit GOx enziminde bulunan primer amin gruplarıyla çapraz bağlanarak elektrokimyasal sentez zincirinde yerini alır.69 Şekil 22 de boş karbon rod elektrodun, Fe3O4-Ch-Au nanopartikül ile kaplı elektrot (Fe3O4Ch-Au) ile yüzeyine GOx immobilize edilmiş Fe3O4-Ch-Au nanopartikül ile kaplı elektrodun (Fe3O4-Ch-Au-GOx) tipik dönüşümlü voltamogramları görülmektedir. Enzim immobilizasyonundan sonra elektrokimyasal reaksiyon sonucunda oluşan elektron transferinin daha yavaş olduğu görülmektedir. 57