İPEK FİBROİNİN FARKLI FORMLARI VE İLAÇ SALIM SİSTEMLERİNDE KULLANIMI

Transkript

1 BT 24 İPEK FİBROİNİN FARKLI FORMLARI VE İLAÇ SALIM SİSTEMLERİNDE KULLANIMI Ö. Malay, E. Kuduğ, A. Batıgün, O. Bayraktar İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Kimya Mühendisliği Bölümü, Gülbahçe Kampüsü, Urla - İzmir e-posta: aysegulbatigun@iyte.edu.tr ÖZET Genetik bilimindeki süregelen kapsamlı araştırmalar ve bunun sonucu olarak protein ve peptit içerikli ilaçların piyasadaki miktarının artması ile deri yoluyla kontrollü ilaç salımı alternatif bir sistem olarak önem kazanmaktadır. Bu çalışmada, deri yoluyla iyontoforetik ilaç salım sistemlerinde kullanılmak üzere ipek fibroinin farklı formaları hazırlanmıştır. Filmlerin suda çözünmezliği yüksek sıcaklıkta ve dondurarak kurutma, metanol ve glutaraldehit ile işleme teknikleri kullanılarak sağlanmıştır. İpek fibroin filmleri Fourier transform kızılötesi spektroskopisi ve taramalı elektron mikroskopu ile incelenmiştir. Glutaraldehit kullanılarak işlenmiş fibroin filmlerinin mekanik dayanımının diğer yöntemlerle hazırlanmış filmlere göre daha iyi olduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle, özel olarak hazırlanmış bir difüzyon hücresinde gerçekleştirilen iyontoforez uygulamalarında fibroin/glutaraldehit filmleri kullanılmıştır. İyontoforez uygulaması ile fibroin fimlerden darbeli tarzda kontrollü ilaç salımı sağlanmıştır. Akım yoğunluğu arttıkça fibroin filmlerden geçen ilaç miktarında artış olduğu görülmüştür. Model ilaç olarak timolol maleate kullanılmıştır. Anahtar Kelimeler: İpek fibroin, kontrollü ilaç salımı, iyontoforez, timolol maleate. 1. GİRİŞ İpek böceği Bombyx mori tarafından üretilen ipek iki tip proteinden oluşmaktadır. Birincisi ipeğin yapısını oluşturan lifli yapıdaki fibroin ve diğeri bu yapıyı saran yapışkan özelliğe sahip serisin proteinidir [1]. Biyouyumluluk ve biyoçözünürlük gösteren ipek fibroini yakın zamanda yapılan birçok biyoteknolojik ve biyomedikal çalışmaya konu olmuştur. Biyosensör geliştirilmesinde [2], kontact lens, yapay kornea, yanık yara pansuman malzemesi, yapay akciğer hazırlanması, doku mühendisliğinde yapı iskelesi oluşturulması [3] ve ilaç salım cihazlarında kullanımı gibi birçok biyomedikal konuda umut vaat eden bir malzeme olarak görülmüştür [4]. Bu uygulamaların yanı sıra fibroin, kozmetik sektöründe kullanılmakta, ve aynı zamanda farmolokolojik ajan ve bir gıda katkı maddesi olarak önerilmektedir. Bu tür uygulamalar için biyomalzemelerin hazırlanmasında iyi bir başlangıç maddesi olarak düşünülen fibroin farklı formlarda (film, jel, toz, köpük, fiber, v.b.) farklı özelliklerde (çözünürlük, geçirgenlik, dayanıklılık, esneklik, v.b.) hazırlanabilmektedir. Sistemik ilaç salımında alternatif bir metod olarak görülen deri yoluyla salım, genetik ve biyokimya alanındaki gelişmeler doğrultusunda protein ve peptit yapıdaki ilaçların kullanımının yaygınlaşmasıyla birlikte gün geçtikçe önem kazanmaktadır. Bu yöntem ile birlikte ilacın karaciğerde metabolizma edilmesi önlenmekte, sindirim sistemi yan etkileri

2 azaltılmakta ve biyo-yararlanım artmaktadır. Ancak yüklü ve yüksek moleküler ağırlığa sahip ilaçların geçişinde bu yöntem kullanılamamaktadır. Düşük voltajlı elektrik akımı kullanılarak yüklü moleküllerin deriden geçişinin sağlanması olan iyonyoforez tekniği bu sınırlamaları ortadan kaldırmak için kullanılmaktadır. Deri yoluyla iyontoforetik ilaç salımında kullanılacak malzemelerin biyouyumlu, mekanik olarak güçlü, suda çözünmeyen, ve yapımı kolaymalzemelr olması tercih edilmektedir. Bu bildiride, İYTE Kimya Mühendisliği Bölümü nde bugüne kadar çalışılmış farklı özellikteki suda çözünmeyen fibroin bazlı malzemelerin karışım ve kurutma tekniklerine bağlı olarak elde edilen farklı formlarının özgün uygulamalarına örnek olarak iyontoforetik kontrollü ilaç salımı konu edilmiştir. 2. YÖNTEMLER Bursa İpekböcekçiliği Enstitüsü nden sağlanan ham ipek Ajisawa çözeltisi (CaCl 2 /ethanol/water, ağırlıkça 111/92/144) kullanılarak çözülmüş, ve diyaliz işlemi sonrasında sulu fibroin çözeltisi olarak hazırlanmıştır. Döküm yoluyla hazırlanmış saf fibroin filmi farklı sürelerde (3, 6, 10 dk.) %50 lik metanol çözeltisine batırılmış, daha sonra deiyonize suyla yıkanmış ve oda şartlarında kurutulmuş veya hazırlanan saf fibroin film doğrudan 45 C de kurutulmuştur. Glutaraldehid/fibroin filmleri ise toplamda 0.4 g fibroin ve 0.4 ml %25 lik glutaraldehid çözeltisi içerecek şekilde karıştırılarak dökülmüş ve oda şartlarında kurutulmuştur. Diğer bir hazırlama tekniğinde ise fibroin filmi saf çözelti dondurularak (-45 C) kurutulmuş ve daha sonra suda çözünmezliği sağlamak için metanole tabi tutulmuştur. Farklı formlarda hazırlanan suda çözünmeyen fibroin malzemeler SEM ve FT-IR teknikleri kullanılarak karakterize edilmiş ve çözünürlükleri test edilmiştir. Glutaraldehit uygulamasıyla hazırlanan filmlerin ilaç geçirgenlik özellikleri elektrik akım (1, 2, 4 ma) uygulaması dahilinde, özel olarak hazırlanmış bir difüzyon hücresi kullanılarak incelenmiştir. Model ilaç olarak timolol maleate kullanılmıştır. 3. SONUÇLAR Saf ipek fibroinin sulu çözeltisinden döküm yoluyla hazırlanan filmlerin farklı teknikler kullanılarak suda çözünmezlikleri sağlanmıştır. 40 C ütünde kurutulan filmlerin α - heliks yapıya sahip olduğu ve suda çözündüğü, ve 40 C nin üstünde bir sıcaklıkta kurutulan filmlerin ise β-tabaka yapısına ship olduğu ve suda çözünmediği bilinmektedir [5]. Uygulanan işlemler sonucu elde edilen filmlerin buna bağlı olarak gelişen farklı morfolojik yapıları taramalı elektron mikroskobuyla görüntülenmiştir. Şekil 1.a ve b de sırasıyla metanole tabi tutulmuş ve yüksek ısıda kurutulmuş fibroin filmlerin taramalı elektron microskobu kesit görüntüleri verilmiştir. Metanol ile işlenmiş filmin yoğun, yüksek sıcaklıkta (45 C) kurutulan filmin ise daha düşük yoğunluklu ve gözenekli bir yapıya sahip olduğu görülmektedir. Yüksek sıcaklıkta kurutularak hazırlanan filmlerin çok kırılgan bir yapıya sahip olduğu belirlenmiştir. Metanol ile işlenmiş filmlerin mekanik dayanımının yüksek sıcaklıkta kurutularak hazırlanan filmlere göre daha iyi olduğu tespit edilmiştir.

3 (a) Şekil 1. Fibroin filmlerin taramalı elektron mikroskobu kesit görüntüleri. a) Metanola tabi tutulmuş fibroin film (12000x), b) Yüksek ısıda kurutulmuş fibroin film (5000x). Dondurarak kurutma tekniği kullanılarak hazırlanan filmlerin taramalı elektron mikroskopu görüntüleri Şekil 2 de verilmiştir. Filmlerin yüzey alanlarını arttırmak amacıyla kullanılan bu teknik sonucu Şekil 2.a.1 ve 2 de farklı büyütmelerde görüntülenmiş olan filmlerin gözenekli, köpükümsü bir yapıya sahip olduğu görülmektedir. Şekil 2.2 de dondurularak kurutuduktan sonra suda çözünmezliğini arttırmak amacıyla metanola tabi tutulmuş fibroin filme ait taramalı elektron mikroskobu görüntüsü verilmiştir. Bu uygulama sonucu filmin gözenekli yapısında bir artış olmuştur. Şekil 2.c de görülen fibroin film ise önce dondurulmuş daha sonra düşük sıcaklıkta (-18 C) kurutularak hazırlanmıştır. Bu filmin çok düşük yoğunluğa sahip mekanik olarak zayıf olduğu belirlenmiştir. Glutarldehit ile işlenmiş filmler ise çok daha yoğun ve gözeneksiz bir yapıya sahip şeffaf filmler olarak elde edilmiştir. Mekanik dayanımı hem kuru iken hem de sulu ortamda çok daha iyi olduğu için iyontoforez uygulamaları için glutaraldehit ile işlenmiş filmler tercih edilmiştir.

4 a.1 a.2 b c Şekil 2. İpek fibroinin farklı formlarının taramalı elektron mikroskobu görüntüleri. a. Dondurularak kurutulmuş fibroin film 1) 2000, 2) 650x. b. Metanol uygulaması (2000x). c. Önce dondurup daha sonra düşük sıcaklıkta kurutma (250x). Metanol kullanılarak işlenmiş olan filmlerin Şekil 3 de görülen Fourier transform kızılötesi spektroktroskopisi incelendiğinde, saf ipek fibroinin α - heliks yapısına özgü olan olarak görülen amid I ( cm -1 ) ve amid II ( cm -1 ) bantlarının [6], metanol uygulaması sonucu β - tabaka yapısına geçişiyle birlikte tek bir büyük banda dönüştüğü görülmektedir. Glutarldehit ile işlenmiş filmlerin ise çok daha yoğun ve gözeneksiz bir yapıya sahip şeffaf filmler olduğu görülmüştür. İyontoforetik ilaç salım uygulamalarında iki kompartmanlı özel yapım difüzyon hücresi kullanılmıştır. Üst kompartman ilaç rezervuarı olarak dizayn edilmiş ve iki kompartman arasına yerleştirilen fibroin filmden ilaç geçişi incelenmiştir. Alt kompartmandan 3 ml/min debiyle peristaltik bir pompa kullanılarak geçişi sağlanan fosfat tampon çözeltisi (ph 7) UV görünür spektrofotometreye yönlendirilmiş ve alt kompartmana geçen ilaç miktarı yerinde görüntülenmiştir. Kompartmanlar üzerine yerleştirilmiş olan Ag/AgCl elektrotlar ve IOMED iyontoforetik ilaç salım cihazı kullanılarak elektrik akım uygulaması gerçekleştirilmiştir. Model ilaç olarak ph 7 ortamında pozitif yüke sahip (pka = 9.5), moleküler ağırlığı yüksek (432.5 g /mol) olan timolol maleate seçilmiştir.

5 b a Wavenumber (1/cm) Şekil 3. FT-IR Spektra a) Fibroin film, b) Metanol uygulaması sonrası fibroin film. İyontoforez uygulamalarında µm kalınlığında glutaraldehit ile işlenmiş fibroin filmler kullanılmış ve bu filmlerin 1, 2 ve 4 ma elektrik akımı altındaki ilaç salım performansları incelenmiştir. Elektrik akım uygulamasına üst kompartmana ilaç enjekte edilip tampon çözelti akışı başlatıldıktan 20 dakika sonra geçilmiştir. 20 dakika aktif (iyontoforetik) 20 dakika pasif geçiş uygulaması izlenmiştir Concentration (mm x 10-4 ) Time (sec) Şekil 4. Glutaraldehit ile işlenmiş ipek fibroin filmlerin 1, 2, 4 ma

6 darbeli akım uygulaması ile iyontoforetik ilaç salımı. Şekil 4 de 3 farklı akım seviyesinde gerçekleştirilen iyontoforez uygulamasına ilişkin ilaç konsantrasyonun zamana bağlı değişimi verilmiştir. Akım seviyesindeki artışa bağlı olarak ilaç salım miktarında artış görülmektedir. 1 ma seviyesinde düşük olduğu gözlenen ilaç salımının 2 ma ve 4 ma seviyesinde kontrollü olarak sağlanmıştır. 4 ma uygulaması ile üst kompartmandaki tüm ilacın geçişi sağlanırken akım seviyesi 2 ma e düşürüldüğünde salımın % 68 oranında gerçekleştiği görülmüştür. 1 ma akım seviyesine düşüldüğünde ise ilaç salımı % 3.95 e kadar düşmüştür. Bu nedenle, 2 ma kontrollü ilaç salımı için eşik değeri olarak düşünülmüştür. Elde edilen sonuçlara bağlı olarak akım seviyesinin filmin geçirgenliğinde etkili olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, karışım ve/veya kurutma yöntemine bağlı olarak farklı özellikte suda çözünmeyen fibroin filmler elde edilmiştir. Bağ yapıcı kimyasallara tabi tutulup oda şartlarında kurutulan filmlerde daha yoğun bir yapı gözlenirken dondurularak hazırlanan filmlerde süngerimsi bir yapı elde edilmiştir. Önceki çalışmalarımızda, EDC kullanılarak hazırlanmış fibroin çözeltisiyle kaplanan theophylline tabletlerin sürekli ilaç salımı sağladığı saptanmıştır [7]. Glutaraldehit uygulamasıyla hazırlanmış fibroin filmlerin ise elektrik alan altında darbeli tarzda kontrollü timolol maleate iletimi gerçekleştirdiği görülmüştür. Fibroin bazlı malzemelerin farklı teknikler kullanılarak farklı formlarının kolayca elde edilebileceği ve bu malzemelerin farklı özelliklere sahip biyomalzemelerin hazırlanmasında kullanılabilecek potansiyel bir biyomalzeme olduğu karakterizasyon teknikleriyle tespit edilmiştir. Bağ yapıcı kimyasallarla işlenmiş fibroin filmlerin ilaç salım sistemlerinde başarıyla kullanılabileceği geçirgenlik testleriyle saptanmıştır. 3. KAYNAKLAR [1] Magoshi, J., Magoshi, Y., Becker, M.A., Nakamura S., Polymeric Materials Encyclopedia, edited by J.C. Salamone, CRC Press, New York, [2] Zhang, Y.-Q., Natural Silk Fibroin as a Support for Enzyme Immobilization, Biotechnology Advances, 16, [3] Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool J., Gronowicz, G., Zichner, L., Langer, R., Vunjak-Novakovic, G. and Kaplan, D.L., The Inflammatory Responses to Silk Films in vitro and in vivo, Biomaterials, 26, [4] Rujiravanit, R., Kruaykitanon, S., Jamieson, A.M. and Tokura, S., Preparation of Crosslinked Chitosan/Silk Fibroin Blend Films for Drug Delivery System, Macromolecular Bioscience, 3, [5] Magoshi, J., Magoshi, Y., Becker, M.A., Kato, M., Han, Z., Tanaka, T., Inoue, S.-i. and Nakamura, S., Crystallization of Silk Fibroin from Solution, Thermochimica Acta, , [6] Tsuboi, Y., Ikejiri, T., Shiga, S., Yamada, K. and Itaya, A., Light Can Transform the Secondary Structure of Silk Fibroin (Rapid Communication), Applied Physics A, 73, [7] Bayraktar, O., Malay, Ö., Özgarip, Y. and Batıgün, A., Silk Fibroin as a Novel Coating Material for Controlled Release of Theophylline, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 60,