Fiz 202 Fizyolojide Deney Teknikleri

Transkript

1 Fiz 202 Fizyolojide Deney Teknikleri Adnan Kur t Ders Öğretim Üyesi: Prof. Dr. S. Karamürsel v1: 27 Nisan 2009

2 Motivasyon: Sinirbilimlerinin uğraş alanlarının önemli bölümünü sinir hücreleri ve toplu etkinliklerinin davranışa, hesaplamaya ya da patolojik bir duruma katkılarını belirlemeye yöneliktir. Bu çalışmalar, ya elektrofizyolojik hasarlayıcı yöntemlerle, ya kimyasal ve biyolojik ajanlarla haraplama yöntemleriyle yapılagelmiştir. Daha seçici, daha az yokedici, hızlı siniretkinlikleri gözleme ve uyarma araçları geliştirmek değerli görünmektedir. Optik mikroskopideki gelişmeler ve tek moleküle kadar görüntüleyebilme, iyi tanımlanmış foton kaynaklarıyla tümleştirebilme sinirbilimdeki etkinlik ölçümü ve uyarımı konusunda çok geniş spektrumda çalışabilme olanağı tanıyacaktır. Amaç: Işıkla sinir uyarma ve dinamik görüntüleme yöntemlerinin araştırılması ve yapılabilirlik ve işbirliği olanaklarının değerlendirilmesidir.

3 Sinirsel yapılanmanın boyutları uzaysal ölçekte, işlevsel yapısıysa zamansal ölçekte görüntülenmiştir. Optik görüntüleme moleküler düzeyden davranışsal düzeye, milisaniye aralığından, günlere varan çözünürlükte ölçüm sağlayabilir.

4 Sinir Devre Dinamiklerinin Optik İzleme (Optical Probing) Teknikleri: Organik kimyasal boyaların Kalsiyum ve Membran Gerilimi göstergeçleri olarak kullanılması. Genetik olarak şifrelenmiş ışıldayan protein duyargalarının sinir devrelerinin işlerliği çalışmalarında kullanılması. İşlevsel Optik Görüntüleme Modaliteleri: Soğurma Saçılma Kimyasal ışıldama Işıma

5 İçkin Işıldama Probları: Beyin dokusu morötesinde aydınlatıldığında (~350nm), 460 nm dalgaboyunda tepe yapan bir ışıldama verir. Mavi otofloresansın kaynağı nicotinamide adenine dinucleide (NADH)dir. Sinir etkinliği NADH'nin ışıldamayan NAD+ molekülüne oksitlenmesini artırır. Chance B, Cohen P, Jobsis F, Schoener B: Localized fluorometry of oxidation reduction states of intracellular pyridine nucleotide in brain and kidney cortex of the anesthetized rat. Science 1962;136:325. Sinirsel etkinlik ölçümünde, flavin adenine dinucleotide molekülünün yaydığı yeşil kendiliğinden ışıma daha kullanışlıdır. Reinert KC, Dunbar RL, Gao W, Chen G, Ebner TJ: Flavoprotein autofluorescence imag ing of neuronal activation in the cerebellar cortex in vivo. J Neurophysiol 2004; 92: Mavi ve Yeşil özışıma yeğinlikleri hücresel çözünürlük elde etmek için çok düşük ve herikisinin de kinetiği hızlı dinamikleri izlemek için çok yavaştır.

6 Serebellumda yeşil özışıma in vivo. Targeted Optical Probing of Neuronal Circuit Dynamics Using Fluorescent Protein Sensors De Lai Qiu Walther Akemann Chun Ping Chu Rikita Araki Thomas Knöpfe Neurosignals 2008;16:

7 Organik Floresan Problar Kalsiyuma duyarlı Gerilime duyarlı Kimyasal boyalarla dinamik görüntüleme yapılabilir. Fare nöronlarında aksiyon potansiyellerinin akson boyunca ilerlemesi görüntülenebilmiştir. Vranesic I, Iijima T, Ichikawa M, Matsumoto G, Knöpfel T: Signal transmission in the parallel fiber Purkinje cell system visualized by high resolution imaging. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91: Organik Floresan boyaların en sınırlayıcı özelliği, çok çeşitli hücre grupları içeren bir yapıda, seçici olarak özgül hücre gruplarını boyamanın olanaksızlığıdır. Serebellum yüzeyine, yıldızlı noktadan elektriksel uyarı verildiğinde her iki yöne doğru yanal ilerleyen aksiyon potansiyelleri izlenmektedir. Targeted Optical Probing of Neuronal Circuit Dynamics Using Fluorescent Protein Sensors De Lai Qiu Wather Akemann Chun Ping Chu Rikita Araki Thomas Knöpfe Neurosignals 2008;16:

8 Özgül Hücre Gruplarının Genetik Denetimle Boyanması Belli hücre grupları, işlevleri bir proteine bağlı olan duyargalarla işaretlenebilir. Aequorea victoria yeşil ışıldayan protein (GFP)in moleküler kopyalanmasıyla, genetik şifrelenmiş floresan problar araştırmada güç kazanmıştır. Martin Chalfie, Osamu Shimomura, and Roger Y. Tsien Yeşil ışıldayan proteini bulup geliştirdikleri için 2008 Nobel Kimya Ödülünü aldılar.

9

10 Işıldayan Protein Gerilim Duyargaları FlaSh SPARC VSFP Paralel liflerde kalsiyum geçiciliğinin GcaMP2 faresinde in vitro ve in vivo ölçümü.

11 Sinir Hücrelerinin Yüksek Çözünürlüklü İşlevsel Görüntülenmesi için Optik Aygıt Yapısı a1: EşOdaklı Laser Taramalı Mikroskop (CLSM) a2: İki Foton Laser Taramalı Mikroskop (2pLSM)

12 Görüntüleme Aygıtlarının Gereksinimleri Sınırları Gelecek gelişmeleri Zorluklar Gelecek Konu: Sinir Etkinliğinin tek Dürtü Zamansal Çözünürlükte Denetlenmesi R: Han X, Boyden ES (2007) Multiple Color Optical Activation, Silencing, and Desynchronization of Neural Activity, with Single Spike Temporal Resolution. PLoS ONE 2(3): e299. doi: /journal.pone