Dokuz Eylül Üniversitesi Buca Eğitim Fakültesi. Fen Bilgisi Eğitimi. Anabilim Dalı

Transkript

1 Dokuz Eylül Üniversitesi Buca Eğitim Fakültesi Fen Bilgisi Eğitimi Anabilim Dalı Đlknur Uyar, Özge Güven, Irmak Artıktay 1-GĐRĐŞ Genel anlamda biyosensörler, biyoloji, fizik, kimya, biyokimya, mühendislik gibi pek çok bilim alanının bilgi birikiminden multidisipliner bir anlayış çerçevesinde faydalanılarak ve biyolojik moleküllerin veya sistemlerin seçimlilik özellikleri ile modern elektronik tekniklerin işlem yeteneğinin birleştirilmesiyle geliştirilen biyoanalitik cihazlar olarak biliniler. Butun organizmalar yaşadıkları ortamdaki değişimleri derhal algılayıp yaşamlarını sürdürebilmek için değişimlere uymaya çalışırlar.đşte bu algılama mekanizması biyosensörlerin in vitro kullanımı için temel olmustur. Canlılar teknologların hayal bile edemeyeceği duyarlılık özelliğine sahiptirler.örneğin bazı köpeklerin koku almaları insanlardan kat daha hassastır.yılan balıkları tonlarca su içerisine ilave edilen birkaç damla yabancı maddeyi derhal farkeder.kelebekler partnerlerinin yaydığı birkaç molekülü bile algılar.algler ise zehirli maddelere karşı çok duyarlıdırlar. Canlıların bu uyarıları algılamayı mümkün kılan biyolojik maddelerin analiz sistemleri ile birleştirilmesi

2 biyosensörleri meydana getirmiştir.biyosensör teknolojisi o kadar hızlı gelişmektedir ki,international Union of Pure and Applied Chemistry tarafından oluşturulan Biyosensörleri Sınıflandırma ve Adlandırma Komisyonu 1996 yılında hazırlayıp yayınladığı biyosensör tanımı biyomikrochiplerin gelişimi ile daha şimdiden geçerliliğini kaybetmiştir.biyosensörlerin gelişiminde,mikroelektronikten bildiğimiz daima daha küçük,daha doğru ve daha ucuz aletlere eğilim olmuştur. Son yıllarda bilim ve teknolojideki hızlı gelişmeler biyosensör kavram ve tanımlarında da önemli genişlemelere ön ayak olmuştur. Canlı yaşamın önemli unsurlarından olan görme, işitme, koklama, tad alma, dokunma gibi algılama mekanizmaları doğal ve en mükemmel biyosensörik sistemler olarak düşünüldükleri için biyosensör çalışmalarına güzel örnek olurlar. Günümüzde görme, işitme gibi yeteneklerini kaybetmiş kişilerin bu yeteneklerini tekrar yerine koyacak yapay sistemler üzerinde yoğun araştırmalar gerçekleştirilmektedir.tıp alanındaki bilim adamlarıyla

3 da ortak çalışmayı gerektiren bu araştırmalar da biyosensör alanına dahil tutulabilirler.bununla birlikte, bugün biyosensörlerden bahsedilince ilk akla gelen daha genel ve yaygın kullanım imkanına sahip, analiz amacına yönelik biyoanalitik sistemlerdir. Biyosensörlerin tarihi 50 li yılların ortalarında L.C.Clark ın Cincinnati Hastanesi nde(ohio,abd)ameliyat sırasında kanın O2 miktarını bir elektrod ile izlemesiyle başlar.1962 yılında Clark ve Lyons Glukozoksidaz(GOD) enzimini O2 elektrodu ile kombine ederek kanın glukoz düzeyini ölçebildiler. Böylece yeni bir analitik sistem oluştu.bu sistem bir yandan biyolojik sistemin yüksek spesifisikliğini (enzim) diğer taraftan ise fiziksel sistemin(elektrod)tayin duyarlılığını birleştirmiş ve geniş spektrumlu bir uygulama olanağına sahip olmuştur. Glukoz + O2 Glukono-δ-lakton + H2O2 Bir biyolojik sıvıdaki glukoz ve çözünmüş oksijen elektrod etrafındaki membranı geçerek elektrod yüzeyine ulaştığında glukoz oksitlenerek glukonik aside dönüşür ve bu sırada O2 kullanılır.ortamdaki glukoz bittiğinde O2 elektrodu ile başlangıçtaki ve reaksiyon sonundaki çözünmüş O2 miktari belirlenir.aradaki fark ortamdaki glukozun oksidasyonu için harcanan O2 olup buradan biyolojik sıvıdaki glukoz miktarı bulunur. Klasik elektrokimya ile sadece anyon ve katyonları belirleyen sensörler hazırlanabilirken sisteme biyomateryalin de katılması ile diğer birçok maddenin tayini yapılabilir. Böylece hazırlanan analiz sistemlerine biyosensorler denir.

4 Biyosensörlerin Kısa Tarihçesi Clark ve Lyons (1962) ilk defa biyosensör terimini kullanmışlardır. Enzimelektrot kompleksini imal eden 7yikili, bu kompleksi glikoz sensörü olarak kullanmışlardır. Senssor oksido-reduktaz Şekil 2. Clark ın enzim elektrodu enzim olan glikoz oksidazın pletanyum elektroduna immobilize olmasıdır.pletenyum elektrod enzim tarafından üretilen H2O2 tarafından + 0.6V da polarize olur.đşte basitçe bu prensibe göre çalışan tarihin ilk biyosensörü 1974 yılında piyasada Yellow Spirngs Instrument (YSI) olarak tanımlanır. YSI sensörünün geliştirilmesinde ana özellik yeni nesil membranlardır. Clark burada sandeviç membrandan faydalanmıştır. Enzim nükleopor polikarbonat membran ve selüloz asetat membran arasına yerlesmistir. Bu membranlar normalde ortamın potansiyel yapısını etkileyecek olan diğer faktörleri elemekte ve cihazın duyarlılığını ve özgünlüğünü yukseltmektedir. Örneğin, Clark ın kullandığı membran H2O2 ı difüze ederken askorbat ve diğer parazitik kimyasalların geçişini olanaksız kılmaktadır. Clark ve Lyons un geliştirdiği ilk biyosensör generasyonu membran diyalizatör,reaksiyon bölgesi ve çeviricileri içermektedir.đkinci jenerasyon biyosensörlerde O2 yerine elektronları enzimin redoks merkezinden elektrodun

5 yüzeyine taşıyabilen bir elektron akseptörü(redoks mediyatörü)kullanılmıştır. GOD FADH2 + MOX GOD FAD + MRED + 2H2 MRED MOX GOD:Glukoz oksidaz, FAD:Flavin Adenin Dinükleotid, M:Redoks Mediyatörü Üçüncü jenerasyon biyosensörlerde enzimin redoks merkezi ile elektrod yüzeyi arasında direkt elektriksel iletişim sağlanmış ve redoks mediyatörlerine gereksinim kalmamıştır. 2.Biyosensörlerin Temel Bileşenleri Biyosensörler, genel olarak analizlenecek madde ile seçimli bir şekilde etkileşime giren biyoaktif bir bileşenin, bu etkileşim sonucu ortaya çıkan sinyali ileten bir iletici sistemle birleştirilmesi ve bunların bir ölçüm sistemiyle kombinasyonuyla oluşturulurlar. Sistemin özelliğine bağlı olarak yükseltici, mikroişlemci, dijital görüntüleyici gibi kısımlar sistem içinde yer alabilirler.

6 Kuru reaktif kimyasının esas alan biyosensörlerde olduğu gibi bu genel kombinasyonun farklı modifikasyonları da vardır. Biyosensörlerde Analizlenebilecek Unsurlar Analitler Anorganik ve organik maddeler, makromolekuller, virus ve mikroorganizmalar Metal iyonları Substratlar Aktivatorler, Inhibitorler Enzimler, Koenzimler Hormonlar Antikorlar, Antijenler Nukleik asitler Virusler, Mikroorganizmalar Analizlenecek madde ve yapılar genel olarak analit olarak adlandırılırlar.

7 Biyosensörlerde Kullanılan Biyoaktif Yapılar Biyosensörlerde kullanılan ve analizlenecek madde ile spesifik bir şekilde etkileşime giren biyoaktif bileşenler, komplekslik hiyerarşisine göre basitten karmaşığa doğru bir sıralama yapıldığında ; iyonoforlar, antikorlar, enzimler, nükleik asitler, lipozomlar, biyomembranlar (örneğin; membran reseptörleri), hücre organelleri (örneğin; mitokondri), tüm hücreler, doku kesitleri ve homojenatları ve organlar (örneğin; koku alma organı) olarak sınıflandırılabilirler. Biyosensörlerde Yararlanılan Đletim ve Ölçüm Sistemleri Biyosensörlerde, biyoaktif bileşenin tayin edilecek madde ile etkileştiğinde oluşan sinyalin iletim ve ölçümünde, genel olarak, elektrokimyasal, optik, kalorimetrik ve piezoelektrik esaslı sistemler kullanılır. Đletim ve Ölçüm sistemleri: Elektrokimyasal esaslı: 1- Amperometri esaslı(elektrotlar) 2- Potansiyometri esaslı(elektrtl.) 3- Yari iletken esaslı(transistorl.) Kalorimetri esaslı: 1- (termistörler) Optik esaslı: 1- Fotometri esaslı(optik lifler) 2- Fluometri esaslı(optik lifler) 3- Biyoluminesans esaslı(optik l.) Piezoelektrik esaslı: 1- (Piezoelektrik kristaller)

8 Analizlenecek Madde-Biyoaktif Bileşen Đlişkisine Göre Biyosensörlerin Sınıflandırılması Biyosensörler farklı bir bakış açısıyla Analizlenecek Madde-Biyoaktif Biyoaktif Bileşen ilişkisine göre aşağıdaki şekilde de sınıflandırılabilirler; *Biyoaffinite Esaslı Biyosensörler (örneğin; iletici sistem üzerinde antikor immobilizasyonuyla antijenlerin tayini için kullanılırlar.kompleks oluşumu sonucu tabaka kalınlığı, refraktif indeks, ışık absorbsiyonu ve elektriksel yük gibi fizikokimyasal parametrelerin magnitüdünü değiştirir ve bu değişimler optik sensörler, potensiyometrik elektrodlar veya transistorler tarafından(saptanır.) *Biyokatal itik Esaslı Biyosensörler: (örneğin; iletici sistem üzerinde enzim immobilizasyonuyla enzimin substratı, inhibitörü, aktivatörü veya koenzimi olan çeşitli kimyasal maddelerin tayini için kullanılırlar.bunlara aynı zamanda metabolizma sensörleri de denilmektedir.) Biyoaffinite ve biyokatalitik sensörleri bir tablo üzerinde örnekleriyle inceleyebiliriz. Bunlar :

9 Biyoaffinite Sensorler Biyokatalitik sensorler Reseptor Analit Reseptor Analit Enzim Substrat,Inhibitor Enzim substrat Apoenzim Antigen Mikroorganizma Kofaktor Antikor Hormon Organel Aktivator Reseptor Glikoproteinler Doku kesiti Inhibitor Lektin Sakkaritler,Protein Enzim *Đmmobilize Hücre Esaslı Biyosensörler(örneğin; iletici sistem üzerinde hücrelerin immobilizasyonuyla o hücreler tarafından metabolize edilen çeşitli maddelerin tayini için kullanılırlar.) *Transmembran Esaslı Biyosensörler: (örneğin; çeşitli moleküllere spesifik reseptör veya farklı membran proteinlerini içeren hücre membranlarının iletici sistem

10 üzerinde immobilizasyonuyla söz konusu moleküllerin seçimli bir şekilde belirlenmesi.) Biyosensörlerde Biyoaktif Bileşen Đmmobilizasyon Yöntemleri Biyoaktif bileşen ile iletici unsurun birleştirilmesinde oldukça farklı immobilizasyon yöntemlerinden faydalanılabilir.biyoaktif bileşen sensör olarak da adlandırabileceğimiz temel iletici unsur üzerinde fiziksel olarak,jel içinde veya polimer matrikste tutuklanabilir, elektrot yüzeyinde biriktirilebilir, kovalent veya çapraz bağlanarak tutuklanabilir. Biyoaktif Tabaka-Đletim ve Ölçüm Sistemi Kombinasyonlarına Genel Örnekler *Elektrokimyasal Esaslı Biyosensörler - Amperometri Esaslı Biyosensörler Amperometri genel anlamda belli bir potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümünü temel almaktadır. Sözkonusu akım yoğunluğu çalışma elektrodunda yükseltgenen yada indirgenen elektroaktif türlerin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak ifade edilir. Đkinci elektrot referans elektrottur. Kalibrasyondan sonra, akım yoğunluklarından ilgili türlerin konsantrasyonlarının belirlenmesinde faydalanılır.

11 Đletici sistem olarak bir amperometrik sensörün kullanılması durumunda potansiyometrik sensörlerden en büyük fark, ürünlerden sinyal oluşturan türün elektrot yüzeyinde tüketilmesidir. Oksijen tüketimine ilişkin reaksiyonlar aşağıdaki şekildedir. Katodik reaksiyon; O2 + 2H2O + 2e- H2O2 + 2HO- H2O2 + 2e- 2HO- Anodik reaksiyon; Ag + Cl- AgCl + e- Toplam reaksiyon; 4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl- 4AgCl + 4HO- Bir biyosensörün biyoaktif tabakasındaki reaksiyonlar oldukça kompleks bir kinetiği vardır. Amperometri esaslı ve biyoaktif bileşen olarak enzimlerin kullanıldığı bazı biyosensörlere ilişkin örnekler.

12 - Potansiyometri Esaslı Biyosensörler Potansiyometri bilindiği gibi en genel anlamda bir çalışma ve referans elektrot arasındaki potansiyel farkının ölçümünü temel almaktadır. Elektrot

13 potansiyelinin belirlenmesi doğrudan analit konsantrasyonunu belirler. Potansiyometrik biyosensörler de kullanılan temel sensörler ph yada tek değerlikli iyonlara duyar cam elektrotlar, anyon yada katyonlara duyar iyon seçimli elektrotlar ve karbondioksit yada amonyağa yönelik gaz duyar elektrotlar olarak bilinir. Potansiyometri esaslı ve biyoaktif bileşen olarak enzimlerin kullanıldığı bazı biyosensörlere ilişkin örnekler.

14 - Yarı Đletkenleri Esas Alan Biyosensörler Temel sensör olarak metal oksit yarı iletken alan etki transistörlerini (MOSFET) yada iyon duyar alan etki transistörlerini (ISFET) esas alan bu tür enzim sensörleri, enzim ile alan etki transistörlerinin

15 birleştirilmesini ifade edecek şekilde enzim alan etki transistörleridirler (ENFET). MOSFET lerin, gazların ölçümüne uygun hale getirilmesiyle oluşan gaz duyar sensörlerde (GASFET) adsorblanan gaz moleküllerinin disosiyasyonu ve oluşan yükün oksit tabakasına transferi temel ilkedir. Bu durum tabanın dielektrik sabitini değiştirerek ve drain akımda bir modifikasyona yol açarak ölçüme olanak sağlar. *Optik Esaslı Biyosensörler Optik biyosensörler iletici sistem olarak optik lifler üzerine uygun bir yöntemle uygun bır biyomolekülün immobilize edilerek hazırlanan ölçüm cihazlarıdır. Etkileşim sonucu meydana gelen kimyasal yada fizikokimyasal bir değişimin ölçümünü temel almaktadırlar. Sinyal, ışık yansıması, saçılımı yada yayımı sonucu oluşur. Örneğin optik lifin üzerine enzim immobilizasyonuyla hazırlanan optik esaslı enzim sensörleri temelde absorbsiyon, fluoresans, biyolüminesans gibi temel ilkeler çerçevesinde çalışırlar.

16 *Kalorimetri Esaslı Biyosensörler Kalorimetri esaslı enzim sensörleri, termal enzim sensörleri, enzim termistörleri yada entalpimetrik enzim sensörleri gibi değişik isimlerle adlandırılırlar. Temel ilkeleri bir enzimatik reaksiyondaki entalpi değişiminden yararlanarak substrat konsantrasyonunu belirlemekten oluşur. Genel olarak enzimatik reaksiyonların ekzotermik doğasından faydalanılır. Enzimatik reaksiyon sonucu meydana gelen sıcaklık değişimi ile substrat konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişkiden sonuca varılir. 0 o C gibi oldukça küçük sıcaklık değişimleri termal olarak yalıtılmış ortamlarda termistör veya termofiller yardımıyla takip edilir. Kalorimetri esaslı termal biyoanalizör ile termal enzim sensörleri arasında biyosensör kavramı açısından önemli farklar vardır. Termal biyoanalizörler, yalıtılmış bir sistemde genelde biri referans olmak üzere iki immobilize enzim kolonu içerirler. Pompalar yardımıyla bir sürekli

17 akış olayı görülür. Enzimatik reaksiyon uyarınca substrat konsantrasyonuna bağlı sıcaklık değişimi termofiller yardımıyla gözlenir. *Piezoelektrik Esaslı Biyosensörler Piezoelektrik sensörler en genel anlamda karakteristik rezonans frekansındaki farklanmayı belirleyerek bir piezoelektrik kristal yüzeyinde toplanan örneğin kütlesinin ölçülmesi esasına göre çalışan gravimetrik cihazlardır. Sensör seçimliliği, kristal yüzeyindeki madde

18 ile spesifik bir etkileşime sahip analitin birikimiyle alakalıdır. Sensör yüzeyinde bir madde adsorblandığı veya biriktiği zaman piezoelektrik kristalin rezonans frekansındaki farklanmanın ölçülmesiyle sonuca varılır. Bir piezoelektrik sensörün üzerinde enzim immobilizasyonuyla gerçekleştirilen piezoelektrik enzim sensörlerinde, enzim moleküllerine substratların bağlanmasından dolayı meydana gelen kütle değişimlerinin, piezoelektrik kuartz diskin vibrasyonunda sebep oldukları farklanmadan yararlanılarak madde miktarı tespit edilir. Piezoelektrik biyosensörlerden virüslerin tayininde de faydanilabilirler;

19 Kuru Reaktif Kimyası Esaslı Biyosensörler Đlk bakışta klasik biyosensör tanımından farklı gözükmekle birlikte test stripleri olarak da adlandırılan kuru reaktif kimyasını esas alan analiz preparatları biyosensör teknolojileri içinde en yaygın kullanılan biyosensör türlerinden birisidir. Ağırlıklı olarak enzimatik reaksiyonların esas alındığı bu sistemlerde, kolorimetrik cihazlar yardımıyla yada renk değişimlerini görme yoluyla algılama şeklinde biyoaktif bileşen-iletici sistem-ölçüm aygıtı devresi dolaylı yolla da olsa tamamlandığı için klasik biyosensör tanımıyla da aslında uyumludurlar. Biyosensörlerin yüksek spesifiklik yanında; renkli ve bulanık çözeltilerde geniş bir konsantrasyon aralığında doğrudan ölçüme olanak sağlamak gibi üstünlükleri vardır.fakat reseptör olarak adlandırılan biyokomponentlerin ph, sıcaklık, iyon şiddeti gibi ortam

20 koşullarından etkilenmesi biyosensörlerin kullanım ömrünü kısalttığından olumsuz bir özelliktir. 2-GENEL BĐLGĐLER 2.1 Biyosensörler Biyosensörler(biyoalgılayıcılar),bünyesinde biyolojik bir duyargacı bulunan ve bir fizikokimyasal çeviriciyle birleştirilmiş analitik cihazlar olarak adlandırılmaktadır.bir biyosensörün amacı,bir veya bir grup analiz edilecek madde miktarıyla orantılı olarak sürekli sayısal elektrik sinyali oluşturmaktadır. Biyosensör sistemleri üç temel bileşenden meydana gelmektedir.bunlar;seçici tanıma mekanizmasına sahip biyomolekül/biyoajan,bu biyoajanın incelenen maddeyle etkileşmesi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyalleri elektronik sinyallere dönüştürebilen çevirici ve elektronik kısımlar. Bu bileşenlerden en önemlisi,tayin edilecek maddeye karşı son derece seçimli fakat tersinir bir şekilde etkileşime giren,duyarlı biyolojik ajandır.genel olarak biyoajanlar,biyoafinite ajanları ve biyokatalitik ajanlar olarak iki alt grubta incelenirler.biyoafinite ajanları olan antikorlar,hormon almaçları,dna,lektin gibi moleküller antijenlerin,hormonların,dna parçacıklarının ve glikoproteinlerin moleküler tanımlanmasında faydalanılır.kompleks oluşumu sonucunda,tabaka kalınlığı,kırınım indisi,ışık emilmesi ve elektriksel yük gibi fizikokimyasal parametrelerin değişime neden olmakta ve bu dönüşüm sonucu ortamda azalan ya da artan madde miktarı takip edilerek sonuca varılmaktadır.bu amaçla saf enzim ya da enzim

21 sistemleri,mikroorganizmalar ve bitkisel ya da hayvansal doku parçalarından yararlanılmaktadır. Biyosensörlerin,klinik,teşhis,tıbbi uygulamalar,süreç denetleme,biyoreaktörler,kalite kontrol,tarım ve veterinerlik,bakteriyel ve viral teşhis,ilaç üretimi,endüstriyel atık su denetimi,madencilik,askeri savunma sanayi gibi alanlarda yaygın olarak kullanım alanları vardır. Özellikle 20.yüzyılın son 10 yılında, askeri bir tehdit oluşturması açısından hem dönemin genelkurmay başkanı, ABD eski dışişleri bakanı Colin Powell ın olabilecek en ürkütücü silahın biyolojik silahlar olduğu yönündeki açıklamaları, 21.yüzyılın ilk dönemi için hem maddi hem de teknik açıdan biyosensör araştırmalarının yönünü tayin etmiştir yılı Mayıs ayında Japonya nın Kyoto şehrinde gerçekleşen 7.Dünya Biyosensör Kongresi çalışma gruplarına ait başlıklar, dünyanın güvenlik, teknik ve ticari anlamda hangi tür araştırmalara öncelik tanıdığı konusunda fikir verecektir. Biyoelektrik ve mikroanalitik sistemler Nükleik asit sensörleri ve DNA yonganları Organizma ve tam hücre sensörleri Biyosensörler için doğal ve sentetik reseptörler Enzim tabanlı sensörler Đmmunosensörler 2.2 Biyosensörlerin Yapısı ve Fonksiyonu Biyosensörler biyokomponentler (reseptör) ile fiziksel komponentlerden (transdeeuser) meydana gelirler.

22 Biyosensörün görevi biyolojik bir olayın elektriksel sinyale çevirilmesidir. Şekilde bir biyosensörün çalışma prensibi şematize edilir. BĐYOSENSÖRLER Elektrokimyasallar NUMUNE Enzimler Doku kesitleri Organeller Tutucu ajanlar Nükleik asitler Mikroorganiz-malar Reseptör molekülleri Potensiyometrik Amperometrik Konduktometrik Transistorler Optik Fotometri Florimetri Luminesans Kütle değişimi ELEKTRONİK Piezoelektrik Isı Değişimi Termistörler Çizelge.Biyosensörlerin Yapısı ve Çalışma şekli Bir biyosensor, biyolojik algılayıcı elementin seçiciliği ile hedef analitin konsantrasyonuyla orantılı olarak sinyal üreten transduserin kombinesinden oluşan bir aygıtdır.bu sinyal proton konsantrasyonundaki değişimden, amonyak ve oksijen gibi gazların salınması yada yükseltgenmesi, ışık emisyonu, absorbsiyon yada reflektans, ısı emisyonu, kütle değişimi ve bunun gibi değişimlerin sonucudur. Sinyal transduşer yardımıyla akım, potansiyel, sıcaklık değişimi, ışığın absorbsiyonu, ya da elektrokimyasal, termal, optik olarak yada Absorbsiyon : soğurma

23 piezoelektrik anlamda kütle artışıyla ölçülebilir forma çevirilir. Sinyal ayrıca ileriki analizler için güçlendirilebilir, işlenebilir ya da saklanabilir. Prensipte herhangi bir reseptör herhangi bir transduserle birleştirilip işleyen bir biyosensör meydana getirilebilir. Aşağıdaki şekilde biyosensörlerin genel çalışma mekanizması gösterilmektedir BĐYOKOMPONENTLER(BĐYORESEPTÖRLER) Biyosensörlerin yapısında görev alan biyokomponentler çoğu kez biyoreseptör olarak isimlendirilirler. Bunların içinde en yaygın kullanılanlar enzimler ve antikorlardır. Enzim substrat ve antikor antijen arasındaki etkileşimin ilk adımı analitlerin protein moleküllerine tutunmasıdır. Hidrolazlar dışındaki enzimler kosubstrat yokluğunda yalnız enzimi substrata bağlarlar. Aynı durum inhibitor ve diğer effektörler içinde söz konusudur. Kosubstrat varlığında ise substratın kimyasal bir dönüşümü olur. Son yıllarda geliştirilmiş olan katalitik antikorlar yalnız antijenlere bağlanmakla kalmaz bunlar kimyasal bir dönüşümüde tetiklerler.

24 Biyolojik membranlar içine yerleşmiş kimyasal reseptorler ise hücre metabolizmasi tarafindan yönlendirilir ve biyolojik aktif maddeler tarafindan kontrol edilirler. Bu durum toksinler, ilaçlar ve hormonların seçimli tayini icin mükemmel imkan sağlarlar. Protein yapılı makro moleküller olarak nükleik asitler ve karbonhidratlar da genom zincir analizleri ve hücre yüzeyi karakterizasyonu gibi özel alanlarda kullanılan biyosensörlerin yapısındadırlar. Biyokomponent (Biyoreseptör) Molekülleri : Enzimler: Enzimler başta da belirtildiği gibi biyoreseptör moleküllerinin en çok bilinenidir. Sensörün analite olan özgünlüğü aslında tamamen biyoreseptörün analite karşı özgünlüğüdür. Enzimlerin substratlarına karşı oldukça yüksek bir özgünlüğü, afinitesi vardır. Binlerce kimyasal arasından ilgili oldukları substratı seçer ve reaksiyonu tetiklerler. Tabi tüm diğer reaksiyonlarda olduğu gibi enzimatik reaksiyonlarda da ortamın sıcaklığı, ph ı, iyonik kudreti ve diğer çevre şartları da önemli faktörlerdir. Antikorlar: Antikorlar bir glikoproteindir. Kandaki proteinlerin %20 sini oluştururlar ve immünoglobinler diye de isimlendirilirler. Y şeklinde olup iki adet antijen tanıma bölgesi bulundururlar. Bağışıklık sisteminde antikorlar

25 tarafından tanınan ve immün cevap oluşumuna sebep olan yabancı moleküller antijen olarak isimlendirilir. Antikorları genelde birbirlerinden ayıran farklılık antijen tanıma bölgeleridir. Her farklı antikor kendine özgün olan antijeni tanır ve ona geçici olarak bağlanır. Kovalent olmasa da güçlü bir bağlanma yaptığından antijenantikor bağlanma stratejisi bir çok modern tanı metodunda faydalanılmaktadır. Özellikle monoklonal antikor üretim teknolojisi sayesinde artık herhangi bir antijene özgün IgG tipi monoklonal antikorlar üretilmekte ve üretilen bu antikorlar biyosensör teknolojisinde de faydalanılmaktadır. Aptamerler: Genel olarak aptemerler rastgele sentezlenmiş tek zincirli oligonükleotidlerdir. Önce oligonükleotid sentezleyicisine zincir dizim sekansı bakımından rastgelelik gösteren trilyon adet farklı sentetik oligonükleotid sentezlettirilir. Baz dizimi farklı olan her bir molekül, farklı üç boyutlu yapıdadır. Dolayısıyla bu kadar farklı molekül, Tanınması düşünülen analitle muamele edilir ve hangi rastgele üretilen oligomerik molekülün analite karşı yüksek bağlanma kapasitesine sahip olduğu SELEX adı verilen özel bir yöntemle belirlenir. Sonrasında tespit edilen oligomerin sekansı belirlenip sentezleyiciye ikinci defa ama bu sefer bilinçli olarak bu molekülden ürettirilir; ürünler ise biyosensör teknolojisinde biyoreseptör olarak faydalanılır. Monoklonal antikorlara rakip olan bu moleküller gün geçtikçe uygulamada kendini daha fazla gösterir. Hatta son 10 yıl içinde özel yöntemlerle üretilen aptamer proteinlerin bazılarının altın ve bakır gibi madenlere karşı bile özgün bağlanma

26 gösterdikleri keşfedilmiştir. Bu da, özellikle yer altı suları üzerinden maden aramaları yapmak için orijinal biyosensör imalatının yapılabileceğini göstermektedir. Reseptör proteinler: Reseptör proteinler biyolojik aktif bileşikler için yüksek ama özgün bağlanma güçleri vardır. Yani, herbir farklı reseptör protein yalnızca kendine has bileşiğe bağlanabilir. Bu özelliklerinden dolayı biyoreseptör olarak biyosensör teknolojisinden faydalanılmaktadır. Mesela, normalde hücrelerdeki ölüm reseptörleri apoptosis sinyali veren ligandlara karşı faydalanılır. Hücre bu ligandları bu reseptörlerle hisseder ve apoptosisi (planlı hücre ölümü) başlar. Sensör teknolojisinde bu reseptörler kullanılarak çevremizde üretilen hangi kimyasalın apoptotik sinyale sebebiyet verdiği belirlenmektedir. Diğer Adaylar: Dünyamızda, biyosensörlerde biyoreseptör olarak kullanılmaya aday bir çok biyolojik materyal vardır. Bakteriler, hücreler, organeller, membran tabakaları bunlardan birkaçıdır. Herhangi bir biyomateryalin biyoreseptör amaçlı kullanımı için tek koşul, materyalin istenilen analiti bir şekilde özgün olarak tanıma kapasitesine sahip olmasıdır.

27 2.2.2.ÇEVĐRĐCĐLER (TRANSDÜŞERLER) Biyosensörlerin, biyolojik tanima ajanının bulunduğu taniyici tabaka dışında, en önemli ikinci kısmı da Çevirici (Transducer) kısmıdır. Çeviriciler biyoajananalit etkileşmesi sonucu gerçekleşen fizikokimyasal sinyali elektrik sinyaline dönüştürerek, bu sinyalin daha sonra güçlenerek okunabilir ve kaydedilebilir bir şekle girmesini sağlarlar. Biyokimyasal reaksiyona gore transduser seçilir. Biyoajan analit etkileşmesi sonucu olan degişimler, sadece tek bir değişkenle belirlenemez. Örneğin, glikoz ölçümü için kullanılan glikoz sensöründe glikoz, oksijen varlığında glikoz oksijen enzimi tarafindan glikonik aside ve hidrojen peroksite parçalanır. Bu tepkime ile: I) Ortamda bir miktar oksijen tüketilir ve bu azalma bir oksijen elektrodu ile takip edilebilir mi?. II) Ortamda glukonik asit arttığı için ph değişimi olmuştur ve bu bir phmetre ile ölçülebilir mi?. III) Ortamda bir elektroaktif madde olan hidrojen peroksit açığa çıktığı için bu maddenin miktari amperometrik olarak ölçülebilir mi? Hem evet hem de hayır. Çünkü biyoajan-analit tepkimesindeki değişimin boyutları,mutlak ölçüt olarak(nanogram,pikoamper, microvolt. vb) gibi inanılmaz(10-6, mertebesinde veya daha küçük) küçük boyutlarda olabilmekte. Đşte bu aşamada çeviricilerin onemi gündeme gelir. Bu bize küçüklügümüzde defalarca dinledigimiz Prenses ve Bezelye Tanesi masalını anımsatıyor. Çevirici, yatağının altındaki bezelye tanesi nedeni ile uyuyamayan

28 prenses rolünde. Bu kadar kuçuk boyutta ki bir değişimi en sağlıklı, doğru ve orantılı olarak yansıtan çevirici, o tepkime için idealdir denebilir. Ancak, bir tepkime için ideal olan bir çeviricinin bir başka tip tepkime için uygun olmayabilecegi unutulmamalı. Biyosensörlerin araştırmaları, analit çeşidini zenginleştirme ve daha düşük derisimlerde ölçüm yönünde ilerlerken, çeviricilerinde daha yuksek, guçlendirilmiş bir sinyal yaratmaları için araştırmalar yoğun şekilde devam etmektedir. Elektrotlar amperometrik ve potansiyometrik olçümlerde kullanilir ve burada hedef; maddedir(o2- elektrodunda çözünmüs O2, ph elektrodunda H + iyonu gibi).optic sensörlerde hedef; ışık, pieozoelektrik sensörlerde ise kristalin salınım rezonansının kütle yüklenimi sebebiyle degişmesidir bunların dışında transistorler ve termistorlerden de transduser olarak faydalanılmaktadır. Transduserler esas olarak dört grup altında toplanırlar; 1-Elektrokimyasal transduserler -Amperometrik -Potansiyometrik -Konduktometrik 2-Optik transduserler 3-Akustik transduserler 4-Termal transduserler Biyosensörlerde Çevirici Çeşitleri ve Özellikleri Geleneksel dönüştürücüler 3 çeşittir. Bunlar; H2O2 veya O2 ölçümlerine odaklanan amperometre, ph veya iyon

29 ölçümleri yapan potansiyometre ve fiber optik kablo kullanan fotometrelerden oluşur. Biyotanıma reaksiyonları genelde kimyasal ürünler üretir ki bunlar elektrokimyasal metotlarla kolayca tespit edilebilirler. H2 O2 (veya reaktif O2) bir çift eletrod vasıtası ile ölçülebilir. Önce referans elektrodun karşısında olan elektroda (Ag/AgCl veya Kalomel) uygun bir voltaj verilir. Bu durumda hedef moleküller olan H2O2 veya O2 elektrotta yüksetgenir ve ardından bir akım oluşur ve oluşan bu akım amperametre ile algılanır. Potansiyometre ise bir membranın iki tarafındaki H+ farkına bakarak çalışır. Fotometre, oluşan ışığı sinyal olarak algılar. Fiber optik kablolar oluşan bu ışığı yönlendirmede kullanılırlar. Piezoelektrik Dönüştürücüler: Pieazoelektrik materyalleri ve yüzey akustik dalga cihazları kütle değişimine karşı hassas bir ortam sunar. Bu tip dönüştücüler, biyoreseptörde tanıma reaksiyonu sonrasında kütle artışı oluyor ise, çok uygundur. Mesela kuartz kristal mikrobalans (QCM) adı da verilen piezoelektrik silikon kristalleri hali hazırda pikogramlık kütle değişimlerini bile hissedebilmektedirler. QCM lere sabitlenen antikorların antijenleriyle karşılaşmalarıyla oluşacak kütle değişimi işte bu şekilde algılanıp dijitalize edilir. Đletkensel Dönüştürücüler: Solusyon iletkenliğindeki değişmeler bir reaksiyonun hızını belirlemede kullanılır. Oluşan iyonların yaptığı haraket sonucu iletkenlikdeki değişimleri baz alan bu

30 teknik bir çok enzim alakalı reaksiyon hızlarının ölçülmesinde uygulanılmaktadır. Elektrik Kapasitans Dönüştürücüleri: Kapasitans ölçüm metodu kullanılarak oluşan bir çeviricidir. Mesela, iki farklı elektrodlu levha üzerine antikorlar immobilize edilse ve bir antijenantikor reaksiyonu oluşsa sonuç doğal olarak iki levha arasındaki ortamın dielektrik sabitesinde dikkate değer bir değişim meydana gelir. Bu değişim de kolayca belirlenebilir. Termometrik Dönüştürücüler: Bazı biyotanımlama reaksiyonları esnasında ortam sıcaklığında fiziksel bir değişme olur. Bu değişim gözlenerek reaksiyon dolayısıyla analit varlığı hakkında yorum yapılabilir. Mesela ATP nin hidrolizlenmesinde veya antijen-antikor kompleksi oluşumları esnasında meydana gelen reaksiyon sonucu ortam sıcaklığında değişme olur. FET Tipi Dönüştürücüler: Đyon konsantrasyonlarındaki değişimi algılayabilen FET ler oldukça uygundurlar.

31 2.2.3.ĐMMOBĐLĐZASYON( TUTUKLANMA) Genel olarak biyolojik komponent uygun bir şekilde immobilizasyonla transdusere bağlanır.biyoaktif bileşen ile iletici unsurun birleştirilmesinde oldukça farklı immobilizasyon yöntemlerinden faydalanılabilir. Reseptorlerin transduserler üzerinde immobilizasyonu fiziksel(adsorpsiyon, polimer matrikste tutuklanma vb) veya kimyasal(kovalent bağlama, bir veya multi fonksiyonel reaktifler ile çapraz bağlama) yöntemler ile gerçekleştirilir.immobilizasyon metodu immobilize edilecek biyokomponentin yapısına gore belirlenir. Kullanılan transdüksiyon elementi ve analitin fiziksel durumu da seçilecek metod için önemli özelliklerdir.doku kültürleri, organeller ve mikroorganizmaların immobilizasyonunda daha çok polimer jellerde tutuklama yöntemi uygulanır. Polimer matriksi biyokatalizörün kaçışını engellerken küçük substratlar ve ürün moleküllerinin geçisine engel olmaz. Genel olarak 5 yaygın metot vardır. Bunlar; 1-Adsorbsiyon, 2-Mikroenkapsulasyon, 3-Tutuklama, 4-Çapraz bağlama, 5-Kovalent

32 Nitelikli Biyosensörlerde Aranan Özellikler Biyosensörler sekiz parametreye göre nitelendirilirler: 1. Duyarlılık (ing:sensitivity): Cihazın analitteki değişime (konsantrasyon) birebir cevap vermesi anlamındadır. Duyarlılık yüksekse analitteki birim değişim sensörün ekranında aynen görülür. 2. Seçicilik (ing:selectivity): Cihazın sadece analite özgünlüğünü gösterir. Cihaz başka reaktiflere ilgi göstermez ve hatalı sonuç vermez. 3. Ölçüm aralığı: Cihazın ölçebildiği analit konsantrasyonun aralığıdır. Analit belli bir konsantrasyondan az veya çoksa cihaz iyi bir duyarlılıkta sonuç vermeyebilir. 4. Ölçüm süresi: Analit konsantrasyonundaki bir basamak değişime karşı cihazın vereceği nihayi yanıtın verilmesidir. Bir tür cihazın ölçme hızını gösterir. 5. Tutarlılık: Cihazın sonuçlarındaki tutarlılığı ifade eder. 6. Tesbit sınırı: Cihazın tesbit edebileceği en düşük analit konsantrasyonudur. 7. Ömrü: Cihazın, performansında gözle görülür bir azalma olmadan verdiği hizmet ömrüdür. 8. Kararlılık: Belirli bir süre içinde cihazın duyarlılığındaki veya baz çizgisinde değişimleri dikkate alan bir kalite ölçüm parametresidir. Biyosensör Dizaynında Dikkat Edilmesi Gerekenler:

33 Biyosensör tasarımlarında önce biyosensörün hangi analiti tanıyacağı tesbit edilmelidir. Sonrasında ise aşağıdaki maddeler dikkate alınarak biyosensörler dizayn edilmelidir. Bunlar sırasıyla; 1. Analite uygun bir biyoreseptörün belirleme (tanıyıcı molekülün) 2. Biyoreseptörü dönüştürücüye sabitlemede kullanılacak uygun ve verimli immobilizasyon yöntemi teshis etme, 3. Biyoreseptörün analiti tanıyacak dönüştürücüyü seçme ve dizayn etme, 4. Ölçüm aralığının, duyarlılığın ve ölçümlerdeki parazitlere dikkate edilmesi, 5. Cihazın kompakt bir hale dönüştürülmesi Tüm bunları yapmak için ise bir çok alanda geniş bir bilgi birikimine ihtiyaç duyulur. Mesela, birinci şık için biyokimya ve biyoloji, ikinci ve üçüncü için kimya, elektrokimya ve fizik ve dördüncü için kinetik ve kütle transferi alanları bunlardan birkaçıdır. Biyosensör dizayn edilir edilmez sıra onun elverişli imalat ve kullanma için uygun bir şekilde paketlenme kısmına geçer. Modern imalat teknolojileri ve stratejileri sayesinde çok daha az maliyetle biyosensör üretimi mümkündür. Tasarıdan imalata tüm bu basamaklarda çokludisiplinlerin bir arada kafa kafaya çalışması son derece mühimdir. Biyosensörlerin avantaj ve dezavantajlarını belirleyen özellikler

34 Biyosensörleri esas alan analiz sistemlerinin avantaj ve dezavantajlarını belirleyen temel özellikler aşağıdaki şekilerde sıralanabilir; *Biyosensörlerdeki biyoaktif bileşen spesifik ve kararlı olma özelliklerini taşımalıdır. Biyoaktif bileşenin spesifik olması girişim yapabilecek türleri içeren karmaşık içerikli ölçüm ortamlarında detaylı ön işlem yapılmaksızın analize olanak sağlar. Biyoaktif bileşenin kararlı olması ise çok sayıda analize imkan vereceği için biyosensörün ekonomik olmasını olanaklı kılar. *Biyosensörlerdeki temel reaksiyonun fiziksel parametrelere olabildiğince az duyarlı olması tercih edilir. Bu özellik fiziksel koşulların değişebildiği laboratuvar dışı koşul ve ortamlarda da güvenilir analizlerin yapılabilmesine olanak sağlar. *Biyosensör cevaplarının doğru, duyarlı ve tekrarlanabilir olması büyük önem taşır. Cevapların doğruluğu beklenen esas özelliklerdir. Duyarlık, biyolojik sistemlerden gelen unsurlar kullanıldığı için genelde çoğu klasik yöntemden daha kullanışlıdır.tekrarlanabilir sonuçlar alınması ise bir ölçüde daha önce sözü edilen parametrelerle de alakalıdır.cevap zamanının kısa olması ise genelde biyosensörlerin tercihli olarak kullanımlarına yol açan en önemli özelliğidir. *Biyosensörlerde algılayıcı elementin küçük ve bazen biyouyumlu olması önemlidir. Küçük ve biyouyumlu sistemlerin özellikle in vivo ölçümlere uyarlamada önemli üstünlükleri mevcuttur. *Ölçüm ünitesinin ucuz ve taşınabilir olması değişik alanlarda yaygın kullanımına olanak sağlar.

35 *Biyosensörler düşük maaliyette seri olarak büyük miktarlarda imal edilebilirler. Özellikle tek kullanımlık şekilde standardize edilebilen biyosensör türleri, kullanım kolaylığını arttırabildiği gibi kullanacak kişilerin de detaylı bir tecrübeye sahip olmasını gerektirmez. Bu nedenle yaygın kullanım olanakları karşımıza çıkar. Doğal olarak tüm biyosensörlerin bu özelliklerin tümünü üzerinde taşıması mümkün değildir. Ancak doğru,duyarlı ve tekrarlanabilir cevaplar kesinlikle beklenen parametrelerdir. Bunların dışındaki parametrelerdeki değişiklikler biyosensörlerin diğer yöntemlere avantaj ve dezavantajları olarak karşımızdadır. BĐYOSENSÖRLERĐN UYGULAMA ALANLARI Biyosensörler tıp, gıda, eczacılık, çevre kirliligi, savunma ve bir çok endustriyel aktivitede özellikle otomasyon, kalite kontrolü, durum tespit ve enerji saklanmasında çok önemli rol oynarlar. Bugüne kadar 180 den fazla farkli madde için biyosensör hazirlanmiş olup bunlardan ancak 25 kadarı ticari olarak üretilmektedir. Biyosensorlerin başlıca kullanım alanları: Klinik diyagnostik, biyomedikal sektör Proses kontrolü: o Biyoreaktor kontrol o Gida uretim ve analizi Tarla tarımı, bag-bahçe tarımı ve veterinerlik Bakteriyel ve viral diyagnostik Endüstriyel atık su kontrolu

36 Çevre koruma ve kirlilik kontrolü Maden ve işletmelerinde toksik gaz analizleri Askeri uygulamalar Tıp Metabolitlerin ölçülmesi, insulin eksikliği belirtilerinin ölçülmesi, hastane koşullarının gözlenmesi, yapay pankreasın çalışma koşullarının kontrolü, vb. şeyler. Antijen - Antikor - Toksin - Lipozom - Enzim kombinasyonuyla hazırlanan kolera toksin biyosensörü, DNA hibridizasyonu temeline dayanan DNA-Avidin- Biotin-Lipozom-Enzim kombinasyonuyla oluşturulan Tay Sacs biyosensörleri örnek olabilir. Son yıllarda analizatörlere enzim elektrodlari monte edilmiştir ve yoğun bakım ünitelerinde kullanılmaktadır. Ayrıca biyoproseslerin nükleik asit düzeyinde izlenmesi, ilaçların reseptörlere etkisi ve özellikle transmitterreseptör etkileşimi de biyosensörlerin gelecekteki önemli tibbi uygulamaları olması beklenmektedir. Biyosensörlerin gelecekte önemli uygulamalarından biri superoksit ve nitrik oksit gibi kısa ömürlü ve hormonlar ve norotransmitterler gibi düşük konsantrasyonlu maddelerin in vivo tayini olacaktır. Çevresel analizlerde Klorür, ph, kalsiyum, nitrat, sodyum, potasyum, magnezyum, amonyum duyarlı kimyasal sensörler vardır. Biyoraportörler yoluyla petrol sızıntıları, yeraltı sularındaki uranyum miktarı, zehirli atıkların, kanserojenlerin ve içme sularını kirleten Çevre Koruma Ajansı (ing:epa (Environmental Protection Agency) EPA

37 mikroorganizmaların konsantrasyonları tespit edilmektedir. Çevre Koruma Ajansı tarafından hava ve su düzenli olarak kontrol edilmektedir. Ayrıca yerel idari mercilerin de bölgesel izleme birimleri vardır. Bu birimler düzenli olarak hava ve suyu tahlil ederler. Đlaç analizleri Artık, kimyasal silahların tesbitinde olduğu gibi, biyosilahların tesbiti için de küçük boyuttaki robotlar ya da uçaklar kullanılabilecektir. Đlaçlarin kötü amaçla kullanımı ve uyuşturucu ile mücadelede biyosensörler uygulanabilecektir. Uyuşturucu arayan köpeklerin yerini biyosensörler almasi beklenmektedir. Böylece özellikle gümrüklerde, karakollarda zaman tasarrufu sağlanmış olacaktır. Endüstri Endüstriyel proses kontrollerinde gereklidir. Biyoreaktörlerin kontrolü, giren hammadde ve çıkan ürünlerin ölçülmesi, vb şeklindedir. Biyomedikal Sektör Hiç kuşkusuz biyomedikal sektör biyosensörler için en iyi pazar alanıdır. Enzim sensörleri bu alanda uygulama olanağı bulan ilk biyosensörlerdir. Ticari olarak üretilen ilk biyosensör ise şeker hastalığı teşhisi için kan ve idrarda glukoz tayinini mümkün kılan glikoz oksidaz elektrodudur. Biyosensörlerin, ilaçların vücuttaki düzeylerinin ayarlanmasi ve kontrolunde kullanılması

38 yakın bir gelecekte gerçekleştirilebilecektir. Örneğin :Yapay pankreas çalışmaları. Savunma (askeri ve sivil) Askeri ve sivil savunma alanında kullanılmak üzere bir çok sensör ve biyosensör dizaynı ve imalatına, son körfez krizi ve 11 Eylül sonrasında hızlandırılmıştır. Herhangi bir biyoterör ve biyosaldırı sonrası erken tesbit ve analiz için çok güçlü ve taşınabilir biyosensörler en elzem aygıtlardır. Savaş durumunda kimyasal ve bakteriyolojik silahlara karşı korunma olasılığı çok kolay değildir. Çünkü bunların algılanması zordur. Ancak biyosensörler sayesinde bu algılama mümkündür. Birçok kimyasal savas maddesinde organofosfor bileşikleri bulunur ve bunlarda kolinesteraz enzim sensörleri ile tayin edilir. Bakteriyolojik silahlardaki virus,bakteri ve toksik ajanlar diğer bazı biyosensörler ile tayin edilebilmektedir. Bu konu ilerde daha detaylı verilecektir. Biyoteknoloji ve Gıda Biyoteknoloji ve gıda endüstrisinde başta glikoz olmak üzere bir çok monosakkarit, amino asitler, organik asitler (laktik asit) üre ve alkol tayinlerinde enzim sensörleri kullanılır. Ayrıca gıdalardaki yabancı maddeler (peptisitler, toksitler ve yabancı hormonlar vb.) yanında aroma ve tazelik gibi komplex parametreler içinde biyosensörler geliştirilebilir.

39 Günümüzde gıda zehirlenmelerinin gittikçe artması toksik ve mikrobiyal kontaminantların daha hızlı tayinini zorunlu tutmaktadır. Biyosensörler yardımı ile bu tayin 2 şekilde başarıyla uygulanır. I. Antigen-antikor reaksiyonu veya DNA hibridizasyonu vasitasi ile mikroorganizmalarin dogrudan analizi ( immüno sensörler+dna sensörleri). II. Mikrobiyal kontaminasyonun gidanin metabolik değişimi üzerinden dolaylı analizi (Enzim tayini). GIDA Gıdalara uygulanan analizler temelde kalite ve güvenlik amacına yönelik olarak uygulanmaktadır. Kaliteden amaç, bazı fiziksel özellikler ve kimyasal bileşenlerin miktarlarını, guvenlikten amaç ise zararlı mikroorganizmaları veya onların toksinlerini ve diğer allerjen ve toksik bileşenlerin miktarlarını bulmaktır. Ayrıca gıdalara dışarıdan katılan belirli bir amaca yönelik olan veya olmayan maddelerin tespiti de önemlidir. Biyosensörlerin gruplarına göre analiz alanları Tablo 1 de gösterilmiştir. BIYOSENSOR GRUBU Enzim sensorleri Mikrobiyal sensorler KAPSADIGI ANALIZ ALANI Kucuk molekullu organik ve anorganik maddeler Enzim sensorlerin kapsadigi alanlar + BOD, Toksisite, Mutajenite BOD: biyokimyasal oksijen ahtiyaci

40 DNA sensorleri Immuno sensorler Virusler, Patojen, mikroorganizmalar Virusler,Patojen,mikroorganizmalar+Ksenobiyotikler Proses boyunca in-line (sensörün örneğe daldırıldığı) yada on-line (örneğin sürekli olarak sensörün üzerinden geçtiği) analizlerde biyosensörler ürünlerin kalite kontrolünde ve gıda endüstrisinin bazı uygulamalarında kolaylık sunabilir. Proses kontrolünde kromatografik yöntemlerle karşılaştırıldığında biyosensörlerin iki avantajlı yönü yüksek seçicilik ve hızlı cevap zamanıdır. Doksanlı yılların sonunda gıda endüstrisinde çok az sayıda biyosensör kullanılmaktaydı ve bunlar da off-line analiz niteliğinde gerçekleştirilmekteydi. Ticari olarak kullanım gıda ve içecek sanayinde benzer teknolojiler üzerine tasarlanmaktaydı. Ya bir oksijen elektrodu yada bir hidrojenperoksit elektrodu ile birleştirilmiş enzim sistemleri uygulanmaktaydı. Gıda analizlerinde elektrokimyasal ve enzim sistemlerinin kombine edildiği sistemler ve özellikle oksidaz temelli sistemler ticari anlamda baskın rol oynamakta hücre doku veya mikroorganizmaya dayalı biyosensörlerin geç cevap süreleri nedeniyle kullanımının ise kısıtlı olacağı beklenmektedir. Enzimlerin saflaştırılması, enzim stabilizasyonu ve immobilizasyon yöntemleri konusundaki ilerlemeler ve biyosensörlerde cevaplama hızının artması, analiz süresinin azalmasına katkılar sunmaktadır. Biyosensorlerin eş zamanlı veri sağlama yetenekleri ve basit dizaynlarının yanı sıra ucuz olmaları gıda üretiminde kalite ve güvenliğin izlenmesinde çok çeşitli

41 uygulamalarda kullanılmalarına olanak verecektir. Örneğin optik biyosensörler asetaldehit, glikoz, alanin, laktat, nitrat, gliserol, etanol, ksilitol, glutamat ve sorbitol gibi çesitli bileşenlerin konsantrasyon belirlemelerinde potansiyel uygulama belirlenecektir. Bunun yanında et ve süt ürünlerinde ilaç kalıntıları, hormonlar, antibiyotik kalıntılarının belirlenmesi ve gıdaya bulaşan Salmonella, Listeria ve Staphylococus gibi çeşitli mikroorganizmaların belirlenmesi biyosensörler tarafından yapılabilmektedir. Günümüzde birkaç ticari biyosensör çeşidi içermektedir. Bu biyosensörler; otoanalizatörler, manuel laboratuar cihazları ve taşınabilir cihazlar şeklinde vardır. Bunlar, Apec Glikoz Analiz Sistemi, ESAT Glikoz Analiz Sistemi, Glucoprocesseur, Amperometrik Biyosensor Detektor, ISI Analiz Sistemi ve Oriental Tazelik Ölçer gibi ya oksijen elektrodu yada hidrojenperoksit elektroduna bağlanmış oksidaz sistemleri içeren benzer teknolojiler vardır. Elektrokimya prensibine dayalı olarak çalışan Malthus 2000 gibi mikroorganizma izleyebilen ticari sistemler de vardır. Bu cihaz mikroorganizmanın Aykut U., Temiz H. Teknolojik Araştırmalar: GTED 2006 (3) gelişmesi ve metabolizması sonucunda meydana gelen yapıların elektriksel iletkenliğindeki (konduktansı) değişiklikleri belirlemektedir ve bu cihazın analiz süresi 8-24 saattir. Midas Pro adlı cihaz ise amperometrik belirleme tekniğine vardır ve 20 dakika icinde ml de 106 hücrelik değişim aralığında mikroorganizmaları tayin edebilmektedir. BIACORE un mikroorganizma belirlenmesi icin SPR (Yuzey plazmon resonans) teknolojisine dayalı cihazları vardır. Lumac Biocounter ve Unilite ise biyoluminesans prensibine dayalı olarak çalışmakta ve mikrobiyal biyokutleyi tayin etmektedirler.

42 Her iki analiz cihazı da 10 dakikalık sure icinde ml de 103 hucrelik değişimi algılayabilmektedir. Gıda endüstrisinin gereksinimlerini karşılamaya yönelik dünya çapındaki biyosensör üreten firmalardan bazıları Tablo 2 de gösterilmektedir. Tablo 2. Gıda endüstrisi için ticari biyosensörler [3] Sirketler( ulkeler) Biyosensorler Gizli Bilesen Danvers (ABD) Apec Glukoz Glikoz Analyser Biometra Biomedizinische Biometra Biosensors For Glikoz, etanol ve Methanol Analytik GmbH(Almanya) HPLC Eppendorf (Almanya) ESAT 6660 Glikoz Glukoz Analyser Solea- Glukoprocesseur Glikoz ve Laktat Tacussel(Fransa) Universal Sensors(ABD) Amperometrk Biosensor Detector Glikoz, Galaktoz, L- amino asitler, Askorbat ve Etanol Yellow Springs Enstrument (ABD) ISI Analysers Glikoz, Laktoz, L- laktat,etanol, Metanol, Glutomat ve Kolin Toyo Joso Biyosensors(Japonya) Models: PM ve PM-1000 DC (on line), M- 100,AS-200 ve PM-1000 DC Glikoz, Laktat, L- amino asitler, Kolesterol,Trigliseritler,Gliserin, Askorbik asit, Alkol Oriental Oriental Balik Freshness

43 Electric(Japonya) Freshnees Meter Swedish Biacore BIOCORE Bakteri AB(Isvec) Malthus Instruments Malthus 2000 Bakteri (Ingiltere) Biosensori SpA Midas Pro Bakteri (Italya) Biotrace(Ingiltere) Unilite Bakteri Biyosensorler gıdalarda kompozisyon belirlemede, işlenmiş ve çiğ gıdalarda kontaminasyonu belirlemede, fermentasyon prosesinin on-line kontrolünde uygulanmaktadır. Yine analiz süresini Teknolojik Araştırmalar : GTED 2006 (3) Biyosensörler Ve Gıdalarda Kullanımı 56 kısaltması ve maliyetinin daha az olması nedeniyle on-line olçüm sistemleri oluşturularak HACCP sistemlerinde kontrol mekanizması olarak uygulanabilmektedir[3]. Kontaminasyon : Bulaşma, genelde yabancı maddelerin karışması-kirlenme olarak kullanılır. Gıda bileşenleri üzerine değişik gıdalarda çeşitli transduserler ve biyokomponentlerle hazırlanmış biyosensörlerin tespit aralıkları Tablo 3 ve 4 de gösterilmiştir. Tablo 3. Gıda maddelerindeki çeşitli bileşenler için biyosensör uygulamaları [3

44 Analit Uygulama Biyokompone nt Yumusak ickiler, Transduser Tespit Araligi mm Glikoz Meyve Glikoz oksidaz Amperometrik sulari ve Sut Glikoz oksidaz, 4.44 g/100g Glikoz ve Sut β-galaktosidaz Amperometrik (laktoz) Laktoz ve mutarotaz mmol Glikoz, Fruktoz, Sarap Glikoz oksidaz, D-fruktoz dehidrogenaz, Amperometrik (Glikoz) mm (fruktoz) mm Etanol, Alkol (etanol) L-Laktat, L-Malat, Sulfit dehidrogenaz, L-malat dehidrogenaz, mm (L-laktat) mm ( Sulfit oksidaz, L-malat) Diyaforaz mm (sulfit) Fruktoz Bal, Sut, D-fruktoz Amperometrik 50 x Meyve suyu ve Sarap dehidrogenaz x10-3 mol/l Nisasta Bugday unu α- amilaz, Amperometrik 5 x ornekleri Amiloglikosilaz ve glikoz x10-4 mol/l oksidaz Etanol Bira Alkol oksidaz Amperometrik mm Aset aldehit alkollu Alkol Amperometrik M icecekler dehidrogenaz Polifenol Yesil cay, uzum ve Zeytin ekstarktlari Tyrosinaz Amperometrik mol /L Meyva suyu Sitrat Liyaz Sitrik asit ve Sporcu Amperometrik mm

45 icecekleri L-malat Sarap, Meyve sulari ve Cider L-malat dehidrogenaz ve Salsilat hidroksilaz Askorbik Meyve Askorbat asit sulari oksidaz L-amino Sentetik L-amino asit asitler ornekler oksidaz ve Horseradis peroksidaz L-glutamat Gida L-glutomat aromalari oksidaz ve NADH oksidaz Aminler Balik Diamin oksidaz Biyojenik Balik Diamin aminler oksidaz Histamin Deniz Histamin urunleri oksidaz Hipoksantin Balik Ksantin oksidaz Nitrat Sentetik Nitrat reduktaz ornekler Ispanak Oksalat Oksalat ornekleri oksidaz Oksalat Oksalat Ispanak oksidaz ve ornekleri horseradish peroksidaz Amperometrik Amperometrik Potansiyometrik Amperometrik Amperometrik Amperometrik Amperometrik Amperometrik Amperometrik Amperometrik Amperometrik mmol/l 5.0x x10-3 M mm <6 mm <9.5x10-7 M µm µm < 100 µm nitrat µm mmol/l Tablo 4. Gıda analizlerinde kalıntı, mikroorganizma, toksin ve katkılar için biyosensör uygulamaları [3]

46 Analit Uygulam a Biyokomponent Transduser Tespit orani Antibiyotikl Sut Antibadiler SPR - er Antibiyotikl er Gidalar Antibadiler SPR ng/ml Bakteri Tavuk karkasi Anti-salmonella antibody Amperometrik cfu/ml Bakteri Beef Anti-E coli 0157:H7 Fiber-optik cfu/ml Bakteri Gidalar Anti-E coli ve Anti- Salmonella Amperometrik hucre/ml Antibadileri Bakteri Tavuk ve balik S.Enteridis proteinleri Piezopelektrik quartz Kristal - Bakteri Gidalar Anti-Salmonella spp antibadi Piezopelektrik quartz Kristal 5x x109 cfu/ml Herbisit Sebzeler Antibadiler ISFET ng/ml Herbisit Gidalar Antibadiler Potansiyometrik µg/ml Herbisit Icme Antibadiler Piezopelektrik suyu quartz Kristal - Peptisitler Sentetik ornekler Asetilkolinesteraz Piezopelektrik quartz Kristal 5x x10-5 M (parokson) 1.0x x10-5 M (karbaril) Peptisit Sentetik ornekler Asetilkolinesteraz Fiber-optik 5x x10-7 M (karbofura n) 5x x10-6 M (parokson) Peptisit Sentetik ornekler Butinilkolinesteraz ve kolin oksidaz Amperometrik µmol/l Peptisit Sentetik Asetilkolinesteraz Fiberoptik mM

47 ornekler Peptisit Sentetik ornekler Asetilkolinesteraz ve Butinilkolinesteraz Potansiyometrik 1.5x x10-3 mol/l Peptisit Sentetik ornekler Asetilkolinesteraz Amperometrik 1.8x x10-5 M Peptisit Sut Kolinesteraz Amperometrik 1x x10-7 M Peptisit Sebzeler Asetilkolinesteraz ve Amperometrik 5x mg/kg Butinilkolinesteraz Peptisit Meyve sebze sulari Asetilkolinesteraz ve Butinilkolinesteraz Amperometrik µg/l(karba ril) Peptisit Meyve ve sebzeler Kolinoksidaz, Asetilkolinesteraz Amperometrik 1x x10-7 M ve Asetilkolin Peptisit Spiket elma Tirosinaz Amperometrik µmol/l ornekleri Toksin Gidalar Anti-aflatoksin Fiber-optik - antibadi Toksin Sentetik ornekler Anti-staphylococal enterotoksin Piezoelektrik quartz kristalin 1-10 µg SEB/ml B(SEB) Antibadi Toksin Sentetik Antibadiler SPR - ornekler Toksin Gidalar Antisphylococal enterotoksina(sea) Optik ng/g antibadi Toksin Gidalar Antisphylococal SPR 1-10 ng/ml enterotoksina(sea) antibadi Aspartam Gidalar Alkol oksidaz, α- simotrizin ve katalaz Amperometrik -

48 Biyosensörlere Đlişkin Bazı Spesifik Uygulamalar Son yıllarda geliştirilen ve yeni uygulama olanağı bulmuş değişik biyosensör çalışmaları vardır; *Antijen - Antikor - Toksin - Lipozom - Enzim kombinasyonuyla hazırlanan kolera toksin biyosensörüne, DNA hibridizasyonu temeline dayanan DNA-Avidin-Biotin-Lipozom-Enzim kombinasyonuyla oluşturulan Tay Sacs biyosensörleri örnek olabilir. *Diasetilen lipid ile türevlendirilmiş sialik asit molekülleri yardımıyla enfekte edilmiş örneklerde, UV ışık etkisiyle renk değişimi yoluyla virüslerin tayini, S.aureus ve E.Coli'nin fluoresans veren sistemler yoluyla belirlenmesi, gıda zehirlenmelerinde yaygın olarak karşılaşılan çeşitli bakterilerin antijen-antikor ve optik sistem kombinasyonlarıyla analizlenmesi son yıllardaki diğer ilginç biyosensör örnekleridir.