Agrobacterium rhizogenes

Transkript

1 Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium toprakta yaşayan gram negatif bir bakteri, Rhizobieceae fam., doğal genetik mühendisi, A. rhizogenes- saçak kök ( hairy root ) hastalığı A. tumefaciens- dikotillerde taç tümörü ( crown gall ) hastalığı A. rubi- bazı dikotillerde küçük tümörler oluşturur radiobacter- avirulent 1

2 Agrobacterium rhizogenes ve saçak kök ( hairy root ) oluşumu kontrol transformant A. rhizogenes, saçak kök hastalığı etkenidir (Riker et al., 1930; Hildebrand, 1934). 450 türden fazla bitkinin A. rhizogenes ile infekte olabildiği bilinmektedir. A. rhizogenes ile infekte edilmiş birçok türün eksojen hormon gereksinimi olmaksızın hızlı ürediği gözlenmiştir (Tepfer ve Tempé, 1981; Willmitzer ve ark., 1982). Bu özelliklerinden dolayı saçak kök kültürleri sekonder metabolit çalışmaları için önemli bir doku kültürü yöntemidir. 2

3 A. rhizogenes, Yaralanan bitki bölgelerinden salgılanan fenolik bileşiklere karşı kemo-hassas, hem kendi genomlarında hem de plazmidlerinde (Ri- root inducing ) taşıdıkları genler aracılığı ile kendi DNA bölgesini bitki genomuna aktarır ve bitkilerde saçak kök ( Hairy Root ) hastalığına yol açar. Saçak kökleri büyümek için bitki büyüme düzenleyicilerine gerek yoktur. Enfeksiyon sonucu oluşan dokunun normalde bitkide bulunmayan opinler olarak bilinen bazı aminoasit türevlerini sentezler. Opinler bakteri tarafından katabolize edilir. 3

4 saçak kök oluşumu ve opin sentezi için; 200 kb dan daha büyük bir megaplazmid üzerinde bulunan hareketli bir DNA parçası (T-DNA) iş görür. T-DNA bölgesinde bulunan genlerin transkripsiyonu sonucunda saçak kök oluşumu ve opin sentezi gerçekleşmektedir. Agrobacterium hücresinde bulunan Ri plazmidi ve bitki hücrelerine T-DNA aktarımı Ri plazmidi 4

5 A. rhizogenes in ırkları opin sistemine göre sınıflandırılmıştır. Agropine, mannopin, mikimopin veya cucumopin Ri plazmidinin T-DNA bölgesi bakteri ırkına göre değişebilen iki bölgeden ibarettir (TL ve TR DNA). TL DNA bölgesi saçak kök oluşumundan sorumlu genleri taşırken, TR DNA ise opin sentezinden sorumlu genleri taşır. Ri plazmidinde T-DNA bölgesinden başka vir bölgesi de bulunmaktadır. Vir bölgesinde A. rhizogenes in infeksiyonu için gerekli faktörleri sentezleyen genler bulunur. Bu genler vira, virb, virc, vird, vire, virf, virg, virh dir. Ayrıca bakteri kromozomunda bulunan chva, chvb, psca ve attr genleri de mekanizmanın işlemesinde görev alırlar. 5

6 6

7 Vir genleri tarafından kodlanan proteinlerin Agrobacterium daki fonksiyonu Vir proteini VirA VirG VirB1 VirC1 VirD1 VirD2 VirE1 VirF VirG Agrobacterium daki fonksiyonu Fenolik algılayıcı Fenolik tepki regülatörü T-pilusunun sentezi ve oluşumu T-DNA transferinin arttırılması In vivo T-DNA prosesi ve çift sarmal T-DNA nın sınırlarında in vitro çentik açılması T-DNA sınır spesifik endonükleaz; T-iplikçiğini bitkiye taşıyan pilot proteini T-DNA nın Agrobacterium dan taşınması ve korunması Taşınmada görev alan bir proteini kodlamaktadır VirA dan aldığı sinyalin devamını sağlar ve RNA polimeraz ile ilişkilidir A. rhizogenes in bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması saçak kök oluşumu için ilk aşamadır. Bakteri bitki duvarına tutunduktan sonra selüloz lifleri sentezlemektedir. Bakteri bitki hücre duvarına tutunduktan sonra bitki duvarından salınan fenolik bileşiklerce virülens genleri uyarılır. 7

8 T-DNA aktarımının moleküler mekanizması 1. Agrobacterium un bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması Virülens genlerin uyarılması 1 3. T-DNA transferi 4. T-DNA nın bitki genomuna entegrasyonu 2 Uyarılan vira proteini kendi fosfatını virg proteinine aktararak sinyal iletiminin devamını sağlar. VirG proteininin RNA polimeraz ile sıkı ilişkili olduğu bildirilmiştir. Vir genlerinin uyarılmasından sona, T-DNA bölgesinde tek iplikli bir parça sentezlenir. Ve bu tek iplikli DNA bitki hücresine aktarılır. vire proteini bu tek iplikli DNA yı sararak nükleaz etkilerinden korunması sağlanır. VirB proteini bitki duvarında bu tek iplikli DNA nın geçebileceği bir boşluk yaratarak aktarımı sağlamakta görev alır. Vir F de taşınmada görev alan bir proteini kodlamaktadır. T-DNA bitki nükleusuna ulaştıktan sonra bir veya birkaç kopya halinde rasgele birleşir. 8

9 VirB membran kanal modeli P. Zambryski den Agrobacterium dan bitki hücresine T-DNA aktarımındavir genlerinin fonksiyonu 9

10 Yaralanmış bitki hücreleri tarafından salgılanan fenolik bileşiklerin (asetosiringon) vir genlerini uyarması ve bitki hücresine T-DNA transferi Agrobacterium aracılığı ile gen aktarımı için gerekli olan koşullar-i- Gen aktarımı için uygun gelişme safhasındaki eksplant sağlanmalıdır. Tür içerisindeki farklı transformasyon oranları elde edilebilir. Geliştirilen gen aktarım tekniği, kültürü yapılan yüksek verimli çeşitlerde başarılı olmadıkça önemi yoktur. Çok sayıda bireysel transgenik bitki elde edebilmek için yöntem etkili, ekonomik ve tekrarlanabilir olmalıdır. Gen aktarımı yapılan hücrelerden transgenik bitkilerin elde edilebilmesi için etkili bir seleksiyon sistemi geliştirilmelidir. Maliyet ve somaklonal varyasyonu en düşük seviyede tutmak için, doku kültüründe geçen süre mümkün olduğu kadar kısaltılmalıdır. 10

11 Agrobacterium aracılığı ile gen aktarımı için gerekli olan koşullar-ii II- Gerek tohumla gerekse vejetatif çoğaltım için stabil ve tek tip transgenik bitkiler elde edilmelidir. Sadece istenilen özellikleri kodlayan genler bitkilere aktarılmalı, istenmeyen DNA dizilerinin geçişi engellenmelidir. Fazla kopya sayısından kaynaklanan, aktarılan genin inaktivasyonu ve entegrasyon bölgelerinde oluşabilecek gen zararlarını engellemek için, genler düşük kopya sayısında aktarılmalıdır. Aktarılan genler istenilen fizyolojik devrede ve arzu edilen seviyede aktivite göstermelidir. Agrobacterium aracılığı ile gen aktarımı ve transgenik bitkilerin elde edilmesi Seçici besi ortamında gün sonra saçak kök oluşumu Saçak kök 11

12 Gen aktarımında kullanılacak DNA parçası, aktarılmak istenen gene ilave olarak; Aktarılmak istenen genin bitki dokularında ifade edilebilmesi için RNA polimerazların tanıyıp bağlanabilecekleri düzenleyici diziler (promotorler) Sadece gen aktarımı yapılan hücre ve dokuların seçimi için seçici bir işaret geni ( marker ) Aktarılan genin bitkide anlatım yapıp yapmadığının anlaşılmasına yardımcı olmak üzere yer alan haberci ( reporter ) genler gereklidir. A. rhizogenes ile gen transferi; A. rhizogenes aracılığı ile gen aktarımı basit bir yöntem olmasına karşın, son yıllarda A. tumefaciens ve fiziksel yöntemlerle gen aktarımı daha önemli gelişmeler kaydetmiştir. Böylece A. rhizogenesin transforme bitki üretimi için vektör olarak kullanımına ilgi giderek azalmıştır. Diğer taraftan A. rhizogenes biyolojik çalışmalar yapmak üzere sekonder metabolit üretime ve metabolizma mühendisliği çalışmaları için saçak kök üretiminde etkin bir biçimde kullanılmaktadır. 12

13 Hairy Root ların avantajları, Temel avantaj, köklerin kolaylıkla dışarıdan hormon gerektirmeden basit besiyerlerinde kolayca üreyebilmeleridir. Sıklıkla kökler, disorganize hücre kültürlerinin ikilenme zamanına benzer şekilde hızla büyürler. Ama hücre süspansiyon kültürlerinden farklı olarak transforme edilen kültürlerin karakteristiği, sekonder metabolitleri tamamen farklılaştırırlar. Genel olarak normal köklere benzerler. Morfolojik olarak normal bitki köklerinden çok daha fazla dallanmış oldukları için farklıdırlar. Gelişme süresince çok fazla yeni yanal (lateral) meristematik büyüme noktaları meydana getirirler ve bu sayede normal köklerden daha hızlı bir büyüme oranı ortaya koyarlar. Bol miktarda üreyen (belli koşullar altında) dokular olduklarından, enzimolojik çalışmalar açısında da önemlidirler. Sürekli bölünen dokular oldukları için fenolik içerikleri düşüktür. Sekonder metabolit üretimi üzerine, substrat ve inhibitörlerin etkileri incelenirken tüm bitki ile yapılan çalışmalara göre kolaylık sağlar. Örnekler Tropan alkoloidleri- Hyoscyamus muticus saçak kökleri ( Flores ve Filner, 1985), Piridin alkoloidleri ve betasiyanin pigmentleri Nicotiana rustica ve Beta vulgaris saçak kökleri ( Hamill ve ark., 1986) Tropan alkoloidleri- Atropa belladonna ve Scopolia japonica ( Kamada ve ark., 1986, ve Mano ve ark., 1986). 13

14 Mikropropagasyon bitkileri in vitro çoğaltma sanatı.

15 Klon Tek bir bitkiden vegetatif olarak çoğalmış aynı genetik yapıdaki bitkiler.

16 Eksplant In vitro kültürü başlatmak için kullanılan hücre, doku veya organ.

17 Aksiller gövde çoğaltılması Aksiller tomurcuklara sitokinin uygulanması iledaha önce var olan meristemlerden gövde gelişmesi.

18 Gövde çoğaltılması Hally Jolivette kirazında

19

20 Mantar kontaminasyonu rhododendron kültürü

21 Rhododendron kültürleri

22 Amelanchier laevis toprağa ve tarlaya aktarım

23 Mikropropagasyon Olumlu Yönleri Bir bitkiden binlercesinin kısa sürelerde üretimi Kontrollu lab koşullarında üretim Yıl boyunca üretim Hastalıksız bitki üretimi

24 Aletler min.fiatta Deneyim Ucuz Potensiyel hastalıksız bitki Klasik Propagasyon Üstünlükleri Büyüme kontrolu için aşı, kök sürgünü gibi yöntemler

25 Mikropropagasyon Olumsuz Yönleri Alet ve donanım gereksinimi Teknik deneyim Protokol geliştirilmesi Endüstriyel standartlara uyum Pahalı üretim olabilir

26 Mikropropagasyon Uygulamalar Elit varyetelerin hızlı üretimi Hastalıların eliminasyonu Morfoloji ve büyüme özelliklerinin incelenmesi Büyümenin hızlandırılması

27 Gövde organogenez Yaprak, gövde ve çiçek üzerinde adventif meristem gelişimi

28 Afrikan menekşesinde yaprak kültürü

29

30 Begonia x chiemanta Emma mikroüretimin değişik evreleri

31 Somatik Embryogenez Bipolar zigotik embiryoya benzer yapıların oluşması.

32

33 Ototrofi ve miksotrofi Doğal koşullarda bitkiler ototrofiktir ve çevresel CO 2 kullanırlar. Doku kültüründe karbon kaynağı besiyerindeki karbonhidratlardır ve boş alndaki CO 2 olabilir (miksotrofi). Serada yetiştirilenlere göre kültürdeki bitkilerde fotosentez oranı düşüktür.. Akilimitasyon sırasında fotosentezin evolüsyonu ve Şeker ve nişasta türevlerinin evolüsyonu gerekir. Tam ototrofi ekstra CO 2 gereksinim gösterir PAR (250 µmol.m -2.s -1 ) Besiyerinde şeker azaltılınca bitkiler ototrofiye doğru gelişim gösterirler.

34 d Stoma yapıları varians

35 Aklimatizasyon tünelleri Max. Nem çok önemli

36 Büyüme odaları ayrı bölmelerde aklimatizasyon

37 Perlit, toprak, vermikülit, yosun vb. Maddeler ekim için kullanılır.

38 Otomasyon

39 Nem: Çok ıslak olmamalı Sıcaklık Yüksek ısıdan kaçınılmalı CO 2 : Yüksek konsantrasyon (900 ppm) Işık Çok şiddetli olmamalı Fotoperyod Doğru seçilmeli Gübre İlk aşamada gerekmez Pestisidler Min. Düzeyde olmalı

40 Somatik Hibridizasyon Farklı genotiplerdeki protoplastların füsyonu.

41

42

43

44

45

46

47 Somaklonal varyasyon Doku kültüründe regenere olan bitkilerdeki genetik varyasyon.

48

49

50

51

52

53 Kimera Bitki üzerinde farklı iki genotipik yapının bulunması.

54 Çiçek durumu kültürü. Brakte aksil Pedikul Çiçek tomurcuğu

55

56

57 Kallus eldesi Süspansiyon kültürü başlatılması Süspansiyon kültürü kurmak için genelde önce kallus kültürü kurulur. Friable kolay dağılan kalluslar en uygundur. Dağılmayan kallusla başlanırsa dağılan formların eldesine çalışılır. Bazen enzim de kullanılır. Düzenli alt kültürleme ile agregat birikimi engellenir.

58 Süspansiyon kültürü +

59 Anter ve mikrospor kültürleri haploid bitk elde etmek için yapılır. Haploidler daha sonra diploidleştirilerek istenen özellikteki bitkilerin kısa sürede eldesi amaçlanır.

60 Terminoloji Haploid bitki tek kromozom seti taşıyan bitkilerdeir. Androgenesis anterden haploid veya diploidleştirilmiş haploid bitkilerin gelişimi Tetraploidden oluşan haploid dihaploiddir. Birinci mitoz öncesi mikrospor, sonrası pollen tanesi terimi uygundur.. Isogenik döller birbirinden tek gen yönünden farklıdır.

61

62

63 Anter kültüründe anterdeki inhibe edici maddeler nedeniyle genellikle birinci bölünmeye geçiş olmaz. Anter duvarından homozigot olamayan diploidler oluşabilir. Mikrospo kültürü sonucu daima homozigotlar elde edilebilir. Homogen bir populasyon elde edilir.

64 Olumlu yönleri Olumsuzlukları Fenotip=Genotip Mutasyon çalışmaları için ideal İsogenik diploidler elde edilebilir Homozigotlaşma tek generasyonda olur Somatik hücre genetiği çalışmaları için ideal Seleksiyon, kantitatif karakter çalışmalaarı vb. İçin uygun Lethal genler taşınabilir.

65 Kendiliğinden Endoreduplikasyon Kimyasal Kolşisin colchicine Colchicine

66 Hücre çeperinden kurtulmuş plasma zarı ile çevrili hücreler.

67 Füsyon yapılabilir. Yabancı maddeyi içine alır. Çeper oluşumu incelenebilir. Tek hücre sistemidir.

68 8-15% (w/v) Mannitol ile plasmoliz yapılır.

69

70

71

72

73

74

75 Pirinç protoplastı 4 gün sonra ilk bölünme Hücre demetleri Blok üzerinde hücre kümeleri Bitki gelişimi

76 Bitki hücrelerinim özellikleri Büyük (10-100mM) Agregat oluşturur Yırtılmaya hassas Yavaş büyür Kolay kontamine olur Az oksijen gereksisnimi var Anaerobik koşullara toleranslı değil Büyümesiiyi (>300g/l taze ağırlık). Viskoz solüsyonlar oluştururlar

77 Dry weight (g/l) Büyüme özellikleri 1. Başlangıç fazı Plant Cell Suspension typical Growth curve 2. Eksponansiyal faz (dt 1-30 d) 3. Besiyeri içeriğinin azalması Durma fazı time (d)

78 Bioreaktör Kontrollu kabin Çalkalayıcı Tekerlek

79 Hücre süspansiyonu kullanım alanları: Metabolit üretimi Somatik embiryogenez vb..

80 Besiyeri Prof. Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

81 Bitki hücre, doku ve organ kültüründe ana parametreler 1. Besiyeri 2. Eksplant 3. Kültür çevresi Bu faktörlerle oynayarak büyüme ve gelişmeyi etkileyebiliriz.

82 I. İnorganik tuzlar/mineraller A. Bileşim, ana mikro- ve makroelementler* B. Miktar ve biçim C. optimizasyon II. Organik bileşenler A. Karbon kaynağı B. Büyüme düzenleyicileri C. Vitaminler D. Heksitoller E. Diğerleri III. Doğal kompleksler IV. Fiziksel taşıma maddeleri V. Besiyeri hazırlığı 1. Besiyeri

83 Esansiyel elementler Makroelementler- C, H, O, P, K, N, S, Ca, Mg Mikroelementler Fe, Mn, Zn, Cu, B, Cl, Mo Na, Se ve Si bazı bitkiler için esas elementtirler.

84 B. Miktar ve biçim - (White s vs MS), form (N, Gautheret (NO 3- ) vs MS (NO 3- & NH 4+ ) C. Optimizasyon - ph, stabilite, fizyoloji i. Nitrogen formu - e.g. NH 4 + organogenezi stimule eder ve NO 3 - embryogenezi, ph ve kök oluşumu etkilenir (NH ph, NO ph ) ii. Demir stabilitesi kelatlar daha stabil iii. K + absorpsiyonu - Na+ ile inhibe olur ve uyaran Ca 2+

85 Miktar

86 Miktar

87 II. Organik Bileşenler A. Karbon kaynağı - Sukroz, veya glukoz + fruktoz - 20 to 60 g/l Galactoz ve riboz - Fotoautotrofik hücreler - 1-2% CO 2 (100 E m -2 S -1 vs 25 E m 2 S -1 ),

88 II. Organik Bileşikler B. Büyüme düzenleyicileri - oksin (Hücre uzaması ve genişlemesi) ve sitokinin (hücre bölünmesi). 1. Oksinler IAA, (Doğal oksinler) IBA (indol türevi) ve10.0 mg/l (etkin konsantrasyonlar) ve 2,4-D, Dikamba, Pikloram (fenolic oksinler, herbisidler) ve NAA (naftalene asetik asit) to 10.0 mg/l, Nisbi aktivite - 2,4-D NAA IBA IAA;

89

90 2. Sitokininler - adenine to 30.0 mg/l a. adenine türevi sitokininler- zeatin, 2iP, kinetin ve benziladenin. b. fenilurea türevi cytokinins thidiazuron, difenilurea nisbi aktivite - zeatin 2-iP/fenilurea BA kinetin

91

92 Fenilurea

93 3. Gibberellinler to 1.0 mg/l, GA 3, gibberellinler 4-7 C. Vitaminler 1. Thiamine-HCl to 1.0 mg/l 2. Diğerleri- nikotinik asid, pridoksin-hcl D. Amino asidler/amidler mg/l Tirosin gövde oluşumu Glutamin/asparagin/prolin tahıl embiryogenesi Serin kök kültürleri

94 E. Heksitoller - 10 to 100 mg/l myo-inositol - Sorbitol/mannitol - osmotic stabilizer F. Diğerleri Purinler/pirimidinler - 50 mg/l Organik asidler (antioksidantlar) - 50 mg/l Tamponlar (ph) Adsorbantlar (PVP, charcoal) -.03 to 1.0% III. Natural Kompleksler (100 to mg/l) Hindistancevizi endospermi Protein hidrolizatları Meyve ekstreleri IV. Fiziksel Destek Maddeleri A. Jell maddeleri - (2 to 12 g/l) agar B. Structural destek - Filtre kağıdı vb.,

95 Agar : Ortamın sertleştirilmesi için kullanılır toz halindedir. Doğu Asya deniz alglerinden elde edilen polisakkarittir. Ortam asitliği(ph):5,5-6 arasında değişir. Su olarak kullanılır. deiyonize, destile steril su

96 Besiyeri hazırlığı A. deionize distile su B. ph - ph

97 D. Sterilizasyon 1. Isı sterilizasyonu C, 15 lbs/in2, dak Considerations: 2. Filtre sterilizasyonu or 0.45 m mesh membranlar, antibiotics 3. Radiosterilizasyon - gamma irradiationu 4. Gaz sterilizasyonu - ethylene oksid

98 2. Eksplant hazırlığı Eksplant - I. Mikroplardan arındırma A. Yüzey sterilizasyonu - B. İçsel dekontaminasyon - II. Asepsis: (0.3 m HEPA filters)

99 Bitkilerde sterilizasyon için kullanılan maddeler Konsantrasyon Zaman Madde Fitotoksisite (dak) Na hipoklorit % Ilımlı 5-20 Ca hipokhlorit 9-10% Ilımlı 5-20 H 2 O % Yüksek 5-20 Alkol (etanol veya isopropanol) 70% Yüksek 30 san.

100 2. Eksplant hazırlığı Eksplant Kültüre alınacak kısım I. Mikroplardan arındırma A. Yüzey sterilizasyonu B. İçsel sterilizasyon - II. Laminar Flow - (0.3 m HEPA filtreler)

101 I. Isı A C B. Günlük C. Mevsimsel II. Işık A. Kalite - B. Şiddet lux veya 20 E m -1 s -2 C. Fotoperiod - 16 saat/gündüz III. Nem 3. Kültür çevresi IV. Atmosferik gazlar

102 Doku Kültürü Küçük hücre,doku veya organ parçalarını veya organları bitkilerden ayıran ve aseptik koşullar altında sentetik beslenme ortamlarında (besiyeri) kültüre alan bir üretme tekniğidir.

103 Doku Kültürü Genel Fidan Üretimi Generatif üretim Vejetatif üretim Heterovejetatif üretim (Aşı) Autovejetatif üretim Mikrovejetatif üretim (Doku kültürü, invitro) Makrovejetatif üretim (Çelik)

104 Doku kültürü ile üretme çeşitleri Kallus kültürü Hücre (süspansiyon) kültürü Embriyo kültürü Protoplast kültürü(zarsız hücre): Organ kültürü( Tomurcuk, yaprak, kök ucu, anter, vb):

105 En çok kullanılan besiyerleri Murashige ve Skoog (MS) Llyod ve McCrown (Woody Plant Medium) WPM

106 Doku Kültürü MS ve WPM Ortamlarının Hazırlanmasında Kullanılan Stok Eriyikler MS WPM Besin Maddeleri Miktarı (mg/l) Besin Maddeleri Miktarı (mg/l) MAKRO STOK MAKRO STOK I NH 4 NO NH 4 NO KNO Ca (NO 3 ) 2.4H 2 O 5560 CaCl KH 2 PO MgSO MgSO KH 2 PO MAKRO STOK II MİKRO STOK H 2 SO H 3 BO MnSO 4.4H 2 O 2230 MİKRO STOK III ZnSO 4.7H 2 O 860 H 3 PO KI 83 NaMoO 4.2H 2 O 25 NaMoO 4.2H 2 O 25 CuSO 4.5H 2 O 2.5 MİKRO STOK IV CoCl 2.6H 2 O 2.5 MnSO 4.4H 2 O 2240 ZnSO 4.7H 2 O 860 CuSO 4.5H 2 O 25

107 Doku Kültürü MS Vitamin Stok ve NaFeEDTA İçeriği MS Vitamin Stok Miktarı (mg/l) NaFe EDTA Stok Miktarı (mg/l) Nicotinic Asit 50 NaFe EDTA 390 Pyridoxin HCl 50 Thiamine HCl 10 Glycine 200

108 D. Sterilizasyon 1. Isı sterilizasyonu C, 15 lbs/in2, dak 2. Filtre sterilizasyonu or 0.45 m mesh membranlar, antibiotics 3. Radiosterilizasyon - gamma irradiationu 4. Gaz sterilizasyonu - ethylene oksid

109 Eksplant hazırlığı Eksplant - I. Mikrorganizmalardan arındırma A. Yüzey sterilizasyonu - B. İçsel dekontaminasyon - II. Asepsis: (0.3 m HEPA filters)

110 Bitkilerde sterilizasyon için kullanılan maddeler Konsantrasyon Zaman Madde Fitotoksisite (dak) Na hipoklorit % Ilımlı 5-20 Ca hipokhlorit 9-10% Ilımlı 5-20 H 2 O % Yüksek 5-20 Alkol (etanol veya isopropanol) 70% Yüksek 30 san.

111 Doku kültüründe sterilizasyon çok önemlidir. Steril çalışılmazsa bakteri ve mantar tüm emekleri yok edebilir. A-Yüzeysel sterilizasyon B-Besiyeri sterilizasyonu:

112 Doku Kültürü A-Yüzeysel sterilizasyon (Materyal sterilizasyonu) Kültüre alınan materyalin sterilizasyonudur. Materyalin yüzeyinde mantar sporları ve bakteriler olabilir. Bunları öldürmek için sterilizasyon yapılır. Eksplantlar kış sonunda veya erken ilkbaharda alınırsa bu enfeksiyonlar en az düzeyde olmaktadır. Önce küçük dal parçaları bol su ile yıkanır. Yüzeysel sterilizasyonda %3 lük NaHCl(Çamaşır suyu) %70 lik alkol (etanol) ve saf steril su kullanılmaktadır. Eksplant: Kültüre alınan doku parçalarına denir.

113 Doku Kültürü Çeşme suyu %3 Na HCl Yüzeysel sterilizasyon %70 alkol steril saf su

114 B-Besiyeri sterilizasyonu Besiyerlerin sterilizasyonu için otoklav kullanılır. Besiyer 121 C, 1,1 atm basınç altında dakika tutulur.

115 I. Isı A C B. Günlük C. Mevsimsel II. Işık A. Kalite - B. Şiddet lux veya 20 E m -1 s -2 C. Fotoperiod - 16 saat/gündüz III. Nem 3. Kültür çevresi IV. Atmosferik gazlar

116 Kültür koşulları: Işık: lüks 16 saat Genel olarak C optimaldir. Nem: Doyma noktasına gelmeyecek kadar nem olmalıdır. Fazla olursa çürüme, az olursa kuruma olur.

117 Laboratuvar organizasyonu: Ön hazırlık odası: Besiyerlerin hazırlandığı, kültüre alınacak materyalin kabaca temizlenip steril edilecek duruma getirildiği, kullanılan kap ve malzemenin yıkanıp temizlendiği odadır.

118 Kültür hazırlama odası: Kültürün yapılacak olduğu odadır. Temiz ve hava akımının olmadığı bir yer olması gerekir. Bu odalar tamamen bağımsız, steril odalardır.

119 Kültür geliştirme : Çoğu bitki kültürleri sabit sıcaklık ve ışığı olan bir ortamda daha iyi gelişmektedir. Termostat yardımıyla sıcaklık ayarlanır. Işılandırma florasan lambalarla gerçekleştirilir.

120 Doku Kültürü ile Üretmenin Yararları: Kısa sürede üretim Vejetasyon süresine bağlı değil Çiçeklenmeye bağlı değil Plaigrotop büyüme engellenir. Mutant elde edilebilir Poliploid elde edilebilir Gen konservasyonu yapılabilir

121 Doku Kültürü Çelikle üretilmesi zor olan türler bu yolla üretilebilir Az alana ihtiyaç vardır Gen transferi yapılabilir Vejetetif melezleme yapılabilir Yaşlı ağaçlardan elde edilen materyalin yeniden gençleştirme olanağı vardır. Virüssüz bitki üretilebilir Çeşitli zararlılara karşı dirençli bitki üretilebilir

122 Doku Kültürü Doku Kültürü ile Üretmenin Sakıncalı Yanları: Az materyal kullanıldığı zaman gen fakirliğine yol açar. Bunu engellemek için çok sayıda ağaçtan yaralanmak gerekir. Pahalı bir yöntemdir.

123

124

125

126

127

128

129 BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ Prof. Dr. Nermin Gözükırmızı

130 Bitkilerin hayatımızdaki önemi Hayatın temelidir ve primer besin kaynağıdır. Havadaki oksijen dengesini sağlarlar. Çevre dengelerini düzenlerler. Erozyonu önlerler, nem sağlarlar. Sessiz fabrikalardır; tıp, kağıt, boya, kozmetik vb. sanayi uygulamalarında ve enerji alanında kullanılırlar. Mikro çevrede varlıklarını hareketsiz biçimde sürdürerek önemli katkılar sağlarlar.

131 Bitkiler çok çeşitlidir Eğreltiotları Çiçekli bitkiler Otsu bitkiler Geniş yapraklı bitkiler Kara yosunları Tohumlu bitkiler Kozalaklılar Yosunlar Ciğer otları Vasküler bitkiler Kara bitkileri Yeşil alg Bitkiler çok çeşitli bölge ve topraklarda büyüme yeteneği geliştirmiştir.

132 kadar bitki türünün kadarı yenilebilir 150 kadarı aktif tarımda kullanılır ancak 30 tanesi insan kalorilerinin %95 ini oluşturur. Ana ürünler (tahıllar, yağ bitkileri, baklagil, Patates, meyve, sebze ve şeker bitkileri) Özel ürünler (Yöresel; meyve, sebze, baharat vb. Az kullanılan ürünler(bazı tahıllar ve yağ bitkileri vb.) İhmal edilen ürünler ( Panicum,bazı tuberler) Yeni ürünler (Kiwi, Taxus vb.) Transgenik ürünler (Mısır, pamuk, soya vb.) Yeni teknolojilerle üretilen ürünler 4

133 Bitki Teknolojisinin Tarihsel Gelişimi (Mısır) MÖ 19.yy erken 20.yy Orta 20.yy Kültüre alma Melezleme Mutasyon ve seleksiyon Hücre kültürü Somaklonal varyasyon Embriyo kurtarılması Poliembriyogenez Anter kültürü Rekombinant DNA Marker ile seleksiyon Genomik Biyoinformatik Proteomik Metabolomik Sistem Biyoloji Yeni yöntemler 5

134 Bitki doku kültürü Aseptik şartlarda yapay bir besin ortamında hücre, doku veya organ gibi bitki kısımlarından (eksplant) kontrollü çevre koşullarında yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin üretilmesidir.

135 Eksplant; in vitro kültürü başlatmak için kullanılan bitki kısmı.

136 Bitki doku kültürleri Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak Kaybolmakta olan türlerin korunması Çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde rutin olarak uygulanmaktadır.

137 Daha önce var olan Yapılardan gelişme Totipotensi temelli gelişme Aksiller tomurcuk Adventif tomurcuk

138 Tuber oluşumu Çiçeklenme in vitro

139 Ovaryum Gelişimi Kök oluşunu Rizogenez

140 Aşı in vitro Bulbil Gelişimi

141 Somatik embiryogenez

142 Pamukta somatik embiryogenez

143 Bitki doku kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü Haploid bitki üretiminde anter (polen) veya yumurtalık (ovül) kültürü Somaklonal varyasyon İn vitro seleksiyon İn vitro döllenme İn vitro germplazm korunması Somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu) Gen transferi Sekonder metabolit üretimi Kimeralar Mikroçoğaltım Sentetik tohum üretimi

144 Bitki Doku Kültürü Tarihçesi TOTİPOTENSİ Hücre teorisi SCHLEIDEN 1838 bitkilerde, SCHWANN 1839 bitki ve hayvanlarda açıkladı: Among the lower plants any cell can be separated from the plant and continue to grow. Thus, entire plants may consist of cells whose capacity for independent life can be clearly demonstrated.

145 Haberland, 1902 (İlk aseptik kültür denemesi, Doku kültürünün kurucusu)

146 White,1934 İlk kök kültürü

147 WHITE, GAUTHERET ve NOBECOURT WHITE Nicotiana hibridi, GAUTHERET ve NOBECOURT Daucus carota ile 1939 da ilk bitki kültürünü yaptılar.

148 Gautheret, ilk kallus kültürü

149 Skoog, 1954

150 Murashige Murashige ve Skoog besiyeri

151 1957 Folke Skoog ve Carlos MillarOksin ve sitokinin dengesinin önemi

152 1958 Reinert ve Steward havuçta somatik embiryogenez

153 Maheswari, 1960 Anter kültürü

154 Nitsch, 1974 mikrospor kültürü

155 Cocking, 1960 Protoplast kültürü

156 Morel, 1960 mikropropagasyon Melchers, 1978 protoplast füsyonu Pomato

157 Nickell, Sekonder metabolit üretimi

158 1974 Schell ve Van Montagu

159

160

161

162 GDO Rekombinant nükleik asit teknolojisi ile gen aktarımı yapılarak oluşturulan organizma GMO (Genetically Modified Organism) GMO; Genetik olarak modifiye edilmiş organizma GDO; Genetik olarak değiştirilmiş organizma, Transgenik LMO (Living Modified Organism) 34

163

164 Biyoteknolojiye dayalı yeni bitki yetiştirme yöntemleri: Oligo-yönlendirilmiş mutagenez (ODM); sentetik oligonukleotidler ile genomda small, site-spesifik mutasyonlar oluşturma. Çinko parmak nukleaz teknolojisi(zfn); Geliştirilmiş cinko parmak nukleazları kullanarak to genomda sitespesifik mutasyonlar oluşturma. ZFN ile mutasyonlar birkaç nukleotid veya yeni DNA parçası insersiyonu şeklinde olabilir. Meganukleaz (MGN), Meganukleazlar moleküler DNA makası" dizileri yok etme ve değiştirme işleminde kullanılırlar. Talenler, Transkripsiyon Aktivatör Benzeri Efektör Nukleazlar CRISPR/Cas sistemi clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats Cisgenez/intragenez; Genoma ayni türden veya çaprazlanabilir bir türden yeni genler aktarma. RNA-bağımlı DNA metilasyonu (RdDM); DNA da metilasyon ile gen anlatımını etkıileme. Aşılama (on GM rootstock); non-gm bitki üzerine (rootstock) GM bitki aşılayarak tek vaskuler sistemli bitki oluşturmak. Reverse yetiştirme; Mayotik rekombinasyonu engelleyerek homozigot parental hatlar oluşturmak, sonra hibridizasyonla, elit heterozigotları elde etmek. Agro-infiltration; Sentetik genomik

165 Türkiye de Bitki Doku Kültürü Üniversiteler ve Ziraai Araştırma Enstitü Laboratuvarlarında mikroüretim çalışmaları ile başladı. Ege ve Ankara Üniversiteleri ile Bornova Ziraai Araştırma Enstitüsü Öncü kuruluşlardır. Günümüzde çok sayıda Üniversite, Araştırma Enstitüsü, TÜBİTAK ve Özel sektör laboratuvarlarında bitki doku kültürü çalışmaları gerçekleştirilmektedir.

166 Tavsiyeler Koridorlar transport için geniş olmalı Temiz alanda basınç olmalı Aseptik alan;: besiyeri saklama,, transfer odası, büyüme odaları Hazırlik ve sterilezasyon odası Aseptik alanlar: ofis, resepsiyon ve taşıma Günlük temizlik yapılmalı Lab.Bölümleri Ayakkabılar, ağız ve baş kapatılıp temiz önlük giyilmeli

167 Otoklav odası Besiyeri saklama odası * * laminar flows

168 Totipotensi ve Kompetens Totipotensi: Bütünü verme yeteneği Kompetens: Farklılaşma yeteneği olma

169 Bitki doku kültürü aşamaları Uygun bir laboratuvar düzeninin kurulması Kullanılacak bitki parçalarının ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu Kallus veya hücre süspansiyonlarının oluşturulması Kallus veya hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun uyarılması Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların oluşturulması Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi Köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması

170 Su Besin ortamları Makro elementler (azot, fosfor,sodyum, magnezyum, kükürt, vb.) Mikro elementler (demir, manganez, çinko, bakır, vb.) Vitaminler (thiamin, nikotinik asit, vb.) Şekerler (sakkaroz, glikoz, vb.) Jel yapıcı maddeler (agar, pytagel,jelatin, vb.) Amino asitler (glisin, arginin, vb.) Kimyasal olarak tanımlanamayanlar (hindistan cevizi sütü, vb.) Bitki büyüme düzenleyicileri

171 Hormon Oksinler Sitokininler Gibberellinler Absisik asit Etilen Bitki büyüme düzenleyicileri Genel Etki Fotoperyodizm, köklendirme, apikal dominans, yan sürgünlerin gelişiminin engellenmesi, hücre gelişimi. Hücre bölünmesi, yeniden farklılaşma, bitki rejenerasyonu, sürgün çoğaltımını etkiler, sürgünlerde köklenmeyi ve embriyogenesisi engeller. Meristemlerden bitki rejenerasyonun uyarılması, sürgünlerin boylarının uzatılması, embriyo ve ovül kültürlerinin gelişiminde, kallus gelişimi, organogenesis ve adventif kök oluşumunu engeller Doku kültüründeki rolü tam olarak bilinmemekle beraber somatik embriyoların olgunlaştırılmasında kullanılmaktadır. Köklerin uzamasını engelleyerek enine büyüme ve çoğalmayı arttırmaktadır.

172 Sıcaklık Işık Nem Kültür Şartları Kültür odalarında kullanım amacına göre 18±2, 22 ±2 veya 25 ±2 0 C ye ayarlanır. Genellikle serin floresan lambalarıyla sağlanır. Aynı zamanda ışıklama süresi ve zamanlamasıda önemlidir. % arasında bir değere ayarlanır.

173 Bitki Rejenerasyonu Organogenesis Somatik embriyogenesis Protoplast kültürü Haploid hücre kültürü Meristem kültürü (hastalıksız bitki üretimi)

174 ORGANOGENESİS Hücrelere ve dokulara baskı uygulayıp bazı değişikliklere sebep olarak sürgün veya kök taslağı diye adlandırılan tek kutuplu ve vasküler sistemi kökenini aldığı dokuya bağlı olan bir yapının meydana gelmesine yol açan işlemdir.

175 In vitro organogenesisde etkin bitki rejenerasyonu için gerekli şartlar 1. Uygun eksplantın seçilmesi 2. Büyümede aktif maddeleri içeren uygun bir besin ortamının seçilmesi 3. Fiziksel çevre koşullarının kontrolü

176 Eksplant seçimi Doku kaynağı olarak kullanılan organ Organın ontogenetik ve fizyolojik yaşı Eksplantın bitkiden alındığı dönem Eksplantın büyüklüğü Eksplantın alındığı bitkinin diğer özellikleri

177 Besin ortamının temel içerikleri İnorganik maddeler Organik maddeler Bitki büyüme düzenleyicileri Doğal kompleksler

178 Kültür şartları Ortamın fiziksel hali Ortamın ph değeri Nem Işık Sıcaklık

179 ORGANOGENESİS ÇEŞİTLERİ İndirekt organogenesis Direkt organogenesis Kallus Sürgün veya kök Sürgün veya kök Bitki Bitki

180 Organogenesis Olumlu yönleri; Hücre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tanıdığı için, generatif yoldan çoğaltılması zor olan bitkilerin üretimine kolaylıklar sağlamaktadır. Bitki transformasyon çalışmalarında oldukça önemlidir. Olumsuz yönleri; Bütün bitki türleri için evrensel bir rejenerasyon protokolü yoktur. Her bitki türü, hatta her bitki çeşidi için spesifik bir sistemin optimize edilmesi edilmesi gerekir.

181 Pamukta rejenerasyon protokolü Apeks Node

182 Pamuk nod eksplantlarından kallus oluşumu ve rejenerasyon

183 Pamuk nod eksplantlarından direkt gövde rejenerasyonu

184 Pamukta kök rejenerasyonu

185 İn vitro da rejenere olam pamuk bitkisinin toprağa aktarımı

186 SOMATİK EMBRİYOGENESİS Bağımsız vasküler sistemi olan ve kök ile sürgün aksini içeren iki kutuplu bir yapının oluşmasına yol açan bir süreçtir. Vejetatif hücrelerden gelişen embriyolar da somatik embriyo olarak adlandırılır.

187 Dikotiledon bitkilerde somatik embriyoların gelişim dönemleri globular kalp torpedo kotiledon

188 Somatik embriyogenesis Bireysel bitkilerin hücrelerinden geliştikleri için somatik embriyolardan elde edilen bitkiler genetik olarak klon oluştururlar. Döllenmiş yumurtadan gelişen embriyoda olduğu gibi, iki çenekli bitkilerde somatik embriyolar da globular, kalp, torpedo ve kotiledon oluşum safhalarını geçirirler. Gövde-kök eksenine aynı zamanda sahip olup, asıl doku ile vaskular bağlantıları olmadığından dolayı dokudan kolaylıkla ayrılabilirler.

189 Somatik embriyogenesisi etkileyen faktörler Eksplant kaynağı Genotip Besin ortamının içeriği Çevre şartları

190 Somatik Embriyo Rejenerasyonu Direkt embriyogenesis Eksplant İndirekt embriyogenesis Eksplant Somatik embriyolar Kallus Pro-embriyolar Bitki Bipolar embriyolar Bitki

191 Somatik embriyogenesisin kullanım alanları Klonal çoğaltım Sentetik tohum üretimi Gen aktarımı

192 Paulownia elongata da indirekt somatik embriyogenesis

193 PROTOPLAST KÜLTÜRÜ Hücre çeperleri yok edilmiş hücre zarı ile çevrili hücrelerin kültürüdür. Bir hücrenin duvarı uzaklaştırıldığında geriye kalan kısmına protoplast denir. Protoplastlar izotonik ortamlarda canlılığını sürdürüp, yeni duvar oluşturup, mitozla bölünebilir, yeni hücre grupları ve daha sonra da yeni bitkiler oluşturabilirler.

194 Protoplast izolasyonu, kültürü ve rejenerasyonunda önemli aşamalar Başlangıç materyali seçimi ve özellikleri a. Bitki türü/genotip b. Yaş, hücre hayat döngüsü, fizyolojik durum c. Eksplant ve donör materyal seçimi Bitki materyali ve enzim karışımlarının hazırlanması a. Yüzey sterilizasyonu b. Enzim karışımları ve özellikleri c. Yıkama solusyonları d. Pre-plazmolizasyon e. Ozmotik basınç

195 Protoplast izolasyonu, kültürü ve rejenerasyonunda önemli aşamalar Protoplast izolasyonu, saflaştırılması ve testler a. İnkübasyon metodu b. Saflaştırma yöntemleri c. Hücre duvarı kalıntısı, canlılık ve verim testleri Protoplast kültürü a. Besin ortamlarının özellikleri ve bitki büyüme düzenleyicileri b. Kültür yoğunluğu c. Kültür sistemleri Protoplastlardan kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu a. Besin ortamları ve yapılacak değişiklikler b. Ozmotik basıncın azaltılması c. Kallusun rejenerasyon ortamına transferi ve sürgün oluşumu

196 Protoplast Füzyonu ve Somatik Melezleme Protoplast teknolojisi ile en küçük canlı üniteye ulaşılabilmekte, hücre füzyonu, seleksiyonu ve klonlanması ile genetik transformasyona imkan sağlanmaktadır. Protoplast kültürü ve somatik melezleme bitki ıslahında daralan genetik varyabiliteyi genişletmede önemli metodlardan biridir. Son yıllarda bakteriler ve diğer yollarla aktarılan kimerik genleri taşıyan transgenik türlere karşı büyük bir reaksiyonun ortaya çıkması bu çalışmaların önemini daha da arttırmaktadır.

197 Protoplast Füzyonu ve Somatik Melezleme Protoplast kültürü ve füzyonu klasik ıslah yöntemleriyle gerçekleştirilemeyen ve çeşitli uyuşmazlıklar gösteren cins ve türler arası melezleme, ve hatta yeni türlerin elde edilmesinde bir araç olabilir. Protoplast füzyonu ve bu yolla bitki rejenerasyonu aynı zamanda cins ve türler arası mitokondriyel DNA (sitoplazmik erkek kısırlığı), kloroplast ve sitoplazma gibi çekirdek dışı genetik elementlerin transferine de imkan sağlamaktadır.

198 Yeni çeşit geliştirmede somatik melezlemenin uygulanışı

199 Somatik melezleme, iki protoplastın çekirdek, sitoplazma veya her ikisininde birbiriyle belirli ortam ve şartlarda birleştirilmesidir. Füzyon sonucu oluşan yapılara füzyon ürünleri veya heterokaryon denir. Bu birleşme sonucu oluşan bitki sitoplazmalar (sibrit), çekirdekler (hibrit) veya her iki bakımdan da somatik melez olabilir.

200 Protoplastların kimyasal ve elektriksel füzyonu ve somatik melezlerin elde edilmesi

201 Protoplast kültürünün olumsuz yönleri Her bitki türü için tekrarlanabilir bir şekilde protoplasttan bitki elde etme metodu geliştirilmiş değildir. Heterokaryonların etkin bir şekilde ayırımı yapılamamaktadır. Somatik melez bitkiler genellikle steril olmakta, döl vermemekte veya fertil olması durumunda çok geniş bir somaklonal varyasyon göstermektedir.

202 HAPLOİD BİTKİ ÜRETİMİ Somatik hücrelerdeki kromozom sayısı, ait oldukları bitki türünün gamet hücrelerinde bulunan kromozom sayısı kadar olan bitkilere haploid bitkiler denir. Haploid sayıda kromozoma sahip hücrelerde (polen/mikrospor veya megaspor) veya bu hücreleri içeren bitki kısımlarının (anter veya ovül) doku kültürü yoluyla elde edilen hücrelerinde veye rejenerantlarında yapılan kromozom katlanması sonucu homozigot bitkiler elde edilebilir. Bu tekniğe in vitro haploidi tekniği denir.

203 Haploid bitki üretimi Erkek gametten haploid uyartımı (Androgenesis) - Anter kültürü - Mikrospor kültürü Dişi gametten haploid uyartımı (Ginogenesis ve partenogenesis) - Ovül ve ovaryum kültürleri

204 Haploid bitkilerin sağlamış oldukları bazı yararlar; Tam bir homozigotiyi çok kısa sürede elde etmek mümkündür. Resesif mutasyonların açığa çıkartılmasında başvurulan en etkin yöntemdir. Haploidler ve bunların katlanması ile geliştirilen dihaploidler sitolojik, fizyolojik ve genetik açıdan önemli deneysel materyallerdir. Dioik türlerde veya klasik yöntemlerle homozigotiye ulaşmanın zor olduğu türlerde dihaploidizasyon yöntemi kullanılarak bu sorun bir generasyonda giderilebilir. Çok yıllık meyve ağaçları ve orman bitkileri gibi tohumdan çiçeklenmeye kadar oldukça uzun bir gençlik kısırlığı olan türlerde de haploidizasyon önem kazanmaktadır. Haploid bitkiler, farklı patojenlere karşı in vitro seviyede seçime olanak vermekte, hastalıklara dayanıklılık çalışmalarında yer, zaman ve maddi kazanç sağlamaktadır.

205 MERİSTEM KÜLTÜRÜ Meristematik hücreleri kullanarak gerçekleştirilen doku kültürü özellikle virüsten arındırılmış bitkilerin elde edilmesinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Apikal sürgün ve kök meristemi hücrelerinin virüs içerme ihtimali oldukça düşüktür.

206 Meristem ve sürgün ucu kültürlerinin uygulama alanları Virüssüz materyal elde etmek Mikroçoğaltım Germplazm muhafazası Genetik transformasyonlar Bitki materyallerinin uluslararası değişimi Bakteri ve mantarlardan arındırılmış bitkilerin üretimi

207 Meristem ucu kültürlerinde başarıyı etkileyen faktörler Bitki materyali - Eksplantın büyüklüğü - Donör bitkinin fizyolojik durumu - Eksplantın alındığı mevsim - Çeşit Kültür ortamı - Mineral tuzlar - Şekerler - Agar - Büyüme düzenleyicileri Kültür şartları

208 Meristem ucu kültürünün yararları En yüksek genetik kararlılık in vitro klonal çoğaltımda elde edilmektedir. Meristem ucu kültürü ile bulaşık olan bir donör bitkiden viral, bakteriyal, ve fungal patojenler uzaklaştırılabilir. Meristem ucu, soğukta muhafaza ve diğer kültür muhafaza teknikleri için homojen bir doku tipi olması ve küçük olması bakımından çok uygundur. Kimera olan bir materyalin aynen çoğaltımı için meristem ucu kültürü çok uygun bir tekniktir. Meristem ucu kültürleri, karantina uygulamalarına göre uluslararası taşımada çoğunlukla kabul edilen kültürlerdendir.

209 Meristem ucu kültürü tekniğinin sınırlamaları Virüsten arındırmada eksplant boyutu ile kontaminasyon derecesi arasında negatif bir ilişki vardır. Virüsten arındırılmış bitkilerin elde edilmesinde stok bitkinin fizyolojik durumu etkili olmaktadır. Bu nedenle virüsten arındırma sezon ile değişmektedir ve her mevsim virüsten arındırılmış bitkileri elde etme şansı mümkün olmamaktadır. Meristem kültürünün virüs eliminasyonunda etkili bir yöntem olarak tanımlanmasına karşın meristemlerin her zaman virüsten arındırılmış olmadığı da unutulmamalıdır.

210 MİKROÇOĞALTIM Bir bitkiden alınan ve tam bir bitkiyi oluşturabilme potansiyeline sahip bitki kısımlarından (embriyo, tohum, gövde, sürgün, kök, kallus vb) yapay besin ortamlarında ve aseptik koşullar altında yeni bitkilerin elde edilmesidir.

211 BİTKİLERDE MİKROÜRETİM

212 Mikroçoğaltımın bitki yetiştiriciliği ve genetiği yönünden önemi ve avantajları; Hastalık ve zararlılardan arındırılmış bitkisel materyal elde edilmesi Kitlesel üretimde - üretilen bitkilerde fenotipik ve genotipik benzerlik - alışılagelen yöntemlerden daha kısa kültür süresi - zor üretilen türlerin daha kolay üretimi - seçilen belirli/üstün genotiplerin hızlı üretimi - üretimde daha az anaç kullanılması Somaklonal varyasyondan dolayı yeni çeşitlerin/genotiplerin elde edilmesi

213 Mikroçoğaltım aşamaları Hazırlık aşaması Kültür başlangıç aşaması - Eksplant seçimi - Sterilizasyon - Başlangıç ortamları - Çevresel faktörler Sürgün çoğaltım aşamaları - Besin ortamları - Kallus oluşumu - Adventif tomurcuk oluşumu -Aksillar tomurcuk oluşumu Sürgün gelişimi ve köklendirme aşaması Dış ortama alıştırma (aklimatizasyon) aşaması

214 Mikroçoğaltımda karşılaşılan sorunlar Vitrifikasyon Toksik bileşiklerin birikmesi ve kararma Kontaminasyon

215 SOMAKLONAL VARYASYON Bitki ıslahında doğal varyasyonun daraldığı veya varyasyon meydana getirmenin zor olduğu durumlarda avantajlı olarak değerlendirilen varyasyon yeni bir kaynak olarak görülmektedir ve doku kültüründe ortaya çıkan bu kalıtsal değişikliklerin tümü somaklonal varyasyon olarak tanımlanmaktadır.

216 Somaklonal varyasyonun orijini Kültür uyarımı dönemi Kültürün gelişme dönemi Bitki rejenerasyonu dönemi

217 Somaklonal varyasyonun nedenleri Hücre organizasyonunun varyasyonda etkisi Doku kaynağındaki varyasyon - donör bitki orijinindeki değişimler - eksplant kaynaklı varyasyon DNA metilasyonu Nükleik asit öncüllerinin kaybı In vitro hücre bölünmesindeki anormallikler Bitki büyüme düzenleyicilerinin önemi Kültür ortamının bileşimi Kültür süresi Genotipin etkisi

218 Faktör Somaklonal varyasyonu etkileyen faktörler Genel Etki Genotip Farklı genotipler farklı derecede varyasyon gösterebilirler. Ploidi Yüksek ploidi düzeyine sahip olan bitkilerde daha fazla kromozom sayısı değişimleri görülmektedir. Rejenerasyon sistemi Protoplastlar eksplantlara göre daha yüksek varyasyon gösterir. Kültür süresi Uzun süreli kültürler daha büyük varyasyonlara neden olurlar. Doku kaynağı Bazı dokular daha fazla varyasyon gösterir. Büyüme düzenleyicileri Yüksek konsantrasyonları varyabiliteyi artırır.

219 Kallus kültürlerinden organogenesis yoluyla elde edilen bitkilerde genetik varyasyon kaynakları

220 Kallus kültürlerinde ve kallustan rejenere olan bitkilerde genetik varyabiliteyi etkileyen faktörler

221 Somaklonal varyasyonun avantajları Hızlı bir varyasyon kaynağı olarak elverişlidir. Bazı değişmeler yüksek frekanslarda meydana gelebilir. Agronomik özellikler değişebilir. Bazı değişimler homozigottur. Yeni varyantlar ortaya çıkabilir. Yeni varyeteler üretilebilir.

222 Somaklonal varyasyonun dezavantajları Somaklonal varyasyon mikroüretimde büyük kayıplara neden olmaktadır. Bitki biyoteknolojisinde bitki ıslahı teknikleri somatik hücrelerden rejenerasyona dayanmaktadır. Bu tür bitkiler somaklonal varyasyonun etkisi altındadır. Ancak istenmeyen mutantlar ayrılabilir. Fakat bu çok yıllık bitkiler için mümkün olmamaktadır. Bazı istenmeyen mutasyonlar hemen tanınamayacak ve bu yüzden bu mutantlar uzaklaştırılamayacaktır. Somaklonal varyasyon, hücre kültürlerinde sekonder metabolit üretimini de etkilemektedir.

223 BİTKİLERDE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALAR Prof. Nermin Gözükırmızı TÜBİTAK, GMBAE, Bitki Biyoteknolojisi Grubu İstanbul Üniversitesi Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü 2. Gen 1. DNA Hücre 4. Genom 3. Kromozom 7. Populasyon 5. Birey 6Aile (pedigri) 1

224 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL ÇALIŞMA ALANLARI Transkripsiyonel kontrol Translasyonel kontrol Translasyon sonrası kontrol Gen dizisi transkriptler primer protein ürünleri İşlevsel protein ürünleri (DNA) (mrna) Nasıl? Neden? Nasıl? Neden? DNA RNA PROTEİN Nasıl? Neden? MOLEKÜLLER ARASI ETKİLEŞİM GENOMİK PROTEOMİK YAPISAL İŞLEVSEL (TRANSKRİPTOMİK) YAPISAL İŞLEVSEL (METABOLOMİK) Nükleotid dizisinin belirlenmesi mrna analizleri Protein yapı analizleri Protein fonksiyon analizleri -omik DNA RNA Protein Metabolit Biyolojik işlev 2

225 BİYOTEKNOLOJİ Biyolojik sistemlerin, canlı organizmaların, ürünlerinin ve aktivitelerinin özgün kullanımlar için belli amaçlar doğrultusunda rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak değiştirilmesi işlem ve süreci İNSANLIK TARİHİ ekmek, bira, yoğurt, peynir yapımı ve geliştirilmesi süreçlerinde biyoteknolojiden yararlanılmıştır Moleküler biyolog, Biyokimya uzmanı, Eczacı, Mikrobiyolog,Mühendis, Doktor vb. gibi birçok disiplini bir araya getiren kişiler aracılığıyla şekillenir. 3

226 Bitkilerin hayatımızdaki önemi Hayatın temelidir ve primer besin kaynağıdır. Havadaki oksijen dengesini sağlarlar. Çevre dengelerini düzenlerler. Erozyonu önlerler, nem sağlarlar. Sessiz fabrikalardır; tıp, kağıt, boya, kozmetik vb. sanayi uygulamalarında ve enerji alanında kullanılırlar. Mikro çevrede varlıklarını hareketsiz biçimde sürdürerek önemli katkılar sağlarlar. Bitki Teknolojisinin Tarihsel Gelişimi MÖ 19.yy erken 20.yy Orta 20.yy Kültüre alma Melezleme Mutasyon ve seleksiyon Hücre kültürü Somaklonal varyasyon Embriyo kurtarılması Poliembriyogenez Anter kültürü Rekombinant DNA Marker ile seleksiyon Genomik Biyoinformatik Proteomik Metabolomik Sistem Biyoloji 4

227 5

228 6

229 kadar bitki türünün kadarı yenilebilir 150 kadarı aktif tarımda kullanılır ancak 30 tanesi insan kalorilerinin %95ini oluşturur. Ana ürünler (tahıllar, yağ bitkileri, baklagil, Patates, meyve, sebze ve şeker bitkileri) Özel ürünler (Yöresel; meyve, sebze, baharat vb. Az kullanılan ürünler(bazı tahıllar ve yağ bitkileri vb.) İhmal edilen ürünler ( Panicum,bazı tuberler) Yeni ürünler (Kiwi, Taxus vb.) Transgenik ürünler 7

230 Bitkileri tehdit eden tehlikeler Böcekler Bakteriler Viruslar Tuzluluk Don Kuraklık Asitlik BİTKİ ISLAHI 8

231 Bitki doku kültürü Aseptik şartlarda yapay bir besin ortamında hücre, doku veya organ gibi bitki kısımlarından (eksplant) yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin üretilmesidir. Bitki doku kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü Haploid bitki üretiminde anter (polen) veya yumurtalık (ovul) kültürü Somaklonal varyasyon In vitro seleksiyon In vitro döllenme In vitro germplazm korunması Somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu) Gen transferi Sekonder metabolit üretimi Mikroçoğaltım Sentetik tohum üretimi 9

232 G r o w t h Paulownia elongata Yaprak eksplantlarından globular somatik embiryolar MS+ 10 mg/l TDZ Torpedo somatik embiryolar hormonsuz MS besiyerinde 4 hafta sonra Çimlenme hormonsuz MS besiyerinde 2 hafta sonra 10

233 Paulownia elongata internod eksplantlarından direkt somatik embiryo gelişimi Globular somatik embiryolar MS+ 10 mg/l TDZ Torpedo somatik embiryolar hormonsuz MS besiyerinde 4 hafta sonra Bitki regenerasyonu hormonsuz MS besiyerinde 2 hafta sonra Çimlenme hormonsuz MS besiyerinde 2 hafta sonra Bitkilerin saksılara transferi peat ve perlite 3:1 oranında Sentetik Tohum Üretimi; Paulownia elongata Somatik Embiryolarından MS tuz solüsyonu; 3% sodium alginate ve 50 mm CaCl2 ile kaplama peat ve perlitde 3:1 2 hafta sonra gelişme 5 hafta sonra 11

234 Hücre çeperinden kurtulmuş plasma zarı ile çevrili hücrelere protoplast denir.. Pirinç protoplastı 4 gün sonra ilk bölünme Hücre demetleri Blok üzerinde hücre kümeleri Bitki gelişimi 12

235 HÜCRE KÜLTÜRLERİNİN KURULMASI Kallus Süspansiyon kültürü En önemli uygulama alanı sekonder metabolit üretimidir. Küçük, yuvarlak ve canlı hücrelerden oluşan, üreme fazındaki tipik bir agregat Uzun hücre Aktif olarak bölünen hücreler Hücre Tipleri Dev uzun hücre (G), Hücre süspansiyon kültürleri için tipik normal boyuttaki uzun hücreler ve yuvarlak hücreler Dev (G) hücre 13

236 Bitki hücrelerinin özellikleri Büyüklük (10-100mM) Agregat oluştururlar Yırtılmaya hassas Yavaş büyürler Kolay kontamine olurlar Az oksijen gereksinimleri vardır Anaerobik koşullara toleranslı değiller Büyümeleri iyi (>300g/l taze ağırlık). Viskoz solüsyonlar oluştururlar Anter ve mikrospor kültürleri haploid bitki elde etmek için yapılır. Haploidler daha sonra diploidleştirilerek istenen özellikteki bitkilerin kısa sürede eldesi amaçlanır. 14

237 Transgenik bitkiler Son 20 yılda bitkilerin genetik potansiyellerinin amaca uygun şekilde değiştirilmesi Bitki biyolojisi Tarım bitkilerinin geliştirilmesi Endüstri Tıp Genetik Modifikasyon nedenleri:.herbisit ve böceklere karşı dayanıklılık kazandırılması Virüsler, fungus, bakteri ve nematodlara karşı dirençlilik kazandırılması Çevresel koşullara tolerans Azot fiksasyonu ve ürün miktarının geliştirilmesi Geç olgunlaşma Besinsel özelliklerin geliştirilmesi Erkek kısırlık sağlama gibi amaçlarla gerçekleştiriliyor den 2005 e trasgenik ekim alanı 82 milyon hektara ulaşmıştır. 15

238 Agrobacterium toprakta yaşayan gram negatif bir bakteri, Rhizobieceae fam., doğal genetik mühendisi, A. rhizogenes- saçak kök ( hairy root ) hastalığı A. tumefaciens- dikotillerde taç tümörü ( crown gall ) hastalığı A. rubi- bazı dikotillerde küçük tümörler oluşturur radiobacter- avirulent 16

239 Genetik Mühendisliği + Bitki Doku Kültürü TRANSGENİK BİTKİ Yabancı genlerin aktarımı kültürde yetiştirilen bitki kısımlarının kullanımını gerektirir DOKU KÜLTÜRÜ TRANSGENİK TEKNOLOJİ İÇİN ÖN KOŞULDUR 17

240 Genetik Transformasyon Gen aktarımı genetik mühendisliği teknikleriyle doğal ya da sentetik nükleik asit dizilerinin aktarımı (Genetik Genetik transformasyon) Yabancı nukleik asit molekülünün hücreye girişi (insersiyon) Genoma bağlanması (entegrasyon) Genin anlatım yapması (ekspresyon) Döllere aktarımı 18

241 19

242 20

243 21

244 22

245 Gen aktarımında kullanılan yöntemler Dolaylı Gen Aktarımı - Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile - Agrobacterium rhizogenes aracılığı ile - Virüsler Dolaysız Gen Aktarımı - Biyolistik - Elektroporasyon - Mikroenjeksiyon - Makroenjeksiyon - Agro-enfeksiyon - Polen transformasyonu - Zigotik embriyoya DNA emdirilmesi - Fiberler aracılığı ile DNA aktarımı - Sonikasyon - Desikasyon - Elektroforez ve mikrolazer 23

246 Agrobacterium aracılığı ile gen aktarımı ve transgenik bitkilerin elde edilmesi Gen aktarımında kullanılacak DNA parçası, aktarılmak istenen gene ilave olarak; Aktarılmak istenen genin bitki dokularında ifade edilebilmesi için RNA polimerazların tanıyıp bağlanabilecekleri düzenleyici diziler (promotorler) Sadece gen aktarımı yapılan hücre ve dokuların seçimi için seçici bir işaret geni (marker) Aktarılan genin bitkide anlatım yapıp yapmadığının anlaşılmasına yardımcı olmak üzere yer alan reporter genlerden oluşur. 24

247 Gen aktarımından sonra marker gen (antibiyotik) ile seleksiyon Gen aktarımından sonra reporter gen (ateş böceği lusiferazı ile gen anlatım analizi 25

248 Gfp reporter geni taşıyan Arabidopsis bitkileri Biyolistik cihazı ve sistemin çalışma prensibi 26

249 20.Yüzyıl Mendel ve bezelyeler ile başladı. Arabidopsis genom projesinin tamamlanması ile sona erdi. 21. yüzyılda hangi çalışmalar genetik bilimi için önem taşıyacak? Birim Tanım Çalışma alanı Gen Genom Genomik mrna Transkriptom Transkriptomik Protein/Enzim Proteom Proteomik Metabolit/Fenotip Metabolom/Fenom Metabolomik 27

250 Arabidopsis thaliana L. Arabidopsis genomundan ne öğrendik? 125Mb gen ürünü, gen ailesi Genlerin %69u diğer türlerdeki genlerle benzer Transkripsiyonla ilgili proteinlerin %8-23ü diğer ökaryot proteinlerine benziyor, protein sentezi genlerinin %48-60u diğer türlerdeki genlerle benziyor Eski bir tetraploid atası da dahil büyük duplikasyonlar var Genlerin %69u bir işlevle bağlantılı %30un işlevi bilinmiyor Genlerin %8-28i diğer ökaryot genleri ile ilişkili 28

251 Arabidopsis in üç genomunun özellikleri Nukleus Plastid Mitokondri Genom büyüklüğü 125Mb 154kb 367kb Genom/hücre Duplikasyon %60 %17 %10 Protein genleri Gen sırası Değişken Sabit Değişken kb/protein Ortalama kodlama 1900nt 900nt 860nt İntronlu genler %79 %18.4 %12 Gen/pseudogen 1/0.03 1/0 1/ Transpozon %14 %0 %4 29

252 Arabidopsis de mutant oluşturma: Tohum uygulaması veya gen aktarımları ile mutanlar elde edilebilir. Mutantlar resesif ise ilk generasyon etkisi görülmez. Arabidopsis kendileşir. İki generasyon sonra seleksiyon yapılır. 30

253 31

254 Arabidopsis in genom bilgisinden de yararlanarak bitkilerde Gelişim Genetiği çalışmaları başlatıldı. 32

255 Transkriptom vs Proteom Çok sayıda genin ayni anda analizi Kolaylıkla kantite edilir 1mRNA/hücre izlenebilir Nükleotidler kolaylıkla manipule edilebilir mrna varlığı gen ürününün varlığını garantilemez Çok sayıda proteinin ayni anda analizi zor Kantite etmek zor (Özellikle Kütle Spektrosunda) Proteinlerle inceleme zor fakat daha stabiller Proteinler gerçek gen ürünü ve işlevsel unite Proteom da post translasyonal değişimlerden etkilenir Denek mrna izolasyonu Kontrol cdna nın mikroarray ile hibridizasyonu Floresan cdna sentezi Farklılığın belirlenmesi 33

256 DNA array teknolojisinin uygulamaya sokulması Ozturk, ZN, Talame, V, Deyholos, M, Michalowski, CB, Galbraith, DW, Gozukırmızı, N, Tuberosa, R, Bohnert, HJ, Monitoring Large- Scale Changes in Transcript Abundance in Drought- and Saltstressed Barley, Plant Molecular Biology, 48: , Denek Kontrol Protein izolasyonu İki boyutlu jel elektroforezi Jel boyama ve farklılıkların gözlenmesi 34

257 Denek Metabolit izolasyonu Kontrol Sıvı kromatografi (LC) ve fraksiyon toplama Fraksiyonların Nuklear Manyetik Rezonans (NMR) spektrofotmetri ölçümleri Denek ve kontrol örneklere ait spektrofotometrik ölçümlerin karşılaştırılması GÜNCEL TANIMLAR Genomik:Genomların analizi (yapısal ve işlevsel) Biyoinformatik: Biyolojik bilginin depolanması Transkriptomik: Gen ürünü RNA ların analizi Proteomik: Proteinlerin analizi Metabolomik: Metabolitlerin analizi Sistem Biyoloji: Genomik, transkriptomik, proteomik, metabolomik ve biyoinformatik verilerin belli bir biyolojik sistemi oluşturmak için integrasyonu 35

258 EPİGENETİK DNA sitozin metillenmeleri Histon kromatin modifikasyonları RNA interferens ve mikro RNA lar RNA aracılığı ile DNA metilasyonu Transgen sessizleşmesi Paramutasyon Genomik imprinting Viruslerle gen sessizleşmesi Paramutasyon Bir allelin ekspresyonunun diğer allele ilgili olarak değişmesi 36

259 Paramutasyon Bir paramutabl allel paramutagenik allele ilişkiden sonra paramutant allel olur. Paramutant allel sonraki generasyonlarda genelde stabildir. Paramutant allel paramutagenik olur. Nötral allel paramutabl veya paramutagenik değildir. paramutasyon 37

260 Mısırda paramutasyon lokus Para-mutable allel Para-mutagenik allel Reversible Paramutant allel paramutagenik DNA metilasyonu r R-r R-sc evet evet evet b B-I B hayır hayır hayır pl pl-rh pl -mah evet evet hayır 38

261 RNAi ile Gen sessizleştirilmesi ~22nt RNAs dsrna işlem ~22nt sirnas hedef mrna yıkım tanıma amplifikasyon dağılım kopyalama + işlem sekonder sirnas 39

262 RNAi mekanizması RNAi=RNA interference İlginiz ve bizlerle olduğunuz için teşekkür ederim. Tüm bu teknolojilerden haberdar olmayan bir bitki bilimcinin yarınları oluşturacak araştırmalara katkıları olamayacaktır. 40

263 Laboratuvarda Biyogüvenlik

264 Laboratuarlar, ilginç ve aynı zamanda tehlikeli çalışma alanlarıdır!

265 Laboratuarda Biyogüvenlik: Çalışan kişinin ve çalışma materyalinin korunması için; çalışma sırasında belirli laboratuar kurallarının, yöntemlerin, altyapı ve cihazların kullanılmasıdır.

266 -Laboratuar çalışmalarında uyulması gereken temel kurallar- Genel: Herhangi birşey yemekten ve içmekten kesinlikle kaçınılmalı Koruyucu gözlük, yüz koruyucu, eldiven ve önlük kullanmaya özen gösterilmeli Uygun giysiler giyilmeli (ayakkabılar kapalı olmalı, palto gibi hareket kısıtlayıcı ya da pahalı ve zarar görebilecek giysiler giyilmemeli). Takılabilecek aksesuar (uzun kolye, bilezik) kullanılmamalı Saçlar uzun bağlanmalı

267 Çalışırken I: Kimyasalları kullanmadan önce etiketleri dikkatle okunmalı. Eğer kimyasal ile ilk kez çalışılacaksa, öncelikle güvenlik etiketini okunmalı Kimyasallara çıplak elle dokunulmamalı (asla tatlarına bakmayı denemeyin ) Tutuşmaya neden olabilecek hot plate gibi aletlerin yanında yanıcı sıvılar bulundurulmamalı Belirtilen prosedür takip edilmeli, işlem çok zor yada açık ifade edilmemiş ise mutlaka yardım alınmalı

268 Çalışırken II: Çatlamış yada kısmen kırılmış cam eşyalar hiçbir çalışmada kullanılmamalı Herhangi bir kimyasal madde döküldüğünde hemen sorumlulara bildirilmeli Deneyinizi bitirdiğinizde çalışma alanı temizlenmeli. Çalışma alanınız için uygun olan temizleyiciler kullanılmalı Laboratuvardan ayrılmadan once, kullanılan kişisel koruyucu ekipmanlar temizlenmeli ve eller yıkanmalı

269 Çalışırken III: Laboratuar atıkları uygun atık kaplarında toplanmalı Kırık cam, bistüri, agaroz ve poliakrilamid jeller genel çöplüğe atılmamalı Kimyasal atıklar etiketli özel kaplarda toplanmalı

270 BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ LABORATUARINDA GÜVENLİ ÇALIŞMA İLKELERİ Çalışma öncesi eller sabunlanır ve alkollenir (%70). Alkol ve asit içeren solüsyonlar çeker ocak içinde hazırlanır. Doku kültürü çalışmaları öncesi ve sonrasında çalışma kabininin için %70 lik teknik alkol ile silinir dakika UV ışık açılır. Kontamine olmuş besiyerleri (bitki veya bakteri materyali gibi) otoklav edildikten sonra normal çöpe atılır. Etidyum bromür içeren agaroz jellerin tutulduğu eldivenler ile hiçbir yere dokunulmamalıdır.

271 Dekontaminasyon: Hedef organizmanın tamamen yok edilmesi Otoklav ile sterilizasyon Çamaşır suyu- 50 g/l klor içerir. Laboratuarı dezenfekte etmek için 1 g/l konsantrasyonunda klor kullanılmalıdır (%2) Deterjanlar Alkol (70%)

272 Otoklav: Atık ve temiz materyallerin sterilizasyonu farklı otoklavlarda yapılır. Biyolojik atık torbası : 121 O C de en dakika tutulmalı Otoklavlanacak bütün maddeler kapların içine konulmalı Otoklav haznesi buharın eşit dağılması için çok fazla doldurulmamalı

273 Alkoller: Etanol ve 2-propanol benzer dezenfektan özelliğine sahiptir. Bakteri, fungus ve lipid içeren virüsler karşısında aktiftirler. En yüksek etkiyi yaklaşık %70 lik konsantrasyonda gösterirler. Deri ile temas süresi 10 saniyeden, yüzeyler ile teması ise 3 dakikadan daha az olmamalıdır.

274 Eldivenler: Tek kullanımlık plastik olanlar Kalın deri veya kumaştan olanlar Temiz alanlara (kapı tokmağı, bilgisayar klavyesi) eldivenle dokunulmaz ve laboratuar dışında eldiven ile dolaşılmaz.

275 Laboratuar malzeme ve cihazlarıyla ilgili uyulması gereken temel kurallar: Mümkün olduğunca plastik malzeme tercih edilmeli Tüm cam pipetler pamuk tıkaç içermeli Buzdolapları, derin dondurucular ve kuru buz kutuları belli aralıklarla çözülmeli, temizlenmeli ve içindeki malzemeler etiketlenmeli

276 Biyogüvenlik kabinleri: Biyogüvenlik kabinlerinde kabin içindeki malzeme sayısı en az düzeyde tutulmalı Kabin içine alınacak malzemelerin yüzeyi ve kabin yüzeyi dezenfektanla silinmeli

277 Santrifüjler: Santrifüj tüpleri tercihen plastik olmalı Tüplerin dengeli olmasına dikkat edilmeli Metal tüplerin ağırlıklarının eşitlenmesinde korozyona yol açacak solüsyonlar kullanılmamalı Tüplerin fazla doldurulmamasına dikkat edilmeli Santrifüj haznesi, rotorlar ve tüpler her gün çatlaklar ve korozyon açısından kontrol edilmeli

278 Bulaşıcı materyaller ile çalışırken dikkat edilmesi gereken kurallar Eldiven giyilmeli, koruyucu gözlük ve kalkan kullanılmalı Örnek kapları tercihen plastik olmalı, etiketlenmeli Dökülmeleri önlemek üzere örnek kapları ikinci bir kabın içine koyulmalı Örnekler biyogüvenlik kabinlerinde açılmalı Ağızla pipetleme yapılmamalı, örnek pipetle çekip-bırakma yöntemiyle karıştırılmamalı Kontamine- tekrar kullanılabilir malzemeler dezenfektan içinde 1 gün bekletilmeli Her çalışma sonrası çalışma alanı uygun bir dezenfektanla dekontamine edilmelidir

279 TEHLİKELİ KİMYASALLAR: Tehlikeli maddeler, tehlikeli maddelerin taşınması ile ilgili yönetmelikler uyarınca ya da tehlikelerinin derecesine göre sınıflandırılırlar. Reaktiflik, bozunma hızı, yangın veya sağlık tehlikesi ya da toksik etkilere göre sınıflandırma yapılır.

280 Color and Number Coded Label Systems NFPA-type label Business & Legal Reports, Inc. Colors represent kind of hazard Red = fire Yellow = reactivity Blue = health White = specific hazard & personal protection Numbers show degree of hazard 0 = Minimal 1 = Slight 2 = Moderate 3 = Serious 4 = Severe

281 White = specific hazard OX = Oxidizer ACID = Acid ALK = Alkali COR COR = Corrosive W = Use no water Business & Legal Reports, Inc.

282 Vücuda Giriş Yolları : Soluma,Kimyasallar tahrişe, hassasiyete, allerjik reaksiyonlara, solunum rahatsızlıklarına veya kansere neden olabilirler. Temas, Deri ile temas kimyasal yanıklara, gözde konjuktivite veya sistemik zehirlenmeye neden olabilirler. Ağızdan alma, Zehirli kimyasallar, ağızla pipetleme yaparken veya yiyecek ve içeceklerin bu kimyasallarla kontaminasyonu sonucunda kazayla yutulabilir. Kesik, Deriden zehirli kimyasallar kesikler, sıyrık veya iğne batması yoluyla vücuda girebilir.

283 Kimyasalların Toksik Etkileri: Solunum sistemi, kan, akciğerler, böbrekler, sindirim sistemi ve diğer dokular olumsuz yönde etkilenebilmektedir. Bazı kimyasallar karsinojendirler. Bazı çözücü buharları toksiktir. Yukarıda sayılan ciddi etkilerin yanı sıra, geç olarak ortaya çıkabilen uyuşukluk, koordinasyon bozukluğu gibi belirtiler olabilir. Pek çok organik çözücü ile uzun süreli temas, deri hasarına yol açar. Bu derinin yağ kaybetmesine bağlı olabildiği gibi alerjik ya da korozif belirtiler de oluşabilir.

284 Kimyasalların Ortama Dökülmesi: Madde üreticileri dökülme durumunda yapılacakları belirten uyarılar hazırlamışlardır. -Koruyucu elbise ör: sıvı geçirmez kauçuk eldivenler, koruyucu - Süpürge, faraşlar, ayakkabı/botlar respiratörler, - Cam toplamak için cımbızlar, - Paspaslar, havlu kağıtları, - Kovalar, - Asitleri nötralize etmek için sodyum karbonat (Na2CO3) veya sodyum bikarbonat (NaHCO3) - Kum, - Yanıcı olmayan deterjanlar. Sıvı dökülmelerinde aşağıdaki şekilde nötralizasyon yapılmalıdır : - Asitler, korozif kimyasallar sodyum karbonat (Na2CO3) veya sodyum bikarbonat (NaHCO3) - Alkaliler kuru kum ile kaplanmalı

285 Tehlikeli Bir Kimyasalın Dökülmesi Halinde Yapılacaklar 1. Biyogüvenlik sorumlusuna haber verilir, görevli olmayan personel olay yerinden uzaklaştırılır. 2. Kontamine olanlara yardım edilir. 3. Dökülen madde yanıcı ise, alevler söndürülür, açık olan gazlar kapatılır, kıvılcıma karşı elektrik ana şalteri kapatılır. 4. Dökülen maddenin kokusu solunmamaya çalışılır. 5. Havalandırma mümkünse çalıştırılır. Çok miktarda bir sıvı dökülmesinde oda boşaltılmalı, pencereler açılmalıdır. Dökülen madde yanıcı ise, alevler söndürülür, açık olan gazlar kapatılır, kıvılcıma karşı elektrikli cihazların fişleri prizden çıkarılır.

286

287

288

289 -Kaynaklar- Laboratuarda Biyogüvenlik, Doç.Dr.Tijen Talas Oğraş, TUBİTAK, GMBAE

290 Doku kültüründeki zorluklar Virüs Bakteri Mantar Mikoplazma Böcek ve diğerleri ile kontaminasyon

291 Virüsler

292 We do not have the possibility to prove a culture is free of bacteria. Sometimes symptoms of bacterial infestation are visible on the plant material or on/in the culture medium. Often visible symptoms appear late in culture or after a few subcultures. They may also not appear at all, but create problems in the early stages of acclimatization. Not all bacteria are pathogenic, they may even have beneficial effects. Agrobacterium Bacillus Enterobacter Pseudomonas Lactobacillus Staphylococcus 3 % 13 % 12 % 19 % 11 % 26 % Doku kültüründe gözlenen bakteriler (Leifert & Waites, 1990)

293 Genelde gözle izlenebilerler. Mantarlar

294 Mycoplasma İzlenmeleri zordur.

295 Artropodlar

296 Virus Bacteria Meristem kültürü, Büyümeyi uzatma, Termoterapi meristem kültürü antibiyotikler Fungi Sterilizasyon ve böceklerden kaçınma Mycoplasma Mikro artropod ve benzeri mikoplazma yok edici etmenler Pestisid veya kapları böcek tutucuların üzerine yerleştirme

297 Virus Virüs analiz yöntemleri Konak hücreye zararlı mı? Electron mikroskop büyüklük ve morfoloji ELISA / Serolojik test Nukleik asid hibridizasyonu / PCR -

298 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbant Assay)

299 Ekofizyoloji Su miktarı Su taşınması Gazlar Boş alanın içeriği Tayin edici faktörler Etkiler

300

301

302 İçerik Sera Kültür kabı O 2 22 % 4 % N 2 77 % 87 % CO ppm 20 % Su buharı % ± 100 % etilene 5 ppb ppb > 2 ppm

303 Gaz kompozisyonunu tayin eden faktörler Bitki Kültür Kabı Besiyeri Çevre koşulları

304 Fig. 1: growth reduction Fig. 2 Albinism Fig. 3. Evolution of carbon dioxide content in honey-jars

305 Somaklonal varyasyon kültürde regenere olan bitkiler arasında görülen varyasyondur. Gen, kromozom sayı ve kromozom yapı değişiklikleri ile kendini gösterir. Varyasyonu arttırarak bazen iyi özelliklerin kazanılmasını da sağlar. Eksplant, kültür ortamı, kültürleme koşulları, kültür yaşı, alt kültürleme aralıkları somaklonal varyasyon oluşumunu etkiler. Kültürler ne kadar genç kallus fazı ne kadar kısa ise somaklonal varyasyon o kadar azalır.

306 Varyasyon= Çeşitlilik Genetik varyasyon=kalıtım maddesindeki değişiklikler (Kalısal) Epigenetik varyasyon=kalıtsal olmayan fenotipik değişiklikler ÖRN.Fizyolojik varyasyon Somaklonal varyasyon=kültürde kendiliğinden oluşan varyasyon Gametoklonal varyasyon=gametlerden türevlenen dokularda oluşan varyasyon

307 Somaklonal varyasyonun orijini Kültür uyarımı dönemi Kültürün gelişme dönemi Bitki rejenerasyonu dönemi

308 Somaklonal varyasyonun nedenleri Hücre organizasyonunun varyasyonda etkisi Doku kaynağındaki varyasyon - donör bitki orijinindeki değişimler - eksplant kaynaklı varyasyon DNA metilasyonu Nükleik asit öncüllerinin kaybı In vitro hücre bölünmesindeki anormallikler Bitki büyüme düzenleyicilerinin önemi Kültür ortamının bileşimi Kültür süresi Genotipin etkisi

309 Kallus kültürlerinden organogenesis yoluyla elde edilen bitkilerde genetik varyasyon kaynakları

310 Kallus kültürlerinde ve kallustan rejenere olan bitkilerde genetik varyabiliteyi etkileyen faktörler

311 Somaklonal varyasyonun avantajları Hızlı bir varyasyon kaynağı olarak elverişlidir. Bazı değişmeler yüksek frekanslarda meydana gelebilir. Agronomik özellikler değişebilir. Bazı değişimler homozigottur. Yeni varyantlar ortaya çıkabilir. Yeni varyeteler üretilebilir.

312 Somaklonal varyasyonun dezavantajları Somaklonal varyasyon mikroüretimde büyük kayıplara neden olmaktadır. Bitki biyoteknolojisinde bitki ıslahı teknikleri somatik hücrelerden rejenerasyona dayanmaktadır. Bu tür bitkiler somaklonal varyasyonun etkisi altındadır. Ancak istenmeyen mutantlar ayrılabilir. Fakat bu çok yıllık bitkiler için mümkün olmamaktadır. Bazı istenmeyen mutasyonlar hemen tanınamayacak ve bu yüzden bu mutantlar uzaklaştırılamayacaktır. Somaklonal varyasyon, hücre kültürlerinde sekonder metabolit üretimini de etkilemektedir.

313

314

315

316

317 Gözükırmızı, N., Arı, Ş., Oraler, G., Okatan, Y., Ünsal, N. (1990).Callus induction, plant regeneration and chromosomal variations in Barley. Acta Bot. Neerl. 39(4),

318

319

320

321 Ana veya verici bitki Eksplant kaynağı olarak seçilen belli genotipte, sağlıklı ve iyi bir fizyolojik durummdaki bitki.

322 Eksplant Ana bitkiden ayrılıp kültürü yapılan bitki parçası Inokulum Kültürde olan bir bitki materyelinin alt kültürü Ekslant: Hava kısımları toprak altı kısımlarından daha temizdir Küçük eksplant kontaminasyon riskine karşı daha iyidir ama yaşama yeteneği azalır. İç dokular daha sterildir Ekplantlar daima ayni davranışı sergilemezler:

323 Eksplantın pozisyonu önemlidir

324 Ekplantın yaşı önemlidir

325 Eksplant yaşı ve mikroüretim Coniferae de in vitro üretim (A) embiryo ve (B) yeni çimlenme durumunda olur (C) GENÇ FİDELERDE BİLE KAYBOLMUŞTUR. (D) YAŞLI AĞAÇLARDA KÖKLENME AZALIR.

326 Polarite Saintpaulia da gövde gelişimi hep bir uçtan başlar

327 Doku kültürü aseptik bir teknolojidir asepsis Sterilizasyon yöntemleri kullanarak kontaminasyonu engelleme aksenik Diğer canlı organizmalardan uzaklaştırılmış. Sterilizasyon Isı, filtre, kimyasal ve diğer malzemeleri kullanarak mikroorganizmaları ve sporlarını öldürme

328 Yüzey sterilizasyonu Kesilmiş bitki materyelini uygun bir kaba koy Musluk suyu ile yıka Alkolde çalkala HgCl 2 (0.1-1%) + Teepol 2 damla/100ml: 3-5 dak Otoklavlanmış distile suya koy Çamaşır suyu 7-15% + Teepol 2 damla/100ml: dak Otoklavlanmış distile su ile birkaç kez yıka

329 Besiyeri sterilizasyonu Isıya dayanıklı olan içerikler otoklav ile, dayanıksızlar filtre ile steril edilirler. Otoklav. 100 kpa basınçta 120 C,0.22µm filtre

330

331 Cam eşya: otoklav, kuru ısı (180 C birkaç saat), radyasyon Disposable malzeme: radyasyon Kağıt: kuru ısı Çalışma aletleri: alevden geçirme veya ısı, (flame, glass beads) Benç yüzeyi: alkol Çevre: laminar flow kabin (HEPA-filtresi) steril kağıt: kuru ısı steril aletler laminar flow kabin

332 Basic ana Optional elements Su Mineraller Karbonhidrat kaynağı Vitaminler Gelleştirici maddeler Bitki büyüme düzenleyicileri Kelatlar Osmotik etmenler Kömür amino asidler organik nitrogen kompleks maddeler

333 Murashige and Skoog stok solutions Macro elements Micro elements NH 4 NO g/l KI 0.83 mg/l KNO g/l H 3 BO mg/l MgSO 4.7H 2 O 0.37 g/l MnSO 4.4H 2 O 22.3 mg/l CaCl 2.aq 0.33 g/l ZnSO 4.7H mg/l KH 2 PO g/l Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 mg/l CuSO 4.5H 2 O mg/l CoCl 2.6H 2 O mg/l Na 2.EDTA 37.3 mg/l FeSO 4.7H 2 O 27.8 mg/l

334 ph 5.5 ve 6.0 otoklav öncesi Tuzların çözülmesi için önemli Besiyeri içernlerinin içeri alınmasi için önemli Agar ın jelleşmesini etkiler ph otoklav ve kültür sırasında değişiklikler gösterir ph değişimleri

335 Sıcaklık 22 ± 2 C. Gece biraz düşük olabilir. (5 C) kadar bir yükseklik kültür kabında oluşabilir. Sıcaklık uniformitesi zordur. Işık peryodunda ısınmalar oluşur.

336 Işık Fluoresan ışık kullanılır. Işıkta: Fotoperyod Işık şiddeti Spektrum önemlidir.

337 Fotoperyod çokönemlidir. Gün uzunluğu 16 saat olarak uzun gün bitkilerine ayarlanır. Enerji tassarrufu için her raf farklı ışıklandırılabilir.

338 En uygun ışık şiddeti yaklaşık 30 µmol m -2 s -1. ototropfik doku kültürlerinde 250 µmol m -2 s -1 gerekir.

339 Spektrum foto-morpogenik etkiler için önemli. Mavi/kırmızı ve kırmızı/kırmızı ötesi Spektrum lamba tipine bağlıdır.

340 Nisbi nem (RH) genelde kontrol edilmez. Aslında %70-80 olmalı. Hiper su birikimi de ayrı bir sorundur. Su damlaları RH 100%

341 GENETİK OLARAK DEĞİŞTİRİLMİŞ BİTKİ VE BİTKİ KÖKENLİ GIDALARIN TANIMLANMASINDA KULLANILAN YÖNTEMLER Z.İpekçi 1, A. Altınkut 1, T. Oğraş 1, N. Gözükırmızı 1,2 1 TÜBİTAK, Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü (GMBAE), P.K. 21, 41470, Gebze-Kocaeli 2 İstanbul Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, 34454, Vezneciler-İstanbul

342 Bir canlı türüne başka bir canlı türünden gen aktarılması veya mevcut genetik yapıya müdahale edilmesi yoluyla yeni genetik özellikler kazandırılmasını sağlayan modern biyoteknoloji tekniklerine gen teknolojisi, bu teknolojiyi kullanarak doğal süreçler ile elde edilmesi mümkün olmayan yeni özellikler kazandırılmış organizmalara da Genetik Yapıları Değiştirilmiş Organizma (GDO) denir.

343 Bitki Teknolojisinin Tarihsel Gelişimi MÖ 19.yy erken 20.yy Orta 20.yy Kültüre alma Melezleme Mutasyon ve seleksiyon Hücre kültürü Somaklonal varyasyon Embriyo kurtarılması Poliembriyogenez Anter kültürü Rekombinant DNA Marker ile seleksiyon Genomiks Biyoinformatik Proteomiks

344 Rekombinant nükleik asit teknolojisi ile gen aktarımı yapılarak oluşturulan organizma (mikroorganizma, bitki veya hayvan) GMO (Genetically Modified Organism) GMO; Genetik olarak modifiye edilmiş organizma GDO; Genetik olarak değiştirilmiş organizma, Transgenik LMO (Living Modified Organism) Bu tip organizmaları içeren gıdalara da GMO lu (Genetik olarak değiştirilmiş katkılar içeren gıdalar) tanımı kullanılmaktadır.

345 Genetik Modifikasyon (Bitkilerde) Herbisit ve böceklere karşı dayanıklılık kazandırılması Virüsler, fungus, bakteri ve nematodlara karşı dirençlilik kazandırılması Çevresel koşullara tolerans Azot fiksasyonu ve ürün miktarının geliştirilmesi Geç olgunlaşma Besinsel özelliklerin geliştirilmesi Erkek kısırlık sağlama gibi amaçlarla gerçekleştiriliyor den 2003 e trasgenik ekim alanı 6 milyon hektara ulaşmıştır.

346 Genetik Olarak Değiştirilen Organizmaların Tanımlanması DNA ya dayalı teknikler Kalitatif...PCR Kantitatif...Kantitatif-kompetetif PCR, Real-time PCR, LightCycler, Perkin Elmer Mikroarray (DNA chip ) Proteine dayalı teknikler ELISA Western blot Protein chip Herbisit uygulaması Spektrofotometrik teknikler

347 Spesifik bir gen nasıl belirlenir? 35S promotör, nos terminatör veya genin kendi dizileri kullanılarak PCR.

348

349 Real-Time PCR

350 Real-Time PCR da kullanılan problar TaqMan Problar

351 Moleküler beacon

352 Real-time PCR ile DNA çoğaltımının görüntülenmesi

353 Real-time PCR ile elde edilen sonuçların değerlendirilmesi

354 Membran üzerine spotlanmış cdna Deney dokusundan izole edilmiş radyoaktif işaretli mrna Kontrol dokudan izole edilmiş radyoaktif işaretli mrna İki farklı membran üzerindeki aynı klonların hibridizasyon seviyeleri arasındaki farkların ölçümü anlatımdaki farklılıkları verir

355 Gene Scan GMO Chiplerinde kullanılan bazı bitki ve genetik elementler Bitkilerden: Mısır, Kanola, Soya,Pirinç, CaMV GMO lardan : CaMV 35s-promotör, Bar geni, Nos terminatör, Bt- Xtra mısır, Bt 11 mısır, Bt176 mısır, Mon 810/809/802 mısır, Round up soya

356

357 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbant Assay)

358 Mikrotiter plate renk analizleri

359 Mikrotiter plate analiz sonuçlarının değerlendirilmesi

360 Lateral flow strip 5-10 dakika içerisinde pozitif/negatif cevap oluşturur. Örneklerin analizi ve hızlı olarak gerçekleştirilir.

361 Herbisit dirençliliği taşıyan soya fasulyesi ve mısır tohumlarının analizi

362 Roundup Ready herbisitine dayanıklı ve hassas mısır bitkileri

363 Biyoteknolojik Ürünlerin Dünya Pazarlarındaki Payları 12% 7% 3% 1% 77% Gıda Antibiyotik İlaç-kit Tarım Diğer

364 Bir GMO Analizinde 3 Soruya Yanıt aranır:1. GMO var mı? 2. Hangisi var? 3. Ne kadar var? Bu nedenlerle: Yöntemlerin geçerliliği Örnek toplama Sertifikasyonlu referans materyali çok önemlidir. Örnek homojenizasyonu

365

366 Negatif GMO tanısı GMO test Pozitif Örnek alma GMO tanısı Yasal olmayan hayır İzinli mi? evet GMO analizi. Etiket gerekmez 1% den az Etiket gerekir 1% den fazla

367 Hibrid mısır F1 F2 Hibrid mısır ilişkili olmayan iki türün melezlenmesi sonucu oluşan tohumlardan gelişen birinci generasyondur.

368 1. Silk scar 2. Tohum ceketi 3. Endosperm (Maternal F1 genom*) 4. Embriyo (F2 genom) a. koleoptil b. plumula c. skutellum d. radikula 5. Siyah absisyon zonu 6. Pedisel (*) Triploid doku iki dişi ve bir erkek nukleus kökenli.

369 Biyogüvenlik Bitki, hayvan ve mikroorganizmaların kullanımı ile oluşturulan biyoteknolojik ürünlerin çevre ve insan sağlığı üzerinde güvenli kullanımının sağlanmasıdır.

370 Biyoteknolojik çalışmalar sonucu oluşabilecek risk kaynakları; İnsan-hayvan sağlığı Biyolojik çeşitlilik ve doğal çevre Sosyo-ekonomik yapı

371 Biyogüvenlik önlemleri; Bilimin önünü kesmeden insan-hayvan sağlığı, biyolojik çeşitlilik ve sosyal yapı üzerinde oluşabilecek olumsuzlukları önceden belirleyerek önlem alma yolunda bazı idari sistemleri gerektirmektedir. Tüketici hakları ve güvenli tüketim için etiketleme sistemleri büyük önem taşır.

372 Ulusal Biyogüvenlik Sisteminin Amacı: Biyoteknolojik ürünlerin güvenli kullanımının sağlanması İnsan sağlığı ve çevre üzerindeki zararlı etkilerin indirgenmesi İnsanların sorumluluklarının arttırılması Sistemin kontrol altında tutulması Biyogüvenlik yönetmeliğinin sürekli incelenmesi

373 Ulusal Biyogüvenlik Sisteminin Elemanları 1. Biyogüvenlik sistemin kontrol eden bir kurul 2. GMO ların salımı ve kullanımı için Biyogüvenlik Yönetmeliği 3. Risk analizi 4. Sistemin iyileştirilmesi (bilimsel ve teknik)

374 Ulusal Biyogüvenlik Yönetmeliği Biyogüvenlik politikası ile ilgili doküman GMO ların oluşturulması GMO ların kullanımı Modern biyoteknoloji ve rdna çalışmaları Laboratuar ve sera denemeleri Transgenik bitkilerin tarla denemeleri Gıda güvenliğinin sağlanması Rekombinant aşı, farmasotik, fermantasyon özellikleri Transgenik hayvanlar İlgili bakanlıklar ve çalışma grupları Ürünün ticarileştirilmesi söz konusu mu? Ürünün iyileştirilmesi söz konusu mu?

375 Etkili Bir Biyogüvenlik Sistemi İçin; Eğitim Yeterli para fonu Her adımda inceleme Koordinasyon (Bakanlıklar,Üniversiteler, Araştırma Enstitüleri, Özel sektör ve Halk) ve ULUSLARARASI AĞLAR

376

377 Risk Analizi (transgenik ürünlerden doğabilecek risklerin belirlenmesi) Risk değerlendirme; insan sağlığı ve biyolojik çeşitlilik üzerindeki etkiler Risk yönetimi; risklerin oluşma olasılığının ortadan kaldırılması, gerçekleşmesi halinde alınacak önlemler Risk iletişimi; riskler ile ilgili önlemlerin tüm birimlere duyurularak risk bilgi akışının sağlanması

378 Risk Analizi: 1. Potansiyel etkilerin belirlenmesi (aktarılan genetik materyalin özellikleri) 2. Olasılıkların değerlendirilmesi (etkilerin gerçekleşme olasılığının değerlendirilmesi; konukçunun özellikleri, uygulamanın niteliği, uygulama yapılacak çevrenin mevcut durumu) 3. Belirlenen risklerin değerlendirilmesi (sonuçlar, uygulamanın yapılacağı çevre koşulları) 4. Bu risklerin yönetimi için stratejilerin geliştirilmesi (potansiyel risklerin gerçekleşmesi durumunda firmanın ve hükümetin alması gereken önlemler) 5. Çevre üzerindeki etkinin değerlendirilmesi (önerilen risk yönetimlerinin ve mevcut durumun değerlendirilmesi)

379 Risk Analizinde Üzerinde Durulan Noktalar: Genin alındığı organizma Aktarılan gen Genetik olarak değiştirilmiş organizmanın özellikleri Konukçu organizma Konukçu organizmanın şu andaki doğal durumu Uygulamanın niteliği (alan denemeleri, satış...) Organizmanın kullanılacağı çevrenin özellikleri

380 Risk Analizinde Göz Önünde Bulundurulması Gereken Etkiler: Toksik ve allerjik etkiler Antibiyotik direnç geninin etkileri Yeni hastalıklar ve viruslar yaratma potansiyeli Hedef organizmalardaki etkileri Hedef olmayan organizmalardaki etkileri Yabancı ot olma potansiyeli Doğrudan ve dolaylı geçişi gen geçişi ve etkileri Tarım alanındaki etkileri

381 GMO Analizler: - Moleküler - Genotip - Fenotip - İçerik Normal GMO ve kontrol grup farklılık analizleri Insersiyon Ekspresyon Gen transferi Metabolitler Gıda maddeleri Anlatım yapan proteinler Degradasyon Toksisite Alerjik etki Toksisite Toksisite Ürünün beslenmedeki rolü Ürünün içeriği

382 GMO mrna izolasyonu Kontrol cdna nın mikroarray ile hibridizasyonu Floresan cdna sentezi Farklılığın belirlenmesi

383 GMO Kontrol Protein izolasyonu İki boyutlu jel elektroforezi Jel boyama ve farklılıkların gözlenmesi

384 GMO Metabolit izolasyonu Kontrol Sıvı kromatografi (LC) ve fraksiyon toplama Fraksiyonların Nuklear Manyetik Rezonans (NMR) spektrofotmetri ölçümleri GMO ve kontrol örneklere ait spektrofotometrik ölçümlerin karşılaştırılması

385 BM Biyolojik Çeşitlilik Sözleşmesi (29 Ocak 2000) (Cartagena Protokolü) 24 Mayıs 2000 de imzaya açılmış Eylül 2000 de ; Türkiye, AB (75 ülke imzası) İnsan sağlığı üzerindeki risklerin göz önünde bulundurulmas Sınır ötesi hareketlerde biyolojik çeşitliliğin korunması GMO ların güvenli nakli ve kullanımı ******************************** GMO ların ülkelerarası transferi GMO ların çevreye salımı GMO ların kullanımı biyolojik çeşitliliğin korunması insan sağlığı üzerindeki etkileri

386 Avrupa Birliği 23 Nisan /220/EEC kodlu direktifi, GMO ların çevreye salımı 2001/18/EC geliştirilmiş direktif 90/290/EEC, çevre ve insan sağlığının GMO ların kapalı kullanımından kaynaklanabilecek risklere karşı korunması 97/258/EEC (27 Ocak 1997), GMO lardan üretilmiş veya GMO içeren gıdaların insan sağlığı için tehlike oluşturmamasını garanti altına almayı amaçlar

387 AB (26 Mayıs 1998) Konsey Düzenlemesi 1139/98/EC; Genetik olarak modifiye edilmiş ürünlerin etiketlenmesi. Ocak /2000; %1 eşiği uygulaması; Genetik modifikasyon sonucu, gıdaların DNA veya protein ile kaza sonucu kontaminasyonu, minimum eşik belirtimini gerekli kılmaktadır. 2002/66/EC GMO tanı ve kuantifikasyonu harmonisasyon ve standardizasyon. Aralık 2002 den itibaren ENGL (European Network of GMO Laboratories)(DG Joint Research Center- JRC) kuruldu(50 laboratuvar ve 2500 bilim insanı).

388 Ulusal Biyogüvenlik Yönetmeliği Mayıs 1998 de Tarım ve Köyişleri Bakanlığı nca Transgenik Bitkilerin Alan Denemeleri Hakkında Talimat hazırlanmıştır. Avrupa Topluluğu Konseyi nin 90/220/EEC sayılı yasasına dayanarak Genetik Yapısı Değiştirilmiş (GDO) ların Çevreye Bilinçli Salınımı ve Pazara Sürülmesi Hakkında Yönetmelik ve Bitki Çeşitlerinin Tescil Edilmesine İlişkin Yönetmelik le ilgili raporlar hazırlanmıştır.

389 Devlet Planlama Teşkilatı nın 8. beş yıllık kalkınma planında Biyoteknoloji ve Biyogüvenlik öncelikli konular olarak seçilmiş ve 8. uyum paketine göre; Genetik modifiye gıdalar konusunda AB mevzuatı ve uygulamaları, bu gıdaların yurt içi denetimi, numune alma teknikleri ve analiz metotları konularında 6 Sağlık Bakanlığı personeli için eğiticilerin eğitimi ve yurt dışı çalışma ziyareti ve 20 personelin yurt içinde eğitimi Genetik modifiye gıdalar konusunda AB mevzuatı ve uygulamaları, bu gıdaların ülkeye kabulü ve yurt içi denetimi, numune alma teknikleri ve analiz metotları konularında Tarım ve Köyişleri Bakanlığı na ait 14 personel için eğiticilerin eğitimi ve yurt dışı çalışma ziyareti, 30 personelin yurt içinde eğitimi kararları alınmıştır.

390 1.Bitki Biyogüvenlik Araştırmaları Uygulamalı Eğitim Programı I-IV, ISBN TÜBİTAK GMBAE,Gebze-Kocaeli. gov.tr 2.Training Course on The Analysis of Food Samples for the Presence of Genetically Modified Organisms User Manual

391 İlginize teşekkür ederiz. Transgenik ürün ve gıdaların uzun süreli kumulatif etkilerinin ne olabileceği bilinmemektedir. Bu nedenle çok dikkatli kullanımları gerçekleşmelidir. Önemli web ve adresleri: data1.htm

392 HÜCRE KÜLTÜRLERİ ve SEKONDER METABOLİTLER

393 HÜCRE KÜLTÜRLERİNİN KURULMASI Kallus kültürlerini etkileyen pek çok faktör süspansiyon kültürlerini de etkiler. Dikotillerin süspansiyon kültürlerini kurmak monokotillerinkini kurmaktan daha kolaydır. Kallus Süspansiyon kültürü Öncelikle in vitro kallus kültürlerinin kurulması gerekir. Bunun için üç farklı yol izlenebilir:

394 Friable/gevşek Friable kallus kullanımı (en sık kullanılan yöntem): Tekrarlı alt kültürleme ve filtrasyon sonucu, süspansiyon kültürü tek hücre ve küçük hücre kümelerine ayrılır. Uygun friable kallus elde etmek için, besiyerindeki oksin:sitokinin dengesi oksin artırılarak değiştirilir. Friable olmayan kallus kullanımı: Kalluslardan hücre kültürü kurulur. Kalluslar istenen hali alana kadar alt kültürlenir. Enzim kullanımı: Kallus, düşük konsantrasyonda hücre duvarı parçalayan enzimler (selülaz ve pektinaz) eklenmiş besiyerinde süspansiyon oluşuncaya kadar kültürlenir.

395 Küçük, yuvarlak ve canlı hücrelerden oluşan, üreme fazındaki tipik bir agregat Uzun hücre Aktif olarak bölünen hücreler Hücre Tipleri Dev uzun hücre (G), Hücre süspansiyon kültürleri için tipik normal boyuttaki uzun hücreler ve yuvarlak hücreler Dev (G) hücre

396 Bitki hücrelerinin özellikleri Büyüklük (10-100mM) Agregat oluştururlar Yırtılmaya hassas Yavaş büyürler Kolay kontamine olurlar Az oksijen gereksinimleri vardır Anaerobik koşullara toleranslı değiller Büyümeleri iyi (>300g/l taze ağırlık). Viskoz solüsyonlar oluştururlar

397 Tipik hücre kültürünün üreme grafiği X = kültür için uygun altkültürleme zamanı

398 Hücre Büyümesi ve Büyümenin İzlenmesi için Kullanılan Farklı Yöntemler

399 Bioreactor Shaker (Çalkalayıcı) Kontrollü chamber Farklı tipte çalkalayıcılar Çalkalayıcılar için cam kaplar Çalkalayıcılar için cam kaplar Çalkalayıcılar için cam kaplar Çalkalayıcılar için cam kaplar Dönen çalkalayıcı

400

401 Hücre Kültürlerinin Kullanımı

402 Hücre süspansiyon kültürleri büyüme ve farklılaşmayı etkileyen koşulların araştırılması için idealdir. Somatik embriyo üretiminde kullanılabilirler.

403 En önemli uygulama alanı sekonder metabolit üretimidir. Süspansiyon kültüründe antosiyanin üretimi

404 Sekonder Metabolitler

405 Sekonder metabolitler bitkinin temel yaşamsal işlevleri ile doğrudan ilişkisi olmayan, buna karşılık en az bitkinin yaşamsal işlevleri ile doğrudan ilişkili primer metabolitler kadar önemli maddelerdir. Sekonder metabolitler bitkilerin, çevresel koşullara uyum sağlama, savunma, korunma, hayatta kalma, neslini sürdürme ve ekosistemle ilişkilerini düzenlemelerinde yardımcı olurlar.

406 Sekonder metabolitleri doku kültürü ile üretmek avantajlıdır!!! Doğadan Toplama Az miktarlarda ve belli gelişim evrelerinde üretilirler, Bazı türlerin zamanla soylarının tükenmesi tehlikesi vardır, Bazı bitkilerin toplanması çok güçtür ve maliyeti yüksektir, Doku Kültürü İstenilen zamanda, istenilen kadar üretim Türlerin kaybolma tehlikesi yok Standart kalitede ve bol miktarda üretim İstenildiği kadar bitkinin elde edilme kolaylığı

407 İlaç Hammaddelerinin Üretimi

408 Batı dünyasında kullanılan reçeteli ilaçları yaklaşık %25 i bitkisel kaynaklıdır. Bu bitkileri klasik yöntemlerle üretimi hücre kültürlerine göre daha pahalıya mal olur. Ancak dezavantaj olarak, bazen sekonder metabolitler hücre kültürlerinde üretilmez yada çok az üretilirler. Hücre veya organ kültürlerinde üretilen ilaç hammaddeleri arasında: diosgenin, kodein, morfin, atropin, hiyosiyamin, skopolamin, digoksin, digitoksin, kuinin, reserpin, artemisinin and taxol.

409 Farklılaşma

410 Pek çok kallus ve süspansiyon kültüründe hücreler ana bitkide olan sekonder metabolitleri üretmezler. Farklılaşma başladığında yani gövde/kök gelişimi veya somatik embriyogenezis, farklılaşmış dokular ana bitkideki aynı sekonder metabolitleri üretmeye başlar.

411

412 Bazı hücre kültürlerinde sekonder metabolitlerin üretilmemesinin nedeni: Belirli öncüllerin primer metabolizmaya yönlenmesi, Kilit enzimlerin baskılanması yada azalması, Uygun depo organlarının bulunmamasıdır.

413 Pigment Üretimi

414 Bazı hücre kültürleri bol miktarda pigment biriktirir. Örn, Lithospermum erythrorhizon, kırmızı pigmenti (shikonin), kozmetikte kullanılır. Diğer hücre kültürleri, kırmızı veya mavi flavonoidler olan antosiyaninleri üretir.

415 Elisitasyon

416 Bitkilerin mikroorganizmalarla enfekte olması sonucu fitoaleksin adlı sekonder metabolitler sentezlenir. Bu maddelerin antimikrobiyal etkileri vardır. Patojen tarafından salınan maddeler veya patojenin hücre duvarı parçaları da aynı cevabın oluşmasını sağlar. Bu maddeler elisitör olarak adlandırılır. Elisitor Elisitör tanınması Enzim sentezi Fitoaleksin sentezi Patojen kaynaklı maddelere ilave olarak çeşitli stres koşulları da bu maddelerin salınımını sağlar. Bu stres koşulları arasında; UV-radiation, soğuk, sıcak, etilen, fungisid, antibiyotik, ağır metal tuzları ve yüksek tuz konsantrasyonları gelir.

417 Biyodönüşüm

418 Ucuz öncül maddelerin hücre kültürüne uygulanmasıyla sekonder metabolit içeriği artırılabilir. Bazen hücreler öncülleri ana bitkide bulunmayan yeni maddelere çevirir. Başka bir olasılık da hücre kültürüne yabancı bir maddenin eklenmesi ve yeni bir maddenin oluşturulmasıdır. Bu şekilde hücre kültürleri kullanılarak test tüplerinde yapılması çok zor olan kimyasal reaksiyonlar bitkilerin kendi enzimlerini kullanmalarıyla gerçekleştirilebilir.

419 Hücre kültürlerinde biyodönüşüme örnek: Podophyllum hexandrum süspansiyon kültürüne Coniferin verilince, podophyllotoxin üretir. Podophyllotoxin anti-kanser amaçlı kullanılır.

420 İnce çeperli parankima hücrelerinin kitlesel yapısı Kallus

421 Kallus oluşumu Köklerde ve gövdede yaralı bölgede kallus oluşur.. Kallus oluşumu: Erythrina ağacı

422 Yapraktan kallus oluşumu Vaskular dokudan kallus oluşumu Kökten kallus oluşumu Embiryodan kallus oluşumu

423 1. İndüksiyon 2. Hücre Bölünmesi 3. Farklılaşma

424 Friable Sert Yapışkan Rhizogenik Kırmızı Beyaz Yeşil Sarı

425 Kallus Dedifferensiyasyon

426

427

428 Kallusta kendiliğinden değişimler oluşur. Epigenetik Genetik

429 Kallusları 3-6 haftada bir alt kültür yapmak gerekir.

430 Bitki Rejenerasyonu Organogenesis Somatik embriyogenesis Protoplast kültürü Haploid hücre kültürü Meristem kültürü (hastalıksız bitki üretimi)

431 ORGANOGENESİS Hücrelere ve dokulara baskı uygulayıp bazı değişikliklere sebep olarak sürgün veya kök taslağı diye adlandırılan tek kutuplu ve vasküler sistemi kökenini aldığı dokuya bağlı olan bir yapının meydana gelmesine yol açan işlemdir.

432 ORGANOGENESİS ÇEŞİTLERİ İndirekt organogenesis Direkt organogenesis Kallus Sürgün veya kök Sürgün veya kök Bitki Bitki

433 Organogenesis Avantajları; Hücre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tanıdığı için, generatif yoldan çoğaltılması zor olan bitkilerin üretimine kolaylıklar sağlamaktadır. Bitki transformasyon çalışmalarında oldukça önemlidir. Dezavantajları; Bütün bitki türleri için evrensel bir rejenerasyon protokolü yoktur. Her bitki türü, hatta her bitki çeşidi için spesifik bir sistemin optimize edilmesi edilmesi gerekir.

434 Pamukta rejenerasyon protokolü Apeks Node

435 Pamuk nod eksplantlarından kallus oluşumu ve rejenerasyon

436 Pamuk nod eksplantlarından direkt gövde rejenerasyonu

437 Pamukta kök rejenerasyonu

438 İn vitro da rejenere olam pamuk bitkisinin toprağa aktarımı

439 SOMATİK EMBRİYOGENESİS Bağımsız vasküler sistemi olan ve kök ile sürgün aksini içeren iki kutuplu bir yapının oluşmasına yol açan bir süreçtir. Vejetatif hücrelerden gelişen embriyolar da somatik embriyo olarak adlandırılır.

440 Dikotiledon bitkilerde somatik embriyoların gelişim dönemleri globular kalp torpedo kotiledon

441 SOMATİK VE ZİGOTİK EMBRİYOGENEZ Somatic Embryogenesis Callus or explant Globular Heart/Torpedo Plantlet Regeneration of whole plant Zygotic Embryogenesis Expansion Maturation Desiccation Germination and growth Zygote Globular Heart/Torpedo Cotyledonary Dormancy

442 Somatik embriyogenesis Bireysel bitkilerin hücrelerinden geliştikleri için somatik embriyolardan elde edilen bitkiler genetik olarak klon oluştururlar. Döllenmiş yumurtadan gelişen embriyoda olduğu gibi, iki çenekli bitkilerde somatik embriyolar da globular, kalp, torpedo ve kotiledon oluşum safhalarını geçirirler. Gövde-kök eksenine aynı zamanda sahip olup, asıl doku ile vaskular bağlantıları olmadığından dolayı dokudan kolaylıkla ayrılabilirler.

443 Somatik Embriyo Rejenerasyonu Direkt embriyogenesis Eksplant İndirekt embriyogenesis Eksplant Somatik embriyolar Kallus Pro-embriyolar Bitki Bipolar embriyolar Bitki

444 Somatik embriyogenesisin kullanım alanları Klonal çoğaltım Sentetik tohum üretimi Gen aktarımı

445 Paulownia elongata da indirekt somatik embriyogenesis

446 Pamuk somatik embirypogenez

447

448

449

450 In vitro rejenerasyonda etkin bitki rejenerasyonu için gerekli şartlar 1. Uygun eksplantın seçilmesi 2. Büyümede aktif maddeleri içeren uygun bir besin ortamının seçilmesi 3. Fiziksel çevre koşullarının kontrolü

451 Eksplant seçimi Doku kaynağı olarak kullanılan organ Organın ontogenetik ve fizyolojik yaşı Eksplantın bitkiden alındığı dönem Eksplantın büyüklüğü Eksplantın alındığı bitkinin diğer özellikleri

452 Besin ortamının temel içerikleri İnorganik maddeler Organik maddeler Bitki büyüme düzenleyicileri Doğal kompleksler

453 Kültür şartları Ortamın fiziksel hali Ortamın ph değeri Nem Işık Sıcaklık

454 Micropropagasyon bitkileri in vitro çoğaltma sanatı. Klon Tek bir bitkiden vegetatif olarak çoğalmış aynı genetik yapıdaki bitkiler.

455 Eksplant In vitro kültürü başlatmak için kullanılan hücre, doku veya organ. Aksiller gövde çoğaltılması Aksiiller tomurcuklara sitokinin uygulanması iledaha önce var olan meristemlerden gövde gelişmesi.

456 Gövde çoğaltılması Hally Jolivette kirazında

457 Mantar kontaminasyonu rhododendron kültürü Rhododendron kültürleri

458 Amelanchier laevis toprağa ve tarlaya aktarım Mikropropagasyon Olumlu Yönleri Bir bitkiden binlercesinin kısa sürelerde üretimi Kontrollu lab koşullarında üretim Yıl boyunca üretim Hastalıksız bitki üretimi

459 Aletler min.fiatta Deneyim Ucuz Klasik Propagasyon Üstünlükleri Potensiyel hastalıksız bitki Büyüme kontrolu için aşı, kök sürgünü gibi yöntemler Micropropagasyon Olumsuz Yönleri Alet ve donanım gereksinimi Teknik deneyim Protokol geliştirilmesi Endüstriyel standartlara uyum Pahalı üretim olabilir

460 Elit varyetelerin hızlı üretimi Hastalıların eliminasyonu Mikropropagasyon Uygulamalar Morfoloji ve büyüme özelliklerinin incelenmesi Büyümenin hızlandırılması Gövde organogenez Yaprak, gövde ve çiçek üzerinde adventif meristem gelişimi

461 African menekşesinde yaprak kültürü

462 Begonia x chiemanta Emma mikroüretimin değişik evreleri Somatik Embryogenez Bipolar zigotik embiryoya benzer yapıların oluşması.

463 Ototrofi ve miksotrofi Doğal koşullarda bitkiler ototrofiktir ve çevresel CO 2 kullanırlar. Doku kültüründe karbon kaynağı besiyerindeki karbonhidratlardır ve boş alndaki CO 2 olabilir (miksotrofi). Serada yetiştirilenlere göre kültürdeki bitkilerde fotosentez oranı düşüktür.. Akilimitasyon sırasında fotosentezin evolüsyonu ve Şeker ve nişasta türevlerinin evolüsyonu gerekir. Tam ototrofi ekstra CO 2 ge reksinim gösterirs PAR (250 µmol.m -2.s -1 ) Besiyerinde şeker azaltılınca bitkiler ototrofiye doğru gelişim gösterirler.

464 d Stoma yapıları varians Aklimatizasyon tünelleri Max. Nem çok önemli

465 Büyüme odaları ayrı belmelerde aklimatizasyon Perlit, toprak, vermikülit, yosun vb. Maddeler ekim için kullanılır.

466 Otomasyon Nem: Çok ıslak olmamalı Sıcaklık CO 2 : Yüksek ısıdan kaçınılmalı Yüksek konsantrasyon (900 ppm) Işık Çok şiddetli olmamalı Fotoperyod Doğru seçilmeli Gübre İlk aşamada gerekmez Pestisidler Min. Düzeyde olmalı

467 Somatik Hibridizasyon Farklı genotiplerdeki protoplastların füsyonu.

468

469

470 Somaklonal varyasyon Doku kültüründe regenere olan bitkilerdeki genetik varyasyon.

471

472

473 Kimera Bitki üzerinde farklı iki genotipik yapının bulunması.

474 Çiçek durumu kültürü. Brakte aks il Pedikul Çiçek tomurcuğu

475 Kallus eldesi Süspansiyon kültürü başlatılması Süspansiyon kültürü kurmak için genelde önce kallus kültürü kurulur. Friable kolay dağılan kalluslar en uygundur. Dağılmayan kallusla başlanırsa dağılan formların eldesine çalışılır. Bazen enzim de kullanılır. Düzenli alt kültürleme ile agregat birikimi engellenir.

476 Süspansiyon kültürü + Bitki hücrelerinim özellikleri Büyük (10-100µM) Agregat oluşturur Yırtılmaya hassas Yavaş büyür Kolay kontamine olur Az oksijen gereksisnimi var Anaerobik koşullara toleranslı değil Büyümesiiyi (>300g/l taze ağırlık). Viskoz solüsyonlar oluştururlar

477 Büyüme özellikleri 1Başlangıç fazı 2. Eksponansiyal faz (dt 1-30 d) 3. Besiyeri içeriğinin azalması 4. Durma fazı Dry weight (g/l) Plant Cell Suspension typical Growth curve time (d) 3 4 Bioreaktör Kontrollu kabin Çalkalayıcı Tekerlek

478 Hücre süspansiyonu kullanım alanları Metabolit üretimi Somatik embiryogenez Vb..

479 kadar bitki türünün kadarı yenilebilir 150 kadarı aktif tarımda kullanılır ancak 30 tanesi insan kalorilerinin %95ini oluşturur. Ana ürünler (tahıllar, yağ bitkileri, baklagil, Patates, meyve, sebze ve şeker bitkileri) Özel ürünler (Yöresel; meyve, sebze, baharat vb. Az kullanılan ürünler(bazı tahıllar ve yağ bitkileri vb.) İhmal edilen ürünler ( Panicum,bazı tuberler) Yeni ürünler (Kiwi, Taxus vb.) Transgenik ürünler

480

481

482

483

484 CIAT - Centro Internacional de Agricultura Tropical CIFOR - Center for International Forestry Research CIMMYT - Centro Internacional de Mejoramiento de Maiz y Trigo CIP - International Potato Center ICARDA - International Center for Agricultural Research in the Dry Areas ICRISAT - International Crops Research Institute for the Semi- Arid Tropics IFPRI - International Food Policy Research Institute IITA - International Institute of Tropical Agriculture ILRI - International Livestock Research Institute IPGRI - International Plant Genetic Resources Institute IRRI - International Rice Research Institute IWMI - International Water Management Institute WARDA - West Africa Rice Development Association World Agroforestry Cntre (ICRAF) WorldFish Center

485 Germplasm Korunması Mikropropagasyon yöntemleri 1) Yavaş büyütme (Isı, Işık, besiyeri vb.osmotik inhibitörler, büyüme gerileticiler, doku dehidratasyonu vb. 1-4 yıl saklanabilir.

486 Kryopreservasyon (Dondurup saklama) Çok düşük ısılar 196 o C Hücre metabolizması ve bölünme durur Çok uzun süreler saklama olur

487 Kryopreservasyon gereksinimleri Ön kültür (Hızlı büyüyen ve vakuolu küçük hücrelerin eldesi Kryoproteksiyon (Gliserol, PEG,DMSO vb.) Dondurma Yavaş dondurma Hızlı dondurma

488