BAZI FLAVONOĠD ve FENOLĠK BĠLEġĠKLERĠN ANTĠOKSĠDAN KAPASĠTELERĠNĠN BELĠRLENMESĠ ve ĠNSAN ERĠTROSĠTLERĠNDEN SAFLAġTIRILAN KARBONĠK ANHĠDRAZ I ve II

Transkript

1 BAZI FLAVONOĠD ve FENOLĠK BĠLEġĠKLERĠN ANTĠOKSĠDAN KAPASĠTELERĠNĠN BELĠRLENMESĠ ve ĠNSAN ERĠTROSĠTLERĠNDEN SAFLAġTIRILAN KARBONĠK ANHĠDRAZ I ve II ĠZOENZĠMLERĠ ÜZERĠNE İN VİTRO, RAT ERĠROSĠTLERĠ KARBONĠK ANHĠDRAZ ENZĠMĠ ÜZERĠNE İN VİVO ETKĠLERĠNĠN ARAġTIRILMASI Zübeyir HUYUT Doktora Tezi Kimya Anabilim Dalı Biyokimya Bilim Dalı Prof. Dr. ġükrü BEYDEMĠR 2014 Her hakkı saklıdır

2 ATATÜRK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ DOKTORA TEZĠ BAZI FLAVONOĠD ve FENOLĠK BĠLEġĠKLERĠN ANTĠOKSĠDAN KAPASĠTELERĠNĠN BELĠRLENMESĠ ve ĠNSAN ERĠTROSĠTLERĠNDEN SAFLAġTIRILAN KARBONĠK ANHĠDRAZ I VE II ĠZOENZĠMLERĠ ÜZERĠNE İN VİTRO, RAT ERĠTROSĠTLERĠ KARBONĠK ANHĠDRAZ ENZĠMĠ ÜZERĠNE İN VİVO ETKĠLERĠNĠN ARAġTIRILMASI Zübeyir HUYUT KĠMYA ANABĠLĠM DALI Biyokimya Bilim Dalı ERZURUM 2014 Her hakkı saklıdır

3 T.C. ATATÜRK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ TEZ ONAY FORMU BAZI FLAVONOĠD ve FENOLĠK BĠLEġĠKLERĠN ANTĠOKSĠDAN KAPASĠTELERĠNĠN BELĠRLENMESĠ ve ĠNSAN ERĠTROSĠTLERĠNDEN SAFLAġTIRILAN KARBONĠK ANHĠDRAZ I ve II ĠZOENZĠMLERĠ ÜZERĠNE İN VİTRO, RAT ERĠTROSĠTLERĠ KARBONĠK ANHĠDRAZ ENZĠMĠ ÜZERĠNE İN VİVO ETKĠLERĠNĠN ARAġTIRILMASI Prof. Dr. ġükrü BEYDEMĠR danıģmanlığında, Zübeyir HUYUT tarafından hazırlanan bu çalıģma 21/11/2014 tarihinde aģağıdaki jüri tarafından Kimya Anabilim Dalı-Biyokimya Bilim Dalı nda Doktora tezi olarak oybirliği/oy çokluğu ( / ) ile kabul edilmiģtir. BaĢkan : Prof. Dr. Ö. Ġrfan KÜFREVĠOĞLU İmza : Üye : Prof. Dr. ġükrü BEYDEMĠR İmza : Üye : Prof. Dr. Ġlhami Gülçin İmza : Üye : Prof. Dr. Orhan ERDOĞAN İmza : Üye : Prof. Dr. Sevgi KOLAYLI İmza : Yukarıdaki sonuç; Enstitü Yönetim Kurulu...../..../ tarih ve....../ nolu kararı ile onaylanmıģtır. Prof. Dr. Ġhsan EFEOĞLU Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve baģka kaynaklardan yapılan bildiriģlerin, çizelge, Ģekil ve fotoğrafların kaynak olarak kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

4 ÖZET Doktora Tezi BAZI FLAVONOĠD VE FENOLĠK BĠLEġĠKLERĠN ANTĠOKSĠDAN KAPASĠTELERĠNĠN BELĠRLENMESĠ ve ĠNSAN ERĠTROSĠTLERĠNDEN SAFLAġTIRILAN KARBONĠK ANHĠDRAZ I VE II ĠZOENZĠMLERĠ ÜZERĠNE İN VİTRO, RAT ERĠTROSĠTLERĠ KARBONĠK ANHĠDRAZ ENZĠMĠ ÜZERĠNE İN VİVO ETKĠLERĠNĠN ARAġTIRILMASI Zübeyir HUTUT Atatürk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Biyokimya Bilim Dalı DanıĢman: Prof. Dr. ġükrü BEYDEMĠR Bu çalıģmanın ilk bölümünde ticari olarak satın alınan bazı flavonoid ve fenolik yapıdaki bileģiklerden Malvin, Callistephin, Oenin, Pelargonin, AraĢidonoil dopamin, ID-8, Silikristin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit maddelerinin antioksidan kapasitelerini belirlemek amacıyla Fe 3+ -TPTZ metodu ile Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme, kuprik iyonlarını (Cu 2+ ) indirgeme, N-N'-Dimetil-fenilendiamin (DMPD) radikali giderme, 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil (DPPH) serbest radikali giderme, 2-2'-Azino-bis(3-etilbenztiyazolin-6-sülfonik asit) (ABTS) radikali giderme, O.- 2 radikali giderme, ferrozin ve bipiridil reaktifi ile ferröz iyonlarını (Fe 2+ ) Ģelatlama aktiviteleri ile birlikte ferrik tiyosiyanat metoduna göre total antioksidan aktivitesi çalıģıldı. Metal Ģelatlama, indirgeme ve radikal giderme aktivitelerinin tamamında pozitif kontrol olarak standart antioksidanlar olarak bilinen BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks kullanıldı. ÇalıĢmanın ikinci bölümünde çalıģılan maddelerin insan eritrositlerinden izole edilen hca I ve II izoenzimleri üzerine in vitro inhibisyon etkileri araģtırıldı. Bu amaçla önce Sepharose-4B-L-Trozin afinite kolon kromatografisi ile insan eritrositlerinden hca I ve II izoenzimleri saflaģtırıldı. Enzim saflığını kontrol etmek için SDS-PAGE yapıldı ve tek bant gözlendi. ÇalıĢma kapsamındaki bütün maddelerin hca I ve II izoenzimleri CO 2 -hidrataz ve esteraz aktiviteleri üzerine inhibisyon etkileri araģtırıldı. Elde edilen Aktivite (%)- Konsantrasyon grafiklerinden her bir maddenin ayrı ayrı IC 50 değerleri ile birlikte esteraz aktivitesi K i değerleri hesaplandı. Son olarak fenolik bileģikler olan AraĢidonoil dopamin, 3,4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi araģtırıldı ve elde edilen grafiklerden faydalanılarak yarılanma ömürleri (t 50 ) hesaplandı. Bu çalıģmada kullanılan bileģikler hca I ve II izoenzimlerini in vitro olarak 2, ile 1055,00 µm aralığında IC 50 değerleri ile inhibe etmiģtir. Ayrıca çalıģtığımız maddelerin birçoğu pozitif kontrol olarak kullandığımız BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks dan daha iyi antioksidan aktivite göstermiģtir. 2014, 222 sayfa Anahtar Kelimeler: Karbonik anhidraz, antioksidan aktivite, fenolik bileģik, flavonoid, indirgeme kuvveti, metal Ģelatlama aktivitesi, radikal giderme aktivitesi i

5 ABSTRACT PhD Thesis DETERMINATION OF ANTIOXIDANT CAPACITIES OF SOME FLAVONOIDS AND PHENOLIC COMPOUNDS and INVESTIGATION OF EFFECT IN VITRO ON HUMAN ERYTHROCYTES CARBONIC ANHYDRASE I and II ISOENZYMES, THEĠR IN VIVO ON RAT ERYTHROCYTES CARBONIC ANHYDRASE ENZYME Zübeyir HUYUT Atatürk University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Department of Biochemsitry Supervisor: Prof. Dr. ġükrü BEYDEMĠR In first part of study, the antioxidant activities of agents of Malvine, Callistephin, Oenin, Pelargonin, Arachidonoyl Dopamine, ID-8, Silychristine, 3,4-Dihydroxy-5-methoxybenzoic acid and 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyde from compounds flavonoid and phenolic structure were using by antioxidant assays including ferrous ions (Fe 3+ ) reducing capacity with Fe 3+ - TPTZ, Fe 3+ -Fe 2+ reducing capacity, cupric ions (Cu 2+ ) reduction capacity, N-N'-Dimethylphenylenediamine (DMPD) radical scavenging, 1,1-diphenyl 2-picryl hydrazyl (DPPH ) radical scavenging, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging, O - 2 radical scavenging, ferrous ions (Fe 2+ ) chelating activities using by ferrozine and bipyridyl reagents and lastly total antioxidant activity by ferric thiocyanate method. Ġn all studies of metal chelating, reduction and radical scavenging activities as a positive control was used BHA, BHT, α-tocopherol and Trolox that are known as standard antioxidants. The obtained results were compared with standard antioxidants. In second part of this study, studied substances were investigated in vitro inhibitory effects on hca I and II isozymes isolated from human erythrocytes. For that purpose, the first was purified hca I and II isoenzymes from human erythrocytes by using L-tyrosine-Sepharose-4B affinity column chromatography. To check the purity of the enzyme was performed SDS-PAGE and only one band was observed. The effects on CO 2 -hydratase and esterase activities of hca I and II isozymes were investigated we tried in all the materials. Separately of each agent were calculated values of IC 50 with levels of esterase activity K i by using the obtained Activity (%) - Concentration graphics. Finally we use in this study and from sunbstances observing the in vitro inhibitory effect on hca I and II isoenzymes activities were investigated of inhibitory effects on CO 2 -hydratase activity of rat erythrocytes total CA enzyme of Arachidonoyl Dopamine, 3,4-Dihydroxy-5-Methoxybenzoic Acid and 2,4,6-Trihydroxybenzaldehyde and benefiting from obtained graphics were calculated their in vivo half-lives (t 50 ). The phenolic compounds, which used in this study inhibited hca I and CA II isoenzymes at the range of 2, ,00 µm as in vitro. Also, most of these compounds demostrated antioxidant activity more than that used positive controls such as BHA, BHT, α- Tokoferol and Trolox. 2014, 222 pages Keywords: Carbonic anhydrase, antioxidan activity, phenolic compounds, flavonoids, reducing force, radical scavenging activity ii

6 TEġEKKÜR Doktora tezim olarak sunduğum bu çalıģmanın deneysel kısımları Atatürk Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Biyokimya AraĢtırma Laboratuarı ile Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilimdalı AraĢtırma Laboratuarlarında gerçekleģtirilmiģtir. Öncelikle çalıģmalarımın her safhasında bana her türlü yardım ve desteğini esirgemeyen bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım danıģman hocam Sayın Prof. Dr. ġükrü BEYDEMĠR e, Ayrıca çalıģmam süresince birçok konuda bana yol göstererek fikir alıģveriģinde bulunduğum Kimya Bölümü Biyokimya Anabilimdalı öğretim üyelerinden kıymetli eniģtem Sayın Prof. Dr. Ġlhami GÜLÇĠN e, ÇalıĢmamın bütün safhalarında fakültemizin ve bölümümüzün tüm imkanlarını kullanmama yardımcı olan dekanımız Sayın Prof. Dr. Yavuz ONGANER e, Kimya Bölümü baģkanımız Sayın Prof. Dr. Abdullah MENZEK e, Kimya Bölümü Biyokimya Anabilimdalı BaĢkanımız Sayın Prof. Dr. Ömer Ġrfan KÜFREVĠOĞLU na, öğretim üyelerinden Sayın Prof. Dr. Hasan ÖZDEMĠR e, YYÜ Tıp Fakültesi Biyokimya AraĢtırma Laboratuar imkanlarını kullanmama yardımcı olan YYÜ Tıbbi Biyokimya A.D. BaĢkanı ve yüksek lisans tez danıģmanım olan Sayın Prof. Dr. M. Ramazan ġekeroğlun na ve anabilim dalındaki diğer öğretim üyesi hocalarıma, ÇalıĢmalarım esnasında bana yardımıcı olan Sayın Yrd. Doç. Dr. Meryem TOPAL ve Öğrt. Gör. Dr. Fevzi TOPAL baģta olmak üzere Kimya Anabilimdalı Biyokimya AraĢtırma Laboratuarı nda çalıģan tüm arkadaģlarıma, Ayrıca beni yetiģtiren ve bugünlere gelmemde her türlü maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen anneme, babama, kardeģlerime ve çalıģmalarım esnasında benim her türlü sıkıntılarıma katlanan çok değerli eģime ve kızım Hümeyra ya teģekkürü bir borç bilirim. Zübeyir HUYUT Kasım, 2014 iii

7 ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEġEKKÜR... iii SĠMGELER ve KISALTMALAR DĠZĠNĠ... ix ġekġller DĠZĠNĠ... xi ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ... xvi 1. GĠRĠġ Serbest Radikaller ve Oksidatif Stres Bazı reaktif oksijen türleri ve özellikleri Serbest radikal kaynakları Serbset radikallerin hücresel yapılara etkileri Serbest radikallerin immün sistem disfonksiyonu üzerine etkisi ROS nin bazı hücre içi sinyal yolakları üzerine etkileri Oksidatif stres ve hastalık ĠliĢkisi Antioksidan Savunma Sistemleri ve Antioksidanlar Sentetik antioksidanlar Doğal kaynaklı antioksidanlar Fenolik asit ve flavonoid bileģikler Fenolik asit ve flavonoid bileģiklerin kullanım alanları ÇalıĢmada kullanılan fenolik ve flavonoid bileģikler Antioksidan Kapasite Belirleme Yöntemleri Enzimler Enzim aktivitesine etki eden faktörler Enzim inhibisyonu Karbonik Anhidraz Karbonik anhidraz enzimlerinin hücresel yerleģimleri Karbonik anhidraz enziminin fizyolojik fonksiyonları ve etki mekanizmaları Karbonik anhidraz enziminin inhibisyonu mekanizmaları Karbonik anhidraz inhibitörleri iv

8 Karbonik anhidraz enzimi ve hastalık iliģkisi ÇalıĢmanın Amacı KAYNAK ÖZETLERĠ MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Kullanılan alet ve cihazlar Kullanılan kimyasal maddeler Kullanılan çözeltiler ve hazırlanıģı ÇalıĢmada Kullanılan BileĢikler Ġçin Antioksidan Kapasite Tayinleri Fe 3+ -Fe 2+ Ġndirgeme kuvveti tayini FRAP reaktifi ile Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesi (FRAP Metodu) tayini Cu 2+ -Cu + indirgeme kuvveti (CUPRAC Metodu) tayini Süperoksit anyon radikali (O.- 2 ) giderme aktivitesi tayini ,1-Difenil 2-pikril hidrazil (DPPH) serbest radikal giderme aktivitesi tayini ,2-Azino-bis (3-etil benzo-tiyazolin-6-sülfonikasit) (ABTS) radikali giderme aktivitesi tayini N-N'-Dimetil-p-fenilendiamin dihidroklorür (DMPD) radikali giderme aktivitesi tayini Ferröz iyonları (Fe 2+ ) Ģelatlama aktivitesi tayini Bipiridil metal Ģelatlama aktivitesi tayini Total antioksidan aktivite tayini Ġnsan Kanı Temini ve Hemolizatının Hazırlanması Deney Hayvanları (Rat) Temini, Ġnhibitör Uygulama ve Numune Alma ĠĢlemleri Hemoglobin Tayini İn vivo çalıģma sonuçlarının istatistiksel değerlendirmesi Karbonik Anhidraz Enziminin Afinite Kromatografisiyle SaflaĢtırılmasına Yönelik ÇalıĢmalar Protein Tayin Yöntemleri Kalitatif protein tayini Kantitatif protein tayini v

9 3.9. SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Enzim Saflığının Kontrolü Karbonik Anhidraz Aktivitesi Tayinleri Hidrataz aktivitesi tayini Esteraz aktivitesi tayini p-nitrofenilasetat substratı için K m ve V max değerlerinin bulunması Ġnsan Eritrositlerinden Ġzole Edilen CA I ve II Ġzoenzimlerinin Aktiviteleri Üzerine Bazı Fenolik ve Flavonoid Yapıda Moleküllerin Etkilerinin Belirlenmesi Ġnhibisyon etki gösteren fenolik asit ve flavonoid bileģiklerin IC 50 değerlerinin belirlenmesi ARAġTIRMA BULGULARI Anioksidan Kapasite Tayini Sonuçları Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesi bulguları Cu 2+ -Cu + indirgeme kuvveti (CUPRAC Metodu) bulguları FRAP reaktifi ile ferrik iyonları (Fe 3+ ) indirgeme kuvveti (FRAP) bulguları Süperoksit anyon radikali (O.- 2 ) giderme aktivitesi bulguları DPPH serbest radikali giderme aktivitesi bulguları ABTS serbest radikali giderme aktivitesi bulguları DMPD radikali giderme aktivitesi bulguları Ferröz iyonları (Fe 2+) Ģelatlama aktivitesi bulguları Bipiridil metal Ģelatlama aktivitesi bulguları Total antioksidan kapasite tayini bulguları Karbonik Anhidraz Enzimi SaflaĢtırma ve Kantitatif Tayin Bulguları hca I ve II izoenzimleri için elde edilen saflaģtırma sonuçları Kantitatif protein tayini için kullanılan standart grafik SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile enzim saflığının kontrolü Karbonik Anhidraz Ġzoenzimlerinin (hca I ve II) Esteraz Aktivitesi Üzerine Ġnhibitör Maddelerin Etkilerinin Belirlenmesine Yönelik Yapılan ÇalıĢma Sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Malvin in ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları vi

10 hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Malvin in IC 50 değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Pelargonin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Pelargonin in IC 50 değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Silikristin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Silikristin in IC 50 değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine ID-8 ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren ID-8 in IC 50 değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine AraĢidonoil Dopamin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren AraĢidonoil dopamin in IC 50 ve K i değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Callistephin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Callistephin in IC 50 ve K i değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Oenin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Oenin in IC 50 ve K i değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit in IC 50 ve K i değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine 3,4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları vii

11 hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit in IC 50 ve K i değerleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine çalıģtığımız maddelerden inhibisyon etki gösterenlerin inhibisyon türleri ve IC 50 ile K i değerlerinin toplu gösterimi Ġnhibitör olarak kullanılan maddelerin hca I izoenzimi CO 2 -Hidrataz aktivitesi üzerine etkisi ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları Ġnhibitör olarak kullanılan maddelerin hca II izoenzimi CO 2 -Hidrataz aktivitesi üzerine etkisi ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II Ġzoenzimleri CO 2 -Hidrataz aktivitesi üzerine çalıģtığımız maddelerden inhibisyon etki gösterenlerin r 2 ve IC 50 değerlerinin toplu gösterimi AraĢidonoil dopamin, 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit ve 3,4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit in rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -Hidrataz aktivitesi üzerine elde edilen inhibisyon sonuçları TARTIġMA ve SONUÇ KAYNAKLAR EKLER EK EK EK EK ÖZGEÇMĠġ viii

12 SĠMGELER ve KISALTMALAR DĠZĠNĠ AD PD HD ALP RBC ROS RSI RNI NFT PHF ERK ID-8 LTP EÜ IU E.C. hca I hca II I IC 50 K i K m V V max AAZ BRZ MZA EZA DZA Addison hastalığı Parkinson hastalığı Huntinghon hastalığı Amitropik lateral skleroz Kırmızı kan hücreleri (eritrositler) Reaktif oksijen türleri Reaktif oksijen ara ürünleri Reaktif azot ara ürünleri Ġntrasellüler nörofibriler yumaklar Çift helezon lifleri Ekstrasellüler sinyal düzenleyici kinazlar 1-(4-Metoksifenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol Uzun süreli potasiasyon Enzim Ünitesi Uluslararası enzim ünitesi Enzim kod numarası Ġnsan karbonik anhidraz I izoenzimi Ġnsan karbonik anhidraz II izoenzimi Ġnhibitör Enzim aktivitesini yarıya düģüren inhibitör konsantrasyonu Enzim-inhibitör kompleksinin ayrıģma sabiti Maksimum hızı yarıya düģüren substrat konsantrasyonu Enzimatik reaksiyon hızı Maksimum hız Asetazolamid Brinzolamid Metazolamid Etoksozolamid Dorzolamid ix

13 DCP O 2 -. ABTS ABTS + BHA BHT DPPH DPPH DPPH-H DMPD DMPD + DTNB TEMED LOO LOOH MDA NBT PAGE PER SDS TCA Tris Troloks EDTA BSA Diklorofenamid Süperoksit anyon radikali 2,2 -Azino-bis(3-etilbenztiyazolin-6-sülfonik asit) 2,2 -Azino-bis(3-etilbenztiyazolin-6-sülfonik asit) radikali BütillenmiĢ hidroksianisol BütillenmiĢ hidroksitoluen 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil radikali ĠndirgenmiĢ 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil N,N'-Dimetil-fenilendiamin N,N-Dimetil-fenilendiamin radikali 5,5 -Ditiyo-bis (2-Nitrobenzoik Asit) N,N,N',N -Tetrametilendiamin Lipit peroksit radikali Lipit hidroperoksit Malondialdehit Nitroblue tetrazolium Poliakrilamid jel elektroforezi Amonyum persülfat Sodyum dodesil sülfat Triklorasetik asit Trihidroksimetil amino metan 6-Hidroksi-2,5,7,8-tetramethilkroman-2-karboksilik asit Etilendiamin tetra asetik asit Sığır serum albumin x

14 ġekġller DĠZĠNĠ ġekil 1.1. Singlet oksijen oluģumu yolları... 3 ġekil 1.2. Serbest radikal ve reaktiflerin oluģumu... 9 ġekil 1.3. Lipid peroksidasyonunun kimyasal yolu ve malondialdehit oluģumu ġekil 1.4. Oksidatis stres sonucu meydana gelen hücresel hasarın oluģum mekanizması ġekil 1.5. Oksidatif metabolizma esnasında veya sonucunda oluģan bazı hasarlı DNA lar ġekil 1.6. ÇeĢitli dıģ faktörler ile fagositik hücrelerin aktivasyonu sonucu oluģan ROS ve etkileri ġekil 1.7. Oksidatif stres sonucu oluģan ROS nin hafıza ve öğrenme üzerinde etkili olan LTP sentezi üzerine etkileri ġekil 1.8. ROS nin nörodejeneratif hastalıkların altında yatan katlanmıģ ve agrege olmuģ proteinlerle iliģkisinin Ģematik gösteriliģi ġekil 1.9. ROS nin sebep olduğu bazı hastalılar ġekil En popüler sentetik antioksidanların molekül yapıları ġekil Askorbik Asit in deprotonizasyonu ve enolat oluģumu ġekil Askorbik Asit in dehidroaskorbata dönüģüm mekanizması ġekil Tokoferol ve tokotrienollerin sınıflandırılması ġekil α-tokoferolün radikal giderme mekanizması ġekil Bazı karotenoidlerin kimyasal yapıları ġekil Fenolik asit sınıflarından olan Benzoik ve Sinamik Asit türevleri ġekil Flavonoidler için önerilen metal bağlama alanı ġekil Kuersetin in DPPH radikalleri ile muhtemel reaksiyon mekanizması ġekil Peroksil radikalleri (ROO. ) ile Katekolün reaksiyon mekanizması ġekil Fenolik bileģiklerin biyosentezi ġekil Fenol radikalinin rezonans yapıları ġekil ÇalıĢmada kullanılan moleküllerin açık yapıları ġekil Anahtar kilit modeli (Fischer modeli) ġekil YarıĢmalı inhibitör varlığında hız ve substrat iliģkisi garafiği xi

15 ġekil YarıĢmasız inhibitör varlığında hız-substrat konsantrasyonu grafiği ġekil Ankompetitif inhibisyonda hız-substrat konsantrasyonu grafiği ġekil CA IX dimerik proteininin temsili gösterimi ġekil CA II izoenziminin ligand yapısındaki metal merkezinin Ģematik olarak gösteriliģi ġekil CA enzimlerinin katalitik bölgeleri ġekil CA enziminin inhibisyon mekanizmalarında rol alan aktif alanları ġekil Standart inhibitörler olan AAZ, MZA, EZA, DZA, DCP sülfonamidlerin molekül yapıları ġekil YeĢil ile temsil edilen iki inhibitör maddenin hca II aktif alanına bağlanma modeli ġekil Bazı sülfonamidlerin hca II izoenzimi aktif alanına bağlanma modeli ġekil CA enzimi üzerine inhibisyon etki gösteren bazı fenolik bileģiklerin molekül yapıları ġekil 3.1. CNBr Sepharose-4B-L-Trozin afinite jelinin hazırlanmasındaki reaksiyonlar ġekil 3.2. p-nitrofenilasetat ın p-nitrofenol e dönüģüm mekanizması ġekil 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin Fe 3+ iyonlarını indirgeme kuvvetlerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması ġekil µg/ml ye karģılık gelen Fe 3+ indirgeme aktivitesi için 700 nm deki absorbans değerlerinin karģılaģtırılması ġekil 4.3. Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin Cu 2+ iyonlarını indirgeme kuvvetlerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması ġekil µg/ml ye karģılık gelen Cu 2+ indirgeme aktivitesi için 700 nm deki absorbans değerlerinin karģılaģtırılması ġekil 4.5. Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) antioksidanların FRAP reaktifi ile Ferrik iyonlarını (Fe 3+ ) indirgeme aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması xii

16 ġekil 4.6. FRAP raektifi ile 30 µg/ml ye karģılık gelen ferrik iyonlarını (Fe 3+ ) indirgeme aktivitesi için 700 nm deki absorbans değerlerinin karģılaģtırılması ġekil 4.7. Farklı konsantrasyonlardaki (10-20 µg/ml) maddelerin süperoksit ayon radikali giderme kuvvetinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması ġekil 4.8. ÇalıĢılan antioksidanların 20 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen süperoksit anyon radikali (O.- 2 ) giderme aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması ġekil 4.9. DPPH serbest radikal giderme aktivitesi için hazırlanan standart DPPH grafiği ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin DPPH serbest radikali giderme aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması ġekil ÇalıĢılan antioksidanların 20 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen DPPH radikali giderme aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması ġekil ABTS serbest radikal giderme aktivitesi için hazırlanan standart ABTS radikali grafiği ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin ABTS serbest radikali giderme aktivitesinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması ġekil ÇalıĢılan antioksidanların 10 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen ABTS radikali giderme aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması ġekil DMPD serbest radikal giderme aktivitesi için hazırlanan standart grafik..123 ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin DMPD serbest radikali giderme aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması ġekil ÇalıĢılan maddelerin 10 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen DMPD radikali giderme aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin ferröz iyonları metal Ģelatlama aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması xiii

17 ġekil ÇalıĢılan antioksidanların 10 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen ferröz iyonları metal Ģelatlama aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin bipiridil reaktifi kullanılarak yapılan metal Ģelatlama aktivitesinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması ġekil ÇalıĢılan antioksidanların 10 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen bipiridil metal Ģelatlama aktiviteleri (%) değerlerinin karģılaģtırılması ġekil µg/ml konsantrasyonda ilave edilen antioksidanların geçen süreye bağlı olarak total antioksidan kapasite kuvvetlerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması ġekil µg/ml konsantrasyonda kullanılan maddelerin 36. saatteki lipid peroksidasyon inhibisyonu yüzdelerinin karģılaģtırılması ġekil Sepharose-4B-L-Trozin afinite kromatografisi kullanılarak saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin elüsyon grafiği ġekil Bradford metodu ile proteinlerin kantitatif tayini için kullanılan BSA standart grafiği ġekil SDS-PAGE fotoğrafı ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Malvin inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Malvin] grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Pelargonin inhibitörünün 5 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite(%)] [Pelargonin] grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Sikristin inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Silikristin] grafikleri xiv

18 ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda ID-8 inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [ID-8] grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda AraĢidonoil dopamin inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [AraĢidonoil dopamin] grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzre 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen AraĢidonoil dopamin Lineweaver Burk grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Callistephin inhibitörünün 5 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Callistephin] grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzre 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen Callistephin e ait Lineweaver Burk grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Oenin inhibitörünün 5 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Oenin] grafikleri ġekil hca I izoenzimi esteraz aktivitesi üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzere 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen Oenin ait Lineweaver Burk grafiği ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit inhibitörünün 5 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [2,4,6Trihidroksibenzaldehit] grafikleri xv

19 ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzere 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit Lineweaver Burk grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine doygun substrat konsantrasyonunda 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit] grafikleri ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzere 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit Lineweaver Burk grafikleri ġekil hca I izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyounda Silikristin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, ID-8 ve Malvin inhibitörlerinin 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen Aktivite (%) [Ġnhibitör] grafikleri ġekil hca I izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, Callistephin, Oenin ve AraĢidonoil dopamin inhibitörlerinin 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen Aktivite (%) [Ġnhibitör] grafikleri ġekil hca II izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda AraĢidonoil dopamin ve 3,4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit inhibitörlerinin 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen Aktivite (%) [Ġnhibitör] grafikleri ġekil hca II izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Malvin, Callitephin, 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, Silikristin, ID-8 ve Oenin inhibitörlerinin 4 farklı konsantrasyonu xvi

20 kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen Aktivite (%) [Ġnhibitör] grafikleri ġekil AraĢidonoil dopamin, 3,4-dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 - hidrataz aktivitesi üzerine 1 ve 4. saatte IU/gHb cinsinden ölçülen aktivite sonuçları ġekil AraĢidonoil dopamin ve 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit in rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine yarılanma ömrünün (t 50 ) hesaplanması için çizilen Aktivite (%)-Geçen süre grafiği ġekil ,4,6-Trihidroksibenzaldehit in rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine yarılanma ömrünün(t 50 ) hesaplanması için çizilen Aktivite (%)-Geçen süre grafiği ġekil 5.1. FRAP metoduna göre [Fe 3+ -(TPTZ) 2 ] 3+ - Fe 2+ -(TPTZ) 2 ] 2+ kompleksinin oluģum mekanizması ġekil 5.2. Antioksidan bir molekül tarafından meydana gelen CUPRAC reaksiyonu. 166 ġekil 5.3. Antioksidanlar (AH) tarafından DPPH radikali giderme mekanizması ġekil 5.4. Resveratrol ün DPPH radikal giderme mekanizması ġekil 5.5. Kurkumin ile DPPH radikalleri arasındaki reaksiyon için önerilen mekanizma ġekil 5.6. Ksantin-ksantin oksidaz sistemi ile süperoksit anyon radikallerinin dönüģümü ve nitroblue NBT 2+ nin formazan a indirgenmesi ġekil 5.7. NADH-PMS de süperoksit anyon radikallerinin dönüģümü ve Nitroblue NBT 2+ nin formazan a indirgenmesi ġekil 5.8. K 2 S 2 O 8 ile ABTS nin oksidasyonu ve ABTS radikallerinin oluģumu ġekil 5.9. DMPD radikallerinin oluģum mekanizması ġekil Ferrozin in kimyasal yapısı ġekil Kurkumin için önerilen ferröz (Fe 2+ ) iyonu Ģelatlama mekanizması ġekil Ferrozinden önce Resveratrol ve Rozmarinik Asit in ferröz iyonlarını Ģelatlama mekanizması ġekil hca II (sarı renkli kurdela Ģeklinde) ve hca IX (yeģil renkli kurdela Ģeklinde) in fullerenler ile oluģturduğu kompleksin yapısı xvii

21 ġekil Diüretik olarak kullanılan Klortialidon (A), Ġndapamid (B), Triklormetiazid (C) ve Furosemid (D) in hca II aktif alanına bağlandığı zaman meydana gelen X-ray kristal yapının karģılaģtırılması ġekil hca I ve II izoenzimlerinin aktif alanına yerleģen ve çeģitli 5,10- dihidroindenoindol türevlerinin bağlanma pozisyonları ġekil Trithiokarbomat ın hca II izoenzimi aktif alanında, bikarbonat-hca I kompleksine benzer Ģekilde metal iyonuna tetrahedral geometri Ģeklinde bağlanması modeli ġekil Sülfokumarinlerin hca enzimi inhibisyon mekanizması xviii

22 ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ Çizelge 1.1. BaĢlıca reaktif oksijen ürünlerinin yarılanma ömrü... 1 Çizelge 1.2. Reaktif oksijen ve azot türleri... 2 Çizelge 1.3. Endojen kaynaklı oksidatif stres oluģturucuları Çizelge 1.4. Oksidatif stres ile pozitif iliģkili ölümcül hastalıklar ve etyolojileri Çizelge 1.5. Farklı sınıflara ait prooksidantlar ve oksidatif stres geliģimindeki etki mekanizmaları Çizelge 1.6. Antioksidan savunma sistemleri Çizelge 1.7. Antioksidanların sınıflandırılması Çizelge 1.8. Yiyecekelerde yaygın olarak kullanılan sentetik ve doğal antioksidanların avantaj ve dezavantajları Çizelge 1.9. Fenolik bileģiklerin sınıflandırılması Çizelge Bazı flavon, flavonon, flavonol ve türevleri Çizelge Bazı antioksidan kapasite belirleme yöntemleri ve genel prensipleri Çizelge CA izoenzimlerinin hücresel yerleģimleri ve sülfonamidlere ilgisi Çizelge CA enziminin katalizlediği reaksiyonlar Çizelge Bazı maddelerin hca I ve II izoenzimleri üzerine inhibisyon sabiti değerlerinin karģılaģtırılması Çizelge Bazı fenolik bileģiklerin hca I ve II izoenzimleri üzerine inhibisyon K i değerleri ve inhibisyon çeģitleri Çizelge ml lik küvetler kullanılarak yapılan esteraz aktivitesi prosedürü Çizelge ml lik küvetler kullanılarak yapılan esteraz aktivitesi prosedürü Çizelge µg/ml konsantrasyonunda kullanılan maddelerin ferrik (Fe 3+ ) ve kuprik (Cu 2+ ) iyonlarını indirgeme kuvvetinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması Çizelge 4.2. ÇalıĢtığımız maddelerin O.- 2, DPPH, DMPD ve ABTS radikali giderme aktiviteleri IC 50 (µg/ml) değerlerinin, pozitif kontrol olarak kullanılan standart antioksidanlardan BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile karģılaģtırılması xix

23 Çizelge 4.3. ÇalıĢılan maddelerin 10 µg/ml antioksidan ilavesine karģılık gelen ferröz iyonları (Fe 2+ ) ve bipiridil metal Ģelatlama aktiviteleri IC 50 (µg/ml) ve aktivite (%) değerlerinin pozitif kontrol olarak kullanılan standart antioksidanlardan BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile karģılaģtırılması Çizelge 4.4. Ġnsan eritrositlerinden elde edilen hca I ve II izoenzimlerinin saflaģtırma tablosu Çizelge 4.5. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Malvin için elde edilen r 2 ve IC 50 değerleri Çizelge 4.6. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Pelargonin için elde edilen r 2 ve IC 50 değerleri Çizelge 4.7. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Silikristin için elde edilen r 2 ve IC 50 değerleri Çizelge 4.8. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren ID-8 için elde edilen r 2 ve IC 50 değerleri Çizelge 4.9. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren AraĢidonoil dopamin için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Callistephin için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Oenin için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren maddelerin IC 50 ve K i değerleri ile inhibisyon türlerinin karģılaģtırılması Çizelge hca I izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren maddelerin IC 50 değerleri xx

24 Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren maddelerin r 2 ve IC 50 değerlerinin toplu olarak gösterimi Çizelge AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine elde edilen inhibisyon sonuçları Çizelge AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 - hidrataz aktivitesi üzerine elde edilen yüzde (%) inhibisyon sonuçları Çizelge AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine elde edilen yarılanma (t 50 ) ömürleri Çizelge saatte 20 µg/ml konsantrasyonda test çözeltisinde bulunan antioksidanların linoleik asit emülsiyonunun lipid peroksidasyonunu inhibe etme yüzdeleri ve absorbans değerlerinin karģılaģtırılması Çizelge 5.2. Test ortamına ilave edilen 20 µg/ml konsantrasyondaki maddelerin DPPH ve O -. 2 anyon radikali giderme yüzde (%) değerleri ve IC 50 (µg/ml) değerlerinin karģılaģtırılması Çizelge 5.3. Test ortamına ilave edilen 10 µg/ml konsantrasyondaki maddelerin ABTS ve DMPD radikali giderme yüzde (%) ve IC50 (µg/ml) değerlerinin karģılaģtırılması Çizelge 5.4. Bazı fenolik yapıdaki moleküllerin hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine elde edilen inhibisyon sabiti değerleri Çizelge 5.5. ÇalıĢmamızda kullandığımız flavonoid ve fenolik moleküllerin daha önce çalıģılmıģ moleküllerin hca I ve CA II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine elde edilen K i değerleri ile karģılaģtırılması Çizelge 5.6. hca I ve II izoenzimlerinin CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren maddelerin IC 50 değerlerinin daha önce yapılan çalıģmalarda kullanılan fenolik bileģikler ile karģılaģtırılması xxi

25 1 1. GĠRĠġ 1.1. Serbest Radikaller ve Oksidatif Stres Gezegenimizde yaģayan aerobik canlılar hayatlarını sürdürebilmeleri için oksijene ihtiyaç duyarlar. Oksijen ise metabolizmada canlılara zarar veren reaktif oksijen türlerinin oluģmasına sebep olur (Öztürk Sarikaya 2009). Reaktif oksijen türleri (ROS) bağıģıklık aracılı bazı hücre fonksiyonları ve solunum gibi oksijenin normal olarak kullanıldığı proseslerde sürekli oluģmaktadır. Reaktif oksijen türleri süperoksit anyon radikalleri( O 2.- ) ve hidroksil radikali (OH. ) gibi serbest radikaller ile hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve singlet oksijen ( 1 O 2 ) gibi serbest olmayan radikal türlerini içermektedir (Çetinkaya et al. 2012). Yüksek derecede reaktif olan bu serbest radikaller farklı moleküllerle kolayca reaksiyona girebilmekte, hücrelere ve canlıya zarar verebilmektedirler (Keha ve Küfrevioğlu 2005; Gülçin 2012). Bu reaktiflerden süperoksit, hidrojen peroksit ve hidroksil radikallerinin elektron alarak O 2 den oluģum reaksiyonları aģağıda verilmiģtir. e - e - e - e - O 2 O 2. H 2 O 2 OH. H 2 O Radikalin yarılanma ömrü ne kadar kısa ise reaktivitesi o oranda yüksektir. Bu da radikalin sabit konsantrasyonunu düģürür. Reaktif türlerine ve atomlara göre farklılık gösteren yarılanma ömrü radikallerin toksisitesi ile doğru orantılı olduğundan, radikalin potansiyel gücü açısından önemlidir (Thomas 1995). Çizelge 1.1. BaĢlıca reaktif oksijen ürünlerinin yarılanma ömrü (Thomas 1995). Radikal türleri Sembol Yarılanma ömrü(s -1 ) Süperoksid radikali O 2 ٠ 1*10-6 Hidroksil radikali OH ٠ 1*10-9 Alkoksil radikali RO ٠ 1*10-6 Peroksil radikali ROO ٠ 1*10-2 Singlet oksijen radikali 1 g 1 O 2 1*10-6

26 2 Serbest radikaller dıģ orbitallerinde bir veya daha fazla eģleģmemiģ elektron çifti ihtiva eden kısa ömürlü atomik veya moleküler yapıdaki reaktif oksijen veya azot türündeki maddelerdir (AkkuĢ 1995; Bursal 2009). Çizelge 1.2 de bazı reaktif azot ve oksijen türleri görülmektedir. Çizelge 1.2. Reaktif oksijen ve azot türleri (Aruoma and Cuppet 1997; Gülçin and Beydemir 2013). Reaktif Oksijen ve Azot Türleri Radikal Olanlar Molekül Formülü Nonradikaller Molekül Formülü Peroksi ROO ٠ Ozon O 3 Hidroksil OH ٠ Hipoklorik asit HOCl Alkoksi RO ٠ Hipobromik asit HOBr Hidroperoksi HO 2 ٠ Süperoksit O 2 ٠ Singlet oksijen 1 g 1 O 2 Hidrojen peroksit H 2 O 2 Nitrik Oksit NO ٠ Nitröz asit NO 2 Azot dioksit NO 2 ٠ Nitroksi anyonu Nitrozil katyonu NO + Dinitrojen trioksit N 2 O 3 Nitronyum katyonu NO 2 + NO Nitröz oksit NO 2 Lipid alkoksi LO. Peroksinitrit ONOO Tiyol radikali RS. Peroksinitröz asit ONOOH Lipid radikali L. Nitronyum katyonu NO 2 + Protein radikali P. Alkilperoksi nitritler ROONO Bazı reaktif oksijen türleri ve özellikleri Singlet oksijen ( 1 O 2 ): Singlet oksijen ( 1 O 2 ) moleküler oksijenin diamagnetik formu için yaygın Ģekilde kullanılmaktadır. Singlet oksijen normal triplet oksijenden daha kararsızdır. Singlet oksijenin ıģığa maruz kalan dokularda in vivo olarak sentezlendiği düģünüldüğü için farklı bir nonradikal reaktif oksijen türüdür. Yarılanma ömrünün etrafındaki matrikse bağlı olarak 10-6 s olduğu tahmin edilmektedir. Kimyasal olarak uyarım enerjisini transfer etmek suretiyle diğer moleküller ile etkileģebilir. Kimyasal reaksiyonları için tercihli hedefleri, çift katmanlı zarlardır. Çünkü singlet oksijen çoklu

27 3 doymamıģ yağ asitleri ve DNA daki guanin e etki ederek onların yapısını bozarlar (Gülçin 2012). Enzimler (COX, MPO, Sit-p450) Flavin nükleotidler, deri, retina, bilirubinin Spontan dismutasyon ıģık absorbsiyonu Ozon(O 3 ) 1 O 2 H 2 O 2 + HO 2 -. H 2 O 2 + HO 2 -. O O 2 -. OH + O 2 -. ġekil 1.1. Singlet oksijen oluģumu yolları Ozon (O 3 ): Kuvvetli oksitleyici bir ajan olan ozon üç oksijen atomunu içeren triatomik yapıda bir moleküldür. Dünyanın yüzeyine yakın olan ozon, istenmeyen bir oksidan olarak toksik bir hava kirleticisi olarak kabul edilir ve canlılarda in vivo olarak üretilmez. Ozon yüksek UV ıģını üreten lambalara sahip olan cihazların olduğu laboratuarlarda ve yerleģim merkezlerinde fotokimyasal reaksiyonlar ve hava kirliliğinin sonucu olarak oluģabilmektedir. Ozonun biyolojik etkisi direk olarak biyomolekülerin oksidasyonuna veya peroksidasyonuna sebep olarak ya da her ikisine birden katkıda bulunmasıyla meydana gelir. Bu etki bazen de serbest radikal mekanizmasını etkileme tarzında da olabilir (Ak 2006). Süperoksit anyon radikali: Süperoksit anyon radikalleri hücrelerde oksidazlar gibi bazı enzimlerin aktivitesi veya enerji metabolizmasında (glikoliz, yağ asitleri oksidasyonu, sitrik asit devri gibi) oksidasyon esnasında meydana gelebilirler. Moleküler oksijenin (O 2 ) mitokondrial elektron transport sisteminde bir elektron alması sonucu meydana gelen radikallerdir. Süperoksit dismutaz (SOD) adı verilen bir enzim vasıtasıyla inaktive edilirler (Bursal 2009).

28 4 Nitrik oksit radikali (NO. ): Nitrik oksit memelilerde önemli bir sinyal molekülü ve aynı zamanda serbest radikal çeģididir. Oksijen çok hızlı bir Ģekilde zehirli etkiye sahip olan azot dioksit meydana getirebilir. Kan damarlarında bulunan endotelyal hücreleri nonradikal ürünler sağlamak için nitrik oksit ile reaksiyona girebilen az miktarda süperoksit ürettiği bilinmektedir. Nitrik oksit ve süperoksit üretimindeki bu değiģiklik, vasküler özellikleri ve bunun sonucu olarak da kan basıncını düzenleyen bir mekanizma oluģturmaktadır (Ak 2006). Serbest radikallerden yararlı fizyolojik etkisi olanlara örnek olarak NO radikali verilebilir. NO, nitrik oksit sentaz (NOS) tarafından argininden sentezlenir. NO damar geniģlemesi süreçlerinde endotelyal nitrik oksit sentaz (enos), sinir uyarılarınn iletilmesi sürecinde ise nöronal nitrik oksit sentaz (nnos) tarafından sentezlenir. Stres varlığında NO uyarılabir nitrik oksit sentaz (inos) ın katalitik etkisiyle oluģturulur. NO ya direkt olarak veya süperoksit ile reaksiyona girerek çok reaktif molekül olan peroksinitrit (ONOO) radikallerine dönüģmek suretiyle proteinlere lipitlere ve DNA ya zarar verebilir (Rahal et al. 2014). NO in kanser, akut inflamasyon, kardiyovasküler hastalıklar, sıtma, bazı nörolojik hastalıklar ve Ģeker hastalığı gibi rahatsızlıklarla iliģkisi ispatlanmıģtır. NO hücre fonksiyonlarının ayarlanması ve dokuların yaģam özelliklerinde etkili bir Ģekilde kullanılmaktadır. NO ile süperoksit arasındaki reaksiyon sonucunda peroksinitrit (ONOO-) meydana gelir. OluĢan peroksinitritlerin oksidatif DNA hasarlarına yol açtığı bilinmekte ve peroksinitrit radikalinin nitrik oksite bağlı bir toksisiteye sahip olduğu tahmin edilmektedir (Ak 2006). Hidrojen peroksit radikali (H 2 O 2 ): EĢleĢmemiĢ elektrona sahip olmadığından dolayı nonradikal özelliğe sahip bir reaktif oksijen türüdür. Ancak bakır (Cu) ve demir (Fe) gibi metallerle reaksiyona girerek çok reaktif bir radikal olan OH. radikalini meydana getirirler. Hidrojen peroksit hücre içine kolayca girerek Fe 2+ nin yapısına katılır ve onları güçlü oksitleyici özelliğe sahip kılar (Bursal 2009).

29 5 H 2 O 2 + H + + Cl - HOCl + H 2 O Hidroksil radikali (OH. ): Lipidler, proteinler, nükleik asitler gibi kritik öneme sahip biyomoleküllere güçlü bir Ģekilde saldırarak onların oksitlenmelerine ve yapılarında kalıcı hasarlara yol açan, yarılanma ömrü 10-9 s gibi çok kısa olan oldukça reaktif yapıda bir moleküldür. H 2 O 2 in indirgenmesi sonucu oluģur ve Fenton ile Haber-Weiss reaksiyonları olarak isimlendirilen indirgenme reaksiyonları aģağıda gösterildiği gibidir (Nordberg and Arner 2001; Bursal 2009). Fenton reaksiyonları: H 2 O 2 + Fe 2+ OH. + OH - + Fe 3+ H 2 O 2 + Cu 2+ OH. + OH - + Cu 2+ Haber-Weiss Reksiyonları: H 2 O 2 + O 2.- H + OH. + O 2 + H 2 O Ayrıca UV ıģınları ile H 2 O 2 nin hidroksil radikaline dönüģtüğü bilinmektedir. UV H 2 O 2 OH. Peroksi radikalleri (ROO. ): Çoklu doymamıģ yağ asitlerinin oksidasyonu esnasında oluģan ürünlerdir. Lipid peroksidasyonu hücre memranında bulunan araģidonik veya linoleik asit gibi çoklu doymamıģ yağ asitlerinin yan zincirinden bir hidrojen atomunu koparabilecek reaktifliğe sahip olan herhangi bir atom ya da molekül tarafından meydana getirebilir (Ak 2006). Hipoklorik asit (HOCl): Serbest bir radikal olmayan hipoklorik asit potansiyel bir oksitleme ve klorlama ajanıdır. HOCl primer aminlere ve proteinlerin sülfidril gruplarına saldırmakta ve DNA daki pürin bazlarını da kolayca koparabilmektedir.

30 6 Kozumbo et al. (1992) yaptıkları bir çalıģmada HOCl in fizyolojik düzeyinin sübstitüe olmuģ aril aminleri etkileyerek DNA yı bağlayabilen ve insan hücrelerinde genotoksisite sağlayan uzun ömürlü ürünler oluģturduğunu ortaya koymuģlardır. Ayrıca son zamanlarda hücre lizisleri ve ölümüne yol açan ve hücre mebranının bozulmasını sağlayan, kolesterol klorohidrinlerinin formasyonuna katıldığı tahmin edilmektedir (Ak 2006) Serbest radikal kaynakları Reaktif oksijen ve azot türleri insan vücudunda değiģik Ģekillerde meydana gelir. Örneğin; süperoksit ve hidrojen peroksit miktarı; adrenalin, dopamin, tetrahidrofolat ve elektron transport zincirinin bazı bileģikleri gibi biyomoleküllerin oksidasyonuyla artabilmektedir (Frodowich 1986; Halliwell 1994). Ayrıca insanlar çoğu zaman değiģik kaynaklardan radyasyona maruz kalmaktadır. Böyle durumlarda düģük dalga boyundaki elektromagnetik ıģınlar suyu parçalayarak reaktif hidroksil radikallerini oluģturabilir (Gülçin et al. 2011). Su, enerjiye maruz bırakıldığı zaman saniyede uyarılmıģ hale (H 2 O٠) geçer. h 2H 2 O H 2 O + + e - + H 2 O٠ (1) H 2 O٠ H٠ + OH٠ (2) H 2 O + + H 2 O H 3 O + + OH٠ (3) Birinci reaksiyonda görüldüğü gibi uyarılmıģ haldeki su molekülleri saniyelik bir zaman dilimi içinde homolitik parçalanmaya uğrarlar. Ġkinci reaksiyon ile üçüncü reaksiyon spontan olarak cereyan edebilir. Elektron ise saniye içerisinde su molekülleri tarafından sarılır. Böylece bir sulu çözeltinin uyarılmasıyla üç farklı radikal oluģur. Bunlar hidrojen (H٠), hidroksil (OH٠) radikalleri ile hidratlanmıģ elektron (e - aq) dur (Halliwell and Guttaridge 1989).

31 7 Reaktif oksijen ve azot türleri canlı organizmaya sigara içilmesi gibi değiģik yollar ile dıģarıdan alınabilirler. Sigara dumanının ana bileģiği NO 2 ٠ dir. NO 2 ٠ in sigara olefinleri ile reaksiyona girmesi sonucu karbon merkezli radikallerin oluģtuğu öne sürülmektedir. Ayrıca sigara içilmesi nötrofilleri aktive ederek dolaylı olarak da serbest radikal üretimini arttırabilir (Papas 1996). Sıcaklık, oksijen konsantrasyonu, ıģık, geçiģ metallerinin varlığı da otooksidasyonu etkileyen en önemli faktörlerden bazılarıdır. Sıcaklık, oksijen konsantrasyonu ve ıģık Ģiddeti gibi parametrelerin artmasıyla otooksidasyon hızı artmaktadır. Ayrıca metabolizmada serbest haldeki demir ve bakır iyonlarının gereğinden fazla bulunması en az serbest oksijen reaktifleri kadar hasar verebilmektedirler. GeçiĢ metallerinin düģük bir konsantrasyonu bile Fenton Reaksiyonu sebebiyle radikalik zincir reaksiyonlarını indükleyen hidroksil radikali oluģumuna sebep olmaktadır. H 2 O 2 ve Fe 2+ tuzu karıģımının birçok organik molekül ile etkileģtiği ilk kez 1894 te Fenton tarafından gözlemlenmiģtir. Bu reaktivitenin, meydana gelen OH radikallerinden kaynaklandığı anlaģılmıģtır. Fenton reaksiyonunda Fe 2+ H 2 O 2 ve lipit peroksitlerini parçalayarak, reaktif serbest radikal oluģturması nedeniyle lipit oksidasyonunu hızlandırır. Benzer reaksiyon Cu 2+ ile de meydana gelebilmektedir (Dunford 1987). Fe 3+ iyonları da peroksitlerden radikal üretebilir. Ancak reaksiyon hızı 10 kat daha düģüktür. Fenton reaksiyonu aģağıdaki gibi gösterilebilir (Gülçin 2002; Halliwell and Guttaridge 1989). H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH + OH٠ k = 761 mol -1 s -1 H 2 O 2 + Cu + Cu 2+ + OH + OH٠ k = 4, mol -1 s -1 Kaslardaki lipit oksidasyonunun baģlaması da serbest metal iyonlarından (Kanner et al. 1988) ve miyoglobin gibi hem proteinlerinden kaynaklanır (Lui and Watts 1970). Sonuç olarak serbest radikaller canlı organizmalarda endojen veya eksojen kaynaklı olarak iki farklı Ģekilde meydana gelebilir. AĢağıda eksojen ve endojen kaynaklı antioksidanlar maddeler halinde kısaca sıralanmıģtır.

32 8 A. Ekzojen kaynaklı olanlar: -Radyasyon, çevre kirliliği, organik çözücüler ve pestisitler (Halliwell 1994). -AlıĢkanlık yapan maddeler: Alkol, sigara ve uyuģturucular. -Antineoplastik ajanlar: Nitrofurantion, Belamisin, Doxorubicine, Adriamicine, Bisfenol v.b. -Stres: Stres durumunda katekolamin düzeyleri artar. Katekolaminlerin oksidasyonu ise serbest radikallerin kaynağıdır. Bu olay stres olayının hastalıkların patogenezindeki rolünün serbest radikal üretimi ile ilgili olabileceğini göstermesi bakımından önemlidir (AkkuĢ 1995; Huyut 2007) B. Endojen kaynaklı olanlar: Normal aerobik solunum; polimorfnükleer lökositleri, makrofajları ve peroksizomları sitimüle eder. Peroksizomlar, hücre tarafından üretilen birçok reaktif oksijen türlerinin temel endojen kaynağıdır (Halliwell 1994). Mitokondri ROS nin %90 ından daha fazlasının üretilmesinden sorumlu organeldir. ROS elektron transport zincirinden elektronların sızması ve O 2 ile reaksiyon vermesi sonucu meydana gelir. KarĢı cevap olarak mitokondrideki msod (SOD2) ve sitozoldeki Cu-Zn-SOD (SOD1) gibi süperoksit dismutaz enzimleri süperoksit radikallerini diatomik oksijen (O 2 ) veya H 2 O 2 e dönüģümünü katalize ederler (Yan et al. 2013). Serbest radikaller granülosit ve makrofajlar gibi fagositik hücreler tarafından intrasellüler öldürücü bakteriler gibi patojenlerin yok edilmesi benzeri biyolojik süreçlerde anahtar bir rol oynar (Gülçin and Beydemir 2013). Dolayısıyla fagositik hücrelerde patojenlere karģı öldürücü etki oluģturmak için yüksek miktarda NO ve süperoksit gibi radikaller sentezlenir. Ayrıca bu hücreler patojenik durumlarda normalden 1 ile 10 kat arasında daha fazla oksijeni daha uzun süre tutarlar. Solunum patlaması olarak ifade edilen bu olay ile de serbest radikallerin oluģumu artar (Rahal et al. 2014). Metabolizmada oluģan ve dıģ kaynaklı radikal ve reaktiflerin oluģum yolları aģağıdaki Ģekilde gösterilmiģtir (Nelson and Cox 2005).

33 9 O 2 ETS zinciri, ilaçlar, radyasyonlar, zehirler v.b..- O 2 e - + 2H + Glutatyon Peroksidaz H 2 O 2 2H 2 O H + 2GSH GSSG 2H 2 O OH٠ Lipid, protein ve DNA yapılarına zarar verir. ġekil 1.2. Serbest radikal ve reaktiflerin oluģumu BaĢlıca endojen kaynakları maddeler halinde kısaca aģağıdaki Ģekilde sıralayabiliriz: 1. Enzimler ve proteinler: Ksantin oksidaz, Triptofan deoksijenaz, Hemoglobin 2. Mitokondrial elektron transportu 3. Endoplazmik retikulum ve nükleer membran transport sistemleri (stokrom P 450, stokrom b) 4. ÇeĢitli moleküllerin oksidasyonu: Tioller, hidrokinonlar, katekolaminler, flavinler 5. Plazma membranında lipoksijenaz, prostaglandin sentetaz, fagositlerde NADPH oksidaz, lipid peroksidasyonu ile. 6. Oksidatif stres yapıcı durumlar: Ġskemi, travma, intoksikasyon (AkkuĢ 1995; Huyut 2007) Serbest radikallerin hücresel yapılara etkileri Hücre membranının yapısında bulunan lipitler, doymamıģ yağ asitleri içerdiğinden dolayı oksidasyona karģı daha hassastırlar (Halliwell and Guttaridge 1989). Kolesterol oksitlendiğinde kolesterol hidroperoksitleri oluģur (Smith 1992). Kolesterolün oksidasyon ürünleri, kolesterol biyosentezini önler, membran fonksiyonunu değiģtirir ve

34 10 sitotoksik özellik gösterirler. Ayrıca bu durum damar tıkanıklığına sebep olan temel etkenlerden biridir. Bu yüzden sağlık açısından da değiģik olumsuzluklara yol açar (Smith and Johnson 1989). Membran lipitlerinin oksidasyonu, membranın akıģkanlığını ve geçirgenliğini olumsuz yönde etkiler (Kaya 2006). Ġnterasellüler ortamda oluģan serbest radikaller, intrasellüler kompartmanlarda reaksiyona girmek için membranı geçmek zorundadırlar (Pol Yu 1994). Serbest radikaller nörotransmitterler, genetik materyaldeki nükleik asitler ve hücre membranlarının majör komponenti olan yağ asitlerine etkilidirler (Kaya 2006). Radikaller yoğun olarak üretildiklerinde, aerobik solunumu ve kapiller trombosit agregasyonunu hızlandırarak çeģitli reaksiyonlara yol açabilirler (Halliwel and Guttaridge 1984). Bu reaksiyonların en önemlilerinden biri lipid peroksidasyonudur. Lipid peroksidasyonu, lipid hidroperoksit (LOOH) lerini meydana getirmek için oksijen radikali ile, hücre membranı fosfolipidlerindeki poliansatüre yağ asitlerinden bir hidrojen atomunun uyarılmasıyla baģlar ve arttırıcı bir dizi kompleks reaksiyon oluģtuktan sonra devam eder. Bu kompleks olaylar sonucunda poliansatüre yağ asitleri suda çözünebilen ürünlere dönüģür, membran bütünlüğü bozulur ve hücre penatrasyona müsait hale gelir (Holley and Cheeseman 1993). Bu radikaller, baģlatıcı olarak hareket edip zincirleme mekanizmalar ile elektron transferi oluģturur (Reilly et al. 1991). Lipid peroksidasyon zincir tepkimesinin uzunluğu ve peroksidasyonun Ģiddeti, lipidlerin doymamıģlık derecesi ile orantılı olarak artar (Mayes 1993). Santral sinir sistemi uzun zincirli doymamıģ yağ asitleri bakımından en zengin organ olduğu için lipid peroksidasyonunun en önemli etkileri beyinde görülür (Tanakol 1998). OluĢan lipid radikalleri konjuge dienleri oluģturur. Sonra çift bağların yeniden düzenlenmesi ve moleküler oksijenin etkilenmesiyle bir lipid hidroperoksiti veya endoperoksid radikali oluģur. Yağ asidinde en az üç çift bağ varsa, son ürün olarak malonaldehit (MDA) oluģur (Mayes 1993). Ayrıca lipid peroksidasyonu ile oluģan ürünlerin tiobarbütirik asit ile reaksiyona girmesi sonucuyla da MDA ortaya çıkar (Powel and Tortoloni 1992). MDA proteinler ve fosfolipidlerle çapraz bağ oluģturabilir ve böylece özelliklerinin

35 11 kaybolmasına sebep olur (Kaya 2006). MDA nın tespit edilen miktarları serbest radikal hasarı hakkında bilgi verir (Kılınç 1986; Reilly et al. 1991). LH + R L + O 2 LOOH L + RH LOO LO LH: Hedef polianatüre yağ asidi R: BaĢlatıcı okside edici ajan L: Yağ asidi radikali LO: Lipid alkoksil radikali LOO: lipid peroksil radikali LOOH: lipid hidroperoksidi. Poliansatüre yağ asidinin oksidasyonu, bir yağ asidi radikali meydana getirir. Bu yağ asidi peroksil radikali oluģturmak için hemen oksijene eklenir. Peroksil radikalleri, zincir reaksiyonlarının taģıyıcılarıdır. KomĢu poliansatüre yağ asidi moleküllerini okside edebilir ve yeni zincirler baģlatabilir. Bu sırada lipid peroksitlerini üretirler. Bunlar baģka radikallere ve aldehitlere yıkılırlar (Imlay 1998). Lipid peroksidasyon ürünü olan MDA miktarı (ġekil 1.3), TBA testi ile ölçülmekte ve bu yöntem, lipid peroksid düzeylerinin tespitinde sıklıkla kullanılmaktadır (Jain et al. 1989). Ayrıca lipid peroksidasyonu sırasında oluģan ara bileģiklerden dien konjugatlarıyla lipid hidroperoksitleri ve son ürünlerden etan ve pentan gibi gazların ölçümü de, son yıllarda lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olarak değerlendirilmektedir (Erden 1992; Kaya 2006). Serbest radikallerle ilgili yukarıda ifade edilen bilgilere de bakıldığında antioksidan savunma kapasitesinin geliģtirilmesine ve muhafazasına yönelik çalıģmaların önemi oldukça artmıģtır.

36 12 DoymamıĢ yağ asidi H + Lipid radikali Konjuge dien O-O H Lipid peroksi radikkali. H HO-O H O O Hidroperoksit Endoperoksit O O Malondialdehit ġekil 1.3. Lipid peroksidasyonunun kimyasal yolu ve malondialdehit oluģumu (Gülçin 2002). Oksidasyon olayı, radikalik zincir reaksiyonları vasıtasıyla meydana gelir. Radikaller eģleģmemiģ elektronlarını eģleģtirme eğiliminde oldukları için özellikle gevģek bağlı elektronları koparabilirler. Radikallerin bu özellikleri, onlara kimyasal aktiflik sağlar. Radikallerin organizmada kontrolsüz bir Ģekilde varlığı biyomoleküllerin modifikasyonuna sebep olur. Hayatın vazgeçilmez temel unsuru olan oksijenin, bir diradikal olması aerobik canlılar için bir dezavantajdır. Bu sebeple aerobik canlılarda biyolojik sistem oksidasyona doğru giderken, oksidasyon önleyici veya geciktirici sistemler oksidasyonu durdurma veya yavaģlatma yönünde hareket ederek sürekli bir denge oluģtururlar. Gıda maddeleri özellikle de yağ ihtiva eden ürünler, iģlenme ve

37 13 ambalajlanma esnasında oksijenden uzak tutulmakta ya da antioksidanlar aracılığıyla oksidasyondan korunmaya çalıģılmaktadırlar (Aruoma and Cuppett 1997). Önleyici sistemlerin yokluğunda indirgenme potansiyeli düģük, bir baģka deyiģle yükseltgenme potansiyeli yüksek olan atom ve moleküller için oksidasyon kaçınılmaz bir durumdur. Lipitlerin oksidasyonu tipik bir radikalik zincir reaksiyonudur. Bu reaksiyonun mekanizması Ģematik olarak aģağıdaki Ģekilde cereyan etmektedir (Aruoma and Cuppett 1997). RH + O 2 RH + R ٠ R٠ + ٠OOH R٠ + R H BaĢlama basamağı R٠ + O 2 ٠ ROO٠ + R'H ROO ROOH + R'٠ GeliĢme basamağı R٠ + R٠ RR R٠ + ROO٠ ROOR Sonlanma basamağı ROO ٠ + ROO ٠ ROOR + O 2 Çoklu doymamıģ yağ asitleri, doymuģ yağ asitlerine göre hidrojen koparılmasıyla oluģan radikalin çift bağın konjugasyonuyla kararlı hale getirilmesi ve böylece de hidrojenin daha kolay koparılmasına sebep olmasından dolayı, otooksidasyona daha yatkındırlar (Halliwel and Guttaridge 1989). Serbest radikaller eģleģmemiģ elektron çiftlerinden dolayı ortamdaki lipoproteinler, membran lipidleri, çoklu doymamıģ yağ asitleri, karbohidratlar, nükleotidler gibi bazı kritik öneme sahip moleküllere yoğun bir Ģekilde saldırarak lipid peroksidasyonuna ve protein oksidasyonuna sebep olurlar ve onların yapısını bozarlar (Bursal and Gülçin

38 ; Çetinkaya et al. 2012). Lipid peroksidayon reaksiyonları çoklu doymamıģ yağ asitlerine serbest radikallerin saldırısını içerir (Bursal and Gülçin 2011). Hücrelerde çok sayıda koruma ve savunma mekanizmaları bulunur. Organizmaların kendilerini oksijen metabolizmasının toksik etkilerine karģı korumaları için, bu savunma mekanizmaları gereklidir (Frodowich 1976). Mikrozomal ve mitokondrial elektron transport zincirleri H 2 O + ½ O 2 XO CAT Solunum patlaması O 2.- SOD H 2 O 2 GSH-Px 2H 2 O Prostaglandin sentezi H + GSH GSSG GSH-Red Arginin tnos NO. Fenton Reaksiyonu Fe 2+ NADPH + H + NADP + Pentoz fosfat yolu ONOO. ONOOH OH. + OH. Membran fosfolipidlerinde (PUFA) H +. NO 2 hasar Lipid peroksidasyou MDA salınımı Subsellüler yapılarda hasar ġekil 1.4. Oksidatis stres sonucu meydana gelen hücresel hasarın oluģum mekanizması

39 15 Bu bakımdan biyolojik sistemlerde antioksidatif savunma mekanizmasının araģtırılması ile ilgili çalıģmalar son zamanlarda büyük bir önem kazanmıģtır. Günümüzde en çok araģtırılan biyolojik olaylardan biri olan yaģlanma da dahil olmak üzere, birçok hastalığın oksidatif hasarla iliģkili olduğu gösterilmiģtir. Bütün bu olaylar göz önünde bulundurulduğunda lipit peroksidasyonunu takip etmek, oksidasyon derecesini belirlemek açısından oldukça önemlidir. Ayrıca oksidasyon sadece lipitlerde zararlı etkilere yol açmaz. Reaktif oksijen ve azot türleri, DNA bazlarını hasara uğratması sonucu mutasyona da sebep olmaktadır. O ٠ 2, OH ٠, peroksinitrit (ONOO ), DNA hasarının birçok türünün sebebi olarak bilinir. DNA hasarı kanserden sorumlu temel faktördür (Guyton and Kensler 1993). Elektron taģıma sisteminin mitokondride yer alması ve mrna sentezi esnasında RNA polimerazın bir hata okuma (proofreading) mekanizmasına sahip olmaması nedeniyle, oksidatif hasar, mitokondride kromozomal DNA ya göre daha sıklıkla meydana gelir. Mitokondriyal solunum sonucu oluģan serbest radikaller (O.- 2, H 2 O 2, OH. v.b.), tek zincir kırıklarına ve 8-oksoguanin ve timin glikol gibi hasarlı bazların oluģmasına sebep olur (Bütüner and Kantarcı 2006). Oksidatif metabolizma esnasında veya sonucunda oluģan bazı hasarlı DNA lar ġekil 1.4 de gösterilmiģtir. O O O NH 2 H 3 C HO HO NH HO NH HO NH HO N N H N H O HO N H O Timin glikol 5,6-Dihidroksiurasil 5-Hidroksiurasil 8-Hidroksiadenin O O H N H NH 2 O N H O N H OHCHN NH OHCHN NH HO N HO N N H 2N N H N 2,6-Diamino-4-Hidroksi 4,6-Diamino-5-5-Hidroksistozin 8-Hidroksiguanin -5-Foarmamit primidin Formamit pirimidin H N H O N H N NH 2 ġekil 1.5. Oksidatif metabolizma esnasında veya sonucunda oluģan bazı hasarlı DNA lar

40 16 Sonuç olarak; eğer serbest radikaller nötralize edilmezlerse vücutta aģağıda belirtilen bazı ciddi hasarlara neden olabilirler. Bunlar; -Enzim aktivitelerinde ve lipid metabolizmasında meydana gelen değiģiklikler -Mukopolisakkaritlerin yıkımı -Nükleotid yapısındaki koenzimlerin yıkıma uğraması -Membran transport sistemlerinin bozulması -Steroid ve yaģ pigmenti adı verilen bazı maddelerin birikmesi -Tiyollere bağlı bazı enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının bozularak hücre ortamının tiyol/disülfit oranının değiģmesi -Elastin ve kollagen gibi uzun ömürlü proteinlerin oksidasyon redüksiyon olaylarının bozularak kapillerde meydana gelen aterofibrotik değiģmeler (Öztürk Sarikaya 2009) -Hücre membranı proteinlerinin yıkılarak hücrelerin ölmesi, -Membran lipid ve proteinlerinin yok olması ve hücre membranının sertleģip hücre fonksiyonunun engellenmesi. -Nükleer membranın yıkılarak nükleustaki genetik materyalġ (DNA) kırılma ve mutasyonlara açık hale getirmek. -BağıĢıklık sistemindeki hücreleri yok ederek bağıģıklık sistemini zorlamak, Ģeklinde sıralanabilir (Kaya 2006; Temur 2006) Serbest radikallerin immün sistem disfonksiyonu üzerine etkisi Ġmmün savunma mekanizması patojenlerin ölümünde anahtar bir rol oynayan ROS ve RNS ile benzerlik gösterir Ģekilde oksidanların öldürücü etkisini kullanır (Rahal et al. 2014). ROS öncelikle immün savunma mekanizmasının bir parçası olarak organizmada üretilir. Nötrofiller, monositler veya makrofajlar gibi fagositik hücreler öldürücü mekanizmalarının bir parçası olan O.- 2, NO. radikallerini büyük miktarda üreterek yabancı patojenlere karģı organizmayı korur. AĢırı fagosit aktivitesiyle oluģan ROS nden dolayı ortaya çıkabilecek doku hasarı çeģitli hastalıklara eģlik eder. Fagositik aktivite ile ortaya çıkan doku hasarları ile yaģlanma, kanser, sıtma, edinilmiģ bağıģıklık sistemi yetersizliği, kalp hastalığı, inme, damar sertliği ve diyabet gibi yaklaģık 100 den fazla hastalığa sebep olur (Gülçin and Beydemir 2013). Bu alanda etkili olan hücreler B

41 17 ve T lenfositlerin yanında fagositik hücreler olan makrofajlar, eozinofiller, heterofiller ile enzimlerden NADPH oksidaz enzimidir. Bu bağıģıklık tepkimesinin baģlangıcında fagositler oksijen alımını ve tutulmasını kat daha artırırlar (respiratuar patlama). Bu hücreler tarafından H 2 O 2, hipoklorik asit (HOCl), peroksinitrit (ONOO), hidroksil radikali gibi güçlü peroksidantlar üretilir. Fagositlerin sitotoksik cevabında bu yüksek reaktif moleküller kullanılmakta fakat yan etki olarak da bu reaktif moleküller doku yaralanmasına sebep olmaktadırlar. ÇeĢitli çalıģmalar oksidatif stres, immün sistem ve inflamasyonun iç içe olduğunu ortaya koymuģtur. Artan NO in çeģitli tip viral enfeksiyonlara maruz bırakılan immünosit hücre kültürlerinde viral enfeksiyonu azalttığı gösterilmiģtir (Rahal et al. 2014). Ancak monosit kültürlerinde yapılan çalıģmalarda aģırı NO üretiminin oksidatif stres marker oluģmuna katkı sağladığı ile ilgili olduğu görülmüģtür. Buna ek olarak oksijen stresi immün sistem disfonksiyonunda yaģlanma teorisi ile birlikte anahtar bir role sahip olduğu ifade edilmektedir. Bunlarla birlikte polenlerdeki NADPH oksidaz hava yoluyla alındığı zaman oksidatif strese yol açabilmektedir. Bu oksidatif sonuçlar duyarlılığı olan hayvanlarda alerjik inflamasyondan sorumlu tutulmaktadır. Bunlar arasında IL-8, IL-6, proinflamatuar stokinlerin üretimi, tümör nekroz fakör-α (TNF-α) nın üretiminin tetiklenmesi de mevcuttur. Ġmmün sistem direkt olarak birçok hastalık oluģumuyla iliģkilidir. ÇeĢitli fiziksel ve fizyolojik stres faktörleri çeģitli viral ve patolojik hastalıkların artıģına yol açabilir (ġekil 1.6). Fötal yaģamdaki çeģitli viral hastalıklar canlı hücreye zarar veren oksidatif stresi üretebilir. Kısacası immün sistemin uyarılmasındaki herhangi bir değiģiklik hastalık oluģumunu tetikleyebilir. Bakteriyal, viral veya parazitik sınıflarına bakılmaksızın bütün patojenlerin antioksidan savunma mekanizmasıyla iliģkili olduğu ve ROS nin öldürücü rolüne benzer Ģekilde konak hücrelere yerleģtiklerinde fagositik hücrelerin patojenleri öldürmesine duyarlılığının arttığı rapor edilmiģtir. Reaktif türler patojenleri öldürmede gereklidir. Ancak doku hasarları gibi negatif yan etkiler ile de iliģkilidir. Bu durum özellikle de kronik inflamasyonda oksidatif stres artıģıyla birlikte daha fazla ortaya çıkar ve aģırı doku yaralanması meydana gelir. Bu hücresel hasarlar enfeksiyona cevap

42 18 vermede değiģikliğe yol açar ve sonuç olarak bakteriyal, viral ve parazitik infeksiyonlara duyarlılığı artırır (Rahal et al. 2014). Enfeksiyonlar Virüs, Bakteri, Parazitler Yabancı Maddeler Sigara, asbestos, kimyasal, organik çözücüler Hasarlı Doku Isı, yaralanma, mekanik etki,uv Fagositik Hücrelerin Aktivasyonu Monosit Mast Hücreleri Makrofaj Eozinofil Nötrofil Bazofl ROS, RNS Farklı nörodejeneratif hastalıklar (Alzheimer, Addison, Huntinghon v.b) ateroskleroz, yaģlanma, kanser v.b. ġekil 1.6. ÇeĢitli dıģ faktörler ile fagositik hücrelerin aktivasyonu sonucu oluģan ROS ve etkileri ROS nin bazı hücre içi sinyal yolakları üzerine etkileri Reaktif oksijen ve azot türlerinin zararlı etkileri iyi bilinmektedir. Ancak son yıllarda giderek artan kanıtlara bakıldığında Reaktif oksijen türleri ile reaktif azot ara ürünlerinin (RNI) kabul edilebilir konsantrasyonlarının normal fizyolojik proseslerde vücut savunma sisteminde yararlı etkilere sahip olduğu ortaya konmuģtur (Li et al. 2013). ROS çok çeģitli vücut fonksiyonlarını düzenleyen hücre canlılığını, göçünü ve farklılaģmasını kontrol ederek sinyal yollarıyla iliģkili olan sinyal molekülleri olarak da

43 19 görülmektedir (Li et al. 2013; Rahal et al. 2014). Bu durum ilk olarak H 2 O 2 in insülin, stokin, büyüme faktörü, aktivatör protein-1 (AP-1) ve nükleer faktör kappa B (NF- K B ) sinyal yolları için gerekli olduğunun göterildiği 1990 yılında ortaya konulmuģtur (Tak 1999; Tak and Firestein 2001). Ayrıca stokrom c temelli apoptozisde ROS nin rolü iyi kurgulanmıģtır (Liu et al. 1996). ROS sinyal yollarını etkilemek suretiyle geri dönüģümlü olarak posttranslasyonel protein modifikasyonlarına sebep olabilir (Pryor et al. 2006). ROS nden H 2 O 2 in son ürünü olan süperoksit anyon radikali (O.- 2 ), sinyal proteinlerini oksidatif modifikasyona uğratması yolu ile sinyal molekülü olarak hareket eder. Protein kinaz B veya PKB olarak da bilinen Akt bir serin/treonin kinazdır. Bu enzim preapoptotik düzenleyiciler olan Bod ve Myc gibi mitotik iliģkili transkripsiyon faktörlerinin direkt olarak inhibisyonunu sağlamak suretiyle hücre canlılığının devamını sağlayan sinyal yollarına aracılık ederler. PP2A olarak da bilinen protein fosfataz 2A, PI3K/Akt yolunu bloke etmek suretiyle treonin 378 ve serin 473 üzerinden Akt yi defosforile ederler. H 2 O 2 sistein alanında PP2A yı inaktive ederek hücre yaģamını kolaylaģtıran ve devamını sağlayan Akt sinyal yolunu aktive etmiģ olur (Rao and Clayton 2002; Groeger et al. 2009). Ayrıca mitojen aktive kinazlar (MAPK) diğer bir serin/teronin kinaz ailesindendir. Onlar içinde ekstrasellüler sinyal düzenleyici kinaz (ERK) yolakları hücre farklılaģmasının düzenlenmesiyle iliģkilidir. Bu yolda MAPK kinaz kinazların (MAPKKK) fosforilasyonu ve MAPK kinazların [MAPKK veya MAPK/ERK kinazlar (MEKs)] aktivasyonu ve MAPKs (veya ERs) ların aktivasyonu veya fosforilasyonunun dönüģümü yoluyla hücre farklılaģmasının meydana gelmesi söz konusudur. Bu yolun negatif düzenlenmesi fosfatazlar tarafından MAPKs ın defosforilasyonu yolu ile gerçekleģtirilir. ROS çeģitli yollarda ERK sinyalini aktive eder. Ġlk olarak ERK sinyal yolu EGF ve PDFG reseptörlerinin alt kısmını aktive eder. Oksijen radikalleri bu reseptörlerin fosforilasyonunu sağlayarak mitojenle iliģkili sinyal yolunun aktivasyonunu gerçekleģtirir (Gamou and Shimizu, 1995; Catarzi et al. 2011). Gerçekte ERK sinyal yolunun aktivasyonu reseptör seviyeleri ile sınırlı değildir. Ayrıca ROS, RAS ın üst düzenleyicisi olan Src kinazı aktive edebilir ve ERK sinyal yolunun aktivasyonuna yol açabilir (McCubrey et al. 2006).

44 20 ERK sinyal yolu hidroksil radikalleriyle MAPK fosfatazların direkt inhibisyonu sonucunda aktive edilebilmektedir (Whisler et al. 1995; Brookmeyer et al. 1998). ROS hücre farklılaģmasına aracılık etmektedir. Miyojenik farklılaģma ROS içeren çeģitli ekstrasellüler uyaranlara cevap vermede miyojenez için zorunlu bir süreçtir. Apoptozis sinyal düzenleyici kinazlar (ASK) 1, MAPKKK ailesinin bir üyesidir ve kalp iskelet hücrelerinde p38 MAPK aracılı miyojen sinyallemenin intrasellüler tetikleyicisidir. Oksidatif stres gibi bir dizi stres çeģitleri ASK1 i aktive edebilir ve miyoblastların farklılaģma sürecini baģlatabilir. Bir sinyal molekülü olarak ROS nin hücre göçü ve yönlendirilmesinde VEGF veya anjiyopoietin 1 gibi anjiyogenik faktörlerin fonksiyonuna aracılık ettiği gösterilmiģtir (Li et al. 2013). ROS ikinci mesajcılar olarak hücre sinyal yollarının düzenlenmesine ek olarak, enfeksiyöz ajanlara karģı hücre savunmasıyla da iliģkilidir. Ġnflamasyon Ģartları altında aktive olan nötrofiller ve makrofajlar büyük miktarlarda süperoksit radikallerini ve diğer ROS ni üretebilir ve gözle görülür bir biçimde NADP oksidaz ın fagositik formu artabilir. Bu durumda hücre savunmasını kolaylaģtırmak için H 2 O 2 nin konsantrasyonu µm a kadar çıkabilir (Keisari et al. 1983). Oksidatif stres hafıza ve öğrenme sürecini de içine alan santral sinir sistemi (CNS) nin fizyolojik fonksiyonları ile de iliģkilidir. Uzun süreli potasiasyon (LPT), eģ zamanlı uyarılan iki nöron arasındaki geçiģ sinyalinin uzun süreli baģarılmasıdır. Sinaptik gücün modifikasyonuyla kodlandığı düģünülen anılar gibi belleğin fonksiyonunda, LTP nin hafıza ve öğrenmenin altında yatan önemli bir hücresel mekanizma olduğu düģünülmektedir (Li et al. 2013). ġekil 1.7 de görüldüğü gibi LTP öğrenme ve hafızanın en önemli hücresel mekanizmalarından biridir. Bu mekanizma N-metil-Daspartat resptör (NMDAr), α-amino-3-hidroksi-5metil-4-izoksazolpropiyonik asit reseptör (AMPAr) ve metabotropik glutamat reseptör (mglur) gibi glutamat reseptörlerinin aktivasyonu ve PP2A ve PP2B gibi protein fosfatazların negatif aktivasyonu ile yürümektedir. Glutamat reseptörlerinin aktivasyonu muhtemelen NADPH-oksidaz (Nox) tarafından üretilen süperoksit radikalleri (O.- 2 ) birikimine neden olur (ġekil 1.7).

45 21 ROS LTP oluģumunda hücresel haberciler olarak kabul edilir. LTP nin oluģumunda önemli bir rol oynayan NMDA reseptörünün aktivasyonu, kemirgenlerin hipokampal dilimlerinde süperoksit birikimine yol açmaktadır. Hipokampal bölgelerde süperoksidin temizlenmesi yüksek frekans ile uyarılan LTP nin bloke edilmesine sebep olmaktadır (Klann et al. 1998). NMDAr AMPAr mglur Nox NMDAr Ca +2 PP2A PP2B Protein Trozin Fosfatazlar PKA PKC CaMKII PI-3K ROS ERK Defosforilasyo n Fosforilasyon Sinyal Proteinleri Sitoiskelet Proteinleri Nükleer Proteinler Gen Transkripsiyonu Protein sentezi Morfolojik DeğiĢiklikler LPT ekspresyonu ġekil 1.7. Oksidatif stres sonucu oluģan ROS nin hafıza ve öğrenme üzerinde etkili olan LTP sentezi üzerine etkileri (Li et al. 2013)

46 22 NADPH-oksidaz subünitelerinin genetik mutasyonu veya silinmesi LTP nin eksikliğiyle sonuçlanmaktadır (Kishida et al. 2006). Ekzojen süperoksid dismutaz (SOD) ile hipokampal alanların inkübasyonu LTP nin azalmasına yol açmaktadır (Klann et al. 1998). ROS PKA, PKC, CaMKII ve ERK gibi çok sayıda protein kinazların aktivitesini etkilemek suretiyle LTP üretimini artırabilmektedir (Klann and Thiels 1999; Huddleston et al. 2008). Buna ek olarak ROS protein trozin fosfataz, PP2A ve kalsineurin gibi birçok protein fosfatazların aktivitesini baskılamak suretiyle LTP üretimini tetikleyebilir (Klan and Thiels 1999). ROS aynı zamanda Alzhemier hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), Amitropik Lateral Skleroz (ALP) hastalığı gibi birçok nörodejeneratif hastalıkların oluģumundaki sinyal ve protein yolaklarının aktifleģmesi ile de iliģkilidir. Ġntrasellüler nörofibriler yumaklar (NFT) ve ekstrasellüler Aβ, Addison hastalığının en önemli iki histopatolojik iģeretlerindendir. NFT çift jhelezon lifleri (PHF) Ģeklindedir. NFT nin en önemli bileģeni protein Tau ile iliģkili olan mikrotübüllerdir. Tau nun hiperfosforilasyonu anormal bir Ģekilde toplanmasına ve katlanmasına yol açarak AD ında nöronlara etki eden bu proteinin fonksiyonlarında bozulmaya yol açar (Lü et al. 2010). ROS Tau nun fosforilasyonuna aktif bir Ģekilde katılmaktadır. Nöronal hücre ölümüne yol açmaksızın hemoksijenaz ın aktive edildiği hafif oksidatif stres oluģturulmuģ in vitro modelde, ROS nin zamana bağlı olarak PHF1 in epitopunda serin 399/404 pozisyonuda Tau proteininin fosforillenmesiyle iliģkili olduğu görülmüģtür (Li et al. 2013). AraĢidonik asitin peroksidasyon ürünü olan akrolein, insan nöroblastoma hücreleri ile primer fare embriyosu kortikal nöron kültürlerinde PHF-1 in antikoru olan alan üzerinden Tau proteininin fosforilasyonunu artırmaktadır (Gomez-Ramos et al. 2003). Buna ek olarak c-jun-terminal kinazlar ile p38 in aktivasyonu ve PP2A nın inaktive olması kronik oksidatif stres Ģartları altında Tau proteininin fosforilasyonu ile iliģkilidir (Lü et al. 2010).

47 23 Alzheimer Addison Huntington Amitropik Lateral Hastalığı Hastalığı Hastalığı Sklerozis ROS ROS ROS ROS JNK P38 PP2A BACE1 β-sekretaz Tau Aβ1-42 αsyn mhtt TDP-43 Katlanma Ca +2 Katlanma Katlanma Katlanma Nox Agregasyon Agregasyon Agregasyon Agregasyon Prx ROS ROS ROS ROS Hücre Disfonksiyonu ve Ölümü ġekil 1.8. ROS nin nörodejenaratif hastalıkların altında yatan katlanmıģ ve agrege olmuģ proteinlerle iliģkisinin gösteriliģi (Li et al. 2013) Nörodejeneratif hastalıklarda yaygın bir özellik olarak AD için beta amiloid (Aβ), ve Tau, PD ında alfa-sinüklein (αsyn), HD ında mutant huntingtin protein (mhtt), ALS hastalığında TAR DNA bağlayıcı protein (TDP-43) gibi düzenleyici proteinler rol almaktadırlar. ROS bu düzenleyici proteinleri okside ederek modifiye etmek suretiyle

48 24 nörodejeneratif hastalıkların her biri için nörotoksisite aracı olarak hareket etmektedirler (Li et al. 2013). AD ında ROS, c-jun-terminal kinazlar ile p38 i aktive ve PP2A yı inhibe edebilirler. JNK ve p38, Tau proteininin salınımını artırmak suretiyle PP2A nın inhibisyonuna sebep olur. JNK ve p38 in aktivasyonu AβPP bölünmesini teģvik eden enzim 1 (BACE1) i aktive eder. Bu enzim Aβ1-42 nin birikmesine yol açar. Aβ1-42 ise süperoksit radikallerini üretmek amacıyla NADPH-oksidaz (Nox) ın aktivasyonunu sağlayarak uyarıcı nörotoksisite ortaya çıkarmak için hücre içine Ca 2+ akıģını artırır. HD ında mhtt nin birikmesi peroksiredoksinin inhibisyonuna yol açabilir. Yukarıda anlatılan etki ve iliģkiler ağı yoluyla katlanmıģ proteinlerin salınımı ve agregasyonunun artması daha fazla ROS oluģumuna yol açarak hücre disfonksiyonu ve ölümüne yol açabilmektedir (Li et al. 2013) Oksidatif stres ve hastalık iliģkisi Canlı sistemlerde meydana gelen bütün fizyolojik olaylar; enzim, hormon ve iz elementleri gibi farklı ajanlar tarafından yönetilen oksidasyon ve indirgenme reaksiyonlarının kompleks kombinasyonlarını içerir (Cuttler 1984). Oksidasyon, bir atom ya da molekülün bir alıcıya elektron vermesi ile meydana gelen yükseltgenme iģlemidir. Yükseltgenme potansiyeli yüksek olan madde yükseltgenirken diğer madde indirgenir. Ġnsan vücudunda ve besinlerde bulunan lipitler, proteinler, karbonhidratlar, nükleik asitler de oksidasyona uğrayabilmekte ve canlı organizma için zararlı olabilecek oksidasyon ürünleri oluģabilmektedir. Bu durum intrasellüler reaktif türlerinin konsantrasyonunun artmasıyla karakterize olan ve antioksidan savunma sisteminin düģmesiyle eģleģtirilen oksidatif stres olarak ifade edilir (Papas 1996; Çetinkaya et al. 2012). Oksidatif stresin antioksidan savuma sistemi ve ROS arasındaki dengesizlik olarak tanımlanması ve ROS nin besinler üzerinde ağır etkilerinin bulunması dolayısıyla, ROS

49 25 kanseri de içeren birçok farklı kronik hastalık ile iliģkilendirilmiģtir (Mayne 2013). Canlı sistemlerde bulunan redoks dengesindeki herhangi bir değiģiklik, hücrelerin ve dolayısıyla dokuların fonksiyonlarının bozulmasına sebep olur ve bu durum zamanla ölümle sonuçlanabilir (Cuttler 1984). Çizelge 1.2 de gösterilen reaktif oksijen ve azot türleri oksidatif strese en çok sebep olan temel faktörlerdendir (Aruoma and Cuppet 1997; Kaya 2006). Çizelge 1.3. Endojen kaynaklı oksidatif stres oluģturucuları Radikallerin sızması Membrana bağlı enzimler NADPH oksidaz Oksijen aktivasyonu Elektron transport sistemleri Çözünebilir hücre bileģenleri Ksenobiyotik metabolizma enzimleri ROS nin tetiklenmesi ve üretimi Çözünebilir stozolik enzimler Fagositik hücreler Lokal iskemi KarıĢık fonksiyonlu oksidazlar GeçiĢ metalleri, tiyol grupları içeren proteinler, epinefrin, metaloproteinler, flavoprotein ler, demir bağlı proteinler Cyt P450 bağımlı monooksijenazlar Cyt b5 ve NADPH bağımlı stokrom redüktazlar Ksantin oksidazlar, süperoksid dismutaz, katalaz Ġnflamasyon, solunum patlaması, toksik moleküllerin uzaklaģtırılması ile iliģkili nötrofiller, makrofajlar ve monositler. Akut kan kaybı Günümüzde dünya kardiyovasküler hastalıklar, kanser gibi sağlıkla negatif iliģkili hastalıklar ile karģı karģıyadır. Diyabet gibi bazı metabolik hastalıklar lipoprotein oksidasyonu ile iliģkilidir. Merkezi sinir sistemi küçük total antioksidan kapasite değiģiminde bile serbest radikal hasarına karģı oldukça duyarlı hale gelir. Dokularda üretilen ROS lipidler, proteinler, nükleik asitler gibi makromoleküllere hasar verebilir. Lipid peroksidasyonu bir kez baģladı mı zincir reaksiyonları Ģeklinde cereyan eder. Bu yüzden lipid peroksidasyon ürünleri olan MDA, 4-hidroksi-2-nonenol ve F2- izoprastanlar biyolojik sistemlerde birikir. DNA bazları da ROS ne karģı çok hassastırlar. İn vivo olarak DNA oksidasyon ürünlerinden olan 8-hidroksi-2- deoksiguanozin (8-OHdG) belli oranda artarak kolaylıkla ölçülebilir. DNA nın oksidasyonu mitokondri ve çekirdek DNA sında mutasyonlara sebep olabilir. ROS nin

50 26 baģlıca kaynaklarından sorumlu organellerden biri olan mitokondride DNA tamir mekanizmaları çekirdekteki gibi olmadığından dolayı, oksidatif stresten daha fazla etkilenir. Bu oksidatif modifikasyonlar çeģitli tip proteinlerde enzim aktivitesi ve yapısal özelliklerde değiģimlere yol açar. Benzer Ģekilde transkripsiyon faktörlerinin redoks düzenlemesi DNA bağımlı spesifik aktiviteleri değiģtirebilir. Böylece gen expresyonunun modifikasyonuna yol açar (Rahal et al. 2014). Çizelge 1.4. Oksidatif stres ile pozitif iliģkili ölümcül hastalıklar ve etyolojileri (Rahal et al. 2014). Hastalık Organ Etyolojisi Moleküler dejenerasyon Diyabet Kronik yorgunluk Aterskleroz Otoimmün hastalıklar Nörodejeneratif hastalıklar (Parkinson, Alzheimer) Astım Romatizma ve osteoartrit Nefrit Melanom Miyokard infarktüsü Gözler Çoklu Organ Çoklu organ Kan damarları Ġmmün sistem Beyin Akciğer Eklemler Böbrek Deri Kalp Reaktif oksijen ara ürünleri (ROI) Süperoksid dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz C-reaktif protein Redükte NADPH oksidaz sistemi R O nükleoprotein Reaktif oksijen türleri Reaktif oksijen türleri ve özellikle H 2 O 2 Radikal oksijen türleri Glutatyon transferaz kappa 1 (GSTK1-1) DNA hasarı ve lipid peroksidasyonu (LPO) içeren patofizyolojik süreçler Reaktif oksijen türleri Serbest radikaller doğal bir Ģekilde yaģayan sistemlerde mevcuttur. Son yıllarda yapılan çalıģmalar, artmıģ oksijen serbest radikallerinin ve lipid peroksidasyonunun, birçok hastalığın patogenezinde rol aldığını göstermektedir (Altan et al. 2006). Bu radikallerin yüksek konsantrasyonları yaģlanma, kanser, kardiyovasküler hastalıklar, ateroskleroz, nörolojik hastalıklar, cilt lezyonları, diyabet, romatoid artrit ve inflamasyon gibi hasarlara yol açan süreçlerde biyomoleküllerin oksidasyonuna sebep olabildiğinden dolayı bu hastalıklarla doğrudan veya dolaylı sorumlu olduğu ortaya konmuģtur (Altan et al. 2006; Bursal and Gülçin 2011; Çetinkaya et al. 2012). Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikaller, organizmanın doğuģtan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak tanımlanabilecek bir çizgide tutulmaya çalıģılır. Prooksidant ve antioksidant arasındaki denge prooksidant aktiviteye

51 27 doğru kaydığında fonksiyonel dokuların hasarına sebep olan oksidatif strese yol açar (Bursal and Gülçin 2011). Çizelge 1.5. Farklı sınıflara ait prooksidantlar ve oksidatif stres geliģimindeki etki mekanizmaları (Rahal et al. 2014) Ġlaçlar -Kanser (metotreksat) ve analjezik (parasetamol) gibi ilaçlar ROS baģlıca akciğer ve böbrek dokularında ölümcül hasara yol açan makromolküllerde değiģikliklere yol açar. GeçiĢ metalleri -Mg, Fe, Cu, Zn v.b. ROS üreten Haber-weis ve Fenton reaksiyonlarını tetikleme Kronik Mg prooksidant bir hastalıktır. Cu dan dolayı Wilson hastalığı ve yüksek Fe den dolayı hemokromatoz hastalığı Pestisidler -BHC, DDT v.b Serbest radikal üretimi, lipid peroksidasyonunda artıģ, glutatyon redoks sistemi ve antioksidant enzim aktivitelerinde değiģiklikler Fiziksel egzersiz -KoĢma, ağırlık kaldırma Kas kasılması ve gevģemesinde ROS üretimi, aģırı egzersiz aģırı ROS üretimi Zihinsel bozukluk -Gerginlik, endiģe Redoks sistemi dengesizliği nöroinflamasyon nörodejenerasyon, mitokondriyal disfonksiyon, nöronal sinyallerde değiģme, nöron oluģumunda gerileme Patofizyoloji -Lokal iskemi Artan ROS üretimi Çevresel faktörler -AĢırı sıcak, soğuk, sigara v.b Antioksidanlar -Askorbik asit, vit. C, polifenoller v.b. Adaptasyon esnasında mitokond riyal membran akıģkanlığında azalma, elktron transportunda bozulma, artan ROS üretimi Ağır metallerin varlığı gibi Ģartlar altında prooksidant molekül olarak hareket etme Vücutta ölümcül kötü hastalıkların ilerlemesinin hücre canlılığını ve farklılaģmasını sağlayan genlerin mutasyonlarındaki artıģla meydana geldiği düģünülmektedir. ROS aerobik hücrelerde normal Ģartlarda üretilmekte ve antioksidan sistemler tarafından elimine edilmektedir. ROS aynı zamanda DNA hasarı, mutasyonu ve tamir mekanizmalarını olumsuz etkilemek suretiyle genotoksik stres meydana getirirler (Chung et al. 2014). Konu ile ilgili yapılan çalıģmalarda ROS nin akut miyeloid ve kronik lösemide arttığı tespit edilmiģtir. Yine metabolik sendromlu hastalarda oluģan hematopoietik hücrelerde ROS ve DNA hasarının arttığı görülmüģtür (Chung et al. 2014).

52 28 Damarlar Ateroskleroz Vazospazm Hepatit Karaciğer Hasarı DiĢler Periodontis Çoklu organ patolojisi Kanser Göz Katarakt oluģumu Retinal hasar Cilt Dermatit, YaĢ pigmenti ROS Beyin Travma, Ģok, nörodejeneratif hastalıklar Eklemler Artrit Akciğer Astım, hiperoksi ġekil 1.9. ROS nin sebep olduğu bazı hastalılar Ayrıca Parkinson ve Alzheimer gibi sinir hücrelerinin harabiyeti sonucu ortaya çıkan norodejenaratif hastalıkların patogenezinde oksidatif stresin rolü olduğu ortaya konulmuģtur. Dolayısıyla sinir hücrelerinin disfonksiyonu ve ölümünün geliģmesinde oksidatif stresin patojenik olarak önemli rol oynadığı ileri sürülmektedir (Yan et al. 2013) Antioksidan Savunma Sistemleri ve Antioksidanlar Serbest oksijen radikallerinin oluģumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta bazı savunma mekanizmaları geliģtirilmiģtir. Bunlar antioksidan savunma mekanizmaları olarak bilinirler (Çizelge 1.6). Antioksidan moleküller endojen ve eksojen kaynaklı yapılar olup, oluģan oksidan moleküllerin neden olduğu hasarı hem hücre içi hem de hücre dıģı savunma ile etkisiz hale getirirler. Hücre dıģı savunma, albümin, bilirubin, transferin, seruloplazmin, ürik asit gibi çeģitli molekülleri içermektedir. Hücre içi serbest radikal toplayıcı enzimler asıl antioksidan savunmayı sağlamaktadır. Bu enzimler süperoksid dismutaz (SOD), Glutatyon-S-transferaz, glutatyon peroksidaz (GSH-Px), glutatyon redüktaz, katalaz ve

53 29 stokrom oksidazdır. Bakır, çinko ve selenyum gibi eser elementler ise bu enzimlerin fonksiyonları için gereklidir (Altan et al. 2006). Çizelge 1.6. Antioksidan savunma sistemleri (Gülçin 2002; Huyut 2007) Giderici Antioksidanlar Askorbik asit α-tokoferol Tiyoller β-karoten Ürik asit Flavonoidler CoQ10 Fenolik bileģikler ANTĠOKSĠDAN SĠSTEMLER Enzimatik Sentetik Antioksidanlar Antioksidanlar Katalaz N-asetilsistein Paraoksonaz Allopurinol SOD Probakol GSH-Px Penisilamin Ksantin oksidaz Deferoksamin NADPH oksidaz Bütil-Hidroksitoluen Glutatyon redüktaz BHT, BHA, TBHQ Miyeloperoksidaz Tokoferol, Troloks Önleyici Antioksidanlar Transferin Albumin Seruloplazmin Ferritin Histidin Metiyonin Sistein Tiyoredoksin Serbest radikallerle ilgili yukarıda ifade edilen bilgilere de bakıldığında antioksidan savunma kapasitesinin geliģtirilmesine ve muhafazasına yönelik çalıģmaların önemi oldukça artmıģtır. Lipit peroksidasyonu, gıda maddelerinin iģlenmesinde ve muhafazasında da önemli bir sorun oluģturmaktadır. Lipit peroksidasyonu yağlarda ve yağlı yiyeceklerde sadece yiyecekleri bozmakla kalmaz, aynı zamanda kansere, mutasyonlara ve yaģlanmaya sebep olan peroksi (ROO ٠ ) ve hidroksil (OH ٠ ) radikalleri ile aktif oksijen türlerini ve serbest radikallerini de meydana getirir (Yagi 1987). Tıpta, biyolojide, toksikolojide ve gıdaların bozulmasında serbest radikaller gittikçe artan yoğun bir ilgi alanına sahip olmaktadır. Lipit peroksidasyonunun radikalik zincir reaksiyonları, gıda endüstrisinde imalat prosesleri boyunca karģılaģılan en önemli sorunlardan biridir. Ġmalatçılar, antioksidanları kullanarak, lipit içeren gıdaların oksidasyonunu minimize etmeyi hedeflerler. Bunun yanısıra biyomedikalciler ve klinisyenler de vücudu, reaktif oksijen türleri tarafından oluģan hasara karģı korudukları için antioksidanlara ayrı bir ilgi duymuģlardır (Aruoma 1993).

54 30 Antioksidanlar yaģam organlarına saldıran ROS türlerinin saldırıları tarafından zarar verilen biyomoleküllerin hasarını kendine özgü bir yol ile minimize eden moleküllerdir (Çetinkaya et al. 2012). Antioksidanlar serbest radikallerin neden olduğu zararlı etkileri düģük yoğunluklu lipoproteinleri (LDL) ve lipoprotein oksidasyonunu önleyerek sağlık üzerinde olumlu etkiler oluģturmaktadırlar (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Bütün aerobik organizmalar zarar verici molekülleri modifiye etmek veya kaldırmak için kendi antioksidan savunma mekanizmalarına sahiptirler (ġerbetçi Tohma and Gülçin 2010). Antioksidanlar lipid moleküllerinin oksidatif hasarını geciktirmek suretiyle yiyeceklerin kalitesinin muhafaza edilmesinde önemli rol oynarlar (Çetinkaya et al. 2012). Antioksidanlar serbest radikaller ve lipid peroksitlerini üreten lipid peroksidasyon zincir reaksiyonlarını inhibe eder. Antioksidanlar toplayıcı, bastırıcı, onarıcı ve zincir kırıcı olmak üzere dört farklı Ģekilde fonksiyonlarını icra ederler. Antioksidant bileģiklerin hidrojen atomu vermesi veya metal Ģelatlama özelliklerinden dolayı serbest radikallerin oksidan etkileri yok edilebilir (Bursal et al. 2011). Antioksidanlar, oksidasyonu inhibe ederek erteleme görevini yapmakta, ancak oksidasyonu tamamen engelleyemeyen maddeler olarak ifade edilmektedir (Sherwin 1990). Farklı oksidasyon reaksiyonlarını düzenleyen ve dokularda doğal bir Ģekilde bulunan antioksidan bileģikler, uzun ömürlü determinantların potansiyel bir sınıfı olarak değerlendirilmektedir. Antioksidan bileģiklerde veya antioksidant telafi (kompensatör) sistemlerinde bulunan bazı komponentlerin endojen sentezindeki herhangi bir yetersizlik, farklı hastalıkları meydana getirebilir (Kaya 2006 ). Antioksidanlar için değiģik sınıflandırmalar mevcuttur. Örneğin askorbik asit gibi indirgeyici ajanlar, karoten gibi antioksidanlar ile antiradikal ve primer antioksidanlar olmak üzere üç sınıfa ayrılabilmektedir. Ayrıca primer veya radikalik zincir reaksiyonu parçalayan antioksidanlar ile radikalik zincir reaksiyonları baģlatıcılarını indirgeyen antioksidanlar olmak üzere iki sınıfa da ayrılabilir (Moure et al. 2001). Antioksidanlar, doğal (endojen) ve dıģ (eksojen) kaynaklı antioksidanlar olmak üzere iki ana gruba ayrılabildiği gibi serbest radikalin meydana geliģini önleyenler ve mevcut olanları etkisiz hale getirenler diye de iki guruba bölünebilmektedir. Ayrıca enzim olanlar ve olmayanlar olarak da sınıflandırılabilirler. Doğal antioksidanlar polifenoliklerde olduğu

55 31 gibi kinon veya lakton yapısındaki bileģikler olmasına rağmen, sentetik antioksidanlar genellikle fenolik yapıdadırlar (Houlihan and Ho 1985). Çizelge 1.7 de görüldüğü gibi bazı kaynaklarda ise antioksidanlar, vücut içi ve besin kaynaklı antioksidanlar olarak ikiye ayrılmıģtır. Çizelge 1.7. Antioksidanların sınıflandırılması (Gülçin 2002). ANTĠOKSĠDANTLAR Endojen Kaynaklı Eksojen Kaynaklı Enzimler Küçük Moleküller Sentetik Doğal Katalaz Peroksidaz Süperoksit dismutaz Glutatyon peroksidaz Glutatyon redüktaz Askorbik asit Glutatyon Ürik asit Metal bağlayıcılar Tiyoredoksin BHA BHT TBHQ Propilgallat Kuersetin Tokoferoller Karotenler Fenoller Flavonlar Katekinler Sentetik antioksidanlar En popüler sentetik antioksidanlar bütillenmiģ hidroksianisol (BHA), bütillenmiģ hidroksi toluen (BHT), tert-bütil hodrokuinon (TBHQ) ve propilgallat (PG) molekülleridir. Bu bileģikler yaygın bir biçimde yiyeceklerde ve farmakolojik uygulamarda kullanılmıģtır. Sentetik antioksidanlar katı ve sıvı yağlarda çözünürlüklerini artırmak için daima alkillerle birleģirler (Gülçin 2012). Sentetik antioksidanlar da farklı Ģekillerde sübstitüe olmuģ alkil gruplarına sahip fenolik yapıdaki bileģiklerdir. Bunlardan en yaygın olarak kullanılanları ise BHAve BHT dir (Taylor and Richardson 1980). Antioksidanlar lipid ve lipid içerikli yiyeceklere ilave edildiği zaman lipid peroksidasyon sürecini geciktirdiğinden dolayı gıdaların raf ömrünü uzatırlar (Gülçin et al. 2011). Ancak ticari olarak kullanılan antioksidanlar genelde sentetik antioksidanlardır. BHA, BHT, PG, gallik asit, TBHQ gibi sentetik antioksidanlar gıdalarda yaygın Ģekilde kullanılmıģtır (Ak and Gülçin 2008; ġerbetçi Tohma and Gülçin 2010; Gülçin 2012).

56 32 OH OH OH COOC 3H 7 OCH 3 CH 3 OH HO OH BHA BHT TBHQ PG OH ġekil En popüler sentetik antioksidanların molekül yapıları (Gülçin 2012). Kullanılan dört ana sentetik antioksidanlar yiyecek uygulamarında pratikte katı ve sıvı yağ içeriğinin %0,02 si ile sınırlandırılmıģtır. Sebze yağları için en uygun sentetik antioksidan TBHQ dur. BHA ve BHT ısıya dayanıklı olduğu için piģirilmiģ ve kızartılmıģ yağların stabilizasyonunda kullanılır. BHA ve BHT gibi bazı antioksidanlar sinerjik etkilerinden dolayı kombine Ģekilde kullanılmıģtır. BHA aynı zamanda PG ile sinerjik etki ortaya koyar (Gülçin 2012). Ancak BHA ve BHT gibi sentetik antioksidanlar farklı Ģüpheli toksik ve karsinojenik etkilerinden dolayı kullanımları sınırlandırılmıģ ve bunun yerine bitkisel kaynaklı antioksidanların kullanımına ve keģfedilmesine artan bir ilgi meydana gelmiģtir (Ak and Gülçin 2008; ġerbetçi Tohma and Gülçin 2010; Gülçin 2012). Besin kaynaklı antioksidanlar enzim yapısında değildirler ve genellikle fenolik ve nonenzimatik yapıdaki bileģiklerdir. Bu tür bileģiklerin büyük bir kısmı in vivo ve in vitro olarak antioksidan özellik gösterirler (Fuhrman et al. 1995) Doğal kaynaklı antioksidanlar Doğal kaynaklı antioksidanlar tahıl ve baklagillerde, meyvelerde, Ģifalı bitkilerde ve bitki kaynaklı içeceklerde bol miktarlarda bulunurlar (Foo and Porter 1981). Bitkisel kaynaklardan elde edilen antioksidanların genelikle aģağıda yazılan yapılarda olduğu görülmüģtür (Larson 1988; Hudson 1990; Gülçin 2002).

57 33 Tokoferoller, flavonoidler, karotenler, alkaloidler, klorofiller, proteinler, amin gibi azotlu bileģikler Polifonksiyonlu organik asitler Fenolik asit gibi fenolik bileģikler. Ġnsan diyetinde ROS ni temizleme özelliği gösterilen çok sayıda antioksidant vardır. Diyetteki antioksidanların en önemli sınıfları arasında askorbik asit (vitamin C), tokoferoller, karotenoidler ve flavonoidler vardır. Vitamin C den farklı olarak bu antioksidant sınıflarının her biri yapısal özelliği farklı çok sayıda bileģiklerden oluģmaktadır. Örneğin insan diyetinde son 50 yılda 60 farklı karotenoid olduğu tespit edilmiģtir. ġimdilik açıklanması zor olan diyetteki çok sayıda farklı antioksidan bileģiklerin sinerjik etkileri söz konusu olabilir. Askorbik asit doğal antioksidanlar arsında en güçlü ve en az toksik olanıdır. Vitamin C bitkilerde ve yiyeceklerde yüksek miktarlarda bulunan suda çözünen bir vitamindir. Tipik olarak oksidantlar ile reaksiyona girer. Askorbik asit elektron transfer etmek suretiyle radikalik zincir reaksiyonlarını sonlandırır. Vitamin C tek bir elektron tranfer ettiğinden dolayı özeldir. Askorbik asit etkili bir indirgeyici moleküldür. Protonları uzaklaģtırılmıģ konjuge bazının iki önemli rezonans yapısı ve hidroksil gruplarından dolayı tipik hidroksil gruplarına kıyasla daha fazla asidiktir. BaĢka bir deyiģle askorbik asit enol olarak kabul edilebilir ve protonu uzaklaģtırılmıģ formu ise stabil yapıdaki enolattır (Gülçin 2012). ġekil Askorbik asitin deprotonizasyonu ve enolat oluģumu (Gülçin 2012) Ġnsan plazması yaklaģık 60 µmol askorbat içerir. ROS ile etkileģmesi sonucunda vitamin C askorbil serbest radikali ara ürünü ve devamında dehidroaskorbata okside

58 34 olur. ġekil 1.12 de görüldüğü gibi dehidroaskorbat, dehidro askorbat redüktaz enzimi tarafından askorbik asite dönüģtürülür NADP + GSH Dehidro H 2 O Askorbik Asit NADPH-oksidaz Dehidroaskorbat oksidaz Askorbik asit oksidaz Askorbik NADP + H + GSSG Asit H 2 O 2 ġekil Askorbik asit in dehidroaskorbata dönüģüm mekanizması (Gülçin 2012) Bundan dolayı dehidroaskorbat askorbik asite kıyasla daha düģük düzeylerde bulunur. ROS nin temizleyicisi olarak askorbik asit süperoksit anyon radikali, H 2 O 2, OH ve singlet oksijene karģı etkili olduğu görülmüģtür. Askorbik asitin sulu çözeltileri verimli bir Ģekilde RNS ni de temizleyebilmektedir. Diyetteki en önemli askorbik asit kaynakları narenciye, kivi, kavun, kiraz gibi meyveler ile domates, brokoli, karnabahar, yeģil yapraklı sebzelerdir. Brüksel lahanasının taze 100 g ında 100 mg askorbik asit bulunmaktadır. Yapılan bir çalıģmada taze 100 g liyofilize kivi meyvesinin 105 mg askorbat içerdiğini ortaya koymuģlardır (Bursal and Gülçin 2011). Sentetik olarak 100 mg ve aģağı askorbat değerlerinin yiyeceklerdeki askorbik asit e eģdeğer olduğu söylenebilir (Gülçin 2012). Vitamin E tarafından lipid peroksidasyonun inhibisyonu ile oluģan tokoferoksil radikallerinin yeniden tokoferole dönüģmesi ile ilgili in vitro olarak vitamin C iliģkili çalıģmalar yapılmıģtır (Niki et al. 1982; 1985). ROO + TocOH ROOH. + TocO. TocO. + Askorbik asit TocOH + Askorbat

59 35 Tokoferoller vitamin E aktivitesine sahip olan kimyasal bileģiklerin bir sınıfıdır (Gülçin et al. 2005a). Antioksidan olarak yaygın kullanılan bileģikler içinde tokoferoller en iyi bilinen antioksidanlardır. Tokoferoller tokoferol ve tokotrienoller olmak üzere iki ana sınıfa ayrılmıģtır. Her bir sınıf da kendi içinde a,b,c,d olmak üzere 4 izomere sahiptir (Gülçin 2012). Tokoferoller serbest radikalleri indirgemek için bir hidrojen atomu verebilen OH gurubu ve biyolojik membranı geçebilen hidrofobik bölgesi ile kromal halka özelliğine sahiptir (Burton and Ingold 1981). Tokoferoller Tokotrienoller α-tokoferol β-tokoferol γ-tokoferol δ-tokoferol R 4 R 5 R 7 R 8 R 4 R 5 R 7 R 8 H CH 3 CH 3 CH 3 H CH 3 CH 3 CH 3 H CH 3 H CH 3 H CH 3 H CH 3 H H CH 3 CH 3 H H CH 3 CH 3 H H H CH 3 H H H CH 3 ġekil Tokoferol ve tokotrienollerin sınıflandırılması (Gülçin 2012). Tokoferoller hemen hemen bütün yiyeceklerde az da olsa bulunmaktadır. Genelde vitamin E sebze yağlarında, fındık, tohum ve tahıllarda yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Bu gurubun en önemlisi α-tokoferoldür ve yemeklik yağlardaki diğer tokoferollerden daha düģük antioksidan aktiviteye sahiptir. α-tokoferol suda çözünen bir antioksidandır. Lipid peroksidasyonunu inhibe etmesine ek olarak hücre içi bazı etkilere de sahiptir. α-tokoferol hücre dıģ membranı ve organellerinde bulunan suda çözünür bir vitamindir (Gülçin 2012). α-tokoferoller lipid peroksil radikallerine hidroksil gruplarından bir hidrojen vermek suretiyle antioksidan olarak hareket ederler.

60 36 Bir tokoferol ile bir radikalin dönüģtürülmesi tokoferolün aromatik halka yapısında yalnız kalan elektronun delokalizasyonu ile stabilize edilir (Diplock et al. 1998). Tokokuinon Tokoferol peroksit ġekil α-tokoferolün radikal giderme mekanizması (Gülçin 2012). Bu bileģik yüksek oranda lipofiliktir ve membranlar ile lipoproteinlerde görev yapar. Onların antioksidan olarak en önemli fonksiyonları tokoferoksil radikalleri ve lipid hidroperoksitlerini vermek üzere lipid peroksil radikallerini temizleyerek lipid peroksidasyonunun inhibisyonunu sağlamalarıdır (Diplock et al. 1998). Tokokuinon ve tokoferol dimerleri tarafından indirgenebilen peroksillerin bu radikal formları nonradikal ürünlerdir. α-tokoferol aynı zamanda hidroperoksitlerin ayrıģmasını geciktirmesi ile de iliģkilidir. Etminan et al. (2005) α-tokoferolün Parkinson hastalığına karģı koruyucu etki gösterdiğini rapor etmiģlerdir. Tokoferol eksikliği spinoserebellar ataksi ve nöropati gibi nörolojik problemlere sebep olmaktadır. Katı ve sıvı yağlar ile lipoproteinlerde tokoferollerin elektron verme gücü δ> β = γ > α Ģeklinde sıralanmıģtır. Tereyağı triaçilgliserolleri içindeki α-tokoferolün antioksidan gücü γ-tokoferollerden daha düģük bulunmuģtur (Gülçin 2012). Doğal antioksidanlar hemen hemen bütün bitkilerde, organizmalarda, mantarlarda ve hayvan dokularında bulunur (Pokorny 1999). Fenolik bileģikler bitki kökenli yiyecek

61 37 ürünlerini de içeren tüm bitki materyallerinde doğal olarak bulunan ikincil bitki metabolitleridir (Gülçin 2006a). Bu bileģiklerin insan ve hayvan diyetlerinin ayrılmaz parçası olduğu düģünülmektedir. Doğal antioksidanların en önemlisi fenolik bileģiklerdir ve doğal antioksidanların en önemli grubunu oluģturmaktadır. Fenolik asitler, flavonoidler ve tokoferoller olarak sınıflandırılan fenolik bileģiklerden flavonoidler bitkilerdeki en yaygın bileģendir. ÇeĢitli bitki türlerinde tanımlanmıģ 4000 den fazla flavonoid ve 8000 den fazla fenolik asit türevi bulunmuģtur ve hala da gün geçtikçe bulunmaya devam etmektedir. Bu maddeler Becher in raporunda ifade ettiği gibi bitki yaprakları, sapları, kökleri, meyve ve tohumları gibi bitkilerin hemen hemen tüm bölümlerinden izole edilmiģtir (Becher 1999). Flavonoidler bitkilerde melonat, trozin ve fenilalanin gibi aminoasitlerden sentezlenir. Susam yağı, sesamol gibi birçok doğal antioksidan içerir. Susam yağı, susam tohumlarından elde edilmiģ yenebilir bir bitkisel yağdır. Bunun yanısıra Güneydoğu asya mutfağında daha az olmak üzere Hindistan, Çin, Japonya ve Kore gibi ülkelerde lezzet artırıcı piģirme yağı olarak kullanılır (Gülçin 2012). Antioksidanlar farklı radikal ve oksidan kaynaklara farklı cevaplar verebilir. Örneğin karotenoidler, fenolikler ve diğer antioksidanlara kıyasla peroksil radikallerinin iyi temizleyicisi değillerdir. Ancak farklı bir özellik olarak singlet oksijeni temizlemede diğer antioksidanlardan daha fazla etkilidirler (Gülçin 2012). Karotenoidler bitkikerde denovo sentez ile meydana gelen doğal yağlarda çözünen bileģiklerin bir sınıfıdır ve belirgin antioksidan aktiviteye sahip doğal renklendiricilerdir (Rodriguez-Amaya et al. 2008) Karotenoidler insan diyetindeki en önemli mikrobesin sınıfındandır. Kimyasal yapılarından dolayı önemli antioksidan potansiyeline sahiptir. Ġnsan organizmasında karotenoidler de savunma sisteminin bir parçasıdırlar. Kantitatif olarak insan diyetindeki en önemli karotenoidler β-karoten, likopen, lutein, β-kriptoksantin, zeaksantin ve astaksantindir. Çok sayıda gözlemsel çalıģmalar karotenoidler, vitamin E veya metabolitleri gibi antioksidanların kardiyovasküler hastalıklarla iliģkili olduğu hipotezini desteklemektedir. Karotenoidler sebze ve meyvelerin renginden sorumlu renk

62 38 pigmentleridir. Likopen domatesin kırmızı renginden sorumludur. Onun rengi konjuge karbon çift bağlarından gelir. Her bir çift bağ yüksek enerjili duruma geçmek için elektronlar için enerji gereksinimini azaltır. ġekil 1.15 de bazı karotenoidlerin kimyasal yapısı gösterilmiģtir. Beta-karoten Beta-kriptoksantin Lutein Zeaksantin Astaksantin ġekil Bazı karotenoidlerin kimyasal yapıları (Gülçin 2012) Likopen karpuz, papaya, pembe greyfurt ve diğer kırmızı renkli diğer meyve türleri ve domateste bol bulunan karotenoid pigmentidir. β-karoten kırmızı-turuncu renkli meyve sebzelerde bol miktarda bulunan ve söz konusu meyve ve sebzelere rengini veren bir bileģiktir. β-karoten organik bir bileģiktir ve kimyasal olarak hidrokarbon sınıfına dahil edilmiģtir (Gülçin 2012). β-karoten geranil pirofosfattan sentezlenir ve karotenlerin bir üyesidir. Karotenler 40 karbona sahip 8 izopren biriminden meydana gelmiģ tetraterpenlerdir. Karotenlerin bu sınıfı içinde β-karoten molekülün her iki ucundaki beta halkalarına sahip olması nedeniyle biraz farklı bir moleküldür (Susan and Arnum 1998). β-kriptoksantin doğal bir karotenoid pigmentidir. β-kriptoksantin çeģitli bitki yaprak ve çiçekleri de dahil olmak üzere portakal kabuğu, papaya, yumurta sarısı, tereyağı, elma ve sığır serum undan izole edilmiģtir. Lutein doğal olarak bulunan ve en çok bilinen bir karotenoiddir. Ispanak ve lahana gibi yeģil yapraklı sebzelerde bol miktarda bulunur.

63 39 Aynı zamanda lutein yumurta sarısı, hayvansal yağlar ve retinada bulunur. Zeaksantin gözün retinası içinde yer alan iki temel ksantofil karotenoidlerinden biridir. Zeaksantin merkezi makulada baskın bir bileģendir. Aynı zamanda periferal retinada da baskındır. Adı zea mays a yeģil renk veren pigment olması sebebiyle, zea mays dan türemiģtir. Birçok karotenoidler gibi Zeaksantin renkli ve suda çözünebilen bir bileģiktir. Zeaksantin somon, kerevit, kabuklular, karides, alabalık, bazı kuģların tüyleri ve mikroalglerde bulunur (Gülçin 2012). Bazı karotenoidlerin aksine Astaksantin insan vücudunda vitamin A ya dönüģtürülemez. Vitamin A nın fazlası insan vücudu için çok toksik olmakla birlikte, astaksantin daha az toksiktir. Onun diğer karotenoidlere göre antioksidan aktivitesi daha düģüktür (Mortensen and Skibsted 1997). Karotenoidler fotooksidatif süreçlere karģı bitkileri koruyucu rol üstlenir. Onlar singlet oksijen ve peroksil radikallerini etkili bir Ģekilde temizleme gücüne sahiptirler. Doğal antioksidanlar tüketiciler tarafından daha fazla tercih edilmektedir ve sentetik katkı antioksidanlarından daha kolay yasama izni elde edilebilir. Ancak bir yiyecekte bir maddenin fazla bulunması onun hiç toksik etkisi olmayacağı garantisini de vermemektedir (Gülçin 2012). Sentetik antioksidanların mutajenik ve karsiyojenik etkileri test edilmiģtir. Ancak doğal kaynaklı antioksidanlar bu anlamda henüz test edilmemiģtir (Ames 1996). Doğal antioksidanların birçoğu özellikle de flavonoidler çok çeģitli biyolojik etkilere sahiptirler. Meyve ve sebze tüketimiyle kanser ve kalp-damar hastalıkları arasındaki ters orantı meyvelerde bol miktarda bulunan flavonoidlere dayandırılmaktadır (Hertog et al. 1993). Çizelge 1.8 de sentetik ve doğal kaynaklı antioksidanların avantaj ve dezavantajları maddeler halinde gösterilmiģtir. Çizelge 1.8. Yiyeceklerde yaygın olarak kullanılan sentetik ve doğal antioksidanların avantaj ve dezavantajları (Gülçin 2012) Sentetik Antioksidanlar -Ucuzdur. -Yaygın olarak uygulanmaktadır. -Orta ve Yüksek antioksidan aktivite gösterir. -Artan güvenlik kaygıları vardır. -Bazılarının kullanımı yasaklanmıģtır. -DüĢük oranda suda çözünürlük. -Azlan ilgi -Bazıları adipoz dokuda birikir. Doğal Kaynaklı Antioksidanlar - Pahalıdır. - Bazılarının kullanımı sınırlıdır. - GeniĢ bir aralıkta antioksidan aktivite gösterir. - Zararsız maddeler olarak algılanmaktadır - Artan kullanım ve geniģleyen uygulama alanları - GeniĢ çözünebilir aralığa sahip - Artan ilgi - Tamamen metabolize olur.

64 40 Bazı protein ve aminoasitler de antioksidan davranıģ göstermektedirler. Örneğin sistein, metiyonin, histidin, triptofan, lizin aminoasitleri (Taylor and Richardson 1980) ve sülfürlerce zengin olan tiyoredoksin proteini (Buchanan et al. 1994) antioksidan özelliğe sahiptirler Fenolik asit ve flavonoid bileģikler Fenolik bileģikler bitkilerde fazla bulunan sekonder metabolitlerdir. Bu bileģikler serbest radikallerin neden olduğu reaksiyonları durdurarak veya engelleyerek kanser, kalp hastalığı ve akciğer hastalıkları gibi pek çok hastalıkların oluģumuna engel olurlar. Meyvelerde bulunan çeģitli fenolik bileģikler antioksidatif ve antimikrobiyal etkilerinden dolayı sağlık için olumlu katkılarından dolayı fonksiyonel gıda olarak değerlendirilmektedir. Fenolik bileģikler, fenolik asitler ve flavonoidler olmak üzere iki guruba ayrılırlar (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). 1-Fenolik asitler: Hidroksibenzoik (C 7 H 9 O 2 ) ve hidroksisinnamik asitler (C 7 H 7 O 2 ) olmak üzere iki guruba ayrılırlar. Hidroksi benziok asitler C 6 -C 1 fenilmetan yapısında olup bitkisel gıdalarda genelde eser miktarda bulunurlar. Bunlar arasında salisilik asit, m-hidroksi benzoik asit, gallik asit, vanilik asit gibi maddeleri örnek olarak verebiliriz. Hidroksi sinnamik asitler ise C 6 -C 3 fenil propan yapısında olup fenilpropan halkasına bağlanan OH gurubunun konumu ve yapısına göre farklı özellik gösterirler. Kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit, o-kumarik asitler en yaygın olanlarıdır. Bitkilerde büyük kısmı organik asitler ve Ģekerlerle esterleģmiģ halde bulunur (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). 2-Flavonoidler: Flavonoidler bitkisel kaynaklı olarak oluģan fenolik bileģiklerin büyük bölümünü oluģtururlar. Flavonoidler 15 karbon atomundan meydana gelen flavan çekirdeği (C 6 -C 3 -C 6 ) ile karakterizedirler. Bu bileģiklerin temel yapıları üç karbonlu alifatik zincirin A ve B halkalarına bağlanmasıyla furan halkasının piran halkasına dönüģmesiyle meydana gelmektedir. Bu halkalar sırasıyla A, B, C diye

65 41 isimlendirilmiģtir. A, B ve C halkalarındaki fonksiyonel grupların ve çift bağların yerleģimi ile biribirlerinden oldukça farklı özellikte oksidasyon seviyesi farklılıkları gösterirler (Harborne 1986; Gülçin 2012). Fenolik Asitler Benzoik asit türevleri Gallik asit p-hidrobenzoik asit 3,4-Dihidroksibenzoik asit Vanilik asit Siringik asit Protokatekuik asit Sinamik asit türevleri Kafeik asit p-kumarik asit Rozmarinik asit Ferulik asit Sinapik asit Klorojenik asit ġekil Fenolik asit sınıflarından olan benzoik ve sinamik asit türevleri (Gülçin 2012) Flavonoidlerin yapısındaki OH grupları, reaktif özelliklerinden dolayı glikozitlenir. YaklaĢık 6500 farklı flavonoid molekülü bilinmektedir. Bu moleküller yaygın olarak beģ gruba ayrılırlar (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Çizelge 1.9. Fenolik bileģiklerin sınıflandırılması (Nizamlıoğlu ve Nas 2010) Antosiyanidinler Flavonlar Flavononlar KateĢinler Proantosiyanidinler ve flavonollar Palergonidin Siyanidin Peonidin Apigenin Luteolin Krisoeriol Naringin Hesperidin Naringenin KateĢin EpikateĢin GallokateĢin Prosiyanidin Prodelfinidin Delfinidin Petunidin Malvinidin Kamferol Kuersetin Mirisetin Ġzoramnetin EpigallokateĢin

66 42 C halkasındaki pranil grubunda bulunan bir hidroksil gurubu ve karbon atomları arasındaki çift bağın mevcudiyeti ile çeģitli sınıflamalar yapılmıģtır. A ve B halkalarıdaki hidroksil gruplarının yerleģimi her bir sınıfın üyelerini farklı kılar (Musialik et al. 2009). Çizelge Bazı flavon, flavonon, flavonol ve türevleri (Gülçin 2012) (Flavonlar veya Flavonoller) R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Apigenin H H H OH H Krisin H H H H H Luteolin H H OH OH H Datisetin OH H OH OH H Kuersetin OH H OH OH H Mirisetin OH H OH OH OH Morin OH OH H OH H Kamferol OH H H OH H (Flavononlar) Hesperetin H H OH OCH 3 H Naringenin H H H OH H (Flavononol) Taksifolin OH H OH OH H (Ġzoflavonlar) A 5 A 7 R 4 Genistein OH OH OH Genistin OH Oglc OH Daidzein H OH OH Daidzin H Oglc OH Biochanin A OH OH OCH 3 Formononetin H OH OCH 3

67 43 Flavonoidler çok etkili antioksidanlardır ve düģük yoğunluklu lipoproteinlerin oksidasyonunu azaltmak suretiyle kardiyovasküler hastalıklara karģı koruyucu rol üstlendikleri bidirilmiģtir. Aynı zamanda flavonoidlerin diyetimizdeki en önemli antioksidanlar arasında yer aldığı bilinmektedir. Günlük diyetle alım miktarı 100 mg ın üzerindedir (Pietta 2000). Flavonoidlerin en önemli özellikleri arasında oksidatif hastalıklara karģı koruyucu etki oluģturma, çeģitli enzimleri aktive veya inhibe etme yeteneği ile bazı spesifik reseptörleri etkileyebilme yetenekleri olmasıdır (Pietta 2000). Genelde flavonoidlerin etkin antioksidan kapasite gösterebilme yeteneği bazı faktörlere bağlıdır (Gülçin 2012). Metal Ģelatlama kapasitesi molekülün yapısındaki hidroksil ve karbonil gruplarının yerleģimine, serbest radikal giderme aktivitesi bir hidrojen veya elektron verme yeteneğine ve stabil fenoksil radikalinin oluģumuna yol açan çiftleģmemiģ elektronun delokalizasyonuna bağlıdır (Gülçin 2012). ġekil 1.17 de görüldüğü gibi flavonoidlerin metal bağlama alanı için önerilen bölge B halkasındaki katekol alanı ile heterosiklik halkadaki 3-hidroksil-4-okso gurubu ile A halkası arasındaki 3-okso, 4 hidroksil alanıdır (Pietta 2000). ġekil Flavonoidler için önerilen metal bağlama alanı (Gülçin 2012) Fakat en önemli katkı kamferol ve kuersetinin bakır indirgeme kapasitesi karģılaģtırıldığında katekol alanının olduğu görülmüģtür. C halkası içinde karbon atomları arasında bir çift bağın varlığı çiftleģmemiģ elektronun delokalizasyonu için çok önemlidir. Ek olarak antioksidan aktivite 3 ve 5. Pozisyonlarda -OH gruplarının mevcudiyeti ile de iliģkilidir. 4-okso gurubuna bir hidrojenin bağlı olması da kinetik

68 44 yönden eģdeğer kabul edilir (Gülçin 2012). Fenolik antioksidanların aktivasyonu (genellikle ArOH) için kabul edilen iki genel mekanizma olarak bir hidrojen transferi (HAT) (Wright et al. 2001) ArOH ArO. + H. veya bir proton transferini takiben bir elektron transferidir (SET-PT). ArOH ArOH.+ + e - ArOH.+ ArO. + H + Yakın zamanlarda ikinci bir proton kaybı elektron transfer mekanizması (SPLET) da keģfedilmiģtir. ArOH ArO - + H + ArO + ROO. ArO. + e Falvonoidlerdeki 7-OH grubu ikinci proton kaybı elektron transferine göre, elektron transferi ve iyon alanı olarak önemli role sahiptir (SPLET). Ġki basamakta gerçekleģen bu mekanizma yakın zamanlarda bulunmuģtur (Litwinienko and Ingold, 2003; 2004; Foti et al. 2004). ArOH ArO - + H + ArOH + ROO. ArO. + ROO - Ġlk reaksiyonun entalpisi fenoksid anyonunun proton afinitesine eģdeğerdir (ArO - ). Ġkinci basamakta fenosid anyonundan ROO ya elektron transfer edilmiģtir ve fenoksil radikali oluģmuģtur. Bu basamaktaki reaksiyon entalpisi elektron transfer entalpisi

69 Nonpolar çözücü 45 olarak belirtilmiģtir. Örneğin kuersetinin muhtemel DPPH mekanizması ġekil 1.18 de görülmektedir. radikalini giderme Bu reaksiyon A ve C halkalarındaki elektron yoğunluğunun artmasıyla hızlandırılır. Ayrıca alternatif bir yol da DPPH radikallerine fenolat anyonundan hızlı bir elektron transferidir. A halkası güçlü bir Ģekilde elektron çeken, B halkasındaki katekol alanı da proton verme kabileti muhtemelen en fazla olan alandır. -OH gruplarının mevcudiyetinden dolayı birçok flavonoid molekülü biyolojik sistemlerin su fazında bulunmaktadırlar. Elektron eksikliği olan radikallerle flavonoidlerin reksiyonları, hücrelerdeki reaktif oksijen türlerini etkili Ģekilde minimize eden SLEPT mekanizmasıya hızlandırılabilir (Gülçin 2012). Kuersetin Çok hızlı ġekil Kuersetin in DPPH radikalleri ile muhtemel reaksiyon mekanizması (Gülçin 2012) Ayrıca Litvinienko ve Inglold (2004) tarafından SPLET için bir mekanizma önerilmiģtir. Organik çözücüler içinde ve özellikle metanolün iyonizasyonunu destekleyen çözücülerde deneysel hız sabiti, geleneksel HAT prosesi hız sabitinin toplamıdır ve SPLET prosesi ile gerçekleģen fenoksid anyonu ile radikalinin hız sabiti oranından çok daha büyüktür (Gülçin 2012).

70 46 HAT ArOH + DPPH. Ar-O. + DPPH-H YavaĢ SPLET ArOH + DPPH. Ar-O. + DPPH-H Hızlı Yukarıdaki reaksiyonlar aromatik bileģiklerin HAT ve SPLET dönüģüm mekanizmasını açık bir Ģekilde göstermektedir (Gülçin 2012). DüĢük pka lı fenolik bileģiklerin elektron eksikliği olan radikallerle reaksiyona girmesinde SPLET favori olanıdır ve düģük pka lı ürünler verir. Kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit ve sinapik asit gibi bazı fenolik asitler ile metil esterlerinin DPPH radikali ile arasındaki reaksiyonların hız sabiti, serbest karboksilik asitlerin fenolik -OH gruplarının iyonizasyonunun baskılanmasından dolayı serbest asitlerden birkaç kat daha büyüktür. Falavonoidler flavon, flavonol, izoflavon, flavonon ve kalkonları içerir ve yüksek bitki dokularında bulunur. Falvon ve flavonoller hemen hemen her bitkide bulunur. Özellikle de bitki yapraklarında flavonoller flavonlardan daha fazla oranda bulunur. Yaygın flavonoidlerden bazıları apigenin, luteolin, krisin, daisetin, kuersetin, mirisetin, morin ve kamferoldür. Flavonoidlerin hem doğal hem de model lipitlerdeki lipid peroksidasyonu üzerine etkileri iyi bilinmektedir. Flavonoidler süperoksid anyon radikali, hidroksil radikali, lipid peroksil radikali, singlet oksijen giderme, metal iyonu Ģelatlama, lipoksijenazların inhibisyonu gibi özellikleri sebebiyle antioksidanlar olarak hareket ederler (Gülçin 2012). - B halkasında 3,4 dihidroksi yapısı - C halkasında 3 hidroksil gurubu varlığında 4-okso gurubuna bağlı 2,3 çift bağ - A halkasına bağlı 5 hidroksil gurubu kriterlerini taģıyan bir flavonoid molekülünün maksimum radikal giderme aktivitesi gösterdiği sonucuna varılmıģtır (Gülçin 2012).

71 47 Ek olarak aromatik asid, ester veya lakton gibi karbonil gurubunun mevcudiyetinde flavanoidlerin antioksidant aktivitesinde artıģ görülmektedir. Bir molekülün antioksidan aktivitesi karbonil gurubu halkadan ayrıldığı zaman daha da artmaktadır. Sinamik asit benziok asit ile kıyaslandığında antioksidan aktivitesi daha yüksektir. Metoksi gibi inert bir komģu grup tarafından fenolik hidroksil gruplarının sterik engele uğraması onun antioksidan aktivitesini artırır. Sinamik Asit ve türevleri biyoaktif bitki kökenli gıda maddeleridir. İn vivo olarak yararlı sağlık etkisi gösterebilecek in vitro antioksidan aktiviteye sahiptir. Fenolik asitlerin antioksidan aktivitesi onların hidroksil gruplarının ayrıģma entalpi değerlerinin büyüklüğü ile ters orantılıdır (Gülçin 2012). Fenolik bileģiklerin zincir kırıcı mekanizma anahtarı fenolik -OH gruplarında peroksil radikallerine hidrojen atomu transferi (HAT) dir. Literatüre göre hidroksilasyonun derece ve pozisyonu antioksidan aktivite için öncelikli öneme sahiptir (Gülçin 2012). Fenolik asitlerin antioksidan akiviteleri ile yapıları arasındaki iliģkiler iyi kurgulanmıģtır. Monofenoller, difenoller veya polifenollerden daha az etkilidir (Göçer and Gülçin 2011). Son zamanlarda yapı ve aktivite iliģkisi arasında yapılan çalıģmada L-dopa nın L-trozine göre antioksidan olarak daha fazla radikal giderme aktivitesi gösterdiği görülmüģtür. ÇalıĢılan maddelerin antioksidan ve radikal giderme aktiviteleri, yüksek fenolik hidroksil gurubu sayılarına göre temellendirilmiģtir (Gülçin 2007). Ayrıca orto veya para pozisyonunda ikinci bir hidroksil gurubu varlığı antioksidant aktiviteyi güçlendirmiģtir. Monofenollerin inhibisyon etkileri bir veya iki metoksi gurubu bulundurmalarıyla önemli ölçüde artmıģtır. Fenolik asitlerin antioksidan aktiviteleri ile yapıları arasındaki iliģkiler iyi kurgulanmıģtır. Ġki fenolik asitin kombinasyonu antioksidan aktiviteyi daha da artırmaktadır. Örneğin Rozmarinik Asit Kafeik Asit e göre daha etkili bir antioksidandır. Yakın zamanlarda Gülçin (2006b) yaptığı bir çalıģmada Kafeik Asitin antioksidan aktivitesinin iyi bir Ģekilde göstrerek muhtemel antioksidan mekanizmasını da açıklamıģtır (Gülçin 2006b). ġeker gurubu tarafından Kafeik Asit in esterleģtirilmesi aktivitesini azaltmıģtır. Örneğin Klorojenik Asit Kafeik Asit den daha az etkilidir (Cuvelier et al. 1992; Chen ve Ho

72 ). Kafeik Asit önemli hidroksi sinnamik asitlerdendir. Pekkarinen et al. (1999a,b) yaptıkları çalıģmada seçilmiģ hidroksibenzoik ve hidroksi sinnamik asitlerin karanlıkta katı ve emülsifiye halde iken metil linoleat oksidasyonu üzerine etkilerini çalıģmıģlardır. Bu spesifik antioksidanlar ile diğer bileģiklerin özel iliģkileri gösterilmiģtir. Örneğin emülsifiye edici ve diğer intramoleküler hidrojen bağlarının antioksidan aktivite ve indirgemede önemli bir rol oynadığı görülmüģtür. Oleuropein, tirozol, hidroksitirozol zeytinyağındaki en önemli fenolik bileģiklerdendir (Gülçin 2012). Aynı zamanda hidroksitrozol ve kafeik asit BHT den daha fazla koruyucu etkiye sahiptir (Papadapoulos and Boskou 1991). ġekil Peroksil radikalleri (ROO. ) ile katekolün reaksiyon mekanizması (Gülçin 2012). Fenolik bileģiklerin kökeni karbohidratlardır. Fosfoenol pirüvik asit, glikolitik yolla D- eritros fosfat ile birleģerek pentoz fosfat devresiyle 5-dehidrokuinik asit ve devamında 5-dehidroĢikimik asite dönüģür. ġikimik asit, prefenik asit Ģekline dönüģürken p- hidroksifenil, pirüvik asit veya fenil pirüvik asit Ģekline dönüģür (ġekil 1.20). Trozin p- kumarid ürünlerini vermesine rağmen fenilalanin sinamik asit ürünlerini verir. Sinamik asit arka arkaya gelen p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit ve sinapik asit Ģekline dönüģür. Diğer taraftan pirüvat, malonil-coa Ģekline dönüģürken, sinamik ilave edilmesiyle beraber çeģitli flavonoidler ve izokumarinler meydana gelir.

73 49 Karbohidrat Fosfoenol pirüvat D-Eritroz-4-fosfat Pirüvat Klorojenik asit Kinik asit 5-Dehidrokuinik asit 5-DehidroĢikimik asit enat Asetil-CoA Gallik asit ProtokateĢuik asit Katekol Antranilik asit ġikimik asit Prefenik asit Malonil-CoA p-hidroksifenil pürivik asit Fenil pürivik asit Trozin Kumarin Kumarinik asit Fenil alanin Sinamik asit Umbelliferon Kumarik asit Kafeik asit Ferulik asit Flavonoid Ġzokumarin Skopoletin Sinapik asit ġekil Fenolik bileģiklerin biyosentezi (Gülçin 2002)

74 50 Fenolik bileģikler, hidrojen atomu vericisi olarak etkilerini gösterirler ve zincir oluģturan radikalleri daha az bir Ģekilde reaktif türlere dönüģtürürler. Bu Ģekilde oluģan antioksidan radikali, oksijen atomu ile aromatik halka üzerindeki eģleģmemiģ elektronun yer değiģtirmesiyle stabilize olurlar. Bu sebeple antioksidan moleküller yapılarında genellikle fenolik yapı bulundururlar. Fenolik bileģiklerin antioksidan etkisi, metal iyonlarıyla kompleks oluģturma (metal Ģelatlama) ve singlet oksijen oluģumunu engelleme veya azaltma, serbest radikalleri temizleme gibi özelliklerinden ve genellikle fenol radikallerinin rezonans kararlılığından kaynaklanmaktadır. Bu bileģikler, lipidlerin ve diğer biyomoleküllerin (protein, karbohidrat, nükleik asit v.b.) serbest radikallerce okside olmalarını engellemek için aromatik halkalarındaki hidroksil gruplarında bulunan hidrojeni verebilmektedirler. Bu yüzden fenolik antioksidanlar çok iyi bir H + ve e - donörleridir (Öztürk Sarikaya 2009) (ġekil 1.20). ġekil Fenol radikalinin rezonans yapıları (Öztürk Sarikaya 2009) Fenolik asit ve flavonoid bileģiklerin kullanım alanları Fenolik antioksidanlar serbest radikal gidericisi veya metal Ģelatör gibi fonksiyonlar ortaya koyarlar. Fenolik bileģikler ve onların bazı türleri otooksidasyonun önlenmesinde çok etkilidirler. Bunların yanı sıra bu bileģikler, çinko gibi bazı mineralleri Ģelatlayarak

75 51 yararlanılabilirliğini azaltırlar. Bitki fenoliklerinin antioksidan etkileri onların bilhassa redoks özelliklerinden ötürüdür ve bu yüzden indirgeyici ajanlar, hidrojen vericiler, tekli oksijen önleyiciler ve metal Ģelatörü yapıcılar olarak etki ederler. Polifenoller, askorbik asit, karotenoidler, takofenolleri yüksek miktarda içeren meyve ve sebzeler organizma için oldukça faydalıdır. Bu nedenle sebze ve meyvelerin vücuda alınması kardiyovasküler hastalıkları ve kanser gibi kronik rahatsızlıkların riskini önemli ölçüde azaltmaktadır (Bursal et al. 2011). Hardal, ahududu, zeytin ve yaprağı, üzüm, kekik, ada çayı, siyah çay gibi birçok bitkiler fenolik bileģiklerce zengin kaynakları oluģturmaktadır. Yapılan epidemiyolojik çalıģmalarda çay tüketmenin kalp krizi, koroner kalp hastalığı, karaciğer rahatsızlıklarını ve bazı kanser türlerinin riskini azalttıkları rapor edilmiģtir (Öztürk Sarikaya 2009 ). Fenolik bileģikler çok önceleri tıbbi uygulamada antiseptik olarak kullanılmıģtır. Bu bileģikler güneģ koruyucu olarak da yaygın bir Ģekilde kullanılmaktadır. Ayrıca bu maddelerin yaygın bir kullanımı da östrojenik aktivitedir. Bu bileģikler hormon dengesini etkileyip kadınlarda göğüs kanserini tetiklemektedir. Bunların dıģında fenolik antioksidanların Ca 2+ hemeostazisi üzerindeki etkileriyle, koroner kalp yetmezliğinde de önleyici role sahip oldukları ifade edilmiģtir (Bursal et al. 2011). Yukarıda sözü edilen etkilerinin yanı sıra flavonoid içeren polifenoller, bitki metabolizmasının en önemli ve en çok bulunan grupları olduklarından dolayı hayvan ve insan gıdalarının tamamlayıcı kısmını oluģtururlar. Bu maddeler kötü tat, renk ve dokularda esmerleģmeye sebep olduklarından dolayı besleyici olarak görülmeseler de, sağlık üzerindeki etkileri nedeniyle artan ilgi konusu olmuģlardır (Bursal et al. 2011) ÇalıĢmada kullanılan fenolik ve flavonoid bileģikler Meyve ve sebzelerde bol miktarda bulunan fenolik bileģiklerin insan sağlığı ile iliģkileri üzerine araģtırmalar son zamanlarda oldukça artmıģtır. Bu bileģiklerin çeģitli insan

76 52 kanserlerine karģı anti-tümöral aktiviteye sahip oldukları bildirilmektedir (Shim et al. 2007). ÇeĢitli bitkilerde flavonoid olarak bulunan Acacetin (5,7-dihidroksi-4 -metoksiflavon), anti-peroksidatif, anti-inflamatuar, anti-plazmoidal ve anti-mutajenik etkilere sahip flavonoid bir bileģiktir (Shim et al. 2007; Shen et al. 2010). Shen et al. (2010) yaptığı çalıģmada Acacetin in insan prostat kanserinin geliģmesini ve yayılmasını inhibe ettiğini, antimetastatik bir etken madde olarak kullanılabileceğini ortaya koymuģlardır (Shen et al. 2010). Buna paralel olarak Fong et al. (2010) yaptıkları çalıģmada akciğer kanserinde Acacetin in benzer etkiler gösterdiğini bulmuģlardır. Ayrıca gastrik tümör hücreleri gibi hastalıklarda anti-tümör özellik gösterdiği ifade edilmiģtir (Shim et al. 2007). Yine bir fenolik bileģik olan protokatekuik asit (PCA), fenolik asit yapısında bir dihidroksibenzoik asittir. YeĢil çayda bulunan antioksidan maddelerden biridir. PCA in vivo olarak akciğer toksisitesine sahip olan kimyasallara karģı koruyucu olarak, Hibiccus Sabdariffa dan ekstrakte edilmiģ olan bir flavonoid moleküldür. Normal ve kanserli hücreler üzerine in vivo ve in vitro etkileri araģtırılmıģtır (Lin et al. 2007). PCA nın antioksidan ve antiinflamatuar özelliklere sahip bir fenolik asit olduğu ortaya konulmuģtur. Sonuç olarak fenolik moleküllerin biyolojik aktif özelliklerinin araģtırılması onların insan sağlığı için değerini ve önemini ortaya çıkaracaktır. ÇalıĢmasını yaptığımız moleküllerin Protokatekuik asit ve Acacetin gibi maddelerin molekül yapılarına benzerlik gösterdiği ve antioksidan kapasite belirleme ve hca izoenzimleri üzerine herhangi bir inhibisyon çalıģması yapılmamıģ olması bakımından yaptığımız çalıģma önemli hale gelmiģtir. Yaptığımız çalıģmada antioksidan özellikleri hiç araģtırılmamıģ ve CA izoenzim aktiviteleri üzerine inhibisyon çalıģmaları yapılmamıģ olan fenolik bileģiklerden

77 53 Trihidroksibenzaldehid, 3-4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve AraĢidonoil dopamin ile flavonoid moleküllerden ID-8 (1-(4-Metoksifenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol), Callistephin, Malvin, Oenin, Pelargonin ve Silikristin moleküllerini kullandık. Literatürde bu moleküllerle ilgili pek bir çalıģma göremedik. Ayrıca sözünü ettiğimiz bu moleküller hakkında çok fazla bilgiye ulaģamamakla birlikte bazı bilgiler elde ettik. Malvin: Bitkilerde doğal olarak meydana gelen ve antosiyanin ailesinden olan bir kimyasal olup özellikle malva ve rhododendron gibi bitkilerde pigment olarak bulunan malvidin in diglukozide olmuģ Ģeklidir (Joule and Mills 2000). Strongyloodon macrobotrys ın karakterisitik çiçek yeģim renklenmesi, saporin (flavon-glukozid) ve malvinin mevcudiyetinin bir sonucu olarak kopigmentasyonun bir örneği olarak gösterilmiģtir (Takeda and Enoki 1989). Malvin bir dizi yiyeceklerde bulunmaktadır. AĢağıda ifade ettiğimiz yiyeceklerle sınırlı olmamak koģuluyla; -Avakado, pancar, siyah gözlü bezelye, lahana, havuç, patlıcan, yeģil bezelye, mısır, zeytin, soğan gibi sebzeler, -Kaju ve ceviz gibi tohumlar -Kırmızı biber, hardal tohumu, tarçın gibi baharatlar, -Elma, incir, karpuz, çilek, ayva, Ģeftali, armut, erik, üzüm, kaysı, muz, böğürtlen, yaban mersini, kiraz, kızılcık, siyah frenk üzümü gibi meyveler (Chang et al. 2000). -Ġnek sütü, peynir, yoğurt, tereyağı, Ģeker pancarı ve bal gibi gıdalarda bulunmaktadır. Oenin: Oenin bir antosiyanin olup Malvidin in 3-glukozide olmuģ Ģeklidir. ġarap ve üzümün kabuklarında bulunan kırmızı renk pigmentlerinden biridir. Prosiyanidin mevcudiyetinde Oenin in kırmızı rengi daha stabil olarak ortaya çıkar (Malien-Aubert et al. 2002). Malvidin-3-glukozid polifenol oksidazlar varlığında okside edilemez. Ancak ham üzüm ekstresi antosiyanid-kaffarik asit oluģumuyla artaya çıkan kafeik asit mevcudiyetinde bozunur (Sami-Manchado et al. 1997).

78 54 ÇalıĢmamızda kullandığımız diğer maddeler ile ilgili literatürde pek bir bilgiye rastlayamadık. ÇalıĢacağımız moleküllerin açık yapıları toplu olarak gösterilmiģtir (ġekil 1.22). Oenin Pelargonin Callistephin Slikrisitin ID-8 Malvin 3,4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik Asit AraĢidonoil dopamin 2,4,6-Trihidroksi benzaldehit ġekil ÇalıĢmada kullanılan moleküllerin açık yapıları Dolayısıyla yaptığımız çalıģmanın, söz konusu maddelerle ilgili antioksidan özellikleri ve hca I ve II izoenzimleri üzerine in vitro inhibisyon etkileri ile 2,4,6- Trihidroksibezaldehit, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve AraĢidonoil dopamin maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi üzerine in vivo olarak inhibisyon etkileri ile ilgili elde ettiğimiz sonuçlar literatüre yeni bilgiler kazandırmıģtır Antioksidan Kapasite Belirleme Yöntemleri Doğal bileģiklerin in vitro olarak antioksidan aktivitelerini belirlemek amacıyla birçok farklı metot kullanılmaktadır. Çizelge 1.11 de belirtilen yöntemlerde antoksidan kapasite elektron alıģveriģine veya Ģelat oluģturmaya dayanmaktadır.

79 55 Çizelge Bazı antioksidan kapasite belirleme yöntemleri ve genel prensipleri (Thatoi et al. 2014). Yöntem Adı 1-Total Atioksidan Kapasite (TAC) Tayini 2-DPPH radikali Giderme Aktivitesi Tayini 3-Nitrik Oksit Giderme Yöntemi 4-Ferröz Ġyonları Metal ġelatlama Aktivitesi 5-Bipiridil Metal ġelatlama Aktivitesi 6-Bakır Ġndirgeme Gücü (CUPRAC) Tayini 7-Hidrojen Peroksit Giderme Aktivitesi 8-ABTS Radikali Giderme Aktivitesi 9-FRAP Metodu 10-Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi 11-Glutatyon-S-Transferaz Aktivitesi 12-Oksijen Radikali Giderme (ORAC) Kapasitesi 13-Hidroksil Radikali Giderme (HORAC) Aktivitesi 14-Total Peroksil Radikali Tutucu Antoksidan Parametre (TRAP) 15-Lipid Peroksidasyon Ġnhibisyon Yöntemi 16-Fosfomolibden Yöntemi 17-Dikolorofloresindiasetate (DCFHDA) Temelli Yöntem 18-Fotokemilüminesans (PCL) Yöntem Mekanizma Asidik ph da antioksidan madde tarafından Mo 6+ nın Mo 5+ e indirgenmesi esasına dayanır. Metanol ile renklendirilmiģ serbest radikal solüsyonunun indirgenmesi esasına dayanır. Yöntem 516 nm deki DPPH radikali solüsyonuna eklenen antioksidan vasıtasıyla karıģımın absorbansındaki azalma presibine dayanır. Fizyolojik ph da sodyum nitroprusid den üretilen nitrik oksit radikallerinin inhibisyonuna dayanır. Bu yöntemde Fe 2+ iyonlarının ferrozin ile oluģturduğu kompleksin 500 nm dalga boyunda maksimum absorbans vermesi prensibine dayanılarak yapılır. Bipiridil reaktifi kullanılarak oluģturulan radikallerin 522 nm dalga boyunda spesifik olarak maksimum absorbans vermesi prensibine dayanır. CUPRAC metodu elektron verebilen antioksidanlar vasıtasıyla Cu 2+ nin Cu + e indirgenmesi prensibine dayanır. H 2 O 2 nin 230 nm de absorbans vermesiyle ölçülür. OluĢturulan ABTS.+ radikallerinin 734 nm de spektrofotometrik olarak ölçülmesi prensibine dayanır. Elektron verilerek Fe 3+ iyonlarından oluģan Fe 2+ iyonlarının tiripiridil triazin (TPTZ) ile oluģturduğu mavi renkli kompleksin 593 nm de ölçülmesi esasına dayanılarak yapılır. Riboflavin-metiyonin ıģık yöntemi ile NBT maddesinin 560 nm de spesifik olarak ölçülmesi ile gerçekleģtirilir. GST aktivitesi substrat olarak 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) kullanılarak 340 nm de tiyoester formuna dönüģen ürünün spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır. ORAC yöntemi 37 o C de 2-2 -azobis-(2 amidinopropan)- dihidroklorid (AAPH) tarafından indüklenen peroksi radikallerinin antioksidanlar ile süpürülmesi esasına dayanır. HORAC metodu Fenton benzeri Ģartlar altında antioksidanların metal Ģelatlama aktivitesi ölçümüne dayanır. Metot ile Co 2+ kompleksi kulanılır ve hidroksil radikali oluģumuna karģı koruma prensibini oluģturur. Bu deney peroksil radikallerini izleyebilmek için kemilüminesans özellikli luminol ile kompleksinin ölçülmesi prensibine dayanır. Kemilüminesans sinyali lüminol türevli radikallerin üretimi ile artar. Bu deney yönteminde lipid peroksidasyonunu tetiklemek için fenton benzeri sistemi (Co 2+ + H 2 O 2 ) kullanır. Fosfomolibden yöntemi asidik ph da yeterli yeģil fosfat/mo 5+ oluģumunda antioksidanlar tarafından Mo 4+ nın Mo 5+ e indirgenmesi esasına dayanır. Bu metotta peroksil radikallerini üretmek için AAPH kullanılır. Peroksi radikalleri için oksitlenebilir substrat olarak da DCFH-DA kullanılır. DCFHDA nın oksidasyonu ile diklorofloresein (DCF) oluģur. DCF yüksek floresans (Eksitasyon 480 nm, Emisyon 526 nm) özellik gösterir. Böylece DCF hem florometrik hem de spektrofotometrik olarak ölçülebilir. Bu deney yönteminde su ve lipid fazında süperoksit radikallerine benzer Ģekilde antioksidan kapasite ölçmeyi sağlar. Bu metot ile hidrofilik veya hidrofobik saf veya kompleks (sentetik, bitki, hayvan veya insan numuneleri) örneklerde antioksidan kapasite ölçülebilir. Bu yöntemlerden bir kısmı da ticari olarak kullanılan radikallerin (DPPH, ABTS, DMPD gibi) veya deney ortamında oluģturulan radikallerin (süperoksit, hidroksil

80 56 radikali gibi) artamdan giderilmesine dayanır. Yöntemlerin bir kısmı da metal iyonu komplekslerinin (Fe 3+ -TPTZ, Cu 2+ -neocuprin gibi) indirgenmesi temeline dayanır (Gülçin 2012; Anissi et al. 2014) Enzimler Canlı organizmalardaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen ve hiçbir yan ürün oluģmasına fırsat vermeden %100 ürün verimi sağlayan biyolojik katalizörlere enzim adı verilmektedir. Katalitik RNA moleküllerinin küçük bir gurubu hariç olmak üzere bütün enzimler protein yapısındadır. Bugüne kadar yaklaģık 2000 kadar enzim tanımlanmıģ olup bunlardan yaklaģık 200 tanesi saf olarak izole edilebilmiģtir (Keha ve Küfrevioğlu 2005). Bir enzimin aktif bölgesi subtratları ve varsa kofaktörleri bağlayan, bağ yapımı ve yıkımında görev yapan aminoasitleri kapsar. Bunlara katalitik gruplar adı verilir. Her enzimin kendine özgü yapı, spesifiklik ve kataliz özellikleri farklıdır. Aktif bölge enzimin toplam hacmine oranla çok küçük bir bölgeyi kapsar ve substratlar bu bölgeye kovalent bağlara nispeten zayıf bağlarla bağlanır. Ancak son yıllarda yapılan çalıģmalar enzimlerin aktif bölgelerinin rijit bir yapıya sahip olmadığını, esnek bir yapıya ve düzenlemeye sahip olduğunu göstermiģtir. Dolayısıyla bu tür enzimler substratla karģılaģtıklarında aktif bölge substrata uyum sağlamakta ve etkileģme sonucu uygunluk modeli diye açıklanan bir bağlanma çeģidi söz konusu olmaktadır (Keha ve Küfrevioğlu 2005). Bazı enzimler katalizleme fonksiyonlarını sadece kendi protein yapılarıyla yerine getirebilirken bazıları da kofaktör adı verilen ve protein olmayan baģka gruplara da ihtiyaç duyarlar. Kofaktör bir metal iyonu olabileceği gibi, koenzim adı verilen kompleks organik bir bileģik de olabilir. Bazen aktivite için her ikisi de gerekebilir. Katalitik olarak aktif olan kofaktör-enzim kompleksine holoenzim adı verilir.

81 57 Kofaktörsüz proteine ise apoenzim adı verilir. Enzim kofaktörüne kovalent bağla sıkıca bağlanmıģ ve diyalizle uzaklaģtırılamayacak kadar sıkı bağlı ise bu tür kofaktörlere prostetik grup adı verilir. Enzimler katalizledikleri reaksiyonların hızını, reaksiyona giren maddelerin aktifleģme enerjisini düģürerek artırırlar (Keha ve Küfrevioğlu 2005). Bağlı Substrat (Sukroz) Substrat ın enzime bağlanarak ES kompleksi oluģumu Glukoz Ürünler Fruktoz Aktif alan Enzim Serbest kalan substrat bağlama alanı ġekil Anahtar kilit modeli (Fischer modeli) Enzim aktivitesine etki eden faktörler 1-Substrat konsantrasyonu: Kimyasal reaksiyon kinetiği genel prensipleri, enzimli reaksiyonlarda da aynen geçerlidir. Ancak bu reaksiyonlarda substrata doyma gibi farklı özellikler vardır. DüĢük substrat konsantrasyonunda, reaksiyon hızı substrat konsantrasyonuyla orantılı olarak artar, yani reaksiyon birinci derecedendir. Substrat konsantrasyonu arttıkça reaksiyon hızı artıģında bir azalma gözlenir yani reaksiyon 0 ile birinci derece arsındadır. Maximum hızdan sonra bütün enzim substrata doyduğu için substrat konsantrasyonu artırılsa dahi reaksiyon hızı bu noktada sabit kalır. Enzimlerim maksimum hızları (V max ) birbirinden farklıdır. Ayrıca substratın yapısı, ph, sıcaklık ve iyonik Ģiddetle de değiģebilir (Keha ve Küfrevioğlu 2005). Enzimatik reaksiyonların hızına bu faktörlerin dıģında enzim miktarı, varsa kofaktör konsantrasyonları ve inhibitör-aktivatör konsantrasyonları da etki eder.

82 1 / V Enzim inhibisyonu Enzimlerin hem in vivo hem de in vitro aktivitelerinin bazı bileģikler tarafından azaltılması ve hatta bazen yok edilmesine inhibisyon adı verilir. Buna sebep olan bileģiklere de inhibitör denir. Ġnhibitörler genelde küçük molekül ağırlığına sahip moleküller veya iyonlardır. Birçok ilaçlar veya zehirler etkilerini bu yolla gösterirler. Enzimlerin inhibisyonu dönüģümlü veya dönüģümsüz olabilir. DönüĢümsüz inhibisyon: Bu inhibisyon türünde enzimle inhibitör kovalent bağlı veya zor ayrıģan bir kompleks meydana getirir. Sinir uyarılarının iletiminde önemli rol alan asetilkolin esteraz enziminin sinir gazı zehirleri tarfından inhibisyonu buna bir örnektir. DönüĢümlü inhibisyon: Bu inbisyon çeģidinde inhibisyonu oluģturan Ģartlar ortadan kalktığı zaman enzim eski aktivitesini yeniden kazanır. DönüĢümlü inhibisyon üç tipte incelenir; a-yarıģmalı (competitive) inhibisyon: YarıĢmalı inhbitör yapı olarak substrata benzer ve enzimin aktif bölgesine bağlanır Böylece substratın enzime bağlanması önlenmiģ olur. Substratın konsantrasyonunu artırmakla inhibisyon etkisi kaldırılabilir. Çünkü enzim-substrat ve enzim-inhibitör komplekslerinin ayrıģması denge reaksiyonu olduğundan substrat konsantrasyonunun artması dengeyi enzim-substrat lehine kaydırır (Keha ve Küfrevioğlu 2005) İnhibitör yok 4 İnhbibitör var / [S] ġekil YarıĢmalı inhibitör varlığında hız ve substrat iliģkisi garafiği

83 1 / V 59 ġekil 1.24 de Linweaver Burk grafiklerinde görüldüğü gibi, V max değiģmezken enzimin substrata karģı ilgisi azalır ve bunun göstergesi olan Km artar. b-yarıģmasız (competitive) inhibisyon: Bu dönüģümlü inhibisyon çeģidinde ise substrat ile inhibitör aynı anda enzime bağlanabilir. Bu durum enzimin aynı bölgesine bağlanmanın olmadığını gösterir. Dolayısıyla substrat konsantrasyonunu artırmakla inhibisyon kaldırılmaz ve inhibitör enzimin turnover sayısına etki ederek aktivitesini düģürür (Keha ve Küfrevioğlu 2005) / [S] 8 Ġnhibitör yok Ġnhibitör var ġekil YarıĢmasız inhibitör varlığında Hız-Substrat konsantrasyonu grafiği ġekil 1.25 deki grafikden de görüldüğü gibi yarıģmasız inhibisyonda enzimin substratına karģı ilgisi değiģmediğinden Km değeri değiģmez, ancak V max değeri azalır. c-yarı yarıģmalı (uncompetitive) inhibisyon: Bu dönüģümlü inhibisyon çeģidinde ise inhibitör serbest enzime değil de enzim-substrat kompleksine bağlanır. E + S ES E + P ESĠ

84 1 / V 60 Buna göre inhibitör varlığında ortamdan sürekli enzim-substrat (ES) kompleksi uzaklaģtığı için Km artar ve enzimin substratına karģı ilgisi azalır (Keha ve Küfrevioğlu 2005). Aynı zamanda ortamda sürekli ESI kompleksi var olacağından V max düģer. ġekil 1.26 da görüldüğü gibi K m artmıģ, V max ise azalmıģtır Ġnhibitör yok Ġnhibitör var 1 / [S] ġekil Ankompetitif inhibisyonda Hız-Substrat Konsantrasyonu grafiği 1.5. Karbonik Anhidraz Karbonik anhidrazlar (Karbonat hidroliyaz CA, EC ) Zn içeren enzimler içinde geniģ bir enzim ailesini oluģturmaktadır (Öztürk Sarikaya et al. 2011). Karbonik anhidraz ailesi α-, β-, γ-, δ- ve δ-ca olmak üzere beģ farklı tür içermektedir (Bootrorabi et al. 2010). α-, β-, δ-ca izoenzimleri aktif bölgelerinde Zn 2+ iyonu bulundururlarken γ- CA izoenzimleri muhtemelen demir iyonu bulundururlar. Ancak Zn 2+ ve Co 2+ iyonlarıyla da aktivite gösterirler. δ-ca izoenzimleri ise akitivite için Cd 2+ veya Zn 2+ kullanırlar. Bu beģ enzim sınıfının 3D katlanması biribirinden oldukça farklılık gösterir. α-ca lar normalde monomerler Ģeklindedir ve çok nadiren dimerler Ģeklinde bulunur. β-ca lar dimerler, tetramerler ve oktamerler Ģeklinde bulunurlar. γ-ca lar trimerler Ģeklinde bulunurken, δ- ve δ-ca lar muhtemelen monomerler Ģeklinde bulunur (Gülçin and Beydemir 2013). Karbonik anhidrazlar hemen hemen bütün organizmalarda bulunur (Beydemir et al. 2002).

85 61 ġekil CA IX dimerik proteininin temsili gösterimi (Supuran 2010). * : YeĢil renkli kısım intrastozolik alanı, sarı renkli kısım transmembran bölgeyi, mavi kısım X-ray kristal fotoğraftan elde edilen CA alanını, eflatun renkli kısım proteoglikan alanını göstermektedir. Memeli izoformları α-ca enzimleri olarak sınıflandırılır (Bootrorabi et al. 2010). ġimdiye kadar memelilerde 16 farklı karbonik anhidraz izoenzimi tanımlanmıģtır (ġentürk et al. 2009; Yenikaya et al. 2010; Öztürk Sarikaya et al. 2011). Bu izoenzimler farklı dokularda farklı yapı, pozisyon, dağılımda ve farklı moleküllere ilgileri farklı olarak hayvanlarda, bitkilerde, bakterilerde ve insanlarda bulunur. Örneğin insan CA II enzimi 250 aminoasit içeren yaklaģık 29 kda ağırlığında tek bir polipeptid zincirinden ibarettir. CA enzimi aktif bölgesinde üç çeģit histidin kalıntısına (His-94, 96 ve 119) bağlı bir çinko iyonu bulundurur (ġekil 1.31) ve tetrahedral geometrik yapısında su molekülüne bağlı olan ve sülfonamidlere yüksek afinite gösteren stoplazmik bir izoenzimdir (Ranjbar et al. 2012). Ġnsan CA 7 geni 10 Kb uzunluğunda ve önceden tanımlanmıģ CA I, II ve III genlerini belirlemede kullanılan 7 ekzon ve 6 intron içermektedir. Ġnsan CA 7 geni 263 rezidü içerir ve bu rezidülerin yaklaģık %50 si CA I, %56 sı CA II ve %49 u ise CA III ü ifade eder. Ġnsan CA 7 geni 16q22 olarak kromozomlarda lökalize olmuģtur. Öteki

86 62 stozolik enzimlere ait gen ise (CA I, II, III ve XIII) 8q22 olarak kromozomlarda lökalize haldedir (Bootorabi et al. 2010). ġekil CA II izoenziminin ligand yapısındaki metal merkezinin Ģematik olarak gösteriliģi (Kılınç 2011). CA izoenzimlerinin üç boyutlu yapıları çok farklı olmasına karģın aktif bölgelerindeki katalitik gruplar ise neredeyse tamamen aynıdır. ġekil 1.29 da görüldüğü üzere her bir izoenzimin aktif bölgesi üç boyutlu yapı olarak yaklaģık tetrahedral geometriye sahip üç histidin imidazol halkası ve su molekülü Ģeklinde koordine olmuģtur. CA izoenzimlerinin yapısındaki çinko iyonu aktivite için mutlaka gereklidir. Çinko iyonu uzaklaģtırılmıģ CA apoenzimleri aktiviteden tamamen yoksun olmaktadırlar. Karbonik anhidraz izoenzimlerinden CO 2 in hidrasyonunda CA IX ile birlikte en aktif rol üstlenen ve 25 o C ve ph 9 da saniyede 106 molekülün hidrasyonunu sağlayarak en yüksek turnover oranına sahip olan CA II izoenzimidir. CA I izoenzimi ise 105 turnover sayısı ile CA II izoenziminden daha az aktif bir enzim olarak karģımıza çıkmaktadır (Beydemir et al. 2002)

87 63 ġekil Karbonik anhidraz enzimlerinin katalitik bölgeleri (His 119, 96 ve 94) (ġahin 2008) * : Ortadaki büyük küre Zn 2+ iyonunu, etrafındaki küçük küreler ise immobilize olmuģ su moleküllerini temsil etmektedir Karbonik anhidraz enzimlerinin hücresel yerleģimleri Ġnsanlarda katalitik olarak aktif 13 karbonik anhidraz izoenzimi mevcuttur. Bu enzimlerden bazıları (CA I, II, III, VII ve XIII) sitoplazmada, diğerleri (CA IV, IX, XII, ve XIV) hücre zarına bitiģik ekstrasellüler sıvı tarafında, CA VA ve VB ise mitokondride ve CA VI ise süt ve tükürükte sentezlenir ve bulunur (Çoban et al. 2009; Yenikaya et al. 2010; Moeker et al. 2012). Çizelge 1.12 de bazı CA izoenzimlerinin hücresel yerleģimleri ve inhibitörlere duyarlılıkları gösterilmiģtir. Bu karbonik anhidraz izoenzimlerinin dıģında karbonik anhidraz iliģkili proteinler (CARPs) olarak adlandırılan CARP VIII, X ve XII gibi inaktif formları da mevcuttur. Bu enzimler kırmızı kan hücreleri, beyin, göz, kas, kalp ve sindirim sistemleri gibi bir çok dokuda yüksek spesifik aktivite gösterirler (Çoban et al. 2009). Ġlk olarak kırmızı kan hücrelerinde bulunan CA I ve II izoenzimleri, RBC nin sitoplazmasında bol miktarda bulunur (Öztürk Sarikaya et al. 2011; Ekinci et al. 2010; ġentürk et al. 2009; Lindskog 1997). Aynı zamanda böbrek, kolon, akciğer, göz,

88 64 merkezi sinir sistemi ve gastrointestinal sistemlerin birçok salgı bezlerinde de bulunur (Lindskog 1997; ġentürk et al. 2009; Öztürk Sarikaya et al. 2011). Çizelge CA izoenzimlerinin hücresel yerleģimleri ve sülfonamidlere ilgisi (ġahin 2008) Ġzoenzim CO 2 Hidrasyonu Sülfonamidler Ġçin Hücre Ġçi YerleĢimi Kataliz Aktivitesi Afinite CA I DüĢük Orta Sitozol CA II Yüksek Çok yüksek Sitozol CA III Çok düģük Çok düģük Sitozol CA IV Yüksek Yüksek Membrana bağlı CA VA Orta yüksek * Yüksek Mitokondri CA VB Yüksek * Yüksek Mitokondri CA VI Orta Yüksek Salgı halinde CA VII Yüksek Çok yüksek Sitozol CARP VIII Nonkatalitik ψ Sitozol CA IX Orta Yüksek Transmembran CARP X Nonkatalitik ψ Sitozol CARP XI Nonkatalitik ψ Sitozol CA XII DüĢük Yüksek Transmembran CA XIII Orta Yüksek Sitozol CA XIV DüĢük Yüksek Transmembran CA XV DüĢük Yüksek Membrana bağlı * : ph 7,4 de orta aktivite, ph 8,2 veya daha yüksek ph değerinde yüksek aktivite ψ: CARP proteinleri Zn 2+ bulundurmadığı için aktivite göstermemektedir Karbonik anhidraz enziminin fizyolojik fonksiyonları ve etki mekanizmaları Farklı CA izoenzimleri çeģitli dokularda gaz dengesi, kalsifikasyon, fotosentez, CO 2 ve iyon transportu, göz, böbrek ve iç kulakta ph ın düzenlenerek (Ceyhun et al. 2011) asitbaz dengesinin sağlanması, solunum, kemik rezorpsiyonu, lipid, üre ve glukoz sentezi, vücut sıvı değiģimi, tümör hücrelerinin geliģimi, elektrolit salınımı gibi bir çok önemli biyolojik süreçlere katılırlar (Çoban et al. 2009; Ekinci et al. 2010; Öztürk Sarikaya et al. 2011). Karbonik anhidrazlar insan vücudunda ph dengesinin sağlanmasını, CO 2 in hidratasyonu ile H + ve HCO - 3 vererek iki basamakta katalizlemek ve asidik ortamda HCO - 3 ın yeniden CO 2 e dönüģümünü gerçekleģtirmek suretiyle sağlarlar (Beydemir et al. 2002; ġentürk et al. 2011; Öztürk Sarikaya et al. 2011).

89 65 Çizelge CA enziminin katalizlediği reaksiyonlar (Söyüt 2006) 1) O=C=O + H 2 O - HCO 3 + H + 2) O=C=NH + H 2 O H 2 NCOOH 3) HN=C=NH + H 2 O H 2 NCONH 2 4) RCHO + H 2 O RCH(OH) 2 5) RCOOAr + H 2 O RCOOH + ArOH 6) RSO 3 Ar + H 2 O RSO 3 H + ArOH 7) ArOPO H 2 O HPO ArOH 8) ArF + H 2 O HF + ArOH (Ar: 2,4dinitrofenil) 9) PHCH 2 OCOCl + H 2 O PHCH 2 OH + CO 2 + HCl 10) RSO 2 Cl + H 2 O RSO 3 H + HCl (R: Me; Ph) Karbonik anhidraz enziminin inhibisyonu mekanizmaları Enzimler aktivitelerini aktif bölgelerindeki katalitik gruplarıyla gerçekleģtirmektedirler. Eğer bir substrat enzimin aktif alanıyla etkileģirse enzimin 3D yapısında değiģikliğe yol açabilir. Bu inhibisyon Ģekli yarıģmalı olabilir. Diğer inhibisyon türü de yarıģmasız inhibisyondur. Bu tip inhibisyonda inhibitör enzimin aktif alanının dıģındaki bir bölgeye bağlanır. Bu yüzden yarıģmasız bir inhibitör enzimin aktivitelerinin turnover sayısını düģürmek suretiyle inhibisyon etkisi gösterirler. Hemen hemen bütün organizmalar ilaç, pestisid ve metaller ile diğer kimyasal kirliliklere küçük konsantrasyonlarda da olsa maruz kalmaktadırlar. Bu etkiler enzim inhibisyonu gibi çeģitli mekanizmalar aracılığıyla ortaya çıkar. Memelilerde 16 farklı CA izoenzimleri baģlıca 3 farklı mekanizmayla inhibe edilmektedir. Bunlardan ilki Zn 2+ bağlı su/hidroksit iyonunun değiģerek Zn 2+ nin tetrahedral geometrisine yol açmak suretiyle enzim aktif alanında Zn 2+ iyonunun inhibisyonunu koordine ederek (ġekil 1.30 A) veya metal koordinasyon küresine inhibisyon eklemek suretiyle trigonal bipiramidal geometride Zn iyonunu ile koordine olarak inhibisyonun gerçekleģmesidir (ġekil 1.30 B). Diğeri su veya hidroksit iyonu gibi Zn bağlı solvent molekülüne inhitörün bağlanması suretiyle inhibisyonun meydana gelmesidir. Fenoller ve poliaminler etkilerini bu yolla gerçekleģtirmektedirler (ġekil 1.30 C). Sonuncusu ise CA enziminin aktif alanındaki aktivatör bağlı bölgeye inhibitörlerin giriģ yaparak aktif alana bağlanmasıyla inhibisyonun gerçekleģmesidir.

90 66 ġekil 1.30 D de gösterildiği gibi kumarinler bu yolla bağlanmayı gerçekleģtirirler (Gülçin and Beydemir 2013). Aktif alanın hidrofobik bölümü Aktif alanın hidrofilik bölümü A B Yarı hidrofobik Yarı hidrofilik C D ġekil CA enziminin inhibisyon mekanizmalarında rol alan aktif alanları (Gülçin and Beydemir 2013). Birçok CA izoenzimleri ödem, glokom, obezite, kanser, osteoporoz ve epilepsi gibi bir dizi hastalıkların tedavisinde aktive veya inhibe olma potansiyeli ile önemli terapötik süreçlerde terapötik hedeflerle iliģkilendirilmiģtir. Son zamanlarda 16 farklı CA izoenzimlerinin çeģitli kolikinol, difenoller, parasetamol, salisilatlar ve türevleri gibi basit fenoller ile çeģitli tip fenolerle iliģkisi, Zn bağlı karbonik anhidraz inhibitörleri olarak araģtırılmıģ ve araģtırılmaya devam etmektedir. Sülfonamidler ve onların biyoesterleri olan sülfamatlar ve sülfamidler gibi klasik moleküller birinci tip inhibisyon mekanizması kullanarak etkilerini gerçekleģtirirler (Gülçin and Beydemir 2013).

91 Karbonik anhidraz inhibitörleri CA enzimi ile birlikte birçok enzim ilaç ve kimyasal hedefli enzim olarak düģünülmektedir. CA enzimlerinin inhibisyona uğrayabilme özelliklerinden dolayı iliģkili olduğu birçok hastalığın tedavisi için hedef molekül haline gelmiģtir. Sülfonamid türevlerinin α-ca izoenzimlerinin güçlü inhibitörü olduğu bilinmektedir. Bu bileģikler heterosiklik yapı gibi uygun bir organik yapıya sahiptir ve kolayca iyonik yapı kazanabilmektedir. Bu durum CA enzimi üzerine inhibisyon etkisi açısından kritik öneme sahiptir. Örneğin asetazolamid (AZA), dorzolamid (DZA), brinzolamid (BZA) üç önemli CA inhibitörüdür. Sülfonamidler Zn ve trozin-199 aminoasidinin hidroksil ve amino gruplarıyla etkileģerek CA enzimlerinin aktivasyonunu kısıtlar. Sülfonamidler böbrek tübül hücrelerinde CA izoenzimlerini inhibe etmek suretiyle diüretik etkiye sahiptirler. Buna ek olarak bu tür CA inhibitörleri göz içi basıncını düģürücü etkisiyle glokom tedavisinde farmakolojik ajanlar olarak kullanılmaktadırlar. Bu konu ile ilgili literatürde birçok araģtırma mevcuttur. Supuran (2010) yılında sülfonamidler ve sülfamatlara ek olarak kumarinler, fenoller, fullerenler gibi yeni ve ilginç kemotikleri, CA enzimi üzerine etkileriyle beraber inhibisyonlarını açıklamıģtır. Enzim inhibitörlerinin bu sınıfı, moleküler seviyede ayrıntılı protein-ilaç iliģkilerini anlamayı ve ilginç farmakolojik ajanların dizaynı için bir ümit vadetmektedir. Ek olarak ġen et al. (2009) hca enzimi üzerine yeni piranol karboksamid türevlerinin inhibisyon etkilerini araģtırmıģlardır. Bu pirazol karboksamid türevlerinin insan eritrositleri CA I ve II izoenzimleri üzerine inhibisyon etkisini belirlemiģlerdir (Gülçin and Beydemir 2013). Karbonik anhidraz enziminin en güçlü inhibitörleri aromatik ve heteroaromatik sülfonamidlerdir. Sülfonamidler genel olarak R-SO 2 -NH 2 molekül yapısına sahiptirler. Bu formüldeki R grupları aromatik veya heteroaromatik halka sistemlerinden oluģmaktadır. O O R-S-NH 2 R-S-NH - + H + O O

92 68 denklemine göre kolaylıkla iyonlaģabilmektedir. Onların bu özellikleri CA inhibisyonu için gereklidir. Sülfonamidler heterofilik bölgelerinin yanısıra hidrofobik bölgelere de sahiptirler. Sülfonamidler R-SO 2 NH - nin yapısındaki azot atomlarıyla öncelikli olarak CA enziminin Zn 2+ iyonlarına iyonik bağlanmayı gerçekleģtirirken hidrofobik etkileģmelerle de inhibitörün enzime bağlanması yoluyla bu etki tamamlanmıģ olur. Sülfonamidlerin CA enzimini güçlü bir Ģekilde inhibe etmeleri bu etkilerinin toplamıdır. Nitekim sübstitüe olmuģ veya alkil sülfonamidlerin enzime bağlanmasında sadece hidrofobik etkileģmeler söz konusu olduğu için aromatik ve heterosiklik yapı taģıyan moleküllere göre daha zayıf inhibisyon etkisi gösterirler (ġahin 2008). Asetazolamid Metazolamid Etoksozolamid Diklorofenamid Dorzolamid Brinzolamid ġekil Standart inhibitörler olan AAZ, MZA, EZA, DZA ve DCP sülfonamidlerinin molekül yapıları CA nin bu özellikleri ilaç dizaynı için çok önemlidir. Çünkü bugüne kadar memelilerde tanımlanan 16 farklı CA izoenzimlerinin aktif alanında büyük boģluklar vardır. Bununla birlikte yüksek yapısal çeģitlilik ve aminoasit diziliminin farklı olduğu bu bölgeler aktif alanın giriģindedir. Gerçekte de sadece fenoller değil Zn bağlayan kumarinler ve diğer tip inhibitörler seçici CA izoenzimi inhibitörleri olarak tanımlanmıģtır. Bu maddeler klasik olarak sülfamat ve sülfonamid inhibitörleri olarak sınıflandırılmıģtır (Gülçin and Beydemir 2013). CA inhibisyonu, idrarın modifikasyonunun azalmasına, idrar alkalilerinin üretimine ve sonunda metabolik asidoza yol açar (Beydemir et al. 2002; Gülçin et al. 2004). Karbonik anhidraz inhibitörleri ağız yarası, gastrik ve dodenal ülserler, nörolojik

93 69 rahatsızlıklar ve osteoporoz gibi hastalıkların tedavisinde anti-glokom, diüretik ve antiepileptik olarak kullanılan ilaçların bir sınıfını oluģturmaktadır (Öztürk Sarikaya et al. 2011). Karbonik anhidraz izoenzimleri metal kompleks anyonları, sülfonamidler ve sülfonamidlerin türevleri olan sülfamat ve sülfamidler, fenoller ve poliaminler ile inhibisyona uğrarlar. Bu moleküller enzimin aktif bölgesindeki metal iyonuna bağlanarak aktiviteyi düģürürler (Carta et al. 2012). CA izoenzimleri katalitik bölgelerindeki farklılıkları gibi aynı inhibitörlere duyarlıklıkları da farklıdır. D Ambrosio et al. (2012) Zn 2+ bağlayan sülfamidler ve sülfonamidleri içeren bir dizi bileģiğin metaloenzim CA izoenzimlerinin inhibitörü olduğunu rapor etmiģlerdir. Bu serinin kurģun bileģiği ile CA II kompleksi üzerine yapılan kristaliyografik çalıģmalar 4-sülfamidobenzen sülfonamidin enzim aktif alanında iki molekülün bağlandığını ortaya çıkarmıģtır (D Ambrosio et al. 2012). Ġlk olarak sülfonamid gurubu aracılığıyla Zn 2+ iyonuna bağlanma, ve ikinci olarak aktif alan baģlangıcında lokalize olma mekanizmasıyla bu moleküllerin bağlandığı rapor edilmiģtir. Fizyolojik insan CA I, II IX ve XII izoenzimleri üzerine kısa moleküllerle uzun kuyruklu moleküllerin inhibisyon etkileri karģılaģtırıldığında uzun moleküllerin 10 kat daha fazla inhibisyon özelliği gösterdiği görülmüģtür (D Ambrosio et al. 2012). ġekil 1.32 de iki inhibitör molekülün CA II izoenzimi aktif alanına bağlanma modelleri gösterilmiģtir. ġekil YeĢil ile temsil edilen iki inhbitör maddenin hca II aktif alanına bağlanma modeli (D Ambrosio et al. 2012)

94 70 Dututiene et al. (2013) bir dizi 2,3,5,6,-tetraflorobenzen sülfonamidler ile ilgili insan CA I, II, VII, XII ve XIII izoenzimleri üzerine inhibisyon etkilerini incelemiģlerdir. Florlanan bütün benzensülfonamdilerin CA izoenzimleri üzerine nm düzeyde bağlanma potansiyeli ortaya koydukları gözlenmiģtir. FlorlanmıĢ benzen sülfonamidler, florlanmamıģ benzen sülfonamidlere kıyasla daha yüksek bağlanma ve inhibisyon potansiyeli göstermiģlerdir (Dututiene et al. 2013). CA II ve XII ile kompleks yapmıģ 4- [(4,6-dimetilpirimidil-2 yl)thio]-2,3,5,6 tetraflorobenzen sülfonamdiler ile CA III ile, kompleks yapan 2,3,5,6-tetrafloro-4-[(2-hidroksietil)sulfonuyl]benzen sülfonamidlerin kristal yapısı belirlenmiģtir. Bazı florlanmıģ sülfonamidler için CA I izoenzim inhibisyonu K i değerleri yüksek nanomolar düzeye sahiptir. Biswas et al. (2011) 2-tienasetamid çekirdeği içeren iki sülfonamid molekülünün klinik uygulamalarda kullanılan diklorfenamid, metazolamid ve asetazolamid gibi sülfonmidlerle hca I, II, III, VIII, XIII izoenzimleri üzerine inhibisyon etkilerini karģılaģtırmıģlardır. Ġzoenzimler üzerine inhibisyon profilleri oldukça farklılık göstermiģtir. hca II üzerine inhibisyon etkisi göstermesi için eklenen iki farklı sülfonamid 2-tienasetolamid kuyruklarının konformasyonu oldukça farklıdır. Aminoasit rezidüleri ve yapısal olarak farklı inhibitörlerin iliģkileri kanıtlanmıģ ve X-ray kristal yapıları rasyonalize edilmiģtir (Biswas et al. 2011). ġekil Bazı sülfonamidlerin hca II izoenzimi alanına bağlanma modeli (Biswas et al. 2011) * YeĢil (1) ve mavi (2) ile gösterilen Ģekiller sırasıyla 1 ve 2 maddelerinin hca II aktif alanına bağlanma Ģeklini temsil etmektedir. Elektron yoğunuluğu mavi-gri karıģımı renk ile gösterilmiģ ve aminoasitler iģaretlenmiģtir.

95 71 Carta et al. (2013) dithiokarbomatların son zamanlarda CA inhibitörleri olarak keģfedildiğini ortaya koymuģlardır (Carta et al. 2013). Ksantotaz ve trihidrokarbomatın bir serisi olan dihidrokarbomatlar yapısal olarak iliģkili moleküllerdir. Bu bileģikler bazı patojenlerle iliģkili olan hca I, II, IX, ve XII izoenzimleri üzerine inhibisyon etkileri test edilmiģtir. Ksantotaz ve trithiokarbomat maddelerinin CA izoenzimleri üzerine çeģitli nm düzeyde inhibisyon etkileri görülmüģtür. Bazı ksantotazların hca II izoenzimi aktif alanına yerleģtirme çalıģmasında ksantotazların dithiokarbomatlara benzer Ģekilde enzim aktif boģluğunda Zn 2+ iyonuna tek bağla koordinasyonunu ortaya koymuģtur. Bu ksantotazlar topik uygulama yoluyla glokom oluģturulmuģ iki hayvan modelinde potansiyel göz içi basıncını düģürme aktivitesi ortaya koymuģtur. Ksantotazlar ve tiyoksantotazlar ın iki yeni temsilci olarak hca inhibitörlerinin umut verici yeni sınıf molekülleri olabileceğini rapor etmiģlerdir (Carta et al. 2013). Carta et al. (2012) dithiokarbomatlar (DTC) için in vivo yaptıkları çalıģmada bu bileģiklerin güçlü CA izoenzimleri inhibisyonuna sahip oldukları ve antiglokom özellik gösterdiklerini ortaya koymuģlardır. Bunun için bir seri dithiokarbomatların golokom (CA II ve XII), kanser (CA IX) gibi bazı patojenik durumlarla iliģkili olan hca I, II IX ve XII üzerine inhibisyon etkisini incelemiģlerdir. Bu bileģiklerin CA izoenzimleri üzerine çeģitli nm düzeyde inhibisyon etkisi gösterdiklerini belirlemiģlerdir. Morfolin dithiokarbomat ın hca II üzerindeki inhibisyon etkisi iliģkili kompleksin X-ray kristal yapısı bu bileģiklerin inhibisyon mekanizması kanıtını ortaya koymuģtur. Bu mekanizmaya göre dithiokarbomatın Zn 2+ bağlanma fonksiyonunun sülfür atomu aracılığıyla metal iyonuna koordinasyonunu öngörmektedir. Bazı dithiokarbomatlar glokomlu hayvan modelinde göz içi basıncı düģürücü etki ortaya koyduğu rapor edilmiģtir (Carta et al. 2012). Ayrıca CA inhibitörleri olarak araģtırılan fenollerin büyük çoğunluğunun fenolik yapıda olduğu ve belli CA izoformları için substrat olarak CO 2 e karģı yarıģmalı inbisiyon etki ortaya koyduğu gösterilmiģtir. Nair et al. (1994) nın yaptıkları önemli bir çalıģmada fenolik bileģiklerin hca II enziminin aktif bölgesindeki Zn 2+ iyonuna bağlı su/hidroksit iyonuna bir hidrojen bağlanması ve Trozin-199 aminoasidinin NH (amid) gurubuna

96 72 ikinci bir hidrojenin bağlanması ile α-ca izoenzimlerinin katalitik döngüsünde kritik öneme sahip oldukları ile ilgili oluģan yapının X-ray kristal yapısını ortaya koymuģlardır (Gülçin and Beydemir 2013). Fenolün fenil kısmının hca II enziminin fizyolojik substratı olan CO 2 in prekatalitik kompleks Ģeklinde bağlandığı yer olan enzimin aktif alanının hidrofobik kısmında olduğu görülmüģtür. ġimdiye kadar bütün memeli CA I ve XV izoenzimlerinin fenoller ve türevleri ile iliģkileri araģtırılmıģtır. Bu maddelerin seçici CA izoenzim tasarım inhibitörlerinin olabilirliği ve mikromolar ile submikromolar konsantrasyonlarda inhibisyon etki gösterebilecekleri ile ilgili kanıtlar gösterilmiģtir. Gerçekte de bu sınıftan olan ajanların çeģitli CA izoenzimleri üzerine inhibisyon etkileri çok farklılık arz etmektedir. Bu maddelerin CA izoenzimleri üzerine gösterdikleri inhibisyon sabitleri birçok basit fenolik bileģikler için milimolar ile mikromolar aralığında değiģmektedir. Bu durum fenollerin antioksidan olarak yiyeceklere eklenmesi klinikteki çalıģmaları içeren daha önceki çalıģmaların geniģletilmesi sürecinde ortaya çıkmıģtır. Propofol, guaiakol ve vanilin gibi dimerik fenol türevleri olarak çalıģılan yapısal iliģkili diğer maddeler de çalıģılmıģtır. Son on yıl içinde CA izoenzimleri üzerine fenolik bileģiklerin etkileri yoğun bir Ģekilde araģtırılmıģtır. Bu amaçla propofol ve propofol benzeri bileģikler ve dimerik türevlerinin etkileri araģtırılmıģtır. Ek olarak dantrolenin CA enzimi üzerine inihibsyonu üzerine etkileri de iyi bilinmektedir. Ayrıca sentetik fenolik antioksidanların inhibisyon etkileri üzerine de birçok çalıģma yapılmıģtır. ġentürk et al. (2009) 2,6-dimetilfenol (DMP), 2,6-dipropilfenol (propofol), 2,6-di-t-bütilfenol (DiBHT), bütillenmiģ hidroksi toluen ve hidroksianisol, vanilin, guaiakol, di(2,6 dimetilfenol) (DiDMP), di(2,6 diisopropilfenol) (DiDIP) ve di(2,6-di-t-bütilfenol) gibi monomerik ve dimerik antioksidant fenolik bileģiklerin hca I ve II izoenzimleri üzerine etkilerini araģtırmıģlardır. Bu çalıģmada yazarlar fenolik bileģiklerin enzimin aktif bölgesindeki -OH gruplarına bağlandığını ifade etmiģlerdir. Buna ek olarak Davis et al. (2010) yaptıkları çslıģmada yapıları yukarıda ifade edilen moleküllere ve fenollere benzeyen bazı doğal ürünlerin CA VA ve VB üzerine çok iyi inhibisyon etkisi ortaya koyduğunu göstermiģlerdir (Gülçin and Beydemir 2013).

97 73 Bütün bu çalıģmalar gösteriyor ki, klasik sülfonamidlerden farklı olarak CA inhibitörlerinin yeni bir sınıfı olan diğer kemotipler ve fenoller ile türevlerinin çok yönlü ve ümit verici olarak yararlı olabileceklerini göstermektedir (Gülçin and Beydemir 2013). Çizelge Bazı maddelerin hca I ve II izoenzimleri üzerine inhibisyon sabiti değerlerinin karģılaģtırılması (Gülçin and Beydemir 2013). Molekül Adı KısaltılmıĢ K I (µm) Adı hca I hca II 2,6-Dimetilfenol DMP 198,30 113,50 2,6-Diizopropilfenol Propofol 98,90 19,50 2,6-Di-t-bütilfenol DTP 274,50 0,51 2-Metoksifenol Guaiakol 60,20 2,94 4-Hidroksi-4-Metoksibenzaldehit Vanillin 55,60 1,25 Di(2,6-dimetilfenol) (Di-DMP) 92,80 4,05 Di(2,6-diizopropilfenol) Dipropofol 37,90 1,87 Di(2,6-di-t-bütilfenol (Di-DTP) 37,50 0,29 (3,4-Dihidroksifenil)(2,3,4-Trihidroksifenil) metanon - 32,48 23,03 (5-Brom-3,4-trihidroksifenil)(3,4-dihidroksifenil) metanon - 6,77 3,25 (5-Brom-2,3,4-trihidroksifenil)(2-brom-4,5-dihidroksifenil) - metanon 1,19 28,56 4-(3,4-Dihidroksifenil)benzen-1,2,3-triol - 8,36 42,48 4-Brom-6-(2-brom-4,5-dihidroksifenil)benzen-1,2,3-triol - 2,59 118,41 Yakın zamanda yapılan bir çalıģmada 3,4-dihidroksifenil ile 2,3,4-trihidroksifenil metanon ve onların bir dizi türevlerinin hca I ve II üzerine inhibisyon etkileri araģtırılmıģtır. Bu bileģiklerin en iyi inhibisyon sonuçları hca I için IC 50 : 3,22-54,28 µm, hc II için IC 50 : 18,52-142,01 µm olarak bulunmuģtur. Ayrıca sülfamat ve sülfonamidlerin fonksiyonel gruplarından yoksun olan ve basit bir kloro fenolik bileģik olan thioksolon CA I inhibitörü olarak hareket etmektedir. Böylece inhibitörlerin yeni bir sınıfı olma potansiyeline sahip olarak sülfonamid ve türevlerine alerjisi olan hastalar için alternatif olabilir (Gülçin and Beydemir 2013). Bununla birlikte Innocenti et al. (2010a) Thioxolone nin sülfonamidlere kıyasla seçici CA izoenzim inhibitörlerini üretmede yetersiz kaldığını ortaya koymuģtur. Zn bağlayan grubu bulunan sülfonamidler çok çeģitli izoenzim seçici inhibitörleri üretmede tiyol

98 74 grupları büyük bir önem arzetmektedir. Fakat bununla birlikte yeni CA izoenzim inhibitörlerinin yeni bir sınıfını keģfetmek ve sülfonamidlerle kıyaslamak, yaygın olan CA izoenzim inhibitörlerinin yeni uygulamalarını bulmak açısından faydalı olacaktır. Yakın zamanlarda bir dizi fenolik bileģik ve fenolik asitlerin insan eritrositleri CA I ve II izoenzimleri üzerine inhibisyon etkileri araģtırılmıģtır. Bu amaçla fenolik bileģiklerden fenol, katekol, rezorsinol, hidrokuinon, pirogallol, kuersetin, guaiakol, vanillin, kafeik asit fenil ester (CAPE), kurkumin, slimarin, resveratrol and morfin kullanılmıģtır. Son zamanlarda da antioksidant fenolik bileģikler arasında varsayılan resveratrol, kateģin, slimarin, dobutamin, kafeik asit fenil ester, rozmarinik asit ve kurkumin gibi maddelerin inhibitör etkileri araģtırıldı. Fenol karbonik ve fenik asit olarak da bilinen organik bileģiklerdir. Bu hafif asidik fenol molekülleri zayıf da olsa - OH gurubundan hidrojen kaybetme eğilimleri vardır ve yüksek oranda suda çözünerek fenolat anyonlarına dönüģürler. Fenol CA I ve II izoenzimlerinin etkili inhibitörleridirler. Aynı Ģekilde katekol, rezorsinol, hidrokuinon, pirogallol CA II izoenziminin etkili inhibitörüdür. Bu fenolik bileģikler K i 0,1-20 µm aralığında olarak etkili inhibitör olarak davranmaktadır. Ancak bu etkili inhibisyon özellikleri CA I üzerinde görülmemiģtir. Özellikle rezosinol ve katekol zayıf CA I inhibitörüdür (Gülçin and Beydemir 2013). Katekol ve rezorsinol gibi sülfamat, sülfamit veya diğer CA inhibitörü olarak bilinen diğer iliģkili gruplardan yoksun olan basit bileģikler kısmen de olsa CA I inhibitörü olarak davrandıkları için yeni bir inhibitör sınıfı olarak sülfonamidlere alerjisi olan hastalara alternatif avantaj sağlayabilir (Gülçin and Beydemir 2013). Ayrıca resveratrol, kafeik asit fenil ester, slimarin, kurkumin gibi çeģitli biyolojik ve farmakolojik özellikleri bulunan fenolik bileģikler CA I ve II izoenzimlerinin güçlü inhibitörleridirler. Özellikle de kurkumin CA I ve II izoenzimi üzerine çok güçlü inhibitör etkiye sahiptir ve bu bileģiğin K i değerleri 2,25-5,63 µm aralığındadır. Bu doğal bileģikler CA I izoenzimi üzerine inhibisyon etkisi gösteren orto-meta pozisyonunda -OH gruplarına sahiptir. Dobutamin ve kurkumin e kıyasla resveratrol, slimarin ve katekol ün daha iyi CA I inhibitörü olduğu rapor edilmiģtir (Gülçin and Beydemir 2013).

99 75 Fenol Katekol Rezorsinol Hidrokuinon Pirogallol Vanilin Salisilik asit Kuersetin Silimarin Morfin Resveratrol Kurkumin CAPE Rozmarinik asit ġekil CA enzimi üzerine inhibisyon etki gösteren bazı fenolik bileģiklerin molekül yapıları (Gülçin and Beydemir 2013). hca II aktivitesi için resveratrol, kateģin, slimarin, dobutamin ve kurkumin in en iyi inhibisyon etkisi ortaya koydukları rapor edilmektedir. Bu basit fenol türevlerinin oldukça belirgin bir Ģekilde yapı aktivite arasında bir iliģki vardır (Gülçin and Beydemir 2013). Kurkumin in yapısındaki CH 3 O, submikromolar hca II inhibitörü olan 1,3 dihidoksi ile kıyaslandığında inhibisyon etkisinde zayıflamaya yol açar. Bu eğilim dobutaminde olduğu gibi para pozisyonundaki -OH yerinde farklı gruplar bulunduğu zaman devam etmektedir. Bu grup maddeler içinde en iyi CA II inhibitörleri μm K i değerleri aralığıyla kateģin, slimarin ve resveratroldür. Öte yandan fenolik asitlerden salisilik, tannik, kafeik, ellajik, gallik, ferulik, siringik, p-kumarik, p-hidroksibenzoik ve rozmarinik asit değerlendirilmiģtir (Gülçin and Beydemir 2013). Kinetik çalıģmalara bakıldığında sülfonamidler, anorganikler ve diğer çalıģılan bütün moleküllerin 4-nitrofenilasetat (4-NPA) substratının yarıģmalı inhibitörü olarak hareket

100 76 ettiğini göstermektedir. Ġnhibitörler substratla kıyaslandığında aktif alandaki boģluğun farklı bölgelerine bğlanırlar. N-NPA ın enzimin hangi bölgsine bağlandığı bilinmemektedir. Fakat 4-NPA nın enzimin fizyolojik substratı olan CO 2 ile aynı bölgeye bağlandığı zannedilmektedir (Gülçin and Beydemir 2013). Çizelge Bazı fenolik bileģiklerin hca I ve II izoenzimleri üzerine inhibisyon K i değerleri ve inhibisyon çeģitleri (Gülçin and Beydemir 2013) Fenolik BileĢikler IC 50 (µm) hca I K i (μm) hca II Ġnhibisyon Türü IC 50 (µm) K i (μm) Ġnhibisyon Türü Fenol * 1,20 YarıĢmasız * 5,50 YarıĢmasız Katekol * 4003,00 YarıĢmasız * 9,90 YarıĢmasız Rezorsinol * 795,00 YarıĢmasız * 7,70 YarıĢmasız Hidrokuinon * 10,70 YarıĢmasız * 0,09 YarıĢmasız Progallol * 7,41 YarıĢmasız * 0,54 YarıĢmasız Salisilik Asit * 560,00 YarıĢmasız * 680,00 YarıĢmasız Tannik Asit * 75,90 YarıĢmasız * 32,80 YarıĢmasız Kuersetin * 99,00 YarıĢmasız * 105,00 YarıĢmasız Guaiakol 24,50 60,20 YarıĢmasız 1,62 2,94 Yarı yarıģmalı Vanillin 21,20 55,65 YarıĢmasız 0,85 1,26 Yarı yarıģmalı CAPE 85,00 115,00 YarıĢmasız 40,00 47,30 YarıĢmasız Ellagik Asit -* 207,00 YarıĢmasız * 146,00 YarıĢmasız Gallik Asit * 1052,00 YarıĢmalı * 758,00 YarıĢmalı Ferulik Asit * 408,00 YarıĢmasız * 210,00 YarıĢmasız Siringik Asit * 919,00 YarıĢmasız * 695,00 YarıĢmasız p-kumarik Asit * 441,00 YarıĢmasız * 675,00 YarıĢmasız P-Hidroksibenzoik Asit * 1061,00 YarıĢmalı * 537,00 YarıĢmalı Rozmarinik Asit 8,00 86,00 YarıĢmasız 47,00 57,00 YarıĢmasız Asetazolamid 7,38 36,00 YarıĢmasız 0,18 3,70 YarıĢmasız Kurkumin * 2,41 * * 0,38 * Slimarin * 1,49 * * 2,51 * Resveratrol * 2,21 * * 2,77 * Morfin 45,00 ** ** 92,3 ** ** *: Kayıt edilemedi. **: Belirlenemedi.

101 Karbonik anhidraz enzimi ve hastalık iliģkisi Hastalıkların tedavi ve teģhisinde CA inhibitörlerinin önemi glokom hastalığının tedavisi için karbonik anhidraz enzimi üzerine yapılan inhibisyon çalıģmalarıyla artmıģtır. Bu çalıģmayla CA enzimlerinin kataliz mekanizmalarıyla birlikte bu enzimlerin dokulardaki dağılımları fonksiyonları ayrıntılı olarak araģtırılmıģtır. Buna bağlı olarak da CA inhibitörleri ve aktivatörleri ile ilgili birçok çalıģma yapılarak yeni inhibitör ve aktivatör maddeler sentezlenmiģtir (ġahin 2008). Önceleri H + ve Na + değiģiminin CA aktivitesinin bir sonucu olduğu ortaya konulmuģtur. Yine Rougohton ve Booth CA ın enzimatik aktivitelerinin, reaksiyon ortamının iyon bileģimine ve kan ph ına bağlı olduğunu ortaya koymuģlardır. Yine ayrıca diyabet ve kronik böbrek yetmezlik bulunan hastaların durumlarının karbonik anhidraz değiģimleri ile iliģkili olduğu ortaya konulmuģtur. Belli patolojik Ģartlar altında ve çeģitli hastalıklarda insan eritrositlerindeki CA I seviyesinde değiģmeler olduğu CA II de ise gözle görülür bir değiģme olmadığı bildirilmiģtir (Gambhir et al. 2007). Ancak Stevens et al. (1978) diyabetli hastalarda CA I ve II izoenzimlerin her ikisinin düzeylerinde azalma olduğunu rapor etmiģlerdir. Yine CA I izoenzimi konsantrasyonunun aneminin çeģitli tiplerinde ve kronik asidozda arttığı bulunmuģtur. Sonuç olarak çeģitli hastalıklarda karbonik anhidraz seviyeleri farklı bulunmuģtur (Gambhir et al. 2007). Karbonik anhidraz izoenzimleri CO 2 in HCO - 3 a katalitik hidrasyonuna bağlı diyabet, hipertansiyon, bazı metabolik bozukluklar gibi patolojik ve fizyolojik süreçlerle iliģkili olduğundan bu ve benzeri hastalıklarda enzim aktivitesi gözle görülebilir Ģekilde değiģtiğinden ve CA inhibitörleri ve aktivatörleri aracılığıyla aktivitelerinin düzenlenmesi potansiyeline sahip olduklarından dolayı birçoğu ödem, glokom, obezite, kanser, epilepsi ve osteoporoz gibi birçok iliģkili oldukları hastalığı tedavi etmek için önemli bir belirteç molekül haline gelmiģtir (Beydemir et al. 2002; Çoban et al. 2009; ġentürk et al. 2009; Ekinci et al. 2010; Fiore et al. 2010). Yüksek göz basıncı (IOP) ile ortaya çıkan glokom hastalığı, hastaların %15-20 oranında görme kaybının ortaya çıkarak nihayetinde körlükle sonuçlanan çok ciddi bir hastalıktır.

102 78 Göz retinasında bulunan CA II izoenzimi göz içi basıncından sorumlu olan baģlıca prtoteinlerdendir. Dolayısıyla glokomlu hastalarda IOP nı düģürmenin en iyi yollarından biri de CA II proteinini inhibe etmektir. Bu amaçla CA II inhibitölerinden olan AZA ve sülfonamidler uzun yıllardan beri kullanılmaktadır (ġahin 2008). CA izoenzimleri diyabet, kanser, yağ, üre oluģumu gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol almaktadır. Diüretikler ve antiglokom ilaçlarının yanısıra antiobezite, antikanser ve antienfeksiyon ilaçlarında da kullanılması gerektiği vurgulanmaktadır. Yine Alzheimer gibi bazı nörodejeneratif hastalıklarda CA etkinliğinin tedavi olanağı sağlayacağı ile ilgili görüģler bulunmaktadır (ġahin 2008) ÇalıĢmanın Amacı Bitkilerin meyve, yaprak, tohum, kök ve gövdelerinde antioksidanlar doğal olarak bulunmaktadır. Vitamin E (α-takoferol), vitamin C (askorbat), ve fenolik bileģikler bu antioksidanların baģlıcalarıdır. Örneğin dünyanın birçok yerinde yaygın olarak bulunan ahududu (Rubus idaeus L.) adı verilen ve rosaceae ailesinden olan kırmızı ahududu, bağıģıklık için faydalı olan birçok fenolik bileģiği içerir ve iyi bir antioksidan kaynağıdır. Bitkiler vitamin ve minerallere ek olarak antosiyanin, fenolik asitler ve falavonoidlerden olan antosiyanin, kateģin, flavonol, flavon, askorbik asit gibi insan hastalıklarına karģı önemli koruyucu etki gösteren antioksidan kaynakları bakımından oldukça zengindir (Gülçin et al. 2011). Bunların yaģayan organizmalarda çok etkili radikal temizleyici özellikleri vardır. Son zamanlarda doğal antioksidant kaynaklarının araģtırılması yukarıda ifade edilen bileģiklerden dolayı önemli hale gelmiģtir. Ayrıca doğal antioksidanlar sentetik antioksidanlardan daha etkili ve daha yararlıdır. Polifenoller, askorbik asit, karotenoidler takofenolleri yüksek miktarda içeren meyve ve sebzeler organizma için oldukça faydalıdır. Bu sebze ve meyvelerin vücuda alınması kardiyovasküler hastalıkları ve kanser gibi kronik rahatsızlıkların riskini önemli ölçüde azaltmaktadır (Bursal et al. 2011)

103 79 Fenolik bileģiklerin yukarıda sayılan özelliklerinin yanında antialerjik, antienflamatuar, antidiyabetik, antimikrobiyal, antipatojenik, antiviral, antitrombotik etkiye sahip olduğu yapılan pek çok araģtırmalarla ortaya konulmuģtur. Antioksidan olarak fenolik bileģikler ve flavonoidler kanser, kalp, katarakt, göz ve alzheimer gibi hastalıkları engellediği ifade edilmiģtir (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Dolayısıyla flavonoid ve fenolik bileģiklerin molekül yapıları itibariyle antioksidan özellikleri ve gıdalardaki görüntü, tat, koku, kalite ve lezzet özelliklerini göstermesi, BHA ve BHT gibi sentetik antioksidanlardan bazılarının karsinojenik v.b zararlı etkilerinden dolayı kullanımı bazı ülkeler tarafından sınırlandırılmıģtır (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Bromfenoller gibi sentetik antioksidanların etkili radikal süpürücü özelliklerine rağmen, sentetik antioksidanların yukarıda ifade edilen olumsuz etkilerinden dolayı (Çetinkaya et al. 2012), oksidatif strese karģı iyi farmakolojik alternatif oluģturabilecek, antioksidant özellik gösteren, ucuz ve sağlıklı farklı fenolik yapıdaki yeni sentetik ve doğal antioksidanlara karģı ilgi artmaktadır (Çetinkaya et al. 2012). Yukarıdaki bilgiler ıģığında antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi ve CA enzim aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları bulunmayan ve molekül yapıları itibariyle antioksidan özellik gösterebilecek fenolik yapıdaki Trihidroksibenzaldehit, 3-4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik Asit, AraĢidonoil dopamin ve flavonoid yapıdaki moleküllerden, ID-8, Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin gibi moleküllerin antioksidan ve antiradikal kapasitelerini araģtırmak ve hca I ve II izoenzimleri üzerine inhibisyon etkilerini araģtırmayı planladık. Ayrıca fenolik bileģikler olan Trihidroksibenzaldehit, 3-4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve AraĢidonoil dopamin moleküllerinin rat eritrositleri total CA enzim aktivitesi üzerine in vivo çalıģmalarını yaparak ileriki süreçlerde bu maddelerin ilaç olarak kullanılma ihtimali sebebiyle literatüre faydalı bilgiler sağlayabileceğini düģündük.

104 80 2. KAYNAK ÖZETLERĠ Ġnsan vücudundaki her bir hücre oksidan ve antioksidan arasındaki dengeyi korumaya çalıģır. Ġnsanlar tarafından solunum yoluyla alınan oksijenin %1-3 ü ROS ne dönüģür. Normal metabolizma Ģartları altında, ROS ve diğer serbets radikal türlerinin sürekliliği ATP üretimi, hücresel redoks döngüsüne eģlik eden anabolik ve katabolik olaylar gibi normal fizyolojik fonksiyonlar için gereklidir. Ancak kimyasallara maruz kalma, kirlilik, radyasyon, sigara içme, sağlıksız beslenme gibi dıģ faktörler ile endojen kaynaklı biyolojik faktörler aģırı serbest radikal üretimi meydana getirebilir. Ġlk baģlangıçta hücrelerde süperoksit (O. 2 ) ve NO. serbest radikalleri oluģur (Rahal et al. 2014). ÇeĢitli endojen hücre ve hücre bileģenleri ROS nin üretimine iģtirak etmektedirler. Bütün bu kritik faktörler hücre homeostazının sağlanmasında ve devamında kritik role sahiptir. Oksidatif stres vücut savunma kapasitesinden daha fazla serbest radikal üretildiği ve homeostatik denge bozulduğu zaman meydana gelir. Böylece hücre yaralanması ve doku hasarı ortaya çıkar. Bu hasar hücre membranlarındaki lipid peroksidasyonu, kalsiyum akıģı, mitokondri ĢiĢmesi ve lizisi ile birlikte hücrelerdeki protein ve DNA hasarını da içerir. Çoklu doymamıģ lipidlerin oksidasyonu oksidatif stresin en önemli göstergelerinden biridir. Lipid peroksidasyon ürünü olan malondialdehit kan ve plazmada kolayca ölçülebilmekte ve oksidatif stresin belirteci olarak kullanılabilmektedir. Ek olarak bu reaksiyonlardan üretilen doymamıģ aldehitlerin hücresel proteinler ve diğer bileģenlerin de modifikasyonuna sebep olduğuna iģaret edilmiģtir. Perokside olan lipidler peroksi radikallerini ve singlet oksijeni üretirler (Rahal et al. 2014). Bazı araģtırmacılar hücresel sinyal proseslerinde serbest radikallerin rolünün olduğunu ortaya koymuģtur. ROS normal fizyolojik konsantrasyonlarda hücresel bazı fonksiyonlar için gereklidir. Fakat yüksek konsantrasyonları nükleik asitler, lipidler, proteinler, PUFA ve karbonhidratlar gibi kritik öneme sahip moleküllere zarar verir.

105 81 Eğer hücre bileģenleri tarafından ROS temizlenemez ise, serbest radikal zincir reaksiyonlarını baģlatarak protein, lipid, nikleik asit gibi biyomoleküllere zarar vererek birçok hastalığın patogenezinde önemli rol oynar (Gülçin and Beydemir 2013). Serbest radikaller ökaryotik hücrelerde redoks dengesini sağlamak için antioksidan savunma sistemi tarafından sürekli dengelenmek zorundadır. ROS ve antioksidan savunma sistemi arasındaki dengesizlik oksidatif zararla sonuçlanan oksidatif strese sebep olur (Yan et al. 2013). ROS endojen kaynaklı dönüģüm için gerekli biyolojik yollarda oluģan ara ürünlerdir. ROS dıģ kaynaklardan da organizmaya girebilir. ROS canlı organizmalarda birçok farklı biyolojik yolla oluģabilir. Normal aerobik solunumda polimorf nükleer lökositler, makrofajlar ve peroksizomlar ROS nin hücreler tarafından üretildiği en önemli yapılardır. ROS nin eksojen kaynakları sigara içme, belli kimyasal ve organik çözücülere maruz kalma ve pestisitlerdir. Prooksidant içerikli bir diyetle beslenme, sigara içme, hava kirliliğine sebep olan ozon artıģı gibi faktörler lipid peroksidasyonuna sebep olarak ROS ni oluģturabilir. Normal hücrelerde prooksidant ve antioksidant arasında bir denge söz konusudur. Bu denge antioksidanlar azaldığı ve oksijen türlerinin üretimi arttığı zaman prooksidan yönüne doğru kayar. Bu durum oksidatif stres olarak adlandırılır. BaĢka bir tanımla da oksidatif stres, resktif oksijen türlerinin üretimi ve oluģan hasarın tamiri ve ara ürünlerin hızlıca uzaklaģtıran biyolojik sistemlerin yeteneği arasındaki dengeyi ifade eder (Gülçin and Beydemir 2013). Beyinde redoks dengesi bozulduğunda meydana gelen oksidatif stres nörodejeneratif hastalıklarla iliģkili olan nöron kaybına sebep olur. ROS türleri nükleik asit kırıklarına, enzim inaktivasyonu, lipid peroksidasyonu ve diğer tahrip edici mekanizmalarda artıģa sebep olur. ROS türleri ile hasara uğramıģ biyomoleküller çoğaldığı zaman nihai olarak hücre ölümüne yol açar (Yan et al. 2013). Stres günümüzde fizyolojik, psikolojik ve diğer çevresel faktörler tarafından biyokimyasal süreçlerdeki dengenin bozulması olarak tanımlanmaktadır. Sosyal, fizyolojik veya fiziksel olarak herhangi bir uyaran vücut tarafından tehdit olarak

106 82 algılanabilir. Stres faktörleri vücut dengesinin sağlanmasında rol alan nörohormonların aktivasyonuna yol açar. Bütün bu fizyolojik etkiler hayvanların sağlık, üreme, büyüme gibi fizyolojik aktivitelerindeki varyasyonları belirler (Rahal et al. 2014). Bu değiģimler Hans Sely tarfından ortaya konulan genel adaptasyon sendromunun bir sonucu olarak ortaya çıkabilir ve uyaran ortadan kalktığında tekrar normal durumuna dönebilir. Güçlü ve uzun süre strese maruz kalma, yüksek negatif enerji, adaptasyon mekanizmalarında artıģ patojenler tarafından enfeksiyona duyarlılıkta artıģa ve verimlilikte azalmaya yol açarak büyük ekonomik kayıpları ortaya çıkarabilir (Rahal et al. 2014). Fagositlerden kaynaklanan oksijen, azot ve karbon temelli reaktif türlerin sayıları kronik inflamasyonda artar. Aerobik organizmalar oksijenli bir çevre ortamında canlı kalarak büyüyebilir. Bütün aerobik organizmalar zararlı molekülleri modifiye etmek ve uzaklaģtırmak için antioksidan savunma sistemlerine sahiptir. Hücreler kimyasal antioksidanlar ve antioksidan enzimlerin koordinasyonu ile oksidatif strese karģı korunurlar. Aynı zamanda antioksidan enzimler doğal antioksidnatların yeni tipi olarak yiyeceklerde değerlendirilmektedir. Antioksidant enzimler lipid hidroperoksitlerini azaltmak ve oksijen ile birlikte ROS ni kaldırmak için yararlı bir Ģekilde kullanılabilir. Patolojik olayların sonucu olarak oksidatif stres ortaya çıktığında antioksidant savunma sistemleri antioksidant enzimlerin üretimini ve düzenlenmesini teģvik eder (Gülçin and Beydemir 2013). Birçok hayvan ve insanlar beslenme ve hayvancılık uygulamaları, iklim değiģiklikleri, ulaģım, terapötik ve proflaktik etkinlikler, çeģitli stres faktörleri gibi biyolojik ve çevresel faktörlere maruz kalmaktadır. Bu faktörlere karģı mücadele etme yeteneği sağlık ve verimlilik için gereklidir (Rahal et al. 2014). Günümüzde tüm dünya kardiyovasküler hastalıklar, hipertansiyon, diyabet, farklı kanser türleri ve diğer hastalıklar gibi kronik sağlık sorunlarına Ģahitlik etmektedir. Tıbbi

107 83 araģtırmalar bu kronik hastalıkların kontrolü için diyetin potansiyel bir araç olarak hizmet edebileceğini göstermektedir. Yetersiz beslenmeyle birlikte düzenli tütün çiğneme ve kullanımı, Amerika birleģik devletlerinde akciğer kanserinden meydana gelen ölümlerde en önemli potansiyel sebep olarak ortaya konulmaktadır (Rahal et al. 2014). Birçok kiģi sıkıntı, stres ve oksidatif stresle karģı karģıyadır. Vücut homeostsındaki herhangi bir değiģim dokuların uzaklaģtırmayacağı miktarda serbest radikal üretimine yol açabilir. Serbest radikaller farklı moleküllerle etkileģerek hücre içinde membran, protein ve genlerin oksidatif hasarına sebep olabilir. Bu süreç daha fazla serbest radikal üretimini ortaya çıkararak bir yıkım zincirini baģlatır (Rahal et al. 2014). Oksidatif hasar kardiyovasküler hastalıklar, nöronal dejenerasyonlar, kanser, yaģlanma prosesi gibi birçok hastalığın patogenezinde rol alır. Aynı zamanda terapötik ajanlara karģı ortaya çıktığı da gözlenmiģtir. Sigara, hava kirliliği, güneģ ıģığı, radyasyon gibi çevresel faktörler serbest radikal üretimini tetikler. En önemlisi stres hastalıkların temel etyolojilerinden biridir. Stres soğuk, sıcaklık, hipoksi, fiziksel ekzersiz veya yetersiz beslenme gibi çeģitli etkenlerden köken alır (Rahal et al. 2014). Ġnsan vücudu ROS nin etkilerini sınırlamak için antioksidan savunma sistemlerinden faydalanır. Eksojen antioksidanlar fenolik bileģikler, alkoloid ve streroidler gibi çeģitli sınıf molekülleri kapsar (Rahal et al. 2014). Glutatyon peroksiaz (GSH-Px) ve katalaz ek antioksidan sistemi olarak görev yaparlar ve membran kolaylıkla baģtan baģa geçebilen Fe 2+ geçiģ metalleriyle reaksiyon vererek tehlikeli olan HO. radikallerine dönüģebilen H 2 O 2 i H 2 O ya dönüģtürürler (Yan et al. 2013). Antioksidant moleküller küçük konsantrasyonlarında bile okside edici maddelerin oksidasyonunu yararlı bir Ģekilde geciktiren ve inhibe eden moleküller olarak tanımlanmıģtır. Antioksidant bileģikler serbest radikallleri temizleyebilir ve farmasötik ürünler ile yiyeceklerin iģleme ve depolama süresince kötüleģmesinin en önemli sebebi

108 84 olan lipid peroksidasyonunu geciktirmek suretiyle onların yaģam ömürlerini uzatır. Antioksidanlar aynı zamanda ROS ve serbest radikallerin etkilerinden vücudu korurlar. Antioksidanlar lipid peroksidasyonunu geciktirmelerinin yanısıra kronik hastalığın ilerleme sürecini de geciktirirler. Son yıllarda doğal olan ve besinlerde bulunan antioksidanlar ortaya konulmuģ ve tanımlanmıģtır. Özellikle bitkisel kaynaklı antioksidanlar üzerine çalıģmalar yapılmıģtır ve büyük ilgi görmüģtür. Antioksidanlar oksidasyon ile meydana gelen radikalik zincir reaksiyonlarını önlemek için yiyeceklere ilave edilmiģtir. Böylece gıdalarda oksidasyon sürecinin baģlangıcındaki tetikleyici reaksiyonları inhibe ederek geciktirmek suretiyle gıdaların raf ömürlerinin uzamasına yardımcı olmuģlardır. Yiyecek komponentlerinin antioksidan kapasitesini belirlemek için antioksidan kapasite ve aktivite terimi birbirinin yerine sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak kabul edilmelidir ki, bunlar farklı terimlerdir. Aktivite spesifik antioksidan ve oksidan arasındaki reaksiyonun hız sabitinin oranını ifade eder. Kapasite ise bir örnek tarafından belli bir serbest radikal miktarının uzaklaģtırılmasının ölçüsüdür (Gülçin and Beydemir 2013). Antioksidant içerikli yiyeceklerin çeģitli insan hastalıklarının geliģmesindeki etkisi uzun süre tartıģılmıģtır. Meyve ve sebzelerin tüketimi koroner plak oluģumu gibi bazı kronik hastalıkların riskini azaltmasıyla iliģkilendirilmiģtir. Bu durum fenolik ve flavonoid bileģiklerin düģük yoğunluklu lipoprotein (LDL) kolesterolünün oksidasyonunu inhibe ederek antioksidan özellik göstermesinden kaynaklanıyor olabilir. Ayrıca epidemiyolojik araģtırmalar meyve ve sebze alımının yaģla iliģkili koroner kalp hastalığı ve kanser gibi hastalıklardan kaynaklanan ölümle ters orantılı olduğunu ve bu durumun meyve ve sebzelerin antioksidan özellikleriyle iliģkili olduğunu göstermiģtir (Gülçin and Beydemir 2013 ). GeçmiĢten bugüne kadar geçen süreçte belli antioksidanlardan yoksun diyetle beslenen hayvan modelleriyle yapılan çalıģmalarda kronik hastalıkların tetiklendiği ve arttığı görülmüģtür. Son otuz yıldan bugüne kadar insanlarda kronik hastalıkları önlemede, hastalıklarla beslenme arasındaki iliģkinin nasıl olduğu ile iliģkili olarak yaygın biçimde antioksidant içerikli besinler kullanılmıģtır (Mayne 2013).

109 85 Sebze ve meyvelerce zengin bir diyetin kanser ve kardiyovasküler hastalıklar gibi çeģitli hastalıklara karģı koruyucu etki gösterdiği rapor edilmiģtir. Meyve ve sebzelerden sağlanan koruma için düģünülen temel besin maddeleri antioksidanlardır. Bunun için yorumlanan 200 epidemiyolojik araģtırma değerlendirildiği zaman meyve ve sebze alımının artması ile ortaya çıkan koruyucu etkinin, meyve ve sebzelerde bol miktarda bulunan polifenolik antioksidanlardan kaynaklandığı sonucunu doğurmuģtur (Rahal et al. 2014). Bu farkındalık son 20 yılda akģam yemeğinde antioksidanlarca zengin meyve ve sebzelerde muazzam bir artıģa yol açmıģtır. Fakat kronik sağlık problemlerinin hala niçin azalmayarak tersine arttığı sorusu önemli bir olgu olarak karģımızda durmaktadır. Bunun sebebinin vücut dokularında antioksidanların zengin olması durumunda ne olduğu veya açıklanamamıģ baģka faktörlerin varlığının da olduğu ile ilgili muhtemel sorundan kaynaklandığı düģünülmektedir (Rahal et al. 2014). Doğal kaynakların en önemli biyokaktif bileģikleri özellikle fenolik ve flavonoid bileģiklerdir. Çünkü bu bileģikler doğal kaynakların antioksidan özelliklerinden sorumludur. Sonuç olarak meyve sebze tüketimi koroner kalp hastalığı ile negatif iliģkilidir. Fenolik bileģikler aynı molekül içinde aromatik halkalarına bağlı iki veya daha fazla hidroksil gurubu içerir. En basit örnek 3-benzendiollerdir. Her biri benzen halkasına bağlı iki hidroksil gurubu bulundurur. Her ne kadar alkollere benzeselerde hidroksil gurubunun doymuģ bir hidrokarbona bağlı olmaması gibi eģsiz özelliklerinden dolayı alkol sınıfında değillerdir. Fenolik bileģikler aromatik halkalarına oksijenin sıkı Ģekilde bağlanması ve oksijen ile hidrojen arasındaki bağın ise daha gevģek olması dolayısıyla yüksek asiditeye sahip moleküllerdir. Fenollerdeki hidroksil gruplarının asitliğinin, alifatik alkolller ile karboksilik asitler arasında olduğunu ifade edebiliriz. Fenollerdeki hidroksil gruplarının pka sı 10 ile 12 aralığındadır. Fenolik bileģiklerden negatif fenolat veya fenoksid iyonuna pozitif hidrojen iyonunun verilmesi tuzlarını oluģturur. Fenolik bileģikler oksijen atomlarındaki pi elektronlarını kendi halkalarına bağlamalarıyla yüksek reaktiflik gösteren moleküllerdir. Bitkisel kaynaklı besinlerde bir veya daha fazla aromatik halkaya sahip olan ve farklı biyolojik aktivite gösteren fenolik

110 86 bileģikler bulunmuģtur. Bu bileģikler gıda veya gıda maddelerine renk, tat ve koku sağlarlar. Basit fenolik maddeler tek bir benzen halkasıyla ĢekillenmiĢ olan meyve ve tohumlarda bulunan 3-etilfenol ile 3-4 dimetilfenol, kafeik asit ve ferulik asit i içeren asit gurubundaki hidroksi sinnamik asit, flavonoidler ve kateģinler, proantasiyaninler, antosiyanidinler ve flavonolleri içeren falavonoidlerin glikozile türevleri gibi monofenolleri içerir. Taninler daha karmaģık ve yüksek molekül ağırlıklıklarıyla birlikte daha az tanımlanmıģ ve suda çözünen maddelerdir. Fenolik maddelerin her gün gram düzeyinde alınması fazla olabilir. Flavonoidler için tanımlanan günlük alım miktarı birkaç miligramdan daha fazla değildir. Fenolik bileģiklerin orto veya para pozisyonundaki hidroksil gruplarının stabilitesi ve elektron yoğunluğu artmadığı, oksijen ile hidrojen arasındaki bağ enerjisi düģmediği ve lipid serbest radikallerine karģı reaktivitesi yükselmediği müddetçe aktif antioksidanlar değillerdir. Meta pozisyondaki fenolik bileģiklerin stabilitesi sınırlı bir etkiye sahiptir. Sterik ve elektronik etkiler zincir kırıcı antioksidanların stokiyometrik ve antioksidant aktivitelerinden sorumludur (Gülçin and Beydemir 2013). CA izoenzimleri ilk olarak 1993 yılında sığır eitrositlerinde tanımlanmıģ olan α, β, γ, δ ve ε olmak üzere bağımsız beģ farklı gen ailesi tarafından kodlanır. hca II izoenzimi 23,9 kda büyüklüğünde oldukça büyük bir prtoteindir. Ayrıca diğer karbonik anhidraz izoenzimlerine gör aktivitesi oldukça yüksektir. hca I izoenzimi 30 kda büyüklüğünde bir proteindir. Eritrosit, göz lensi, kornea ve kolon epitelinde bulunur. Hücre içinde sitoplazmada yer alan CA I izoenzimi çözünebilir yapıdadır ve eritrositlerde hemoglobinden sonra en bol bulunan bir proteindir. Eritrositlerde CA II enziminden yaklaģık 5 kat daha fazla bulunmasına rağmen katalitik aktivitesi CA II ye göre oldukça düģüktür (ġahin 2008). Kabonik anhidraz enzimleri vücutta birçok fizyolojik aktivitede rol alırlar. Bunlardan en önemlisi CO 2 ve H 2 O dan karbonik asit ve HCO - 3 oluģumunu iki basamakta çift yönlü olarak katalizleme ve ph ın dengelenmesinde önemli fonksiyon icra etmesidir (Beydemir and Gülçin 2004). Karboksilik, sülfonik ve fosforik asit esterlerinin hidrolizlerinde CA enzimi aracılık etmektedir. CA enzimi, hidrataz aktivitesi dıģında

111 87 elektrofilik merkeze nükleofilik atakları içeren aldehit, alkil ve alkil prüvatların hidratasyonu, pirüvik, sülfonik ve fosforik asit esterlerinin hidrolizi gibi fonksiyonlar icra eder. CA enziminin esteraz aktivitesini gösteren bu özelliğinin vücutta her hangi bir fonksiyonu olup olmadığı henüz tam olarak açıklanamamıģtır (ġahin 2008). CA izoenzimlerinin yapıları tamamen birbirinden farklıdır. Ancak katalitik bölgelerinin yapısında aktif rol üstlenen gruplar neredeyse tamamen aynıdır. CA enzimleri katalitik bölgelerindeki boģluklar ve Zn 2+ varlığıyla birçok molekül ile etkileģime girebilmektedir. Onun bu özelliği iliģkili oldukları hastalığın tedavisi için CA enzimlerinin inhibisyonu veya aktivasyonu çalıģmalarına yönelik hız kazandırmıģ ve belirteç bir molekül olarak kullanılmasını sağlamıģtır. CA enzimi inhibisyonu üzerine yapılan çalıģmalarda sülfonamid ve türevlerine karģı ilgisinin yüksek olduğu ve bu maddelerle yüksek inhibisyona uğradıkları görülmüģtür. Son zamanlarda antioksidan araģtırmaları yapılan birçok fenolik yapıdaki bileģiklerin de CA enzimi üzerine inhibisyon etki gösterdikleri ve CA inhibitörlerinin yeni potansiyel bir sınıfı olarak fonksiyon gösterebilecekleri ile ilgili çalıģmalar yapılmaktadır (Gülçin and Beydemir 2013).

112 88 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Kullanılan alet ve cihazlar Saf su cihazı Ġnkübatör Çalkalayıcı ph metre Hasas terazi Vorteks Otomatik pipetler Elektroforez UV lamba Magnetik karıģtırıcı Spektrofotometre küveti UV-VIS Sepektrofotometre Dijital fotoğraf makinası Derin dondurucu (-20 ve -80 o C) : Mes, MP Minipure : JEIO TECH, model ON-11, Kore ve Wiseven : JEIO TECH, model SK-300, Kore : HANNA, model H12211 ve Thermo : Shimadsu, model AUX320 : JEIO TECH, model UM 96EB, Kore : Eppendorf, Gilson : Biorad : CAUTĠON Type T D 5x 20x 2A : NÜVE, model MK418 : 1 ve 3 cm 3 lük kuartz küvet : Shimadsu, UV-1208 : FUJĠFĠLM Corporatioon DĠGĠTAL CAMERA, FinePix S2995 : SANYO, Japan Kullanılan kimyasal maddeler Sodyum dihidrojen fosfat (NaH 2 PO 4 ), Potasyum ferrosiyanür( K 3 Fe(CN) 6 ), triklor asetik asit (TCA), demir-iii-klorür (FeCl 3 ), potasyum peroksidisülfat (K 2 O 8 S 2 bakır-iiklorür (CuCl 2 ), sodyum asetat (NaCH 3 COO), hidroklorik asit (HCl), Tris, demir-iisülfat (FeSO 4 ), demir-ii-klorür (FeCl 2 ), disodyum hidrojen fosfat (Na 2 HPO 4 ), metiyonin, etanol, etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), amonyum tiyosiyanat (NH 4 SCN), sodyum bikarbonat (NaHCO 3 ), sodyum hidroksit (NaOH), sodyum sülfat

113 89 (NaSO 4 ), sodyum perklorat (NaClO 4 ), disodyum karbonat (Na 2 CO 3 ), brom timol mavisi, sodyum barbital (C 8 H 11,N 2 NaO 3 ), akrilamid, N-N'-metilen bisakril amid, sodyum dodesil sülfat (SDS), (TEMED), (PER), glisin, gliserin, β-merkaptoetanol, izopropanol, commessie brillant blue, p-nitrofenil asetat, metanol, asetik asit MERCK den, sığır serum albümin, CNBr ile aktifleģtirilmiģ sefaroz 4B-L-trozin, cis-9, cis-12-oktadekanoik asit (linoleik asit), 2,2-difenil-1-pikril hidrazil (DPPH), polyoksietilen sorbitan monolaurat (Tween 20), nitroblue tetrazolium (NBT), 3-(2- piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazin-4',4''-disülfonikasit sodyum tuzu (Ferrozine), riboflavin (Vitamin B2), N-N-Dimetil-p-fenil-enediamin dihidroklorür (DMPD), neokuprin hidrat (C 4 H 12 N 2.XH 2 O), 2,2'-Azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit diamonyum sülfat (ABTS), inhibitör olarak kullanılan ID-8 (C 6 H 14 N 2 O 4 ), 3,4-dihidroksi-5-metoksi benzoik asit (C 8 H 8 O 5 ), silikristin (C 25 H 22 O 10 ), malvin (C 29 H 28 O 17 ), pelargonin (C 27 H 31 O 15 ), oenin (C 23 H 25 O 2 ), araģidonoil dopamin (C 28 H 41 NO 3 ), callistephin (C 21 H 21 O 10 ), 2,4,6-trihidroksi benzaldehit (C 6 H 2 CHO) Sigma Aldrich Company den temin edilmiģtir Kullanılan çözeltiler ve hazırlanıģı 1- Antioksidan aktivite tayinleri için çalıģılan yöntemlerde kullanılmak üzere; A- FRAP METODU tayini için; 1. Asetat tamponu (0,3 M ph: 3,6): 2,4 g NaCH 3 COO tartılarak yaklaģık 80 ml saf suda çözüldü. Sonra 1 N lik HCl çözeltisi ilavesi ile ph 3,6 ya ayarlandı. Son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 2. HCl çözeltisi (40 mm): %37 lik HCl den 0,334 ml alınarak bir miktar distile suya ilave edildi. Son hacin distile su ile 100 ml ye tamamlandı. 3. TPTZ çözeltisi (10 mm): Tris piridil triazin den 0,312 g tartıldı ve 40 mm lık 100 ml HCl çözeltisine eklenerek çözüldü. 4. Demir-III-klorür çözeltisi (20 mm) : 0,54 g FeCl 3.6H 2 O tartıldı ve bir miktar suda çözüldü. Son hacim distile suyla 100 ml ye tamamlandı.

114 90 5. FRAP Reaktifi: 10 hacim 0,3 M lık asetat tamponu, 1 hacim 10 mm lık TPTZ ve 1 hacim 20 mm lık demir-iii-klorür çözeltisi karıģtırılarak hazırlandı. B- Demir indirgeme metodu (Fe 3+ Fe 2+ ) için; 1. Fosfat Tamponu (0,2 M, ph:6,6): NaH 2 PO 4 dan 2,4 g alındı ve yaklaģık 90 ml saf suda çözüldü. Sonra ph metre yardımıyla 1 N lik NaOH damla damla ilave edilerek çözeltinin PH ı 6,6 ya ayarlandı. En son hacim distile suyla 100 ml ye tamamlandı. 2. Potasyum Ferrisiyanür Çözeltisi (%1 lik): K 3 Fe(CN) 6 dan 1 g tartıldı ve bir miktar distile suda çözüldü. Son hacim 100 ml ye tamalandı. 3. Triklor asetik asit çözeltisi (%10 luk): 10 g TCA alındı ve bir miktar saf suda çözüldü. Son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 4. Demir-III-klorür çözeltisi (%0,1 lik): 0,17 g FeCl 3.6H 2 O alındı ve bir miktar saf suda çözüldü. Son hacim distile suyla 100 ml ye tamamlandı. C- ABTS radikali giderme aktivitesi (radikal katyon renksizleģtirme) tayini için; 1. Fosfat tamponu (0,1 M, ph:7,4): Na 2 HPO 4 ten 1,42 g alındı ve yaklaģık 90 ml saf suda çözüldü. Sonra 1 N lik HCl çözeltisi ilavesi ile ph 7,4 e ayarlandı. Son hacim distile suyla 100 ml ye tamamlandı. 2. ABTS çözeltisi (0,2 mm): 11 mg ABTS alınarak ph sı 7,4 ve 0,1 M lık fosfat tamponuna ilave edilerek bir gece boyunca magnetik karıģtırcıda tamamen çözülünceye kadar karıģtırıldı. En son hacim distile suyla 100 ml ye tamamlandı. 3. Potasyum persülfat çözeltisi (2,5 mm): 0,663 g K 2 O 8 S 2 tartıldı ve ph sı 7,4 olan 0,1 M lık bir miktar fosfat tamponuna ilave edilerek manyetik karıģtırıcı yardımıyla çözüldü. Son hacim distile suyla 100 ml ye tamamlandı. D-Bakır indirgeme metodu (CUPRAC) tayini için; 1. Bakır-II-klorür (0,01 M): 0,134 g CuCl 2 alındı ve bir miktar saf suda çözüldü. Son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 2. Neokuprin (7, M): 0,156 g Neokuprin alındı ve bir miktar etil alkolde çözüldü. Son hacim etil alkol ile 100 ml ye tamamlandı.

115 91 3. Amonyum asetat tamponu (1 M): 7,7 g CH 3 COONH 4 tartıldı ve 90 ml saf suda çözüldü. Sonra 1 N lik HCl ile ph sı 6,5 e ayarlandı. Son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. E- DMPD radikali giderme aktivitesi tayini için; 1.DMPD çözeltisi (0,1 M): 0,105 g DMPD tartıldı ve bir miktar distile suda çözüldü. Son hacim 5 ml ye tamamlandı. 2. Sodyum asetat tamponu (0,1 M, ph:5,25): 0,82 g NaCH 3 COO alınarak yaklaģık 90 ml saf suda çözüldü. ph metre yardımıyla 1 N lik HCl ilavesi ile ph sı 5,25 e ayarlandı. Son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 3. Demir-III-klorür çözeltisi (0,05 M): 0,81 g FeCl 3 alındı ve bir miktar saf soda çözüldükten sonra son hacim distile suyla 100 ml e tamamlandı. 4. N-N'-Dimetil-p-fenilendiamin radikalinin (DMPD.+ ) hazırlanması (0,001 M): 0,1 M lık DMPD çözeltisinden 1 ml alındı ve 1 M lık ph sı 5,25 olan 100 ml lik asetat tamponuna ilave edildi. Bunun üzerine 0,05 M lık FeCl 3 çözeltisinden 0,2 ml eklendi. Toplam hacim 101,2 ml oldu. F- Bipiridil metal Ģelatlama aktivitesi tayini için; 1. Tris-HCl tamponu (0,1 M, ph:7,4): 1,211 g tris tartıldı ve 90 ml saf suda çözüldü. Sora 1 N lik HCl ilave edilerek ph metre yardımıyla ph 7,4 e ayarlandı. Son hacim distile su ile 100 ml ye tamamlandı. 2. Demir-II-sülfat çözeltisi (2 mm): 55,6 mg FeSO 4.7H 2 O alındı ve bir miktar saf suda çözüldü. Son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 3. Hidroklorik asit (%2 lik): %37 lik HCl den 1,6 ml alındı ve bir miktar saf suya ilave edildi. Son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 4. Bipiridil Çözeltisi (%0,2 lik): 0,2 g bipiridil tartıldı ve %2 lik 100 ml HCl çözeltisine ilave edilerek hazırlandı. G- Süperoksit anyon radikali (O 2.- ) giderme aktivitesi tayini için; 1. Fosfat tamponu (0,05 M, ph:7,8): 0,71 g Na 2 HPO 4 alındı ve 90 ml saf suda çözüldü.

116 92 Sonra 1 N lik HCl ilavesi ve ph metre yardımıyla ph 7,8 e ayarlandı. Son hacim distile suyla 100 ml ye tamamlandı. 2. Riboflavin çözeltisi (1, M): 12 mg riboflavin alındı ve 0,05 M lık ph sı 7,8 olan fosfat tamponuna ilave edilerek çözüldü. 3. Metiyonin çözeltisi (4, M): 0,665 mg metiyonin tartıldı ve ve ph ı 7,8 olan 0,05 M lık bir miktar fosfat tamponuna ilave edilerek çözüldü. Son hacim aynı fosfat tamponuyla 100 ml ye tamamlandı. 4. Nitroblue tetrazolium çözeltisi (8, ): 12,2 g NBT alındı ve ph ı 7,8 olan 0,05 M lık bir miktar fosfat tamponuna ilave edilerek çözüldü. Son hacim aynı fosfat tamponuyla 100 ml ye tamamlandı. H- DPPH serbest radikal (DPPH. ) giderme aktivitesi tayini için; 1.DPPH çözeltisi (10-3 M): 40 mg DPPH alındı ve bir miktar saf etanol de karıģtırılarak çözüldü. Son hacim etanol ile 100 ml ye tamamlandı. I-Total antioksidan aktivite tayini için; 1. Fosfat tamponu (0,01 M, ph:7,4): 0,48 g NaH 2 PO 4 tartıldı ve 90 ml saf suda çözüldü. 1 N lik NaOH ilavesi ve ph metre yardımıyla ph sı 7,4 ayarlandı. Çözeltinin son hacmi saf suyla 100 ml ye tamamlandı. 2. Hidroklorik asit çözeltisi (%3,5 lik): %37 lik HCl den 9,46 ml alındı ve bir miktar saf suya ilave edildikten sonra saf suyla son hacim 100 ml ye tamamlandı. 3. Demir-II-klorür çözeltisi (20 mm): 281 mg FeCl 2.3/4H 2 O tartıldı ve bir miktar %3,5 lik HCl içinde çözüldükten sonra aynı asit çözeltisi ile 100 ml ye tamamlandı. 4. Amonyum tiyosiyanat çözeltisi (%30 luk): 30 g NH 4 SCN alındı ve bir miktar saf suda çözüldükten sonra son hacim distile suyla 100 ml ye tamamlandı. 5. Linoleik asit emülsiyonu (0,017 M): 265 µl linoleik asit 0,01 M ve ph sı 7,4 olan 50 ml fosfat tamponuna karıģtırma iģlemi ile birlikte çok yavaģça damla damla ilave edildi. Emülgatör olarak da 0,01 M ve ph sı 7,4 olan 140 ml fosfat tamponuna 90 ml tween 20 aynı Ģekilde karıģtırılarak ilave edildi. Son olarak da hazırlanan bu iki çözelti birbirine eklendi.

117 93 2-Karbonik anhidraz enzimi saflaģtırılması ve aktivitesi tayin yöntemlerinde kullanılmak üzere: A- Sefaroz-4B matriksi üzerinde afinite jeli hazırlanırken kullanılan tampon; 1. Karbonat tamponu (0,2 M, ph:8,8): 16,8 g NaHCO 3 alındı ve yaklaģık 950 ml saf suda çözüldü. Sonra 1 N lik NaOH ilavesi ve ph metre yardımıyla çözeltinin ph sı 8,8 e ayarlandı. Son hacim saf su ile 1 L ye tamamlandı. B- Afinite kolonunun dengelenmesi için kullanılan dengeleme tamponu; 1. Tris-HCl sodyum sülfat tamponu (25mM / 0,1M-pH:8,7): 3,03 g Tris ve 14,2 g Na 2 SO 4 tartıldı ve yaklaģık 950 ml saf suda çözüldü. Daha sonra 1N lik HCl ve ph metre yardımıyla PH 8,7 e ayarlandı. Son hacim distile suyla 1 L ye tamamlandı. C- Hemolizatın tatbikinden sonra kolona tutunmuģ safsızlıkların yıkanmasında kullanılan yıkama tamponu; 1. Tris-HCl sodyum sülfat tamponu (25 mm / 22 mm, ph:8,7): 3,03 g Tris ve 3,12 g Na 2 SO 4 alınarak 950 ml saf suda çözüldü ve 1N lik HCl çözeltisi ile ph 8,7 e ayarlandı. Son hacim saf su ile 1 L ye tamamlandı. D- Kolona tutunmuģ CA I izoenzimlerinin elüsyonunda kullanılan tampon; 1. Fosfat tamponu (25 mm Na 2 HPO 4 / 1 M NaCl, ph:6,3): 2,2 g Na 2 HPO 4 ve 14,63 g NaCl alındı ve ph:6,3 e titre edildi. Son hacim saf suyla 250 ml ye tamamlandı. E- Kolona tutunmuģ CA II izoenzimlerinin elüsyonunda kullanılan tampon; 1. Asetat tamponu (0,1 M NaCH 3 COO / 0,5 M NaClO 4, ph:5,6): 6,13 g NaClO 4 ve 1,36 g NaCH 3 COO ayrı ayrı tartıldı ve 90 ml saf suya ilave edilerek çözüldü. Sonra 1N lik HCl ile ph 5,6 ya kadar titre edildikten sonra son hacim saf suyla 100 ml ye tamamlandı.

118 94 F- Alınan elüatların diyalizlenmesinde kullanılan tampon; 1. Tris-sülfat tamponu (0,05 M, ph:7,4): 6,06 g Tris 950 ml saf suda çözüldü. Sonra 1 N lik H 2 SO 4 ile ph 7,4 e kadar titre edildikten sonra son hacim saf su ile 1 L ye tamamlandı. G- Proteinlerin kantitatif tayininde kullanılan çözelti; 1. Commessie brillant blue G-250 reaktifi: 100 mg commessie brillant blue G-250 tartılarak %95 lik 50 ml etanolde çözüldü. Sonra bu çözeltiye %95 lik fosforik asit ilave edildi. Son hacim saf su ile 1 L ye tamamlandı. H- CO 2 -hidrataz aktivitesi ölçümünde kullanılmak üzere; 1. Bikarbonat tamponu (0,15 M Na 2 CO 3 / 0,1 M NaHCO 3 ): 15, 9 g Na 2 CO 3 ve 8,4 g NaHCO 3 alınarak bir miktar saf suda çözüldü. Son hacim distile suyla 1 L ye tamamlandı. 2. Veronal Tamponu (0,025 M): 5,15 g sodyum barbital (C 8 H 11 NaO 3 ) tartıldı ve 950 ml saf suda çözüldü. Daha sonra 1 N lik HCl ile ph 8,2 ye kadar titre edildi ve son hacim distile suyla 1L ye tamamlandı. 3. Ġndikatör çözelti (%0,04 lük): Bunun için 0,1 g brom timol mavisi tartıldı ve 16 ml 0,01 N lik NaOH çözeltisine ilave edilerek çözüldü. En son hacim saf su ile 250 ml ye tamamlandı. 4. CO 2 çözeltisi: Soğuk suyun içinden 3 kez olmak üzere her defasında 5 er dakika CO 2 gazı geçirilerek hazırlandı. I- CA I ve II izoenzimleri esteraz aktivitesi ölçümünde kullanılmak üzere; 1. Tris-sülfat tamponu( 0,05 M, PH:7,4): 6,06 g Tris alındı ve 950 ml saf suda çözüldü. Sonra 1 N lik H 2 SO 4 ile ph 7,4 e kadar titre edildikten sonra son hacim distile suyla 1 L ye tamamlandı. 2. Paranitrofenilasetat çözeltisi: 0,014 g PNF tartıldı ve 1 ml aseton içinde çözüldü. Sonra bu çözelti 24 ml saf su üzerine damlalık kullanılarak yavaģça eklendi.

119 95 Ġ- Hemoglobin tayininde kullanılmak üzere; 0,2 g K 3 Fe(CN) 6 + 0,05 g KCN, 1 g NaHCO 3 + 0,28 g KH 2 PO 4 alınarak bir miktar distile suda çözüldü ve hacmi bir litreye tamamlandı. Sonra üzerine 0,5 ml Triton X-100 katıldı ve ph 7,4 e ayarlandı J- SDS-Poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) kullanılmak üzere; 1. Tris tamponu (1 M, ph:8,8): 12,1 g Tris tartıldı ve 90 ml saf suda çözüldü. Sonra 1 N lik HCl çözeltisi ile ph 8,8 e titre edildi. En son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 2. Tris tamponu (1 M, ph:6,8): 12,11 g tris tartılarak 90 ml saf su içinde çözüldü. 1 N lik HCl ile ph 6,8 e titre edildikten sonra son hacim saf suyla 100 ml ye tamamlandı. 3. Akrilamid-bisakriamid çözeltisi: 30 g akrilamid, 0,8 g bisakrilamid alınarak bir miktar saf suda çözüldü. Son hacim saf suyla 100 ml ye tamamlandı. 4. Sodyum dodesil sülfat çözeltisi (%10 luk): 10 g SDS alındı ve bir miktar saf suda çözüldü. Son ağırlık saf su ile 100 g a tamamlandı. 5. TEMED çözeltisi: %5 lik hazırlanır. 6. PER çözeltisi: %15 lik hazırlanır. Yürütme tamponu: 1,5 g Tris ile 7,2 g glisin 450 ml saf suda çözüldü. Üzerine 5 ml %10 luk SDS ilave edildi. Son hacim saf su ile 500 ml ye tamamlandı. Numune tamponu: 1 M lık ve PH sı 6,8 olan Tris-HCl tamponundan 650 µl, %10 luk SDS den 1 ml, %100 lük gliserinden 1 ml, %0,1 lik brom timol mavisinden 1 ml alındı ve saf su ile 10 ml ye tamamlandı. Bu tampon kullanılmadan hemen önce 950 µl tampona 50 µl β-merkaptoetonal oranı korunacak Ģekilde β-merkaptoetonal eklendi. Fiksasyon çözeltisi: %50 izopropanol, %10 TCA, %40 saf su oranı korunacak Ģekilde ihtiyaca göre hazırlandı.

120 96 Jelin boyanması için kullanılan çözelti: %0,1 lik commessie brillant blue G-250 çözeltisinden 290 µl, %50 lik metanolden 100 ml, %10 asetik asit çözeltisinden 20 ml, %40 oranında su olacak Ģekilde 79,71 ml su karıģtırılarak hazırlandı. Boyalı jeli yıkama tamponu: %50 lik metanolden 250 ml, %10 luk asetik asitten 50 ml, %40 oranında saf su olacak Ģekilde 200 ml karıģtırılarak hazırlandı. K- Antioksidan ve inhibitör olarak kullanılan fenolik ve flavonoid maddelerin stok çözeltilerinin hazırlanması için; 1. Her antioksidan ve inhibitör madde ml çözeltide 1 mg (mg/ml) olacak Ģekilde saf suda çözülerek stok çözeltileri hazırlandı. Daha sonra seyreltilmiģ olarak kullanılması gereken durumlarda bu stok çözeltilerden seyreltilerek çalıģıldı. ÇalıĢtığımız bütün maddeler için çözücü olarak saf su kullanıldı. Sadece ID-8 maddesi saf suda çözünmediği için çözücü olarak %10 luk DMSO kullanıldı ÇalıĢmada Kullanılan BileĢikler Ġçin Antioksidan Kapasite Tayinleri Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kuvveti tayini Ġndirgeme kuvveti tayini Oyaizu (1986) yöntemi ne göre yapıldı. Bunun için stok çözeltiden 10, 20, 30 μg/ml olacak Ģekilde alınarak tüplere aktarıldı ve hacim distile suyla 1 ml ye tamamlandı. Her bir tüpün üzerine 2,5 ml 0,2 M fosfat tamponu (ph 6,6) ve 2,5 ml %1 lik potasyumferrisiyanür K 3 [Fe(CN) 6 ] ilave edilerek 20 dk boyunca 50 o C de inkübasyona bırakıldı. Daha sonra reaksiyon karıģımına 2,5 ml %10 luk triklorasetik asit (TCA) ilave edildikten sonra, çözeltinin üst fazından 2,5 ml alındı. Bunun üzerine 2,5 ml distile su ve %0,1 lik 0,5 ml FeCl 3 eklendikten sonra 700 nm de distile su körüne karģı absorbansı okundu. Kontrol olarak da numune yerine su kullanıldı.

121 FRAP reaktifi ile Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesi (FRAP Metodu) tayini FRAP reaktifi ile indirgeme kuvveti tayini Oyaizu yönteminnin küçük bir modifikasyonu iģlemi ile yapıldı (Oyaizu 1986). Bunun için çalıģtığımız maddelerden 1 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan stok çözeltiden değiģik konsantrasyonlarda olacak Ģekilde farklı tüplere aktarıldı. Tüplerdeki numune hacmi asetat tamponu (ph 3,6) ile 0,5 ml ye tamamlandı. Daha sonra her tüpe 2,25 ml FRAP reaktifi ile 2,25 ml FeCl 3 çözeltisi ilave edildi. Son hacmi 5 ml olan ve 10 dk. inkübe edilen çözeltinin absorbansı 593 nm de köre karģı okundu. Kör olarak asetat tamponu, kontrol için numune yerine asetat tamponu kullanıldı Cu 2+ -Cu + indirgeme kuvveti (CUPRAC Metodu) tayini Fenolik yapıdaki moleküllerin Cu 2+ indirgeme aktiviteleri bakır iyonları indirgeme metodunun (Apak et al. 2006) küçük bir modifikasyonuyla yapıldı (Ak and Gülçin 2008). Farklı konsantrasyonlarda hazırlanan fenolik bileģiklerin tüplerine 0,01 M lık 125 µl CuCl 2 çözeltisi, 7, M lık 125 µl etanolik neokuprin çözeltisi ve 1 M lık 125 µl amonyum asetat (CH 3 COONH 4 ) tampon çözeltisi sırasıyla konuldu. Yarım saat karanlıkta inkübasyondan sonra distile su körüne karģı 450 nm de absorbans değerleri ölçüldü Süperoksit anyon radikali (O 2.- ) giderme aktivitesi tayini Fenolik bileģiklerin süperoksit anyon radikallerini giderme kapasitesi nitroblue tetrazolium (NBT) maddesinin spektrofotometrik ölçümüyle belirlendi. Bu amaçla Zhishen et al. (1999) nın kullandığı metodun küçük bir modifikasyonu ile uygulandı. Daha önce hazırlanan stok çözelti bu amaçla kullanıldı. Bunun için numune ve standartların farklı konsantrasyonları 0,05 M lık ve ph ı 7,8 olan fosfat tamponu ile hazırlandı. Numune içeren tampon çözeltiye riboflavin, metiyonin ve NBT den 1, , 4, , 8, M konsantrasyonlarına denk gelecek miktarları sırasıyla ilave

122 98 edildi. OluĢan reaksiyon karıģımı oda sıcaklığında 2 saat boyunca 20 W lık floresan ıģığı ile uyarıldı. Sudan oluģan köre karģı 560 nm de absorbans ölçümleri kaydedildi ,1-Difenil 2-pikril hidrazil (DPPH) serbest radikal giderme aktivitesi tayini DPPH serbest radikal giderme aktivitesi Blois metoduna göre yapıldı (Blois 1958). Serbest radikal olarak DPPH ın 1 mm lık çözeltisi kullanıldı. Numune olarak daha önce hazırlanan 1 mg/ml konsantrasyonundaki stok çözeltisi kullanıldı. Deney tüplerine sırasıyla 10, 20 ve 30 μg/ml konsantrasyonlarında çözelti oluģturacak Ģekilde aktarılarak toplam hacimler etanol ile 2,5 ml ye tamamlandı. Daha sonra her bir numune tüpüne stok DPPH çözeltisinden 0,5 ml ilave edildi. Yarım saat oda sıcaklığı ve karanlıkta inkübe edildikten sonra etanolden oluģan köre karģı 517 nm de absorbansı ölçüldü. Kontrol olarak 2 ml etanol, 0,5 ml DPPH çözeltisi kullanıldı. Çözeltide geriye kalan DPPH miktarını veren azalan absorbans değerleri serbest radikal giderme aktivitesini belirlemiģ oldu ,2-Azino-bis(3-etil benzo-tiyazolin-6-sülfonikasit) (ABTS) radikali giderme aktivitesi tayini ABTS radikali giderme aktivitesi Re et al. (1999) nın yaptığı çalıģmaya göre yapıldı. Bunun için öncelikle 1 M ve ph ı 7,4 olan fosfat tamponu ile 2 mm lık ABTS çözeltisi hazırlandı. Bu çözeltiye 2,45 nm lik persülfat çözeltisi ilave edilerek ABTS radikalleri üretildi. ABTS radikal çözeltisi kullanılmadan önce kontrol çözeltisinin 743 nm da absorbansı 0,1 M ve ph ı 7,4 olan fosfat tamponu ile 700±0,025 nm ye ayarlandı. ABTS radikal giderme aktivitesine bakılacak olan fenolik bileģiklerin farklı konsantrasyonlarına (10-30 μg/ml) 0,5 er ml ABTS radikal çözeltisi ilave edilerek yarım saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Etanolden oluģan köre karģı 734 nm de absorbansları ölçüldü.

123 N-N'-Dimetil-p-fenilendiamin dihidroklorür (DMPD) radikali giderme aktivitesi tayini Bu amaçla ilk önce renkli radikal katyon (DMPD.+ ) elde edildi. Bunun için 1mL lik DMPD çözeltisi 100 ml lik asetat tamponuna (ph 5,3; 100 mm) ilave edildikten sonra üzerine 0,05 M FeCl 3 çözeltisinden 0,2 ml eklenir. Böylece DPPH radikali çözeltisi oluģur. DMPD.+ radikal çözeltisi kullanılmadan önce kontrol çözeltisinin 505 nm de optik dansitesi 0,1 M lık ve ph ı 5,3 olan fosfat tamponu ile 0,900±0,100 nm ye ayarlandı. Günlük taze olarak hazırlanan DMPD.+ çözeltisinin absorbansı 12 saat boyunca stabildir (Foliono et al. 1999). Fenolik bileģiklerin ve standart antioksidanların farklı konsantrasyonlardaki çözeltileri (10-30 μg/ml) deney tüplerine aktarıldı ve hacim distile su ile 0,5 ml ye tamamlandı. Bunun üzerine 1 ml DMPD.+ çözeltisi eklendi ve 50 dk lık inkübasyondan sonra 505 nm de absorbans ölçümleri yapıldı. Kör olarak tampon çözelti kullanıldı Ferröz iyonları (Fe 2+ ) Ģelatlama aktivitesi tayini Pozitif kontrol olarak kullandığımız maddeler ile birlikte çalıģtığımız diğer maddelerin metal Ģelatlama aktiviteleri Dinis et al. (1994) nın belirledikleri metoda göre yapıldı. Bu iģlem için 2 mm lık 50 µl FeCl 2.4H 2 O ve 350 µl saf su içeren çözeltiye, değiģik konsantrasyonları (10, 20 ve 30 µg/ml) oluģturacak Ģekilde antioksidan bileģik ilave edildi. Son hacim distile etanol ile 4 ml ye tamamlandı. Reaksiyon 5 mm lık 0,2 ml ferrozin çözeltisi ilavesiyle baģlatıldı. Çözelti vorteksle iyice karıģtırıldıktan sonra oda sıcaklığında 10 dk. inkübasyona bırakıldı. Ġnkübasyon iģleminden sonra kör olarak kulandığımız etanol e karģı 562 nm de absorbansları okundu. Kontrol olarak da antioksidan maddenin olmadığı geriye kalan çözelti kullanıldı.

124 Bipiridil metal Ģelatlama aktivitesi tayini Bipiridil raktifi ile metal Ģelatlama aktivitesi Re et al. (1999) nın kullandıkları metoda göre yapıldı. Bu amaçla önce test tüplerine 2 mm lık 125 µl FeSO 4 çözeltisi konuldu. Üzerine 10, 20 ve 30 µg/ml konsantrasyonda olacak Ģekilde antioksidan bileģik içeren stok çözeltiden eklendikten sonra 0,1 M lık ph sı 7,4 olan Tris-HCl tamponundan 500 µl ilave edildi. 30 dk. oda sıcaklığında inkübasyondan sonra %2 lik HCl çözeltisi içinde çözünmüģ bipiridil reaktifinden 500 µl konuldu. Üzerine 595 µl su eklendikten sonra son hacim etanol ile 3 ml ye tamamlandı ve karıģımın absorbansı etanol den oluģan köre karģı 522 nm de okundu. Sonuçlar kontrol olarak antioksidan maddenin yerine alkolün kullanıldığı karıģımın absorbansı ile karģılaģtırıldı Total antioksidan aktivite tayini ÇalıĢtığımız maddelerin total antioksidan aktiviteleri tiyosiyanat metoduna göre belirlendi (Yen and Chen 1995). ÇalıĢtığımız maddelerin stok çözeltilerinden farklı konsantrasyonlara (10, 20, 30 µg/ml) karģılık gelen hacimleri vezin kaplara pipetlendi ve toplam hacim fosfat tamponu (0,01 M; ph 7,4) ile 2,5 ml ye tamamlandı. Sonra her bir vezin kabına 2,5 ml linoleik asit emülsiyonu ilave edilerek 37 o C ve karanlıkta inkübasyona bırakıldı. Ġnkübasyona bırakılan vezin kaplarından her 12 saatte bir 100 µl numune alındı ve 4,7 ml etanol, 100 µl SCN - çözeltisi ve %3,5 lik HCl içinde hazırlanmıģ 20 mm lık 100 µl Fe 2+ çözeltisi karıģımına eklendi. Hazırlanan numunelerin absorbansı 500 nm de köre karģı okundu. Kör için numune yerine alkol, kontrol için numune yerine tampon çözelti kullanıldı. Kontrol numunesinin maksimum absorbansına ulaģılıncaya kadar inkübasyon ve absorbans ölçümü iģlemlerine devam edildi.

125 Ġnsan Kanı Temini ve Hemolizatının Hazırlanması Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi AraĢtırma Hastanesi kan merkezinde, gönüllülerden alınan insan kanı kullanılıncaya kadar +4 o C de muhafaza edildi. Bu amaçla öncelikle Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi GiriĢimsel Olmayan Klinik AraĢtırmalar Etik Kurulu ndan izin alındı (Ek 4). Alınan kan örnekleri santrifüj tüplerine doldurularak 1500 xg de 15 dk. santrifüj edilerek üstte kalan plazma ve lökosit tabakası damlalık kulanılarak dikkatli bir Ģekilde uzaklaģtırıldı. Tüplerin alt kısımda çökmüģ bulunan kırmızı kan hücreleri (eritrositler) nin hacmi kadar %0,9 luk izotonik NaCl çözeltisi eklendi ve 1500 xg de 15 dakika santrifüj edilerek üstteki sıvı uzaklaģtırıldı. Bu iģlem üç kez tekrarlanarak eritrositlerin safsızlıklıklardan iyice yıkanması sağlandı. Daha sonra hacminin 5 katı kadar buzlu su ile hemoliz edildi. Hemolizat içinde bulunan eritrosit hücre zarlarını uzaklaģtırmak için +4 o C ve xg de 30 dk. santrifüj edildi. Üst kısımdaki hemolizat damlalık kullanılarak dikkatli bir Ģekilde alındı ve sonraki çalıģmalarda kullanılmak üzere +4 o C de muhafaza edildi (Hunaiti and Soud 2000; Çoban et al. 2008) Deney Hayvanları (Rat) Temini, Ġnhibitör Uygulama ve Numune Alma ĠĢlemleri Bu çalıģmanın deney hayvanları bölümü için ilk önce Yüzüncü Yıl Üniversitesi Deney Hayvanları Yerel Etik Kurulu (YÜHADYEK) undan etik kurul izni alındı (Ek 1, 2 ve 3). Daha sonra Yüzüncü Yıl Üniversitesi Deney Hayvanları Ünitesi nden 48 deney hayvanı temin edilerek eģit sayıda 8 guruba ayrıldı. 1) Herhangi bir inhibitör madde verilmeyen ve 1. saatte anestezi altında (10 mg/kg ketamin) kalpten kan alınan kontrol grubu (Grup 1) 2) Herhangi bir inhibitör madde verilmeyen ve 4. saatte anestezi altında (10 mg/kg ketamin) kalpten kan alınan kontrol grubu (Grup 2)

126 102 3) 10 mg/kg oranında tek doz olmak üzere intraperitonal trihidroksi benzaldehid inhibitörü verilen ve 1. saatte anestezi altında (10 mg/kg ketamin) kalpten kan alınan grubu (Grup 3) 4) 10 mg/kg oranında tek doz olmak üzere intraperitonal trihidroksi benzaldehid inhibitörü verilen ve 4. saatte anestezi altında (10 mg/kg ketamin) kalpten kan alınan grubu (Grup 4) 5) 10 mg/kg oranında tek doz olmak üzere intraperitonal 3-4-dihidroksi-5- metoksibenzoik asit inhibitörü verilen ve 1. saatte anestezi altında (10 mg/kg ketamin) kalpten kan alınan grubu (Grup 5) 6) 10 mg/kg oranında tek doz olmak üzere intraperitonal 3-4-dihidroksi-5- metoksibenzoik asit inhibitörü verilen ve 4. saatte anestezi altında (10 mg/kg ketamin) kalpten kan alınan gurubu(grup 6) 7) 5 mg/kg oranında tek doz olarak intraperitonal AraĢidonoil dopamin inhibitörü verilen ve 1. saatte anestezi altında (10 mg/kg ketamin) kalpten kan alınan gurubu (Grup 7) 8) 5 mg/kg oranında tek doz olarak intraperitonal AraĢidonoil dopamin inhibitörü verilen ve 4. saatte anestezi altında (10 mg/kg ketamin) kalpten kan alınan gurubu (Grup 8) Yukarıda verilen grupların her birinde 6 Ģar adet deney hayvanı bulunmaktaydı (n=6). Gülçin et al. (2004) nın kullandığı metoda göre, anestezi altında uyutulan ratların kalbinden enjektör yardımı ile alınan kanlar antikuagulan bulunan biyokimya tüplerine konuldu. Sonra alınan kanlar +4 o C ve 2500 xg de 15 dk. santrifüjlenerek plazması atıldı ve lökosit tabakası dikkatlice uzaklaģtırıldıktan sonra eritrosit hacmi kadar izotonik çözelti ilave edildi ve yukarıda anlatıldığı Ģekilde santrifüjleme iģlemi yapılarak üstte kalan sıvı uzaklaģtırıldı. Bu iģlem üç kez tekrarlanarak eritrositlerin iyice yıkanması sağlandı (Gülçin et al. 2004). Böylece safsızlıklardan arındırılmıģ olan eritrosit pelletleri kendi hacimlerinin 5 katı buzlu suyla hemoliz edildikten sonra Rickly et al. (1969) tarafından modifiye edilen Wilbur and Anderson (1948) yöntemine göre CA enzimi hidrataz aktivitesi ölçümleri yapıldı (Rickly et al. 1969). Daha sonra eritrosit

127 103 hemolizatlarında bölüm 3.5 de anlatıldığı Ģekilde hemoglobin tayinleri yapıldı. Böylece inhibitör verilen grupların (Grup 3, 5 ve 7) inhibitör verildikten 1 saat sonraki ghb baģına düģen eritrosit CA aktiviteleri ile aynı saatte kan alınan ve inhibitör verilmeyen kontrol grubu (grup 1) CA aktiviteleri karģılaģtırıldı. Ayrıca inhibitör verilen grupların (Grup 4, 6, ve 8) 4 saat sonraki CA aktiviteleri ile inhibitör verilmeyen ve aynı saatte kan alınan kontrol grubu (Grup 2) CA aktiveteleri karģılaģtırıldı. Elde edilen sonuçlar 100 olarak kabul edilen kontrol gurubu CA aktiviteleri ile kıyaslanarak yüzde (%) CA aktivite değerleri olarak ifade edildi Hemoglobin Tayini Hemolizatlarda hemoglobin tayini siyanomethemoglobin yöntemiyle yapıldı. Bu yöntemde Fe 2+ iyonlarının Fe 3+ e yükseltgenmesi ile oluģan siyanomethemoglobin konsantrasyonunun 540 nm de spektrofotometrik ölçülmesi ile gerçekleģtirildi. Bunun için 20 µl hemolizat bulunan tüplere 5 ml drabkin çözeltisi ilave edilerek 10 dk. oda sıcaklığında inkübe edildi. Spektrofotometrede 540 nm de transmittans ölçülerek daha önce hazırlanan standart eğriden Hb miktarı g/dl olarak hesaplandı (Fairbanks and Klee 1986) İn vivo çalıģma sonuçlarının istatistiksel değerlendirmesi İn vivo çalıģmalarda total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi ile ilgili elde edilen sonuçlar ile ilgili üzerinde durulan özelikler bakımından tanımlayıcı istatistikler ortalama ve standart sapma olarak ifade edilmiģtir. Üzerinde durulan özelikler bakımından gruplar arası karģılaģtırmada Post Hock analizi için Tukey T testi kullanıldı. Aynı grupların zamana göre grup içi karģılaģtırmalarında ise Student T testi uygulandı. Hesaplamalarda istatistik anlamlılık düzeyi %5 (p<0,05) olarak alınmıģ ve hesaplamalar için SPSS 15 istatistik paket programı kullanılmıģtır.

128 Karbonik Anhidraz Enziminin Afinite Kromatografisiyle SaflaĢtırılmasına Yönelik ÇalıĢmalar 1- Sepharose-4B-L afinite jelinin hazırlanması: Afinite jeli CNBr ile aktifleģtirilmiģ Sepharose-4B matriksi üzerinde hazırlandı. Bu kolon materyaline L-tirozin kovalent olarak takıldı ve sülfanilamit diazollanarak tirozine kentlendirildi. Burada tirozin afinite jelinin uzantı kolunu, sülfanilamit ise enzimi spesifik olarak bağlayan ortamı oluģturmaktadır. Sülfanilamit CA enziminin spesifik bir inhibtörü olup bu enzimin yüksek oranda saflaģtırılması amacıyla kullanıldı (Beydemir et al. 2002; Söyüt 2006). Afinite jeli aģağıda verilen prosedüre göre hazırlandı. 2- CNBr ile aktifleģtirilmiģ sepharose-4b ye tirozin takılması: CNBr ile aktifleģtirilmiģ sepharose-4b, 0,1 M lık 250 ml soğuk NaHCO 3 tamponu (ph 10) ile yıkanarak bir behere aktarıldı. Aynı tamponun 20 ml sinde 80 mg tirozin çözünmüģ olan soğuk çözelti bir behere konarak karıģtırıldı. Bundan sonra süspansiyon +4 o C de 2 saat süreyle manyetik karıģtırıcıda karıģtırıldı ve 16 saat boyunca +4 o C de bekletildi. Bu sürenin bitiminde yıkama suyu 280 nm de absorbans verinceye kadar bol su ile yıkandı ve böylece reaksiyona girmeyen tirozin tamamen uzaklaģtırıldı. Yıkama 100 ml 0,2 M NaHCO 3 tamponu (ph 8,8) ile tekrarlanarak tirozin takılı jel, aynı tamponun 40 ml si içine alındı (Beydemir et al. 2002). 3- Sülfanilamit kenetlendirilmesi: 25 mg sülfanilamit 0 o C civarında 10 ml 1 M HCl içinde çözüldü. Sonra içinde 75 mg NaNO 2 bulunan 0 o C deki 5 ml çözelti, sülfanilamit çözeltisine damla damla katıldı. 10 dakikalık reaksiyondan sonra diazollanmıģ bulunan sülfanilamit 40 ml sepharose-4b-l-tirozin süspansiyonuna ilave edildi. 1 M NaOH ile ph 9,5 e çıkarılarak sabit tutulduktan sonra 3 saat süreyle oda sıcaklığında yavaģça karıģtırıldı. Daha sonra 1 L saf su ve 200 ml 0,05 M Tris-SO 4 (ph 7,4) tamponuyla yıkandı. Sonra üzerine bir miktar daha aynı tampondan konularak muhafaza edildi (Söyüt 2006; Öztürk Sarikaya 2009). Tüm reaksiyon basamaklarının mekanizması aģağıda verilmiģtir (ġekil 2.1).

129 105 Sefaroz 4B Ġmidokarbonat Sefaroz 4B L-Trozin afinite jeli Sefaroz 4B L-Trozin ġekil 3.1. CNBr Sepharose 4B-L-Trozin afinite jelinin hazırlanmasındaki reaksiyonlar (Gülçin and Beydemir 2013) 4- Afinite kolonunun paketlenmesi: Hazırlanan jel dengeleme tamponu olan Tris-HCl (ph 7,8) içine alınarak süspanse edildi ve su trombu kullanılarak vakum ile havası alındı. Süspanse edilmiģ jel 1x10 cm lik kapalı sistemden oluģan soğutmalı kolona paketlendi. Jel çöktükten sonra peristaltik pompa yardımıyla yıkama ve dengeleme tamponu ile yıkandı. Kolonun dengelenmiģ olduğu, elüat ile tamponun 280 nm de absorbans ve ph larının eģit olmasından anlaģıldı. 5- Afinite kolonuna numune tatbiki ve elüsyonu: Katı Tris ile ph ı 8,7 ye ayarlanmıģ olan hemolizat kolona tatbik edildi ve kolon 400 ml 25 mm Tris-HCl / 22 mm Na 2 SO 4 (ph 8,7) çözeltisi ile yıkandı. Böylece CA enzimi kolona tutunmuģ ve diğer safsızlıklar uzaklaģtırılmıģ oldu. Sonra 1 M NaCl/25 mm Na 2 HPO 4 (ph 6,3) tamponu tatbik edilerek hca I izoenzimi, daha sonra 0,1 M NaCH 3 COO/0,5 M NaClO 4 (ph 5,6) çözeltisi kolona tatbik edilip hca II izoenzimi elüe edildi. Fraksiyon toplayıcı yardımıyla elüatlar 2 Ģer ml halinde tüplere alındı ve 280 nm deki absorbanslarına bakıldı. Peristaltik pompa yardımıyla kolonun akıģ hızı 20 ml/saat e ayarlandı (Öztürk Sarikaya 2009).

130 Protein Tayin Yöntemleri Kalitatif protein tayini Bu tayin yöntemi proteinlerin yapısında bulunan tirozin ve triptofan ın 280 nm de maksimum absorbans vermesi esasına dayanır (Segel 1968; Beydemir et al. 2002). Bu metot yardımıyla kromatografi iģlemlerinde fraksiyon toplayıcısı yardımıyla eģit hacimde alınan bütün fraksiyonlarda kalitatif protein tayini yapıldı. Fraksiyonlar küvetlere alınarak spektrofotometrede absorbansları köre karģı okundu Kantitatif protein tayini Afinite kromatografisi ile saflaģtırılan enzim çözeltisi ve hemolizattaki protein miktarları bu yöntemle belirlendi. Bu yöntem Commassie-Blue-G-250 nin proteine bağlanması esasına dayanmaktadır. OluĢan kompleks 595 nm de maksimum absorbans gösterir. Boyanın proteine bağlanması çok hızlı gerçekleģmektedir. Protein-boya kompleksi çözeltilerde uzun süre kalmaktadır. Bu yöntemin hassasiyeti 1 ile 100 μg arasındadır (Bradford 1976). Kalitatif tayin iģlemlerinde aģağıda verilen prosedür takip edildi. 1 ml sinde 1 mg protein ihtiva eden standart sığır serum albumin çözeltisinden tüplere 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ve 100 μl alındı ve saf su ile bütün tüplerin hacmi 0,1 ml ye tamamlanarak her bir tüpe 5 ml renklendirme reaktifi katıldı. Hemen sonrasında vortekslenerek 10 dakika sonra 595 nm de 3 ml lik küvetlerde, köre karģı absorbansları okundu. Kör olarak 0,1 ml aynı tampon ve 5 ml renklendirme reaktifinden oluģan karıģım kullanılarak absorbans değerlerine karģılık gelen μg protein değerleri standart grafik haline getirildi. Protein tayini yapılacak numuneler için aynı yöntem uygulanarak standart grafikten miktar tayini yapıldı (Beydemir et al. 2002).

131 SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Enzim Saflığının Kontrolü Enzim saflaģtırıldıktan sonra SDS-PAGE tekiniği ile enzimin saflığı kontrol edildi. (Laemli 1970; Öztürk Sarikaya 2009). Numune önce %1 SDS ve %10 luk 2- merkaptoetanol ile muamele edildikten sonra 5 dakika kaynar su banyosunda bekletildi. Daha sonra %20 ayırma jelinde jel elektroforezinden sonra boyama yapılarak bantlar belirlendi (Çoban et al. 2008) Karbonik Anhidraz Aktivitesi Tayinleri Hidrataz aktivitesi tayini Bu amaçla öncelikle hidrataz aktivitesi için Rickly et al. (1964) tarafından modifiye edilen Wilbur and Anderson yöntemi kullanıldı (Wilbur and Anderson 1948). CO 2 in hidrasyonu sonucu açığa çıkan H + iyonundan meydana gelen ph değiģiminin brom timol mavisi indikatörü ile belirlenip, geçen sürenin ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Bunun için kör olarak hazırlanan tüpe 1 ml ve 0,025 M lık veronal tamponu (ph 8,2), 0,1 M ve %0,04 lük brom timol mavisi, 0,6 ml saf su ve 2,5 ml CO 2 çözeltisi ilave edildi. Böylece aktivite ölçüm ortamında toplam hacim 4,2 ml oldu. Daha sonra bir kronometre yardımıyla CO 2 çözeltisi katıldığı andan itibaren indikatörün mavi renginin sarımsı yeģile dönmesi (ph 6,3) için geçen süre belirlendi (t o ). Numune tüpüne ise sudan 0,05 ml azaltarak bunun yerine enzim çözeltisi ilave edildi ve yine en son CO 2 çözeltisi ilave edilir edilmez, indikatörün renginin sarımsı yeģile dönüģmesi (ph 6,3) için geçen süre bir kronometre vasıtasıyla belirlendi (t c ). Bu yönteme göre CA aktivitesi için bir enzim ünitesi (EU) enzimsiz olarak meydana gelen CO 2 hidratasyonu süresini yarıya indiren enzim miktarı olarak tanımlanmaktadır. EU = (t o t c ) / t c

132 108 formülüne göre kullanılan enzim çözeltisi hacmi için enzim ünitesi hesaplandı (Maren 1967). Hemolizat, saf enzim çözeltisi ve inhibisyon çalıģmalarında aktivite tayininde aynı iģlemler uygulandı. Kinetik ve inhibisyon çalıģmaları için esteraz aktivitesi yöntemi uygulandı (Beydemir et al. 2002) Esteraz aktivitesi tayini Bu yöntem karbonik anhidrazın esteraz aktivitesine sahip olması esasına dayanır. Metodun prensibine göre; CA enzimi substrat olarak kullanılan p-nitroasetatı 348 nm de absorbsiyon veren p-nitrofenol veya p-nitrofenolat a hidroliz etmektedir (ġekil 3.2). O CA O 2 N OCCH 3 + H 2 O O 2 N OH + CH 3 COOH p-nitrofenilasetat p-nitrofenol ġekil 3.2. p-nitrofenilasetatın p-nitrofenole dönüģüm mekanizması (Öztürk Sarikaya 2009). P-nitrofenol veya p-nitofenolat ın her ikisi de 348 nm de aynı absorbansı vermektedir. Bu yüzden fenol gurubundaki H + iyonunun ayrıģıp ayrıģmaması ölçümü etkilememektedir (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Bu dalga boyunda p- nitrofenilasetat ın çok az absorbsiyonu olduğundan kör olarak kullanıldı. 3 ml lik küvetler kullanılarak ölçülen aktivite tayin iģlemleri için reaksiyon karıģımını oluģturan maddelerin ortama katılım sırasına göre çizelge 3.1. deki prosedür uygulandı. Çizelge ml lik küvetler kullanılarak yapılan esteraz aktivitesi prosedürü Kullanılan Madde ve Çözeltiler Kontrol Tüpü (Kör) (μg) Numune Tüpü 0,5 M, ph 7,4 Tris-SO4 tamponu p-nitrofenolsetat çözeltisi Saf su Enzim çözeltisi Toplam hacim

133 109 1 ml lik küvetler kullanılarak yapılan aktivite ölçümü tayin iģlemleri için reaksiyon karıģımını oluģturan maddelerin ortama katılım sırasına göre çizelge 3.2. deki prosedür uygulandı. Çizelge ml lik küvetler kullanılarak yapılan esteraz aktivitesi prosedürü Kullanılan Madde ve Çözeltiler Kontrol Tüpü (Kör) (μg) Numune Tüpü 0,5 M, ph 7,4 Tris-SO4 tamponu p-nitrofenolsetat çözeltisi Saf su Enzim çözeltisi - 33 Toplam hacim Çizelgedeki reaksiyon karıģımı hazırlandıktan sonra 25 o C ve 348 nm de 0. ve 3. dakikadaki absorbans ölçümü farkı alındı. Spektrofotometre, daha önce enzim yerine saf su konularak elde edilen karıģımın 3 dakika sonundaki absorbansı ile sıfıra ayarlandı. Yapılan çalıģmalarda kullanılacak p-nitrofenilasetat substrat çözeltisi günlük olarak hazırlandı: 13,5 mg ester, 1 ml aseton içinde çözülerek hızlıca karıģtırılan 24 ml distile suya yavaģ yavaģ ilave edildi. Aseton, diğer organik çözücülere nispeten hidroliz reaksiyonunu en az inhibe eden çözücü olduğu için seçildi (Verpoorte et al. 1967; Beydemir et al. 2002). Kinetik çalıģmalar esnasındaki aktivite ölçümleri enzimin esteraz aktivitesi ile gerçekleģtirildi p-nitrofenilasetat substratı için K m ve V max değerlerin bulunması P-Nitrofenilasetat substratı için insan eritrositlerinden saflaģtırılan CA I ve II izoenzimlerinin K m ve V max değerlerinin belirlenmesi için en az 5 farklı p- nitrofenilasetat konsantrasyonu kullanılarak optimum Ģartlarda aktivite ölçümü yapılarak Linweaver-Burk grafiği çizildi ve bu grafikten K m ve V max değerleri hesaplandı (Lehninger et al. 2005).

134 Ġnsan Eritrositlerinden Ġzole Edilen CA I ve II Ġzoenzimlerinin Aktiviteleri Üzerine Bazı Fenolik ve Flavonoid Yapıda Moleküllerin Etkilerinin Belirlenmesi Ġnsan eritrositlerinden izole edilen CA I ve II izoenzimlerinin aktiviteleri üzerine 2,4,6- Trihidroksi Benzaldehit, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin, ID-8, Silikristin, Malvin, Oenin, Callistephin ve Pelargonin maddelerinin etkilerini araģtırmak amacıyla küvet ortamına farklı konsantrasyonlarda çalıģılan maddelerden ilave edilerek aktivite ölçümleri yapıldı. Kullanılan maddelerin farklı konsantrasyonlarını oluģturmak için stok çözeltiler seyreltildi. Kullanılan stok çözelti hacmi gereken deriģimi sağlamadığı zaman küvete alınan tampon hacmi azaltılarak ilave edilen madde konsantrasyonu ayarlandı. Bunun için ölçümler hem hidrataz hem de esteraz aktivitesi yöntemiyle araģtırıldı Ġnhibisyon etki gösteren fenolik asit ve flavonoid bileģiklerin IC 50 değerlerinin belirlenmesi Bunun için farklı inhibitör konsantrasyonunda aktivite ölçümü yapılarak inhibitör etkisi gösteren maddeler belirlendi. Bu maddelerde inhibisyon etkisi yüksek olanların Aktivite (%) - [Iinhibitör] olarak grafikleri çizildi. Eğrinin denkleminden IC 50 değerleri hesaplandı. IC 50 değerleri hesaplanan bazı maddelerin K i değerlerini belirlemek amacıyla hca I ve II izoenzimlerinin aktivitelerini yarıya düģüren madde konsantrasyonu ile bu değerin altında ve üstünde iki sabit inhibitör konsantrasyonu ve uygun beģ farklı substrat konsantrasyonu stok çözelti olarak kullanıldı ve ön deneme ile belirlendi. Elde edilen değerler kullanılarak her bir inhibitör için Lineweaver-Burk grafikleri çizildi. Grafik denkleminde yarı yarıģmalı ve yarıģmasız inhibisyon için [V max = V I max(1+[i]/k i )] formülünden (Lineweaver-Burk denkleminden) yararlanılarak K i değerleri belirlendi.

135 Absorbans (700 nm) ARAġTIRMA BULGULARI 4.1. Antioksidan Kapasite Tayini Sonuçları Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesi bulguları ÇeĢitli moleküllerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesinde kullanılan bu biyoanalitik metot ile çözeltinin sarı rengi, ortamda bulunan antioksidan maddelerin gücünün azalmasına bağlı olarak yeģil ve mavinin farklı tonlarına dönüģmektedir. ÇalıĢmada kullanılan Trihidroksibenzaldehit, 3-4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8 (1-(4-Metoksifenil)-2-metil-3-nitro- 1H-indol-6-ol), Callistephin, Malvin, Oenin, Pelargonin ve Silikristin maddelerinin indirgeme potansiyelleri, bu maddelerin farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) çözeltilerinin 700 nm deki absorbansları ölçülerek belirlendi. Elde edilen sonuçlar pozitif kontrol olarak kullanılan standart antioksidanlar olan BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile karģılaģtırıldı. Standart antioksidanlarla kıyaslanarak elde edilen sonuçlara göre çizilen absorbans-miktar grafiği ġekil 4.1 de görülmektedir. 4,5 Demir İndirgeme Grafiği BHA BHT 3 1, Konsantrasyon (µg/ml) α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil 4.1. Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin Fe 3+ iyonlarını indirgeme kuvvetlerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması

136 Absorbans (700 nm) 112 AĢağıdaki grafik incelendiğinde Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesi tayininde 3,4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, 2,4,6-Trihidroksi benzaldehit Callistephin ve Oenin maddelerinin, standart antioksidanlar olarak kullanılan Trolox ve α-tokoferol den daha iyi Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesine sahip oldukları gözlendi. Söz konusu maddelerin demir indirgeme kapasitesi grafiği değerlendirilerek standart antioksidant ve çalıģılan maddelerin 30 µg/ml ye karģılık gelen absorbans değerleri Çizelge 4.1 de verilerek birbirleriyle mukayese edildi. 4,5 3 1,5 0 Antioksidan Maddeler BHA BHT α-tokoferol Troloks ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür AraĢidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil µg/ml ye karģılık gelen Fe 3+ indirgeme aktivitesi için 700 nm deki absorbans değerlerinin karģılaģtırılması 30 µg/ml konsantrasyonda Trihidroksibenzaldehid, 3-4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8 (1-(4-Metoksifenil)- 2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol), Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin, ve Pelargonin maddelerinin Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme potansiyelleri standart antioksidanlarla kıyaslandığında BHA >BHT >2-4-6-Trihidroksi benzaldehid >Oenin >3-4-Dihidroksi- 5-metoksibenzoik asit >Callistephin >Malvin >Troloks >α-tokoferol >Silikristin >Pelargonin >AraĢidonoil dopamin ve ID-8 Ģeklinde sıralandığı görüldü.

137 Absorbans (450 nm) Cu 2+ -Cu + indirgeme kuvveti (CUPRAC Metodu) bulguları ÇalıĢmada kullandığımız fenolik bileģiklerden Trihidroksibenzaldehit, 3,4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, ID-8 (1-(4-Metoksifenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6- ol), AraĢidonoil dopamin, ile flavonoidlerden Callistephin, Malvin, Oenin, Pelargonin ve Silikristin maddelerinin Cu 2+ -Cu + indirgeme potansiyelleri, bu maddelerin farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) çözeltilerinin 450 nm deki absorbansları standart antioksidanlar ile kıyaslanarak elde edilen sonuçlara göre çizilen absorbans-miktar grafiği ġekil 4.3 de görülmektedir. 0,6 Cu 2+ -Cu + İndirgeme Kuvveti Grafiği BHA 0,4 0, Konsantrasyon (µg/ml) BHT α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil 4.3. Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin Cu 2+ iyonlarını indirgeme kuvvetlerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması Miktara karģı absorbans grafiğini incelendiğimizde 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, Malvin, Callistephin ve Oenin maddelerinin Cu 2+ - Cu + indirgeme kapasitesinin standart antioksidanlar olarak kullanılan Trolox ve α- Tokoferol den daha iyi oldukları gözlendi. Ayrıca Cu 2+ -Cu + indirgeme kapasitesinin kullanılan maddelerin konsantrasyonu artıģıyla doğru orantılı olarak arttığı da gözlendi. Söz konusu maddelerin indirgeme kapasitesi grafikleri değerlendirilerek her bir standart

138 Absorbans (450 nm) 114 antioksidan ve çalıģılan maddelerin 30 µg/ml ye karģılık gelen absorbans değerleri Çizelge 4.1 de verilerek birbirleriyle mukayese edildi. 0,6 0,4 0,2 0 Antioksidan Maddeler BHA BHT α-tokoferol Troloks ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür Araşidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil µg/ ml ye karģılık gelen Cu 2+ indirgeme aktivitesi için 700 nm deki absorbans değerlerinin karģılaģtırılması Fenolik bileģiklerden Trihidroksibenzaldehit, 3-4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8 (1-(4-Metoksifenil)-2-metil-3-nitro- 1H-indol-6-ol), Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin maddelerinin Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme potansiyelleri 30 µg/ml konsantrasyonda standart antioksidanlar ile kıyaslandığında BHA >BHT >3-4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit > Trihidroksibenzaldehid >Oenin >Callistephin > Malvin >Troloks >Pelargonin >α- Tokoferol >AraĢidonoil dopamin >Silikristin ve ID-8 Ģeklinde sıralandığı görüldü FRAP reaktifi ile ferrik iyonlarını (Fe 3+ ) indirgeme kuvveti tayini Bu biyoanalitik metot ile ortamdaki indirgeyici moleküller aracılığıyla elektron verilerek ferrik (Fe 3+ ) iyonlarından oluģan ferröz (Fe 2+ ) iyonlarının Tripiridil Triazin (TPTZ) ile oluģturduğu mavi renkli kompleksin maksimum absorbans gösterdiği 593 nm dalga boyunda okunmasıyla sonuçlar elde edildi. Elde edilen sonuçlara göre çizilen absorbans-miktar grafiği ġekil 4.5 de görülmektedir.

139 Absorbans (593 nm) FRAP Reaktifi ile Ferrik İyonları İndirgeme Kuvveti Grafiği BHA BHT α-tokoferol Troloks 1,5 Malvin ID Konsantrasyon (µg/ml) Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin ġekil 4.5. Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) antioksidanların FRAP reaktifi ile ferrik iyonlarını (Fe 3+ ) indirgeme aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması Absorbans-Konsantrasyon grafiği incelendiğinde hemen hemen tüm çalıģılan maddelerin ferrik iyonlarını (Fe 3+ ) ferröz iyonlarına (Fe 2+ ) indirgeme kapasitelerinin konsantrasyonla doğru orantılı olarak arttığı gözlendi. Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesi ölçümünde 3,4-dihidroksi-5-metoksibenzoik asit in diğer bütün maddelerden ve standart antioksidanlardan daha iyi indirgeme kapasitesine sahip olduğu görüldü. Ayrıca Callistephin in standart antioksidanlar olarak bilinen BHA, Trolox ve α-tokoferol den, Oenin in ise Trolox ve α-tokoferol den daha iyi Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesine sahip oldukları gözlendi. Yapılan mukayese sonucunda fenolik bileģiklerden Trihidroksibenzaldehit, 3-4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8 (1-(4- Metoksifenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol), Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin maddelerinin Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme potansiyelleri 30 µg/ml konsantrasyonda standart antioksidanlar ile kıyaslandığında 3-4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit >BHT >Oenin >BHA >Callistephin >Troloks >Malvin>α-Tokoferol >Pelargonin >2-4-6-

140 Absorban (593 nm) 116 Trihidroksi benzaldehit >AraĢidonoil dopamin >Silikristin ve ID-8 Ģeklinde sıralandığı görüldü. 3 1,5 0 Antioksidan Maddeler BHA BHT α-tokoferol Troloks ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür AraĢidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil 4.6. FRAP reaktifi ile 30 µg/ml ye karģılık gelen ferrik iyonlarının (Fe 2+ ) indirgeme aktivitesi için 700 nm deki absorbans değerlerinin karģılaģtırılması Söz konusu maddelerin indirgeme aktivitesi grafikleri değerlendirilerek her bir standart antioksidan ve çalıģılan maddelerin 30 µg/ml ye karģılık gelen indirgeme kuvvetlerinin absorbans değerleri Çizelge 4.1 de verilerek birbirleriyle mukayese edildi. Çizelge µg/ml konsantrasyonunda kullanılan maddelerin ferrik (Fe 3+ ) ve kuprik (Cu 2+ ) iyonlarını indirgeme kuvvetinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α- Tokoferol ile karģılaģtırılması Antioksidanlar Absorbans Absorbans Absorbans (700 nm) (450 nm) (593 nm) BHA 3,966 0,489 2,344 BHT 3,103 0,476 2,430 Troloks 1,156 0,330 2,086 α-tokoferol 1,396 0,403 2,259 Malvin 1,439 0,431 2,189 ID-8 0,167 0,145 0,615 Callistephin 1,585 0,456 2,328 Oenin 2,192 0,464 2,351 Silikristin 1,074 0,259 1,181 Pelargonin 1,085 0,385 2,064 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit 2,060 0,474 2,458 AraĢidonoil dopamin 0,462 0,308 1,392 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 2,916 0,466 1,839

141 Absorbans (560 nm) Süperoksit anyon radikali (O 2.- ) giderme aktivitesi bulguları Süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi riboflavin-metiyonin-ıģık yöntemine göre ortamdan giderilen süperoksit radikallerinin miktarı ölçülerek yapıldı. Elde edilen sonuçlardan faydalanılarak çizilen absorbans-miktar grafiğine (ġekil 4.7) göre süperoksit anyon radikali giderme kuvvetinin madde konsantrasyonu artıģıyla doğru orantılı olarak güçlendiği görüldü. 0,6 Süperoksit Anyon Radikali Giderme Grafiği 0,4 0, Konsantrasyon (µg/ml) BHA BHT α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil 4.7. Farklı konsantrasyonlardaki (10-20 µg/ml) maddelerin süperoksit ayon radikali giderme kuvvetlerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması Ortamdan giderilen süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi (%) aģağıda verilen formüle göre hesaplandı. Süperoksit Giderme Aktivitesi (%) = (λ 560(kontrol) λ 560(numune) (λ 560(kontrol ) x 100

142 Aktivite (%) 118 Absorbans-Miktar grafiği incelendiğinde süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi ölçümünde 20 µg/ml ye karģılık gelen değerlerde 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit in diğer bütün maddelerden ve standart antioksidanlardan daha iyi süperoksit anyon radikali temizleyicisi olduğu olduğu gözlendi. Yine çalıģtığımız maddelerden Pelargonin in BHA, Trolox ve α-tokoferol den, Silikristin ve Callistephin in ise Trolox ve α-tokoferol den daha iyi süperoksit anyon radikali giderme aktivitesine sahip oldukları görüldü Çalışılan Maddeler BHA BHT α-tokoferol Troloks ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür Araşidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil 4.8. ÇalıĢılan antioksidanların 20 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen süperoksit anyon radikali (O 2.- ) giderme aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması KarĢılaĢtırma sonucunda fenolik bileģiklerden Trihidroksibenzaldehit, 3-4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8 (1-(4- Metoksifenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol), Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin maddelerinin süperoksit anyon radikali giderme potansiyelleri 20 µg/ml konsantrasyonda standart antioksidanlar ve diğer çalıģılan maddeler ile kıyaslandığında 3-4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit >Pelargonin >AraĢidonoil dopamin >BHT >Silikristin >BHA >2-4-6-Trihidroksibenzaldehid >α-tokoferol >Troloks >Callistephin >ID-8 >Oenin Malvin Ģeklinde sıralandığı gözlendi.

143 Absorbans (517 nm) Absorbans (517 nm) DPPH serbest radikali giderme aktivitesi bulguları Bu metodu kullanmak için, DPPH radikali giderme tayininden önce standart grafik oluģturuldu (ġekil 4.9). DPPH serbest radikal giderme iģleminden sonra çözelti ortamında geriye kalan DPPH serbest radikal miktarı 517 nm dalga boyunda ölçüldü. Elde edilen sonuçlara göre elde edilen Absorbans Konsantrasyon grafiği ġekil 4.10 da görülmektedir. 3 2 DPPH Standart Grafik y = 0,002x + 0,3089 R² = 0, Konsantrasyon (µg/ml) ġekil 4.9. DPPH serbest radikal giderme aktivitesi için hazırlanan standart DPPH grafiği. 1,5 DPPH Serbest Radikal Giderme Kuvveti Grafiği 1,0 0,5 0, Konsantrasyon (µg/ml) BHA BHT α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin DPPH serbest radikali giderme aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması

144 Aktivite (%) 120 Yukarıdaki grafik incelendiğinde, madde konsantrasyonu arttıkça serbest radikal miktarının beklendiği gibi doğru orantılı olarak azaldığı gözlendi. Ayrıca 30 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen değerlere bakıldığı zaman 3,4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit in diğer bütün maddelerden ve standart antioksidanlar olan BHA, BHT ve α-tokoferol den daha iyi DPPH serbest radikal giderme kuvvetine sahip olduğu görüldü (ġekil 4.11). ÇalıĢmada kullandığımız maddeler ile birlikte standart olarak kullanılan antioksidan maddelerin DPPH serbest radikal giderme aktiviteleri birbirleriyle mukayese edildi Çalışılan Maddeler BHA BHT α-tokoferol Troloks ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür Araşidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil ÇalıĢılan antioksidanların 20 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen DPPH radikali giderme aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması Yaptığımız karģılaģtırma sonucunda Trihidroksibenzaldehid, 3-4-Dihidroksi-5 metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin, Silikristin, ID-8 (1-(4-Metoksifenil)-2 metil- 3-nitro-1H-indol-6-ol), Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin maddelerinin DPPH serbest radikal giderme kuvveti Troloks >3-4-Dihidroksi-5 metoksibenzoik asit >BHA >BHT >α-tokoferol >Oenin >Malvin >Callistephin >2-4-6-Trihidroksibenzaldehit >Pelargonin >AraĢidonoil dopamin >Silikristin ve ID-8 Ģeklinde sıralandığı görüldü ABTS.+ serbest radikali giderme aktivitesi bulguları Bu yöntem için öncelikle 0,1M lık ph ı 7,4 olan fosfat tamponu içinde 0,2 mm olacak Ģekilde ABTS çözeltisi hazırlandı. Sonra bu çözeltiye 2,45 M lık potasyum persülfat

145 Absorbans (734 nm) 121 ilave edildikten sonra karanlıkta manyetik karıģtırıcı ile 12 saat boyunca karıģtırılarak ABTS.+ radikali üretildi. Daha sonra ABTS.+ radikali çözeltisi için için standart grafik oluģturuldu (ġekil 4.12). 2 1,5 y = 0,0018x R² = 0, , Miktar (µg/ml) ġekil ABTS.+ serbest radikal giderme aktivitesi için hazırlanan standart ABTS radikali grafiği ABTS.+ radikali giderme aktivitesi tayininden sonra geriye kalan ABTS.+ radikali miktarı, spesifik olarak 734 nm dalga boyunda ölçülerek elde edilen verilerden oluģturulan grafik yardımıyla hesaplandı. ABTS.+ radikali giderme aktivitesi bulgularından yararlanılarak elde edilen absorbans miktar grafiği Ģekil 4.13 de görülmektedir. ABTS.+ radikal giderme kuvveti grafiği incelendiğinde, 5 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen değerlere bakıldığı zaman 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit, Oenin ve Callistephin in diğer bütün maddelerden ve standart antioksidanlar olan BHT, Troloks ve α-tokoferol den daha iyi ABTS.+ radikal giderme kuvvetine sahip olduğu gözlendi. ÇalıĢmada kullandığımız maddeler ile birlikte standart olarak kullanılan antioksidan maddelerin radikal giderme kuvveti IC 50 değerleri grafik yardımıyla hesaplanarak birbirleriyle mukayese edildi. KarĢılaĢtırma sonucunda fenolik bileģiklerden Trihidroksibenzaldehit, 3-4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8, Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin maddelerinin 5 µg/ml konsantrasyonda ABTS.+ serbest radikal giderme kuvveti BHA >2-4-6-

146 Aktivite (%) Absorbans (734 nm) 122 Trihidroksibenzaldehit >Callistephin >Oenin >ID-8 >BHT >3-4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit >Silikristin >Malvin >Pelargonin >Troloks > α-tokoferol >AraĢidonoil dopamin Ģeklinde sıralandığı görüldü. 1,3 ABTS Radikal Giderme Aktivitesi Grafiği 1 0,7 0,4 0,1 BHA BHT α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit -0, Konsantrasyon (µg/ml ) ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin ABTS.+ serbest radikali giderme aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks, α-tokoferol ile karģılaģtırılması Çalışılan Maddeler BHA BHT α-tokoferol Troloks ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür Araşidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil 4.14 ÇalıĢılan antioksidanların 10 µg/ ml konsantrasyonuna karģılık gelen ABTS radikali giderme aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması

147 Absorbans (505 nm) Absorbans (505 nm) DMPD radikali giderme aktivitesi bulguları ABTS ve DPPH radikal giderme aktivitesi tayinlerinde olduğu gibi DMPD radikal giderme aktivitesi tayini için öncelikle DMPD radikal çözeltisi standart grafiği hazırlandı (ġekil 4.15). Sonra çalıģtığımız maddelerden farklı konsantrasyonlarda (10-30 µg/ml) ilave edilerek DMPD radikali giderme aktivitesi ölçümleri yapıldı. Radikal giderme aktivitelerinden sonra geriye kalan radikal miktarı belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre absorbans miktar grafiği ġekil da görülmektedir. 0,06 0,04 DMPD Standart Grafiği y = 4E-05x R² = 0,9647 0, Miktar (µg/ml) ġekil DMPD.+ serbest radikal giderme aktivitesi için hazırlanan standart grafik 0,8 DMPD Radikal Giderme Aktivitesi Grafiği 0,6 0,4 0, Konsantrasyon (µg/ml) BHA BHT α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin DMPD.+ serbest radikali giderme aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması

148 Aktivite (%) 124 DMPD radikal giderme kuvveti grafiği incelendiğinde, 30 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen değerlere bakıldığı zaman 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit in diğer bütün maddelerden ve standart antioksidanlar olan BHA, BHT ve α-tokoferol den daha iyi DMPD radikal giderme kuvvetine sahip olduğu görüldü. ÇalıĢmada kullandığımız maddelerle birlikte standart olarak kullanılan antioksidan maddelerin DMPD radikali giderme kuvvetleri birbirleriyle mukayese edildi Çalışılan Maddeler BHA BHT α-tokoferol Troloks ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür Araşidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil ÇalıĢılan maddelerin 10 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen DMPD radikali giderme aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması Elde ettiğimiz veriler ile yaptığımız karģılaģtırma sonucunda fenolik maddelerden Trihidroksibenzaldehit, 3-4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8 [1-(4-Metoksifenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6-ol], Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin maddelerinin DMPD serbest radikal giderme kuvveti Troloks >2-4-6-Trihidroksibenzaldehit >Callistephin > α-tokoferol >BHT >Malvin >BHA >Pelargonin >Oenin >ID-8 >AraĢidonoil dopamin >Silikristin ve 3-4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit Ģeklinde sıralandığı görüldü. ÇalıĢmada kullandığımız maddeler ile birlikte standart olarak kullanılan antioksidan maddelerin grafik yardımıyla hesaplanan DPPH, DMPD, ABTS ve süperoksit anyon radikali giderme kuvveti IC 50 değerleri Çizelge 4.2 de birbirleriyle mukayese edildi.

149 125 Çizelge 4.2. ÇalıĢtığımız maddelerin O 2.-, DPPH, DMPD ve ABTS radikal giderme aktiviteleri IC 50 (µg/ml) değerlerinin pozitif kontrol olarak kullanılan standart antioksidanlardan BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile karģılaģtırılması Antioksidanlar DPPH. Giderme DMPD.+ Giderme ABTS.+ Giderme.- O 2 Giderme BHA 8,09 15,34 3,60 23,37 BHT 11,89 15,26 6,04 15,02 α-tokoferol 17,25 15,14 8,47 23,21 Troloks 14,13 13,90 7,39 23,21 ID-8 536,41 17,56 6,80 34,73 Silikristin 86,16 17,62 6,71 18,19 Oenin 16,72 15,46 6,60 16,70 Malvin 21,36 16,47 7,20 30,97 Callistephin 20,64 12,80 5,54 19,70 Pelargonin 67,73 15,86 6,71 14,13 AraĢidonoil dopamin 84,10 18,02 12,54 23,95 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit 10,69 17,80 6,05 11,47 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 28,86 13,27 5,28 16, Ferröz iyonları (Fe 2+ ) Ģelatlama aktivitesi bulguları Dinis et al. (1999) nın çalıģtığı metoda göre yapılan ferröz iyonları metal Ģelatlama aktiviteleri ölçümünde pozitif kontrol olarak kullanılan BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile birlikte diğer çalıģtığımız maddelerin 10, µg/ml konsantrasyon değerlerinde çalıģıldı. Elde ettiğimiz sonuçlara göre çizilen absorbans-miktar grafiğinden (ġekil 4.18) her maddenin ayrı ayrı IC 50 değerleri hesaplandı. Grafikten hesapladığımız IC 50 değerlerine göre sırasıyla 18.33, 18.54, ve µg/ml sonuçlarına sahip olan ID-8, AraĢidonoil dopamin, Malvin ve Pelargonin maddelerinin pozitif kontrol olarak kullandığımız standart antioksidanlar ile birlikte çalıģtığımız diğer tüm maddelerden daha fazla ferröz (Fe 2+ ) iyonlarını Ģelatlama aktivitesi gösterdi. IC 50 değerlerine göre yaptığımız karģılaģtırma sonucunda en yüksek metal (Fe 2+ ) Ģelatlama aktivitesi gösteren maddeden en düģük metal (Fe 2+ ) Ģelatlama aktivitesi gösterene doğru ID-8> Malvin >AraĢidonoil dopamin >Pelargonin >α- Tokoferol >3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit >Oenin >BHT >2,4,6- Trihidroksibenzaldehit >BHA >Callistephin >Silikristin ve Troloks Ģeklinde sıralandığı gözlendi.

150 Aktivite (%) Absorbans ( 500 nm) 126 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Konsantrasyon (µg/ml) BHA BHT α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin ferröz iyonları metal Ģelatlama aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol ile karģılaģtırılması Ayrıca çalıģtığımız maddelerin 10 µg/ml antioksidan konsantrasyonuna karģılık gelen aktivite (%) değerlerine bakıldığında ID-8, AraĢidonoil dopamin, Malvin ve Pelargonin in pozitif kontrol olarak kullandığımız standart antioksidanlar dahil çalıģtığımız diğer bütün maddelerden daha yüksek aktiviteye sahip antioksidanlar olduğu görüldü (ġekil 4.19; Çizelge 4.3) Çalışılan Maddeler BHA BHT α-tokoferol Troloks ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür Araşidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil ÇalıĢılan maddelerin 10 µg/ ml konsantrasyonuna karģılık gelen ferröz iyonları (Fe 2+ ) metal Ģelatlama aktivite (%) değerlerinin karģılaģtırılması

151 Absorbans (522 nm) Bipiridil metal Ģelatlama aktivitesi bulguları Bu yöntemde çalıģtığımız bütün maddelerin bipiridil metal Ģelatlama aktivitesi bipiridil reaktifi kullanılarak yapıldı. Yapılan bipiridil metal Ģelatlama aktivitesi tayininde 10, 20, 30 µg/ml konsantrasyonlara karģılık gelen sonuçlara göre çizilen Absorbans- Konsantrasyon grafiğinden (ġekil 4.20) her bir maddenin ayrı ayrı IC 50 değerleri hesaplandı. ÇalıĢtığımız maddelerin bipiridil metal Ģelatlama aktivitelerinin artan konsantrasyon ile doğru orantılı olduğu gözlendi. 1,6 Bipridil Metal Şelatlama Grafiği 1,2 0,8 0, Konsantrasyon (µg/ml) BHA BHT α-tokoferol Troloks EDTA Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil Farklı konsantrasyonlardaki (10-30 µg/ml) maddelerin bipiridil reaktifi kullanılarak yapılan metal Ģelatlama aktivitelerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α- Tokoferol ile karģılaģtırılması Yukarıdaki grafik incelendiğinde, 30 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen değerlerde Pelargonin, AraĢidonoil dopamin ve ID-8 in standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α-tokoferol den daha iyi bipiridil metal Ģelatlama aktivitesi gösterdiği görüldü. ÇalıĢmada kullandığımız maddelerle birlikte standart olarak kullanılan antioksidan maddelerin bipiridil reaktifi ile metal Ģelatlama aktiviteleri birbirleriyle mukayese edildi.

152 Aktivite (%) BHA BHT α-tokoferol Troloks EDTA ID-8 Malvin Klorür Oenin Klorür Callistephin Klorür Pelargonin Klorür Araşidonoil Dopamin Silikristin 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoikasit ġekil ÇalıĢılan maddelerin 10 µg/ml konsantrasyonuna karģılık gelen bipiridil metal Ģelatlama aktiviteleri (%) değerlerinin karģılaģtırılması Çizelge 4.3. ÇalıĢılan maddelerin 10 µg/ml antioksidan ilavesine karģılık gelen ferröz iyonları (Fe 2+ ) ve bipiridil metal Ģelatlama aktiviteleri IC 50 (µg/ml) ve aktivite (%) değerlerinin pozitif kontrol olarak kullanılan standart antioksidanlardan BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile karģılaģtırılması Antioksidanlar Ferrozin Reaktifi ile Fe 2+ Ġyonları ġelatlama Bipiridil Reaktifi ile Fe 2+ Ġyonları ġelatlama (IC 50 ) Aktivite (%) (IC 50 ) Aktivite (%) BHA 32,47 27,34 42,03 24,46 BHT 30,07 34,89 31,98 28,86 α-tokoferol 25,73 38,41 12,66 72,53 Troloks 49,44 21,35 18,56 30,86 EDTA - - 7,32 95,80 ID-8 18,33 54,16 8,80 88,06 Silikristin 36,78 25,78 24,83 14,20 Oenin 28,95 22,00 26,47 16,40 Malvin 18,54 52,21 14,34 65,73 Callistephin 34,51 22,73 20,80 33,06 Pelargonin 25,72 39,58 14,30 51,46 AraĢidonoil dopamin 20,37 50,65 11,08 73,86 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit 26,93 36,32 52,37 92,00 2,4,6-Trihidrooksibenzaldehit 32,16 32,16 17,93 48,00 Yapılan karģılaģtırma sonucunda fenolik bileģiklerden Trihidroksibenzaldehit, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8 (1- (4-Metoksifenil)-2-metil-3-nitro-1H-indol-6 ol), Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin maddelerinin bipirididil reaktifi ile metal Ģelatlama kuvveti EDTA >ID-8 >AraĢidonoil dopamin >Pelargonin >Troloks >α-tokoferol >Malvin >2,4,6-

153 Ansorbans (500 nm) 129 Trihidroksibenzaldehit >Callistephin >Silikristin >Oenin >BHT >BHA >3-4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit Ģeklinde sıralandığı gözlendi Total antioksidan kapasite tayini bulguları Fenolik bileģiklerden 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin ile flavonoidlerden ID-8 (1-(4-Metoksifenil)-2-metil-3-nitro- 1H-indol-6-ol), Silikristin, Callistephin, Malvin, Oenin ve Pelargonin maddelerinin total antioksidan kapasite tayinleri için Tiyosiyanat Metodu kullanıldı. Bu yöntem için önceden hazırladığımız linoleik asit emülsiyonunun otooksidasyonu sonucu oluģan peroksitler ferröz iyonlarını (Fe 3+ ) ferrik iyonlarına (Fe 2+ ) indirgemektedir. Böylece oluģan ferrik iyonları (Fe 3+ ) tiyosiyanat ile (SCN - ) ile Fe(SCN) 2+ kompleksi meydana getirir. OluĢan kopmleksin spesifik olarak 500 nm dalga boyunda absorbans vermesiyle ölçüm gerçekleģtirildi. 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0, İnkübasyon Süresi (saat) Kontrol BHA BHT α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil µg/ml konsantrasyonda ilave edilen maddelerin geçen süreye bağlı olarak total antioksidan kapasite kuvvetlerinin standart antioksidanlar olan BHA, BHT, Troloks ve α- Tokoferol ile karģılaģtırılması

154 130 Absorbansın fazla olması peroksit radikallerinin fazla olduğunu ve antioksidan olarak kullandığımız maddenin antioksidan kapasitesinin düģük olduğunu ifade eder. Bu tayin için pozitif kontrol olarak kullandığımız antioksidanlar ile birlikte çalıģtığımız maddelerin 20 µg/ml konsantrasyondaki çözelti ve emülsiyonlarının fosfat tamponu ve etanoldeki çözeltilerinin 500 nm dalga boyunda ölçülmesiyle belirlendi (ġekil 4.22). Pozitif kontrol olarak kullandığımız BHA, BHT, α-tokoferol, Troloks ve çalıģmada kullandığımız maddelerin linoleik asit emülsiyonunun peroksidasyonunu inhibe etme kapasitesi yüzde (%) olarak aģağıda verilen denklemden faydalanılarak yapıldı. Lipid peroksidasyonun inhibisyon yüzdesi (%) = (λ N500 ) 1 x 100 (λ K500 ) Denklemdeki λ N500, pozitif konrol olarak kullandığımız standart antioksidanlar veya çalıģtığımız maddelerin ilave edildiği linoleik asit emülsiyonunun inkübasyon sonrası 500 nm deki absorbansını, λ K500 ise sadece linoleik asit emülsiyonunun inkübasyon sonrası ölçümü için kullanılan 500 nm deki absorbansı ifade etmektedir. Denklemden faydalanılarak yapılan hesaplama iģlemlerinde pozitif kontrol olarak kullandığımız BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile çalıģtığımız maddelerin 20 µg/ml konsantrasyonları için linoleik asit emülsiyonunun peroksidasyonunu yüzde (%) olarak inhibe etme değerleri ġekil 4.23 de gösterilmiģtir. Grafikten görüleceği üzere ID-8, Callistephin ve Oenin için elde edilen % 97,98-97,58 ve 96,75 inhibisyon değerlerinin pozitif kontrol olarak kullandığımız BHA, BHT, α- Tokoferol ve Troloks ile birlikte çalıģtığımız diğer maddelerin lipid peroksidasyonu inhibe etme aktivitesi değerlerinden daha yüksek olduğu görüldü. ÇalıĢılan diğer maddelerin lipid peroksidasyonunu inhibe etme yüzdeleri ve absorbans değerleri biribiriyle karģılaģtırıldı.

155 Ġnhibisyon Değeri (%) (20 µg/ml) BHA BHT α-tokoferol Troloks Malvin ID-8 Pelargonin 3,4 Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit Slikristin Araşidonoil Dopamin Callistephin Oenin 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ġekil µg/ml konsantrasyonda kullanılan maddelerin 36. saatteki lipid peroksidasyon inhibisyonu yüzdelerinin karģılaģtırılması Pozitif kontroller ve çalıģtığımız diğer maddelerin total antioksidan kapasite tayini yöntemiyle lipid peroksidasyonunu inhibe etme kapasitesilerinin karģılaģtırılmasında ID-8 >Callistephin >Oenin >BHA > BHT >Silikristin >Malvin >Pelargonin >Troloks >BHT >AraĢidonoil dopamin >2,4,6-Trihidroksibenzaldehit >3,4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit >α-tokoferol Ģeklinde sıralandığı görüldü Karbonik Anhidraz Enzimi SaflaĢtırma ve Kantitatif Tayini Bulguları hca I ve II izoenzimleri için elde edilen saflaģtırma sonuçları Sepharose-4B-L-Trozin afinite kolon kromatografisi kullanılarak saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin elüsyon grafiği ve saflaģtırma tablosu aģağıda verdiğimiz ġekil 4.24 ve Çizelge 4.4 de görülmektedir. Elde edilen sonuçlara göre hca I izoenzimi 5934 EÜ/mL aktivitesi ile 3096 EÜ/mL aktivite gösteren hca II izoenziminden daha yüksek aktivide gösterdi. Ayrıca hca I ve II izoenzimlerinin sırasıyla %56 ve %14 lük yüksek denebilecek bir verimle saflaģtığı gözlendi.

156 Absorbans (280 nm) Enzim aktivitesi (EÜ/mL) Absorbans 1,5 Enzim Aktivitesi , Tüp sayısı ġekil Sepharose-4B-L-Trozin afinite kromatografisi kullanılarak saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin elüsyon grafiği Çizelge 4.4. Ġnsan eritrositlerinden elde edilen hca I ve II izoenzimlerinin saflaģtırma tablosu Numune Türü Aktivite (EÜ/mL) Toplam hacim (ml) Protein (mg/ml) Toplam protein (mg) Toplam aktivite Spesifik aktivite (EÜ/mg) Verim (%) SaflaĢtırma katsayısı Hemolizat ,5 78, , , Sepharose- 4B-L-Tirozin Sülfanilamit Afinite Kromatogra fisi CA I ,5 1,26 19, , CA II ,5 0,28 0, , Kantitatif protein tayini için kullanılan standart grafik SaflaĢtırma iģleminde kullandığımız afinite kolonundan elde ettiğimiz proteinlerin kantitatif tayinlerini yapabilmek için önce Bradford (1976) yöntemine göre standart grafik hazırlandı. Elde ettiğimiz enzim çözeltilerindeki protein tayinlerini yine Bradford

157 Absorbans 595 nm) 133 (1976) yöntemiyle elde ettikten sonra bu standart grafikten faydalanarak protein miktarları hesaplandı. ġekil 4.25 de BSA standart grafiği görülmektedir. 0,8 0,6 y = 0,0069x R² = 0,9982 0,4 0, BSA (µg) ġekil Bradford metodu ile proteinlerin kantitatif tayini için kullanılan BSA standart grafiği SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile enzim saflığının kontrolü Afinite kromatografisi yöntemiyle enzim saflaģtırıldıktan sonra sodyum dodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Laemmli metoduna göre yapılarak enzimin saflık derecesi kontrol edildi (Laemmli 1970). Enzim örnekleri yaklaģık 20 µg protein olacak Ģekilde hazırlandı. Toplam hacim 50 µl olacak Ģekilde 1/1 oranında numune tamponu katıldı. Üç dakika kaynar su banyosunda inkübe edildi. Bunun için elektroforez plakaları önce su sonra alkol ile iyice yıkandı. Her iki kenarında aralık oluģturucu bir plaka ile düz bir plaka üst üste getirilerek kıskaçlarla sabitleģtirildi. SabitleĢtirilen plakalar, içerisinde sızdırmayı önleyen sünger ihtiva eden jel ile beraber hazırlama kabinine konuldu. Önce ayırma jeli hazırlandı ve enjektörle plakaların arasına

158 134 üst kesimde 5 cm kalıncaya kadar dolduruldu. YaklaĢık bir saat jelin donması için beklendi ve ayırma jelinin katılaģtığından emin olunduktan sonra yığma jeli hazırlandı. Yığma jeli, ayırma jelinin üst kısmındaki boģluğa dolduruldu ve numune kuyucuklarının oluģması için tarak dikkatlice yerleģtirildi. Yığma jelinin katılaģması beklenirken ıslatılmıģ süzgeç kağıdı sistemin üzerine kapatıldı ve kuruması önlendi. Yığma jeli katılaģtıktan sonra, tarak dikkatlice çıkartılarak numune kuyuları belirlendi. Önce saf su, sonra da yürütme tamponuyla yıkandı ve jel plakalarla birlikte elektroforez tankına yerleģtirildi. Elektroforez tankının alt ve üst kısmına yürütme tamponu dolduruldu. Elektroforez tankı kapatılarak alt tarafından (+) anot, üst taraftan ise (-) katot yerleģtirildi. Önce 80 V da 20 dakika yürütüldü ve örnek ayırma jeline kadar gelip yığıldı. Sonra akım 100 V a çıkarıldı ve yürütme iģlemi numunelerin jelin alt sınırına gelmesine kadar sürdürüldü. Numunelerin takip edilmesi numune tamponuna katılan brom timol mavisi yardımıyla anlaģıldı. Yürütme iģlemi bittikten sonra akım kesilerek plakalar arasındaki jel dikkatlice çıkarıldı ve sabitleģtirme çözeltisine konuldu. SabitleĢtirme çözeltisinde 20 dakika bekletilen jel çıkarılarak boyama çözeltisine konuldu ve çalkalayıcı üzerinde 3 saat bekletildi. Jel boyandıktan sonra çıkarılarak yıkama çözeltisine konuldu. Rengi açılıp protein bantları belirginleģinceye kadar çalkalayıcıda yıkanan jel, daha sonra yıkama çözeltisinden çıkarıldı ve fotoğrafı çekildi (ġekil 4.26). Ayırma jeli Ģöyle hazırlandı: 5 ml 1 M Tris-HCl (ph 8,8), 4,4 ml %30 luk akrilamid-%0,8 bisakrilamid, 200 µl %0,1 lik SDS, 130 µl %5 lik TEMED (N,N, N,N -Tetrametil etilen diamin) ve 3,13 ml saf su karıģtırıldı. Bu karıģımın üzerine en son olarak 270 µl %5 lik PER [amonyum persülfat, (NH 4 ) 2 S 2 O 8 ] eklendi. Yığma jeli Ģöyle hazırlandı: 410 µl 1 M Tris-HCl (ph=6,8), 440 µl %30 luk Akrilamid-%0,8 bisakrilamid, 30 µl %0,1 lik SDS, 30 µl %5 lik TEMED ve 2,45 ml saf su karıģtırıldı. Bu karıģımın üzerine en son olarak 70 µl %5 lik PER eklendi.

159 135 A B C D E F 116 kda 97 kda 66 kda 45 kda 29 kda ġekil SDS- PAGE fotoğrafı * A ve D standart proteinler (116, 97, 66, 45 ve 29 kda), B ve F insan eritrositlerine ait CA I, C ve E insan eritrositlerine ait CA II izoenzim bantlarını göstermektedir 4.3. Karbonik Anhidraz Ġzoenzimlerinin (hca I ve hca II) Esteraz Aktivitesi Üzerine Ġnhibitör Maddelerin Etkilerinin Belirlenmesine Yönelik Yapılan ÇalıĢma Sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Malvin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi tayini için CA enzimlerinin esterleri hidroliz etme aktiviteleri özelliğinden yararlanıldı. Bu aktivite tayini ile için doygun p- nitrofenilasetat substratı konsantrasyonunda Malvin in 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak insan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine etkisi araģtırıldı. Malvin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde p-nitrofenil asetat ın p-nitrofenol e dönüģümü ile oluģan ürünün 348 nm de ölçülmesi esasına dayanılarak yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre hca I ve II izonenzimleri üzerine inhibisyon etkisi gösteren Malvin ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör Konsantrasyonu grafikleri ġekil 4.27 de görülmektedir.

160 hca I Aktivite (%) hca II Aktivite (%) y = 100e -0,296x R² = 0, y = 100e -0,007x R² = 0, Konsantrasyon (nm) Konsantrasyon (µm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Malvin inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerlerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Malvin] grafikeri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Malvin in IC 50 değerleri Malvin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi sonuçlarından elde edilen Aktivite (%) - Konsantrasyon grafiklerinden yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren Malvin konsantrasyonları (IC 50 ) hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.5 de gösterilmiģtir. Çizelge 4.5. hca I ve hca II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Malvin için elde edilen r 2 ve IC 50 değerleri Malvin IC 50 r 2 hca I 2,34 nm 0,9875 hca II 99,00 µm 0,9765

161 hca I Aktivitesi (%) hca II Aktivitesi (%) hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Pelargonin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları Bunun için doygun p-nitrofenilasetat substratı konsantrasyonunda Pelargonin in 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak, insan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimleri esteraz aktivitesi üzerine etkisi araģtırıldı. Pelargonin in hca I ve II izoenzimleri esteraz aktiviteleri üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde p-nitrofenil asetat ın p-nitrofenol e dönüģüm metodu kullanılarak yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre inhibisyon etkisi gösteren Pelargonin ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör konsantrasyonu grafikleri çizildi (ġekil 4.28). Elde edilen grafikten yararlanılarak IC 50 hesaplandı. Hesaplanan IC 50 değerleri biribiriyle karģılaģtırıldı. değeri y = 100e -0,002x R² = 0, y = 100e -0,005x R² = 0, Konsantrasyon (µm) Konsantrasyon (µm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Pelargonin inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerlerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Pelargonin] grafikleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Pelargonin in IC 50 değerleri Pelargonin in hca I ve II izoenzimlerinin estraz aktivitesi üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi snuçlarından elde edilen Aktivite (%) - Konsantrasyon grafiklerinden

162 hca I Aktivitesi (%) hca II Aktivitesi (%) 138 yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren Pelargonin konsantrasyonları (IC 50 ) hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.6 da gösterilmiģtir. Çizelge 4.6. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Pelargonin için elde edilen r 2 ve IC 50 değerleri Pelargonin IC 50 (µm) r 2 hca I 346,5 0,9754 hca II 138,6 0, hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Silikristin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları Silikristin in insan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimleri esteraz aktivitesi üzerine etkisi için doygun p-nitrofenil asetat substratı ve 5 farklı inhibitör konsantrasyonu kullanıldı. Silikristin in hca I ve II izoenzimleri esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre inhibisyon etkisi gösteren Silikristin ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör Konsantrasyonu grafikleri çizildi (ġekil 4.29). Elde edilen grafikten yararlanılarak IC 50 değerleri hesaplandı y = 100e -0,015x R² = 0, y = 100e -9E-04x R² = 0, Slikristin (µm) Silikristin (µm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Silikristin inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerlerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Silikristin] grafikleri

163 hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Silikristin in IC 50 değerleri Silikristin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi sonuçlarından elde edilen Aktivite (%) - Konsantrasyon grafiklerinden yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren Silikristin konsantrasyonları hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.7 de gösterilmiģtir. Çizelge 4.7. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Silikristin için elde edilen r 2 ve IC 50 değerleri Silikristin IC 50 (µm) r 2 hca I 46,20 0,9806 hca II 768,04 0, hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine ID-8 ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları Ġnsan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine ID-8 in etkisi için doygun p-nitrofenil asetat substratı ve 5 farklı inhibitör konsantrasyonu kullanıldı. ID-8 in hca I ve II esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde p-nitrofenil asetat ın p-nitrofenol e dönüģümü ve 348 nm dalga boyunda absorbans vermesi metodu kullanılarak yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre inhibisyon etki gösteren Silikristin ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör Konsantrasyonu grafikleri çizildi (ġekil 4.30). Elde edilen grafikten yararlanılarak IC 50 değerleri hesaplandı.

164 hca I Aktivitesi (%) hca II Aktivitesi (%) y = 100e -0,005x R² = 0, y = 100e -1E-03x R² = 0, ID-8 (µm) ID-8 (µm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda ID-8 inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [ID-8] grafikleri hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren ID-8 in IC 50 değerleri ID-8 in hca I ve II aktivitesi üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi sonuçlarından elde edilen Aktivite (%) - Konsantrasyon grafiklerinden yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren Silikristin konsantrasyonları (IC 50 ) hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.8 de gösterilmiģtir. Çizelge 4.8. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren ID-8 için elde edilen r 2 ve IC 50 değerleri ID-8 IC 50 (µm) r 2 hca I 138,60 0,9952 hca II 715,30 0, hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine AraĢidonoil Dopamin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları AraĢidonoil dopamin in insan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimleri esteraz aktivitesi üzerine etkisi için doygun p-nitrofenil asetat substratı ve 4 farklı

165 hca I Aktivitesi (%) hca II Aktivitesi (%) 141 inhibitör konsantrasyonu kullanıldı. AraĢidonoil dopamin in hca I ve II izoenzimleri esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre inhibisyon etkisi gösteren AraĢidonoil dopamin ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör Konsantrasyonu grafikleri çizildi (ġekil 4.31). Elde edilen grafiklerden yararlanılarak IC 50 değerleri hesaplandı. Hesaplanan IC 50 değerleri biribiriyle mukayese edildi y = 100e -0,002x R² = 0, y = 100e -0,003x R² = 0, Araşidonoil Dopamin (µm) Araşidonoil Dopamin (µm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda AraĢidonoil dopamin inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [AraĢidonoil dopamin] grafikleri K i değerinin bulunması için IC 50 değerlerinin altında ve üstünde olmak üzere üç farklı inhibitör konsantrasyonu ve beģ farklı p-nitrofenilsetat konsantrasyonu kullanılarak 1/V(IEU/mL) ye karģı 1/[S] grafikleri (Lineweaver Burk) çizildi (ġekil 4.32). 1/V (EU/mL) Kontrol 341,25 µm 455,00 µm 568,75 µm hca I /[S] mm -1 1/V (EU/mL) -1 Kontrol 227,50 µm 341,25 µm 455,00µM hca II /[S] mm -1 ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzre 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen AraĢidonoil dopamin Lineweaver Burk grafikleri

166 hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren AraĢidonoil Dopamin in IC 50 ve K i değerleri AraĢidonoil dopamin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi sonuçlarından elde edilen Aktivite (%) - Konsantrasyon grafiklerinden yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren AraĢidonoil dopamin konsantrasyonları (IC 50 ) hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı (Çizelge 4.9) Çizelge 4.9. hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren AraĢidonoil dopamin için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri AraĢidonoil Dopamin IC 50 (µm) r 2 K i (µm) hca I 346,5 0, ,80 hca II 231,0 0, ,25 Ayrıca AraĢidonoil dopamin in hca I ve II izoenzimlerinin estreaz aktivitesi üzerine gösterdiği %50 inhibisyon gösterdiği konsantrasyonların üstünde ve altında olmak üzere toplam üç farlı inhibitör konsantrasyonu ile 5 farklı substrat konsantrasyonları kullanılarak elde edilen sonuçlara göre çizilen Lineweaver Burk grafiklerinden yararlanarak hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı K i değerleri hesaplandı (Çizelge 4.9) hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Callistephin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları Callistephin in insan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine etkisi için doygun p-nitrofenil asetat substratı ve 5 farklı inhibitör konsantrasyonu kullanıldı. Callistephin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre inhibisyon etkisi gösteren

167 hca I Aktivitesi (%) hca II Aktivitesi (%) 143 Callistephin ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör konsantrasyonu grafikleri çizildi (ġekil 4.33). Elde edilen grafiklerden yararlanılarak IC 50 değerleri hesaplandı y = 100e -0,005x R² = 0, y = 100e -0,006x R² = 0, Callistephin (µm) Callistephin (µm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Callistephin inhibitörünün 5 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Callistephin] grafikleri Ayrıca IC 50 değerlerinin altında ve üstünde olmak üzere üç farklı inhibitör konsantrasyonu ve beģ farklı substrat (p-nitrofenil asetat) konsantrasyonu kullanılarak 1/V(IEU/mL) ye karģı 1/[S] grafikleri (Lineweaver Burk) çizildi (ġekil 4.34). Kontrol 106,65 µm 159,97 µm 213,3 µm 1/V (EU/mL) hca I /[S] mm -1 1/V (EU/mL) hca II Kontrol 106,65 µm 159,97 µm /[S] mm -1 ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzre 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen Callistephin e ait Lineweaver Burk grafikleri Elde edilen Lineweaver Burk grafiklerinden faydalanılarak K i değerleri hesaplandı.

168 hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Callistephin in IC 50 ve K i değerleri Callistephin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi sonuçlarından elde edilen Aktivite (%) - Konsantrasyon grafiklerinden yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren Callistephin konsantrasyonları (IC 50 ) hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı (Çizelge 4.10). Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon gösteren Callistephin için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri Callistephin IC 50 (µm) r 2 K i (µm) hca I 138,6 0, ,01 hca II 115,5 0, ,40 Ayrıca Callistephin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine gösterdiği %50 inhibisyon konsantrasyonlarının üstünde ve altında olmak üzere toplam üç farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonları kullanılarak elde edilen sonuçlara göre çizilen Lineweaver Burk grafiklerinden yararlanarak hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı K i değerleri hesaplandı hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine Oenin ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları Doygun p-nitrofenil asetat substratı ve 5 farklı inhibitör konsantrasyonu kullanılarak Oenin in insan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine etkisi araģtırıldı. Oenin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde p-nitrofenil asetat ın p-nitrofenol e dönüģümü ve 348 nm dalga boyunda absorbans vermesi metodu kullanılarak yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre inhibisyon etkisi gösteren Oenin ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör Konsantrasyonu

169 hca I Aktivitesi (%) hca II Aktivitesi (%) 145 grafikleri çizildi (ġekil 4.35). Elde edilen grafiklerden yararlanılarak IC 50 değerleri hesaplandı y = 100e -0,005x R² = 0, y = 100e -0,008x R² = 0, Oenin (µm) Oenin (µm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Oenin inhibitörünün 5 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Oenin] grafikleri Ayrıca IC 50 değerlerinin altında ve üstünde olmak üzere üç farklı inhibitör konsantrasyonu ve beģ farklı substrat (p-nitrofenilsetat) konsantrasyonu kullanılarak 1/V(IEU/mL) ye karģı 1/[S] grafiği (Lineweaver Burk) çizildi. Elde edilen Lineweaver Burk grafiğinden (ġekil 4.36) faydalanılarak K i değeri hesaplandı. 1/V (EU/mL) Kontrol 94,55 µm 141,83 µm 235,38 µm /[S]mM -1 ġekil hca I izoenzimi esteraz aktivitesi üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzere 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen Oenin e ait Lineweaver Burk grafiği

170 hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren Oenin in IC 50 ve K i değerleri Oenin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi sonuçlarından elde edilen Aktivite (%) - Konsantrasyon grafiklerinden yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren Oenin konsantrasyonları (IC 50 ) hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı (Çizelge 4.11). Ayrıca Oenin in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine gösterdiği %50 inhibisyon konsantrasyonlarının üstünde ve altında olmak üzere toplam üç farlı inhibitör konsantrasyonu ile 5 farklı substrat konsantrasyonları kullanılarak elde edilen sonuçlara göre çizilen Lineweaver Burk grafiklerinden yararlanarak hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı K i değerleri hesaplandı (Çizelge 4.11). Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine inhibisyon gösteren Oenin için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri Oenin IC 50 (µm) r 2 K i (µm) hca I 138,6 0, ,55 hca II 86,6 0,9888 ψ ψ: Elimizde yeterli inhibitör madde olmadığından tespit edilemedi hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit in 5 farklı konsantrasyonu ve doygun p-nitrofenil asetat substratı kullanılarak insan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine etkisi araģtırıldı. 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde p-nitrofenil asetat ın p-nitrofenol e dönüģümü ve 348 nm dalga boyunda absorbans vermesi metodu kullanılarak yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre inhibisyon etki gösteren 2,4,6-

171 hca I Aktivitesi (%) hca II Aktivitesi (%) 147 Trihidroksibenzaldehit ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör Konsantrasyonu grafikleri çizildi (ġekil 4.37). Elde edilen grafiklerden yararlanılarak IC 50 değerleri hesaplandı y = 100e -0,499x R² = 0, y = 100e -0,009x R² = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit (mm) ,4,6-Trihidroksibenzaldehit (µm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit inhibitörünün 5 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [2,4,6- Trihidroksibenzaldehit] grafikleri Ayrıca IC 50 değerlerinin altında ve üstünde olmak üzere üç farklı inhibitör ve beģ farklı substrat (p-nitrofenilsetat) konsantrasyonu kullanılarak 1/V(IEU/mL) ye karģı 1/[S] grafiği (Lineweaver Burk) çizildi. Elde edilen Lineweaver Burk grafiğinden (ġekil 4.37) faydalanılarak K i değerleri hesaplandı. 1/V (EU/mL) -1 Kontrol 0,649 mm 1,297 mm 1,947 mm hca I /[S] (mm) -1 1/V (EU/mL) hca II Kontrol 64,88 µm 97,32 µm 0-1,5 0,5 2,5 4,5 6,5 1/*S+µM -1 ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzere 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit e ait Lineweaver Burk grafikleri

172 hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit in IC 50 ve K i değerleri 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi sonuçlarından elde edilen Aktivite (%) - Konsantrasyon grafiklerinden yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit konsantrasyonları (IC 50 ) hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı (Çizelge 4.12 Ayrıca 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit in hca I ve II izoenzimlerinin estreaz aktivitesi üzerine gösterdiği %50 inhibisyon konsantrasyonlarının üstünde ve altında olmak üzere toplam üç farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonları kullanılarak elde edilen sonuçlara göre çizilen Lineweaver Burk grafiklerinden yararlanarak hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı K i değerleri hesaplandı Çizelge 4.12). Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine inhibisyon gösteren 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit IC 50 r 2 K i (mm) hca I 1,38 mm 0,9717 1,165 hca II 77,00 µm 0,9896 0, hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine 3,4-Dihidroksi-5- Metoksibenzoik Asit ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları Ġnsan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit in etkisi, 4 farklı inhibitör konsantrasyonu ile doygun konsantrasyonda p-nitrofenil asetat substratı kullanılarak araģtırıldı. 3,4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit in hca I izoenzimi esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde yapıldı (Amstrong et al. 1966; Verpoorte et al. 1967). Elde edilen sonuçlara göre inhibisyon etkisi gösteren 3,4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ile ilgili Aktivite (%) Ġnhibitör Konsantrasyonu

173 hca I Aktivitesi (%) hca II Aktivitesi (%) 149 grafikleri çizildi (ġekil 4.39). Elde edilen grafiklerden yararlanılarak IC 50 değerleri hesaplandı y = 100e -0,446x R² = 0, y = 100e -0,848x R² = 0, ,5 1 1,5 2 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoik Asit (mm) 0 0 0,5 1 1,5 2 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoik Asit (mm) ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine doygun substrat konsantrasyonunda 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoik Asit inhibitörünün 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [3,4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik Asit] grafikleri Ayrıca IC 50 değerlerinin altında ve üstünde olmak üzere üç farklı inhibitör ve beģ farklı substrat (p-nitrofenilsetat) konsantrasyonu kullanılarak 1/V(IEU/mL) -1 ye karģı 1/[S] grafiği (Lineweaver Burk) çizildi (ġekil 4.40). Elde edilen Lineweaver Burk grafiklerinden faydalanılarak K i değerleri hesaplandı. 1/V (EU/mL) Kontrol 1,086 mm 1,358 mm 1,629 mm hca I /S (mm) 1/V (EU/mL) hca II Kontrol 0,543 mm 1,086 mm 1,629 mm /[S] mm -1 ġekil hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine IC 50 değerinin altında ve üstünde olmak üzere 3 farklı inhibitör ve 5 farklı substrat konsantrasyonunda çizilen 3,4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit e ait Lineweaver Burk grafikleri

174 hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoik Asit in IC 50 ve K i değerleri 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine gösterdiği inhibisyon etkisi sonuçlarından elde edilen Aktivite (%)- Konsantrasyon grafiklerinden yaralanılarak %50 inhibisyon gösteren 3,4-Dihidroksi-5- Metoksibenzoik Asit in konsantrasyonları (IC 50 ) hca I ve II izoenzimleri için ayrı ayrı hesaplandı (Çizelge 4.13). Ayrıca 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit in hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine gösterdiği %50 inhibisyon konsantrasyonlarının üstünde ve altında olmak üzere toplam üç farklı inhibitör konsantrasyonu ile 5 farklı substrat konsantrasyonları kullanılarak elde edilen sonuçlara göre çizilen Lineweaver Burk grafiklerinden yararlanarak hca I ve II için ayrı ayrı K i değerleri hesaplandı (Çizelge 4.13). Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine inhibisyon gösteren 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit için elde edilen r 2, IC 50 ve K i değerleri 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoik Asit IC 50 (mm) r 2 K i (mm) hca I 1,55 0,9721 0,91 hca II 0,82 0,9866 1, hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktivitesi üzerine çalıģtığımız maddelerden inhibisyon etki gösterenlerin inhibisyon türleri ve IC 50 ile K i değerlerin toplu gösterimi Bu çalıģmada kullandığımız inhibitörlerin tamamının hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine inhibisyon etkisi sonuçlarından elde ettiğimiz Aktivite (%) - Ġnhibitör Konsantrasyonu grafikleri ve Lineweaver Burk grafiklerinden faydalanılarak hesaplanan IC 50 ve K i değerleri ile inhibisyon türleri Çizelge 4.14 de toplu olarak gösterilmiģtir. ÇalıĢtımız maddelerin hca I izoenzimi esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi için IC 50 değerlerine baktığımızda, µm düzeyde inhibisyon gösteren

175 151 maddelerin içinde 42 µm ile Silikristin in diğer çalıģılan maddelere kıyasla en düģük konsantrasyonda inhibisyon etki yaptığını gözlemledik. Ayrıca inhibisyon etki gösteren maddeler içinde Malvin 2,34 nm ile hca I esteraz aktivitesi üzerine %50 inhibisyon göstererek diğer çalıģılan tüm maddelere kıyasla nm düzeyde en düģük konsantrasyonda inhibisyon etki gösterdi. hca II izoenzimi esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren maddelerin IC 50 değerlerini göz önüne aldığımızda çalıģılan bütün maddelerin µm düzeyde inhibisyon yaptığı gözlendi. Söz konusu maddeler içinde hca II izoenzimi esteraz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, 77 µm IC 50 değeri ile inhibisyon yapan diğer maddelere kıyasla en düģük konsantrasyonda inhibisyon etki ortaya koydu. Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin esteraz aktiviteleri üzerine inhibisyon gösteren tüm maddelerin IC 50 ve K i değerleri ile inhibisyon türlerinin karģılaģtırılması Ġnhibitör Madde Adı hca I hca II IC 50 (µm) K i (µm) Ġ. Türü IC 50 (µm) K i (µm) Ġ. Türü Malvin 2, ψ ψ 99,00 ψ ψ Pelargonin 346,50 ψ ψ 138,60 ψ ψ Silikristin 46,20 ψ ψ 750,00 ψ ψ ID-8 138,60 ψ ψ 665,00 ψ ψ AraĢidonoil dopamin 346,50 203,80 YarıĢmasız 231,00 75,25 Y. yarıģmalı Callistephin 138,60 51,01 YarıĢmasız 115,50 352,40 YarıĢmasız Oenin 138,60 99,55 YarıĢmalı 86,60 ψ ψ 2,4,6-Trihidroksi 1380, ,00 YarıĢmalı 77,00 354,00 YarıĢmasız Benzaldehit 3,4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit 1550,00 910,00 YarıĢmalı 820, ,00 YarıĢmasız ψ: Maddelerin inhibisyon türleri ve K i değerleri, yeterli inhibitör madde olmaması dolayısıyla tespit edilememiģtir Ġnhibitör Olarak Kullanılan Maddelerin hca I izoenzimi CO 2 -Hidrataz Aktivitesi Üzerine Etkisi Ġle Ġlgili Yapılan ÇalıĢma Sonuçları ÇalıĢtığımız 9 farklı flavonoid ve fenolik yapıda inhibitör maddelerin doygun substrat konsantrasyonunda, insan eritrositlerinden saflaģtırılan hca I izoenzimi CO 2 -Hidrataz aktivitesi üzerine etkileri araģtırıldı. Söz konusu maddeler olan 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit, AraĢidonoil dopamin, 3,4- Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit,

176 Aktivite (%) Aktivite (%) Aktivite (%) Aktivite (%) 152 ID-8, Silikristin, Oenin, Pelargonin, Malvin ve Callistephin maddelerinin hca I CO 2 - hidrataz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde Rickly et al. (1964) tarafından modifiye edilen Wilbur and Anderson (1948) yöntemine göre CO 2 in HCO 3 a hidratasyonu ve açığa çıkan H + iyonları etkisiyle meydana gelen ph değiģiminin brom timol indikatörü ile belirlenerek geçen sürenin ölçülmesi prensibine dayanılarak yapıldı. Elde edilen sonuçlara göre her bir inhibitör için çizilen Aktivite (%) - Ġnhibitör Konsantrasyonu grafikleri (ġekil 4.41 ve 4.42) aģağıda gösterilmiģtir. 100 y = 100e -0,016x R² = 0, y = 100e -9E-04x R² = 0, Silikristin (µm) ,4-Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit (µm) y = 100e -0,001x R² = 0, y = 100e -0,006x R² = 0, ID-8 (µm) Malvin (µm) ġekil hca I izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyounda Silikristin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, ID-8 ve Malvin inhibitörlerinin 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Ġnhibitör] grafikleri

177 Aktivite (%) Aktivite (%) Aktivite (%) Aktivite (%) y = 100e -0,006x R² = 0, y = 100e -0,015x R² = 0, ,4,6-Trihidroksibenzaldehit (µm) Callistephin (µm) y = 100e -0,037x R² = 0, y = 100e -0,004x R² = 0, Oenin (µm) Araşidonoil Dopamin (µm) ġekil hca-i izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, Callistephin, Oenin ve AraĢidonoil dopamin inhibitörlerinin 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen Aktivite (%) [Ġnhibitör] grafikleri Sonuçlardan elde edilen Aktivite (%) - Ġnhibitör Konsantrasyonu grafiklerine bakıldığında, hca I CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine Silikristin, ID-8, 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, AraĢidonoil dopamin, Callistephin, Oenin ve Malvin in kısmi inhibisyon etkisi olmuģtur. Ancak Pelargonin in hca I CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine herhangi bir inhibisyon etkisi gözlenmemiģtir. Ġnhibitör olarak kullanılan maddelerden inhibisyon etki gösterenlerin IC 50 değerleri Çizelge 4.15 de gösterilmiģtir. Pelargonin in ise IC 50 değeri inhibisyon etki göstermemesi dolayısıyla hesaplanamamıģtır. Elde edilen sonuçlara göre sırasıyla 18,73 µm, 43,31 µm, 46,20 µm IC 50 inhibisyon değerleri ile Oenin, Silikristin ve Callistephin çalıģılan maddeler içinde en düģük konsantrasyonda inhibisyon etki göstermiģ oldu.

178 Aktivite (%) Aktivite (%) 154 Çizelge hca I izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine inhibisyon etki gösteren maddelerin IC 50 değerleri Ġnhibitör IC 50 (µm) Silikristin 43,31 Oenin 18,73 Callistephin 46,20 Malvin 115,50 ID-8 693,00 AraĢidonoil Dopamin 173,25 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 115,50 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoik Asit 542, Ġnhibitör olarak kullanılan maddelerin hca II izoenzimi CO 2 -Hidrataz aktivitesi üzerine etkisi ile ilgili yapılan çalıģma sonuçları 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, Silikristin, ID-8 Oenin, Callistephin, Malvin ve Pelargonin maddelerinin hca II izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de anlatıldığı Ģekilde CO 2 in HCO 3 a hidratasyonu reaksiyonu ile Rickly et al. (1964) tarafından modifiye edilen Wilbur and Anderson (1948) metodu kullanılarak yapıldı. Elde edilen sonuçlara göre Aktivite (%) - Konsantrasyon grafikleri çizildi (ġekil 4.43 ve 4.44). Çizilen grafiklerden yararlanılarak IC 50 değerleri hesaplandı y = 100e -5E-04x R² = 0, y = 100e -0,001x R² = 0, Araşidonoil Dopamin (µm) ,4-Dihidroksi-5-Metoksi Benzoik Asit (µm) ġekil hca II izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda AraĢidonoil dopamin ve 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit inhibitörlerinin 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen Aktivite (%) - [Ġnhibitör] grafikleri

179 % Aktivite Aktivite (%) Aktivite (%) Aktivite (%) Aktivite (%) Aktivite (%) y = 100e -0,003x R² = 0, y = 100e -0,002x R² = 0, Malvine (µm) Callistephin (µm) y = 100e -5E-04x R² = 0, y = 100e -0,533x R² = 0, ,5 1 1,5 2 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit (µm) Silikristin (µm) y = 100e -0,013x R² = 0, y = 100e -0,002x R² = 0, ID-8 (µm) Oenin (nm) ġekil hca II izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine doygun substrat konsantrasyonunda Malvin, Callistephin, 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, Silikristin, ID-8 ve Oenin inhibitörlerinin 4 farklı konsantrasyonu kullanılarak IC 50 değerinin bulunması için çizilen [Aktivite (%)] [Ġnhibitör] grafikleri

180 hca I ve II izoenzimlerinin CO 2 -Hidrataz aktivitesi üzerine çalıģılan maddelerden inhibisyon etki gösterenlerin r 2 ve IC 50 değerlerinin toplu gösterimi ÇalıĢmadan edilen grafik sonuçlarına bakıldığı zaman mikromolar düzeyde hca II izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine Malvin, Callistephin, Oenin, AraĢidonoil dopamin, ID-8 ve Silikristin maddeleri kısmi inhibisyon etkisi göstermiģtir. Ancak diğer maddelerin hca II hidrataz aktivitesi üzerine herhangi bir inhibisyon etkisi gözlenmemiģtir. Ġnhibitör olarak kullanılan maddelerden inhibisyon etki gösterenlerin IC 50 değerleri Çizelge 4.16 da gösterilmiģtir. Ġnhibisyon etkisi göstermeyen diğer maddelerin IC 50 değerleri ise inhibisyon etki göstermemeleri dolayısıyla hesaplanamamıģtır. Çizelgeden de görüleceği gibi hca I ve II izoenzimlerinin CO 2 -hidrataz aktiviteleri üzerine sırasıyla 43,31 ve 1,30 µm IC 50 değeri ile inhibisyon etki gösteren Silikristin, µm düzeyde inhibisyon etki gösteren ve çalıģılan tüm maddelerden daha düģük konsantrasyonda inhibitör özellik göstermiģtir. Ancak çalıģtığımız maddeler içinde Oenin hca II izoenzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine 346,50 nm IC 50 değeri ile nm düzeyde inhibisyon gösteren tek madde olarak ortaya çıkmıģ oldu. Pelargonin ise inhibisyon göstermediği için IC 50 değeri belirlenemedi. Çizelge hca I ve II izoenzimlerinin CO 2 -hidrataz aktiviteleri üzerine inhibisyon etki gösteren maddelerin r 2 ve IC 50 değerlerinin toplu olarak gösterimi Ġnhibitör hca I hca II IC 50 (µm) r 2 IC 50 (µm) r 2 Malvin 115,50 0, ,00 0,9264 ID-8 693,00 0, ,30 0,9737 AraĢidonoil dopamin 173,25 0, ,00 0,9948 2,4, 6-Trihidroksibenzaldehit 115,50 0, ,00 0,9635 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit 542,88 0, ,00 0,9991 Oenin 18,73 0,9699 0,35 0,9739 Callistephin 46,20 0, ,50 0,9576 Silikristin 43,31 0,9370 1,30 0,9828 Pelargonin ψ ψ ψ ψ ψ : Ġnhibisyon etki gözlenmediği için ilgili değerler hesaplanamamıģtır.

181 AraĢidonoil Dopamin, 2,4,6-Trihidroksi Benzaldehit ve 3,4-Dihidroksi-5- Metoksibenzoik Asit in rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -Hidrataz aktivitesi üzerine elde edilen inhibisyon sonuçları AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine inhibisyon çalıģmaları Bölüm de p-nitrofenol ün p- nitrofenilasetat a dönüģümüyle oluģan ürünün 348 nm dalga boyunda ölçümü ile yapıldı Üzerinde durulan özelikler bakımından tanımlayıcı istatistikler ortalama ve standart sapma olarak ifade edilmiģtir. Bu özellikler bakımından gruplar arası karģılaģtırmada Post Hock analizi için Tukey T testi ve zamana bağlı olarak grup içi karģılaģtırmada Student T testi kullanıldı. Elde edilen sonuçların istatistik anlamlılık düzeyi %5 (p<0,05) olarak alındı ve hesaplamalar için SPSS 15 istatistik paket programı kullanıldı (Çizelge 4.17 ve ġekil 4.45). Çizelge AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine elde edilen inhibisyon sonuçları Gruplar Zaman Kontrol AraĢidonoil Dopamin 3,4-Dihidroksi-5- Metoksibenzoik Asit 2,4,6-Trihidroksi benzaldehit CA Aktivitesi (IU/gHb) CA Aktivitesi (IU/gHb) CA Aktivitesi (IU/gHb) CA Aktivitesi (IU/gHb) 1.saat 54927,1±1258,8 A,a 46953,0± 730,0 B,a 47067,0±1246,9 B,a 45698,8± 641,2 B,a 4.saat 55589,5±1262,5 A,a 40661,6±1750,7 B,b 39357,5± 930,3 B,b 37781,4±1182,4 C,b ( A,B,C p) Aynı satırda farklı büyük harfi alan grup değerleri arasındaki fark (gruplar arası) anlamlıdır (p<0,001) ( a,b p) Aynı sütunda farklı küçük harfi alan zaman değerleri arasındaki fark (grup içi) anlamlıdır (p<0,001) Ġstatistiksel sonuçlar değerlendirildiğinde 1 ve 4. saatte ölçülen total CA enzim aktivitesi, inhibitör gruplarında kontrol gurubuna göre anlamlı olarak düģük çıktı (p<0,001). Zamana bağlı olarak grup içi karģılaģtırmalarda ise inhibitör gruplarının 4. saatteki total CA enzim aktiviteleri 1. saat total CA enzim aktivitesine göre anlamlı olarak düģmüģtü (p<0,001).

182 CA (IU/gHb) / saat 4.saat 0 ġekil AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine 1 ve 4. saatte IU/gHb cinsinden ölçülen aktivite sonuçları Elde edilen sonuçlardan faydalanılarak kontrol gurubuna kıyasla hesaplanan total CA aktivitesi yüzde (%) olarak istatistiksel sonuçlarıyla birlikte Çizelge 4.18, ġekil 4.46 da verilmiģtir. Çizelge AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine elde edilen yüzde (%) inhibisyon sonuçları Gruplar Zaman Kontrol ᴪ AraĢidonoil 3,4-Dihidroksi-5-2,4,6-Trihidroksi Dopamin Metoksibenzoik asit benzaldehit CA Aktivitesi (%) CA Aktivitesi (%) CA Aktivitesi (%) CA Aktivitesi (%) 1.saat 100±2,29 A,a 85,48±1,30 B,a 85,69±2,26 B,a 83,19±1,16 B,a 4.saat 100±2,27 A,a 73,11±3,16 B,b 70,80±1,67 B,b 67,96±2,12 C,b ᴪ : Kontrol gurubu total CA enzimi CO 2 aktivitesi 100 olarak kabul edilmiģtir. ( A,B,C p) Aynı satırda farklı büyük harfi alan grup değerleri arasındaki fark (gruplar arası) anlamlıdır (p< 0,001) ( a,b p) Aynı sütunda farklı küçük harfi alan zaman değerleri arasındaki fark (grup içi) anlamlıdır (p< 0,001) Elde edilen grafiklerden yararlanılarak AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5- metoksibenzoik asit ve 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit maddelerinin yarılanma ömürleri (t 50 ) hesaplandı (Çizelge 4.19).

183 Aktivite (%) Aktivite (%) Aktivite (%) Araşidonoil Dopamin y = 100e -0,083x R² = 0,8805 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoik asit y = 100e -0,09x R² = 0, Geçen süre (saat) Geçen süre (saat) 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 100 y = 100e -0,102x R² = 0, Geçen süre(saat) ġekil AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit in rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine yarılanma ömrünün (t 50 ) hesaplanması için çizilen Aktivite (%) - Geçen süre grafikleri Çizelge AraĢidonoil dopamin, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit maddelerinin rat eritrositleri total CA enzimi CO 2 -hidrataz aktivitesi üzerine elde edilen yarılanma (t 50 ) ömürleri AraĢidonoil Dopamin 3,4-Dihidroksi-5- Metoksibenzoik asit 2,4,6-Trihidroksi benzaldehit Yarılanma ömrü (Saat) 8,34 7,7 6,79

184 TARTIġMA ve SONUÇ ROS nin iskemi iliģkili miyokard reperfüzyon yaralanması gibi kardiyovasküler hastalıklar, diyabet, kanser, iflamasyon gibi birçok hastalığın patojenezinde rol oynadığı bildirilmiģtir (Lorgis et al. 2010; Bursal 2011). ROS nin hücresel kaynaklarında antioksidan denge değiģtiği ve savunma sistemi yetersiz kaldığı durumlarda, ROS proteinler ve fosfolipidler gibi hücresel komponentler ile raksiyona girebilir. Bu reaksiyonlar tiyol gruplarının oksidasyonu ve lipid peroksidasyon reaksiyonlarını içerir. Bu olumsuz etkiler inflamasyon, apoptozis ve hücre ölümüne kadar giden süreçleri ortaya çıkarabilir (Logis 2010). Antioksidanların antioksidan kapasitelerinin en önemli faktörlerinden biri onların elektron vererek indirgeyici olma özelliklerinden kayaklanmaktadır. Güçlü antioksidan özellikleriyle bilinen fenolik bileģiklerin radikalik zincir reaksiyonlarını engellemesi yapılarındaki fenolik -OH gruplarından peroksil radikallerine hidrojen atomu veya elektron transferi iledir (Gülçin 2012). Falavonoidler ve fenolik bileģikler insan diyetinin önemli bir bölümünü oluģturan bitkilerde yaygın olarak bulunan bileģiklerdir. Bu bileģiklerin kanser türü ile mücadele potansiyeli, antioksidan ve antiinflamtuar etkileri rapor edilmiģtir. Flavonoidlerin VEGF salınımını artırma, kanser hücresi farklılaģması ve anjiyogenezi inhibe ettiği rapor edilmiģtir (Chen and Chen 2013). Sentetik veya doğal kaynaklı bileģiklerin, bitki ekstraktları ve diğer numunelerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi için birçok yöntem geliģtirilmiģtir. Bu parametreleri ölçen yöntemler arasında total antioksidan kapasite, indirgeme kapasitesi, DPPH, DMPD, ABTS ve süperoksit anyon radikali giderme ile metal Ģelatlama aktiviteleri sıklıkla kullanılan ve popüler olan yöntemlerdir (Gülçin 2012). Total antioksidan kapasite tayini diğer yöntemlerin etki ettiği faktörleri bir arada bulunduran bir metot ise de, antioksidan moleküllerinin aromatik halkalarına bağlı -OH gurubu ve

185 161 sayısı, konjuge dien yapıları gibi faktörlerin metal Ģelatlama, indirgeme kuvveti, serbest radikal giderme kapasiteleri üzerine etkileri nedeniyle her bir metodun ayrı olarak uygulanması ve ayrı ayrı değerlendirilmesinin daha uygun olacağı açıktır (Gülçin 2012; Göçer 2014). Sentetik antioksidanların zararlı ekilerinden dolayı günümüzde ilgi haline gelen doğal kaynaklı antioksidanlar ve özellikle de bitkilerin antioksidan özelliklerinde en önemli etken olan flavonoid ve fenolik bileģiklerin antioksidan kapasiteleri araģtırılmaya devam edilmektedir. Ayrıca fenolik ve flavonoid yapıdaki bileģiklerin CA izoenzimleri inhibitörlerinin yeni sınıfı olma potansiyeli ile de bu moleküller ayrı ilgi konusu haline gelmiģtir (Gülçin 2012). OluĢan bu tablo tez çalıģmamızın mantığının geliģmesinde önemli bir etken oluģturmuģtur. Bu çalıģmamızda antioksidan ve antiradikal giderme aktiviteleri ve CA izoenzimleri inhibisyonu üzerine etkilerinin araģtırılmasında bazı fenolik ve flavonoid yapıdaki bileģikler kullanıldı. Antioksidan bileģikler hidrojen abstraksiyonunu engelleme, geçiģ metal iyonlarını bağlama, radikal giderme ve peroksitleri parçalama gibi farklı mekanizmalarla antioksidan etkilerini ortaya koymaktadırlar (Diplock 1997; Gülçin 2012). Bu amaçla öncelikli olarak Malvin, Callistephin, Oenin ve Pelargonin, Silikristin, AraĢidonoil dopamin, 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit, 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve ID-8 maddelerinin total antioksidan özellikleri araģtırıldı. Total antioksidan kapasite tayini klinik olarak kullanılan biyoaktif maddeler ile gıda bileģeni olan moleküller için yaygın kullanılan bir metottur. Bu metot bileģiklerin lipid peroksidasyonu gibi oksidatif bozulmayı inhibe etme kapasitesi olarak da tanımlanabilir (Roginsky and Lissi 2005). Lipid peroksidasyonu bir dizi korbon-karbon çift bağ içeren lipidlerin oksidatif bozulması olarak tanımlanmaktadır. Biyoaktif bileģiklerin muhtemel total antioksidan etkilerinin belirlenmesi için linoleik asit emülsiyonunu inhibe etme yeteneği test edilir. Linoleik asit emülsiyonu sonuçta hidroperoksitleri üretir ve oluģan hidroperoksitler ikincil ürünleri oluģturmak için ayrıģırlar. Tiyosiyanat metodu ile total antioksidan kapasite tayini lipid oksidasyonu baģlangıcından itibaren lipid oksidasyonunun ilk ürünü olan peroksit seviyelerini ölçmek için kullanılır. Bu metotta deney periyodu süresince

186 162 otoksidasyon sonucu linoleik asitten meydana gelen hidroperoksit miktarı ölçülür. Hidroperoksitler, meydana gelen peroksitlerin linoleik asit oksidasyonu süresince Fe 2+ ile reaksiyona girerek Fe 3+ ü oluģtururlar. OluĢan bu ikincil iyonlar (Fe 3+ ) tiyosiyanat (SCN - ) ile kompleks oluģtururlar. OluĢan Fe(CN) 2+ kompleksi 500 nm de maksimum absorbans gösterir. Antioksidanların mevcudiyetinde linoleik asit oksidasyonu yavaģtır. Ayrıca buna bağlı olarak tiyosiyanat formunun yavaģ değiģmesinden dolayı renk değiģimi de yavaģ olacaktır (Gülçin 2002). Dolayısıyla antioksidan maddenin Fe 2+ yi Fe 3+ e yükseltgenmesini inhibe etme yeteneği ne kadar fazla ise absorbans o kadar düģük çıkacaktır. Total antioksidan kapasite tayini için tiyosiyanat metodu ile yaptığımız çalıģmada elde edilen verileri (ġekil 4.22), pozitif kontrol olarak kullandığımız standart antioksidanlar olan BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile birlikte çalıģtığımız diğer maddeleri karģılaģtırdığımızda ID-8, Callistephin ve Malvin in sırasıyla %97,98 97,58 ve 96,75 inhibisyon değerleriyle en yükek lipid peroksidasyonunu inhibe etme aktivitesi sergiledikleri gözlendi (ġekil 4.22 ve 4.23; Çizelge 5.1). Çizelge ıncı saatte 20 µg/ml konsantrasyonda test çözeltisinde bulunan antioksidanların linoleik asit emülsiyonunun lipid peroksidasyonunu inhibe etme yüzdeleri ve absorbans değerlerinin karģılaģtırılması Antioksidan 36. saat Absorbans Değeri (500 nm) % Ġnhibisyon BHA 0,100 96,39 BHT 1,007 63,63 α-tokoferol 2,517 9,10 Troloks 0,178 93,57 Malvin 0,134 95,16 ID-8 0,056 97,98 Pelargonin 0,168 93,93 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit 2,292 17,23 Silikristin 0,126 95,45 AraĢidonoil dopamin 1,353 51,14 Callistephin 0,067 97,58 Oenin 0,090 96,75 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 1,987 28,24 Ayrıca Malvin ve Pelargonin ile Silikristin %95,16-93,93 ve 95,45 inhibisyon değerleriyle pozitif kontrol olarak kullandığımız BHT, α-tokoferol ve Troloks dan daha

187 163 iyi lipid peroksidasyonunu inhibe etme aktivitesi gösterdiler (ġekil 4.22 ve 4.23; Çizelge 5.1). Tez çalıģmasında kullandığımız diğer maddelerin tamamı da kendi kapasitelerine göre farklı oranlarda lipid peroksidasyonunu inhibe etme yeteneği sergiledi. Fenolik asitler ve onların esterlerinin antioksidan aktiviteleri molekül içerisindeki -OH gurubunun sayısı ve pozisyonuna bağlıdır. Bu nedenle bazı araģtırmacılar, fenolik bileģiklerin yapı-aktivite iliģkisiyle ilgili çalıģmalar yapmıģlardır (Bursal 2011; Göçer and Gülçin 2011). Nitekim Gülçin (2007) yaptığı bir çalıģmada iki OH gurubuna sahip L-Dopa nın bir OH gurubuna sahip trozinden daha yüksek antioksidan kapasiteye sahip olduğunu ortaya koymuģtur. Dolayısıyla yapılan bu çalıģma fenolik bileģiklerin antioksidan özelliklerinin yapılarındaki hidroksil gurubu sayısı ve pozisyonundan önemli ölçüde etkilendiğini göstermektedir. Ayrıca fenol halkalarına bağlı farklı grupların varlığı antioksidan kapasite ve hidrojen verme yeteneği üzerine etki etmektedir. Orto ve para pozosyonunda hidroksil iyonları gibi elektron veren baģka grupların varlığı da antioksidan kapasiteyi artırmaktadır (Chimi et al. 1991). Dimerik fenoller basit monomerik fenollerden daha etkili antioksidanlar iken, basit fenoller aracılığıyla peroksit radikallerinin giderilmesinde hidrolize edilebilen taninler, daha düģük antioksidan aktiviteye sahip moleküllerdir (Bursal 2011). Bu amaçla iki Kafeik Asit in birleģtirilmesiyle elde edilen Rozmarinik Asit ile ilgili yapılan çalıģmada dimerik yapıdaki Kuersetinin daha fazla antioksidan özellik gösterdiği rapor edilmiģtir (Gülçin 2006a). Bunlardan farklı olarak fenolik bileģiklerin yapısında bulunan ester, lakton veya aromatik asit gibi karbonil gruplarının varlığı da antioksidan aktiviteyi azaltmaktadır (Göçer and Gülçin 2011). Buna bağlı olarak kafeik asit ile Ģeker birimlerinin ester oluģturmasının antioksidan aktiviteyi azalttığı ifade edilmiģtir (Chen and Ho 1997).

188 164 Fenolik asit sınıfına ait hidroksi sinnamik asit ve türevleri -CH 2 =CH-COOH alifatik gurubu bulundurmaktadır. Hidroksi sinnamik asit ve türevlerinin -COOH gurubu bulunduran hidroksibenzoik asit türevlerine göre daha az antioksidan etki gösterdiği belirtilmiģtir (Cuppet et al. 1997; Gülçin 2012). Bir kimyasal maddenin indirgenmesi onun elektron kazanması olarak tarif edilebilir. Oksidasyon ise elektron kaybı olarak ifade edilebilir. Ġndirgeyici bir ajan elektron vererek baģka bir reaktantın indirgenmesine sebep olan örnektir. Oksidan veya okside edici ajan ise elektronları kabul eden ve diğer reaktanı yükseltgeyen madde demektir. Dolayısıyla bir reaksiyonda indirgenme ve yükseltgenme durumu söz konusu ise bu reaksiyonlar ''redoks reaksiyonu'' olarak adlandırılır. Kimyasal zincir reaksiyonları, yaģayan sistemlere enerji sağlamak için yiyeceklerin parçalanmasından açığa çıkan kimyasal maddeleri oksitlenmesi oksijen ile meydana gelen biyolojik oksidasyonların baģlıca reaksiyonudur. Ġndirgeyici veya yükseltgeyici terimleri, sıklıkla antioksidan veya prooksidan terimleri yerine de kullanılmaktadır. Prooksidanları etkili bir Ģekilde indirgeyebilen antioksidanlar, Fe 3+ nı da etkili bir Ģekilde Fe 2+ na indirgeyebilirler (Gülçin 2012). Dolayısıyla bir bileģiğin indirgeme gücü onun antioksidan aktivitesi hakkında bize önemli bilgiler sunar. Ġndirgeme özelliği bir bileģiğin en önemli antioksidan özelliklerinden biridir (Meir et al. 1995). Bu durum çalıģmamızda kullandığımız üç farklı indirgeme kapasitesi tayini olan FRAP reaktifi ile Fe 3+ iyonlarını indirgeme, Cu 2+ iyonlarını indirgeme ve ferröz iyonları (Fe 3+ ) indirgeme kuvveti ölçümlerini önemli hale getirmektedir. Ġndirgeme gücü tayini için en sık kullanılan yöntemlerden biri ferrik iyonlarını (Fe 3+ ) ferröz iyonlarına (Fe 2+ ) indirgeme gücü tayini (FRAP) dir. Bu yöntem asidik ortamda Fe 3+ -2,4,6,-tripiridil-s-triazin [(Fe 3+ -(TPTZ) 2 ] 3+ kompleksini koyu renkli Fe 2+ -2,4,6- tripiridils-triazin[(fe 2+ -(TPTZ)2] 2+ kompleksine (ġekil 5.1) indirgemesini sağlar (Benzie and Strain 1999). Ġndirgeme gücü yeteneğinin çoğu antioksidanlar tarafından H + transferi sebebiyle meydana gelen radikal temizleme süreciyle az iliģkili olduğu iddia edilmiģtir. Fakat yine

189 165 de radikallerin iyonlara indirgenmesi ve yükseltgenmesi olayı önemini korumakta ve indirgeme gücü doku ve plazmadaki redoks düzenlemesini ayarlayan bileģiklerin yeteneğini yansıtmaya devam etmektedir (Prior et al. 2005). ġekil 5.1. FRAP metoduna göre [Fe 3+ -(TPTZ) 2 ] 3+ - Fe 2+ -(TPTZ) 2 ] 2+ kompleksi oluģum mekanizması (Gülçin 2012). FRAP deneyi ile elde edilen değerler, oluģan ferröz 2,4,6-tripiridin-s-triazin komleksinin 593 nm de maksimum absorbans vermesi esasına dayanılarak elde edildi. FRAP deneyi ile elde edilen değerlere bakıldığında 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit 2,458 absorbans değeriyle pozitif kontrol olarak kullandığımız antioksidanlar ile birlikte çalıģtığımız diğer maddelerden daha etkili Fe 3+ indirgeme aktivitesi sergiledi. Ayrıca Oenin 2,351 absorbans değeriyle BHT dıģındaki diğer standart antioksidanlardan, Callistephin 2,328 absorbans değeriyle α-tokoferol ve Troloks ile birlikte çalıģılan diğer maddelerden daha etkili Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme kapasitesi gösterdi. ÇalıĢtığımız tüm maddeler kendi potansiyellerine göre konsantrasyon artıģına bağlı olarak Fe 3+ -Fe 2+ indirgeme aktivitesi sergiledi. C 2+ nin Cu + e indirgenmesini içeren CUPRAC metodu Apak et al. (2006) tarafından geliģtirilmiģtir. Bu yöntem Neocuprin (2,9-dimetil-1,10-fenantren) mevcudiyetinde antioksidanların kombine etkileriyle sulu etanol ortamında ph 7 de Cu 2+ nin Cu + e indirgenmesi esasına dayanır. Fenoller trafından meydana gelen Cu + kompleksi 450 nm de maksimum absorbans gösterir (Gülçin 2008; Lee et al. 2011). Bu metot okside olmuģ kromojenik ajan olarak Cu 2+ -Neocuprin tarafından yiyecek içeriklerinin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesinde sıklıkla kullanılır. Ġndirgeyici ajan

190 166 tarafından Neocuprin nin mevcudiyetinde Cu 2+ nin indirgenmesi 450 nm de absorbans veren Cu + kompleksini (ġekil 5.2) verir (Tütem et al. 1991). Neocuprin Ģelatlayıcı bir ajan ve heterosiklik organik bir bileģendir. Bu metot düģük maliyeti olan ancak hızlı, stabil, seçici olması münasebetiyle çok çeģitli antioksidanlar ve hidrofobik tip kimyasallar için uygun olan bir yöntemdir. Kromojenik CUPRAC redoks reaksiyonu fizyolojik ph (ph: 7) da gerçekleģtirilmekte ve -SH gurubu içeren antioksidanlara cevap vermeyen FRAP metodunun aksine glutatyon gibi protein olmayan tiyol tipi antioksidanların ölçümünün karģılaģtırılmasında yaygın kullanılan bir metottur (Gülçin and Aslan 2007). CUPRAC metodu seçicidir. Basit Ģekerler ve sitrik asit gibi gerçekte antioksidan sınıfında olmayan bileģikler CUPRAC reaktifi ile okside olmazlarken, güçlü redoks potansiyelleri ile fenolik bileģikler kolayca okside olurlar (Apak et al. 2005). Bu metodun bir avantajı da hem hidrofilik hem de lipofilik yapıdaki antioksidanların ölçümünde kullanılabilmesidir (Apak et al. 2008). ġekil 5.2 Antioksidan bir molekül tarafından meydana gelen CUPRAC reaksiyonu (Gülçin 2012). * HA: antioksidant bir molekül, A + ise okside olan antioksidan molekülü temsil etmektedir. Açığa çıkan protonla amonyum asetat tamponu tarafından nötralize edilmektedir. Cu 2+ nin Cu + e indirgenme aktivitesi için Apak et al. (2006) tarafından geliģtirilen metodun Ak and Gülçin (2008) tarafından yapılan küçük bir modifikasyonuyla elde edilen yöntemi mevcut çalıģmada kullandık. Pozitif kontrol olarak kullandığımız BHA, BHT, Tokoferol ve Troloks ile diğer çalıģılan maddelerden elde ettiğimiz sonuçlarda (ġekil 4.4) tüm çalıģılan maddeler konsantrasyon ile doğru orantılı olarak Cu 2+ indirgeme aktivitesi göstermiģlerdir (ġekil 4.3).

191 167 Ayrıca çalıģtığımız maddelerden 30 µg/ml ye karģılık gelen absorans değerlerine göre karģılaģtırma yapıldığı zaman Malvin, Oenin ve Callistephin ile 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit ve 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit sırasıyla 0,431, 0,464, 0,456, 0,466 ve 0,474 absorbans değeriyle değeriyle pozitif kontrol olarak kullanılan troloks ve α-tokoferol ile bu çalıģmada kullanılan diğer tüm maddelerden daha iyi Cu 2+ indirgeme kapasitesine sahip olduklarını göstermiģlerdir (ġekil 4.3 ve Çizelge 4.1). Reaktif bileģiklerin indirgeme gücü veya gıda bileģenlerinin elektron verme kapasiteleri antioksidant aktiviteyle doğrudan iliģkili olduğu bildirilmiģtir (Köksal and Gülçin 2008). Biyoaktif bileģiklerin indirgeme gücü direkt olarak Fe[(CN) 6 ] 3 ün Fe[(CN) 6 ] 2 ye dönüģümüyle ölçülür. Ġndirgeyici ürünlere serbest Fe 3+ iyonu ilave edildiği zaman yoğun Prussian mavi kompleksi oluģumu meydana gelir. Fe 4 [(CN) 6 ] 3 kompleksi 700 nm de maksimum absorbans gösterir (Bursal and Gülçin 2011). Bu metotta, test çözeltisinin sarı rengi antioksidant maddenin indirgeme gücüne bağlı olarak mavi ve yeģilin farklı tonlarına dönüģür. Yüksek absorbans değeri yüksek ferrik indirgeme gücünü gösterir (Gülçin 2002). Malvin, Callistephin, Oenin, 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit ve 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit sırasıyla 1.439, 1.585, 2.192, ve absorbans değerleriyle, pozitif kontrol olarak kullanılan α- Tokoferol ve Troloks un ve absorbans değerlerinden yüksek çıkarak daha iyi Fe 3+ indirgeme kapasitesine sahip olduklarını göstermiģlerdir. (ġekil 4.1 ve 4.2). Ayrıca çalıģma için kullandığımız bütün maddeler konsantrasyon artıģı ile doğru orantılı olarak değiģik oranlarda Fe 3+ indirgeme özelliği sergilediler (Çizelge 4.1). Serbest radikal zincir reaksiyonları lipid peroksidasyonunun ortak bir mekanizması olarak yaygın Ģekilde kullanılır. Radikal temizleyiciler yiyecek ürünlerinin stabilitesini, kalitesini artırmak ve peroksidasyon zincir reaksiyonlarını sonlandırmak için peroksit radikallerini temizlemek adına direkt olarak onlarla reaksiyona girebilir. Antioksidanların serbest radikal süpürme mekanizması lipid oksidasyonunu inhibe etmesi diye bilinen mekanizmalardır. Bu test antioksidan aktivite çalıģmalarında yapılan standart testlerden biridir ve spesifik bileģiklerin radikal temizleme aktivitesi için hızlı

192 168 bir teknik sunar. DPPH., DMPD.+, ABTS.+.- ve O 2 radikalleri üzerine temellendirilmiģ bu metotlar yiyecek, içecek ve bitki ekstraktlarının antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi için kullanılan en popüler spektrofotometrik metotlardır. Buna ek olarak DPPH. ve ABTS.+ temizleme metotları basit, hızlı, hassas ve tekrarlanabillir olması bakımından bileģiklerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesinde sıklıkla kullanılmaktadır (Özcelik et al. 2003; Gülçin et al. 2005a). Antioksidanlar fenolik hidroksil gruplarından hidrojen vererek lipid oksidasyonunu baģlatamayan ve teģvik edemeyen stabil son ürünler oluģturarak serbest radikal zincir reaksiyonunu engeller (Amarowicz et al. 2004). Radikal giderme aktivitesi biyolojik sistemlerde ve yiyeceklerde serbest radikallerin zararlı etkilerinden dolayı çok önemlidir. Farklı metotlar bitki fenolik bileģiklerinin antioksidan aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılmaktadır. Radikal temizleme için kullanılan kimyasal metotlar ve bir dizi radikal üreten sistemler, sentetik serbest radikalleri temizleme yeteneği üzerine temellendirilmiģtir. DPPH., ABTS.+, DMPD.+ ve O -. 2 radikal giderme metotları bileģiklerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesinde sıklıkla kullanılan spektrofotometrik yöntemlerdir. Antioksidanlar, radikallerin bulunduğu ortama ilave edildiği zaman DPPH., DMPD.+, ABTS.+ radikallerini baģka forma dönüģtürmesi suretiyle belli ölçülerde renk giderilmesi durumu söz konusu olur. Serbest radikal giderme mekanizmasını basit bir Ģekilde aģağıdaki gibi gösterebiliriz. DPPH. + AH DPPH-H + A. ABTS.+ + AH ABTS + + A. DMPD.+ + AH DMPD + + A. Bu metotlar hızlıdır ve bir örneğin toplam ölçüm süresi yaklaģık 15 dakika kadardır. Az iģ gücü gerektirmesi, pahalı olmayan reaktifler kullanılması ve karmaģık aletler gerektirmemesi bakımından avantajlı metotlardır. Bu kromojenlerin kullanılmasının kolay olması, yüksek sensitivite göstermesi ve çok sayıda örneğin antioksidan özelliklerinin analizine hızlı Ģekilde imkan vermesi gibi birçok avantajları vardır (Köksal et al. 2009).

193 169 DPPH radikal giderme yöntemi antioksidant aktivitenin belirlenmesi kullanılan en eski ve dolaylı yöntemlerden biridir. Bu yöntem ilk olarak doğal materyallerin hidrojen iyonu vermesinin keģfiyle 1950 li yıllarda önerilmiģtir. Daha sonra biyolojik ilgili örneklerin dıģında yiyecek ve bireysel olarak fenolik bileģiklerin antioksidan potansiyellerini belirlemek amacıyla kullanılmıģtır (Roginsky and Lissi 2005). DPPH radikali koyu mavi renk taģıyan ve az stabil olan organik azot radikalleridir. DPPH radikali ticari olarak mevcuttur ve ABTS radikal giderme metodunda olduğu gibi önceden hazırlanmak zorunda değildir. DPPH metodunda antioksidanlar stabil DPPH radikallerini sarı renkli difenil-pikrilhidrazin e indirgerler. Bu metot alkol çözeltisi içinde antioksidanların hidrojen vermesi neticesinde DPPH radikallerinin indirgenerek nonradikal form olan DPPH-H a dönüģtürülmesi esasına dayanır. Antioksidan yetenek elektron spin rezonans (ESR) veya absorbansının azalmasının ölçümüyle ortaya konabilir. Yaygın bir Ģekilde kullanılan renksizleģtirme ilk olarak Blois (1958) tarafından rapor edilmiģtir. DPPH genellikle antioksidanların serbest radikal giderme aktivitesini ölçmek için reaktif olarak kullanıldı (ElmastaĢ et al. 2006). Stabil serbest DPPH radikali 517 nm dalga boyunda maksimum absorbans gösterir. DPPH radikalleri proton veren bir substrat ile karģılaģtığı zaman radikaller temizlenmeli ve absorbans düģmelidir (Gülçin et al. 2009). Bu metotta koyu mor renkli DPPH radikalleri radikal süpürücü tarafından açık sarı renge karģılık gelen hidrazin (DPPH-H) e indirgenir (ġekil 5.3). ġekil 5.3. Antioksidanlar (AH) tarafından DPPH radikali giderme mekanizması (Gülçin 2012)

194 170 Bu test basit, hızlı, ve yalnızca antiokidan özellik belirlemede yaygın olarak kullanılan UV-VĠS spektrofotometreye ihtiyaç duyan bir yöntemdir. DPPH deney yönteminin hidrojen atomu verme veya elektron transfer reaksiyonu üzerine temmellendiği düģünülebilir. Bu yöntem DPPH radikallerinin antioksidanlar tarafından indirgenmesinin ölçümü olarak tanımlanabilir (Prior et al. 2005). Stabil serbest DPPH radikalleri fenoll, katekol ve anilinlerin süpürücü özelliklerini araģtırmak için faydalı bir radikal türüdür. DPPH radikalleri ve fenoller arasındaki reaksiyon için Ģimdilik kabul gören iki yaygın mekanizma ( HAT ve SPLET) vardır (Musialik and Litwinienko 2005). Ar-OH + DPPH. Ar-O. + DPPH-H (HAT) Ar-OH Ar-O - + H+ (SPLET) Ar-O - + DPPH. Ar-O. + DPPH- DPPH - + H + DPPH-H Taze hazırlanmıģ DPPH solüsyonu 517 nm de maksimum absorbans veren koyu mor bir renk ortaya koyar. Ortamda antioksidanlar olduğu zaman bu koyu renk kaybolmaya ve renksizleģmeye baģlar (Gülçin et al. 2004; 2006b). Antioksidan moleküller makul bir ölçüde serbest radikal ataklarını elektron verme veya hidrojen atomu sağlama suretiyle DPPH radikallerini temizler ve renksizleģtirir. Bu deneyde baģlangıçta hazırlanan DPPH ın absorbansı ölçüldükten hemen sonra antioksidan ilavesi yapılarak antioksidanların DPPH gidermesi aktivitesinde yaralanılarak absorbanstaki azalma ölçülür (Gülçin 2007). DPPH radikal temizleme kapasitesi genellikle absorbans sabit kalıncaya kadar nm deki absorbans azalmasının izlenmesi suretiyle metanol veya etanol gibi organik bir ortamda ölçülür (Brand-Williams et al. 1995). Organik ortam olarak metanolün kullanımı toksik özelliklerinden dolayı pek tercih edilmez. Son zamanlarda Milardowich et al. (2006) cam karbon elektrodunda DPPH ın amperometrik indirgenmesi üzerine dayalı radikal giderme kapasitesi yöntemi belirlemiģlerdir. Bu reaksiyon mekanizması marjinal reaksiyon yolu olan hidrojen verme veya elektron transfer reaksiyonu üzerine temellendirilmiģtir. Çünkü hidrojen bağı kabul eden

195 171 iģlemlerde metanol, etanol gibi solventlerde bu iģlem çok yavaģ gerçekleģir (Foti et al a,b). Elektron transfer temelli diğer yöntemlerde olduğu gibi DPPH radikallerini temizleme kapasitesi çözücü ve reaksiyonun gerçekleģtiği ortam ph ından önemli ölçüde etkilenir (Magalhaes et al. 2008). DPPH radikali giderme metodu için su-etanol solüsyonunun sınırları ve oranları konusu çalıģılmıģtır. ÇalıĢmalar sonucunda elde edilen verilere göre hidrofilik ve lipofilik antioksidanlar için uygun su-etanol oranı 1/1 oranında olması gerektiği görülmüģtür. Aynı zamanda DPPH ve radikal temizleyen bileģikler arasındaki reaksiyon hızı, su oranının artırılmasıyla görülür biçimde artmaktadır. Ancak bununla birlikte su/etanol oranı 60/40 ın üzerinde olmamalıdır. Çünkü bu durumda DPPH radikalleri koagulasyona uğrar ve radikal giderme aktivitesi azalır. Elde edilen sonuçlar genelde serbest radikal konsantrasyonunu yarıya düģüren antioksidan konsantrasyonu (EC 50 ) Ģeklinde verilir (Brand-Williams et al. 1995). EC 50 değerinin düģük olması antioksidanın etkin radikal temizleyici özelliğini yansıtır. Yiyecek içeriklerinin güçlü DPPH giderme kapasitesine sahip olduğu rapor edimiģtir. Resveratrol üzümde bulunan ana bileģenlerden biridir. Gülçin (2010) resveratrol ile ilgili yaptığı çalıģmasında Resveratrol ün etkili DPPH radikali temizleyicisi olduğunu göstermiģtir. Fenolik hidroksil grupları ve kimyasal yapısı boyunca elektron delokalizasyonu potansiyeli vasıtasıyla antioksidanlar olarak hareket eden polifenolik bileģiklerin yetenekleri iyi bilinmektedir. Resveratrolün yapısı DPPH ile giriģim yapan renkli bir sistem sağlar (Ak ve Gülçin 2008). Resveratrolün radikal giderme mekanizması ġekil 5.4 de gösterilmiģtir. Resveratrol Resveratrol fenoksil Radikali ġekil 5.4. Resveratrol ün DPPH radikal giderme mekanizması (Gülçin 2012).

196 172 Resveratrol monofenol ve difenol olmak üzere iki fenolik halkaya sahiptir. Monofenol hidroksil gurubundan hidrojen atomunun verilmesi daha kolay olur (Ak ve Gülçin 2008). Kurkuminin keto formu, iki metoksifenil halkası arasındaki heptadien bağlantısı yüksek reaktif karbon atomu içerir. Kurkumin bu karbon atomundan hidrojeni kolayca verebilir. Fenolik halkadan hidrojen atomu verilmesi çok zordur. Çünkü Kurkumin in fenolik hidrojen atomları bitiģik metoksi gruplarına, molekül içi hidrojen bağlı Ģekildedir. (Gülçin 2012). Kurkumin DPPH. DPPH-H ġekil 5.5. Kurkumin ile DPPH radikalleri arasındaki reaksiyon için önerilen mekanizma (Gülçin 2012) Yukarıda DPPH radikali giderme ile ilgili yapılan çalıģmalar ve ortaya konulan sonuçlar, araģtırma çalıģmalarında DPPH radikal giderme yönteminin verimli bir Ģekilde kullanıldığını göstermektedir.

197 173 Yaptığımız çalıģmada DPPH. radikali giderme aktivitesi için kullanılan3,4-dihidroksi- 5-metoksibenzoik asit 10,69 µg/ml olan IC 50 değeri ile pozitif kontrol olarak kullandığımız BHT, α-tokoferol ve Troloks ile birlikte tez için kullandığımız diğer maddelerden daha düģük çıkarak etkili DPPH radikali giderme aktivitesi gösterdi (ġekil 4.10 ve 4.11; Çizelge 5.2). Pozitif kontroller ile birlikte çalıģtığımız maddeler içinde 536,41 µg/ml IC 50 değeri ile ID-8 en az DPPH radikali giderme aktivitesi gösteren bileģik olarak görüldü. Ancak çalıģtığımız bütün maddeler kendi kapasitelerine göre konsantrasyon artıģı ile doğru orantılı olarak DPPH radikali giderme aktivitesi ortaya koydu (ġekil 4.10 ve 4.11; Çizelge 5.2). Süperoksit anyon radikalleri biyolojik olarak oldukça toksik etkilidir ve vücuda yerleģen mikroorganizmaları öldürmek için bağıģıklık sistemi tarafından üretilmektedir. Fagositler süperoksit anyon radikallerini istilacı patojenleri oksijen bağımlı öldürü mekanizmada kullanmak için NADPH oksidaz enzimi tarafından büyük miktarda üretir. Süperoksit anyon radikali, seçici reaktiviteye sahip olan oksijen merkezli bir radikaldir. İn vivo olarak oksijene bir elektron verilmesinin bir sonucu olarak üretilir. Bu durum aynı zamanda radikal ıģınlar tarafından oksijenin aktivasyonu ve çeģitli metabolik süreçlerden dolayı ortaya çıkabilir (Halliwel 2006). Süperoksit anyon radikali enzimatik veya nonenzimatik mekanizmalar ile H 2 O 2 i dönüģtürür (Halliwel and Gutteridge 1990; Gardner and Frodowich 1992;). Süperoksit radikalleri göreceli olarak zayıf bir oksidant ve kimyasal reaktivitesi sınırlı ise de, lipid peroksidasyonuna sebep olan singlet oksijen ve hidroksil radikali gibi çok tehlikeli olan reaktif bileģenleri üretebilir (Halliwel and Chirico 1993). Süperoksit anyonlar biyolojik makromoleküllerle reaksiyona girerek doku hasarına yol açma potansiyeline sahip olan reaktif serbest radikallerin öncülleridirler (Halliwel and Gutteridge 1984). Süperoksid radikali oksijen varlığında suyun radyoliziyle kolayca oluģmaktadır (Gülçin and DaĢtan 2007). Süperoksit, hidroksil radikali gibi daha fazla reaktif olan türlere dönüģtüğünden dolayı çeģitli fizyopatolojik süreçler ile

198 174 iliģkilendirilmiģtir. Aynı zamanda süperoksit radikalinin lipid peroksidasyonunu doğrudan baģlattığı gözlenmiģtir (Wickens 2001). Bazı flavonoidlerin antioksidan özellikleri ile süperoksit anyon radikallerini etkili bir biçimde temizlediği rapor edilmiģtir. Süperoksid anyonu H 2 O 2, OH., 1 O 2 nin prekürsörüdür. Bu reaktif moleküllerden 1 O 2 lipid, protein ve DNA oksidatif hasarını tetikler. Süperoksit radikalleri oksijen den türeyen ilk radikal formudur ve önemli etkilere sahiptir. Çünkü onlar diğer serbest radikallere okside olan reaktifleri üretirler (Pietta 2000). Süperoksit anyon radikalleri giderme aktivitesinin belirlenmesi için kullanılan biyoanalitik metot ile süperoksit anyon radikallerini üretmek için ph 7,4 de Ksantin-Ksantin Oksidaz sisteminin kullanılmasıyla yapılmaktadır. ġekil 5.6 da görüldüğü gibi süperoksid anyon radikalleri nitroblue tetrazolium (NBT) u formazan a indirgeyebilir ve formazan 560 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülebilir (Aruoma 1993). Normalde kullanılan ksantin oksidaz, nikotinamid adenindinükleotid (NAD) e elektron transfer eden bir dehidrogenaz enzimidir. Stresin devamı süresince bu enzim oksidaz enzimine dönüģtürülür ve H 2 O 2 ile O.- 2 radikallerini oluģturur. Böylece ksantin oksidaz ph 7,4 de.- test tüpünde hipoksantin veya ksantin e dönüģerek O 2 radikallerini üretebilir. Bu reaksiyon NBT yi formazan a indirgemek için O.- 2 radikallerinin yeteneği ile ölçülebilir (Bull et al. 1983) ve formazan oluģumu 560 nm de spektrofotometrik olarak ölçülebilir (Sanchez-Moreno 2002). Bu metodun verimliliği ve kullanımını geliģtirmek için son zamanlarda NBT yerine sitokrom c kullanılan mikro tabaka Ģeklindeki plakaların 550 nm de okutulması yoluyla modifiye edilmiģ (Quick et al. 2000; MacDonald-Wicks et al. 2006) ve ksantin-ksantin oksidaz üreten sistem kullanarak O.- 2 anyon radikallerini temizleme yöntemi için alfaketometiolbütirik asit ile reaksiyona sokulmasıyla oluģan etilen in gaz kromatografisi ile ölçümü yöntemi geliģtirilmiģtir (Vonkrvedener et al. 1995; Lavelli et al. 1999). Bu radikale karģı süpürme kapasitesi ESR spektrometresi kullanılarak ölçülebilir (Rimbach and Rallauf 1998; Calliste et al. 2001).

199 175 Hipoksantin Ksantin Ksantin Oksidaz 2O 2 2O 2.- ġekil 5.6. Ksantin-ksantin oksidaz sistemi ile süperoksit anyon radikallerinin dönüģümü ve nitroblue NBT 2+ nin formazan a indirgenmesi (Gülçin 2012) Ksantin-ksantin oksidaz sistemine benzer Ģekilde ġekil 5.7 de görülen farklı bir metot da NADH varlığında fenazin metosülfatın nonenzimatik reaksiyonunun kullanılması yoluyla O.- 2 radikallerinin üretilmesidir. O radikalleri üreten her iki sistemde de O 2 radikalleri NBT yi formazana indirgeyebilir ve 560 nm de formazan absorbansı izlenebilir (Aruoma 1993). Diğer bir O 2.- radikali üretme metodu riboflavin metiyonin ıģık sistemidir. O 2.- radikalleri bu sistemde NBT yi indirgeyecek riboflavin-metiyonin ıģık sistemi ile

200 176 çözünmüģ oksijenden türetilebilir. Bu yöntemde süperoksit anyonu sarı renkli NBT yi spektrofotometrik olarak 560 nm dalga boyunda maksimum absorbans veren formazan a indirger. NADH NAD + + H + 2e - Okside PMS Redükte PMS 2O 2 2O 2.- Formazan NBT 2+ ġekil 5.7. NADH-PMS de süperoksit anyon radikallerinin dönüģümü ve nitroblue NBT 2+ nin formazan a indirgenmesi (Gülçin 2012) Antioksidan bileģikler reaksiyon hızını azaltmak ve O.- 2 ile reaksiyona girmek için NBT ile yarıģır. Süperoksit radikalleri için kullanılan diğer yaygın prob stokrom c dir. Ferrisitokrom c nin ferrostokrom c ye indirgenmesinin kinetik ölçümü 550 nm de izlenmektedir (Aruoma 1993; Quick et al. 2000). NBT nin indirgenmesinin stokrom c indirgenmesi inhibisyonundan daha büyük olduğu gözlenmiģtir (Aruoma 1993) Bu durum O.- 2 radikallerinin stokrom c ile reaksiyonunun NBT ile reaksiyonundan daha hızlı olmasından kaynaklanmaktadır. Bu yüzden belli bir konsantrasyonda O.- 2 radikal temizleyicisi reaksiyon karıģımına ilave edildiği zaman stokrom c sisteminde daha az etki göstermekte ve daha az inhibisyon sağlamaktadır (Gülçin et al. 2012). Antioksidanlar mavi renkli NBT dönüģümünü inhibe ederek aktivitelerini gösterirler (Parejo et al. 2002). Antioksidanların ilavesiyle 560 nm deki absorbansta azalma reaksiyon karıģımında süperoksit anyon radikallerinin tüketildiğine iģaret eder. Bu durum için iki prensip reaksiyon söz konusudur (Fridovich 1995).

201 177 2NBTH. NBT + NBTH 2 (Formazan) (1) NBTH. + O 2 NBT + O 2.- (Bir yarı denge) (2) Riboflavin fotokimyasal olarak aktive olduğunda NBTH. üretmek için NBT ile reaksiyona girer (Beauchamp and Fridovich 1971). NBTH. radikali ise (1) reaksiyonuna göre formazan oluģumuna yol açar. Oksijen mevcudiyetinde radikal türler yarı denge reaksiyonuyla kontrol edilir. Böylece süperoksit anyon radikalleri deney ortamı aerobik Ģartlarda gerçekleģtirildiği zaman meydana gelir. NBT ye elektron veren antioksidanların ortamda bulunmasıyla, formazan ın tipik mor renginin açılması ve bozulması 560 nm de spektrofotometrik olarak izlenebilir. Antioksidanlar NBT nin dönüģümünü inhibe etme yeteneğine sahiptirler. Antioksidanların mevcudiyetinde 560 nm deki absorbans azalması süperoksit anyon radikallerinin temizlendiğini gösterir (Bursal and Gülçin 2011). Bu metot ile yaptığımız çalıģmada IC 50 konsantrasyonları 11,47 ve 14,13 µg/ml olan 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit ve Pelargonin, pozitif kontrol olarak kullanılan BHA, BHT, α-tokoferol, Troloks ile birlikte çalıģılan diğer maddelere göre çok daha iyi O.- 2 anyon radikali giderme aktivitesi sergiledi (ġekil 4.8 ve 4.7; Çizelge 5.2). Çizelge 5.2. Test ortamına ilave edilen 20 µg/ml konsantrasyondaki maddelerin DPPH ve O 2 -. anyon radikali giderme yüzde (%) ve IC 50 (µg/ml) değerlerinin karģılaģtırılması Antioksidan DPPH. Giderme.- O 2 Giderme IC 50 Aktivite (%) IC 50 Aktivite (%) BHA 8,0 98,64 0,295 41,06 BHT 11,89 96,28 0,177 64,60 α-tokoferol 17,25 93,85 0,290 42,00 Troloks 14,23 95,21 0,280 44,00 Malvin 21,36 92,21 0,335 33,06 ID-8 536,41 93,85 0,347 30,66 Pelargonin 67,73 91,50 0,183 63,40 Silikristin 86,16 91,07 0,241 51,86 Callistephin 20,64 95,57 0,252 49,60 Oenin 16,72 95,35 0,218 56,40 AraĢidonoil dopamin 84,10 98,50 0,303 39,40 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 28,86 96,78 0,216 56,80 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit 10,69 98,64 0,133 73,40

202 178 Ayrıca Oenin, Callistephin, Silikristin ve 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit pozitif kontrol olarak kullanılan BHA, α-tokoferol ve Troloks dan daha yüksek O.- 2 anyon radikali süpürücü özellik gösterdi. Yine çalıģılan diğer bütün maddelerin IC 50 konsantrasyonlarına karģılık gelen absorbans değerleri, konsantrasyon artıģıyla doğru orantılı olarak süperoksit anyon radikali giderme aktivitesinde artıģ olduğunu ve her.- maddenin de kendi potansiyeline göre O 2 anyon radikali süpürücü özellik ortaya koyduğunu göstermiģtir. ABTS radikal giderme yönteminde, ABTS oksidantlar ile yoğun renkli ABTS.+ katyonuna okside edilir. Bu yöntemde antioksidant kapasite, ortama ilave edilen antioksidan ile yoğun renkli ABTS radikallerinin reaksiyonu sonucu test bileģiklerinin renk azaltma kabiliyeti ile ölçülür. ABTS hem lipofilik hem de hidrofilik bileģikler için uygulanabilir. ABTS radikal katyonu Ģeklinin üretimi saf maddeler, sıvı karıģımlar ve içeceklerin total antioksidan kapasitesini ölçmek için uygulanan spektrofotometrik metotlar üzerine temellendirilmiģtir (Gülçin 2009). Renk giderme tekniği için daha uygun bir yaklaģım olarak çalıģılacak antioksidan ilavesi olmadan önce ortamda stabil formda radikal üretiminin yapılmasıdır. ABTS radikali su ortamında 414, 734 ve 815 nm dalga boyunda, etanol ortamında 414, 730 ve 873 nm dalga boyunda maksimum absorbansa sahiptir. Orijinal ABTS radikal giderme metodu Miller et al. (1993) tarafından geliģtirilmiģtir. Bu metot ABTS ile ABTS.+ radikal katyonu üretmek için H 2 O 2 ile ferrimiyoglobin radikali üretmek için peroksidaz olarak aktivite gösteren metimiyoglobinin aktivasyonu üzerine temellendirilmiģtir (Re et al. 1999). BaĢlangıçta bu metot da ABTS radikalleri üretmek için ABTS ile reaksiyona giren ferrimiyoglobini elde etmek amacıyla H 2 O 2 ve metimiyoglobin kullanılmıģtır (Miller et al. 1993). Deney Ģartları açısından uygun dalga boyunun belirlenmesi, uygun reaksiyon zamanı, referans antioksidan seçimi gibi koģullar ABTS radikali üretimi için farklı stratejiler olarak uygulanmıģtır. ABTS nin oksidanlar tarafından ABTS radikallerine dönüģtürülmesi amacıyla MnO 2 kullanılan kimyasal bir reaksiyon tercih edilebilir (Miller et al. 1996). Dalga boyunun belirlenmesinde 734 nm belirlenmiģtir. Çünkü bu dalga boyunda diğer absorbans gösteren komponentler ve örnek bulanıklılığından gelen

203 179 sapmalar minimize edilmektedir (Arnao 2000). Miktar açısından sabitlenmiģ bir reaksiyon zamanından sonra elde edilen absorbans değeriyle geriye kalan ABTS radikal konsantrasyon miktarı orantılıdır (Magalhaes et al. 2008). Genellikle kimyasal reaksiyonlar uzun zaman alır. Bununla birlikte enzim üretimi daha hızlı ve reaksiyon Ģartları daha hafiftir. Cano et al. (1998) ABTS radikallerini üretmek için yaban turpu peroksidazını kullanmıģlardır. Bununla birlikte reaksiyon mekanizması ph ile kayma göstermektedir. Örneğin elektron transferi ph 8 de kolay gerçekleģmektedir. Bu değiģim lipofilik ve hidrofilik antioksidanların tamponlu ve organik çözücü ortamlarda deney metodunun uygulanmasıyla uyarlanmıģtır (Alcolea et al. 2002; Cano et al. 2002) veya hegzan ve su çözücülerinin farklı oranlarda karıģtırılmasıyla elde edilen çözücülerde antioksidanlar ilave edilerek yapılmıģtır (Pulido et al. 2003). Bu spektrofotometrik yöntem teknik olarak basittir. Genellikle ABTS radikalleri K 2 S 2 O 8 ile ABTS nin oksidasyonu suretiyle üretilir (ġekil 5.8). ġekil 5.8. K 2 S 2 O 8 ile ABTS nin oksidasyonu ve ABTS radikallerinin oluģumu (Gülçin 2012). Bu metot ABTS radikal katyonunun 734 nm de dalga boyunda maksimum absorbans göstermesi prensbine dayanır. ABTS radikali ile reaksiyon 0,25 ile 0,5 dk. gibi kısa sürede gerçekleģir. KarıĢık kompleks sıvılar ve saf bileģiklerin antioksidan kapasitelerini değerlendirmek için mavi-yeģil renkli ABTS.+ radikal katyonu solüsyonunun renksizleģtirilmesi yaygın olarak kullanılmaktadır. Serbest radikal temizleyicilerinin radikal giderme performansı 734 nm de örnek absorbansındaki azalmanın izlenmesiyle belirlenebilir (Gülçin et al. 2009). ABTS radikal katyonu farklı oksidantlar ile hazırlanabilir. Oksidant olarak K 2 S 2 O 8 kullanılarak elde edilen sonuçlar peroksidisülfat mevcudiyetinde ABTS.+ radikalleri oranının arttığını göstermiģtir. ABTS

204 180 radikali oluģmasının peroksidisülfatın ayrıģması ve elektron transferinden sonra meydana geldiği görülmüģtür. Bu durumun kimyasal reaksiyonu aģağıdaki gibidir. S 2 O ABTS SO SO4.- + ABTS.+ AĢırı ABTS varlığında sülfat radikali HAT içeren DPPH radikallerinin aksine ABTS tarafından temsil edilecek genel bir reaksiyona yönelecektir (Kaviarasan et al. 2007; Köksal et al. 2009). ABTS radikal giderme aktivitesi yaygın bir ph aralığında değerlendirilebildiği için yiyecek bileģenleri ve antioksidan mekanizmalar üzerine ph ın etkisi çalıģmaları yararlıdır. Dahası ABTS radikali suda ve organik çözücülerde çözünebilir. Ayrıca lipofilik ve hidrofilik bileģiklerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesini mümkün kılar. Termodinamik olarak ABTS radikallerinden daha düģük redoks potansiyeline sahip bir bileģik radikal ile reaksiyona girebilir (Magalhaes et al. 2008; Gülçin 2012). Sonuç olarak ABTS yiyecek bileģenleri ve antioksidanlarla 30 dk. gibi kısa bir süre içinde hızlıca reaksiyona girer. GeniĢ ph aralığında etkileri çalıģılabilir. Aynı zamanda ABTS suda ve organik çözücülerde çözünebilir ve iyonik güç (Awika et al. 2003) tarafından pek etkilenmez. Bu yüzden ABTS hem lipofilik hem de hidrofilik sıvı ve ekstraktların antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi için çeģitli çözücü ve çözücü karıģımlarında kullanılabilir. Bu yöntem ile elde ettiğimiz sonuçlara göre çizilen grafik (ġekil 4.13) değerlendirildiğinde Callistephin ve 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit sırasıyla 5,28 ve 5,54 µg/ml IC 50 değerleri ile pozitif kontrol olarak kullanılan BHT, α-tokoferol ve Troloks dan daha iyi ABTS.+ radikali giderme aktivitesi gösterdi (Çizelge 5.3). Ayrıca 3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoik asit, Oenin, Silikristin, Pelargonin, ID-8 ve Malvin sırasıyla 6.05, 6.60, 6.71, 6.71, 6.80 ve 7.20 IC 50 değerleriyle standart olarak kullandığımız α-tokoferol ve Troloks dan daha etkili ABTS radikali süpürücü özellik ortaya koydu. Bununla birlikte çalıģılan bütün maddeler de konsantrasyon artıģıyla dğru orantılı olarak kendi potansiyellerine göre ABTS.+ radikal giderici özellik gösterdiler (ġekil 4.13 ve 4.14; Çizelge 5.3).

205 181 Çizelge 5.3. Test ortamına ilave edilen 10 µg/ml konsantrasyondaki maddelerin ABTS ve DMPD radikali giderme yüzde (%) ve IC 50 (µg/ml) değerlerinin karģılaģtırılması Antioksidan ABTS.+ Giderme DMPD.+ Giderme IC 50 Aktivite (%) IC 50 Aktivite (%) BHA 3,60 99,80 0,238 15,34 BHT 6,04 99,80 0,246 15,26 α-tokoferol 8,47 70,63 15,14 64,14 Troloks 7,39 83,72 13,90 64,57 Malvin 7,20 81,72 16,47 59,85 ID-8 6,80 82,63 17,56 60,28 Pelargonin 6,71 93,54 15,86 65,85 Silikristin 6,71 89,18 17,62 61,71 Callistephin 5,54 99,72 12,80 72,71 Oenin 6,60 99,72 15,46 65,85 AraĢidonoil dopamin 12,54 42,00 18,02 59,71 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit 5,28 99,72 13,27 70,00 3,4-Dihidroksi-5-Metoksibenzoik asit 6,05 99,80 17,80 64,42 ABTS radikali giderme yöntemine benzer Ģekilde gerçekleģen diğer bir yöntem de DMPD radikali giderme yöntemidir. Fogliano et al. (1999) ABTS testinin yeni bir versiyonunu önermiģlerdir. Bu yöntemde ABTS radikalini N,Ndimetilfenilendiamin den oluģturulan stabil DMPD.+ radikal katyonu ile değiģtirdiler (Fogliano et al. 1999; Schleisier et al. 2002). DMPD.+ radikal giderme aktivitesinin ABTS.+ radikal giderme yöntemine göre daha verimli ve daha az masraflı olduğunu rapor etmiģlerdir. Oksidan ve asidik ph ortamında DMPD renkli ve stabil DMPD.+ radikal katyonuna dönüģtürülür. DMPD.+ radikalinin görülebilir spektrumu 505 nm dalga boyunda maksimum absorbans gösterdiği değerdir. Bununla birlikte antioksidan standardı ve radikal stabilitesi ile ilgili veriler mevcut değildir. Bir baģka problemde DMPD yalnızca suda çözündüğü için hidrofobik antioksidanlar ile kullanılamaz (Fogliano et al. 1999). ġekil 5.9 da görüldüğü gibi antioksidant bileģikler DMPD radikallerine bir hidrojen atomu vererek renk açılmasına ve solüsyonun renksizleģmesine yol açan ürünleri meydana getirir. Bu reaksiyon hızlıdır ve antioksidan etkinin ölçümü olarak alınabilen stabil bir tepe noktasına sahiptir. Bu yüzden bu metot DMPD radikallerinden bir elektronu temizlemek için radikal hidrojen vericilerinin yeteneğini yansıtır (Fogliano et al. 1999; Ak and Gülçin 2008).

206 182 Önceki çalıģmalar oksidant solüsyonu içermeyen DMPD ile oksidant bileģiği oranının metodun etkili olmasında kritik role sahip olduğunu ortaya koymuģtur. Gerçekte radikal katyon oluģumu çok yavaģtır ve absorbansta sürekli artıģa sebep olur. En iyi sonuçlar FeCl 3 ile elde edilmektedir. FeCl 3 0,1mM final konsantrasyonuna kadar stabil renkli bir solüsyon verir. Bununla birlikte bu metot düģük maliyeti ve tekrarlanabilir ölçümleri garanti etmektedir (Gülçin 2008). ġekil 5.9. DMPD radikallerinin oluģum mekanizması (Göçer 2014). DMPD metodu özellikle hidrofilik antioksidanlar için uygundur. Fakat hidrofobik biyoaktif bileģikler için daha az duyarlıdır (Gülçin 2012). ABTS prosedürüne zıt olarak DMPD metodu çok stabil bir son nokta garanti eder. Bu durum özellikle büyük ölçekli tarama olduğunda çok önemlidir. Bu metodun en önemli dezavantajı α-tokoferol ve BHT gibi hidrofobik antioksidanlar kullanıldığı zaman duyarlılık ve tekrarlanabilirliğin dramatik biçimde düģtüğü gerçeğidir. Organik asitlerin interferansa sebep olabileceği bildirilmiģtir (San-chez-Mareno 2002). Yine de her iki standart antioksidan bileģiker bu radikal giderme yönteminde yapılan çalıģmalarda sıklıkla kullanılmıģlardır. ÇalıĢmamızda DMPD radikal giderme metodu ile elde ettiğimiz sonuçları ġekil 4.16 ve Çizelge 5.3 de değerlendirdik. ġekil 4.16 dan görüleceği üzere Callistephin ve 2,4,6- Trihidroksibenzaldehit in sırasıyla 13,27 ve 12,80 µg/ml IC 50 değerleri ile pozitif kontrol olarak kullandığımız BHA, BHT, α-tokoferol ve Troloks ile birlikte diğer bütün çalıģtığımız maddelerin IC 50 konsantrasyonuna karģılık gelen absorbans değerlerine göre daha iyi DMPD.+ radikali giderme aktivitesi sergiledi (ġekil 4.16 ve 4.17; Çizelge 5.3). Ayrıca çalıģtığımız tüm maddeler kendi özelliklerine göre

207 183 konsantrasyon artıģıyla doğru orantılı bir Ģekilde DMPD.+ radikali giderme aktivitesi ortaya koydu. Canlı vücudunda Fe 2+ iyonu gibi elementel türler ROS nin üretimini hızlandırırlar. Dolayısıyla bir maddenin Fe Ģelatlama aktivitesi antioksidan özellik için dikkate değer olabilir. Demir bazı normal fizyolojik olaylar için gereklidir. Fakat aģırı miktarda olması hücre yaralanmasına yol açabilir. GeçiĢ metalleri içinde Fe yüksek reaktivitesinden dolayı lipid peroksidasyonuna sebep olan en önemli prooksidant olarak bilinir. Etkili Fe 2+ iyonu bağlayıcıları fenton tipi reaksiyonlarda çok reaktif olan OH. radikallerini üretebilen Fe 2+ iyonunu bağlamak suretiyle oksidatif hasara karģı etkili bir Ģekilde koruyucu rol üstlenirler. Eğer Fe 2+ iyonları fenton raksiyonlarıyla karģı karģıya kalırsa oksidatif strese yol açan yüksek reaktiviteye sahip OH. radikallerini üretebilirler (Hippeli and Elstner 1999). Ferrik iyonları (Fe 3+ ) ferröz (Fe 2+ ) iyonlarından daha az oranda ise peroksitlerden radikalleri üretebilir (Kehrer 2000). Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH - + OH. Ferröz tuzları H 2 O 2 nin karıģımı fenton reaktifi olarak adlandırılır ve geniģ ölçüde bir dizi organik substrata oksidant olarak etki eder. Fenton 1894 lerde, ferröz tuzları ve H 2 O 2 in düģük konsantrasyonlarının mevcudiyetinde tartarik asit in dihidroksimaleik asit e oksidasyonunu keģfetmiģtir. Sonra Haber ve Weiss gibi yazarlar H 2 O 2 in ayrıģmasını demir tuzlarının katalize ettiğini önermiģlerdir. OluĢan OH. radikallerinin reaktif ara ürün olduğunu ifade etmiģlerdir (Merz and Waters 1947). Daha sonraları Cu +, Ti 3+, Cr 2+, Co 2+ gibi metal iyonları veya komplekslerinin H 2 O 2 ile Fe 2+ örneğine benzer Ģekilde fenton reaksiyonu gibi reaksiyona girdikleri bulunmuģtur (Ou et al. 2002a,b). Yapılan çalıģmalar geçiģ metali ve H 2 O 2 arasında elektron transfer reaksiyonunda elektron transfer mekanizmasının dıģ kürede olmadığını, bunun elektron transferi gerçekleģmeden önce H 2 O 2 ile geçiģ metallarinin oluģturduğu kompleks içinde iç kürede

208 184 meydana geldiğini ifade etmiģlerdir (Goldstein et al. 1993). Bu yüzden geçiģ metali koordinasyonlu olarak doymuģ ise ROS ni vermek üzere H 2 O 2 ile reaksiyona giremez. Gerçekte de Halliwel (1990) Fe 2+ temelli fenton reaksiyonunu demir Ģelatörle inhibe etmiģ ve F 2+ /H 2 O 2 tarafından oluģturulan oksidatif hasarı önlediğini göstermiģtir (Ou et al. 2002a,b). OluĢan oksi radikalleri lipid, nükleik asit, protein ve karbonhidratlar gibi hücresel yapılara zarara verebilir ve hücrelerin yapısını bozabilir. Çünkü ferröz (Fe 2+ ) iyonları yiyecek sistemlerindeki en etkili prooksidantlardan biridir. Dolayısıyla metal Ģelatlama etkisi ve dolaģımdan serbest demir iyonlarının kaldırılması oksidatif stres temelli hastalıkların önlenmesi için ümit verici bir yaklaģım sunacaktır. Demir iyonu Ģelatlandığında prooksidant özelliklerini kaybedebilir. Doğada demir ya ferröz (Fe 2+ ) veya yiyeceklerde baskın from olan ferrik (Fe 3+ ) Ģeklinde bulunur. Ferröz Ģelatlama metal katalizli oksidasyonu geciktirmek suretiyle önemli antioksidan etki ortaya koyabilir. İn vitro biyokimyasal, hayvan ve insan çalıģmalarından elde edilen verilerden oluģan bilgi ve bağlantılar vasküler hastalıklar, kanser ve belli nörolojik hastalıklar gibi bir dizi hastalıklar için risk faktörü artıģının vücutta artan demir seviyesi ile iliģkili olduğunu ortaya koymaktadır (Gülçin 2012). ROS nin demir bağlantılı olarak oluģması, dokulara oksijen taģınmasını sağlayan Fe in normal fizyolojik fonksiyonunun fazlalaģmasından kaynaklanan bir durumun sonucu olarak DNA ve lipid hasarına yol açabilir. DNA ya karģı Fe bağlantılı serbest radikal hasarı, kanser ve kanser hücrelerinin geliģmesi için önemli bir durum olarak görülmektedir. Çünkü demire cavap olarak kanser hücreleri hızla büyüyebilmektedir (Ullen et al. 1997; Valko et al. 2006). GeçiĢ metalleri uygun bir oksidasyon-redüksiyon potansiyeli ve iki veya daha fazla değerliğe sahip olmalarıyla otooksidayon hızını ve hidroperoksitlerin uçucu bileģenlere dönüģmesini etkilerler (Grosch 1982). GeçiĢ metalleri arasında demir yüksek reaktivitesinden dolayı en önemli lipid oksidasyonuna sebep olan prooksidant olarak bilinmektedir. Demir bütün yaģayan hücreler için zorunlu bir elementtir. Demir hem içeren proteinlerin bir bileģeni ve demir içeren enzimlerin kofaktörü olarak önemli bir role sahiptir (Ponko 1999; Wood and Ronnenberg 2006). Doğada zorunlu olarak bulunan demir, serbest iyon olarak bulunduğu zaman potansiyel olarak toksik olabilir. Fe in toksistesi, lipid, protein ve DNA gibi yapıların oksidasyonunu tetikleyen reaktif türler olan HO. radikallerinin oluģumunu katalize eden fenton reaksiyonuna iģtirak etme kapasitesinden dolayıdır (Halliwel and Gutteridge 1984; Valko et al. 2006). Etkili ferröz

209 185 (Fe 2+ ) iyon Ģelatörleri fenton tipi reaksiyonlar aracılığıyla HO. radikallerinin üretilmesine iģtirak eden demiri temizlemek suretiyle oksidatif hasara karģı koruyucu rol oynarlar. Ferröz (Fe 2+ ) iyonları çeģitli metal iyonları arasında en güçlü prooksidanttır (Gülçin 2006b). Serbest demir iyonlarının toksik etkilerinden hücreleri korumak ve kullanılabilirliğini sabitlemek için, demir çeģitli peptid ve demir deposu olarak görev yapan ferritin gibi proteinlerin yapısına katılarak bağlanır (Ponko 1999; Arosio et al. 2009). Gerçekte ferritinin her bir molekülünde 4500 ün üzerinde demir atomu bulunduğu tahmin edilmektedir (Harrison and Arosio 1996). Ferröz (Fe 2+ ) iyonlarının minimize edilmesi ROS nin üretimini inhibe etmek suretiyle oksidatif molekül hasarına karģı koruyucu etki oluģturabilir. Ferrozin bu metot ile kantitatif olarak ölçülebilen Fe 2+ ile kompleks oluģturur. Ferrozin metodu nanomolardan daha küçük konsantrasyonlara seyreltilmiģ ferrröz iyonlarını (Fe 2+ ) iyonlarını belirleyebilir (King et al. 1999). ġekil Ferrozin in kimyasal yapısı (Gülçin 2012). ġelatlayıcı ajanların varlığında indirgenmenin bir sonucu olarak kompleksin kırmızı renginde bozulma meydana gelir. Renk indirgenmesinin ölçümü Ģelatlayıcı ajanın metal Ģelatlama aktivitesi hakkında tahmin yürütülmesini sağlar. DüĢük absorbans yüksek metal Ģelatlama aktivitesinin olduğuna iģaret eder. Metal Ģelatlama önemli bir antioksidan özelliktir (Gülçin et al. 2003). Bir antioksidanın metal Ģelatlama aktivitesinin ölçümü, test materyali ile ferrozin solüsyonunun daha önce birbiri ile karıģtırılması sonrasında oluģan Fe 2+ -ferrozin kompleksinin absorbansının ölçümü üzerine temellendirilmiģtir. Serbest Fe 2+ ile kompleks oluģturan Ferrozin, antioksidanlar gibi diğer Ģelatörlerle bağlanan Fe 2+ ile kompleks oluģturamadığından Ferrozin-Fe 2+ kompleksi oluģumunda azalma meydana gelir. Ferrozin-Fe 2+ kompleksi 562 nm dalga

210 186 boyunda absorbans veren kırmızı bir kromofor üretir. Antioksidan Ģelatör mevcudiyetinde bu kompleks reaksiyonun ölçümündeki en önemli dezavantaj ferrozin ve antioksidan Ģelatörün her ikisinin de yarıģmalı olarak demir iyonuna bağlanmaları durumundan etkilenmeleridir. Böylece zayıf bir demir bağlayıcı antioksidanın kantitatif belirlenmesinde ciddi bir belirsizlik olabilir. Beslenme açısından in vivo olarak fenton reaksiyonunu önlemede zayıf antioksidanların rolünü belirlemek mümkün değildir. Bununla birlikte bu reaksiyon antioksidanların metal Ģelatlama aktivitelerinin belirlenmesinde uygun bir test olarak hizmet eder. 3Ferrozin + Fe(H 2 O) 6 2+ Fe-(Ferrozin) H 2 O Metal Ģelatlama kapasitesi lipid peroksidasyonunda geçiģ metallerinin katalizleme konsantrasyonlarını düģürdüklerinden dolayı önemlidir. Yiyecek ve gıda üreticilerine Fe bağlama kapasitesinin önemli bir belirteç olduğu ve peroksidasyon inhibisyonu aktivitesinin Fe bağlama kapasitesi ile iliģkili olduğu rapor edilmiģtir (Gülçin 2012). Bu metot ile yiyecek bileģeni olan kurkumin in Fe 2+ -ferrozin kompleksinin oluģumunu Ģelatlama aktivitesi ile engelleme ve ferrozinden daha yüksek olarak ferröz iyonlarını bağlama kapasitesi gösterdiği ortaya konulmuģtur. Örneğin ġekil 5.11 de görüldüğü gibi kurkumin -OH ve -OCH 3 ile ferröz iyonlarını Ģelatlayabilir. BileĢiklerin yapısındaki -C-OH ve -C=O fonksiyonel grupları metal iyonlarını Ģelatlayabilmektedir. Kazazica et al. (2006) kamferol gibi flavonoidlerin fonksiyonel grupları aracılığıyla Cu 2+ ve Fe 2+ Ģelatlama aktivitesi gösterdiğini rapor etmiģlerdir. -OH, -SH, -COOH, -PO 3 H 2, -C=O, - NR 2, S ve O gruplarından iki veya daha fazlasını içeren bileģikler metal Ģelatlama aktivitesi gösterirler (Yuan et al. 2005; Gülçin 2006a). Kurukumin in yapısı ve metal Ģelatlama aktivite için bağlama alanları ġekil 5.11 de verilmiģtir. Son zamanlarda Fiorucci et al. (2007) benzer Ģekilde kuersetin in metal iyonlarını bağlama aktivitesi gösterdiğini ortaya koymuģlardır. BaĢka bir çalıģmada da L-karnitin in karbonil ve hidroksil fonksiyonel grupları aracılığıyla ferröz (Fe 2+ ) iyonlarını Ģelatladığı gösterilmiģtir. Aynı Ģekilde kurkumin in karbonil ve hidroksil fonksiyonel grupları üzerinden ferröz iyonlarını Ģelatladığı

211 187 önerilmiģtir (Ak and Gülçin 2008). Benzer Ģekilde L-adrenalin amin ve hidroksil grupları üzerinden demir iyonlarına bağlanmaktadır (Gülçin 2009). Kurkumin + 3Fe +2 ġekil Kurkumin için önerilen ferröz (Fe 2+ ) iyonu Ģelatlama mekanizması (Gülçin 2012). Aynı Ģekilde resveratrol molekülleri de -OH grupları üzerinden ferröz iyonlarına bağlanır. Ġki resveratrol molekülü etkili Fe bağlama kapasitesi gösterir ve peroksidasyon inhibisyon etkisi baģlıca metal Ģelatlama kapasitesi ile iliģkili olabilir. Bu metot ile Resveratrol F 2+ -ferrozin kompleks oluģumunu bozar. Resveratrol ün metal Ģelatlama aktivitesinin ferrozinden önce ferröz iyonlarını yakalama kapasitesinden dolayı olduğu düģünülmektedir. Resveratrolün yapısı ve metal Ģelatlama için bağlama alanları ġekil 5.12 de verilmiģtir. Resveratrol molekülünün aksine rozmarinik asit difenolik aromatik grupları üzerinden iki ferröz iyonunu Ģelatlayabilmektedir (ġekil 5.12) (Gülçin 2012). Benzer Ģekilde bu test metodu bipiridil reaktifi kullanılarak da yapılmakta ve antioksidan maddelerin bipiridil metal Ģelatlama aktivitelerine de bakılmaktadır. Bölüm ve Çizelge 4.3 den görüleceği üzere 10 µg/ml konsantrasyonda test ortamına ilave edilen ID-8, Malvin, AraĢidonoil dopamin ve Pelargonin ortamda bulunan metal iyonlarını sırasıyla %54.16, 52.21, 50,65 ve seviyelerinde Ģelatlayarak EDTA haricinde pozitif kontroller ile birlikte çalıģılan diğer maddelere göre ferrozin reaktifi ile en yüksek Fe 2+ iyonlarını Ģelatlama aktivitesi gösterdiler. Ayrıca 10 µg/ml

212 188 konsantrasyonda test ortamına ilave edilen ID-8, Malvin, AraĢidonoil dopamin ve Pelargonin ile birlikte 2,4,6-Trihidroksibenzaldehit in Bipiridil reaktifi ile metal Ģelatlama aktivitesi EDTA haricinde pozitif kontrol olarak kullanılan BHA, BHT, α- Tokoferol ve Troloks ile birlikte çalıģtığımız tüm maddelerden daha etkili bipiridil reaktifi ile Fe 2+ metal Ģelatlama aktivitesi ortaya koydu. ÇalıĢmamızda her iki yöntem ile elde ettiğimiz sonuçlarda konsantrasyon artıģına bağlı olarak absorbanslarda azalma meydana geldiğini ve aralarında korelasyon olduğunu gördük (ġekil 4.18, 4.19, 4.20, 4.21). 2 + Fe +2 Resveratrol Resveratrol-Fe 2+ kompleksi + 2Fe +2 Rozmarinik asit Rozmarinik asit-fe 2+ kompleksi ġekil Ferrozinden önce resveratrol ve rozmarinik asit in ferröz iyonlarını Ģelatlama mekanizması (Göçer 2014) CA izoenzimleri çok basit ancak vücut için çok önemli olan CO 2 in HCO - 3 ve protona (H + ) hidrolizini gerçekleģtiren enzimdir. Bu reaksiyon kendiliğinden de meydana gelmektedir. Ancak hızı çok yavaģtır. CO 2, HCO - 3 ve H + iyonu bütün yaģayan fizyolojik proseslerde zorunlu iyonlar ve moleküllerdir (Supuran 2010). Ġnsanlarda 13 farklı katalitik aktif CA izoenzimi vardır. CA izoenzimleri α-, β-, γ-, δ- ve δ- olmak üzere 5 farklı gen ailesinden meydana gelmektedirler ve flojenetik soydan bütün organizmalarda bulunur. Bazı patojenik protozoa, mantar ve bakterilerde CA izoenzimlerinin inhibisyonu çalıģılmıģtır. Sülfamat ve sülfonamid inhibitörlerine ek olarak kumarinler, fenoller, fullerenler gibi yeni CA inhibitör kemotipleri mekanizmalarıyla beraber aydınlatılmıģtır (Supuran 2010).

213 189 ġekil hca II (sarı renkli kurdela Ģeklinde) ve hca IX (yeģil renkli kurdela Ģeklinde) in fullerenler ile ouģturduğu kompleksin yapısı (Supuran 2010) * Koyu renkli hca II ye bağlanan, açık renkli hca IX a fullerenlerin bağlanma pozisyonunu göstermektedir. hca II için Zn iyonu sarı renkli, hca IX için yeģil renkli küre olarak gösterilmiģtir Son zamanlarda antiglokom ve diüretik ilaçlar olarak kullanılan CA inhibitörlerinin antikonvülzan, antiinflamatuar, antiobesite, antikanser, antiinfektiv potansiyele sahip oldukları ifade edilmiģtir. α ve δ-ca lardan bazıları kcat/k M değerleri > 10 8 M -1 S -1 ile doğadaki bilinen en etkili katalitik aktiviteye sahip CA izoenzimleridir. Metal iyon ligandları α ve γ-ca larda üç histidin kalıntısı, β ve δ-ca larda bir histidin iki sistein rezidüsünden oluģmaktadır. Bazı β sınıf CA izoenzimleri bir histidin, 2 sistein ve Zn 2+ iyonuna bağlı Asp ile Zn 2+ ya bağlı 4 protein ligandına sahiptir. CA izoenzimlerinin aktivasyonu veya inhibisyonu süreçleri iyi anlaģılmıģtır. Metal merkezine bağlanan çoğu sınıf inhibitörler ve aktif alan giriģine bağlanan aktivatörlerin metal iyonuna bağlı su molekülü ve çevreyle arasında proton vermeye iģtirak eden çoğu sınıf inhibitörler ile bu durum iyice anlaģılmıģtır (ġekil 5.14). Süfonamidler klasik olarak CA inhibitörleridir (RSO 2 NH 2 ) ve antiglokom ve diüretik ilaçları olarak 50 yıldan bu yana kullanılmaktadır. CA izoenzimleri üzerine inhibisyon etkisi gösteren sülfamat ve sülfonamidler farklı klinik uygulamalara ait ilaçlarda kullanılmaktadır.

214 190 Ġnsanlarda yüksek sayıda CA izoenzimlerinin varlığı, dokulardaki farklı yerleģimi, sülfamat ve sülfonamidlerin farklı CA izoenzimlerine karģı farklı seçicilik göstermesi gibi durumlardan dolayı terapötik ajanlar olarak CA I nin dizayn edilmesinde, kritik bazı zorluklar ortaya çıkmaktadır (Supuran 2010). ġekil Diüretik olarak kullanılan klortialidon (A), indapamid (B), triklormetiazid (C) ve furosemid (D) in hca II aktif alanına bağlandığı zaman meydana gelen X-ray kristal yapının karģılaģtırılması (Supuran 2010) Ekinci et al. (2012) çeģitli metoksi, hidroksil, ve halojenleri içeren 5,10-Dihidroindenoindol türevlerinin insan CA izoenzimleri ( hca I, II, IV, VI) ile sığır CA II izoenzimi üzerine inhibisyon etkilerini araģtırmıģlardır. Bu moleküllerinin çoğunun µm düzeyde inhibisyon etki gösterdiğini ortaya komuģlardır. Bu bileģiklerin hca I izoenzimi üzerine inhibisyon sabiti K i değerlerinin 2.14 ve µm, hca II izoenzimi üzerine inhibisyon K i değerlerinin 0.34 ve 2.52 µm, hca IV üzerine inhibisyon sabiti K i değerlerinin ve 5.726, CA VI üzerine inhibisyon K i değerlerinin ise 1.92 ve µm aralığında olduğunu tespit etmiģlerdir. Ayrıca yapı aktivite arasındaki iliģkinin test

215 191 edilmesi için yapısal iliģkili bileģikler olan 1,2 dimetoksibenzen, katekol ve indol test edilmiģtir (ġekil 5.15). ġekil hca I ve II izoenzimlerinin aktif alanına yerleģen ve çeģitli 5,10-didroindenoindol türevlerinin bağlanma pozisyonları (sırasıyla soldan sağa doğru) (Ekinci et al. 2012) Karbonik anhidraz inhibitörleri arasında enzim aktif alanında Zn 2+ iyonuna bağlanan inorganik anyonlar da araģtırılmıģtır. Trithokarbonat (CS -2 3 ) karbonata benzeyen ve hca I izoenzimi üzerine inhibisyon etki gösteren bir anyondur. hca II izoenzimine bağlanan trithokarbonat kompleksinin X-ray kristal yapısı ġekil 5.16 da gösterilmiģtir. ġekil Trithiokarbomat ın hca II izoenzimi aktif alanında bikarbonat-hca I kompleksine benzer Ģekilde metal iyonuna tetrahedral geometri Ģeklinde bağlanması modeli. Protein zincir ligandları histidin 94, 96, 119 ve trozin 199 Ģekilde gösterilmiģtir) (Carta et al. 2013) Dithiokarbomatların ve trithokarbonatın hca II izoenzimi ile oluģturduğu kompleks yapısına benzer Ģekilde ve biraz farklı olarak hca II izoenzimi aktif merkezindeki Zn 2+ iyonuna bağlanan inhibitörler olduğu rapor edilmiģtir (Carta et al. 2013).

216 192 Tanc et al. (2013) 7-substitue sülfokumarinler ve 3,4-dihidroksisulfokumarinlerin türev reaksiyonlarıyla 2,4-dihidroksi veya 2-hidroksi-4-metoksibenzaldehit gibi metanon sülfamatlarına dönüģtürülmesiyle elde edilen bileģikler bazı insan CA izoenzimleri üzerine inhibisyon etkisini araģtırmıģlardır. hca IX ve XII üzerine etkili inhibisyon gösterip hca I ve II izoenzimleri üzerine ise inhibisyon etki göstermeyen 6-substitüe sülfokumarinlerin aksine 7-sübstitüe sülfokumarinler CA II izoenzimi üzerine nanomolar düzeyde, mitokondrial CA VA üzerine 91 nm ile 9.96 µm inhibisyon sabiti (K i ) aralığında inhibisyon etki göstermiģtir. Ancak hca I, IX ve XII üzerine inhibisyon etki göstermemiģlerdir. Bu sınıf bileģiklerin yapı-aktivite iliģkisi de açıklanmıģtır (ġekil 5.17). ġekil Sülfokumarinlerin hca enzimi inhibisyon mekanizması (Tanc et al. 2013) * Sülfokumarin trans-2-hidroksifenil-ω-etilensülfonik asit formasyonuna dönüģümüyle enzim aracılı hidrolize uğrar. Zn bağlı su molekülüne sülfonik asit gurubunun yaklaģması suretiyle sülfonik asit mutant CA II izoenzimi aktif alanına bağlanır. Merkezdeki büyük gri küre Zn iyonunu temsil etmektedir. Zn iyonunun ligandları histidin 96, 94, 119 olarak gösterilmiģtir.. Hidrolize sülfokumarinlerin bağlanmasıyla iliģkili olan aktif alandaki tirozin 200 ve prolin 201 kadar su molekülü Zn 2+ iyonuna koordine olur. Yapılarındaki 7-substitüe kısmından dolayı CA VA yı güçlü bir Ģekilde inhibe etmektedirler. Bununla birlikte bu bileģiklerin doğal yapısı CA II izoenzimi üzerine 1,3-8,4 µm inhibisyon sabiti (K i ) aralığı ile yüksek inibisyon etkisi göstermiģlerdir. hca II ve VA izoenzimlerinin önemli ilaç hedefi izoenzimleri olduğu düģünüldüğü zaman çeģitli biyomedikal uygulamalar için önem arz edeceği açıktır (Tanc et al. 2013).