ÖZEL EGE LİSESİ İMMOBİLİZE KATALAZ İLE SÜTTE PEROKSİD GİDERİMİ

Transkript

1 ÖZEL EGE LİSESİ İMMOBİLİZE KATALAZ İLE SÜTTE PEROKSİD GİDERİMİ HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Gizem SUNUCU Derya MUMCU DANIŞMAN ÖĞRETMEN:Rüçhan ÖZDAMAR 2007 İZMİR

2 İÇİNDEKİLER Amaç...2 Giriş...2 Materyal ve yöntem...4 Sonuçlar ve tartışma...6 Kaynaklar

3 Amaç Enzimler protein yapılı biyokatalizörler olup gıda analizlerinde kullanım olanaklarının arttırılması amacıyla immobilize edilirler. Kovalent bağlama, adsorpsiyon, tutuklama gibi birçok farklı yöntem geliştirilerek gerçekleştirilen enzim immobilizasyonu sonucu enzim daha kararlı hale gelebildiği gibi defalarca kullanım olanağı da sağlanmış olur. Gıda analizlerinde serbest enzimlere kıyasla defalarca kullanıma olanak veren, kararlı immobilize enzimlerin kullanıldığı araştırmalar günden güne artış göstermektedir. Hidrojen peroksid süt endüstrisinin bazı dallarında sütün soğuk sterilizasyonu amacıyla kullanılır. Sütte peroksid giderimi gıda kontrolü için önemlidir. Sütte peroksid miktarını giderebilecek, defalarca kullanıma olanak veren, ucuz, kararlı bir immobilize katalaz preparatı hazırlamak çalışmamızın amacını oluşturmaktadır. Bu amaçla peroksidi parçalayan enzim olan katalaz aljinat kürelerde tutuklanarak immobilize katalaz preparatı hazırlanmış sistemin optimizasyonunun ardından sütte peroksid gideriminde kullanılabilirliği incelenmiştir. Çalışmalarımızda, yardım ve desteğini göz ardı edemeyeceğimiz Ege Üniversitesi Biyokimya Bölümü öğretim üyelerinden Yrd.Doç.Dr. Şenay BAYSAL a teşekkür ederiz. Giriş Enzimlerin değişik fiziksel ve kimyasal yöntemlerle immobilize edildikten sonra tıp, analitik ve endüstriyel amaçlarla kullanımı özellikle ekonomik açılardan sağladığı avantajlar nedeniyle oldukça yaygındır. Endüstri alanında bu yaygın kullanıma doğal olarak immobilize enzimlerin serbest enzimlere kıyasla sistem kontrolünde sağladıkları kolaylıklar da katkı yapmaktadır. Hidrojen peroksid süt endüstrisinin bazı dallarında sütün soğuk sterilizasyonu amacıyla kullanılır. Mikroorganizma kontaminasyonunu önlemek amacıyla süte katılması önerilen hidrojen peroksid oranı %0.05-%0.25 arasındadır. Mikroorganizmaların büyümesini engellemek amacıyla süte katılacak hidrojen peroksid oranı özellikle ortamın sıcaklığı ve mikroorganizma türünün hidrojen perokside olan direnciyle değişir. Sterilizasyon işleminden sonra hidrojen peroksidin parçalanarak sistemden uzaklaştırılması gereklidir. Katalazın kullanıldığı yöntemlerde hidrojen peroksid oksijen ve suya dönüştürülerek insan sağlığına olumsuz etkileri giderilmiş olur. Çalışmamızda aljinat enkapsülasyon polimeri olarak kullanıldı. Aljinat toksik değildir ve (1-4)β-D-mannuronikasit ve α-l-guluronik asit birimlerinden oluşur. Biyokimyasal olarak inerttir. Biyolojik olarak aktif maddelerin enkapsülasyonuna uygundur ve ilaç salınım sistemleri gibi pek çok biyomedikal uygulamada kullanılır. Na+ gibi monovalent katyonların varlığında çözünür. Ba +2 ve Al +3 gibi divalent katyonlarla çözünmeyen jel küreciklerini oluşturur. Ba +2 ve Al +3 iyonlarıyla güçlü çözünemeyen matriksler oluşturur. Ca +2 iyonlarıyla jel,film, küre, mikrokapsüller oluşturur. 2

4 Ca +2 Şekil 1: Aljinat Yapısı iyonlarıyla jel,film, küre, mikropartiküller gibi taşınım sistemleri için matriks oluştururlar. Kalsiyum iyonları aljinatın mannuronik asit ve guluronik asit birimleri için affiniteye sahiptirler. Bu birimlerlerle reaksiyona girerek kalsiyum-aljinat kompleksi oluştururlar. Oluşturulan küreler gözenekli yapıdadır, substratların ve ürünlerin jelden difüzyonuna izin verir. Glukoz, α-laktalbumin gibi düşük molekül ağırlıklı (< 20 kda) enkapsülantlar aljinat kürelerin dışına ve içine kolaylıkla difüzlenirler. Katalaz hidrojen peroksidi su ve oksijene parçalayan oxidoredüktaz sınıfı, yaklaşık Da moleküler kütleli bir enzimdir. Peroksid tayininde kullanılabildiği gibi sütte peroksid giderim amacıyla da süt endüstrisinde yaygın kullanım olanağı bulan enzimdir. 3

5 Şekil 2: Ca +2 İyonuyla Şelatlaşma Bu çalışmada aljinat kürelerde katalaz hapsedilerek aljinat yüzdesinin, katalaz miktarının enkapsülasyon verimleri üzerine etkileri i,ncelenerek optimum immobilizasyon koşulları saptandı. Sistemin optimizasyonunun ardından hazırlanılan katalaz içeren kürelerde optimum ph, optimum sıcaklık değerleri saptanarak serbest enzimle kıyaslandı ve immobilize enzimin depo kararlılığı tespit edildi. Optimum aktivite koşullarında sütte peroksid giderimi batch sistemde zamana bağımlı olarak incelendi. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışmada kullanılan tüm kimyasallar analitik özellikte olup sigma chem. co (St- Louis) den temin edilmiştir. Değişen % lerde aljinat, değişen oranlarda katalaz ile karıştırılarak ucu kesik belirli boyuttaki enjektöre çekilerek soğuk CaCl 2 çözeltisine damlatılarak küreler hazırlandı. 4 saat 4 o C de inkübasyonun ardından küreler nüçe süzgecinden süzülerek 3 kez d-su ile yıkandı. Her bir yıkama sularında ve süzüntüde hapsolan katalaz miktarları bradford yöntemiyle spektrofotometrik protein tayini yapılarak belirlendi. Şekil 3 de uygulanan deney düzeneği özetlenmiştir. Katalaz aktivite tayinleri 10 mm hidrojen peroksid kullanılarak 240 nm de peroksidin parçalanma hızı tespit edilerek belirlendi. 10 sn aralıklarla yapılan spektrofotometrik ölçümler sonrası aktivite tayin formülü kullanılarak her bir örnekte aktivite hesapları yapıldı. 4

6 2 ml (%0.5-3) aljinat ml Katalaz(1-50 mg/ml) Karıştırma 25 ml 0.05 M CaCl 2 (4 o C) çözeltiye şırınga ile damlatma Jelleşmenin tamamlanması için 4 o C de 4 saat karıştırma Nuçe hunisinde süzme 3 kez d-su ile yıkama Yıkama Suları Aktivite tayini Bradford yöntemiyle protein tayini Küreler Aktivite tayini Şekil 3: Katalaz İçeren Aljinat Kürelerin Hazırlanması 5

7 SONUÇLAR VE TARTIŞMA Çalışmamızın her bir aşamasında protein tayinleri bradford reaktifi kullanılarak yapılmış ve mg/ml aralığında konsantrasyonu bilinen albumin ile çizilen standart grafiğin denklemi y= 1,1813x olarak saptandı. Hazırlanılan kürelerin çapları dereceli bir silindirle hacimdeki artışı ölçerek hesaplandı. İşlem 3 kez tekrarlandı ve yapılan hesaplamalar sonucunda oluşturulan kürelerin partikül çapları hesaplandı. Her bir kürenin fotografı çekildi (şekil 4). 6

8 Şekil 4: Katalaz İçeren Aljinat Küreler 7

9 Aljinat % sinin katalaz enkapsülasyonu üzerine etkisi 0.5,1.0, 1.5, 2 ve 3 lük 2ml aljinat ve 100 μl katalaz ile karıştırılarak belirtildiği gibi küreler oluşturuldu. Değişen aljinat oranlarında enkapsülasyon verimleri şekil 5 de verilmiştir. % 0.5 ve 1.0 aljinat miktarlarında küre şekillerinin bozuk olduğu saptandı ayrıca %3 lük aljinat kullanıldığında ise enjektörden damlatmak zor olmuştur. Aljinat yüzdelerinin enkapsülasyon verimi üzerine etkisi şekil 5 de görülmektedir. Şekilde görüldüğü gibi % 2 lik aljinat yüzdesinde maximum verim gözlenmiştir. %2 lik aljinat yüzdesinin üzerinde boncuk hazırlama güçlüğü doğduğundan seçilmemiştir. 100 %Enkapsülasyon verim ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 % aljinat Şekil 5: Aljinat Yüzdesinin Enkapsülasyon Verimi Üzerine Etkisi Katalaz miktarının enkapsülasyon verimi üzerine etkisi incelenmiş ve maximum enkapsülasyon verimi 20 mg/ml katalaz konsantrasyonunda belirlenmiştir. Optimum koşullarda hazırlanılan katalaz içeren kürelerin karakterizasyonu amacıyla optimum ph taraması ve optimum sıcaklık taramaları yapıldı. Bu amaçla, fosfat tamponu kullanıldığında boncuk yapıları bozulduğu için ph sı 3,4,5,6,7,8 ve 9 a ayarlı distile su kullanılarak belirli sayıda boncuk üzerine 3 ml 10 mm hidrojen peroksid eklenerek oda sıcaklığında aktivite tayinleri yapıldı ve sonuçlar şekil 6 da verildi. Serbest enzim ile kıyaslandığında maximum aktivite gözlenen ph değeri değişmeyip 7.0 olarak saptanmıştır. 8

10 %max aktivite ph Şekil 6: ph Değişiminin Etkisi %max aktivite T( o C) Şekil 7: Sıcaklık Değişiminin Etkisi Şekil 7 de görüldüğü gibi maximum aktivite 37 o C de gözlenmiştir. Bu değer serbest katalaz için de aynıdır. Hazırlanılan kürelerin depo kararlılık ve işlem kararlılığı sütte zamana bağımlı peroksid giderim denemeleri devam etmektedir. 9

11 KAYNAKLAR Hamarat Baysal, Ş., Uslan, A.H., Artif. Cells Blood Subst. Imm. Biotech., vol 30(1), ,2002. DeGroot, A.R. and Neufeld, R.J., Enzyme and Microbial Technology, 29, , Tarhan, L., Uslan, A.H., Process Biochemistry, 25(1), 14-18,