ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Meral İNCESU ANAÇ VE ANAÇ ÖZELLİĞİ OLAN BAZI TURUNÇGİL GENOTİPLERİNDE DEMİR (Fe) KLOROZUNA DAYANIKLILIĞIN FİZYOLOJİK VE GENETİK YÖNDEN İNCELENMESİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2011

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ANAÇ VE ANAÇ ÖZELLİĞİ OLAN BAZI TURUNÇGİL GENOTİPLERİNDE DEMİR (Fe) KLOROZUNA DAYANIKLILIĞIN FİZYOLOJİK VE GENETİK YÖNDEN İNCELENMESİ Meral İNCESU DOKTORA TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu Tez 03/02/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU Doç. Dr. Selim EKER Prof. Dr. Mustafa KAPLANKIRAN I. DANIŞMAN II. DANIŞMAN ÜYE Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR ÜYE..... Doç. Dr. Ayfer ALKAN TORUN ÜYE Bu Tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2009D11 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ ANAÇ VE ANAÇ ÖZELLİĞİ OLAN BAZI TURUNÇGİL GENOTİPLERİNDE DEMİR (Fe) KLOROZUNA DAYANIKLILIĞIN FİZYOLOJİK VE GENETİK YÖNDEN İNCELENMESİ Meral İNCESU ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman :Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU II. Danışman: Doç Dr. Selim EKER Yıl: 2011, Sayfa: 267 Jüri :Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU Doç. Dr. Selim EKER :Prof. Dr. Mustafa KAPLANKIRAN :Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR :Doç. Dr. Ayfer ALKAN TORUN Bu çalışmayla anaç özelliğine sahip 16 farklı turunçgil tür, cins ve çeşidinin demir klorozuna tolerans düzeyleri belirlenmiştir. Demir klorozuna tolerans düzeyinin belirlenebilmesi için farklı parametreler kullanılmış ve yapılacak ıslah çalışmalarında elde edilecek bireylerin seçiminde bu parametrelerden bir kısmının bir seleksiyon kriteri olarak kullanılabileceği belirlenmiştir. Ayrıca 16 genotipin kontrollü ve 15 genotipin doğal koşullardaki performansları değerlendirilerek, demir stresinin bitkilerde çevre faktörlerinden etkilenme düzeyleri saptanmıştır. Kontrollü koşullarda yapılan tarama çalışmasında Tuzcu 891 turuncu, Gou Tou turuncu, Antalya Kleopatra mandarini ve Duncan altıntopu demir klorozuna çok tolerant olarak belirlenmiş, doğal koşullarda yürütülen tarama çalışmasında ise Tuzcu turuncu, Gou Tou turuncu, Sunki mandarini ve Antalya Kleopatra mandarini çok tolerant olarak saptanmıştır. Ayrıca demir klorozuna duyarlı ve tolerant olan iki genotipin demir stresinde gösterdikleri fizyolojik ve moleküler tepkiler incelenmiştir. SPAD, skala, aktif ve toplam demir konsantrsyonları ile fotosentez hızının demir klorozundan etkilendiği saptanmıştır. Mikroarray çalışmasıyla demir klorozunda aktif olan genler belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre FRO4, FRO5, IRT1, Fe-S ve Aconitase genleri turunçgillerde demir alımında etkindir. Anahtar Kelimeler: Turunçgil, Anaç, Tarama, Demir klorozu, Mikroarray, I

4 ABSTRACT Ph. D. THESIS INVESTIGATION OF GENETIC AND PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF SOME CITRUS ROOTSTOCKS TO IRON CHLOROSIS Meral İNCESU CUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE DEPARTMENT OF HORTICULTURE Supervisor :Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU Supervisor II : Assoc. Prof. Dr. Selim EKER Year: 2011, Page: 267 Jury :Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU Assoc. Prof. Dr. Selim EKER Prof. Dr. Mustafa KAPLANKIRAN Assoc. Prof. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Assoc. Prof. Dr. Ayfer ALKAN TORUN In this work, 16 different citrus rootstock species, genera and cultivars were assessed for their tolerance to iron chlorosis. Different parameters were used to determine the level of iron chlorosis tolerance and to select individuals for breeding studies. Additionally, 16 genotypes (under controlled conditions) and 15 genotypes (under natural conditions) were evaluated for the environmental factors affecting iron stress. In the screening experiments, under controlled conditions Tuzcu 891 sour orange, Gou Tou sour orange, Antalya Kleopatra mandarin and Duncan grapefruit were found to be very tolerant to iron chlorosis, and under natural conditions Tuzcu sour orange, Gou Tou sour orange, Sunki mandarin and Antalya Kleopatra mandarin were very tolerant. In addition, the physiological and molecular responses of sensitive and tolerant genotypes to iron chlorosis were studied. Leaf color (SPAD), color ratings, photosynthetic activity, active and total iron concentrations were affected by iron chlorosis. By microarray analysis, genes that are affected by iron chlorosis were identified. Based on these, results FRO4, FRO5, IRT1, Fe-S and Aconitase iron uptake genes are active in citrus. Key Words: Citrus, Rootstock, Screening, Iron chlorosis, Microarray, II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans ve doktora öğrenimim boyunca bilimsel bilgisi ve disiplini ile çalışmalarıma ışık tutan, yardımsever ve sabırlı kişiliği ile bana destek olan danışman hocam sayın Prof. Dr. Turgut Yeşiloğlu na tüm samimiyetimle teşekkür ederim yılında emekli olan ancak, uzakta da olsa varlığını hep yanımda hissettiren, doktora tezimin olgunlaşmasına katkıda bulunan Prof. Dr. Önder Tuzcu ya, IVIA Araştırma Enstitüsü nde bana gerekli tüm çalışma koşullarını hazırlayan danışman hocam Dr. José M. Colmenero Flores ve mikroarray çalışmalarında bana yardımcı olan Dr. Javier Brumos a, Çok büyük anlayış ve sabırla doktora çalışmamın takibini yapan tez izleme komitesi üyeleri hocalarım Doç. Dr. Selim Eker, Doç Dr. Yıldız Aka Kaçar ve Doç. Dr. Ayfer Torun a, Yakın ilgisi ve tez jürisinde bulunma nezaketini gösteren hocam Prof. Dr. Mustafa Kaplankıran a, Dokuz yıldır birlikte çok büyük bir keyifle çalıştığım Yrd. Doç. Dr. Bilge Yıldırım ve eski çalışma arkadaşım Dr. Müge Kamiloğlu na, Tezimin laboratuar ve yazımı aşamalarında yardımcı olan sevgili arkadaşım Ar. Gör. Berken Çimen e, Çalışmalarım sırasında yardımlarını gördüğüm Doç Dr. Yıldız Daşgan, Prof. Dr. Ömür Dündar, Prof. Dr. Tamer Kayaalp, Doç. Dr. Yeşim Yalçın Mendi, Prof. Dr. Sevgi Paydaş a, Tezim boyunca kapılarını her çaldığımda beni asla geri çevirmeyen Toprak Bölümü nün tüm olanaklarını kullanmamı sağlayan Doç. Dr. Bülent Torun, Yrd. Doç. Dr. E. Bülent Erenoğlu ve Dr. Özlem Çakmak a, Arazi ve laboratuar çalışmalarında yanımda olan İsrafil Boran, Nurgül Ergin ve Zir. Müh. Aylin Satmaz a; Valencia da birlikte çalıştığım Ar. Gör. Özhan Şimşek e, Ve her zaman yanımda olan aileme, özellikle annem ve babam Saime- Kazım İncesu ve dayım Op. Dr. M. Cüneyt Bozkut a çok teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... XII ŞEKİLLER DİZİNİ... XVI 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bitki Bünyesinde Demirin taşınımı Bitkilerde Demirin Fonksiyonları Demir Noksanlığında Demir İçeren Enzimlerin Durumları Yetiştirme Ortamındaki Bikarbonat İyonunun ve Çevresel Faktörlerin Demir Alımına Etkileri Demir Paradoksu Demir Klorozunun Fotosentez ve Verimlilik Üzerine Etkileri Demir Klorozu ile İlgili Turunçgilde Yapılan Tarama Çalışmaları Mikroarray ile İlgili Çalışmalar Mikroarray Teknolojisi Turunçgillerde Fonksiyonel Genomik Çalışmaları Stres Çalışmalarında Mikroarray Demir Alımı ile İlgili Bulunmuş Genler MATERYAL VE METOD Materyal Çalışmada Kullanılan Genotiplerin Özellikleri Tuzcu turuncu Tuzcu 891 turuncu Gou Tou turuncu Volkameriana Duncan Altıntopu IV

7 Sunki Mandarini Antalya Kleopatra Mandarini Nasnaran Mandarini Sarawak Bintangor Marumi Kamkat Swingle Sitrumelo Kleopatra Mandarini X Swingle Sitrumelo Melezi Carrizo Sitranjı C-35 Sitranjı Pomeroy Üç Yapraklı Yerli Üç Yapraklı Yöntem I. Fizyoloji Denemeleri Tarama Denemeleri İklim Odası Tarama Denemesi (1). Büyüme Oranının Belirlenmesi (1).(a). Bitki Boyu (cm) (1).(b). Yaprak sayısı (adet/bitki) (1).(c). Bitki taze ağırlığı (g/bitki) (2). Yapraklardaki Demir Konsantrasyonlarının Belirlenmesi (2).(a). Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi (2).(b). Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi (3). Yaprak Klorofil Miktarının Belirlenmesi (4). Demir Redüktaz Aktivitesinin Belirlenmesi (5). Bitkilerin Kloroz Durumlarının Demir Klorozu Skalasına Göre Belirlenmesi Yüksek ph lı Toprak Ortamında Tarama Denemesi (1). Büyüme Oranının Belirlenmesi (1).(a). Bitki Boyu (cm) (1).(b). Yaprak sayısı (adet/bitki) V

8 (2). Yaprak Demir Konsantrasyonlarının Belirlenmesi (2).(a). Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi (mg/kg) (b). Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi (mg/kg) (3). Yaprak Klorofil Miktarının Belirlenmesi (4). Bitkilerin Kloroz Durumlarının Demir Klorozu Skalasına Göre Belirlenmesi II. Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Turunçgillerde Fe Eksikliğine dayanıklılığın Fizyolojik Yönden İncelenmesi Büyüme Oranının Belirlenmesi (1). Bitki Boyu (cm) (2). Yaprak sayısı (adet/bitki) (3). Bitki taze ağırlığı (g/bitki) Yaprak Demir Konsantrasyonlarının Belirlenmesi (1). Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi (mg/kg) (2) Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi (mg/kg) Yaprak Klorofil Miktarının Belirlenmesi (µmolm-2) Demir Redüktaz Aktivitesinin Belirlenmesi Bitkilerin Kloroz Durumlarının Demir Klorozu Skalasına Göre Belirlenmesi Yapraklarda Stres Enzimleri Aktivitelerinin Belirlenmesi (a). Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi (µmol/dak/mg TA) (b). Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi (µmol/dak/mg TA) Fotosentez Hızının Belirlenmesi (µmolm-2s-1) Karbonhidrat Analizleri (a). Toplam Şeker Miktarı (%) VI

9 (b). Nişasta Miktarı (%) (c). Toplam Karbonhidrat Miktarı (%) Azot Konsantrasyonu (%) Karbon/Azot Oranı Deneme Deseni ve İstatistik Analiz Mikroarray Çalışması Bitkisel Materyalin Alınması ve RNA İzolasyonu RNA İzolasyon Aşamaları RNA Kalitesi ve Kantitesinin Belirlenmesi arna Amplifikasyonu arna Amplifikasyon Protokolü (1). cdna Purifikasyonu (2). arna nın in vitro Sentezi (3). arna Purifikasyonu (4). arna nın Boyanması (5). Boyanan arna nın Purifikasyonu (6). Hibridizasyona Hazırlık Aşaması (6).(a). Labeled arna Örneklerinin Hazırlığı (6).(b). Hibridizasyonda Kullanılacak Çiplerin Hazırlığı (6).(c). Çiplerin Hibridizasyonu (6).(d). Hibridize Edilmiş Çiplerin Yıkanması (7). Çiplerin Tarama İşlemi (8). Çiplerin Normalizasyonu (9). İstatistiksel Değerlendirme (10). Fonksiyonel Analizler ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Araştırma Bulguları I. Fizyoloji Denemesi Sonuçları İklim Odası Tarama Denemesi Sonuçları Bitki Büyüme Oranları VII

10 (1). İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) (2). İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm) (3). İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Taze Ağırlıkları (g/bitki) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm -2 ) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Redüktaz Enzim Aktiviteleri (nmol/gta/dak.) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Demir Klorozu Skalası Değerleri İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (1) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (2) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Arazi Tarama Denemesi Sonuçları Bitki Büyüme Oranları (1). Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) (2). Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm) Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Demir Klorozu Skalası Değerleri Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (1) Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) VIII

11 (2). Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) II. Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Demir Klorozuna Duyarlı ve Tolerant İki Genotipte Ölçülen Bazı Fizyolojik Parametreler Bitki Büyüme Oranları (1). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) (2). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm) (3). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Taze Ağırlıkları (g/bitki) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Demir Klorozu Skalası Değerleri Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (1). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (2). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Stres Enzimi Aktiviteleri (1). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Katalaz Aktiviteleri (µmol/dak./mg TA) (2) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Askorbat Peroksidaz Aktiviteleri (µmol/dak./mg TA) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Fotosentez Etkinlikleri (µmolm-2s-1) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Karbonhidrat Analizleri IX

12 (1) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Şeker İçeriği (%) (2) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Nişasta İçeriği (%) (3) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Karbonhidrat Miktarı (%) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Azot Konsantrasyonu (%) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Karbon/Azot Oranları İncelenen Parametrelerin Birbirleri ile İlişki Durumları İklim Odası Tarama Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumu Arazi Tarama Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumu Ayrıntılı Fizyoloji Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumu Ayrıntılı Fizyoloji Denemesinde 0. Güne Ait Değerlendirmeler Ayrıntılı Fizyoloji Denemesinde 30. Güne Ait Değerlendirmeler Ayrıntılı Fizyoloji Denemesinde 60. Güne Ait Değerlendirmeler Tarama Çalışmalarında Kullanılan Genotiplerin Genel Değerlendirilmesi Tartılı Derecelendirme Sonuçları İklim Odası Tartılı Derecelendirme Sonuçları Arazi Denemesi Tartılı Derecelendirme Sonuçları İklim odası denemesinden elde edilen tartılı derecelendirme sonuçlarının arazi denemesinde ölçülen parametrelerle ilişkisi Biyoteknolojik Çalışmalar Mikroarray Çalışması Global Gen Ekpresyonu Solunumla İlgili Bulunan Prosesler Alkol Katabolik Proses X

13 Glukoz Katabolik Proses Glikozis Piruvat Dekarboksilaz Aktivitesi Diğer Prosesler Demir Bağlayıcı Genler Metal Bağlayıcı Genler Organik Asit Biyosentetik Proses Porin Aktivitesi Sülfat Asimilasyonu Sistein Biyosentetik Proses Methionin Biyosentetik Proses Serin Familyası Aminoasit Biyosentetik Proses SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ XI

14 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Tarama Çalışmasında Kullanılan Genotiplerin Adları Çizelge 3.2. Yüksek ph lı Toprak Ortamında Tarama Çalışması İçin Kullanılan Arazinin Toprak Analizi Sonucu Çizelge 3.3. İklim Odası Denemesi Etki Oranları Çizelge 3.4. İklim Odası Yaprak Sayısı % Farkı Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge 3.5. İklim Odası Bitki Boyu % Farkı Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge 3.6. İklim Odası Bitki Ağırlığı % Farkı Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge 3.7. İklim Odası SPAD % Farkı Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge 3.8. İklim Odası Skala Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge 3.9. İklim Odası Toplam Demir % Farkı Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge İklim Odası Aktif Demir % Farkı Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge İklim Odası Tarama Denemesi Genotiplerinin Tartılı Derecelendirme Puanlarına Göre Demir Klorozuna Toleranslılıklarının Sınıflandırılması Çizelge Arazi Denemesi Etki Oranları Çizelge İklim Odası SPAD Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge İklim Odası Skala Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge İklim Odası Toplam Demir Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge İklim Odası Aktif Demir Tartılı Derecelendirme Puanları Çizelge Arazi Tarama Denemesi Genotiplerinin Tartılı Derecelendirme Puanlarına Göre Demir Klorozuna Toleranslılıklarının Sınıflandırılması Çizelge 4.1. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) Çizelge 4.2. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm) Çizelge 4.3. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Taze Ağırlıkları (g/bitki) Çizelge 4.4. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri Çizelge 4.5. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Skala Değerleri XII

15 Çizelge 4.6. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Çizelge 4.7. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Çizelge 4.8. Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) Çizelge 4.9. Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm) Çizelge Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm-2) Çizelge Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Skala Değerleri Çizelge Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Çizelge Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Boyları (cm/bitki) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Bitki Taze Ağırlıkları (g/bitki) 143 Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm-2). 146 Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Skala Değerleri Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/mg) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Katalaz Enzim Aktiviteleri (µmol/dak/mg TA) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Askorbat Peroksidaz Enzim Aktiviteleri (µmol/dak/mg TA) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Fotosentez Etkinlikleri (µmolm-2s-1) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Şeker İçeriği (%) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Nişasta İçeriği (%) XIII

16 Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Karbonhidrat Miktarı (%) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Azot Konsantrasyonu (%) Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Karbon /Azot Oranları Çizelge İklim Odası Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumlarından Oluşan Korelasyon Tablosu Çizelge Arazi Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumlarından Oluşan Korelasyon Tablosu Çizelge Fizyoloji Denemesi Sonucunda Deneme Başlangıcında (0.Gün) Parametreler Arasındaki İlişki Durumlarını Yansıtan Korelasyon Tablosu Çizelge Fizyoloji Denemesi 30.Gün Sonununda İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumlarını Yansıtan Korelasyon Tablosu Çizelge Fizyoloji Denemesi 60.Gün Sonununda İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumlarını Yansıtan Korelasyon Tablosu Çizelge İklim Odası Denemesi Tartılı Derecelendirme Sonuçları Çizelge Arazi Denemesi Tartılı Derecelendirme Sonuçları Çizelge Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklıda İndüklenmiş ve Baskılanmış Gen Sayıları Çizelge Yerli Üç Yapraklıda Mikroarray Sonuçlarına Göre 1. ve 5. Gün Işımalarında İstatistiksel Olarak Önemli Bulunan Genler Çizelge Yerli Üç Yapraklıda Mikroarray Sonuçlarına Göre 1. Gün Işımalarında İstatistiksel Olarak Önemli Bulunan Genler Çizelge Yerli Üç Yapraklıda Mikroarray Sonuçlarına Göre 5. Gün Işımalarında İstatistiksel Olarak Önemli Bulunan Genler Çizelge Tuzcu Turuncunda Mikroarray Sonuçlarına Göre 1. ve 5. Gün Işımalarında İstatistiksel Olarak Önemli Bulunan Genler Çizelge Tuzcu Turuncunda Mikroarray Sonuçlarına Göre 1. Gün Işımalarında İstatistiksel Olarak Önemli Bulunan Genler Çizelge Tuzcu Turuncunda Mikroarray Sonuçlarına Göre 5. Gün Işımalarında İstatistiksel Olarak Önemli Bulunan Genler XIV

17 XV

18 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Torfa Ekildikten Sonra Kuvarsa Aktarılan Yerli Üç Yapraklı Bitkilerinin Genel Görünümleri...59 Şekil 3.2. İklim Odası Denemesinin Deneme Sonunda Genel Görünümü..61 Şekil 3.3. İklim Odası Denemesi Bitkilerinin Söküm Sırasındaki Kök Görünümleri Şekil 3.4. İklim Odası Denemesi Bitkilerinin Deneme Sonunda SPAD Ölçümünden Bir Görünüm...63 Şekil 3.5. Arazi Denemesinden Genel Görünüm Şekil 3.6. Ayrıntılı Fizyoloji Çalışmasında Kullanılan Yerli Üç Yapraklı Bitkilerinin Gövde Kalınlıkları 68 Şekil 3.7. Ayrıntılı Fizyoloji Çalışmasında Kullanılan Tuzcu Turuncu Bitkilerinin Gövde Kalınlıkları 69 Şekil 3.8. Ayrıntılı Fizyoloji Çalışmasında Kullanılan Fotosentez Ölçüm Cihazından Bir Görünüm.72 Şekil 3.9. Mikroarray Çalışması İçin Kullanılan Yerli Üç Yapraklı Bitkilerinin İklim Odasında Genel Görünümü 79 Şekil Mikroarray Çalışması İçin Kullanılan Yerli Üç Yapraklı ve Tuzcu Turuncu Bitkilerinin Stresin 1. Gününde Genel Görünümleri.79 Şekil RNA Kalitesinin Kontrolünde Kullanılan Nanodrop Şekil Mikroarray Çalışması İçin Kullanılan Çiplerin Hibridizasyon Aşamalarından Görünüm.87 Şekil Mikroarray Çalışması İçin Kullanılan Çiplerin Yıkama İşleminden Sonra Kurutulması İçin Kullanılan Santrifüj...88 Şekil Mikroarray Çalışması İçin Kullanılan Çiplerin Taraması İçin Kullanılan Scanner 89 Şekil 4.1. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) Şekil 4.2. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm/bitki) XVI

19 Şekil 4.3. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Taze Ağırlıkları (g/bitki) Şekil 4.4. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm- 2) Şekil 4.5. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Skala Değerleri Şekil 4.6. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Şekil 4.7. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Şekil 4.8. İklim Odası Denemesi Sonunda Tuzcu 31-31, Tuzcu 891 ve Gou Tou Turunçlarının (-)Fe ve Kontrol Bitkilerinin Görünümü Şekil 4.9. İklim Odası Denemesi Sonunda Sunki, Antalya Kleopatra ve Nasnaran Mandarinleri İle Bitangor Sarawakta (-)Fe Ve Kontrol Bitkilerinin Görünümü 114 Şekil İklim Odası Denemesi Sonunda K X S, Swingle Sitrumelo, Carrizo ve C-35 Sitranjlarının (-)Fe ve Kontrol Bitkilerinin Görünümü Şekil İklim Odası Denemesi Sonunda Pomeroy Üç Yapraklı ve Yerli Üç Yapraklı (-)Fe ve Kontrol Bitkilerinin Görünümü Şekil İklim Odası Denemesi Sonunda Yerli Üç Yapraklı (-)Fe ve Kontrol Bitkilerinin Görünümü Şekil İklim Odası Denemesi Sonunda Volkameriana, Duncan Altıntopu ve Marumi Kamkatın (-)Fe ve Kontrol Bitkilerinin Görünümü Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm/bitki) Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm-2) Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Skala Değerleri Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/gg) Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Şekil Arazi Denemesine Tuzcu Turuncu Bitkisinin Görünümü XVII

20 Şekil Arazi Denemesine Gou Tou Turuncu Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Tuzcu 891 Turuncu Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Bintangor Sarawak Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Nasnaran Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Sunki Mandarini Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Antalya Kleopatra Mandarini Bitkisinin Görünümü 135 Şekil Arazi Denemesine K X S Melezi Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Swingle Sitrumelo Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Carrizo Sitranjı Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine C-35 Sitranjı Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Pomeroy Üç Yapraklı Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Yerli Üç Yapraklı Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Volkameriana Bitkisinin Görünümü Şekil Arazi Denemesine Marumi Kamkat Bitkisinin Görünümü Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Boyları (cm/bitki) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Bitki Ağırlıkları (cm/bitki) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm-2). 147 Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Skala Değerleri Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Fotosentez Etkinlikleri (µmolm-2s-1) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Şeker İçeriği (%) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Nişasta İçeriği (%) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Karbonhidrat Miktarı (%) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Azot Konsantrasyonu (%) Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Karbon /Azot Oranları XVIII

21 Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesinin 0. Gününe Ait Görüntüler Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesinin 30. Gününe Ait Görüntüler Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesinin 60. Gününe Ait Görüntüler Şekil İklim Odası Denemesinden Elde Edilen Tartılı Derecelendirme Sonuçlarının Arazi Denemesinde Ölçülen Parametrelerle İlişkisi Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklıda İndüklenmiş Ve Baskılanmış Gen Sayıları Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Alkol Katabolik Prosese Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu Ve Yerli Üç Yapraklının Glukoz Katabolik Prosese Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Glikozis Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu Ve Yerli Üç Yapraklının Piruvat Dekarboksilaz Aktivitesi Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Demir Bağlayıcı Genlere Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Metal Bağlayıcı Genlere Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Organik Asit Biyosentetik Proses Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Porin Aktiviteleri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Sülfat Asimilasyonunda Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Sistein Biyosentetik Prosesinde Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Methionin Metabolizmasında Tepkileri Şekil Tuzcu Turuncu ve Yerli Üç Yapraklının Serin Ailesi Aminoasitlerinin Biyosentetik Prosesinde Tepkileri XIX

22 1. GİRİŞ Meral İNCESU 1. GİRİŞ Turunçgillerin kökeni Doğu Arabistan tandan Filipinler e ve Himalayalar ın güneyinden Endonezya-Avustralya ya kadar yayılan bölgenin de içinde bulunduğu Güneydoğu Asya dır. Bu alan içerisinde Kuzeydoğu Hindistan ve Kuzey Burma nın köken merkezi olduğuna inanılmakta, ancak son bulgulara göre Çin'in Yunnan bölgesinde değişik birçok turunçgil türünün bulunmasından dolayı anavatan olarak önemli olduğu görülmektedir (Davies ve Albrigo, 1994). Turunçgil yetiştiriciliği dünyada ağırlıklı olarak 40º kuzey enlemi ile 40º güney enlemi arasında yapılmaktadır. Bu anlamda, yetiştiriciliğin yapıldığı üç ana bölge bulunmaktadır. Bunlar tropik bölge, semitropik bölge ve subtropik bölgedir. Anavatanı tropik ve semitropik bölgeler olmasına rağmen, turunçgil yetiştiriciliği subtropik bölgelerde yoğunlaşmıştır. Tropik ve semitropik bölgelerde meyvede iç ve dış renklenme iyi olmamakta, aroma yetersiz kalmaktadır. Bu çerçevede kaliteli üretim (sofralık) subtropik bölgelerde yapılmakta, diğer bölgelerdeki üretim genelde sanayiye yönelik olmaktadır. Turunçgillerin dünyada yetiştirildiği alanlar dikkate alındığında, kuzey yarı kürede en büyük turunçgil üreticisi ülkeler olarak Kuzey Amerika da ABD ve Meksika; Orta Amerika da Dominik cumhuriyeti, Küba, Venezuella; Akdeniz ülkelerinde İspanya, İtalya, Türkiye, Mısır, Yunanistan, Fas, İsrail, Tunus, Suriye, Cezayir, K.K.T.C., Güney Kıbrıs ve Çin, Japonya, Hindistan, Pakistan gibi bazı Asya ülkeleridir. Güney yarı kürede bulunan önemli üretici ülkeler ise Brezilya, Arjantin, Güney Afrika Cumhuriyeti ve Avustralya dır. Kuzey yarı kürede üretilen turunçgiller dünya üretiminin % 74 ünü oluşturmaktadır (Yeşiloğlu ve ark., 2007). Dünya 2009 yılı toplam turunçgil üretimi tondur. Üretimin %54.34 ü portakal, %24.59 u mandarin, %11.21 i limon - laym, %3.61 i altıntopşadok ve %6.25 i diğer türlerdir. Dünya turunçgil üretiminde Çin ton, Brezilya ton, ABD ton ile ilk 3 sırayı almakta ve Akdeniz ülkeleri yaklaşık olarak 22 milyon ton ile önemli bir yere sahip bulunmaktadırlar (FAO, 2010). 1

23 1. GİRİŞ Meral İNCESU Ülkemiz 2009 yılında ton turunçgil üretmiştir. Türkiye nin toplam turunçgil üretiminin % u portakal (çoğunlukla göbekliler), %24.09 u mandarin, %22.30 u limon, %5.44 ü altıntop ve %0.08 i turunçtur. Ülkemizde çok önemli yeri olan turunçgil yetiştiriciliği, diğer meyve türlerine oranla daha hızlı bir gelişim içerisindedir ve Türkiye Akdeniz ülkeleri içerisinde potansiyeli en yüksek ülkelerden biridir. Turunçgil tarımının yoğun olarak yapıldığı Akdeniz ülkelerinde, dünya toplam turunçgil üretiminin %17.32 si gerçekleştirilmektedir. Türkiye'nin dünya üretimindeki payı ise %2.82 dir. Türkiye de giderek artan turunçgil üretim alanı ha dır (Faostat, 2010). Akdeniz havzası içerisinde yer alan ülkeler, kaliteli sofralık üretim bakımından uygun ekolojik koşullara sahiptirler (Tuzcu, 2000) ve dünya turunçgil ihracatında önemli payları bulunmaktadır. CLAM (Comité de Liaison de l'agrumiculture Méditerranéenne), Nisan 2010 raporunda İspanya 2, ; İsrail ; Fas ;Tunus ve Türkiye nin 1, ton ürünü sezonunda ihraç ettiği bildirilmiştir (CLAM, 2010). Akdeniz ülkeleri iklimsel özellikleri sayesinde turunçgil yetiştiriciliği için elverişli koşullara sahiptir. Ancak, Akdeniz bölgesi topraklarının yüksek kireçli yapıda olması nedeniyle bu bölgede yetiştirilen meyve ağaçlarında demir (Fe) noksanlıkları görülmektedir. Demir noksanlığı alkali yapıya sahip, kireçli topraklarda yetiştirilen bitkilerde sıklıkla görülen bir sorun olup, Fe klorozu çok kireçli topraklarda nemli ve yarı-nemli iklime sahip alanlarda yetiştirilen bitkilerin bir çoğunu olumsuz şekilde etkilemektedir (Yadav ve Singh, 1988; Lopez-Millan ve ark., 2000; Vallejo ve ark., 2000). Ülkemizin de içinde yer aldığı Akdeniz havzasındaki meyve ağaçlarının %20-50 si Fe klorozu ile ilgili sıkıntı yaşamaktadır (Pestana ve ark., 2005). Yerkabuğunda fazla miktarda Fe bulunmasına rağmen, özellikle iyi havalanan kireçli topraklarda okside olup, hidroksil bileşikler meydana getirdiğinden düşük çözünürlüklü olmaları nedeniyle bitkiler tarafından alınamazlar (Lindsay ve Schwap, 1982; Zocchi ve ark., 2007). Toprak solüsyonundaki yüksek miktarda bikarbonat konsantrasyonu yüksek ph ile karakterize edilmektedir (Mengel, 1994). Akdeniz bölgesi topraklarının ph sı, 2

24 1. GİRİŞ Meral İNCESU kalsiyum ve magnezyum karbonatlarının güçlü tamponlama etkisiyle dir (Pestana ve ark., 2005). Kireçli topraklardaki yüksek bikarbonat içeriği ve yüksek ph, kirece bağlı Fe klorozu olarak tanımlanır. Demir elementinin okside olarak Fe +2 den Fe +3 e yükseltgenmesi ve Fe(OH) 3 olarak çökelmesi nedeniyle oluşan yüksek ph da Fe alımı azalır. Genellikle Fe in ph nın 4 ün üstüne çıktığı her bir birimde alımının 1000 defa azaldığı, ayrıca Fe alımının ph nın 7.4 ve 8.5 aralığında minimum olduğu bildirilmektedir (Byrne ve ark., 1995). Demir, canlı organizmaların tümü için gerekli olan ve yerkabuğunda en fazla bulunan dördüncü elementtir (Marshner, 1995). Canlı organizmaların birçok biyokimyasal olayında Fe oldukça önemlidir, solunum ve hücre bölünmesi gibi çok önemli hücresel olaylarda proteinlerin bir bileşeni olarak, terleme ve fotosentez gibi önemli biyolojik olayların indirgeme aşamalarında ve klorofil biyosentezinde görev alır (Einsenstein ve Blemings, 1998; Zocchi ve ark., 2007). Ayrıca, Fe elementinin klorofil sentezinde önemli bir yere sahip olduğu, klorofilin öncü maddesi olan S- aminolevulinik asitin sentezini etkilediği ve Fe içeren bileşiklerin en çok bilinen işlevinin solunum sırasında oksijenin suya indirgenmesi olduğu belirtilmektedir (Çakmak ve Engels, 2000; Güzel ve ark., 2004). WHO (Dünya Sağlık Örgütü) 2004 yılında Fe noksanlığının insanlarda beslenme bozukluğuna yol açtığını bildirmiştir. İnsan beslenmesinde Fe, hücre metabolizması için hem gerekli bir besin ve hem de potansiyel zararlı bir maddedir. Organizmada, hücrenin Fe ihtiyacını karşılayacak, ancak zarar vermeyecek ölçüde tutulabilmesini sağlaması zorunludur (Celkan, 2006). İnsan beslenmesinde Fe genellikle, heme ve non-heme proteinleri olmak üzere iki şekilde karşılanır. Heme proteinleri hayvansal gıdalardan temin edilir ve diğer besin bileşikleri tarafından etkilenmeden adsorbe edilebilir. Gelişmiş ülkelerde Fe kaynağı genellikle bu şekilde temin edilir. Ancak non-heme proteinleri serbest ya da zayıf kompleksler olup bitkisel kökenlidir. Gelişmekte olan ülkelerde et fiyatlarının yüksek olması nedeniyle Fe kaynağı bitkilerden, non-heme proteinleri şeklinde karşılanır (Vasconcelos ve Grusak, 2006). Bitkilerde inorganik formda bulunan non-heme proteinlerinin emilimi C vitamini ile artış gösterir. Vejeteryanlar ya da az et tüketebilen insanlarda non-heme 3

25 1. GİRİŞ Meral İNCESU proteinlerinin elverişliliği heme proteinlerden düşüktür ve bu Fe eksikliği riskini arttırarak anemi problemini ortaya çıkarabilir. Anemi, dünyada en yaygın görülen beslenmeye dayalı bir hastalıktır; büyüme geriliklerine ve fiziksel performansta düşüşlere neden olur. C vitamini açısından oldukça yüksek olan turunçgil meyvelerinin tüketimi anemi probleminin önlenmesine yardımcı olur (Economos ve Clay, 2010). C vitamini açısından zengin olan turunçgil bitkileri, Fe klorozuna duyarlı olarak bilinirler ve yüksek miktarda kireç içeren topraklardaki turunçgil bitkilerinde en sık görülen beslenme problemi Fe klorozudur (Choliaras ve ark., 2004c). Demir noksanlığı gösteren şeftali ve portakal ağaçlarında verim düşüklüğü, meyve olgunlaşmasının gecikmesi, meyve kalitesinin düşmesi gibi olumsuzluklar gözlemlenmektedir (Abadia ve ark., 1999; Pestana ve ark., 2005). Dünyada ve Türkiye de büyük öneme sahip turunçgiller genellikle tohum, çelik ve diğer vegetatif yöntemlerle kolaylıkla çoğaltılabilirlerse de özellikle başta hastalıklar olmak üzere, çeşitli toprak ve iklim koşullarına uyabilmeleri için anaç kullanılması zorunluluğu ortaya çıkmaktadır (Yıldırım, 1996) lü yılların ortalarına kadar turunçgiller tohum yoluyla çoğaltılmışlardır. 15. yy. da aşılama turunçgillerde pratik olarak kullanılabilen bir yöntem olmasına rağmen, Azore adalarında pyhtopthora (kök boğazı çürüklüğü) hastalığının görülmesinden sonra aşıyla çoğaltım yaygınlık kazanmıştır. Bu hastalığın özellikle portakallarda kayıplara yol açtığı fark edilmiştir. Daha sonra pyhtopthora hastalığı Akdeniz ülkelerinde de yaygınlık kazanmıştır. Pyhtopthora hastalığının sporları çoğaltılarak dayanıklı anaç bulunmaya çalışılmış; turunç anacının diğerlerinden daha tolerant olduğu saptanmış ve turunç anacının kullanımı yaygınlık kazanmıştır (Castle, 1987) yılında turunç anacı üzerine aşılı bitkilerin tristeza (CTV) yüzünden öldükleri ve turuncun tristezaya duyarlı olduğu belirlenmiştir. (Castle, 1987). CTV, turunçgillerin anavatanı olan Asya orjinlidir ve muhtemelen yüksek derecede CTV ye tolerant turunçgillerin yetiştirilmesi nedeniyle Asya da tanımlanamamıştır. Turunçgillerin Avrupa ya ve Amerika ya taşınımları tohum yoluyla gerçekleştiğinden ve CTV nin tohumla bulaşmaması nedeniyle, bu bölgelerdeki 4

26 1. GİRİŞ Meral İNCESU turunçgil ağaçları başlangıçta CTV ile infekteli olmamışlardır. Phytophthora etmeninin neden olduğu gövde zamklanması ve kök çürüklüğü hastalığına tolerant olması nedeniyle yaygınlaşan turunç anacının CTV ye duyarlılığı dünya turunçgil alanlarında çok büyük tahribatlara yol açmıştır. CTV ilk olarak 1930 larda turunçgil üretiminin %90 nının turunç üzerinde gerçekleştiği Arjantin de rapor edilmiştir. Daha sonra ani geriye ölümler, Avustralya ve Yeni Zelanda da 1940 yılında tanımlanmıştır. Bununla beraber Güney Afrika da 1900, Java da (Endonezya) 1928, Arjantin de 1930, Brezilya da 1937 ve Kaliforniya da 1939 yılında bu hastalığın belirtileri görülmüş, fakat önceleri bunun anaç-kalem uyuşmazlığı olduğu düşünülmüştür yılında Güney Amerika da uyuşmazlığın bu denli bir salgın gösteremeyeceğinden yola çıkarak bunun virüs kökenli bir hastalık olduğu bildirilmiştir (Mooney ve Harty, 1992). Bu salgınlardan sonra Brezilya da Rangpur laymı (Citrus limonia Osb.) ve Kaliforniya da Troyer sitranjı turunç yerine kullanılmıştır (Castle, 1987). CTV, turunçgil yetiştiriciliğinin yapıldığı hemen her yerde bulunmaktadır ve bir çok afitle taşınımı gerçekleşmektedir. Toxoptera citricidus en etkin vektörü olarak bilinmektedir ancak Avrupa ülkelerinde bu vektörün varlığı bildirilmemektedir (EPPO /CABI, 1997). Akdeniz havzasındaki turunçgil yetiştiriciliğinde yaygın olarak kullanılan, kireçli ve oldukça değişik karakterdeki topraklara uygunluk gösteren turunç anacı kök boğazı çürüklüğüne tolerant olması, ticari çeşitlerle genellikle iyi uyuşması, kolaylıkla çoğaltılabilmesi, %85-90 oranında nüseller embriyo oluşturması ve bir örnek çöğür vermesi sebebiyle tercih edilmektedir (Özsan, 1979). Ancak, son yıllarda Portekiz ve İspanya ya girdiği belirtilen Toxoptera citricidus un ülkemize taşınması halinde geçmiş yıllarda birçok ülkede yaşanan epidemi ve ağaç ölümleri ülkemiz için de söz konusu olabilecektir. Çünkü turunç anacı Türkiye de kullanılan turunçgil anaçlarının %96 sını oluşturmaktadır. Bu nedenle CTV hastalığı turunçgil üretim alanlarımızın büyük bir kısmını tehdit etmektedir (Yeşiloğlu ve ark., 2007). Ülkemizde var olan CTV hastalığının epidemi yapma olasılığına karşı sahip olduğumuz turunçgil alanlarının korunması için, diğer turunçgil üreticisi ülkelerin yaptığı gibi ivedelikle önlemlerin alınması gerekmektedir. 5

27 1. GİRİŞ Meral İNCESU Varolan üç yapraklı ve melezleri bu hastalığa tolerant olmakla birlikte, yüksek ph lı topraklarda başta Fe olmak üzere birçok mikroelement noksanlıkları göstermektedir. Yaprak gübrelemeleri ile mikroelement noksanlıkları giderilse dahi gübrelerin gerek insan sağlığına olumsuz etkileri gerekse de girdi masraflarını arttırması ve ekonomik olmaması nedeniyle yüksek ph lı koşullara iyi adapte olacak, CTV hastalığına, soğuklara, kök boğazı çürüklüğüne (Phytophthora citrophthora (Sm.et Sm.) Leonian) ve uçkurutan (Phoma tracheiphila (Petri) Kanc et Ghik.) hastalığına tolerant, verime ve kaliteye olumlu etki yapan turunca alternatif yeni anaçların bulunması zorunlu hale gelmiştir. Turunçgillerin cins, tür ve çeşit yönünden büyük zenginlikler göstermeleri ve bunların birçoğunun anaç olarak kullanılabilmesine karşın, istenen özelliklerin hepsini kapsayan bir anaç yoktur (Yeşiloğlu ve İncesu, 2009). Turunçgillerde ilk ıslah çalışmaları Florida da Webber ve Swingle tarafından başlatılmıştır yılında Washington Navel portakalı ve birçok yerli portakal, altıntop ve mandarin çeşitlerinin ebeveyn olarak kullanılmasıyla melezleme çalışmaları yapılmış ancak yılında meydana gelen donlarda tüm melez bitkiler kaybedilmiştir yılında soğuklara tolerant anaç bulmak ümidiyle Poncirus trifoliata ile Ruby portakalı arasında yapılan melezlemeler sonucunda 54 sitranj elde edilmiştir. Troyer ve Carrizo sitranjları, Washington Navel ile Poncirus trifoliata nın melezlenmesi ile elde edilmiştir (Mortensen, 1954; Cooper ve ark., 1962). Islah çalışmaları yeni teknoloji adı verilen moleküler genetik, doku kültürü ve rekombinant DNA teknolojisi gibi konuları kapsayan teknikler ile yeni olanaklar sağlamıştır (Aka-Kaçar ve ark., 2009). Seçici yetiştiricilik tarzındaki genetik müdahaleler, tarımsal ilerlemenin temelini oluşturmuştur. Watson ve Crick in 1953 yılında DNA nın moleküler yapısını aydınlatmasıyla başlayan biyolojik devrim, DNA molekülünün yapısı, kalıtım, mutasyon ve evrim mekanizmalarıyla ilgili çözümler sağlamıştır (Öner, 2003). Turunçgil ıslah çalışmalarında moleküler teknikler kullanılarak bugüne kadar linkage haritalama, fiziksel haritalama, 6

28 1. GİRİŞ Meral İNCESU sekansların belirlenmesi ve fonksiyonel genomik çalışmaları yapılmıştır (Talon ve Gmitter, 2008). Son yıllarda birçok organizmanın DNA baz dizileri belirlenmiş olmasına rağmen, bu DNA baz dizileri kendi başlarına bir şey ifade etmezler (Şahin-Çevik, 2005). Mikroarrayler yüksek çıktılı gen ifade incelemeleri için rutin araç olmaya yönelik bir teknolojidir ve bu yöntemle aynı anda pek çok genin ifadesi ile ilgili bilgi almak mümkündür. Mikroarray; gen ifade profillerinin araştırılması, mutasyon taraması ve analizi, genlerin ve klonların haritalanması, mikrodelesyon ve kromozomal aberasyonların tespitinde kullanılabilmektedir (Boylu-Akyerli, 2011) Bu nedenle, mikroarray analizinin sonucunda elde edilen ve farklı gelişme evresinde, farklı koşullarda ve farklı genotiplerde bulunan birçok bitki geni, fonksiyonlarına göre gruplandırılmaktadır (Şahin-Çevik, 2005). Örneğin ışıkta ve karanlıkta yetiştirilen Arabidopsis bitkilerinde mikroarray çalışması yapıldığında ışıkla yönetilen birçok geni belirlemek mümkün olmaktadır. Bu genlerin birçoğu yeni bulunan genler olacağı için daha önce veri tabanında bulunan hiçbir genle benzerlik göstermeyebilir, ama en azından bu genlerin ışıkla yönetilen genler olduğu ve hücrede ışıkla birlikte aktivitelerinin arttığı veya azaldığı hakkında da bilgi sahibi olunur (Şahin-Çevik, 2005). Bu nedenle, mikroarray son yıllarda birçok bilim adamı tarafından bitkilerde abiyotik ve biyotik stresler, meyve olgunlaşması, tohum gelişmesi ve nitrat asimilasyonu sırasında aktif olan ya da aktivitelerini azaltan genlerin bulunmasında kullanılmıştır. Moleküler biyoloji alanında olan tüm bu yeniliklerin turunçgillerde yapılan ıslah çalışmalarında da aktif bir şekilde kullanıldığı görülmektedir. Klasik ıslah yöntemleriyle uzun yıllar alacak çalışmalar bu sayede kısa sürede bitirilebilmektedir. Bu çalışma, turunçgil sektörünün ihtiyaç duyduğu, CTV ye tolerant ve aynı zamanda kireçli toprak koşullarında Fe noksanlığına duyarlı olmayan bir anaç eldesi için gerekli bilgileri edinmek amacıyla yürütülmüştür. Bunu sağlamak için; tarama çalışmalarında kullanılan 16 turunçgil cins, tür ve çeşidinin yüksek ph lı koşullarda Fe klorozuna karşı tepkileri kontrollü koşullarda incelenmiş ve aynı genotipler doğal kireçli toprakta da denemeye alınarak kontrollü 7

29 1. GİRİŞ Meral İNCESU koşullardaki tepkileri ile karşılaştırılmıştır. Ayrıca kireçli koşullarda Fe klorozuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklı çeşitlerinde mikroarray çalışması yapılarak bu genotiplerin gen düzeyinde birbirinden farklılıkları incelenmiştir. Ek olarak, kireçli koşullarda Fe klorozuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklı çeşitlerinde 2.5 yaşlı fidanlarda Fe klorozuna karşı toleranslılıklarının fizyolojik açıdan incelenmesi yapılarak, moleküler ve fizyolojik tepkilerinin tümü bir arada incelenmeye çalışılmıştır. 8

30 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Demir (Fe), canlı organizmaların tümü için gerekli olan ve yerkabuğunda en fazla bulunan dördüncü elementtir (Marshner, 1995). Demir topraklarda oksit, hidroksit, ve silikat mineralleri şeklinde bulunduğu gibi amorf oksitler şeklinde ve adsorbe edilmiş ya da organik madde ile kompleks oluşturmuş veya toprak çözeltisinde çözünmüş şekillerde bulunur (Kacar ve Katkat, 2006). Topraklarda toplam Fe miktarı genellikle yüksek olmasına karşın, bitkiye yarayışlı Fe miktarı azdır ve bu nedenle Fe klorozu kireçli topraklarda karşılaşılan en yaygın problemdir (Marschner, 1995; Mengel ve ark., 2001; Fernandez ve ark., 2006). Yüksek ph, toprak çözeltisindeki ve sulama suyundaki bikarbonat iyonlarının miktarı; ortamda bulunan kalsiyum ve magnezyum karbonatlarının miktarları; ortamda fosfat iyonlarının fazla miktarda bulunması; ortamda bakır, mangan, molibden ve çinko gibi ağır metallerin fazla miktarda bulunması topraktaki Fe in yarayışlılığını etkileyen faktörlerdir (Kacar ve Katkat, 2006). Genellikle Fe in ph nın 4 ün üstüne çıktığı her bir birimde alımının 1000 defa azaldığı, ayrıca Fe alımının ph nın 7.4 ve 8.5 aralığında minimum olduğu bildirilmektedir (Byrne ve ark., 1995). Güzel ve ark. (2004) nın belirttiği denklem Fe +3 ün ph ile olan ilişkisini göstermektedir: Fe(OH) 3 (toprak) + 3H + Fe H 2 O Demirin çözünürlülüğü büyük ölçüde Fe(OH) 3 ün çözünürlük durumuna bağlıdır. ph nın yükselmesi Fe +3 iyonlarının aktivitesini azaltır ve yüksek ph da Fe(OH) + 2, Fe(OH) 3 ve Fe(OH) - 4 bileşikleri oluşur (Kacar ve Katkat, 2006). Demir elementinin çözünürlülüğü ph da minimuma iner. Asitli topraklarda inorganik Fe in çözünürlülük oranının kireçli topraklara göre yüksek olmasının nedeni budur ve bu sebeple kireçli topraklarda Fe klorozu problemi yaşanır. Su baskınlarının meydana geldiği topraklarda oksijensiz solunum gerçekleştiren bakteriler sayesinde Fe +3 iyonları, Fe +2 ye indirgenir. İyi havalanan topraklarda ise 9

31 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Fe +2 iyonları, Fe +3 e yükseltgenir ve bu sırada ortaya çıkan H + sayesinde ph düşer (Mengel ve Kirkby, 1982). Ancak, iyi havalanan kireçli topraklarda bitkilerin yeteri kadar Fe alamamalarının temel nedeni Fe +3 oksitlerin çözünür olmamalarıdır. Solunumun yüksek olduğu genç ve aktif kök yöresinde, Fe +3 ün fazla indirgenmesi ve Fe +3 kileytlerinin çözünmesi yarayışlı Fe miktarının göreceli olarak artmasına neden olmaktadır (Lindsay ve Schwab, 1982; Mengel ve Geurtzen, 1986; Kacar ve Katkat, 2006). Yaşlı yapraklardan genç yapraklara Fe in aktarılamaması nedeniyle bitki, büyüme organlarının Fe gereksinimini ortamdan Fe i sürekli alarak gidermek durumundadır. Kök etki alanı içerisinde toprakta Fe, Fe +2 ve Fe +3 iyonları şeklinde bulunduğu gibi, organik bağlı ya da kileytler şeklinde de bulunur (Kacar ve Katkat, 2006). Topraklarda bulunan diğer katyonlarla karşılaştırıldığında, toprak çözeltisindeki Fe konsantrasyonu çok düşüktür. İyi drenajlı, havalanan topraklarda toprak çözeltisinin Fe +2 konsantrasyonu çözeltide başat olarak bulunan Fe +3 konsantrasyonundan daha azdır (Güzel ve ark., 2004). Demirin bitki bünyesine taşınabilmesi ve metabolik olarak değerlendirilebilmesi için Fe in Fe +2 şekline indirgenmesi gerekir. İndirgenme sırasında Fe +3 kileytinin durağanlığı bozulur ve bağımsız hale geçen Fe +2 iyonundan bitki yararlanır (Kacar ve Katkat, 2006). Bitkiler toprakta bulunan Fe den yararlanabilmek için özel mekanizmalar geliştirmişlerdir (Römheld ve Marschner,1986; Römheld, 1987; Marschner ve Römheld, 1994; Brancadoro ve ark., 1995). Dikotiledonlar ve buğdaygiller dışındaki monokotiledonlar tarafından geliştirilen mekanizma Strateji 1 olarak adlandırılır (Marschner ve Römheld, 1994; Rengel, 2005). Strateji 1 bitkileri plazma membranına bağlı artan redüktaz ve proton salgısı, ayrıca indirgeyici ve çoğunlukla fenolik bileşikler olan şelatizörlerin artışı olmak üzere temelde 3 bileşenle karakterize edilmektedir (Marschner ve Römheld, 1994). Strateji 1 bitkileri topraktaki Fe den daha fazla yararlanabilmek için, kökhücre plazma membranında Fe + ³ ü, Fe + ² ye indirgerler. Ayrıca bu gruba dahil bitkiler, rizosferde kimyasal değişimler meydana getirerek, asidifikasyon ve indirgenme ve/veya şelatize maddelerini salgılayarak; kökte rizodermal transfer 10

32 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU hücrelerini ve daha fazla kılcal kök oluşumunu sağlayarak Fe alımını gerçekleşmektedirler (Römheld ve Marschner, 1986; Römheld, 1987; Bienfait, 1988; Rengel, 2005). Epidermal kök hücrelerinde Fe noksanlığı plazma zarına bağlı redüktaz sisteminin çalışmasını sağlamaktadır. Bu sistem Fe i indirgemek için ihtiyaç duyduğu elektronu sitosolik NADH yada NADPH den karşılar. Bu Fe noksanlığının teşvik ettiği redüktaz aktivitesi Strateji 1 bitkilerine özgüdür ve düşük Fe içeren topraklara adapte olmak için Strateji 1 bitkilerinin geliştirdiği bir mekanizmadır (Moog ve Brüggemann, 1994; Marschner ve Römheld, 1994; Nikolic ve Römheld, 1999). Strateji 1 bitkilerinin Fe +3 ü Fe +2 ye indirgemesini enzimatik yollarla gerçekleştirdiği Chaney ve ark (1972) tarafından bildirilmiştir. Birçok çalışmada Fe redüktaz aktivitesinin genç kök uçları (Römheld ve Marshner 1981; Zheng ve ark. 2003; Jin ve ark., 2008) ve orta uç kök bölgeleri veya genç kök uçları (Marschner ve ark. 1986; Jin ve ark., 2008) tarafından gerçekleştiği belirtilmiştir. Bu nedenle Strateji 1 bitkilerinde Fe eksikliği koşullarında kök ucu yoğunluğu ve Fe redüktaz aktivitesi beklenmektedir (Jin ve ark., 2008). Redüktaz aktivitesi Strateji 1 bitkilerinin Fe noksanlığında gerçekleştirdikleri en yaygın bilinen ve Fe in absorbsiyonu için gerekli bir tepkidir. Demir redüktaz aktivitesi kök epidermal hücrelerinde yer alan plazma membranında, transmembran redoks sistemi yoluyla gerçekleşir. Köklerde Fe redüktaz aktivitesini tetikleyen 2 aktivite gerçekleşir. Birincisi Fe(III) ü indirgeme yeteneğindeki şelatlar ve ferricyanide; ikincisi ise sadece ferricyanide ile gerçekleşen indirgemedir. Turbo redüktaz olarakta adlandırılan Fe(III) şelat redüktaz sisteminin Fe noksanlığı gösteren bitkilerin genç ve lateral kök uçlarındaki epidermal hücrelerde gerçekleştiği düşünülmektedir. Ferricyanide redüktaz sisteminin ise bütün kök hücreleri tarafından gerçekleştirildiği öngörülmektedir. Ancak, bu aktivitelerinin gerçekleştiği yerler konusunda yapılan çalışmalar bu görüşleri desteklememektedir (Guerinot ve Yi, 1994). Strateji 1 bitkileri, fizyolojik ve biyokimyasal mekanizmalar geliştirmiştir. Bunlardan en önemlisi kök yüzeyindeki Fe 3+ ün NAD(P)H ye bağlı olarak 11

33 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU indirgenmesi ve böylece plazma zarından geçişi yapmasıdır. Ayrıca kök plazmalemmasında rizosfer asidifikasyonunu sağlayan H + -ATPase aktivitesini arttırmaktır (Jelali ve ark., 2009). ATPase tarafından sağlanan protonlarla rizosfere yapılan asidifikasyon Strateji 1 bitkilerinin Feeksikliği karşısında oluşturdukları bir başka adaptasyon mekanizmasıdır, bu sayede rizosferde bulunan Fe in çözünebilirliği gerçekleşir. Rizosfer asidifikasyonu, rizosfer ph sının düşük ve çözünebilir Fe konsantrasyonunun düşük olduğu ortamda bulunan Fe noksanlığı çeken bitki köklerinin proton salgılaması ile gerçekleşir. Proton salımı toprak çözeltisindeki ph nın 3 veya daha düşük olması durumunda oldukça hızlıdır. Proton salımını gerçekleştiren ajanlar Fe, NH + 4, ve K + noksanlıklarında gerçekleşir. Öncelikle proton pompalayan H + -ATPase aktive olması ve bitkinin Fe noksanlığında rizosferdeki asidifikasyonu arttırması, katyon/anyonlara ve bitkinin azotla beslenme durumuna bağlıdır (Guerinot ve Yi, 1994). Strateji 1 bitkilerinde köklerden proton ve riboflavin (B 2 vitamini) salgısı Fe etkin ayçiçeği bitkisinde bildirilmiştir (Von Wiren ve ark., 1993). Zocchi (2006), fosfonelolpiruvat karboksilaz (phosphoenolpyruvate carboxylase) (PEPC) aktivitesinin Fe noksanlığından etkilendiğini ve bu nedenle sitrat ve malat gibi karboksillerin rizosfere salımının topraktaki Fe in kullanılabilir hale gelmesinde önemli olduğunu düşündürdüğünü belirtmiştir. Ryan ve ark., (2001), bildirdiklerine göre köklerdeki organik bileşiklerin birikimi Fe noksanlığı çeken bitkilerde artış göstermektedir. Bu çerçevede Landsberg (1981), organik asitlerin köklerden salgılanan H + iyonlarının kaynağı olarak görüldüğünü bildirmiştir. Rombola ve ark., (2002) ve Ollat ve ark., (2003), başlıca karboksil anyonları olan sitrat ve malatın kök dokularında biriktiğini ve Fe noksanlığı durumunda salgılandığını belirtmişlerdir. Jin ve ark., (2008), fenolik bileşiklerin Fe noksanlığı çeken Strateji 1 bitkilerinde sıklıkla rapor edildiğini bildirmiştir. Bu metabolitlerin potansiyel Fe şelatizörleri olduğu düşünülmektedir. Yer fıstığı bitkisinde kafeik asit gibi fenoliklerin indirgen yapıda olduğu ve FeIII ün redükte edilmesinde direkt rol aldığı bilinmektedir. Ayrıca ayçiçeği bitkilerinde Fe noksanlığı altında o-diphenolics birikimi olduğunu ve benzer 12

34 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU salgıların domates ve soya fasulyesinde de bulunduğunu belirtmişlerdir. Ancak bu indirgen maddelerin artışı Fe noksanlığı koşullarında ve ph değerinin 4,5 olduğu zaman gerçekleşmiştir (Olsen ve ark., 1981). Strateji 2 ise buğdaygil bitkileri tarafından geliştirilmiştir ve fitosideroforların rizosfere salgısının artışı şeklinde gerçekleşmektedir. Bu salgı Fe +3 ün rizosferde hareketli hale geçmesini sağlamakta ve bu sayede Fe kök hücrelerine Fe-fitosiderefor formunda alınmaktadır (Özdemir, 2005). Fitosiderofor adı verilen maddeler, mugineik ve avenik asitler gibi protein olmayan asitlerdir. Buğdaygil bitkilerinde kök uçlarında salgılanan fitosideroforlar rizosferde Fe +3 ile kileyt oluştururlar. Kileytten ayrılan ve indirgenen Fe, Fe +2 şeklinde kök hücreleri tarafından alınır (Kacar ve Katkat, 2006). Fitosideroforların salgısı ve Fe- fitosiderofor komplekslerinin alımı farklı genetik kontroller altındadır. Fitosideroforların salgılanma miktarı türlerin sahip olduğu Fe etkinliği ile doğru orantılıdır. Demir eksikliği koşullarında Fe alımı etkin olan buğday ve yulaf çeşitlerinin, Fe alımı etkinliği düşük olan çeşitlere göre daha fazla fitosiderofor salgıladıkları bulunmuştur (Rengel, 2005). Strateji 1 ve Strateji 2 olarak adlandırılan mekanizmaların dışında spesifik olmayan bir başka mekanizma daha söz konusudur. Bu gruba dahil olan Fe etkin bitkiler, Fe eksikliğinde kök salgılarıyla rizosfer ph sını düşürerek daha fazla katyon alırlar. Ayrıca bu bitkiler kökleriyle organik asit ve fotosentez ürünlerini salgılamak suretiyle rizosferde mikroorganizmaların güçlenip çoğalmalarına dolayısıyla rizosfer ph sının düşmesine, redoks potansiyel gücünün artmasına ve Fe +3 ün daha fazla indirgenerek Fe +2 nin oluşmasına neden olurlar (Kacar ve Katkat, 2006). Bu mekanizmaların etkin geliştiği çeşitler efficient (etkin) veya resistant (dayanıklı) çeşitler ve tersi durumlar ise inefficient (etkin olmayan) veya dayanıksız (duyarlı) çeşitler olarak adlandırılmaktadırlar (Römheld ve Marschner, 1986; Rengel, 2005). 13

35 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU 2.1. Bitki Bünyesinde Demirin Taşınımı Demirin bitki bünyesinde taşınımı konusunda eksik noktalar bulunmaktadır. Strateji 1 bitkilerinde Fe(III), sitoplazmaya transfer edilmeden önce indirgenir ve Fe in bitki köklerine alınımı kontrollü olarak gerçekleşir (Zhang, 1995; Bauer ve Hell, 2006). Toprakta alınabilir Fe konsantrasyonun düşük olması nedeniyle, Fe taşınım mekanizması Fe noksanlığında artış gösterir. Bitkiler bünyelerine aldıkları Fe i uzun mesafede ve kısa mesafede taşınımını gerçekleştirerek hedef moleküllere ulaştırırlar. Köklerden, sürgünlere veya kotiledonlardan genç sürgünlere gerçekleştirilen uzun mesafe taşınımda Fe, ksilemden floeme geçerek bu taşınımı 2 adımda gerçekleştirir. Örneğin, Fe ksilemde iken bitkinin uç sürgünleri yerine yapraklarına taşınır. Ayrıca, Fe yapraktan verildiği zaman simplastik yolu izleyerek floeme taşınır. Bu durum uç sürgünlerdeki ksilem borularının yeterince gelişmemesi ve bu bölgelerdeki terlemenin az olması sonucu taşınımın gerçekleşememesi şeklinde açıklanmaktadır (Bauer ve Hell, 2006). Ayçiçeğinde Fe in ksilemde taşınımının terlemeyle birlikte artış gösterdiği bildirmiştir (Schulz ve Marschner., 1969). Ayrıca Fe noksanlığı çeken bitkilerin genç yapraklarındaki klorozun, terlemenin az olması nedeniyle Fe taşınımının gerçekleşememesine bağlı olduğu düşünülmektedir (Bauer ve Hell, 2006). Ksilemde Fe komplekslerinin büyük çoğunluğu ferrik sitrattır (Bauer ve Hell, 2006). Demir açlığı çeken bitkilerde başta sitrat ve malat olmak üzere organik asit birikimi, köklerde, ksilemde, yaprak apoplastlarında ve yaprağın tümünde görülür. Bu organik asit birikimi Fe eksikliği çeken bitkilerde uzun mesafeli Fe taşınımını arttırır (Larbi ve ark.,2010). Kısa mesafeli taşınım ise apoplastlarda hücrelerarası veya simplastlarda hücre içinde meydana gelir. Böylelikle tüm hücre ve dokulara Fe ulaşmış olur. Kısa mesafeli taşınımda bitki organlarında bulunan Fe apoplastlara taşınır. Apoplastik Fe in hücre içine taşınımında, topraktaki Fe in kök epidermisine taşınımı ile benzer yolu izlediği düşünülmektedir. Demir, kök yüzeyindeki apoplastlardan, ksileme 14

36 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU taşınır. Ksilemde ise Fe(II)-nikotinamin kompleksi veya fitosiderofer benzeri şelatörlerle Fe ve diğer ağır metallerin yer aldığı düşünülmektedir. Son adım olarak, hücre içine ulaşan Fe, hedef bileşiklere taşınır. Hücre içinde bulunan organellerin kendi membranlarındaki spesifik taşıyıcılarla Fe i aldıkları düşünülmektedir. Çok az sayıda Fe taşınım proteini organel membranlarına lokalize olmuştur. Örneğin AtNRAMP3 proteini vakuol membranında yer alır ve buradan Fe eksikliği durumunda dışarıya gönderilir. Kloroplastlarda ferritin olarak depolanan Fe, kloroplastlara uniport mekanizmasıyla taşınır. Mitokondriler Fe elementinin bir diğer hedef noktasıdır ve Fe burada çoğunlukla Fe-S clusterında yeralır (Bauer ve Hell, 2006). Ayrıca Zhang (1995), Fe in floem yoluyla da taşınabildiğini belirtmiştir. Araştırıcı yaşlı yapraklara uygulanan radyoaktif Fe in, bitkinin kök ve genç yapraklarına aktarıldığını bildirmiştir Bitkilerde Demirin Fonksiyonları Canlı organizmaların birçok biyokimyasal olayında Fe oldukça önemlidir, solunum ve hücre bölünmesi gibi çok önemli hücresel olaylarda proteinlerin bir bileşeni olarak, terleme ve fotosentez gibi önemli biyolojik olayların indirgeme aşamalarında ve klorofil biyosentezinde görev alır (Einsenstein ve Blemings, 1998; Zocchi ve ark., 2007). Demirin bitkinin fizyolojik ve biyokimyasal olaylarında önemli bir element olduğu, birçok enzimde kofaktör olarak görev yaptığı ve klorofil oluşumunda etkin bir rol üstlendiği bilinmektedir (Marshner, 1995). Yapraklarda bulunan Fe in yaklaşık %80 i kloroplastlarda lokalize olmuştur ve bunun yaklaşık %60 ının toplam Fe olduğu belirtilmektedir (Terry ve Abadia, 1986). Demir apolastlarda depolanabilmesine rağmen, Fe in hücre içi depolanmasında vakuol ve plastidler gibi organellerin büyük rolü vardır. Plastidlerde ferritin olarak depolanan Fe in çevresel strese karşı bitkinin direncini korumak gibi önemli bir işlevi vardır (Briat ve ark., 2007). 15

37 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Demir eksikliğinin esas olarak kloroplastlarda yapısal ve fonksiyonel etkiler yarattığı ve yapraklardaki Fe konsantrasyonunun azalmasıyla klorofil miktarında düşüşler meydana geldiği bildirilmiştir (Iturbe-Ormaexte ve ark., 1995; Ranieri ve ark., 2001; Gogorcena ve ark., 2004). Demirin kloroplastlardaki en önemli rolü tilakoid elektron taşıma sisteminde görev yapmasıdır (Briat ve ark., 2007). Tilakoid membranlarında bulunan yaklaşık 20 Fe atomunun fotosentezin 1. ve 2. aşamalarında (PSI ve PS II) elektron taşıma zincirinde görev aldığı bilinmektedir. Kloroplastlardaki Fe in yüksek bulunmasının nedeni tilakoid membranlarının yapısal ve fonksiyonel bütünlüğü, ferrodoksin ve klorofilin biyosentezidir. Demir noksanlığı gösteren yapraklarda PSI etkinliği, PSII etkinliğine göre çok daha fazla etkilenir. Demir noksanlığı çeken yapraklardaki fotosentez oranının düşüklüğü, şeker ve nişasta oranını da etkilemektedir (Terry ve Abadia, 1986; Marshner, 1995). Ayrıca, Fe noksanlığının kloroplastların boyutu ve içerdikleri protein miktarı üzerindeki etkisi; yaprak gelişimi, hücre sayısı veya hücre başına düşen kloroplast sayısının miktarıyla karşılaştırıldığında çok daha baskındır. Ancak, şiddetli kloroz durumunda hücre bölünmesi engellendiği için yaprak gelişimi gerilemektedir. Demir protein sentezinde görev aldığından dolayı, Fe noksanlığında ribozomların sayısı azalmaktadır. Demir noksanlığında, kloroplastlardaki protein sentezi sitoplazmadaki protein sentezine göre çok daha fazla etkilenir. Klorotik mısır yapraklarında toplam protein miktarının %25 oranında azaldığı ve bunun %82 sinin kloroplastlarda meydana geldiği bulunmuştur. Bunun kloroplastik mrna ve rrna nın Fe ihtiyacına bağlı olmasından ileri geldiği öne sürülmektedir (Marshner, 1995). Heme-proteinleri ve Fe-S proteinleri olmak üzere yapısında Fe bulunan iki büyük protein grubu vardır. Heme-proteinleri sitokrom, katalaz, nitrat redüktaz ve leghemoglobin nin yapısında bulunmaktadır. Demire bağlı bu proteinler pek çok metabolik olayda yer almaktadırlar. Sitokromlar fotosentezde elektron taşınımında rol oynamaktadırlar. Sitokrom oksidaz ise solunumun son aşamasında rol alan önemli bir enzimdir. Demir içeren katalaz ve peroksidazlar hücreyi, H 2 O 2 (hidrojen peroksit) toksik O 2 türevine karşı koruyucu enzimlerdir. Katalaz enzimi H 2 O 2 i su ve oksijene dönüştürerek yok etmektedir. Ayrıca katalaz, süperoksit radikalini yok eden 16

38 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU bir diğer enzim SOD ile işbirliği yaparak çalışmaktadır. Peroksidaz enzimlerinden askorbat peroksidaz, kloroplastlarda H 2 O 2 i detoksifike etmektedir. Diğer grup peroksidazlar ise (guaiakol peroksidaz olarak adlandırılan peroksidazlar) hücre duvarlarına bağlı olarak bulunmaktadırlar (Daşgan, 1999). Çakmak ve Engels (2000), fotosentetik elektron taşıma sisteminin Fe noksanlığına karşı aşırı hassasiyet gösterdiğini ve Fe eksikliği gösteren bitkinin tipik tepkisinin yapraklarındaki klorofil konsantrasyonunun azalması şeklinde kendini gösterdiğini saptamışlardır. Ayrıca, Fe elementinin klorofilin sentezinde önemli bir yere sahip olduğunu ve klorofilin öncü maddesi olan S-aminolevulinik asitin sentezini etkilediğini bildirmişlerdir. Güzel ve ark., (2004), fotosentez ve solunum süreçleri sırasında oksidasyon ve redüksiyon reaksiyonlarıyla ilişkili olan porfirin moleküllerinin (cytochromes, hemes, hematin, ferrichrome ve leghemoglobin), yapısal içeriğinde Fe in olduğunu; ayrıca toplam hücre Fe nin %75 kadarının kloroplastlarda ve yapraklardaki Fe in yaklaşık %90 ının ise kloroplast ve mitokondri membranlarının lipoproteinlerinde bulunduğunu belirtmişlerdir. Kloroplastlardaki Fe in lokalizasyonu, çeşitli fotosentetik redüksiyon süreçlerinin oluşumu için zorunlu olan sitokromların ve ilk elektron akışı olarak ferrodoksinin varlığını yansıttığını ve Fe içeren bileşiklerin en çok bilinen işlevinin solunum sırasında oksijenin suya indirgenmesi olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, baklagil bitkilerinin kök nodüllerinde bulunan leghemoglobin, azot fiksasyonunda görev yapmaktadır. Fe-S içeren enzimler (nitrogenaz kompleksleri) N un indirgenmesinde görev yaparlar (Kacar ve Katkat, 1998). Fe gerektiren enzimlerden bir diğerinin de etilen biyosentezinde gerekli olan 1- aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) olduğu ve ACC nin etilene dönüşmesinde gerekli olan oksidasyonunun Fe 2+ tarafından katalize edildiği bilinmektedir (Bouzayen ve ark., 1991). Demir noksanlığında heme proteinlerin, katalaz ve peroksidaz aktivitesinin azaldığı (Machold, 1968), demir-kükürt proteinin, ferrodoksinin (Alcaraz, 1986), akotinazın (De Vos ve ark., 1986) ve SOD gibi Fe içeren enzimlerin azaldığı belirtilmiştir (Sevilla ve ark., 1984). Yine Fe içeren enzimlerden lipogenaz 17

39 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU (Hildebrand, 1989) ve depo protein ferritinin (Gaymard ve ark., 1996) Fe noksanlığında azaldığı bilinmektedir. Ancak Fe noksanlığında H-ATPase (Dell Orto ve ark., 2000), Iysyl-tRNA sentezi (Giritch ve ark., 1997) ve adenin phosphoribosytransferase enziminin artış gösterdiği bildirilmiştir Demir Noksanlığında Demir İçeren Enzimlerin Durumları Del Rio ve ark. (1978), 0.60 mg/kg (düşük), 0.96 mg/kg (düşük), 3.0 mg/kg (normal) ve 30 mg/kg (fazla) olmak üzere dört farklı Fe içeren besin çözeltisinde bezelyenin (Pisum sativum L., var. Lincoln) Fe e karşı tepkisini araştırmışlardır. Bu araştırmada klorofil, proteinler, katalaz ve peroksidaz aktiviteleri incelenmiştir. Peroksidaz aktivitesinin Fe in hem eksiklik hem de fazla olduğu koşullarda arttığını, fakat normal Fe uygulaması görmüş bitkilerde azaldığını bildirmişlerdir. Katalaz aktivitesi ile Peroksidaz/katalaz oranının bezelyelerde Fe eksikliğini belirleyecek parametreler olduğunu belirtmişlerdir. Daşgan ve ark., (2003), Demir klorozuna karşı hassas ve dayanıklı olan iki ayrı domates genotipinde yürüttükleri çalışmada yaprak klorozu ve toplam Fe konsantrasyonunun, Fe içeren enzimler ile arasındaki ilişkilerini incelemişlerdir. Demir içeren askorbat peroksidaz, katalaz ve guaiakol peroksidaz enzimleriyle Fe içermeyen ancak, bir stres parametresi olan glutathione redüktaz aktivitesini ölçmüşlerdir. Araştırıcılar, elde ettikleri sonuçlara göre domates genotiplerinde Fe klorozuna karşı dayanıklılığın belirlenmesinde Fe içeren enzimlerden katalazın, toplam Fe konsantrasyonuna göre daha doğru bir parametre olduğunu bildirmişlerdir. Chouliaras ve ark., (2004 a), farklı Fe dozlarının (20 μm Fe-EDDHA (Ph=6), 0 μm Fe-EDDHA (ph=6), 3 μm Fe-EDDHA (ph=6) ve 0,5 g L -1 CaCO mM NaHCO 3 eklenmiş 10 μm Fe-EDDHA (ph=7,5)) yaklaşık 15 cm boyundaki Citrus taiwanica ve Citrus volkameriana anaçlarında meydana getirdiği fizyolojik ve biyokimyasal parametreleri incelemişlerdir. Çalışma sonucunda Taiwanica ve Volkameriana anaçlarının kök-fe indirgeme kapasitesi, rizosfer asidifikasyonu, peroksidaz ve katalaz aktiviteleri ve bitki besin maddeleri birikimini birbirinden farklı bulmuşlardır. Bu fizyolojik parametrelerin turunçgillerdeki tarama 18

40 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU çalışmalarında Fe klorozuna toleranslılığın belirlenmesinde kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Bu çalışmaları sonucunda Volkameriana anacının Fe klorozuna karşı Taiwanica dan daha hassas olduğunu vurgulamışlardır. Chouliaras ve ark., (2004 b)., turunç (Citrus aurantium) ve Swingle sitrumelo (Poncirus trifoliata (L.) Raf. X Citrus paradisi Macf.) üzerine aşılı iki portakal (Citrus sinensis) çeşidinin Fe noksanlığında katalaz ve peroksidaz aktivitesi, bitki-su ilişkileri, stoma iletkenliği ve yaprak ağırlıkları parametrelerini incelemişlerdir. Hoagland besin çözeltisine Fe eklemeyerek Fe noksanlığı yaratmışlar ve bunun sonucunda da katalaz ve peroksidaz aktivitesi, fotosentez, osmotik basınç, turgor ve yaprak ağırlığının önemli derecede azalma gösterdiğini, fakat stoma iletkenliğinin ve yaprak su potansiyelinin değişmediğini bildirmişlerdir. Ancak araştırıcılar, besin çözeltisine NaHCO 3 (10 ve 40 mm) ekledikleri zaman stoma iletkenliği, fotosentez ve turgor basıncının azaldığını; ayrıca, yaprak su potansiyeli ve osmotik basıncın arttığını saptamışlardır. Sönmez ve Kaplan (2004), Antalya da 76 elma bahçesinden aldıkları 90 yeşil ve klorotik yaprakta toplam Fe, klorofil, peroksidaz aktivitelerini incelemişlerdir. Yeşil yapraklarda klorofil ve peroksidaz miktarlarının klorotik yapraklara göre fazla olduğunu ve bu parametrelerin toplam Fe yerine kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Zaharieva ve ark. (2004), su kültüründe, kontrol ve (-) Fe koşullarında şeker kamışı bitkilerinin Fe stresine karşı gösterdikleri tepkileri incelemişlerdir. Klorofil içeriği Fe stresine tabi tutulan bitkilerde kontrole göre azalmış, Fe(III) redüktaz aktivitesi ise Fe eksikliği çeken bitkilerde artmıştır. Köklerde inceledikleri; Askorbat (ASC) aktivitesi Fe stresi bitkilerinde kontrole göre artarken, askorbat peroksidaz (APX) aktivitesi azalmıştır. İndirgenmiş ve okside olmuş glutatyon düzeylerinin Fe stresiyle birlikte artış gösterdiği bildirilmiştir. Araştırıcılar indirgenmiş glutatyon ve askorbat konsantrasyonlarının köklerde Fe stresi altında artış gösterdiğini ve bu parametrelerin Fe in indirgenmesiyle ilgili fonksiyonlarının olabileceğini belirtmişlerdir. Molassiotis ve ark. (2006), adları superoksit (. O - 2 ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), hidroksil radikalleri (. OH) ve single oksijen (O 2 ) olan reaktif oksijen türlerinin (ROT) üretiminin birçok biyotik ve abiyotik stres koşulları altında artış gösterdiğini 19

41 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU bildirmişlerdir. Bu oksijen türlerinin mutasyonlara, DNA hasarlarına, membran lipidlerinin peroksidasyonuna, proteinlerin bozulmasına yol açtığını ve bitki hücrelerinin oksijen türlerine karşı bir savunma mekanizması oluşturmuş olduğuna dikkat çekmişlerdir. Bu mekanizmalardan birincisinin, enzimatik olmayan düşük molekül ağırlıklı askorbat, a-tocopherol, glutathione and karotenoidler gibi antioksidantlar; ikincisinin ise Fe içeren enzimler olan süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve peroksidaz (POD) olduğunu belirtmişlerdir. Bu parametrelerin stres altındaki bitkilerde incelenerek genotipler arasındaki farklılıkların ortaya konulabileceğini vurgulamışlardır. Araştırıcılar GF-677 (Prunus amygdalus X Prunus persica) tolerant; şeftali çöğürü (Prunus persica L.); Barrier (Prunus davidiana X Prunus persica) ve Saint Julien 655/2 (Prunus domestica L.) duyarlı ve Cadaman (Prunus persica X Prunus davidiana) çok duyarlı olmak üzere toplam 5 farklı prunus anacının köklendirilmiş explantlarının Fe stresine karşı tepkilerini in vitro ortamda incelemişlerdir. Demir içeren MS ortamı (+Fe) kontrol olarak, ph sı 5.8 olan Fe içermeyen MS ortamı (-Fe); ph sı 6.9 olan bikarbonatlı MS (5 mm NaHCO g l -1 CaCO 3 ) ve ph sı 7.3 olan MS ortamı (10 mm NaHCO g l CaCO 3 ) olmak üzere 4 farklı uygulamadaki tepkileri değerlendirmişlerdir. Araştırıcılara göre, anaçlar Fe noksan olan ve özellikle bikarbonat olan ortamlarda Fe ve toplam klorofil konsantrasyonunu azaltmıştır. Klorofil konsantrasyonlarındaki bu azalışın klorofil biyosentezinde görev yapan S-aminolevulinic acid ve protochlorophyllide oluşumunda Fe in etkin olmasından kaynaklandığını belirtmişlerdir. Yalnızca Fe in olmadığı MS ortamında tüm genotipler Fe(III) redüktaz aktivitesini arttırırken; tolerant GF-677 anacı 5 mm NaHCO 3 ortamında bu aktiviteyi arttıran tek anaç olmuştur. Ancak GF-677 anacının FCR aktivitesi 10 mm NaCO 3 olan ortamda oldukça indirgenmiştir. Şeftali anacı dışındaki diğer anaçlar NaHCO 3 varlığında SOD aktivitelerini arttırmışlardır. Ayrıca POD aktivitesi 10 mm NAHCO3 ortamında duyarlı Saint Julien 655/2 ve tolerant GF-677 genotiplerinde artarken, Barrier genotipinde azalmıştır.bu çalışmada, Fe içermeyen MS ortamında anaçların yaprakları SOD ve CAT aktivitelerini arttırmıştır. POD ise Fe içermeyen MS ortamında bikarbonat uygulamalarına göre duyarlı genotiplerde artış gösterirken, tolerant genotipte azalma göstermiştir. 10 mm NaHCO 3 ortamında yapraklardaki 20

42 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU CAT aktivitesi azalmıştır. CAT aktivitesindeki bu azalışın nedeni muhtemelen oksidatif zararlanma gelişiminin artmasıdır. Ayrıca, 10 mm NaHCO 3 ortamındaki bitkilerin yapraklarında bulunan H 2 O 2 birikimi, sadece Fe in olmadığı MS (- Fe) ortamından çok daha fazla bulunmuştur. Bunun nedeni H 2 O 2 detoksifikasyonunda CAT enziminin rolüdür. Bu enzimin bikarbonatlı koşullarda düşmesinin nedeni H 2 O 2 birikimininden kaynaklanmaktadır. Araştırıcılar CAT enziminin bikarbonatlı koşullarda düşüşünün diğer çalışmalarda da benzer bulunduğunu bildirmişlerdir. Şeftali çöğürü dışındaki diğer anaçlar, NaHCO 3 ün olduğu ortamlarda yapraklarında SOD aktivitesini arttırmıştır. 10 mm NaHCO 3 uygulamasında tüm anaçların yapraklarında H 2 O 2 konsantrasyonu artış göstermiştir. Araştırıcılar Fe eksikliğine toleranslılığın antioksidant savunma mekanizmasıyla alakalı olabileceğini bildirmişlerdir. NaHCO 3 içeren ortamdaki sonuçlarla sadece Fe olmayan koşullar kıyaslanmış ve NaHCO 3 uygulamalarının Fe eksikliği koşullarındaki bitkilerde çok daha fazla oksidatif stres yarattığını bildirmişlerdir. Tewari ve ark. (2005), dut (Morus alba L. cv. Kanva-2), ve karnabahar (Brassica oleracea var. botrytis L. cv. Snowball-16) bitkilerinin Fe stresinde CAT, POD ve APX aktivitelerinin kontrol bitkilerinin yapraklarında daha fazla; SOD aktivitesinin ise (-)Fe uygulama bitkilerinin yapraklarında daha fazla olduğunu bildirmişlerdir. Ksouri ve ark. (2006), su kültüründe 1 aylık odun çeliklerinde 2 tolerant, 1 duyarlı asma çeşitleriyle yaptıkları denemede guaiakol peroksidaz ve katalaz aktivitelerinin genç yaprak ve sürgünlerdeki salınımına bakmışlardır. Kontrol (20 μm Fe); DD: doğrudan eksiklik (1 μm Fe); ID: dolaylı eksiklik (20 μm Fe + 10 mm HCO 3 ) olmak üzere 3 uygulamanın denendiği bu çalışmada direkt Fe noksanlığı koşullarında, karbonat uygulamasına kıyasla tolerant genotiplerde daha az yaprak klorozu, yapraklarda daha yüksek klorofil ve Fe içeriği bulunmuştur. Ayrıca, tolerant genotipler direkt Fe eksikliğinde daha fazla kök asidifikasyonu sağlamış ve fenol bileşiklerinin salgısı daha yoğun gerçekleşmiştir. Duyarlı genotipte ise kontrol ve (- )Fe uygulama bitkileri arasında istatistiksel olarak önemli bir farklılık görülmemiştir. Her iki Fe noksanlığı koşulunda da Fe(III) redüktaz aktivitesi gerçekleşmiştir. Üç 21

43 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU genotipte de Fe içeren enzimler olan katalaz ve guaiakol peroksidaz her iki Fe stresi koşulunda da önemli şekilde etkilenmişlerdir. Araştırıcılar, Fe içeren bu enzimlerin aktivitelerinin bitkilerin oksidadif strese karşı savunma mekanizmasını oluşturduğunu ve genotipe bağlı olarak Fe noksanlığından etkilendiğini belirtmişlerdir. Çalışmada en tolerant olan Khamri ve 140Ru anaçları doğrudan veya dolaylı uygulamalarında daha yüksek guaiakol peroksidaz veya katalaz aktivitesi göstermişlerdir, bunun da antioksidant enzimlerin kritik olduğunu gösterdiğini bildirmişlerdir. Molassiotis ve ark. (2006), Fe eksikliğine oldukça tolerant GF-677 (Prunus amygdalus Batsch X Prunus persica (L.) Batsch) ve duyarlı Cadaman [Prunus persica (L.) Batsch X Prunus davidiana (Carr.) Franch.) anaçlarının 1 yaşlı çöğürlerinin su kültürü çalışmasıyla Fe stresine karşı gösterdikleri tepkileri incelemişlerdir. Araştırıcılar Fe miktarı, Fe(III) redüktaz aktivitesi, fotosentez, klorofil miktarı, antioksidant aktiviteleri ile H 2 O 2 içeriğinin ph sı 6.5 olan ve 20 mm Fe içeren kontrol (20 mm Fe), hiç Fe içermeyen ve ph sı 6.5 olan ortam ve ph sı 7.9 olan (20 mm Fe+0.5 g L -1 CaCO 3 +20mM NaHCO 3 ) üç farklı ortamdaki tepkilerini incelemişlerdir. Yaprak klorozu iki anaçta farklı zamanlarda görülmüş, stresten 16 hafta sonra bikarbonatlı çözeltideki kloroz miktarı sadece Fe eksikliği ortamına göre çok daha şiddetli olmuştur. Demir noksanlığında kök ve yaprak kuru ağırlıkları önemli ölçüde azalmıştır. Kök ve yaprakların Fe içerikleri kontrolde, diğer uygulamalara göre daha yüksek bulunmuştur. Her iki anacın kök ve yapraklarındaki Fe konsantrasyonu bikarbonat uygulamasında, Fe siz ortama göre az bulunmuştur. FCR aktivitesi her iki anaç için de Fe siz besin ortamında, bikarbonatlı ortama göre daha yüksek bulunmuştur. Bikarbonatlı besin çözeltisindeki FCR aktivitesi duyarlı genotipte daha az gerçekleşmiştir. Demir klorozu her iki genotipte de net fotosentez oranını, stoma iletkenliğini ve klorofil miktarını azaltmıştır. SOD, her iki çeşitte (-Fe) ve bikarbonat uygulanan bitkilerin yapraklarında kontrol yapraklarına göre fazla bulunmuştur. Ancak, köklerde uygulamalar arasında farklılık görülmemiştir. POD (peroksidaz), Cadaman çeşidinin hem yaprak hem kök örneklerinde kontrol bitkilerinde, (-Fe) ve bikarbonat uygulananlara göre daha fazla bulunurken, GF 677 de hem yaprak hem kök örneklerinde (-Fe) uygulaması en 22

44 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU yüksek orana sahip bulunmuş, kontrol ise en düşük oranda POD salgılamıştır. CAT aktivitesi her iki çeşittede hem köklerde hem de yaprakta kontrol bitkilerinde en fazla bulunmuş, diğer iki ortamda istatistiksel olarak farklılık görülmemiştir. H 2 O 2, her iki çeşitte de bikarbonat uygulamasında kökte ve yaprakta en fazla, kontrol bitkilerinde ise en az bulunmuştur. Lopez-Millan ve ark. (2009), domates (Lycopersicon esculentum L. Cv. Tres Cantos) bitkisinde Fe stresinin meydana getirdiği metabolik tepkileri incelemişlerdir. (-)Fe uygulama bitkilerine,ortama hiç Fe koymadan, bikarbonat eklenmesiyle stres yaratmışlardır. Çalışmada organik anyon analizleri, malate dehidrogenaz ve fosfofenol karboksilaz enzim ölçümleri, kök uçlarının oksijen tüketimi ve Fe indirgeme kapasitesini incelemişlerdir. Organik anyonlardan sitrat konsantrasyonu kök uçlarında, yapraklarda ve ksilemde (-)Fe bitkilerinde daha yüksek saptanmıştır. Malat konsantrasyonu ise köklerde kontrol bitkisinde daha fazla; yapraklarda ve ksilemde ise (-)Fe uygulamasında daha fazla bulunmuştur. Kök uçları ve yapraklardaki enzimatik aktivitelerde ise akotinaz (-)Fe uygulamasının kök ve yapraklarında daha fazla, fumaraz (-)Fe köklerinde kontrolden daha fazla; yapraklarda ise kontrol bitkilerinde (-)Fe bitkilerine oranla yaklaşık iki kat fazla aktive olmuştur. Jelali ve ark. (2010), Fe klorozuna tolerant ve duyarlı olan iki bezelye çeşitinin Fe klorozuna karşı gösterdikleri metabolik tepkileri incelemişlerdir. Denemede kontrol (30 um Fe), direkt Fe noksanlığı (0 Fe) ve indirekt Fe noksanlığı (30 um Fe+0,5 g/l CaCO mm NaHCO 3 ) uygulamaları kullanılmıştır. Bu çalışmada piruvat kinaz (PK); fosfofruktokinaz (PFK); glukoz-3-fosfat-dehidrogenaz (G3PDH), glukoz -6- fosfat-dehidrogenaz (G6PDH), Fe redüktaz, H-ATPase aktiviteleri ile köklerden salgılanan citrate synthase (CS), isocitrate dehydrogenase (ICDH) organik asitleri ve fenolik bileşiklerin Fe eksikliği koşullarındaki aktivitelerini incelemişlerdir. Direkt Fe noksanlığı uygulamasında glukoz katabolizmasında yer alan sitosolik enzimler olan PK, PFK, G3PDH ve G6PDH aktiviteleri Fe stresindeki hem tolerant hem de duyarlı bitkilerde kontrol bitkilerine göre artış göstermiştir. Tolerant çeşitte bu enzim aktiviteleri duyarlı çeşide göre sırasıyla %156, %126, %123 ve %130 oranında artışla gerçekleşmiştir. Bikarbonat 23

45 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU uygulaması ile direkt Fe noksanlığında bu enzimler, tolerant çeşitte bikarbonat uygulamasında PK ve G36PDH az bir artış göstermiş; PFK ve G6PDH da ise bir değişiklik olmamıştır. Duyarlı genotip ise her enzim için şiddetli düşüşler göstermiştir. Plazma zarındaki H-ATPase aktivitesi ise Fe eksikliği koşulunda hem tolerant hem de duyarlı bitkilerin köklerinde artış göstermiştir. Bu artış direkt Fe uygulamasında bikarbonatlı uygulamaya kıyasla daha fazla olmuştur Yetiştirme Ortamındaki Bikarbonat İyonunun Ve Çevresel Faktörlerin Demir Alımına Etkileri Hem Strateji 1 de hem de Strateji 2 de değişik türler ve aynı türe ait farklı genotipler Fe etkinliği bakımından farklıdır. Ancak Fe alımı üzerine sadece bitkisel etmenler değil, aynı zamanda çevresel ve toprak etmenleri de etkilidir. Düşük Fe alımının sebeplerinden biri de, Fe elementinin ortamdaki azlığından kaynaklanabilir (Lucena, 2000). Türkiye ölçeğinde Eyüpoğlu ve Kurucu (1997) tarafından yapılan bir araştırmada Türkiye nin iklim ve bölgelerini temsil edecek şekilde örneklenen 1511 toprak örneğinde mikro element analizi yapılmıştır. Bu araştırmaya göre Türkiye topraklarının % 27 sinde Fe noksanlığı tespit edilmiştir. Toprak sıcaklığı, toprak nemi, bikarbonat ve karbonat iyonları, fazla su ve yetersiz havalanma ve organik madde, topraktan Fe alımını etkileyen faktörlerdendir (Kacar ve Katkat, 2006). Demir noksanlığı alkali yapıya sahip, kireçli topraklarda yetiştirilen bitkilerde sıklıkla görülen bir sorun olup, Fe klorozu çok kireçli topraklarda nemli ve yarınemli iklime sahip alanlarda yetiştirilen bitkilerin bir çoğunu olumsuz şekilde etkilemektedir (Yadav ve Singh, 1988; Lopez-Millan ve ark., 2000; Vallejo ve ark., 2000). Kireçli topraklara sahip Akdeniz ülkelerinde meyve ağaçlarının büyük bir kısmı Fe klorozu ile ilgili sıkıntı yaşamaktadır (Pestana ve ark., 2005). Demir klorozundan en fazla etkilenen bitkiler domates, ahududu, kivi, ananas, asma, avokado, kayısı, şeftali, erik, kiraz ve turunçgildir (Fernandez ve ark., 2006). 24

46 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Wallihan ve ark. (1976), CaCO 3 lı koşullarda yetiştirilen portakalda Fe klorozunun 16 C toprak sıcaklığında görülürken, C toprak sıcaklığında ise görülmediğini ve bu sıcaklıkta yapraktaki Fe konsantrasyonunun 16 C ye göre %5 oranında artış gösterdiğini belirtmişlerdir. Mengel ve ark. (1984), düşük ve yüksek nem uygulamasının asmalarda kireçli ve kireçsiz topraklardaki Fe klorozu üzerine etkilerini incelemişlerdir. Kireçli ve kireçsiz toprakların fazla su ile doyurulduklarında toprak ph sının ve topraktaki bikarbonat iyonlarının az su ile doyurulan topraklara göre arttığı bildirmişlerdir. Inskeep ve Bloom (1986), soya fasulyesinde (Glycine max (L.) Merr.) toprak nemi ve toprak sıcaklığının Fe alımı üzerine etkilerini araştırmak için 5 farklı kireçli toprakta saksı denemesi yapmışlardır. Toprak neminin artışıyla birlikte, toprak çözeltisindeki HCO - 3 artış göstermiştir. Toplam klorofil içeriği topraktaki nem, CO 2 ve HCO - 3 iyonlarının artışıyla azalmıştır. Nemli toprakta 26 C toprak sıcaklığında, C dereceye göre daha fazla klorozun görüldüğü belirtilmiştir. Mengel, (1994), HCO - 3 iyonu konsantrasyonunun birçok mikroelementin özellikle Fe 2+ in alımını etkilediğini ve bu durumun kireçli topraklarda yetiştirilen bitkilerde görülen kloroz probleminin başlıca nedeni olduğunu bildirmiştir. Marschner, (1995) alkali yapıdaki toprakların genellikle bitki besin elementinin kullanılabilirliği açısından düşük, yüksek miktarda CaCO 3 ve toprak çözeltisinde HCO 3 içeren yüksek ph ile karakterize edildiğini ileri sürmüştür. Römheld (2000), Fe noksanlığının kireçli topraklarda karşılaşılan yaygın bir problem olduğunu ve klorozun kireçli toprak, toprak kompakt yapısı ve toprağın su ile doygunluğundan kaynaklandığını belirtmiştir. Araştırıcı, ıslak kireçli topraklarda havalanmanın yetersiz olması nedeniyle bikarbonat iyonlarının artışı sonucu asma ve diğer yaprağını döken meyve türlerinde ve tek yıllık bitki türlerinde Fe klorozuna rastlandığını, ayrıca yapılan nitrat uygulamalarının toprak ph sını arttırması sebebiyle Fe alımını azalttığını vurgulamıştır. Cinelli ve Loreti (2004), şeftali yetiştiriciliği için kullanılabilecek anaçların tarama çalışması için NaHCO 3 uygulaması ile anaçlar arasındaki performansı değerlendirmeye çalışmışlardır. Araştırıcılar NaHCO 3 uygulamasının tüm bitkilerde 25

47 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU ağırlık kaybı ve toplam sürgün gelişmesinde azalmalar meydana getirdiğini belirtmişlerdir. Ma ve ark. (2006), iki armut anacına ait (Pyrus xerophila Yu ve Pyrus betulaefolia Bunge) çöğürlerin bikarbonatlı koşullardaki tepkilerini inceledikleri çalışmalarında, bikarbonatlı koşullarda duyarlı olan anacın Fe eksikliği simptomları gösterdiğini, ayrıca Fe +3 şelat redüktaz aktivitesinin bikarbonatlı koşullarda aktif hale geldiğini saptamışlardır. Norvell ve Adams (2006), bikarbonat iyonlarının rolünün tam olarak anlaşılmamasına rağmen, bitkilerde Fe alımını ve kullanımını azalttığını, toprakta ph nın yükselmesine neden olduğunu bildirmişlerdir. Soya fasulyesinde farklı kaynaklı bikarbonat (Mg(HCO 3 ) 2 ve NaHCO 3 ) iyonlarının Fe alımı üstüne etkilerini inceledikleri çalışmalarında bikarbonat iyonlarının kaynağının önemli olmadığı, her iki karbonat iyonunun klorofilde ve Fe içeriğinde azalma, kloroz durumunda artış meydana getirdiğini belirtmişlerdir. Karbonat iyonlarının Fe klorozu ile ilgili tarama çalışmalarında kullanılabileceğini ileri sürmüşlerdir. Rombola ve Tagliavini (2006), Fe klorozunun bahar aylarında daha sık görüldüğünü belirtmişlerdir. Araştırıcılar bunun nedenlerini; öncelikle bahar dönemlerinde meydana gelen yağışlar sonrasında toprak boşluklarının dolması ve HCO 3 konsantrasyonunun artması; hava sıcaklığının yükselmesi nedeniyle bitkide sürgün gelişiminin teşvik edilmesi ve Fe e gereksinim duyması; toprak sıcaklığının Fe alımı için yeterli olmaması şeklinde sıralamışlardır. Özdemir ve Tangolar (2007), asma genotiplerinin %10, 30 ve 50 oranlarındaki CaCO 3 miktarlarının dört farklı Fe uygulamasına (20 ppm Fe (FeSO 4 formunda) + çiftlik gübresi (100 g/saksı/5 kg toprak); 20 ppm Fe (Fe-EDDHA formunda); 20 ppm Fe (FeSO 4 formunda) + sitrik asit (FeSO 4 ın %10 u oranında); kontrol (Fe uygulaması yapılmamış toprak) karşı tepkilerini incelemişlerdir. Bu çalışma sonucunda, artan CaCO 3 miktarı ile yapraklardaki Fe konsantrasyonlarının tüm asma genotiplerinde azaldığını, ayrıca Fe-EDDHA ve FeSO 4 + sitrik asit uygulamalarının bitkilerdeki aktif ve toplam Fe açısından en yüksek değeri verdiğini bildirmişlerdir. 26

48 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Öztürk ve ark., (2007), kök mekanizmasındaki bir aksamanın Fe beslenmesiyle ilgili problemlere yol açarak yaprak klorozunun ortaya çıkmasına neden olduğunu, yüksek bikarbonat iyonlarının olduğu topraklarda yetişen veya düşük sıcaklığa, ağır metal yada etilen engelleyicilerine maruz kalan bitkilerde de aynı klorotik durumun söz konusu olduğunu rapor etmişlerdir. Colla ve ark. (2010), toprak ya da yetiştirme ortamındaki NaHCO 3 konsantrasyonunun sürgün ve köklerin gelişimini, yaprak alanını ve net CO 2 asimilasyonunu, olumsuz yönde etkilediğini belirtmiştir Demir Paradoksu Demir eksikliğinin tipik belirtisi olan kloroz, yapraklarda birim alana düşen klorofil ve karatenoid konsantrasyonunun azalmasından kaynaklanmaktadır. Ancak bütün fotosentetik pigmentler aynı oranda azalmazlar, örneğin ksantofil konsantrasyonu klorofil ve beta-karotenden daha az etkilenir. Demir klorozunda yaprağın toplam Fe içeriği ile klorozu arasında bir korelasyon yoktur. Bu durum Fe paradoksu olarak adlandırılır. Toplam Fe in bitkinin Fe durumunu yansıtmaması nedeniyle yaprak klorofil içeriği Fe eksikliğinin belirlenmesi amacıyla kullanılır (Bertamini, 2001). Demir klorozunun ortaya çıkışı ile ilgili iki hipotez vardır. Birincisi rizosferdeki HCO - 3 iyonları yüzünden Fe alımının engellenmesi, ikincisi ise bikarbonat iyonlarının yaprak apoplastlarındaki alkaliliği etkileyerek Fe in inaktive olmasına neden olmasıdır. Köseoğlu (1995) klorotik yapraklarda toplam Fe in yeşil yapraklara kıyasla yüksek olmasının bu hipotezin temelini oluşturduğu bildirilmiştir (Römheld,,2000). Mengel ve Bübl (1983) asma yapraklarına radyoaktif 55 Fe ile HCO 3 uygulaması yapmışlar ve yaprak damarlarındaki Fe birikimini yüksek bulmuşlardır. Ancak genç klorotik yapraklarda Fe konsantrasyonunun yeşil yapraklara göre fazla bulunması, bazen tarla ve saksı denemelerindeki toprakta CO 2 in yükseldiği ekstrem yetişme koşullarında meydana gelmiştir. Daha sonra Biino ve ark. (1997) ve Nikolic 27

49 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU ve ark. (1998) yaptıkları çalışmalarında bikarbonat iyonunun ksilem ya da yaprak apoplastlarındaki ph yı etkilemediğini bildirmişlerdir. Machold ve Scholz (1969), yeşil yapraklarda aktif Fe in, toplam Fe in % 64.1 ini, orta klorotik yapraklarda % sini ve şiddetli klorozda % kadar bulunduğunu saptamıştır. Ayrıca, birçok araştırıcı toplam Fe in bitkinin Fe le ilgili durumunu yansıtmada yeterli olmadığını ve Fe klorozu ile yapraktaki toplam Fe arasında bir ilişkinin olmadığını belirtmişlerdir (Razeto, 1982; Hurley ve ark., 1986; Abadia ve ark., 2000; Razeto ve Palacios, 2007). Morales ve ark.(1998), kontrollü koşullarda sağlanan Fe noksanlığında Fe klorozu gösteren bitkilerin yapraklarındaki toplam Fe miktarının düşük olduğunu ancak, doğal koşullarda yetiştirilen bitkilerde Fe paradoksunun görüldüğünü bildirmişlerdir. Genç yapraklarda Fe konsantrasyonunun azalmasıyla yaprak gelişiminin engellendiği ve bunun da Fe paradoksunun bitkinin fizyolojisi ile ilgili bağlantısını ortaya koyduğu düşünülmektedir. Bugüne kadar elde edilen veriler kloroz paradoksunda, toprak atmosferindeki yüksek CO 2 konsantrasyonunun, etilen ve düşük O 2 konsantrasyonunun yaprak gelişmesini engelleyen toprak faktörlerinden olduğunu ortaya koymuştur (Römheld, 2000). Chouliaras ve ark., (2004 b)., turunç (Citrus aurantium) ve Swingle sitrumelo (Poncirus trifoliata (L.) Raf. X Citrus paradisi Macf.) üzerine aşılı iki portakal (Citrus sinensis) çeşidinin altı farklı çözeltideki (20 μm Fe-EDDHA (ph=6) kontrol; 0 μm Fe-EDDHA (ph=6); 10 μm Fe-EDDHA +0,5 g L -1 CaCO mM NaHCO 3 (ph=7.2, bikarbonat 1); 10 μm Fe-EDDHA +0,5 g L -1 CaCO mM NaHCO 3 (ph=7.5, bikarbonat 2); 10 μm Fe-EDDHA +0,5 g L -1 CaCO mM NaHCO 3 (ph=7.8, bikarbonat 3); ve 10 μm Fe-EDDHA +0,5 g L -1 CaCO mM NaHCO 3 (ph=8.2, bikarbonat 4) toplam ve aktif Fe parametrelerini incelemişlerdir. Araştırıcılar, bikarbonat 4 uygulamasındaki aktif ve toplam Fe in diğer uygulamalara göre Swingle sitrumelo ve turunç anaçları üzerine aşılı Valencia ve Newhall portakallarında en düşük bulunduğunu bildirmişlerdir. Bikarbonat 4 uygulamasında aktif Fe miktarı kontrol bitkilerine göre yaklaşık % 50 oranında azalmış ve aynı uygulamanın (bikarbonat 4) aktif Fe ve toplam Fe leri arasında 28

50 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU yaklaşık % 60 lık bir fark meydana gelmiştir. Karetonoid/klorofil miktarı ise en düşük kontrol uygulamasından, en yüksek ise bikarbonat 4 uygulamasından elde edilmiştir. Bu çalışmada Fe paradoksu görülmemiş, araştırıcılar aktif Fe konsantrasyonu ve karetonoid/klorofil oranının turunçgil bitkileri için Fe klorozu açısından değerlendirilebilir parametreler olduğunu bildirmişlerdir. Ancak, asma bitkisinde yapılan bir çalışmada, farklı anaçlar üzerine aşılı Pinot Blanc çeşidine ait bazı klorotik yaprakların yeşil yapraklardan çok daha fazla Fe içerdiği bulunmuştur (Bavaresco, 1999). Abadia ve ark. (2000), yaprağını döken meyve türlerinde yaprak analizleri ile belirlenen toplam Fe in, Fe paradoksu yüzünden doğru bir parametre olmadığını ileri sürmüşlerdir. Yaptıkları çalışmalarda yaprağını döken şeftalilerde ve herdem yeşil portakal ağaçlarında çiçek analizlerinin genellikle doğru sonuçlar verdiğini belirten araştırıcılar, çiçek analizleriyle bitkinin Fe durumunun daha doğru tespit edilebileceğini bildirmişlerdir. Çelik ve Katkat (2007), farklı toprak koşullarına sahip 9 bahçede yeşil, orta klorotik ve şiddetli klorozlu şeftali yapraklarında yaptıkları çalışmaları sonucunda, toplam Fe in bitkilerin Fe ile ilgili durumlarını yansıtacak iyi bir indikatör olmadığını, ancak aktif Fe in bu amaçla kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Razeto ve Palacios (2007), avokado ağaçlarında Fe beslenme durumunu belirleyebilmek için yaprak analizi ile belirlenen toplam Fe miktarının belirleyici olmadığını, meyvede yapılacak analizlerin çok daha belirleyici olduğunu söylemişlerdir Demir Klorozunun Fotosentez ve Verimlilik Üzerine Etkileri Demir noksanlığının, klorofil içeriğini ve dolayısıyla bitkilerde fotosentezi de etkilediği birçok çalışmayla belirlenmiştir. Davis ve ark. (1986) soya bitkisinde; Hurley ve ark. (1986) elmada Fe eksikliğinin fotosentezi azalttığını bildirmişlerdir. Morales ve ark. (1994), düşük Fe koşullarında bitkilerin yeni yapraklarındaki karakteristik yeşilimsi-sarı renk görüntüsünün çoğunlukla Fe klorozu kaynaklı olduğunu ve bu görünümün, Fe noksanlığında yaprak ksantofil içeriğinin klorofil ve 29

51 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU betakarotene göre daha küçük miktarda azalmasından kaynaklandığını ileri sürmüşlerdir. Ayrıca araştırıcılar Fe noksanlığı çeken yapraklarda fotosentez etkinliğinin de azaldığını saptamışlardır. Abadia ve ark. (1999), demir noksanlığının Akdeniz Bölgesi nin kireçli topraklarında meyve ağaçlarını etkileyen ve en yaygın besin elementi noksanlığı olduğunu; Fe noksanlığının yapraklardaki fotosentetik pigment olan klorofil miktarının azalmasına bağlı olarak yaprakta sararmalar şeklinde kendini gösterdiğini belirtmişledir. Demir noksanlığı çeken yaprakların sadece fotosentezlerinin azalmadığını, klorofil başına düşen absorbe edilen ışığın artması nedeniyle oksidadif stresin de meydana geldiğini bildirmişlerdir. Bertamini ve ark. (2001), İtalya da kontrol, orta şiddetli ve çok şiddetli Fe klorozu gösteren asma yapraklarını klorofil (a+b), karetenoid, PSI, PSII ve protein miktarları açısından incelemişlerdir. Söz konusu parametrelere ait en yüksek değerler kontrol grubunda ortaya çıkarken, orta şiddetli ve şiddetki kloroz gösteren yapraklarda daha düşük değerler elde edilmiştir. Pestana ve ark. (2005), demir noksanlığı gösteren bitkilerde fotosentetik pigmentlerin salınımının azaldığını ve karotenoidlerin oransal olarak zenginleştiğini ve böylece klorofillerden daha fazla olduğunu, dolayısıyla yapraklarda sararmaların başladığını bildirmişlerdir. Demir noksanlığı gösteren şeftali ve portakal ağaçlarında verim düşüklüğü, meyve olgunlaşmasının gecikmesi, meyve kalitesinin düşmesi gibi sonuçları gözlemlemişlerdir. Larbi ve ark., (2006), şiddetli Fe klorozu gösteren şeftali, armut ve şeker kamışı bitkilerinin yapraklarında klorofil ve gaz değişimi ölçümleri yapmışlardır. Araştırıcılar, klorotik yapraklarda stoma açıklığı, transpirasyon oranı ve su kullanım etkinliğinin azaldığını belirtmişlerdir. Ayrıca, klorofil içeriğindeki azalmanın yaprak fotosentez oranını önemli ölçüde azalttığı ve Fe noksanlığında fotosistem II ve rubisko karboksilasyonunun düştüğü belirtilmiştir. Nenova (2009), 0 mg/kg, 0.10 mg/kg, 0.25 mg/kg, 2.00 mg/kg ve mg/kg olmak üzere beş farklı Fe dozunun bezelye (Pisum sativum L. cv. Ran-1) bitkilerindeki fotosenteze etkilerini incelemiştir. Demir uygulamasının olmadığı (0 30

52 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU ppm Fe) durumunda klorofil (a+b), karetenoid miktarı ve yaprak alanına göre fotosentez etkinliği diğer uygulamalara göre en düşük bulunmuştur. Eicherd ve ark. (2010); İspanya-Zaragoza da toplam kireç içeriği %30.00, aktif kireç içeriği %10.00 ve ph nın 7.8 olduğu bahçede 14 yaşındaki şeftali (Prunus persica (L.) Batsch, cv. Miraflores) ağaçlarının Fe klorozu koşullarında fotosentez etkinliğinin belirlenmesine yönelik yaptıkları çalışmalarında kontrol bitkilerini 100 g/ağaç Fe(III)EDDHA ile gübrelerken, klorotik ağaçları 3 yıl boyunca Fe li bir gübre kullanmadan büyütmüşlerdir. Araştırıcılar sağlıklı yeşil yapraklarda, klorotik yapraklara oranla net fotosentez oranını yaklaşık 4.0; transpirasyon oranını yaklaşık 1.5; stoma iletkenliğini yaklaşık 2.0; su kullanım etkinliğini yaklaşık 3.0 ve Fe içeriğini yaklaşık 1.2 kat daha fazla bulmuşlardır. Demir klorozunun fotosentezi etkilediği ve bunun da meyve verim ve kalitesinde değişikliklere yol açtığı bilinmektedir. Meyve verim kayıpları ağaçtaki meyve sayısının azalmasından veya meyve iriliğinin düşüş göstermesinden veya her iki faktörün ortak etkisiyle meydana gelebilmektedir. Şeftali ağaçları kullanılarak yapılan bir çalışmada Fe le yeterince beslenen sağlıklı ağaçlarla klorotik ağaçların SPAD değeri, meyve verim ve kalite parametreleri incelenmiştir. Bu araştırma sonucunda, Fe açlığı çeken bitkilerde, sağlıklı bitkilere göre daha az meyve tutumunun meydana geldiği, ayrıca tutan meyvelerin iriliğinin sağlıklı bitkilerdeki kadar olmadığı belirlenmiştir. Klorofil değerinin 10.0 mmol cm -2 den 5.0 mmol cm - 2 ye düştüğü şiddetli kloroz durumunda ağaçlardaki ürün kaybı %80 lere ulaşmıştır. Meyve ağırlığı da sağlıklı ağaçlara oranla %30 azalmıştır. Meyve iriliğinin yanında meyve renginde değişiklik; meyve suyu miktarında azalma; meyve suyu konsantrasyonunda bulunan organik asitler, vitaminler ve fenolik bileşiklerde de değişimler meydana geldiği belirlenmiştir (Fernandez ve ark., 2006) Demir Klorozuyla İlgili Turunçgilde Yapılan Tarama Çalışmaları Turunçgil bitkilerinin Fe klorozuna hassas olmaları nedeniyle bu konuyla ilgili tarama çalışmaları birçok araştırıcı tarafından yapılmıştır; 31

53 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Cooper ve ark., 1953 yılında turunç ve Kleopatra mandarininin tuzlu ve kireçli topraklardaki toleranslarını; 1954 yılında ise turunçgil fidanlarının kireçli topraklara karşı olan toleranslılıklarını belirlemek için çalışmalar yapmışlardır. Rangpur laymı ve turunç anaçlarının kireçli topraklar için uygun olduğunu bildirmişlerdir. Krader ve Wallace (1964), radyoaktif Fe ve radyoaktif çinko kullanarak Fe ve Zn nin Üç yapraklı ve Kaba limon tarafından alınmasını ve hareketini incelemişlerdir. Her iki radyoizotopun Kaba limon tarafından Üç yapraklıdan daha iyi alındığını, yüksek konsantrasyonda verilen Fe in alımının her iki meyve türünde de aynı olduğunu, fosfor ve bikarbonat iyonlarının Üç yapraklıda Fe in hareketini önemli derecede engellediğini ve yüksek kalsiyum düzeyinin her iki meyve türünde Fe alımının azalmasına neden olduğunu saptamışlardır (Kaplankıran, 1984). Wutscher ve Olsen (1970), Florida da 16 farklı anaç üzerine aşılı altıntop ağaçlarının yüksek miktarda kireç içeren topraklardaki performanslarını değerlendirmişlerdir. Araştırıcılar tıpkı Cooper ve ark. (1954) gibi Rangpur laymı ve turunç anaçlarının kireçli topraklar için uygun olduğunu belirtmişlerdir. Hamze ve ark. (1986), 3 citrus cinsine ait tür, 1 poncirus cinsine ait tür, 5 türler arası melez ve 3 cinsler arası melez olmak üzere 12 anacın su kültüründe yüksek kirece karşı tolerans düzeylerini belirlemişlerdir. Kullanılan anaçların hepsinin kireçli olmayan ortamda kloroz göstermediği bildirilmiştir. Çalışma sonucunda anaçlar kirece karşı toleransları bakımından 4 gruba ayrılmıştır. En tolerant olarak, Citrus jambhiri ve Citrus macrophylla; orta tolerant Citrus volkameriana, Citrus aurantium, Citrus reticulata ve Citrus limonia; az tolerant Citrus tawanica, Citrus sinensis, Troyer ve Carrizo sitranjları ve duyarlı olarak Poncirus trifoliata ve Swingle sitrumelo belirlenmiştir. Kök katyon değişim kapasitesi fazlalığının tolerans gösterenlerde; kök membran esterifikasyonunun ise duyarlılarda daha düşük bulunması nedeniyle bu parametrelerin Fe klorozuna karşı toleranslılığın belirlenmesinde ayırıcı olabileceğini bildirmişlerdir. Legaz ve ark. (1992), Troyer üzerine aşılı Navelina portakalında olgunlaşmamış meyvelerin kuru ağırlığının kg ve içerdikleri Fe miktarının mg olduğunu belirtmiştir. Diğer organlarda ise sürgün kuru ağırlığı kg 32

54 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU ve Fe içeriği mg; yaşlı yaprak kuru ağırlığı kg ve Fe miktarı mg; gövde ve dalların kuru ağırlığı kg ve Fe konsantrasyonu mg; kalın köklerin kg ve Fe oranı mg, kılcal köklerin kuru ağırlığını 2.90 kg ve içerdikleri Fe konsantrasyonunu mg olarak belirlemişlerdir. Treeby ve Uren (1993), portakal, Carrizo sitranjı, üç yapraklı, kaba limon, turunç ve Kleopatra mandarinlerinin farklı ph ve Fe içeren su kültürü çalışmasıyla toleranslılıklarını proton akışı, fenolik bileşiklerin varlığı ve Fe indirgeme kapasitesi ile belirlemeye çalışmışlardır. Bu çalışma sonucunda, yüksek kirece karşı en az tolerans gösteren portakal, Carrizo sitranjı ve üç yapraklı anaçlarının Fe stresinde besin çözeltisindeki ph yı düşüremedikleri, fakat kirece daha tolerant olan kaba limon, Kleopatra mandarini ve turunç anaçlarının besin çözeltisindeki ph yı düşürebildiklerini bildirmişlerdir. Fakat yüksek ph uygulaması için ekledikleri CaSO 4 solüsyonunda ise sadece turunç anacının H + akışını önemli derecede arttırdığını vurgulamışlardır. Araştırıcılar, Kaba limon ve Kleopatra nın Fe stresinde fenolik bileşikleri; kaba limon, turunç ve üç yapraklı anaçlarının ise Fe indirgeyici maddeleri önemli ölçüde salgıladıklarını belirtmişlerdir. ph 8 de ise en iyi tepki veren anaçların Kaba limon ve Kleopatra mandarini olduğunu ileri sürmüşlerdir. Sudahono ve ark., (1994)., 18 turunçgil anacının Fe e karşı tolerans düzeylerini saptamak için kum kültüründe yaptıkları çalışmalarında Fe klorozunu belirlemek için renk ayrımı, SPAD-502 klorofilmetre ölçümü, yaprak klorofil konsantrasyonu, yapraklarda aktif Fe ve toplam Fe i belirlemişlerdir. Teksas turuncu (Citrus aurantium), Kleopatra mandarini (Citrus reshni Tan. var Kleopatra ), Vangasay limonu 8C. Limon Burm.) ve Ridge pineapple X Milam (Citrus sinensis L. Osbeck X Citrus jambhiri) tolerant ve orta tolerant olarak bulunmuşlardır. Birçok üç yapraklı melezi orta duyarlı ve çok duyarlı olarak bulunmasına rağmen, Smooth Sevile X Arjantin üç yapraklısı (( Citrus grandis (L.) Osbeck X Citrus aurantium) X Poncirus trifoliata (L.) Raf.) ve F sitranjının (Citrus sinensis X Poncirus trifoliata) Fe klorozuna karşı yüksek tolerans gösterdiğini bildirmişlerdir. Byrne ve ark. (1995), üç yapraklı, üç yapraklı melezleri ve bazı turunçlar (Çin turuncu, mutant turunç ve teksas turuncu) olmak üzere toplam 26 anaç üzerine aşılı Ray Ruby altıntopunu yüksek kireçli toprak özelliklerine sahip Wescalo ve Edinburg 33

55 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU koşullarında Fe klorozu açısından incelemişlerdir. Edinburg ve Wescalo topraklarının ph ları sırasıyla 8,3 ve 7,8; CaCO 3 içerikleri ise %5 ve %3,8 olarak belirtilmiştir. Anaçlar arasındaki Fe toleranslılığını belirlemek için Fe klorozu skalası ve SPAD ölçümü parametrelerinden yararlanmışlardır. Castle ve Manthey (1998), 26 farklı Citrus cinsi ve yakın akrabalarının Fe e dayanımlarını belirlemek için yaptıkları çalışmalarında, 3 aylık bitkileri kullanmışlardır. Deneme bitkileri Fe içermeyen besin çözeltisiyle büyütülmüş ve genotiplerin Fe e karşı toleranslılıklarının belirlenebilmesi için Fe +3 ü indirgeyebilme durumları göz önünde bulundurulmuştur. Beyaz kök uçlarından periyodik olarak aldıkları örnekleri redüksiyon kapasitesini belirlemek için test etmişlerdir. En fazla indirgeme kapasitesine sahip olarak Volkameriana, Eureka limonu, Etrog ağaç kavunu, turunç ve Rangpur laymı; en düşük olarak Swingle sitrumelo, Duncan altıntopu, Thong Dee altıntopu, Ridge Pineapple portakalı, üç yapraklı ve bir papeda seleksiyonunu bulmuşlardır. Birçok genotip ise düşük-orta indirgeme özelliğinde bulunmuştur. Araştırıcılar, yüksek tolerans gösterenlerin Citrus cinsi içinde Citrus medica orjinli olanlar olduğunu belirtmiştir. Aynı zamanda, Rangpur laymının tamponlanmamış çözeltide ph değerini çok fazla düşürdüğünü (5 in altında) ve tamponlanmamış çözeltideki redüksiyon oranının tamponlanan çözelti yanında daha düşük olduğunu bildirmişlerdir. Pestana ve ark. (2001), Troyer sitranjı ( Citrus sinensis (L.) Osb. X Poncirus trifoliata (L.) Raf.) üstüne aşılı Newhall portakal çeşidinde 0, 5, 10 ve 20 μm Fe miktarlarını kalsiyum karbonatlı ve kalsiyum karbonatsız koşullarda su kültüründe denemişlerdir. 0 μm Fe ve 5 μm Fe uygulamalarında yaprak klorozu görüldüğünü, yaprak klorofil miktarının azaldığını, köklerin diğer uygulamalara göre daha küçük olduğunu ve yan dal oluşumunun daha az meydana geldiğini bildirmişlerdir. 0 μm Fe CaCO 3 lü ve CaCO 3 süz uygulamalarında oksijen değerlendirme oranını 10 μm Fe uygulamasından daha düşük bulmuşlardır. CaCO 3 lı 0 μm Fe ve 5 μm Fe uygulamalarında FCR (Fe chelate reductase) aktivitesinin, 10 ve 20 μm Fe uygulamalarına göre, önemli derecede artış gösterdiğini belirtmişlerdir. Araştırıcılar köklerdeki FCR aktivitesinin kendi denemelerinde sadece CaCO 3 lü uygulamalarında görüldüğünü ve bu sonuçlara göre de turunçgillerde Fe 34

56 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU noksanlığının FCR aktivitesinin artması için tek başına yeterli olmayacağını bildirmişlerdir. Yaptıkları araştırmada tüm CaCO 3 lı uygulamalarda fotosistem II etkinliği benzer olarak bulunmuş ancak, 0 μm Fe de bu etkinliğin biraz daha az olduğunu saptamışlardır. Yaprak klorofil konsantrasyonun CaCO 3 lerde daha belirgin ve bu değerlerin de 0 μm Fe uygulamasındaki değerlere yakın olarak bulunduğunu belirtmişlerdir. Bu araştırma sonucunda, yaprak klorofil konsantrasyonunun Troyer anacı üstüne aşılı Newhall portakallarında önemli derecede azalma gösterdiğini, fotosentetik kapasitenin az miktarda azaldığını ve fotosistem II etkinliğinin çok az miktarda etkilendiğini bildirmişlerdir. Ayrıca Fe klorozu gösteren portakal fidanlarının FCR aktivitesinin CaCO 3 varlığında meydana geldiğini öne sürmüşlerdir. Chouliaras ve ark., (2004 c)., turunç ve Swingle sitrumelo üstüne aşılı 1 yaşlı Valencia ve Newhall portakal fidanlarının farklı Fe ve bikarbonat dozlarına karşı toplam ve aktif Fe miktarını, peroksidaz ve katalaz enzim aktivitelerini, karatenoid/klorofil, P/Fe ve K/Ca oranlarını incelemişlerdir. Çalışmalarında 20 μm Fe-EDDHA (ph 6.0) (+Fe) (kontrol), 0 μm Fe-EDDHA (ph 6.0) (-Fe), 10 μm Fe- EDDHA dm -3 CaCO 3 (ph 7.2), 10 μm Fe-EDDHA dm -3 CaCO mm NaHCO 3 (ph 7.5), 10 μm Fe-EDDHA dm -3 CaCO mm NaHCO 3 (ph 7.8) ve 10 μm Fe-EDDHA dm -3 CaCO mm NaHCO 3 (ph 8.2) olmak üzere 6 uygulama yapmışlardır. Çalışma, kum-perlit karışımında ısıtmalı serada yürütülmüş ve bitkiler 2 günde bir Hoagland besin çözeltisiyle sulanmışlardır. Araştırıcılar (-Fe) uygulaması bitkilerinde FCR aktivitesinin artış gösterdiğini, ancak bikarbonat uygulanmış olanlarda ise azalma meydana geldiğini saptamışlardır. Bunun nedeni olarak, Hoagland besin çözeltisine eklenen bikarbonatın besin çözeltisinin ph sını arttırdığını ve FCR aktivitesinin optimal ph=5 koşullarında çalıştığı için yüksek ph lı ortamlarda azalma göstereceğini bildirmişlerdir. Deneme sonunda, tipik Fe klorozu simptomlarının bikarbonat uygulamalarında, (-Fe) uygulamasına göre her iki anaç ve çeşitte daha şiddetli görüldüğünü ve Fe noksanlığı gösteren yapraklardaki peroksidaz ve katalaz aktivitelerini düşük bulduklarını belirtmişlerdir. Araştırıcılar, peroksidaz, katalaz ve FCR aktiviteleri, aktif Fe konsantrasyonu, karetenoid/klorofil, P/Fe ve K/Ca verilerinin turunçgillerde tarama 35

57 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU çalışmalarında kullanılabileceğini ve Fe ile ilgili çalışmalarda erken değerlendirme için uygun olduğunu bildirmişlerdir. Pestana ve ark. (2005), Troyer sitranjı ( Citrus sinensis (L.) Osb. X Poncirus trifoliata (L.) Raf.), Citrus taiwanica Tan. ve Shim., ve Swingle sitrumelo (Poncirus trifoliata (L.) Raf. X Citrus paradisi Macf.) turunçgil anaçları üzerine farklı dozlarda ( 0, 5, 10, 15 ve 20 μmol Fe dm -3 ) Fe içeren besin çözeltilerinin meydana getirdiği değişimleri incelemişlerdir. Besin çözeltisine 1 g dm -3 CaCO 3 ekleyerek ortam ph sını arttırmışlardır. Her bir anaç için sürgün boyu, yaprak sayısı, kök ve sürgünlerin taze ve kuru ağırlıkları deneme sonunda ölçülmüş ve ayrıca yapraklardaki klorofil konsantrasyonunu ve bitki besin madde miktarlarını belirlemişlerdir. Çalışmaları sonucunda, Troyer sitranjını bu 3 anaç içerisinde Fe e en tolerant olarak, Swingle sitrumelo anacını en hassas ve Taiwanica yı ise orta derecede tolerant olarak bulmuşlardır. Roose, (2008), demir klorozuna karşı tolerant turunçgil anacı ıslahı çalışmaları sonucunda elde ettikleri bitkileri testlemişlerdir. Tarama çalışmaları toprak kültüründe 0, %5 ve %15 CaCO 3 lı ortamlarda yapılmıştır. Yaklaşık 3 ay stres uygulanan bitkilerde büyüme ve kloroz durumlarına göre melez bitkilerin Fe klorozuna tepkileri belirlenmiştir. Castle ve ark., 2009, bazı turunçgil ve akrabalarının Fe klorozuna karşı gösterdikleri tepkileri hem su kültüründe hem de %5,9 CaCO 3 eklenmiş toprak kültüründe incelemişlerdir. Araştırıcılar, su kültürü ve CaCO 3 eklenmiş toprak kültüründeki sonuçların birbirleriyle ve daha önceki çalışmalardan elde edilen verilerle uyum içinde olduğunu bildirmişlerdir. Demir klorozu açısından, Fe redüktazı salgılama oranlarına göre, Volkameriana, Rangpur laymı ve turunç seleksiyonlarının üç yapraklı ve melezlerinden daha iyi tolerans gösterdiklerini saptamışlardır. Topraklarda kireç fazlalığından kaynaklanan Fe klorozu sorunu bu tip topraklarda yetişebilecek uygun anaç ve bitki çeşitlerinin seçilmesi veya ıslah edilmesi ile çözümlendirilebilir (Özdemir, 2005). 36

58 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Turunçgillerde anaç ıslahı çalışmaları 1800 lü yılların sonlarına doğru, Florida da meydana gelen donlar sonucu turunçgil bitkilerinin kaybedilmesiyle başlamıştır (Tuzcu, 2000). Turunçgillerin dünyada kaydettikleri hızlı gelişmede anaçların önemli katkıları olmuştur. Anaçların sahip oldukları değişik ve farklı özellikler nedeniyle yetiştiricilikte karşılaşılan sınırlayıcı ve engelleyici etmenlerin çözümlenmesinde çok çeşitli yararlar sağladıkları bir gerçektir (Yıldırım, 2003). Turunçgillerin cins, tür ve çeşit yönünden büyük zenginlikler göstermeleri ve bunların bir çoğunun anaç olarak kullanılabilmelerine karşın, istenen özelliklerin hepsini kapsayan bir anaç yoktur (Yeşiloğlu ve İncesu, 2010). Turunçgil genetik ıslahı çalışmalarında kullanılan yöntemler teknolojideki değişimlerle birlikte yenilenmiştir (Khan ve Kender, 2007). Islah programlarında son yıllarda yeni teknoloji adı verilen moleküler genetik, doku kültürü ve rekombinant DNA teknolojisi gibi konuları kapsayan teknikler ile yeni olanaklar sağlanmıştır (Aka-Kaçar ve ark., 2009). Aşağıda bitki ıslahındaki yeni yöntemlerden biri olan mikroarrayla ilgili yapılan çalışmalar özetlenmiştir Mikroarray İle İlgili Çalışmalar Mikroarray teknolojisi Watson ve Crick in DNA nın moleküler yapısını aydınlatmalarının üzerinden 50 yıldan fazla zaman geçmiştir. DNA nın moleküler yapısının anlaşılmasının ardından biyoteknolojik arastırmalar da hız kazanmıştır. DNA mikroarray kavramı 1995 yılında Brown tarafından tanımlanmış olup, oldukça yüksek verimde nükleik asit analizi sağlama kapasitesinden dolayı birçok araştırmanın konusu olmuştur (Özkaralı, 2007). DNA, RNA, protein yapı ve işlevinin incelenmesinde, yeni genlerin bulunmasında veya transkripsiyon varyantlarının ve polimorfizmlerin belirlenmesinde etkin bir şekilde kullanılan biyoinformatiksel yaklaşımlar günümüzde çok önemli bir yere sahiptir. Moleküler biyoinformatik; büyük 37

59 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU moleküllerle (DNA, RNA, protein) ilgili her türlü bilginin toplanması, sınıflandırılması, uygun formata getirilerek analiz edilmesi, analizlerin yorumlanması ve bu bilgilerin ham veya işlenmiş olarak veri tabanlarında paylaşımını sağlayarak biyoloji, bilgisayar ve istatistik bilimlerinin ortak olarak kullanımını gerçekleştirmektedir (Seydel, 2007). Mikroarray teknolojisi farklı düzeylerde 20 yıldan beri kullanılan bir teknik olmasına rağmen, son zamanlarda kullanılan tamamlayıcı DNA (complementary DNA, cdna) mikroarray teknolojisiyle bilim dünyasına birçok yenilikler kazandırmış, bu teknolojinin farklı kullanım alanları olmasına rağmen, son yıllarda daha çok değişik organizmalarda genomiks çalışmalarında genlerin ekspresyon analizlerinde kullanılmaktadır. Mikroarray, DNA ların çipler, küçük cam slayt veya naylon membran üzerinde hibridizasyonla, genlerin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi için kullanılan bir yöntemdir ve genel olarak üç farklı mikroarray çeşidi bulunmaktadır. Bunlar oligonükleotit çipleri, oligonükleotit array ve cdna arraydir. Oligonükleotide çipler cam üzerine UV-maskelemesi veya ışıkla aktif olan kimyasal kullanılarak direk olarak sentezlenmiş ve sabitlenmiş kısa oligoları içermektedir. Oligonükleotit arraylar ise önceden sentezlenmiş oligoların cam slayt veya naylon membran üzerine konmasından oluşurken; PCR kullanılarak cdna veya EST lerden amplifikasyonla elde edilen cdna ların cam slayt veya naylon membran üzerine konulmasından da cdna arraylar oluşur. Mikroarray teknolojisi, nükleik asitlerin seçici ve farklılığa dayanan hibridizasyon yöntemi ile elde edilen gen ekspresyon analiz sonuçlarını kullanır. Bu teknolojide ilk olarak iki farklı koşulda tutulan iki ayrı örnekten izole edilen messenger RNA (mrna) lardan RT (reverse transcriptase) yöntemi ile cdna lar sentezlenir. Sonra bu örneklerin biri siyanin 3 (cyanine, Cy3) ve diğeri siyanin 5 (cyanine, Cy5) boyasıyla etiketlenip işaretlenerek iki farklı prob oluşturulur. Cy5 ve Cy3 iki farklı boya olup farklı emme ve uyarılma özelliğine sahip olmalarından dolayı iki farklı renk, kırmızı ve yeşil üretirler. Bu iki farklı boyayla etiketlenip işaretlenen ve iki farklı örnekten elde edilen cdna lar karıştırılır ve oligonükleotidleri veya cdna baz dizilerini içeren ve binlerce geni ifade eden DNA 38

60 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU mikroarrayleriyle hibridizasyon için kullanılır. Genomdaki her bir geni temsil eden bu cdna parçacıkları hibridizasyon sırasında farklı sinyaller vermektedir. Hibridizasyon sırasında üretilen sinyallerin yoğunluğu örneklerdeki mrna miktarları ile orantılıdır. Sonra, bağlanmayan probları uzaklaştırmak için yıkama işlemi yapılır. Daha sonra, boyaların ışıkla uyarılmasıyla oluşan kırmızı ve yeşil renkteki Cy3 ve Cy5 sinyalleri array tarayıcıları yardımıyla farklı dalga boylarında okunur ve iki farklı dalga boyunda elde edilen Cy3 ve Cy5 sinyallerinin oranları bir cdna parçacığının iki farklı probdaki yoğunluğunu ifade eder. Bu sinyallerin yoğunluklarını karşılaştırmak ve analiz sonuçlarını sayısal olarak belirlemek için bu amaçla hazırlanmış bilgisayar programları kullanılır. Bu programlar sayesinde hibridizasyon sonucunda mikroarrayden elde edilen sinyaller, bilgisayarda birleştirilerek üç farklı renkte görüntülenir. Elde edilen bu görüntüde kırmızı renk, herhangi bir mrna nın prob 1 de prob 2 ye göre fazla olduğunu; sarı renk, mrna nın iki farklı probda da eşit miktarlarda bulunduğunu; yeşil renk ise, mrna nın prob 2 de prob 1 e göre daha fazla olduğunu ifade eder. Daha sonra her bir sinyalin ortalaması alındıktan sonra mikroarrayde kendiliğinden oluşabilecek sinyal çıkartılıp ve her bir değer için normalizasyon işlemi farklı koşullarda ekspresyonu değişmeyen temel bir genle (housekeeping gene) veya sinyal yoğunluğu bilinen herhangi bir mrna kullanılarak yapılır. Normalleştirilen bu veriler gen ekspresyon profillerinin belirlenmesinde kullanılır (Şahin-Çevik, 2005) Turunçgillerde Fonksiyonel Genomik Çalışmaları Organizmaları oluşturan hücrelerin içerdikleri toplam genetik bilginin tümü genom olarak tanımlanmaktadır. Arabidopsis thaliana genomu 2000 yılında tamamlanarak bitkilerde genom DNA baz dizisi belirlenen organizmalar içinde yerini almıştır. Arabidopsis genomunun ardından pirinç bitkisinin (Oryza sativa) tüm genom baz dizileri belirlenmiştir. Organizmaların bütün genom bilgilerinin moleküler düzeyde karakterize edilmesi genomiks olarak adlandırılmaktadır ve çalışma alanlarına göre yapısal ve fonksiyonel olarak iki gruba ayrılmaktadır. 39

61 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Yapısal genomiks genetik ve fiziksel haritalama ve DNA baz dizilerinin belirlenmesi yöntemleriyle organizmaların genetik bilgilerinin ortaya çıkarılmasını sağlarken, fonksiyonel genomiks ise genlerin ekspresyonunu, biçim, miktar ve zaman açısından genom düzeyinde inceleyerek genlerin fonksiyonlarının öğrenilmesini ve organizma açısından öneminin anlaşılmasına yardımcı olur (Şahin-Çevik,2005). İlk fonksiyonel genomik çalışmaları, Arabidopsis thaliana üzerinde yoğunlaşmıştır. Daha sonra, pirinç, buğday, yonca, sorgum, Hindistan cevizi, mısır, domates, şeker kamışı, sert çekirdekli meyve türlerinde ve diğer türlerde de çalışmalar başlamıştır (Forment ve ark., 2005). Turunçgillerde fonksiyonel genomik çalışmalarında ilk EST (ekspre edilmiş dizilimler) seti Omura ve ekibi (Hisada ve ark.,1997) tarafından oluşturulmuştur. Daha sonra Bausher ve ark. (2003) portakal; Shimada ve ark. (2003) satsuma mandarininde ESTs oluşturmak için çalışmışlardır (Talon ve Gmitter, 2008). Turunçgillerde ilk cdna mikroarrayleri ise Shimada ve ark. (2003) tarafından oluşturulmuştur. Turunçgillerde meyve gelişimi aşamasından elde edilen 2213 genin mrna ekspresyonları mikroarray yöntemiyle görüntülenmiştir. Dünyada, en fazla üretimi yapılan turunçgil meyveleri ile ilgili fonksiyonel genomik çalışmaları İspanya da Turunçgil Fonksiyonel Genomik Projesi (CFGP) altında başlatılmıştır. Bu projede, turunçgillerin biyolojik aşamaları (vejetatif gelişme, çiçeklenme, meyve tutumu ve gelişimi, meyve kalitesi, meyve olgunlaşması ve dökümler), biyotik ve abiyotik stres faktörleri (virus ve mantar enfeksiyonları, tuzluluk, kuraklık ve Fe klorozu) ve derim sonrası aşama (soğuk ve mantari enfeksiyonlar) amaçlanmıştır. İspanya da, klemantin mandarininin ekonomik öneminden dolayı klemantin mandarininden genomik kütüphanesi oluşturulmuştur yüksek kaliteli ESTs fonksiyonel olarak tanımlanmış ve sı tek transkript veya unigene olarak belirlenmiştir klonu oluşturulan Turunçgil transcriptomunun 6875 varsayılan unigeni cam slaytlar üzerinde noktalandırılmış ve cdna mikroarray çalışmaları için kullanılmaktadır (Forment ve ark., 2005). Daha sonra Riverside California Üniversitesi, Davis California Üniversitesi, Valencia-İspanya Turunçgil Genomik konsorsiyumunda görevli araştırıcılar portakal, klemantin mandarini, altıntop, üç yapraklı ve melezlerinde çalışarak ESTs ler 40

62 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU oluşturmuşlardır yılında NCBI (National Center for Biotechnology Information) ESTs database ine turunçgil sekansı ulaşmıştır. Bu ESTs koleksiyonunda turunçgillerde üreme, vejetatif organ ve dokuların farklı gelişme aşamalarındaki durumlarından ve biyotik-abiyotik strese karşı gösterdikleri tepkilerden oluşturulmuş cdna kütüphanelerinden elde edilen sekanslar bulunmaktadır. Ancak bu ESTs lerin tümü üzerinde çalışmalar başlamış olmakla beraber henüz tamamlanmamıştır. Valencia-İspanya Turunçgil Genomik Konsorsiyumu, ilk nesil cdna mikroarrayini geliştirmiştir. Söz konusu mikroarray, EST koleksiyonundan seçilen 6875 putative unigene karşılık gelen sayıda probu içermektedir. Daha sonra, mikroarray slaytları zaman içinde daha da geliştirilmiştir. Bu konsorsiyumun oluşturduğu son mikroarrayler, unigen içeren elementli cdna arrayleri geliştirilmiştir. Bu arrayler, 52 farklı cdna kütüphanesinden elde edilen yaklaşık yüksek kaliteli sekansa dayalıdır (Talon ve Gmitter, 2008) Stres Çalışmalarında Mikroarray Turunçgillerde mikroarray çalışmaları, dökümlere (Agusti ve ark., 2008), çiçeklenmeye (Nishikawa ve ark., 2010), klemantin mandarininde meyve etinin gelişme ve olgunlaşmasına (Cercos ve ark., 2006), satsuma mandarininde meyve gelişimine (Shimada ve ark., 2005) ve kan portakallarında renklenmeye (Bernardi ve ark., 2010) neden olan genlerin belirlenmesinde kullanılmıştır. Mikroarray, özellikle stres fizyolojisi çalışmalarında etkin olarak kullanılmaktadır. Bitkilerde abiyotik ve biyotik stres koşullarında hangi genlerin devreye girdiğinin belirlenmesi ve genlerin tanımlanmasıyla bitki ıslahında markör olarak kullanılması mümkün olabilmektedir. Thimm ve ark. (2001), arabidopsis bitkisinde Fe noksanlığı uygulandıktan sonraki 1, 3 ve 7. gün örneklemelerinde kök ve sürgünlerde mikroarray çalışmasıyla ekspre (ifade) olan genleri incelemişlerdir. Sürgünlerde 1. gün 143, 3. gün 2240 ve 7. gün 847 gen; köklerde 1. gün 84, 2. gün 776 ve 7. gün 847 gen indüklenirken; aynı uygulamalarda baskılanmış olan gen sayıları sürgünlerde sırasıyla 143, 620 ve 299; 41

63 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU köklerde ise 76, 767 ve 735 olarak belirlenmiştir. Çalışmanın sonunda, indüklenen genler metabolizma, protein, taşınım, sinyalleme (DNA ve RNA binding), fotosentez, hücre organizasyonu ve stres olarak 8 fonksiyonel grupta kategorize edilmiştir. Seki ve ark. (2002), kuraklık, düşük sıcaklık ve tuzluluk olmak üzere 3 farklı stres altında ayrı ayrı yetiştirilen arabidopsis bitkilerinde adı geçen stress koşullarında hangi genlerin ifadesinin gerçekleştiğini bulmak için yaptıkları araştırmada, yaklaşık 7000 indepented ve full-length c-dna lar kullanmışlardır. Araştırma sonucunda düşük sıcaklık stresinde 53, kuraklıkta 277 ve yüksek tuzluklukta ise 194 geni tanımlamışlardır. Ayrıca, 22 genin üç stres koşulunda da etkin olduğunu bildirmişlerdir. Şahin-Çevik ve Moore (2006), soğuklara dayanıklılık genini bulmak için Poncirus trifoliata ya ait fidanlarda iki ayrı uygulama yapmışlardır. Fidanların bir kısmına 2 gün soğuk; kalan diğer bitkiler ise kontrol grubu olarak belirlemişlerdir. c- DNA kütüphanesi soğuk indüklemesinden (cold-induced) elde edilen genlerle oluşturulmuştur. Bu c-dnakütüphanesinden elde edilen PI-B05 ve PI-C10 adlı c- DNA lar karakterizasyon için seçilmişlerdir. Yapılan ekspresiyon analizleri sonucunda bu genlerin soğuklara karşı dayanıklı olan Poncirus trifoliata da aktive olduğu ve soğuklara karşı duyarlı olan şadokta ise (Citrus maxima) bu genlerin ekspre olmadığını bildirmişlerdir. Araştırıcılar, yaptıkları sekans analizleri ve ekspresyon çalışmaları sonucunda, bu genlerin soğuklara tepki gösteren (coldresponsive) gen ekspresyonunda rol aldığını ve bunun da soğuklara duyarlı turunçgillerde soğuklara dayanımı arttırmak için kullanılabileceğini belirtmişlerdir. O Rourke ve ark. (2007), kireçli topraklarda yetiştirilen soyaların yapraklarındaki klorotik nekrozların artışıyla verimlerinin düşmesi sebebiyle soyadaki verim kaybını genetik ve fizyolojik yönden incelemişlerdir. Demir alımında etkinlikleri farklı iki isogenik hattan (PI Fe etkin) ve (PI Fe-inaktif) köklerinden elde edilen RNA lar kök spesifik EST den oluşturulmuş 9728 cdna içeren mikroarraylerde karşılaştırılmıştır. Su kültüründe, iki hafta boyunca Fe eksikliği stresine sokulan bu isogenik hatlarda 43 genin ekspre olduğu belirlenmiştir. Ekspre olan bu 43 genin, %57 sinin 42

64 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU stres koşullarında aktive oldukları kümeleme analiziyle belirlenmiştir. Kontrol bitkilerinde ise farklı ekspre olan gen bulunmamıştır. Demir stresinde ekspre olan genler Real-Time PCR (RT-PCR) da karşılaştırılmıştır. RT-PCR denemeleri Fe-etkin ve Fe etkin olmayan bitkilerde tesadüfü 9-10 gen seçilerek test edilmiştir. Demir fizyolojisini daha iyi anlayabilmek için Fe-redüktaz ölçümleri yapılmış ve Fe etkin olmayan bitkiler Fe eksikliği stresinde daha fazla Fe-redüktaz enzimi sentezlemişlerdir. Bu çalışmada Fe klorozu stresi altındaki bitkilerde hangi genlerin aktive olduğu araştırılmıştır. Single linkage cluster analizinde Fe eksikliği stresi tepkileri kadar genel stres tepkileri de görülmüştür. Kök membranına bağlı redüktaz kapasitesinin Fe etkinliğiyle çok sıkı ilgili olduğunu ve Fe noksanlığı koşullarında Fe etkin olmayan bitkilerde bu enzimin az sentezlenirken, Fe etkin bitkilerde bu enzimin salgılanma kapasitesinin oldukça yüksek olduğu belirtilmiştir. Araştırıcılar, Fe etkin olmayan soya bitkisinde etkin (up-regulated) genlerin bir çoğunun bilinen stres tepkilerini içerdiğini ve Fe etkin olmayan bitkilerin Fe stresine karşı gösterdikleri sinyalleme ve düzenleyici genlerin aşırı sentezi gibi tepkilerin nedeninin hücresel denge için olabileceğini vurgulamışlardır. Ayrıca etkin (up-regulated) genlerin görevinin moleküllerin membrandan geçişini arttırdığını; reaktive oksidatif türlerle ilgili olan genlerin ve ROS savunma enzimlerinde de indüklendiğini bildirmişlerdir. Söz konusu, etkin (up regulated) genlerin Fe stresinden kaynaklanan hücresel çevrede meydana gelebilecek aksaklıkları gidermek için DNA tamiri ve RNA stabilitesini koruduğunu, indüklenen diğer genlerin ise protein ve yağ katabolizmasında görev aldığını belirlemişlerdir.brumos ve ark. (2009), tuzluluğa duyarlıklıkları ile bilinen turunçgiller de tuza tolerant Kleopatra mandarini (Citrus reshni) ve tuza hassas Carrizo sitranjında bu anaçların farklı iyon tuzlarına karşı gösterdikleri tepkileri mikroarray ve bazı stres parametleri ile belirlemeye çalışmışlardır. Bu çalışmanın sonucunda, Carrizo sitranjında 869, Kleopatra mandarininde ise 208 unigen ekspre olmuştur. Bu genlerin %90 ve %75 i, uygulanan farklı tuz kaynaklarında ortak olarak ekspre edilmişlerdir. Bu çalışmada, ekspre edilen genler kategorize edilerek, stres ölçümlerinden elde edilen sonuçlarla kıyaslanarak, duyarlı ve tolerant genotiplerin karşılaştırılması yapılmıştır. 43

65 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Forner-Giner ve ark. (2010), demir klorozuna duyarlılığı ile bilinen ve turunçgillerde anaç olarak kullanılan Poncirus trifoliata (Rubidoux) 18 um ve 0 um dozlarında, kuvars ortamında Fe-EDDHA kullanılarak (60 gün boyunca) bu anacın Fe noksanlığında gösterdiği tepkiyi moleküler ve fizyolojik açıdan incelemişlerdir. Mikroarray çalışması sonucunda, Fe noksanlığında toplam 10 genin aktive olduğunu belirlemişlerdir. Hücre duvarı fonksiyonunda 5 (C31502B08, C05140C08, C05133B06, C19009B12, C05811H06), stres fonksiyonunda 3 (C05807F01, C3 1108D11, C05802F05), elektron taşınımı fonksiyonunda 1(C34001B04) ve görevi bilinmeyen 1 (C05002B06) genin ekspre olduğu belirlenmiştir. Yaptıkları fizyoloji çalışmalarında, Fe noksanlığında bitkinin katalaz ve peroksidaz aktivitelerinin sırasıyla %60 ve %50 oranlarında azaldığını, klorofil miktarının kontrolde %25 daha fazla bulunduğunu belirtmişlerdir. Hücre duvarı fonksiyonlarında yer alan 5 genin Fe noksanlığında ekspre olması nedeniyle inceledikleri kök hücre duvarlarında, stres altındaki bitkilerdeki kök hücre duvarlarının kontrol bitkilerine göre daha ince olduğunu bildirmişlerdir Demir Alımı İle İlgili Bulunmuş Genler Bugüne kadar yapılan çalışmalarda, Saccharomyces cerevisiae mayasında CCC1, FET1-FET5, FRE1-FRE7 ve FTR1; Arabidopsis te FRO2, IRT1-IRT2, NRAMP1,3,4; Arpa (Hordeum vulgare) da NaatA, NaatB, NAS, IDS1-IDS3; Medikado (Medicago truncaluta) da MtZIP3, MtZIP5, MtZIP6; bezelye (Pisum sativum) de FRO1; Hint baklası (Ricinnus communis) da ITP ve mısır (Zea mays) da YSL1 ve YSL8 genlerinin Fe ile ilgili genler olduğu tespit edilmiştir (Vasconcelos ve Grusak, 2006). Strateji 1 bitkilerinde Fe, plazma membranında Fe redüktaz aktivitesi ile Fe(III) indirgenerek çözünebilir hale geldikten sonra rizosferden kök hücrelerine taşınımı gerçekleşir (Mukherjee ve ark., 2006). Demirin, ferrik formundan ferros formuna indirgenmesinde rol alan arabidopsis bitkisinde AtFRO2 ve bezelyede PsFRO1 genleri tanımlanmış ve izole edilmiştir. Ayrıca, Strateji 1 bitkilerindeki Fe alım mekanizmasını açıklayabilmek için Fe transporter genleri arabidopsis bitkisinde 44

66 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU IRT1, IRT2, NRAMP1, NRAMP3 ve NRAMP4; domateste LeIRT1, LeIRT2, LeNRAMP1 ve LeNRAMP3; pirinçte OsIRT1 ve bezelyede PsRIT1 genleri üzerine çalışmalar yoğunlaşmıştır (Li ve ark., 2004; Santi ve Schmidt, 2009). Arabidopsis bitkisinde Fe şelat redüktaz aktivitesinden sorumlu FRO gen ailesinin 8 üyesi bulunmaktadır (Schmidt, 2006). Bu gen ailesi, elektronların membrandan geçişini sağlayan flavositokrom süperfamilyasına bağlı bir alt gruptur (Robinson ve ark., 1999). Samuelson ve ark., (1998), demir alımında Strateji I ve II aşamalarında görev alan genleri klonlanmış ve farklı bitki türlerine aktarılarak performanslarını incelemişlerdir. Mayalarda Fe indirgeme görevini yapan FRE1 ve FRE2 (Fe(III redüktaz kodlayıcı genleri) genleri, tütün bitkisine aktarıldığında ve FRE1 ve FRE2 taşıyan transgenik tütünlerinde kök redüktaz aktivitesinin kontrol bitkilerine göre 4 kat fazla olduğunu, ancak bu artışın yapraktaki Fe oranına yansımadığını bildirmişlerdir. Araştırıcılar, daha sonra, Fe şelat redüktaz genini, FRO2 taşıyan transgenik bitkiler elde ettiklerini belirtmişlerdir. Waters ve ark. (2002), bezelye bitkisinde yaptıkları çalışmalarında FRO1 geninin Fe(III) şelat redüktaz aktivitesini kodladığını; kök, yaprak ve yumrularda ekspre edildiğini bildirmişlerdir. Ayrıca FRO1 geninin mrna sının kökte özellikle en yoğun olarak dış epidermal hücrelerde, yapraklarda ise mezofil hücrelerinde ekspre olduğunu saptamışlardır. Li ve ark. (2004), domates bitkisinde yaptıkları çalışmalarında LeFRO1 geninin domatesin Fe alım sisteminde Fe şelat redüktaz aktivesini etkileyen major bir gen olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca bu gen kök, yaprak, genç meyve, çiçek ve kotiledonlarda da ekspre olmuştur. Araştırıcılar LeFRO1 geninin topraktan Fe alımı ve sürgün ile diğer çoğaltım organlarına taşınmasında önemli rol oynadığını belirtmişlerdir. Mukherjee ve ark. (2006), arabidopsis bitkisinin meyve, çiçek, rozet yaprak ve gövdelerinde FRO alt grubuna bağlı genlerin aktivitelerini incelemişlerdir. FRO ya bağlı 8 genden FRO3 aktivitesinin yaprak plazma membranındaki redüktaz aktivitesi için en iyi aday olduğu belirlenmiştir. FRO2 ise rozet yapraklarda ve sürgünlerde aktive olmuş, ayrıca FRO3 kadar olmasa da rozet yaprakların plazma 45

67 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU membranındaki redüktaz aktivitesinde iyi sonuç vermiştir. Ancak, FRO2 geninin mrna düzeyi için, kontrol ve (-) Fe bitkileri arasında önemli bir fark bulunmamıştır. FRO6 ve FRO7 genleri ise karanlık ve ışığa maruz bırakılmış arabidopsis bitkilerinde incelenmiş, her iki uygulamada da bitkinin fotosentetik dokularında ekspre olmuşlardır. Demirin bitki bünyesinde başlıca plastidlerde ferrritin olarak depolanması nedeniyle, FRO6 ve FRO7 genlerinin Fe in kloroplastlara taşınımında görev aldıkları düşünülmüştür. Arabidopsis bitkisinde FRO4 geni sadece meyvede, FRO5 geninin ise sadece köklerde ekspre olduğunu bildirmişlerdir. FRO2 nin köklerdeki epidermal hücrelerde ekspre olurken, FRO5 in ise diğer hücrelerde aktive olduğu düşünülmektedir. Ayrıca, FRO2 ve FRO5 genlerinin topraktan Fe alımı sırasındaki indirgemede görev aldıkları tahmin edilmektedir. Demir taşınımında görev alan IRT1, ZIP familyasına bağlı bir gendir. Bu familyada bakteri, memeliler ve zebra balığı gibi çok çeşitli organizmalarda tanımlanmış 100 den fazla gen bulunmaktadır. Bu familyaya ait genler, Fe, Mn, Zn, Cu ve Cd elementlerinin taşınımı görevini üstlenirler (Hall ve Guerinot, 2006). Eide ve ark., (1996), arabidopsis ten izole ettikleri IRT1 genini, mutant mayalara aktarmışlar ve bu genin Fe alımını aktive ettiğini ileri sürmüşlerdir. Vert ve ark., (2002), arabidopsis te IRT geninin kökün external hücre tabakasında, özellikle Fe noksanlığı durumunda ekspre olduğunu bildirmişlerdir. Bughio ve ark., (2002), pirinçte OsIRT1 ve OsIRT2 genlerini tanımlamışlardır. OsIRT1 geninin Fe ve Cu noksanlığında özellikle köklerde ekspre olduğunu; ancak OsIRT1 geninin Fe in taşınımında rol alırken, Cu taşınımında rolü olmadığını belirtmişlerdir. Domateste Fe taşınımının indüklenmesi için FER genine ihtiyaç duyulmaktadır. Arabidopsis te bulunan FRU (Fe alımının FER benzeri regülatörü) geni, domatesteki FER geninin homoloğudur. FRU köklerde Fe noksanlığında ekspre olur. FRU geni Fe taşınımı için elzem olan FRO2 ve IRT1 genlerinin indüklenmesi için gereklidir. Arabidopsis bitkisinde Fe in düşük olduğu koşullarda FRU geninin fazla ekspre olmasıyla Fe taşınımı artmıştır. Bu sonuç; FRU geninin Arabidopsiste Fe taşınımının indüklenmesi için aracı olduğunun göstergesidir (Jacoby ve ark. (2004). 46

68 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU Hall ve Guerinot (2006), IRT1 geninin ortolog bir gen olabileceğini belirtmiştir. Araştırıcı, Eckhardt ve ark., (2001) tarafından domateste yapılan çalışmada LeIRT1 ve LeIRT2 genlerinin, kodladıkları proteinlerin sırasıyla %64 ve %62 sinin, AtIRT1 tarafından kodlananlarla aynı olduğunu bildirmiştir. Ayrıca, LeIRT1 ve LeIRT2 genlerinin sekansları incelendiğinde birbirleriyle çok benzer özellikler gösterirken, arabidopsiste bulunan AtIRT1 ve AtIRT2 genlerinin farklı olduklarını belirtmiştir. Bu durumun, Arabidopsisteki bu genlerin, domatesten çok daha önce bulunmasından kaynaklanabileceğini ileri sürmüşlerdir. Araştırıcılar, LeIRT1 ve AtIRT1 genlerinin ortolog ancak LeIRT2 ve AtIRT2 genlerinin ortolog olmadığını düşündüklerini ifade etmişlerdir. Ayrıca, arabidopsiste bulunan 15 ZIP proteini ile LeIRT1 ve LeIRT2 genlerinin kümelenmesini incelediklerinde, LeIRT1 ve LeIRT2 genlerinin AtZIP10 ile çok benzerlik gösterdiğini belirtmişlerdir. AtZIP10 expresyonunun Fe noksanlığı koşullarına düşük olduğunu belirtmişlerdir. NRAMP genleri bir çok olayda görev alan proteinleri kodlar. Memelilerde ve mayalarda bazı NRAMP proteinleri Fe de dahil olmak üzere metal iyonlarının taşınımında görev alır (Curie ve ark., 2000; Thomine ve ark., 2000). Curie ve ark. (2000), arabidopsis bitkisinde beş NRAMP proteini üzerine yaptıkları çalışmada AtNRAMP1 (Natural Resistance Associated Macrophage Protein 1 (NRAMP1), geninin bitkilerde Fe durumunu (homoeostatis) kontrol eden genlerden biri olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar, toksik Fe konsantrasyonlarına karşı dayanım için AtNRAMP1 geninin expresyonunda artış meydana geldiğini bildirmişlerdir. Thomine ve ark.,(2000), metal iyonların bitki bünyesindeki dengesi bitki besleme ve ağır metal toksisitesine dayanım açısından son derece önemli ve Arabidopsis ten izole edilen AtNRAMP cdna larının metal alımı eksikliği gösteren mutant maya ırkının tamamlayıcısı olduğunu belirtmişlerdir. AtNRAMP geni bakteri, maya, bitki ve hayvanlardaki NRAMP gen ailesi ile homoloji göstermiş ve mayalarda AtNRAMP cdna larının ekspresyonundaki artış Cd +2 duyarlılığını ve Cd +2 birikimini arttırmıştır. AtNRAMP3 ve AtNRAMP4 genleri Fe alımı mutant mayaların komplementeri olarak belirlenmiştir. Araştırıcılar bu durumun, NRAMP genlerinin bitkilerde Fe taşınımında rolleri olduğunu ve NRAMP taşıyıcılarının 47

69 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meral İNCESU fonksiyonel özelliklerinin oldukça geniş olduğunu gösterdiğini ileri sürmüşlerdir. Arabidopsiste AtNRAMP geninin metal doygunluğunda köklerde ve havalanan kısımlarda ekspre olduğunu, ancak AtNRAMP3 ve AtNRAMP4 genlerinin ise Fe noksanlığında expre olduğunu belirtmişlerdir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, NRAMP genlerinin bitkilerde metal taşınımında; AtNRAMP ın ise Fe ve toksik metal Cd +2 taşınımında görev aldığı yönündedir. Ayrıca AtNRAMP3 dağılımının Fe açlığı durumunda fazla miktarda ekspre olarak metal iyonlarını birikimini arttırma eğiliminde olduğu, ancak, Fe alım mekanizmasının bu genin fazla miktarda ekspre olmasını azaltarak düzenlediği ve böylece Fe noksanlığı durumunda metal birikiminin önlendiği bildirilmiştir. Bereczky ve ark., (2003), NRAMP1 geninin Fe eksikliği çeken bitkilerin vasküler parankimasındaki Fe taşıma görevini üstlendiğini ileri sürmüşlerdir. Lanquar ve ark., (2005), AtNRAMP3 ve AtNRAMP4 genlerinin Arapidopsis bitkilerinin tohum çimlenmesi sırasında vakuolar depolardan Fe in mobilizasyonunu sağladığını, ayrıca bu çalışmada AtNRAMP4 Fe noksanlığında etkin (upregulate) olarak bu gene ait proteinlerin kök ve sürgünlerde depolandığı belirtilmiştir. 48

70 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tuzcu Turunçgiller Koleksiyonu ve Fransa (Agricultural Research Station, SRA; Institut National de la Recherche Agronomique, INRA) Turunçgiller Koleksiyonu ndan temin edilen ve Çizelge 3.1. de adları belirtilen 16 turunçgil cins, tür ve çeşidi bu çalışmanın bitkisel materyalini oluşturmuştur. Çizelge 3.1. Tarama çalışmasında kullanılan genotipler Tür ve Çeşit Adları Ulusal Gen Kaynakları Kodu Latince Adları Tuzcu turuncu TUR Citrus aurantium L. Tuzcu 891 turuncu TUR Citrus aurantium L. (referans) Citrus aurantium L. var. Gou Gou Tou turuncu TUR Tou Citrus volkameriana V. Ten. Pasq Volkameriana TUR Duncan altıntopu - Citrus paradisi Macf. Citrus sunki (Hayata) hort. ex Tanaka Sunki mandarini TUR Antalya Kleopatra mandarini TUR Citrus reshni Tan. var. Antalya Nasnaran mandarini TUR Citrus amblycarpa Ochse Citrus reticulata Blanco x Citrus Sarawak bintangor - aurantium L. Marumi kamkat - Fortunella japonica Swing. Swingle sitrumelo (Sitrumelo 4475) TUR Kleopatra mandarin X Swingle sitrumelo melezi - Citrus paradisi Macf. var. Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf. Citrus reshni Tan., X [Citrus paradisi Macf. X Poncirus trifoliata (L.) Raf.] Carrizo sitranjı TUR Citrus sinensis (L) Osb. x Poncirus trifoliata (L) Raf. C-35 sitranjı - Citrus sinensis. Osb. 'Ruby' X Poncirus trifoliata (L.) Raf. Pomeroy üç yapraklı TUR Poncirus trifoliata var. Pomeroy Yerli üç yapraklı TUR Poncirus trifoliata (L.) Raf. (referans) 49

71 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Demir klorozuna tolerans düzeylerini ortaya koymak amacıyla iklim odası ve doğal koşullar altında denemeye alınan genotiplerin özellikleri aşağıda belirtilmiştir Çalışmada Kullanılan Genotiplerin Özellikleri Tuzcu Turuncu (Citrus aurantium L.) 1974 yılında Doğu Akdeniz bölgesinden selekte edilmiştir (Yeşiloğlu, 1982). Dik habitüs formlu ve soğuğa tolerant bir turunçtur (Demirkeser, 1993) Tuzcu 891 Turuncu (Citrus aurantium L.) Avustralian SRA turuncundan aşı gözü seleksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Uçkurutana (Phoma tracheiphila) toleranttır Gou Tou Turuncu (Citrus aurantium L. var. Gou Tou) Çin kökenli bir anaç olup Tristeza ya (Göçüren - CTV) toleranttır (Moreno ve ark., 1992). Tuzlu topraklarda iyi performans gösterdiği bildirilmektedir (Fu ve ark., 2004). Florida da Gou Tou anacı üzerine aşılı bitkiler diğer turunçlar üzerine aşılı olanlara göre daha büyük bir habitüse sahip olmuşlardır (Saunt, 2000). Gou Tou turuncunun, altıntoplarda verimi azalttığı bildirilmiştir (Louzada ve ark., 2008). Gou Tou turuncu Phytophthora citrophthora ve Phytophthora parasitica hastalıklarına toleranttır (Matheron, 1998) Volkameriana (Citrus volkameriana V. Ten. Pasq) Volkameriana anacının İtalya kökenli ve limon x turunç melezi olduğu öngörülmektedir. Çok yaygın olarak kullanılan bir anaç değildir ve gelecek yıllarda da yaygın kullanılan anaçlar içerisinde yer alamayacağı varsayılmaktadır. Kaba limona benzer şekilde farklı toprak koşullarına adaptasyon yeteneği yüksektir. Ancak 50

72 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU sıcak bölgelerde çok kuvvetli ve verimli ağaçlar oluşturmaktadır. Kireçli topraklarda iyi gelişme göstermektedir. Tuzluluğa toleransı zayıftır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). İspanya da yapılan çalışmalarda Volkameriana nın demir alımında, yaygın olarak kullanılan turunçtan dahi daha etkin olduğu bulunmuştur (Wright, 1998). Tohumla çoğaltımı ve aşılanması kolay, büyümesi kuvvetli ve verime erken yatmaktadır. Meyve kalitesine etkileri özellikle ilk yıllarda iyi değildir. S.Ç.K.M./Asit oranını bir miktar azalttığı, granülasyona neden olabildiği, meyve iriliğini önemli ölçüde arttırdığı belirtilmiştir. Volkameriana anacı nematodlara duyarlı olmasına rağmen, Cüceleşme (Exocortis - CEV), tristeza (göçüren) ve xyloporosis virüs ve viroid hastalıklarına toleranttır. Uçkurutan hastalığına (Phoma tracheiphila) ve Phytophthora parasitica ya toleranttır (Castle, 1987). Düşük sıcaklıklara ve kış dinlenme döneminde Phytophthora citrophthora'ya çok duyarlı bir anaçtır. Tüm turunçgil tür ve çeşitleri ile çok iyi uyuşmaktadır (Tuzcu, 1978; Tuzcu ve Göksedef, 1983; Özcan ve Ulubelde, 1984; Sakovich, 1986 ve Saunt, 2000) Duncan Altıntopu (Citrus paradisi Macf.) Duncan altıntopu, Florida ya götürülen ilk altıntoptur yılında Florida da Safety Limanı na yakın bir yerde dikilmiş ve 1892 yılında A.L. Duncan tarafından çoğaltımı ve tanıtımı yapılmıştır (Ziegler ve Wolfe, 1975). Ağaçları kuvvetli büyür, büyük taç yapar ve çok verimlidir. Meyveleri, Marsh altıntopundan daha iridir ve soğuklara daha dayanıklıdır. Meyvelerinde, adet tohum bulunur (Tuzcu, 1999). Altıntoplar, 1920 li ve 1930 lu yıllarda çok tanınmaları ve tohumlarının yetiştiriciliğe uygun olması nedeniyle anaç olarak yaygın şekilde kullanılmıştır (Castle, 1987). Kaliforniya koşullarında yapılan denemede, Duncan altıntopu üzerine aşılı portakal, limon, altıntop ve satsuma ağaçlarının taç iriliği ve verimi açısından bir aşırılık göstermediği, ancak Duncan altıntopu üzerine aşılı satsumaların tümünün ilk birkaç yıl içinde öldüğü bildirilmiştir (Batchelor ve Webber, 1948). 51

73 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Sunki Mandarini (Citrus sunki (Hayata) hort. ex Tanaka) Sunki mandarini, Çin de yaygın olarak kullanılmaktadır. Tristeza ve xyloporosis (gözenekleşme) virüs hastalıklarına tolerant, ancak exocortise (Cüceleşme - CEV) duyarlıdır. Sunki mandarini üzerine aşılı ağaçlar tuzluluğa yüksek tolerant, soğuklara orta derecede tolerant ve kireçli topraklara adaptasyonu yüksektir. Meyve verimi, meyve suyu miktarı ve meyve suyundaki şeker içeriği turunç üzerine aşılı ağaçlardan elde edilen meyvelerle eşit miktarda veya daha üstündür (Castle,1987; Saunt, 2000). Kireçli topraklara adaptasyonunun iyi ve demir klorozuna tolerant olduğu bildirilmiştir (Louzada ve ark., 2008) Antalya Kleopatra Mandarini (Citrus reshni Tan. var. Antalya) Kleopatra mandarini dünyada, yaygın olarak kullanılmamasına rağmen, Florida'da yaygın olarak kullanılan anaçlardan biridir. Ancak, son yıllarda anaç olarak kullanımını artıracak önemli özellikleri gözlemlenmiştir (Davies ve Albrigo, 1994). Florida da Hamlin portakalı için yaygın olarak kullanılmakta, diğer portakal çeşitlerinde, özellikle Valencia portakalında ise düşük verimlilik görülmektedir. Kleopatra üzerine aşılı altıntop çeşitlerinin meyve kalitesi mükemmel olmakta ancak, ağaçların düşük verimli ve küçük meyveli olmasına neden olmaktadır. İspanya'da Carrizo sitranjının anaç olarak kullanımı hızla artarken, Kleopatra mandarininin kullanımı azalmaya başlamıştır. Kleopatra mandarini 10 yıl önceki yeni dikimlerin % 20'sini oluştururken, son yıllarda yeni dikimlerin % 10'unda Kleopatra mandarini anaç olarak kullanılmıştır. Buna rağmen, Kleopatra mandarini İspanya'da hâlâ 2. önemli anaç durumundadır ve genellikle mandarin çeşitleri için anaç olarak kullanılmaktadır. İsrail'de de özellikle Valencia ve göbekli portakallarda yeni dikimlerin önemli bir yüzdesini Kleopatra mandarini oluşturmaktadır (Saunt, 2000). Kleopatra mandarini değişik toprak koşullarına kolayca uyum sağlayabilmektedir. Hafif tuzlu topraklardan ağır killi topraklara kadar oldukça geniş uyum yeteneğine sahiptir. Yüksek tuzluluk ve ph'ya toleranttır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). Ancak, 52

74 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU kumlu topraklarda klor iyonlarını, killi topraklara oranla daha iyi tolere eder. Kleopatra anacı üstüne aşılı bitkilerde bor, kalsiyum ve magnezyum birikimi görülür (Ferguson ve ark., 1990). Kumlu - ağır killi topraklarda iyi gelişmektedir (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). Kleopatra mandarini üzerine aşılanan ağaçların taç yapısı büyük ve orta kuvvette olmaktadır. Orta düzeyde verimlidir. Ancak, ağaçlar erken yaşta verime yatmamaktadır. Bu özelliği, anaç olarak kullanımını sınırlayan ve yayılmasını engelleyen en önemli faktördür (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). Üzerine aşılı ağaçların meyveleri diğer anaçlar üzerine aşılılardan daha küçük olmaktadır. Meyve suyu kalitesi iyi ve S.Ç.K.M.'si de orta düzeyde olmaktadır. Meyve kabuğu pürüzsüz ve incedir. Gelişme yavaş ve aynı yaştaki yerli turunç ve kaba limona oranla meyve verimi düşük düzeyde kalmaktadır. Bu anaç üzerindeki ağaçlar oldukça yavaş büyürler ve özellikle nüseller kültür çeşitleri ile aşılandıklarında, geç meyveye yatarlar (Bitters, 1961; Hosein, 1969; Özcan ve Ulubelde, 1984 ve Saunt, 2000). Kleopatra mandarininin en önemli avantajı temel bazı turunçgil virüs ve viroid hastalıklarına karşı diğer anaçlardan daha tolerant olmalarıdır. Tristeza, exocortis ile xyloporosis virüs ve viroid hastalıklarına karşı toleranttır. Nematodlara duyarlı, Phytophthora citrophthora'ya orta derecede duyarlıdır. Soğuklara dayanıklıdır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000) Nasnaran Mandarini (Citrus amblycarpa Ochse) Killi topraklara iyi uyum gösterebilen bir anaçtır. Nasnaran mandarini üzerine aşılı çeşitlerden elde edilen meyve kalitesi turunç üzerine aşılı olanlara yakındır (Castle, 1987). Tristezaya toleranttır (Georgiou ve Gregoriou., 1999). Kıbrıs koşullarında yapılan bir çalışmada klemantin mandarininin meyve verimini turunca göre azaltmış, ancak meyve kalitesi yakın bulunmuştur (Georgiou, 2002). 53

75 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Sarawak Bintangor (Citrus reticulata Blanco x Citrus aurantium L.) Mandarin ile turunç melezidir. Kireçli topraklara toleranttır Marumi Kamkat (Fortunella japonica Swing.) 'Marumi', ya da Yuvarlak Kamkat (Fortunella japonica Swing., syn. Citrus maduremis Lour.) küçük ağaççıklar meydana getirir ve soğuklara toleranttır (Ziegler ve Wolfe, 1975). Meyve şekli yuvarlaktan hafif ovale kadar değişiklik gösterir. Meyvelerinin ortalama ağırlığı g dır. Meyve başına 3-6 adet tohum bulunur (Saunt, 2000). Kamkatlar özellikle süs bitkisi olarak kullanılırlar ayrıca meyveleri şekerleme ve pasta sanayinde değerlendirilir (Tuzcu, 2000). Genellikle anaç olarak kullanılmazlar. Son dönemde yapılan bir çalışmada Marumi kamkatın demirle ilgili performansı değerlendirilmiş ve demir alımı açısından çok etkin olmadığı bildirilmiştir (Castle ve ark., 2009) Swingle Sitrumelo (Sitrumelo 4475) (Citrus paradisi Macf. var. Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) Swingle tarafından 1907 yılında Duncan altıntopu ile Üç Yapraklı nın melezlenmesi ile elde edilmiştir. Florida da yeni dikilen bahçelerin %50 sinden fazlasında ve Güney Afrika da %40 oranında Swingle sitrumelo kullanılır. Birçok çeşidin meyve verim ve kalitesine olumlu etkide bulunur. Meyve kalitesi turunç, Carrizo ve Troyer üstüne aşılı olanlarla benzerlik gösterir (Saunt, 2000). Brezilya koşullarında tristezaya tolerant anaçlar içerisinde Valencia portakalında en yüksek verimi sağlanmıştır (Hutchison, 1974). Florida da Roble portakalı ve Murcott mandarini ile uyuşmazlık göstermesinden dolayı, bu çeşitlerde anaç olarak kullanılmaz. Ancak, altıntop ve melezleri için Kaliforniya ve Florida da en iyi verim ve kalitenin eldesini sağlar (Saunt, 2000). Kıbrıs ta Sitrumelo CPB-4475 (C. paradisi Macf. P. trifoliata) üzerine aşılı Lapithkiotiki (Citrus limon (L.) Burm. F.) limonunun aşılamadan 3-4 yıl sonra öldüğünü bildirmiştir (Georgiou, 2009). 54

76 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Pakistan da Swingle sitrumelo anacı üzerine Kinnow mandarininin taç hacmi ve yaprak sayısının azaldığı bildirilmiştir (Din ve ark., 2001). Tristeza, exocortis, xyloporosis ve P. parasitica hastalıklarına toleranttır (Hutchison, 1974; Saunt, 2000). Ağaçları birçok toprakta iyi gelişir ve su baskınlarına toleranttır. Ancak ağır, kireçli ve yüksek ph lı topraklar için uygun değildir (Saunt, 2000). Demir klorozuna hassas, tuz ve bor stresine orta tolerant, ayrıca soğuklara orta toleranttır (Hutchison, 1974) Kleopatra Mandarin x Swingle Sitrumelo Melezi (Citrus reshni Tan., X Citrus paradisi Macf. X Poncirus trifoliata (L.) Raf.) Kleopatra mandarini ile Swingle sitrumelo melezi bir citrandarindir. Phytophthora parasitica ya diğer melezlere (Kleopatra x Christian, Sunki x English, Kleopatra x Swingle ve Kleopatra x English) kıyasla daha toleranttır (Blumer ve Junior.,2005). Brezilya da bu anaç üzerine aşılı 16 yaşlı Valencia portakallarının yaklaşık 2,5 m boylandığı ve tristezanın simptomlarını taşımadığı belirtilmiştir (Junior ve Blumer, 2009) Carrizo Sitranjı (Citrus sinensis (L.) Osb. x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) donlarından sonra Üç yapraklının soğuklara dayanıklılık özelliğinden yararlanarak yeni anaç elde edilmesi amaçlanmış ve Swingle tarafından 1897 yılında, Washington Navel portakalı ve Üç yapraklı melezlemesi ile elde edilmiştir (Davies ve Albrigo, 1994). Birçok nedenlerden dolayı, portakal ve altıntoplar için anaç olarak çok yaygın şekilde kullanılmaktadır. Carrizo sitranjı, meyveleri tohumlu ve yüksek oranda nüseller embriyoni göstermektedir ve anaç olarak kolaylıkla çoğaltılabilmektedir. Tohumla çoğaltım ve aşılanması kolaydır. Üzerine aşılı ağaçlar kumlu, kumlu-tınlı topraklarda iyi, kireçli topraklarda zayıf gelişmektedir. Ancak, kireçli topraklara adaptasyon bakımından üç yapraklı anacından daha avantajlı görünmektedir (Davies ve Albrigo, 1994). 55

77 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Kaliforniya'da ve Akdeniz Ülkelerinde anaç olarak başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. Troyer sitranjına göre daha hızlı gelişmekte ve meyve kalitesine daha olumlu etki yapmaktadır. Verimlilik üzerine etkisi yüksek ve üzerindeki çeşidi erken meyveye yatırmaktadır. Kök nematoduna (Radopholus similis Cob.) ve uçkurutan hastalığına (Phoma tracheiphila) toleranttır. Troyer sitranjına göre kuraklığa daha toleranttır. (Gardner ve Horanic, 1961a; Gardner ve Horanic 1961b; Ford 1966; Blondel 1967; Tuzcu, 1978; Özcan ve Ulubelde, 1984; Castle, 1984; Jackson, 1985 ve Tuzcu, 1994). Exocortis (Cüceleşme - CEV) virüs hastalığına çok duyarlı olup, Tristeza ve xyloporosis virüs hastalıklarına toleranttır. Pytophthora citrophthora'ya orta derecede duyarlıdır. Tristeza ve Pytophthora citrophthora'ya toleransları nedeniyle anaç olarak kullanımları yaygındır (Davies ve Albrigo, 1994; Saunt, 2000). İspanya'da portakal, mandarin ve mandarin melezlerinin % 80'ni Carrizo sitranjı üzerine aşılanmaktadır. Güney Afrika 'da da en çok kullanılan anaçlar arasında bulunmaktadır (Saunt, 2000). Çinko (Zn) ve mangan (Mn) noksanlığına eğilimi olduğu bildirilmektedir (Ferguson ve ark., 1990). Carrizo sitranjının yüksek ph lı kireçli topraklarda zayıf bir gelişim gösterdiği ve birçok mikroelementin noksanlığının görüldüğü belirtilmiştir (Campbell, 1991). Yüksek ph lı ortamda değişik turunçgil anaçlarının performansları değerlendiğinde demir alımı açısından Carrizo sitranjı orta duyarlı olarak belirlenmiştir (Byrne ve ark, 1995) C-35 Sitranjı (Poncirus trifoliata (L.) Raf. X Citrus sinensis. Osb. 'Ruby') Ruby Kan portakalı ve üç yapraklı anacının melezlenmesi ile elde edilmiş bir anaçtır. Pytophthora, tristeza hastalıklarına ve nematodlara karşı toleranttır. Soğuklara dayanımı Carrizo sitranjı kadar veya biraz daha fazladır. Ağaçları orta büyüklüktedir ve Troyer üzerine aşılı olanlardan %25 kadar daha küçük taç yapar. Kumlu, kumlu-killi ve killi topraklara uyumu iyidir (Saunt, 2000). Ancak, kireçli topraklara Carrizo sitranjından daha duyarlıdır (Saunt, 2000; Forner ve ark., 2003). C-35 sitranjının Kaliforniya koşullarında Zn ve Mn noksanlığına eğilimli olduğu, 56

78 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Navel portakalı aşılanan bitkilerde verimlilikte varyasyonlar olduğu; ayrıca, San Joaquin vadisinde iyi fakat, Riverside da dikimden 3 yıl sonra zayıf kaldığı bildirilmiştir (Ferguson ve ark.,1990) Pomeroy Üç Yapraklı (Poncirus trifoliata var. Pomeroy) Poncirus trifoliata dan selekte edilmiştir. Turunçgil nematoduna oldukça tolerant bir anaçtır (Baines ve ark., 1969). Büyük çiçekliler grubuna girer ve soğuklara toleranttır (Ferguson ve ark., 1990). Poncirus trifoliata ve yakın akrabaları tristezaya toleranttır (Fang ve ark.,1998). Poncirus pomeroy ve Poncirus trifoliata nın yakın akrabalıkları SSR analizleriyle de ortaya konulmuştur (Aka- Kaçar ve ark., 2009) Yerli Üç Yapraklı (Poncirus trifoliata var. Yerli) Orta ve Kuzey Çin de süs bitkisi olarak, Japonya da ise özellikle satsuma için kullanılan bir anaçtır (Castle,1987). Yaprakları 3 parçalı yapıda ve her bir parça birbirine yakın büyüklüktedir. Turunçgiller içinde yaprağını döken tek türdür. Kışın yaprağını dökmesine karşın zorunlu bir dinlenme isteği yoktur. Çiçek tomurcuğu oluşumu bir yıl önceden meydana gelir. Meyvelerinde ortalama tohum bulunur (Tuzcu, 1985). Yüksek oranda poliembriyonik, dikenli ve yavaş büyüyen bir yapıdadır. Bu cinse ait bitkiler küçük ve büyük çiçekli olmak üzere 2 grupta incelenirler. Büyük çiçekli grubu üzerine aşılı olanlar, küçük çiçeklere oranla daha yüksek verimlidir, fakat üzerine aşılı meyveler daha geç olgunlaşırlar. Exocortis hastalığına çok duyarlıdır, fakat xyloporosis ve tristezaya toleranttır. Nematoda ve phytopthoraya toleranttır (Castle, 1987;Saunt, 2000). En önemli özelliklerinden biri de soğuklara toleranslılığıdır. Dinlenme döneminde -26 C ye kadar dayanım gösterebilir (Yelenosky,1985). Kireçli topraklara çok duyarlıdır ve asidik topraklarda ancak anaç olarak kullanılabilir (Tuzcu,1985). Soğuklara ve tristezaya toleranslılığı açısından 57

79 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU melezleme çalışmalarında sıkça kullanılır. Yüksek ph lı koşullarda sıklıkla demir klorozu gösterir YÖNTEM I. Fizyoloji Denemeleri Tarama Denemeleri İklim Odası Tarama Denemesi 16 turunçgil genotipinin iklim odasında inert-substrat tekniği ile genotipik farklılıkları fizyolojik açıdan incelenmiştir. Tarama çalışmaları Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümünde bulunan iklim kontrollü bitki yetiştirme odasında yürütülmüştür. Yetiştirme odasında 16/8 saat aydınlık ve karanlık, gündüz/gece 26 o C ve 20 o C sıcaklık sağlanırken, oransal nem %65 dolaylarında düzenlenmiştir. Demir klorozuna tolerans düzeyleri belirlenmiş genotipler, eksik Fe ve kontrol (Fe ile optimum düzeyde beslenme) bitkileri olarak ayrı ayrı yetiştirilmişlerdir. Demir eksikliği altında büyütülen bitkiler, (-)Fe; Fe ile yeterli koşullarda büyütülen bitkiler ise kontrol bitkileri; ve ilgili uygulamalar (-)Fe ve kontrol uygulamaları olarak anılacaktır. (-)Fe ve kontrol uygulamalarında her genotipten 5 tekerrür ve her tekerrürde 6 bitki olmak üzere deneme Tesadüf Parselleri Deneme Deseni ne göre planlanmıştır. Bu durumda, her genotipten toplam 30 bitki (-)Fe ve 30 bitki kontrol koşullarında tarama çalışmalarında yer almıştır. Tuzcu 891 turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerine ait bitkiler sırasıyla pozitif ve negatif referans olarak tarama çalışmasında kullanılmıştır. Deneme dahilinde olan tüm genotiplere ait tohumlar 26 Aralık 2008 de torfa ekilmiş ve 9 Nisan 2009 da kuvarsa şaşırtılmıştır (Şekil 3.1). Kullanılan kuvars önce seyreltilmiş HCl li suyla (ph 5.5-6) 2 kez ardından sadece saf suyla 5 kez yıkanmıştır. Her saksıda 3 kg kuvars bulunmaktadır. Her yıkamada 4 lt saf su 58

80 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU kullanılmıştır. Transferden önce bitkilerde boy (cm), ağırlık (g) ve yaprak sayısı (adet) ölçümleri yapılmıştır. Stres uygulamasına kadar (-)Fe ve kontrol bitkileri 1.25 mm KNO 3, mm KH 2 PO 4, 2.00 mm MgSO 4, 2.00 mm Ca(NO 3 ) 2, EDTA-Fe (125 µm), 25.0 µm H 3 BO 3, 2.00 µm MnSO 4, 2.00 µm ZnSO 4, 0.50 µm CuSO 4, µm (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 içeren besin çözeltisi ilk 3 ay %50 oranında seyreltilmiş ph ayarı 1M KOH ile yapılarak sulanmıştır. Son çözeltinin ph ve EC değerleri sırasıyla 5.8 ve 1.05 ms dir. Tohum ekiminden itibaren yaklaşık 11 ay sonra, kasım ayı başında, stres uygulaması başlatılmıştır. (-) Fe bitkileri 10-5 M Fe EDTA+ 2 g/l CaCO 3 + 3mM NaHCO 3 (ya da %0.02) ph 7.80 (stress), EC=0,967; kontrol bitkileri 10-4 M Fe EDTA ph 6.0 (kontrol) ile yaklaşık 4 ay stres koşulları devam ettirilmiştir. Şekil 3.1. Torfa ekildikten sonra kuvarsa aktarılan Yerli üç yapraklı bitkileri genel görünümleri İklim odası tarama çalışmasında aşağıdaki parametrelerin ölçümleri gerçekleştirilmiştir (1). Büyüme Oranının Belirlenmesi Genç yapraklarda sararmalar şeklinde kendini gösteren Fe klorozunun asıl nedeni kloroplastlarda yer alan tilakoid membranlarının Fe gereksinimidir. Tilakoid membranlarında elektron taşıma zincirinde yer alan Fe içeren proteinler, demir eksikliği durumunda elektron taşıma kapasitesinin sınırlanması nedeniyle karbon fiksasyonunu azaltmaktadır. Bu nedenle kök, gövde, dal ve yapraklarda gelişme 59

81 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU gerilikleri görülür (Fernandez ve ark., 2006). Bu nedenle bu çalışmada Fe klorozunda bitki büyüme parametreleri incelenmiştir. Genç bitkilerde bitki boyu, yaprak sayısı ve bitki taze ağırlığı parametreleri, tohum ekilen ortamdan inert substratta besin çözeltisi ile yetiştirileceği ortama transfer edilirken ölçülmüş ve etiketlenmiştir. Deneme sonunda etiketlenmiş bitkilerde aynı büyüme parametreleri tekrar ölçülmüş, son ölçüm değerleri ile arasındaki fark hesaplanarak, genotiplerin Fe eksikliği stresi altında gösterdikleri büyüme performansları değerlendirilmeye çalışılmıştır (Şekil 3.2.; Şekil 3.3.) (1).(a) Bitki Boyu (cm) İklim odasında deneme başlangıcında tohum ekilen ortamdan inert substrat ortamına transfer edilirken başlangıç bitki boyu ve deneme sonundaki bitki gövde boyu toprak seviyesinden mezurla cm cinsinden ölçülmüştür (1).(b) Yaprak Sayısı (adet/bitki) İklim odasında deneme başlangıcında tohum ekilen ortamdan inert substrat ortamına transfer edilirken başlangıç yaprak sayısı ve deneme sonundaki bitki yaprak sayıları adet olarak belirlenmiştir (1).(c) Bitki Taze Ağırlığı (g/bitki) İklim odasında deneme başlangıcında tohum ekilen ortamdan inert substrat ortamına transfer edilirken başlangıç bitki ağırlığı ve deneme sonundaki bitki ağırlığı hassas terazi ile gram cinsinden belirlenmiştir. 60

82 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Şekil 3.2. İklim odası denemesinin deneme sonunda genel görünümü Şekil 3.3. İklim odası denemesi bitkilerinin söküm sırasındaki kök görünümleri (2). Yapraklardaki Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi Yaprak klorozunun ortaya çıkmasından önce yapılacak yaprak analizleriyle de bitkinin demir beslenme durumu ortaya konulabilir. Yaprak analizleri, bitki büyümesi ve bitkinin içerdiği besin elementi miktarları arasında ilişkinin kurulması esasına dayanmaktadır (Pestana ve ark.,2003). Bu ilişkiyi kurabilmek için toplam ve aktif demir analizleri yapılmıştır. Turunçgilde yapılan bazı çalışmalarda da toplam Fe konsantrasyonu, Fe klorozunu belirlemek için değerlendirilmiştir (Mohammad ve ark.,1998; Chouliaras ve ark., 2004c; Torres ve ark., 2006). Toplam demir miktarının doğru teşhise imkan sağlamaması nedeniyle aktif demir miktarının tercih edildiğini belirtilen çalışmalar da bulunduğundan (Sudahano ve ark.,1994; Çelik ve Katkat, 2007), aktif ve toplam Fe analizleri aşağıda belirtildiği gibi gerçekleştirilmiştir. 61

83 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU (2).(a) Yapraklarda Toplam Fe Konsantrasyonunun Belirlenmesi (mg/kg) Deneme sonunda bitkilerin gelişmesini tamamlamış en genç yaprakları seyreltik HCl li (%0.1 w/w) sudan geçirilmiş ve saf su ile iki kere yıkanmış, daha sonra 48 saat süreyle 65 o C de etüvde kurutulmuş ve ardından öğütülmüştür. Öğütülen örneklerden alınan 0.2 g lık bitki materyalleri 550 o C de kül fırınında yakılmış ve % 3.3 (v/v) HCI içerisinde çözdürülerek Atomik Absorsiyon Spektrometre cihazında Fe konsantrasyonu mg Fe/kg K.A. olarak belirlenmiştir (Kacar ve İnal, 2008) (2).(b) Yapraklarda Aktif Fe Konsantrasyonunun Belirlenmesi (mg/kg) Öğütülmüş yaprak örneklerindeki aktif demir konsantrasyonunu belirlemek için 100 mg örnek 10 ml 1 N HCl içerisinde 2 saat süreyle çalkalanmış ve mavi bant filtre kağıdından alınan süzüklerdeki aktif Fe konsantrasyonu atomik absorbsiyon spektrometri tekniği ile belirlenmiştir (Kacar ve İnal, 2008) (3). Yaprak Klorofil Miktarının Belirlenmesi (µmolm -2 ) Demir eksikliğinin kloroplastlarda yapısal ve fonksiyonel etkiler yarattığı ve yapraklardaki Fe konsantrasyonunun azalmasıyla klorofil miktarında düşüşler meydana geldiği ve Fe in bitkideki hareketliliğinin düşük olması nedeniyle genç yapraklarda kloroz şeklinde ortaya çıktığı bilinmektedir (Iturbe-Ormaexte ve ark., 1995; Ranieri ve ark., 2001; Gogorcena ve ark., 2004). Demir noksanlığında gerçekleşen yaprak kloroz durumu, yaprak renginin belirlenmesi esasına dayanan SPAD değerleri ile belirlenebilmektedir. Yaprak klorofil miktarı SPAD-502 metre (Minolta, Osaka, Japonya) ile belirlenmiştir. Gelişmesini tamamlamış genç yapraklarda SPAD okumaları yapılmıştır (Şekil 3.4.). 62

84 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Şekil 3.4. İklim odası denemesi bitkilerinin deneme sonunda SPAD ölçümünden bir görünüm (4). Fe-III-Redüktaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi Köklerin Fe III ü Fe II ye indirgeme kapasitesini tanımlayan Fe-III-redüktaz enzim aktivitesi ölçülmüştür. Enzim aktivitesinin ölçüm mekanizması, ortamda bulunan Fe III ün kökler tarafından Fe II ye indirgenmesi ve oluşan Fe II nin ortama eklenen BPDS (bathophenanthrolinedisulphonic acid) ile reaksiyona girerek pembe rengin ortaya çıkması ve bu rengin spektrofotometrede okunması esasına dayanmaktadır (Römheld ve Marschner, 1983; Daşgan, 1999; Pestana ve ark., 2001). 100 ml lik tüplere 80 ml 5 mm MES (morpholino-ethanesulphonic acid) ph 5.5 tampon çözeltisi eklenmiş daha sonra Fe stresine sokulan bitkiler ve kontrol grubu bitkilerin kökleri şişeye yerleştirilmiştir. Fe III kaynağı olarak 10 ml 10-3 M Fe EDTA (ethylenediaminotetra acedic acid) ve en son olarak 10 ml 3X10-3 M BPDS eklenmiştir. Kökler karanlık ve havalandırmalı bir ortamda 25 0 C de 1 saat bekletildikten sonra oluşan pembe renk spektrofotometrede 532 nm de okunmuştur. Okuma işi tamamlandıktan sonra bitkilerin kök ve gövdelerinden olmak üzere iki 63

85 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU kısma ayrılacak şekilde kesilmiş ve kök taze ağırlıkları alınmıştır. Fe redüktaz aktivitesi yaş kök ağırlığı başına (nmol/gta/dak.) hesaplanmıştır (5). Bitkilerin Kloroz Durumlarının Demir Klorozu Skalasına Göre Belirlenmesi Demir klorozu görünebilir simptomlarıyla rahatlıkla tanımlanabilir ve klorozun şiddetini belirten demir klorozu skalası bir çok araştırıcı tarafından kullanılmıştır. Demir eksikliğinde yaprakların kloroz göstermesinin nedeni, kloroplasttaki bazı klorofil-protein bileşiklerinin sentezi için demire gereksinim duymasıdır. (Türkan, 2008). Demir eksikliğinden kaynaklanan genotiplerin kloroz durumları subjektif olarak demir kloroz skalasına göre değerlendirilmiştir (Byrne ve ark., 1995): 1: Normal yeşil yapraklar 2: Damarlar arası bölge sarımsı-yeşil, damarlar yeşil 3: Damarlar arası bölge yeşilimsi-sarı, damarlar yeşil 4: Damarlar arası bölge sarı, damarlar yeşil 5: Damarlar arası bölge sarı-beyaz, damarlar soluk yeşil ve yaprak dökümleri var. (1 ve 2 : tolerant, 3: orta derecede tolerant, 4-5: duyarlı) Yüksek ph lı Toprak Ortamında Tarama Denemesi Toprak ortamındaki tarama çalışması, iklim odası tarama çalışmasında denemeye alınan genotiplerin (Materyal 3.1 de belirtilen) ph sı toprak koşullarında Fe eksikliğine karşı gösterecekleri tepkileri doğal koşullar altında görmek; bu genotiplerin kontrollü ve doğal koşullardaki tepkilerini karşılaştırabilmek amacıyla yürütülmüştür. Bitkiler doğal habitüslerinde bırakılarak budanmamış, ancak diğer kültürel işlemlerde normal bakım koşulları uygulanmıştır (Şekil 3.5.). Yüksek ph lı toprak için Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Araştırma ve Uygulama Çiftliği nde amaca uygun arazi bulunmuş ve toprak analizi sonucu Çizelge 3.2 de verilmiştir. 64

86 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Her genotipten 7 tekerrür bitki olmak üzere deneme Tesadüf Parselleri Deneme Deseni ne göre planlanmıştır. 2 yaşında bitkiler 10 Ekim 2008 tarihinde araziye 1x1 m aralıkla dikilmişlerdir. Ancak mevcut genotiplerden Duncan altıntopu (Citrus paradisi Macf.) bitkilerinin ölmesi nedeniyle bu çalışmada değerlendirilememiştir. Yerli üç yapraklı bitkileri bu parselde denemeye alınmış, ancak yüksek kirece çok duyarlı olduğundan dolayı gelişim gösterememiş ve herhangi bir sürgün gelişimi olmamıştır. Bu nedenle bu çalışmada ele alınan parametreler Yerli üç yapraklıda değerlendirmeye dahil edilmemiştir. Çizelge 3.2. Yüksek ph lı toprak ortamında tarama çalışması için kullanılan arazinin toprak analizi sonucu (0-30) cm (30-60) cm PH Tuz (%) Kireç (Toplam) (%) Kil (%) Silt (%) Kum (%) Bünye sınıfı CL CL Fe (ppm) Zn (ppm) Çalışmanın bu kısmında aşağıdaki parametreler incelenmiştir. 65

87 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Şekil 3.5. Arazi denemesinden genel bir görünüm (1) Büyüme Oranının Belirlenmesi (1)(a) Bitki Boyu (cm) Denemede yer alan bitkilerin bitki boyu ölçümleri deneme başlangıcı olan 2008 yılında araziye aktarma sırasında ve deneme sonu olan 2010 yılı Ekim ayında mezürle cm cinsinden ölçülmüştür (1)(b) Yaprak sayısı (adet/bitki) Denemede yer alan bitkilerin yaprakları, deneme başlangıcı olan 2008 yılında araziye aktarma sırasında ve deneme sonu olan 2010 yılı Ekim ayında sayılmıştır. 66

88 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU (2) Yapraklardaki Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi Denemedeki bitkilere ait örneklemeler 2010 yılının Ekim ayında gelişmesini tamamlamış en genç yapraklar alınarak gerçekleştirilmiştir (2)(a) Yapraklarda Toplam Fe Konsantrasyonunun Belirlenmesi (mg/kg) Tarama çalışmasında kullanılan yöntemle belirlenmiştir (2)(b) Yapraklarda Aktif Fe Konsantrasyonunun Belirlenmesi (mg/kg) Tarama çalışmasında kullanılan yöntemle belirlenmiştir (3) Yaprak Klorofil Miktarının Belirlenmesi (µmolm -2 ) Tarama çalışmasında kullanılan yöntemle belirlenmiştir (4) Bitkilerin Kloroz Durumlarının Demir Klorozu Skalasına Göre Belirlenmesi Tarama çalışmasında kullanılan yöntemle belirlenmiştir. II. Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Turunçgillerde Fe Eksikliğine Dayanıklılığın Fizyolojik Yönden İncelenmesi Tez çalışmasının bu kısmında yüksek ph dan kaynaklanan Fe klorozuna tolerant ve duyarlı olarak bilinen, Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı çeşitleri kullanılmıştır. Demir klorozuna duyarlı ve tolerant olan bu çeşitlerin,fe klorozunda, 67

89 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU farklı fizyolojik parametrelere olan tepkileri incelenmiş, Fe klorozunun teşhisinde kullanılabilecek en uygun kriterler bu denemeyle belirlenmeye çalışılmıştır. Bu çalışmada kullanılmış olan Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı tohumları Şubat 2008 de ekilmiş ve çıkan bitkiler torfa şaşırtılmıştır. Bitkiler Mart 2010 ayında kuvarsa şaşırtılarak, iklim odasında denemeye alınmışlardır. Bitkilerde şaşırtma için gerekli gövde ve kök kesimleri yapıldığından, bitkiler homojen bir büyüklüğü ulaşıncaya değin 1.25 mm KNO 3, mm KH 2 PO 4, 2.00 mm MgSO 4, 2.00 mm Ca(NO 3 ) 2, EDTA-Fe (125 µm), 25.0 µm H 3 BO 3, 2.00 µm MnSO 4, 2.00 µm ZnSO 4, 0.50 µm CuSO 4, µm (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 içeren besin çözeltisi %50 seyreltilerek ph ayarı 1M KOH ile yapılarak sulanmıştır. Son çözeltinin ph ve EC değerleri sırasıyla 5.8 ve 1.05 ms dir. 4 ay boyunca iklim odasında büyütülen bitkilerde demir eksikliği stresinin yarattığı etkileri gözlemleyebilmek amacıyla stresin 0, 30 ve 60. gününde örneklemeler yapılmış ve aşağıdaki ölçümler gerçekleştirilmiştir. ( ) Fe bitkileri 10-5 M Fe EDTA+ 2 g/l CaCO 3 + 3mM NaHCO 3 ph 7.80, EC=0,967; kontrol bitkileri ise 10-4 M Fe EDTA ph 6.0 içeren besin çözeltisiyle büyütülmüşlerdir. Deneme, her uygulama gününde 7 kontrol ve 7 (-) Fe bitkisi olacak şekilde, Tesadüf Parselleri Deneme Deseni nde düzenlenmiştir. Şekil 3.6. ve Şekil 3.7. de denemede kullanılan Yerli üç yapraklı ve Tuzcu turuncunun gövde kalınlıkları görülmektedir. Şekil 3.6. Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında kullanılan Yerli üç yapraklı bitkilerinin gövde kalınlıkları 68

90 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Şekil 3.7. Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında kullanılan Tuzcu turuncu bitkilerinin gövde kalınlıkları Bitki Büyüme Oranları Denemede stresin başlangıç günü olan 0. gününde, daha sonra 30. gününde ve denemenin sonuncu günü olan 60. günündeki bitki boyu, yaprak sayısı ve bitki taze ağırlıkları belirlenmiştir (1) Bitki Boyu (cm): Tarama çalışmasında kullanılan yöntemle belirlenmiştir (2) Yaprak sayısı (adet/bitki): Tarama çalışmasında kullanılan yöntemle belirlenmiştir (3) Bitki Taze Ağırlığı (g/bitki): Tarama çalışmasında kullanılan yöntemle belirlenmiştir. 69

91 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Yapraklardaki Demir Konsantrasyonunun Belirlenmesi (1). Toplam Fe Konsantrasyonu (mg/kg): Tarama çalışmasındaki yöntemle belirlenmiştir (2). Aktif Fe Konsantrasyonu (mg/kg): Tarama çalışmasındaki yöntemle belirlenmiştir Yaprak Klorofil Miktarının Belirlenmesi (µmolm -2 ): Tarama çalışmasındaki yöntemle belirlenmiştir Kök Fe III Redüktaz Enzim Aktivitesi: Tarama çalışmasındaki yöntemle belirlenmiştir Bitkilerin Kloroz Durumlarının Demir Klorozu Skalasına Göre Belirlenmesi Tarama çalışmasında kullanılan yöntemle belirlenmiştir Yapraklarda Stres Enzimleri Aktivitelerinin Belirlenmesi Demir içeren askorbat peroksidaz ve katalaz enzim aktiviteleri stresin 30. gününde belirlenmiştir. Enzim aktivitesinin ölçülmesi için gerekli ekstraktın hazırlanmasında 0.5 g taze genç yaprak örneği, 10 ml 50 mm P-tampon (ph 7.6) çözeltisi içerisinde sıvı azot yardımıyla homojenize edilmiştir. Homojenize edilmiş örnekler +4 0 C de g (devir/dakika) de 20 dakika santrifüj edildikten sonra elde edilen santrifügatlar 70

92 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU doğrudan enzim analizlerinde kullanılmıştır. Enzim aktivitelerinin ölçümü son hacmi 1 ml olan reaksiyon ortamında gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon karışımına hazırlanan santrifügattan askorbat peroksidaz için μl ve katalaz için 100 μl kullanılmıştır. Ölçümler sırasındaki tüm işlemler C de buz içinde çalışılarak gerçekleştirilmiştir (Çakmak ve Marshner, 1992; Çakmak, 1994) (a) Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi (µmol/dak/mg TA) Reaksiyon karışımını sırasıyla μl 50 mm P-tampon çözeltisi (ph 7.6), 100 μl 10 mm EDTA+12 mm H 2 O 2 karışımı, μl örnek enzim ve 100 μl 0.25 mm askorbik asit oluşturmuştur. Kuvars küvet içinde hazırlanacak reaksiyon karışımında 1 dakikadaki askorbatın oksidasyon hızı spektrofotometrede 290 nm dalga boyunda ölçülmüştür (Çakmak ve Marshner, 1992; Çakmak, 1994) (b) Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi (µmol/dak/mg TA) Reaksiyon karışımını sırasıyla 800 μl 50 mm P-tampon çözeltisi (ph 7.6), 100 μl 50 mm H 2 O 2, 100 μl örnek enzim oluşturulmuştur. Karışımda 1 dakika süredeki H 2 O 2 degradasyonu spektrofotometrede 240 nm dalga boyunda ölçülmüştür (Çakmak ve Marshner, 1992; Çakmak, 1994) Fotosentez Hızının Belirlenmesi (µmolm -2 s -1 ): Yüksek bitkilerde fotosentezde en aktif doku olan yapraklardaki mezofil hücrelerinin bol miktarda klorofil içermesi (Türkan, 2008) ve klorofil oluşumunun demir noksanlığında azalması (Bertamini ve ark., 2001) nedeniyle fotosentetik aktivitenin azaldığı bilinmektedir. Demir klorozuna tolerant ve duyarlı genotiplerin fotosentez aktivitelerinin ne ölçüde etkilendiğini belirlemek için bu ölçüm gerçekleştirilmiştir. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı çeşitlerinin 2 yaşlı fidanlarında stresin 0, 30 ve 60. günlerinde yaprak fotosentez hızı taşınabilir fotosentez ölçüm seti LCA-4 model fotosentez cihazı ile (Şekil 3.8.) belirlenmiştir. 71

93 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Her tekerrürde gelişmesini tamamlamış en genç 4 yaprakta ölçüm yapılmıştır. Ölçümler havanın açık olduğu günlerde saat arasında gerçekleştirilmiştir. Şekil 3.8. Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında kullanılan fotosentez ölçüm cihazından bir görünüm Karbonhidrat Analizleri Gelişmesini tamamlamış en genç yapraklarda örnekleme yapılmıştır. Alınan yaprak örnekleri 48 saat süreyle 65 o C de etüvde kurutulup öğütülmüştür (a) Toplam Şeker Miktarı (%) Alınan yaprak örneklerinin toplam şeker içeriği Kaplankıran (1984) tarafından geliştirilen Anthron yöntemine göre belirlenmiştir (b) Nişasta Miktarı (%) Alınan yaprak örneklerinin nişasta miktarı Kaplankıran (1984) tarafından geliştirilen Anthron yöntemine göre belirlenmiştir. 72

94 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU (c) Toplam Karbonhidrat Miktarı (%) Bitkilerin toplam karbonhidrat içeriği Kaplankıran (1984) e göre Toplam Karbonhidrat (%) = Toplam şeker (%) + Nişasta (%) hesaplanmıştır Azot Konsantrasyonu (%) Alınan yaprak örneklerindeki azot konsantrasyonu bir yaş yakma yöntemi olan ve Bremner (1965) tarafından önerilen "Kjeldahl" yöntemi ile belirlenmiştir Karbon / Azot Oranı (C/N) Toplam karbonhidrat miktarının toplam azot miktarına bölünmesiyle karbon / azot oranı hesaplanmıştır Deneme Deseni ve İstatistik Analiz I. Fizyoloji denemelerinde yer alan tarama çalışmalarında elde edilen sonuçlara Düzgüneş (1963) tarafından belirtilen Tesadüf Parselleri Deneme Deseni ne göre varyans analizi ve Tukey testi uygulanarak değerlendirmeler yapılmıştır. II. Ayrıntılı Fizyoloji çalışmasında elde edilen sonuçlar Tesadüf Parselleri Deneme Deseni ne göre LSD testi uygulanarak değerlendirilmiştir. Elde edilen varyans analizi sonucunda uygulama, genotip ve zaman faktörlerinin interaksiyonları %5 önem seviyesine göre değerlendirilmiştir. Bu amaçla SAS v9.00 istatistik paket programı kullanılmıştır. Ayrıca her iki denemede de kontrol ve (-)Fe ortalamaları kendi içinde Student s t test istatistiksel hipotez testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Çalışmada incelenen parametrelerin arasındaki korelasyonun varlığı %1 ve % 5 seviyesinde araştırılmıştır. Korelasyon tablolarının yorumlanmasında ilişkinin 0.60 ve üzerinde olduğu durumlar dikkate alınmıştır. Bunun nedeni korelasyon 73

95 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU katsayısının genellikle arasında olması durumunda korelasyonun çok zayıf, zayıf, arasında orta, kuvvetli ve arasında ise çok kuvvetli ilişki olmasındandır (Köse, 2011). Ayrıca, iklim odası denemesinden elde edilmiş sonuçları genotiplerin Fe klorozuna olan tepkilerini değerlendirebilmek ve sınıflandırabilmek amacıyla tartılı derecelendirme yapılmış, Çizelge 3.3. de belirtilen parametrelerin etki oranları kullanılmıştır. Değerlendirmeye alınan karakterler ve derecelerinin sınıf aralıkları Çizelge 3.4., Çizelge 3.5., Çizelge 3.6., Çizelge 3.7., Çizelge 3.8.,3.9., Çizelge ve Çizelge sunulmuştur. Arazi denemesinden elde edilmiş sonuçları için tartılı derecelendirme etki oranları Çizelge de verilmiştir. Değerlendirmeye alınan karakterler ve derecelerinin sınıf aralıkları Çizelge 3.12, Çizelge 3.13., Çizelge 3.14., Çizelge 3.15., Çizelge ve Çizelge de verilmiştir. İklim odasından elde edilen tartılı derecelendirme puanları ile arazi denemesinden elde edilen SPAD, skala, aktif ve toplam demir konsantrasyonları arasındaki korelasyon araştırılmıştır. Çizelge 3.3. İklim odası denemesi etki oranları Parametreler Etki Oranı (%) İklim Odası Yaprak sayısı % farkı 15 Bitki boyu %farkı 5 Bitki ağırlığı % farkı 15 SPAD % farkı 15 Skala 20 Toplam demir % farkı 15 Aktif demir % farkı 15 TOPLAM 100 Çizelge 3.4. İklim odası yaprak sayısı % farkı tartılı derecelendirme puanları Yaprak sayısı % farkı Puan < 1 74

96 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Çizelge 3.5. İklim odası bitki boyu % farkı tartılı derecelendirme puanları Bitki boyu % farkı Puan < 1 Çizelge 3.6. İklim odası bitki ağırlığı % farkı tartılı derecelendirme puanları Bitki ağırlığı % farkı Puan < 1 Çizelge3.7. İklim odası SPAD % farkı tartılı derecelendirme puanları SPAD % farkı Puan < 1 Çizelge 3.8. İklim odası skala tartılı derecelendirme puanları Skala Puan Çizelge3.9. İklim odası toplam demir % farkı tartılı derecelendirme puanları Toplam demir % farkı Puan < 1 75

97 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Çizelge İklim odası aktif demir % farkı tartılı derecelendirme puanları Aktif demir % farkı Puan < 1 Çizelge İklim odası tarama denemesi genotiplerinin tartılı derecelendirme puanlarına göre demir klorozuna toleranslılıklarının sınıflandırılması (çok duyarlı) (duyarlı) (az tolerant ) (orta tolerant) 4.01 < (çok tolerant) Çizelge Arazi tarama denemesi etki oranları Parametreler Etki Oranı (%) Arazi Denemesi SPAD 40 Skala 40 Toplam demir 10 Aktif demir 10 TOPLAM 100 Çizelge Arazi tarama denemesi SPAD tartılı derecelendirme puanları SPAD Puan 40.00< Çizelge Arazi tarama denemesi skala tartılı derecelendirme puanları Skala Puan

98 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Çizelge Arazi tarama denemesi toplam demir tartılı derecelendirme puanları Toplam demir Puan 45.00> < 6 Çizelge Arazi tarama denemesi aktif demir tartılı derecelendirme puanları Aktif demir Puan > 7 Çizelge Arazi tarama denemesi genotiplerinin tartılı derecelendirme puanlarına göre demir klorozuna toleranslılıklarının sınıflandırılması (çok duyarlı) (duyarlı) (az duyarlı ) (tolerant) (orta tolerant) 5.00< +++ çok tolerant 3.3. Mikroarray Çalışması Turunçgillerde demir klorozuna tolerant olarak bilinen Tuzcu turuncu ve duyarlı olarak bilinen Yerli üç yapraklı çeşitleri bu çalışmada tolerant ve duyarlı genotiplerin demir klorozuna olan tepkilerini moleküler düzeyde anlayabilmek ve aralarındaki farklılılığı ortaya koyabilmek amacıyla yürütülmüştür. Yerli üç yapraklı Tuzcu turuncu tohumları 15 Şubat 2007 tarihinde ekilmiş ve 20 Nisanda 1:1 kum-vermikulit karışımına şaşırtılarak, bitkiler Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümünde bulunan iklim kontrollü bitki yetiştirme odasına alınmışlardır (Şekil 3.9.). İklim odasında 16/8 saat aydınlık ve karanlık, gündüz/gece 26 o C ve 20 o C sıcaklık sağlanırken, oransal nem %65 dolaylarında 77

99 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU düzenlenmiştir. Stres uygulamasına kadar bitkiler ph nın 6 ya ayarlandığı 10-4 Fe içeren modifiye edilmiş Hoagland besin çözeltisiyle (1,25 mm KNO 3, 0,625 mm KH 2 PO 4, 2 mm MgSO 4, 2 mm Ca(NO 3 ) 2, EDTA-Fe (125 µm), 25 µm H 3 BO 3, 2µM MnSO 4, 2µM ZnSO 4, 0.5µM CuSO 4, µm (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ) büyütülmüşlerdir. Stres başladıktan sonra ise kontrol bitkileri ph nın 6 ya ayarlandığı 10-4 Fe-EDTA içeren modifiye edilmiş Hoagland besin çözeltisiyle, strese sokulan bitkiler ise 10-5 FeEDTA içeren ve ph sı 7.5 olan modifiye Hoagland çözeltisiyle deneme başlatılmıştır. Stres başlangıcının 1, 5 ve 18. günlerinde kök örneklemeleri yapılmış, ve kuru buzla IVIA-Valencia ya götürülmüştür (Şekil 3.10.). Bu çalışma, İspanya-Valencia IVIA (Instituto Valenciano Investigaciones Agrarias) Araştırma Enstitüsünün Genomik Merkez Abiyotik Stres Laboratuvarında yürütülmüştür. 1. gün ve 5. gün örneklerinde yapılan mikroarray çalışmalarının sonuçları verilmiştir. 18. gün örneklemelerinde normalizasyon ve istatistiksel analizler yapılmış, ancak, arraylerde fazla ışıma sebebiyle değerlendirilmeye alınmamıştır. Bu tür stres fizyoloji denemelerinde saatlik ve en fazla 1 haftalık stress çalışmasının daha güvenilir olduğu düşünülerek bu karara varılmıştır. Tesadüf parselleri faktöryel deneme desenine göre (2 x 2 x 2) (genotip x uygulama x zaman (1. gün ve 5. gün) kurulmuş, her uygulama zamanı ve genotip için 4 tekerrür kullanılmıştır. Şekil 3.9. Mikrorarray çalışması için kullanılan Yerli üç yapraklı bitkilerinin iklim odasında genel görünümü 78

100 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Şekil Mikrorarray çalışması için kullanılan Yerli üç yapraklı ve Tuzcu turuncu bitkilerinin stresin 1. gününde genel görünümleri Bitkisel Materyalin Alınması RNA İzolasyonu Çalışmada kullanılan bitkisel materyallerden RNA izolasyonunu gerçekleştirmek amacıyla kökler saf su ile yıkanmış, alüminyum folyo ile sarılmış ve sıvı azot içerisine batırıldıktan sonra kuru buz ile IVIA ya götürülmüştür. Total RNA izolasyonu, kontrol ve (-)Fe uygulamasına ait örneklerde gerçekleştirilmiştir. Her uygulamaya ait örnekler porselen havan içerisinde sıvı azot ile öğütülerek 0.1 g olacak şekilde 1.5 ml lik santrifüj tüplerine alınmıştır. Total RNA izolasyonu için RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) kullanılmıştır. Aşağıda RNA izolasyonunda kullanılan protokol verilmiştir RNA İzolasyon Aşamaları Kök örnekleri sıvı azotta ezilerek ve 2 ml lik tüplere, 1414 µl ekstrasyon çözeltisi (700 ul TCES, 14 µl beta-mercaptoethanol ve 700 µl PCI (24:24:1 fenol:kloroform:isoamilik asit) olacak şekilde koyulmuş ve 150 mg donmuş kök örnekleri eklenerek hızlıca vorteks yardımıyla karıştırılmıştır. Homojenizatörde kök örneklerinin parçalanmasını sağlamak için ekstraksiyon çözeltisi içerisinde sıvı azotta öğütülmüş kökler 15 saniye orta, 15 saniye hızlı olmak üzere toplam 30 saniye daha öğütülmüştür. 79

101 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU 3 dakika mini santrifüjde rpm/dk santrifüjlenip, yaklaşık 900 µl lik süpertanant 900 µl PCI içeren santrifüj tüpüne aktarılmıştır. Bu aşamada 3 dakika daha santrifüjlenerek, süpertanant yeniden temiz tüpe aktarılmıştır. Aktarılan süpertanant, 0.1 hacimde 3M Na-asetat (ph=4,8) ile vorteks yardımıyla karıştırılmış ve hacim isopropanol (2-propanol) eklendikten sonra vorteks yardımıyla karışması yeniden tekrarlanmıştır. Bu aşamada 10 dakika ile 2 saat arasında oda sıcaklığında bekletilmiştir. Bu süre sonunda 10 dakika rpm/dk hızda santrifüjlenmiş ve süpertanant kısmı atılmış, tüpler ters çevrilerek kalan pelletin solüsyondan kurtulması sağlanmıştır. Pelletler %70 lik etil alkolle (EtOH), 1 ml ve 1 ml olmak üzere iki kere yıkanmış, daha sonra alkolün uçması beklenmiştir. 100 µl DNAse I (90 µl H2O + 10 µl stok buffer 10x (RNase free DNase (Qiagen)) hazırlanmış, yaklaşık 2 µl DNAse tüplere eklenmiş ve dakika 37 0 C de inkübe edilmiştir. Qiagen RNA purifikasyon kitlerine ait tüplerle RNA saflaştırılmış ve kalitesi, miktarı nanodropta kontrol edilmiştir. Kalitesi kontrol edilen RNA lar C de saklanmışlardır. Şekil RNA kalitesinin kontrolünde kullanılan Nanodrop. 80

102 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU RNA Kalitesi ve Kantitesinin Belirlenmesi Total RNA dondurulmuş kök dokularından mini ependorf yöntemine göre izole edilmiş ve RNase free DNase (Qiagen) ve Qiagen RNA purifikasyon kiti ile purifiye edilmiştir. Çalışmada kullanılmış RNA ların kalite ve kantitesi spektrofotometrede (Nanodrop 1000, Nanodrop Technologies, Thermo Fisher Scientific, Deleware, USA) ile 260 ve 280 nm dalga boylarında okuma yaparak belirlenmiş (Şekil 3.11.), ayrıca agaroz jel elektroforezisde kontrol edilmişlerdir arna Amplifikasyonu Total RNA lar RNA amplifikasyonu için kullanılmıştır. Amlifikasyonda ve mikroarray için RNA ların boyanmasında Ambion kiti (Amina Allyl MessageAmp II arna Amplification Kit) kullanılmış ve Forment ver ark. (2005) e göre amplifike edilmişlerdir. Bu amplifikasyon prosedürü: 1. aşama: cdna sarmalının birinci ipliğinin reverse transkripsiyon ile sentezi (Reverse transcription to synthesize first strand cdna) 2. aşama: cdna sarmalının ikinci ipliğinin sentezi (Second strand cdna synthesis) 3. aşama: cdna purifikasyonu 4. aşama: arna nın in vitro sentezi (In vitro transcription to synthesize Amino Allyl-Modified arna) 5. aşama: arna purifikasyonu 6. aşama: arna nın boyanması (arna:dye Coupling Reaction) 7. aşama: Boyanan arna nın purifikasyonu (Dye Labeled arna Purification) olmak üzere 7 aşamadan oluşmaktadır. Aşağıda bu aşamaların ayrıntılı protokolü sunulmuştur. 81

103 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU arna Amplifikasyon Protokolü (1 ve 2. Aşama) Amplifikasyon için önerilen total RNA miktarı 2000 ng dır. Elde edilen RNA nın kalitesine göre bu miktar hesaplanır ve genellikle 2 µl ye yakın bir değer elde edilir. Optimum 2 µl RNA yı 1,5 ml lik ependorf tüplerine eklenmiş ve son hacim RNA içermeyen suyla 11 µl ye tamamlanmıştır. 1 µl T7 Oligo (dt) primeri ependorf tülerine eklenerek son hacim 12 µl olmuştur. Termocyclerda 70 0 C de 10 dakika inkübe edildikten sonra 5 saniye santrifüjlenmiştir. Reverse Transcription Master Mix örnek sayısına göre (2 µl 10x First Strand Buffer, 4 µl dntp Mix, 1 µl RNase Inhibitor, 1 µl ArrayScript) hazırlanarak buzda bekletilmiştir. 8 µl master mix ten her bir örneğe eklenip pipetle 2-3 defa karıştırdıktan sonra 5 saniye santrifüjlenmiştir. 2 saat 42 0 C de inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra buzda 5 saniye santifürüjlenerek buzda bekletilmiştir. Second strand mix (63 µl Nükleaz içermeyen saf su, 10 µl 10X Second Strand Buffer, 4 µl dntp Mix, 2 µl DNA polymerase, 1 µl RNase H) hazırlandıktan sonra vortekslenmiş ve 5 saniye santifürüjlenmiştir. 80 µl Second Strand Master Mix i her bir örneğe eklenir, pipetle 2-3 defa karıştırılmış ve 5 saniye santrifüjlenmiştir. 2 saat 16 0 C de termocyclerda inkübe edilmiş ve bu inkübasyondan sonra c- DNA pürifiye edilmiştir (1). c-dna Purifikasyonu (3. Aşama) 250 µl cdna Binding Buffer ı her örneğe eklenmiş, pipetle 2-3 defa karıştırılmış ve 5 saniye santrifüjlenmiştir. 82

104 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU cdna Fitler Cartridge den geçirilmiş ve 1 dakika rpm de santrifüjlenmiştir. Santrifüjden sonra sıvı dökülmüş ve filtreyi aynı tüpün üstüne koyulmuştur. 500 µl Wash Buffer ile yıkanmıştır. 1 dakika rpm de santrifüjlenmiş ve tekrar sıvı dökülmüştür. Filtre cdna Elution tüplerinin üstüne koyulmuştur. 9 µl ısıtılan nükleaz içermeyen saf su eklenmiş ve 2 dakika bekletilmiştir. Bu süre sonunda 1.5 dakika rpm de santrifüjlenmiştir. 9 µl nükleaz içermeyen saf su eklenmiş ve 2 dakika bekletilmiştir. Daha sonra yeniden 1.5 dakika rpm de santrifüjlenmiştir (2). arna nın in-vitro Sentezi (In Vitro Transcription To Synthesize Biotin-Labeled arna) (4. Aşama) Etüv 37 0 C ye ayarlanmıştır. IVT Master Mix (3 ul AaUTP (50 mm), 12 µl ATP, CTP,GTP Mix (50 mm), 3 µl UTP Solution (50 mm), 4 µl T7 10X Reaction Buffer, 4 µl T7 Enzyme Mix) hazırlanmıştır. 26 µl IVT Master Mix i örneklere ekle, 2-3 defa pipetle karıştırılmış ve 5 saniye santrifüjlenmiştir C de 14 saat inkübe edilmiştir. İnkübe edilen örneklere 60 µl nükleaz içermeyen saf su eklenmiş ve vorteks yardımıyla karıştırılmıştır (3). arna Purifikasyonu (5. Aşama) Nukleaz içermeyen saf su, C lik fırında ısıtılmıştır. 350 µl arna Binding Buffer eklenmiştir. %100 etanolden 250 ul eklenmiş ve pipetle 2-3 defa karıştırılmıştır. Çözelti, arna Filter Cartridge filtresinden geçirilmiştir. 1 dakika rpm de santrifüjlenerek, altta kalan sıvı dökülmüştür. 83

105 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU 650 µl Wash Buffer filtreden geçirilerek eklenmiştir. 1 dakika rpm de yeniden santrifüjlenmiştir. Sıvının kuruması için 1 dakika daha rpm de santrifüjlenmiştir. Filtre, arna Collection tüpüne aktarılmıştır. 100 µl nucleaz içermeyen saf su, filtrenin merkezine gelecek şekilde dökülmüştür. 2 dakika bekletildikten sonra 1.5 dakika rpm de santrifüjlenmiştir. Nanodropta nukleaz kalitesi kontrol edilmiştir. Ölçülen miktar 5000/absorbans formülünden hesaplanmıştır. Hesaplanan miktar ependorf tüplerine aktarıldıktan sonra örneklerin suyu çekilinceye kadar kurutulmuştur (4). arna nın Boyanması (6. Aşama) Kuruyan örneklere 4 µl Na 2 CO 3 (0.1 M ph=8.5) eklenmiştir. Kontrol örneklerine Cy3 (pembe) ve uygulama örneklerine Cy5 (mavi) solüsyonlarından 4 µl eklenmiştir. Ancak dyeswap yapıldığı için her uygulamada Cy3 ve Cy5 kontrol ve uygulama örneklerine çapraz olarak uygulanmıştır. Nazikçe vorteks yardımıyla karıştırılmış ve çok hızlı santrifüjlenmiştir. 1 saat oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilmiştir. 22 µl nükleaz içermeyen saf su eklenmiştir (5). Boyanan arna nın Purifikasyonu (Labeled arna Purification) (7. Aşama) 105 µl arna Binding Buffer eklenmiş, daha sonra vorteksle karıştırılmış ve 75 µl %100 etanol eklendikten sonra pipetle yeniden karıştırılmıştır. Elde edilen buffer, Labeled arna Filter Cartridge den geçirilmiş ve 1 dakika rpm de santrifüjlenmiş ve daha sonra sıvı dökülmüştür. 84

106 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU 500 µl wash buffer dökülmüş ve yine 1 dakika rpm de santrifüjlenerek, sıvı dökülmüştür. Filtre, Labeled arna Elution tüpünün üstüne koyulmuştur. Oda sıcaklığındaki nükleaz içermeyen saf su 10 µl yi filtrenin merkezine dökülmüştür. Oda sıcaklığında 2 dakika bekletilmiş ve daha sonra 1.5 dakika rpm de santrifüjlenmiştir. Isıtılan nükleaz içermeyen saf su 10 µl yi filtrenin merkezine dökülmüştür. Oda sıcaklığında 2 dakika bekletildikten sonra 1.5 dakika rpm de santrifüjlenmiştir. Isıtılan nükleaz içermeyen saf su 80 µl filtrenin merkezine dökülmüştür. Oda sıcaklığında 2 dakika bekletilmiş ve daha sonra 1.5 dakika rpm de santrifüjlenmiştir. nanodropta RNA kalitesi ölçülmüş ve hibridizasyon yapmak için gerekli olan RNA miktarı 100 / absorbans değeri(pmol/ µl) formülü ile hesaplanmıştır. İstenirse bu aşamada örnekler (-80) de 15 güne kadar saklanabilir (6). Hibridizasyona Hazırlık Aşaması (6).(a) Labeled arna Örneklerinin Hazırlığı Hibridizasyon yapmak için gerekli olan Cy3 ve Cy5 ile boyanmış RNA miktarı 150/absorbans değeri(pmol/µl) formülü ile hesaplanmış ve hesaplanan değer kontrol ve uygulamalar olmak üzere aynı tüpe eklenerek vorteks yardımıyla karıştırılmış ve hızlıca santrifüjlenmiştir. Birçok turunçgil tür ve çeşitinden elde edilen probe içeren turunçgil mikroarray çipleri kullanılmıştır. Bu çözelti Speed Vac te 9 µl oluncaya kadar kurutulmuştur. Fragmentation Reagent ten her bir örneğe 1 µl eklenmiştir. Multiplaces ta 70 0 C derecede 15 dakika inkübe edilmiştir. 85

107 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Bu süre sonunda örneklere Stop Solution dan 1 µl eklenmiş ve örnekler buza koyulmuştur. Bu işlemden sonra multiplace in sıcaklığını 80 0 C ye çıkarılmıştır. Hibridizasyona kadar örnekler buzda ve karanlıkta bekletilmiştir (6).(b) Hibridizasyonda Kullanılacak Çiplerin Hazırlığı Prehibridizasyon tamponu (SSC 5X, 25 ml SSC 20X; SDS % 0.1, 1 ml SDS %10; BSA %1, 10 ml BSA %10; 64 ml DEPC su (Son hacim 100 ml) hazırlanmış ve çipler, turuncu özel kutucuklarına dik yerleştirilip 1 saat inkübe edilmiştir. İnkubasyon sonrasında çiplerin yıkanması için kullanılan siyah kutular saf su ile doldurulmuş ve çipler defa 5 er dakika yıkanmıştır. Yıkama işlemi bittikten sonra santrifüjde 25 0 C derecede, 300 rpm de 4 dakika kurutulmuş ve çipler özel basamaklarına yerleştirilmişlerdir (6).(c) Çiplerin Hibridizasyonu Hibridizasyon tamponu (Formamid %50, 2.5 ml; SSC 5X, 1.25 SSC 20X; SDS %0.1, 50 µl SDS %10; DNA Esperma salmon 100 ug/ml, 50 µl 100X; 1.15 DEPC su (Final volume=5 ml) 80 0 C derecede ısıtılmış ve örnekler buzdan çıkarılarak ve 80 0 C derecede 2 dakika inkübe edilmiştir. Hibridizasyon tamponundan 60 µl her bir örneğe eklenmiş ve bu işlemin sonunda multiplacerı kapatılmış ve örneklerin sıcak kalması sağlanmıştır. SSC 1,5 X hazırlanmış ve çip çemberinin yerleştirildiği bölgeye, çipin yapışmasını engellemek için toplam 80 µl damlalar halinde enjekte edilmiştir. Çipler özel çemberleri içerisine yerleştirilerek, aliminyum folyaya sarılmış ve 42 0 C lik su banyosunda saat inkübe edilmişlerdir (Şekil 3.12.). 86

108 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Şekil Mikrorarray çalışması için kullanılan çiplerin hibridizasyon aşamalarından görünüm (6).(d) Hibridize Edilmiş Çiplerin Yıkanması İnkübasyondan sonra çiplerin yıkanması ve tarama haline getirilebilmesi için gerekli protokol aşağıda verilmiştir. Yıkama 1 çözeltisi (100 ml, SSC 20X ; 10 ml, SDS %10; 890 ml, H 2 O- DEPC) 42 0 C derecelik etüvde 30 dakika ısıtılmıştır. Yıkama 1 aşaması için iki kere tekrarlandığı için iki kutu hazırlanmıştır. Folyodan çıkarılan çiplerin Yıkama 1 çözeltisinin birinci kutusunda üstündeki plastik membrandan kurtulması sağlanmış ve ilgili çipler daha sonra ikinci kutuda bulunan özel basamağına yerleştirilmiştir. Tüm bu işlemler etüvün içinde yürütülmüştür. İkinci kutu içine aktarılmış çipler, çalkalayıcıda 5 dakika boyunca yıkanmış ve daha sonra yıkama 2 işlemi için temiz bir basamağa aktarılmıştır. Yıkama 2 (5 ml, SSC 20X; 10 ml, SDS %10; 985 ml, H 2 O-DEPC) de 2 kere 5 dakika oda sıcaklığında yine çalkalayıcı üstünde yıkanmıştır. Yıkama 87

109 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU sonunda üçüncü yıkama aşamasına geçerken çip temiz basamağa aktarılmıştır. Yıkama 3 (5 ml, SSC 20X; 995 ml, H 2 O-DEPC) te 5 yıkama 2 şer dakika yapılmıştır. Bu işlem sonunda çipler yeniden temiz basamağa aktarılmıştır. Yıkama 4 (100 µl, SSC 20X; 200 ml, H 2 O-DEPC) te 1 yıkama 3 dakika süresince yapılmıştır. Bu işlem sonunda çipler kurutulmak üzere kullanılan beyaz basamağa aktarılmış ve santifüjde (Eppendorf centifuge (5810 R)). 200 rpm de kurutulmuştur (Şekil 3.13.). Şekil Mikrorarray çalışması için kullanılan çiplerin yıkama işleminden sonra kurutulması için kullanılan santrifüj (7). Çiplerin Tarama İşlemi Hibridize edilmiş çipler Scanarray Express programı kullanılarak Scanarray Gx (PerkinElmer) tarayıcısında scan edilmiştir (Şekil 3.14.). 88

110 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU Şekil Mikrorarray çalışması için kullanılan çiplerin taraması için kullanılan scanner (8). Çiplerin Normalizasyonu Hibridizasyondan sonra mikroarraydan elde edilen dataların optimize edilmesi için iki aşamalı regresyona dayalı yönteme (two-step regression-based method) bağlı olarak geliştirilen R Paket Limma software programı, Print-tip fonksiyonu kullanılarak normalizasyon, görüntüleme ve istatistik analiz için kullanılmıştır. Ekspresyon sonuçlarının degerlendirilmesinde geri plan kırmızı/yeşil sinyaller ve özgül kırmızı/yeşil sinyallerin oranları kullanılmıştır. Sonuçlarda belirtilen M değeri bu iki ekspresyon oranınını temel alan logaritmik değeri ifade eder. Hibridizasyonlardan sonra sinyallerin yoğunluğu, çip yüzeyindeki ekspresyon oranının bir örnekliliği ve M değerinin uygulamalardaki dağılımı değerlendirilmiştir (Brumos ve ark., 2009) (9). İstatistiksel Değerlendirme Normalizasyondan sonra, R-package masigpro programıyla probların gösterdikleri önemli farklı ekspresyonlar tanımlanmıştır. P değeri 0.05 ten küçük ve M değeri 0.25 ten büyük olduğu zaman gen ekspresyonundaki farklılıklar önemli bulunmuştur (Brumos ve ark., 2009). 89

111 3. MATERYAL VE METOD Meral İNCESU (10). Fonksiyonel Analizler Gen ontolojisi (GO), Blast2GO programı ile mikroarray sonuçlarından elde edilen ışımaların özelliklerini ve fonksiyonlarına bağlı durumlarını ortaya koymak için kullanılan bir terimdir. GO, biyolojik proses, moleküler fonksiyon ve hücresel komponentler olmak üzere üç ana kategoriden meydana gelir. İstatistiksel olarak önemli bulunan ışımalar bu program yardımıyla kategorize edilmişlerdir. 90

112 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Araştırma Bulguları I. Fizyoloji Denemesi Sonuçları İklim Odası Tarama Denemesi Sonuçları Bitki Büyüme Oranları (1) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) İklim odası tarama denemesi bitkilerinin yaprak sayıları Çizelge 4.1. ve Şekil 4.1. de verilmiştir. Yapılan tarama çalışmasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe ve kontrolde genotipler arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Kleopatra mandarini X Swingle sitrumelo melezi çizelgelerde K X S kısaltması şeklinde yer almıştır. Kontrol grubu incelendiğinde en yüksek yaprak sayısının Swingle sitrumelo (64.67 adet) ve Nasnaran mandarini (58.30 adet) genotiplerinde bulunduğu belirlenmiştir. (-) Fe uygulamasında en fazla yaprak Antalya Kleopatra mandarini (48.66 adet) ve Swingle sitrumelo (47.90 adet); en az ise Tuzcu turuncu (23.25 adet) ve Yerli üç yapraklı (22.90 adet) da saptanmıştır. Kontrol grubuna göre kıyaslandığında Fe noksanlığına bağlı olarak ortaya çıkan yaprak sayısındaki azalmanın, yüksek ph ya duyarlı olan Yerli üç yapraklıda (%33.52 lik kayıp) ortaya çıktığı tespit edilmiştir. Kontrol grubuna göre en az düşüş ise %2.02 ile Gou Tou turuncu ve %2.98 ile Tuzcu 891 turuncunda bulunmuştur. Çalışmada yüksek ph ya tolerant olarak bilinen Tuzcu turuncu ise %25.24 oranında yaprak kaybı göstermiştir. Tuzcu turuncu, Nasnaran mandarini, Swingle sitrumelo, Carrizo sitranjı, Pomeroy üç yapraklı ve Yerli üç yapraklının kontrol ve (-) Fe uygulamaları yapılan t testi ne göre farklı gruplarda yer alan genotipler olarak belirlenmişlerdir. 91

113 Bu genotipler yaprak sayısı bakımından Fe klorozundan en fazla etkilenen genotipler olarak göze çarpmaktadırlar. Pestana ve ark., (2005) farklı Fe dozlarının (0, 5, 10, 15 ppm) Troyer sitranjı, Taiwanica ve Swingle sitrumelo anaçlarının yaprak sayılarını etkilediğini, anaçların artan bu Fe dozlarıyla orantılı olarak yaprak sayısında artışlar meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Sabır ve ark., (2010) dört farklı asma çeşidinde yaptıkları çalışmalarında en fazla yaprak sayısını 9 ppm Fe uygulamasında elde etmişler ve sodyum bikarbonat uygulamasında yaprak sayısında düşüşler yaşandığını belirtmişlerdir. HCO 3 iyonu konsantrasyonunun birçok mikroelementin özellikle Fe 2+ in alımını etkilediğini ve bu durumun kireçli topraklarda yetiştirilen bitkilerde görülen kloroz probleminin başlıca nedeni olduğu bildirilmiştir (Mengel, 1994). Demir noksanlığı turunçgilde yaprakların küçülmesine, kırılgan ve çok ince dokulu olmasına neden olmaktadır (Zekri ve Obreza, 2009). Bu çalışmada (-)Fe bitkileri, kontrol bitkilerine göre daha az yaprak sayısına sahip olarak bulunmuşlardır. Ancak diğer araştırmacıların yaptığı çalışmalarda kullanılan bitkilerin yaşları bu denemede kullanılanlarla farklılık gösterdiğinden yaprak sayıları karşılaştırılamamıştır. Fakat Fe noksanlığında daha önceden yapılan ve yukarıda belirtilen araştırmalarda yaprak sayısında azalmalar belirlenmiş ve bu çalışmada da benzer sonuçlar elde edilmiştir. 92

114 Çizelge 4.1. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) Yaprak (adet/bitki) Genotip Önemlilik ( Kontrol (-) Fe 3) % Kayıp Tuzcu turuncu ef (1) A (2) e B * Tuzcu 891 turuncu ef cde Ö.D Gou tou turuncu bcd a Ö.D Volkameriana cdef cde Ö.D Sunki mandarini bcde abc Ö.D Antalya Kleopatra mandarini abc a Ö.D Nasnaran mandarini ab A abcd B * Swingle sitrumelo a A ab B * K X S cdef cd Ö.D Carrizo sitranjı abc A abc B * Pomeroy üç yapraklı cdef A cde B * C-35 sitranjı bcde abc Ö.D Marumi kamkat ef de Ö.D Sarawak bintangor f e Ö.D Duncan altıntopu cdef bcd Ö.D Yerli üç yapraklı def A e B * Önemlilik (3) ** ** - - D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3): Ö.D.: Önemli Değil. **: p<0.01; *:p<

115 Şekil 4.1. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) (2) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Boyları (cm) İklim odası tarama denemesi bitkilerinin boyları Çizelge 4.2. ve Şekil 4.2. de verilmiştir. Yapılan tarama çalışmasında bitki boyu bakımından (-)Fe ve kontrol grupları düzeyinde genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Kontrol grubu incelendiğinde en uzun bitki boyu Carrizo sitranjı ( cm) ve Pomeroy üç yapraklı (91.97 cm); en kısa bitki boyu ise Marumi kamkatta (36.95 cm) belirlenmiştir. (-)Fe bitkilerinde ise kontrolle benzer şekilde en yüksek bitki boyu Carrizo sitranjı (97.13 cm) ve Pomeroy üç yapraklı (78.00 cm); en düşük ise Marumi kamkatta (25.40 cm) saptanmıştır. Kontrol ve (-)Fe grupları kendi içlerinde karşılaştırıldıklarında, bitki boyunda ki en yüksek kaybın %42.66 ile Swingle sitrumelo da yaşandığı görülmektedir. Daha sonra bu anacı, 94

116 denemede Fe klorozuna en duyarlı olarak bilinen Yerli üç yapraklı %37.00 ile takip etmiştir. Bitki boyunda en az kaybı ise yaprak sayısında olduğu gibi Gou Tou turuncu (%0.51) göstermiştir (Çizelge 4.2.). Bu çalışmada yer alan 16 turunçgil tür, cins ve çeşitleri genetik açıdan birbirinden farklı özellikler göstermektedirler. Büyüme güçleri arasındaki farklılıklardan kaynaklanan bu durum kontrol bitkileri incelendiğinde göze çarpmaktadır. Örneğin Marumi kamkat kontrol ve (-)Fe gruplarında en kısa boylu bitki olarak görünmektedir ve normalde de bitki kendi genetik yapısı itibariyle kısa yapılıdır. Demir noksanlığının bitki bünyesinde yarattığı durumu incelemek için mutlaka kontrol ve uygulama gruplarını kendi içlerinde kıyaslayarak % kayıptan yola çıkılması ile tartışmak çok daha doğru olacaktır. Bu çerçevede yaprak sayısında %25.96 lık bir kayıp yaşayan Swingle sitrumelo, bitki boyunda %42.66 lik düşüş göstermiştir. Yaprak sayısında en az düşüş gösteren Gou Tou turuncu (%2.02 adet) ve Tuzcu 891 turuncu (%2.98 adet), benzer şekilde oldukça az boy kaybı yaşamışlardır (Çizelge 4.2.). Tuzcu 891 turuncu, Gou Tou turuncu, Sunki mandarini, Carrizo sitranjı, C-35 sitranjı ve Duncan altıntopu kontrol ve (-)Fe uygulamalarında aynı gruplarda yer alırken, diğer genotipler farklı grupta yer alarak Fe noksanlığı durumunda daha kısa boylu olarak belirlenmişlerdir (Çizelge 4.2.). Tuzcu (1979), 14 farklı turunçgil anacının 26 0 C gündüz ve 18 0 C gece sıcaklığındaki kontrollü koşullarda performanslarını incelediği çalışmasında, 111. günün sonunda, en uzun boylu bitkileri Carrizo sitranjında belirlemiştir. Bu çalışmada da kontrol bitkileri içinde en uzun boylu bitkiler Carrizo sitranjından elde edilmiştir. Pestana ve ark., (2005) çalışmalarında 5, 10 ve 15 ppm Fe uygulamalarının 0 dozuna göre bitki boyunda artış meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Araştırıcılar, farklı Fe dozlarının (0, 5, 10, 15 ppm) Troyer sitranjı, Taiwanica ve Swingle sitrumelo anaçlarının bitki boylarını etkilediğini, anaçların 0, 5, 10, 15 ppm Fe dozlarıyla orantılı olarak bitki boyunda artış meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Sabır ve ark., (2010) dört farklı asma çeşitinde yaptıkları çalışmalarında en uzun 95

117 bitkileri 9 ppm Fe uygulamasında elde etmişler ve sodyum bikarbonat uygulamasında bitki boylarında düşüşler yaşandığını belirtmişlerdir. Çizelge 4.2. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Boyları (cm) Boy (cm) Genotip % Kontrol (-) Fe Önemlilik Kayıp Tuzcu turuncu efgh (1) A (2) efgb * Tuzcu 891 turuncu defg cde Ö.D Gou tou turuncu efg cdef Ö.D Volkameriana ab A bcd B * Sunki mandarini defg cdef Ö.D Antalya Kleopatra mandarini defg A defg B * Nasnaran mandarini fg A fg B * Swingle sitrumelo abc A cdef B * K X S cdef A cde B * Carrizo sitranjı a a Ö.D Pomeroy üç yapraklı ab A ab B * C-35 sitranjı bcde bc Ö.D Marumi kamkat g A g B * Sarawak bintangor fg A fg B * Duncan altıntopu fg efg Ö.D Yerli üç yapraklı bcd A cdef B * Önemlilik (3) ** ** - - D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3): Ö.D.: Önemli Değil. **: p<0.01; *:p<

118 Şekil 4.2. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Boyları (cm) (3) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Ağırlıkları (g/bitki) İklim odası tarama denemesi bitkilerinin bitki ağırlıkları Çizelge 4.3. ve Şekil 4.3. te verilmiştir. Şekil 4.8., 4.9., 4.10., ve de deneme sonunda bitkilerin genel görünümleri sunulmuştur. Yapılan tarama çalışmasında bitki ağırlığı bakımından (-)Fe ve kontrol grupları düzeyinde genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Kontrol grubu incelendiğinde en yüksek bitki ağırlığının Volkameriana (45.93 g/bitki) ve Tuzcu 891 turuncunda (46.15 g/bitki) bulunduğu belirlenmiştir. (-)Fe grubu incelendiğinde ise en ağır bitkiler kontrolde de en yüksek değeri veren Tuzcu 891 turuncundan (39.04 g/bitki) elde edilmiştir. Tuzcu 891 turuncunu sırasıyla Carrizo sitranjı (36.19 g/bitki) ve Gou Tou turuncu (35.95 g/bitki) izlemiştir. Kontrol ve (-)Fe 97

119 uygulamalarında genotiplerin tepkileri % kayıp olarak incelendiğinde ise Fe klorozunda en fazla ağırlık kaybına uğrayanlar Yerli üç yapraklı (%59.14), Tuzcu turuncu (%49.01), Nasnaran mandarini (%47.18) ve Volkameriana (%43.28) olarak belirlenmiş, en az kayıp ise Antalya Kleopatra mandarini (%7.71) ve Sunki mandarininde (%9.90) görülmüştür. Bu çalışmada yer alan Tuzcu turuncu, Tuzcu 891 turuncu ve Gou Tou turuncu bitki gelişimi açısından farklı tepkiler vermiştir. Tuzcu turuncu yaprak, boy ve ağırlık bakımından sırasıyla %25.24, %33.47 ve %49.01 lik kayba uğrarken, Tuzcu 891 turuncu sırasıyla %2.98, %7.16 ve %15.40 lık; Gou Tou turuncu ise %2.02, %0.51 ve %11.62 lik kayıp yaşamıştır (Çizelge 4.1., 4.2. ve 4.3.). Demir klorozuna duyarlı olarak bilinen Swingle sitrumelo ve Yerli üç yapraklı ise ağırlıkta sırasıyla %35.41 ve %59.14 lük kayba uğramıştır. Demir klorozuna tolerant olan Kleopatra Antalya mandarini ise %7.71 lik ağırlık kaybı yaşamıştır (Çizelge 4.3.). Tuzcu turuncu, Volkameriana, Nasnaran mandarini, Swingle sitrumelo ve Yerli üç yapraklı genotipleri kontrol ve (-)Fe uygulamaları karşılaştırıldığı t testi nde farklı gruplarda yer alarak, Fe noksanlığından bitki taze ağırlığı bakımından etkilendikleri belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). Castle ve ark. (2009), bazı turunçgil anaçlarının Fe kloruzuna karşı gösterdikleri tepkileri inceledikleri çalışmada, Fe klorozunun bitkilerin yaş ağırlıklarını azalttığını belirtmişlerdir. Bu çalışmada yer alan Kleopatra mandarini (-) Fe koşullarında oransal büyümede 2.1 (g/bitki) iken (+) Fe koşulunda ise 2.4 (g/bitki) ağırlığa sahip olmuştur. Ayrıca, aynı çalışmada Swingle sitrumelo (-)Fe koşulunda 1.6 (g/bitki), (+)Fe de ise 2.7 (g/bitki) ağırlığa sahip olmuştur. Bu çalışmada da Kleopatra mandarini %7.71 lik ağırlık kaybı ile en az ağırlık kaybeden genotip olarak belirlenmiş ve Castle ve ark. (2009) nın yaptığı çalışmayla benzer bir sonuç elde edilmiştir. Ayrıca, Pestana ve ark. (2005) turunçgil anaçlarında ve Sabır ve ark. (2010) asma bitkisinin artan Fe dozlarında daha yüksek taze ağırlık kazandıklarını belirlemişlerdir. 98

120 Fernandez ve ark. (2006), turunçgilde demir ile ilgili sıkıntıları olan bahçelerde yapılan birçok Fe gübrelemesi çalışmasında verimin Fe gübrelemesi ile artış gösterdiğini bildirilmişlerdir (Sites et al., 1953; Carpena ve ark., 1957; Stewart ve Leonard, 1957). Örneğin Fe klorozu gösteren Meksika laymı (Citrus aurantifolia) ağaçlarına yapraktan ve topraktan yapılan Fe uygulaması ile meyve boyunda %30 ve meyve sayısında 2 kat artışın, verimde ise 3 kat artışın sağlandığı bildirilmiştir (El- Kassas, 1984). Benzer şekilde topraktan FeEDDHA uygulaması portakalda %26 verim artışı sağlamıştır (Perez-Sanz ve ark., 1997). Alva ve Obreza (1998) FeEDDHA ve Fe-humate ın portakalda %6-55 ve altıntoplarda %4-9 verim artışını sağladığını bildirmişlerdir. Klemantin mandarininde Fe uygulaması %20 lik verim artışı sağlamıştır (Banuls ve ark., 2003). 99

121 Çizelge 4.3. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Taze Ağırlıklıları (g/bitki) Bitki Ağırlığı (g/bitki) Genotip % Kontrol (-) Fe Önemlilik Kayıp Tuzcu turuncu a-d (1) A (2) c-fb * Tuzcu 891 turuncu a a Ö.D Gou tou turuncu abc ab Ö.D Volkameriana ab A bcd B * Sunki mandarini bcde abc Ö.D Antalya Kleopatra mandarini c-f bcd Ö.D Nasnaran mandarini c-f A def B * Swingle sitrumelo a-d A bcd B * K X S def cde Ö.D Carrizo sitranjı abc ab Ö.D Pomeroy üç yapraklı def cdef Ö.D C-35 sitranjı a-e bcd Ö.D Marumi kamkat f 7.05 f Ö.D Sarawak bintangor f 9.37 ef Ö.D Duncan altıntopu cde bcd Ö.D Yerli üç yapraklı ef A 6.32 f B * Önemlilik (3) ** ** - - D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3): Ö.D.: Önemli Değil. **: p<0.01; *:p<

122 Şekil 4.3. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Ağırlıklıları (g/bitki) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm -2 ) İklim odası tarama denemesi bitkilerinin SPAD değerleri Çizelge 4.4. ve Şekil 4.4. de verilmiştir. Yapılan tarama çalışmasında SPAD bakımından (-)Fe ve kontrol gruplarında genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Kontrol grubu incelendiğinde en yüksek SPAD değerinin, Tuzcu turuncu (66.68), Pomeroy üç yapraklı (65.56) ve Antalya Kleopatra mandarininde (65.42) bulunmuştur. (-)Fe uygulamasında ise en düşük SPAD değerleri Yerli üç yapraklı (10.73), Pomeroy üç yapraklı (23.87), Volkamerina (31.72) ve Sarawak bintangortan (31.37) elde edilmiştir. Yüzde kayıplar değerlendirildiğinde kontrol grubuna göre en fazla kaybı Yerli üç yapraklı (%81.53) (Şekil 4.12.) ve Pomeroy üç yapraklı (%63.59) gösterirken, en az kayıp ise %5.78 ile 101

123 Tuzcu 891 turuncunda görülmüştür. Kontrol ve (-)Fe uygulamalarının karşılaştırıldığı t testi nde Tuzcu 891 turuncu dışındaki tüm genotiplerde, kontrol ve uygulama bitkileri farklı grupta yer almışlardır. Tuzcu 891 turuncunda kontrol (48.92) ve uygulama (46.09) bitkilerinin yaprakları benzer yeşil renge sahip olarak bulunmuştur. Bu çalışmadaki sonuçlarla uyumlu bir şekilde, turunçgil anaçlarının Fe klorozuna olan tepkilerinin incelendiği çalışmalarda SPAD miktarının ya da toplam klorofil miktarının Fe klorozunda azaldığı bildirilmiştir (Byrne ve ark., 1995; Pestana ve ark., 2001; Pestana ve ark., 2005; Castle ve ark., 2009). Çizelge 4.4. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm -2 ) SPAD Genotip Kontrol (-) Fe Önemlilik % Kayıp Tuzcu turuncu a (1) A (2) a B * Tuzcu 891 turuncu de ab Ö.D Gou tou turuncu bcde A abc B * Volkameriana cde A de B * Sunki mandarini de A bcd B * Antalya Kleopatra mandarini a A a B * Nasnaran mandarini e A bcd B * Swingle sitrumelo a A cd B * K X S a A ab B * Carrizo sitranjı ab A ab B * Pomeroy üç yapraklı a A e B * C-35 sitranjı abc A bcd B * Marumi kamkat a A ab B * Sarawak bintangor abc A de B * Duncan altıntopu ab A a B * Yerli üç yapraklı abcd A f B * Önemlilik (3) ** ** - - D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3): Ö.D.: Önemli Değil. **: p<0.01; *:p<

124 Şekil 4.4. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm -2 ) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Redüktaz Enzim Aktiviteleri (nmol/gta/dak.) Yapılan tarama çalışmasında redüktaz enzim aktivitesi ölçümleri için Daşgan (1999) ın kullandığı yöntem uygulanmış, ancak bu protokolle etkin bir enzim aktivitesi elde edilememiştir. Turunçgilde yapılan Fe redüktaz aktiviteleri Treeby ve Uren (1993), Pestana ve ark. (2001), Castle ve ark. (2009) tarafından su kültüründe; Chouliaras ve ark. (2004c) ise kum-perlit ortamında yetiştirdikleri bitkilerin köklerinde ölçmüştür. Bu çalışmada kuvars kumu 0.2 mm nin altında olarak kullanılmış ve Daşgan (1999) protokolünde etkinlik sağlanamayınca Castle ve ark. (2009) nın su kültürü ve Chouliras ve ark. (2004 c) nın kum-perlit ortamında 103

125 kullanıkları yöntemler denenmiş, ancak bu yöntemlerden de istenilen sonuç alınamayınca su kültüründe yeni bir deneme kurulmuştur. Su kültüründe kurulan denemede Castle ve ark. (2009) da kullandıkları ve Castle ve Manthey (1998) tarafından geliştirilen yöntem hazırlanan çözeltinin 33 0 C de 3 saat bekletilmesi esasına dayanmaktadır. Bu çalışmada (4). de belirtilen yönteme ilave olarak, hazırlanan çözeltinin 1 saat oda sıcaklığında değil, 33 0 C de 3 saat bekletilmesi durumunda redüktaz aktivitesinin gerçekleştiği ve tayin edilebildiği tespit edilmiştir. Daha önceden yapılan çalışmalarda redüktaz aktivitesinin ölçümü su kültürü ya da kum-perlit gibi köklerin rahat gelişebileceği ve deneme sonunda kılcal köklere zarar vermeyecek şekilde bitkilerin sökümüne uygun dizayn edildiği göze çarpmaktadır. Ancak bu çalışmada kullanılan kuvarsın çok küçük çaplı olması ve deneme sonunda yapılan sökümler sonunda yapılan ölçümlerde aktivitenin olduğuna dair bir işaret olan kırmızı rengin görülmemesi ve su kültüründen elde edilen köklerde aktivitenin görülmesi kılcal köklerin kuvarsdan söküm esnasında zarar gördüklerini göstermektedir İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Demir Klorozu Skalası Değerleri İklim odası tarama denemesi bitkilerinin Fe kloroz skalası değerleri Çizelge 4.5. ve Şekil 4.5. te verilmiştir. Yapılan tarama çalışmasında skala bakımından (-)Fe uygulamasında genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Kontrol grubu incelendiğinde bütün genotipler sağlıklı yapraklara sahip olarak saptanmışlardır. (-)Fe bitkilerinde ise Yerli üç yapraklı (5.00) en klorotik yapraklara sahip olarak belirlenmiştir (Şekil 4.12.). Pomeroy üç yapraklı (4.00) ve Swingle sitrumelo (3.20) değerleriyle Yerli üç yapraklıyı izlemişlerdir. (-) Fe bitkilerinde en yeşil yapraklara Tuzcu turuncu (1.05), Gou Tou turuncu (1.06) ve Tuzcu 891 turuncu (1.20) sahip olmuştur ve bu genotipler yapılan t testi nde gruplar arasında farklılık saptanmamıştır (Çizelge 4.5.). 104

126 Bu çalışmada kullanılan skala değerleri Byrne ve ark. (1995) nın 26 turunçgil anacının Ray Ruby altıntopunda Fe klorozunun etkisini araştırdıkları çalışmalarından alınmıştır. Daha önce yapılan birçok turunçgil çalışmasında da gözlem değerlerinden oluşan skalalar kullanılmıştır (Maxwell ve Wutscher, 1976; Hamze ve ark., 1986; Sudahono ve ark., 1994; Byrne ve ark., 1995; Ferrarezi ve ark., 2007; Castle ve ark., 2009). SPAD değeri ile gözlenen değer arasındaki paralellikler birbirlerini doğrulamaktadırlar. Çizelge 4.5. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Kloroz Skalası Değerleri Skala Genotip Kontrol (-) Fe Önemlilik Tuzcu turuncu f (1) Ö.D. Tuzcu 891 turuncu f Ö.D. Gou tou turuncu f Ö.D. Volkameriana 1.00 B (2) 2.40 cde A * Sunki mandarini 1.00 B 2.00 def A * Antalya Kleopatra mandarini 1.00 B 1.80 ef A * Nasnaran mandarini 1.00 B 1.70 ef A * Swingle sitrumelo 1.00 B 3.20 bc A * K X S 1.00 B 1.83 ef A * Carrizo sitranjı 1.00 B 2.00 def A * Pomeroy üç yapraklı 1.00 B 4.00 ab A * C-35 sitranjı 1.00 B 2.20 cdef A * Marumi kamkat 1.00 B 3.00 bcd A * Sarawak bintangor 1.00 B 2.66 cde A * Duncan altıntopu 1.00 B 2.57 cde A * Yerli üç yapraklı a - Önemlilik (3) Ö.D. ** - D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3): Ö.D.: Önemli Değil. **: p<0.01; *:p<0.05 Skala değerleri; 1: Normal yeşil yapraklar, 2:Damarlar arası bölge sarımsı-yeşil, damarlar yeşil, 3: Damarlar arası bölge yeşilimsi-sarı, damarlar yeşil, 4: Damarlar arası bölge sarı, damarlar yeşil, 5: Damarlar arası bölge sarı-beyaz, damarlar soluk yeşil ve yaprak dökümleri var. 105

127 Şekil 4.5. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Kloroz Skalası Değerleri İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (1) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) İklim odası tarama denemesi bitkilerinin yaprak toplam Fe konsantrasyonları Çizelge 4.6. ve Şekil 4.6. da verilmiştir. Yapılan tarama çalışmasında toplam Fe konsantrasyonu bakımından (-)Fe ve kontrol gruplarında genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Kontrol grubu incelendiğinde en yüksek toplam Fe konsantrasyonunun Sarawak bintangor (70.03 mg/kg) ve Duncan altıntopunda (65.41 mg/kg); en düşük ise Sunki mandarini (

128 mg/kg) ve Nasnaran mandarininde (40.00 mg/kg) bulunduğu belirlenmiştir. (-)Fe grubunda ise en yüksek toplam Fe konsantrasyonu Tuzcu turuncu (46.40 mg/kg), Duncan altıntopu (40.00 mg/kg) ve Marumi kamkattan (36.15 mg/kg) elde edilirken, en düşük toplam Fe konsantrasyonu ise Yerli üç yapraklı (12.76 mg/kg), Pomeroy üç yapraklı (20.45 mg/kg), Sunki mandarini (24.51 mg/kg) ve Gou Tou turuncu (26.98 mg/kg) ndan elde edilmiştir (Çizelge 4.6.). Kontrol ve (-)Fe uygulamalarında yer alan bitkilerin toplam Fe miktarlarındaki % kayıplar bakımından, en yüksek düşüş %77.67 ile Yerli üç yapraklıda görülmüş, bunu %57.28 ile Sarawak bintangor ve %54.51 ile Pomeroy üç yapraklı izlemiştir. En düşük kayıp ise % ile Tuzcu turuncunda belirlenmiştir. Bütün genotipler iklim odası koşullarında Fe klorozunda toplam Fe miktarlarını azaltmış ve yapılan t testi nde kontrolleriyle farklı grupta yer almıştır (Çizelge 4.6.). Yapılan bazı çalışmalarda yapraklardaki toplam Fe düzeyinin yaprağın kloroz durumuna bağlı olarak azalma gösterdiği (Chouliaras ve ark., 2004c; Torres ve ark., 2006), bazı çalışmalarda da toplam Fe in bitkinin Fe le ilgili durumunu yansıtmada yeterli olmadığı; yapraktaki toplam Fe ve yaprak klorozu arasında bir ilişkinin bulunmadığı veya varolan ilişkinin doğrusal olmadığı bildirilmiştir. Bu nedenle, klorotik yaprakların yüksek toplam Fe içerebileceği ve bu nedenle Fe alımı etkinliğinin teşhisinde klorotik yaprakların kullanılamayacağı bildirilmiştir (Razeto, 1982; Hurley ve ark., 1986; Sudahano ve ark.,1994; Mohammad ve ark.,1998; Abadia ve ark., 2000; Razeto ve Valdes, 2006; Ferrarezi ve ark., 2007). Ayrıca kontrollü koşullarda Fe paradoksunun yaşanmadığını bildiren çalışmalarda bulunmaktadır (Morales ve ark.,1998). 107

129 Çizelge 4.6. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Toplam Demir (mg/kg) Genotip Kontrol (-) Fe Önemlilik % Kayıp Tuzcu turuncu cde (1) A (2) a B * Tuzcu 891 turuncu defg A cdef B * Gou tou turuncu efgh A efg B * Volkameriana abc A cd B * Sunki mandarini i A gh B * Antalya Kleopatra mandarini efgh A cde B * Nasnaran mandarini hi A defg B * Swingle sitrumelo fgh A cde B * K X S bcd A cd B * Carrizo sitranjı cdef A fgh B * Pomeroy üç yapraklı fgh A h B * C-35 sitranjı gh A efg B * Marumi kamkat defg A bc B * Sarawak bintangor a A defg B * Duncan altıntopu ab A b B * Yerli üç yapraklı bcd A i B * Önemlilik (3) ** ** - - D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3): **: p<0.01; *:p<

130 Şekil 4.6. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (2) İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) İklim odası tarama denemesi bitkilerinin yaprak aktif Fe konsantrasyonları Çizelge 4.7. ve Şekil 4.7. de verilmiştir. Yapılan tarama çalışmasında toplam Fe konsantrasyonu bakımından (-)Fe ve kontrol gruplarında genotipler arasındaki farklılık p<0.01 e göre istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Kontrol grubu incelendiğinde en yüksek değerler Antalya Kleopatra mandarini (27.52 mg/kg) ve Sarawak bintangor (45.77 mg/kg) genotiplerinde; en düşük ise Pomeroy üç yapraklı (18.90 mg/kg) ve C-35 sitranjında (19.41 mg/kg) belirlenmiştir. (-)Fe grubunda ise en yüksek aktif Fe konsantrasyonu Tuzcu turuncu (24.86 mg/kg) ve Duncan 109

131 altıntopu (20.71 mg/kg) dan en düşük konsantrasyonlar ise Yerli üç yapraklı (3.68 mg/kg), Pomeroy üç yapraklı (9.43 mg/kg) ve Sunki mandarininde (10.77 mg/kg) tespit edilmiştir (Çizelge 4.7.). Kontrol ve (-)Fe uygulamalarında yer alan bitkilerin aktif Fe konsantrasyonlarındaki % kayıplar itibariyle, en yüksek düşüş %83.01 ile Yerli üç yapraklıda görülmüş bunu %67.82 ile Sarawak bintangor izlemiştir. % 8.61 ile en düşük kayıp Marumi kamkatta ve %11.09 ile Tuzcu turuncunda belirlenmiştir. Kontrol ve (-)Fe uygulamalarının karşılaştırıldığı t testi nde Tuzcu turuncu, Marumi kamkat ve Duncan altıntopu dışındaki tüm genotipler farklı grupta yer almışlardır. Demir klorozuna tolerant olarak bilinen Tuzcu turuncu (-)Fe uygulamasında (24.86 mg/kg) ve kontrolde (27.96 mg/kg) istatistiksel anlamda önemli bir farklılık göstermemiş ve birbirine yakın değerler vermiştir (Çizelge 4.7.). Bitkilerde Fe in büyük bir kısmı Fe +3 den oluşmasına karşın, Fe +2 metabolik olarak aktiftir (Kacar ve Katkat, 2009). Bu nedenle, aktif Fe in bitkinin Fe düzeyini belirlemek için uygun olduğu ve bitkinin kloroz durumunu yansıttığı belirtilmiştir (Sudahano ve ark. (1994) ; Mohammad ve ark.(1998); Chouliaras ve ark. (2004 c), Torres ve ark. (2006); Çelik ve Katkat (2007); Ferrarezi ve ark. (2007)). 110

132 Çizelge 4.7. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Aktif Demir (mg/kg) Genotip Kontrol (-) Fe Önemlilik % Kayıp Tuzcu turuncu de (1) a Ö.D Tuzcu 891 turuncu defg A (2) def B * Gou tou turuncu defg A efg B * Volkameriana bc A bc B * Sunki mandarini defg A gh B * Antalya Kleopatra mandarini def A b B * Nasnaran mandarini fg A def B * Swingle sitrumelo b A bcd B * K X S efg A cd B * Carrizo sitranjı cd A fgh B * Pomeroy üç yapraklı g A 9.43 h B * C-35 sitranjı g A fgh B * Marumi kamkat g b Ö.D Sarawak bintangor a A def B * Duncan altıntopu defg b Ö.D Yerli üç yapraklı fg A 3.68 i B * Önemlilik (3) ** ** - - D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3): Ö.D.: Önemli Değil.. **: p<0.01; *:p<

133 Şekil 4.7. İklim Odası Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) 112

134 Şekil 4.8. İklim odası denemesi sonunda Tuzcu 31-31, Tuzcu 891 ve Gou Tou turunçlarının (-)Fe ve kontrol bitkilerinin görünümü. 113

135 Şekil 4.9. İklim odası denemesi sonunda Sunki, Antalya Kleopatra ve Nasnaran mandarinleri ile Sarawak bintangorda (-)Fe ve kontrol bitkilerinin görünümü. 114

136 Şekil İklim odası denemesi sonunda Kleopatra mandarini X Swingle sitrumelo melezi, Swingle sitrumelo, Carrizo ve C-35 sitranjlarının (-)Fe ve kontrol bitkilerinin görünümü. 115

137 Şekil İklim odası denemesi sonunda Pomeroy üç yapraklı ve Yerli üç yapraklı (-)Fe ve kontrol bitkilerinin görünümü. Şekil İklim odası denemesi sonunda Yerli üç yapraklı (-)Fe ve kontrol bitkilerinin görünümü. 116

138 Şekil İklim odası denemesi sonunda Volkameriana, Duncan altıntopu ve Marumi kamkatın (-) Fe ve kontrol bitkilerinin görünümü. 117

139 Arazi Tarama Denemesi Sonuçları Bitki Büyüme Oranları (1) Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet) Arazi tarama denemesi bitkilerinin yaprak sayıları Çizelge 4.8. ve Şekil de verilmiştir. Yapılan arazi tarama çalışmasında yaprak sayısı bakımından genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. En yüksek yaprak sayısı Antalya Kleopatra mandarini ( adet), Nasnaran mandarini (1169 adet) ve Tuzcu turuncunda (1080 adet) belirlenmiştir. En düşük yaprak sayısı ise Marumi kamkat (32.75 adet), Sarawak bintangor (78.50 adet) ve Pomeroy üç yapraklı (107 adet) genotiplerinden elde edilmiştir. İklim odası tarama çalışmasında (-)Fe bitkilerinde en fazla yaprak sayısı Antalya Kleopatra mandarininde (48.66 adet) saptanmıştır (Çizelge 4.1.). Yüksek kireç içeren doğal koşullardaki denemede de benzer şekilde Antalya Kleopatra mandarini en fazla yaprağı vermiştir. İklim odasında (-)Fe koşullarında adet/bitki ile en düşük yaprak sayısına sahip bulunanlardan biri olan Tuzcu turuncu arazi koşullarında en yüksek (1080 adet) yaprak veren genotipler arasında yer almıştır. Demir klorozuna duyarlı olan Yerli üç yapraklı iklim odasında (-)Fe koşullarında %33.52 lik yaprak kaybına uğramış ve arazi koşullarında yeni yaprak oluşturamamıştır (Çizelge 4.1.). Arazi koşullarında bulunan Yerli üç yapraklı bitkilerinin Fe stresinin en ileri aşamaları görülmüş, yeni yaprak oluşturamama ve sürgün uçlarında kuruma gibi simptomlarla Fe klorozuna hassasiyetini göstermiştir. Marumi kamkat ise bodur yapılı bitki olduğundan gerek iklim odasında gerekse arazi koşullarında en az yaprak sayısına sahip genotip olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.1. ve 4.8.). Swingle sitrumelo iklim odasında (-)Fe koşullarında yaprak sayısı bakımından en yüksek sayıya (47.90 adet) sahip olanlardan biri olarak belirlenmiş ve 118

140 benzer şekilde arazideki yaprak sayısı da diğer üç yapraklı melezleri içerisinde en yüksek bulunmuştur. Dünya da anaç olarak kullanımı yaygınlaşan Carrizo ve C-35 sitranjları ise hem iklim odasında hem de arazi koşullarında orta sayıda yaprak sayısına sahip olarak bulunmuşlardır (Çizelge 4.1. ve 4.8.). Çizelge 4.8. Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) Genotip Yaprak sayısı (adet) Tuzcu turuncu bc (1) Tuzcu 891 turuncu Gou tou turuncu Volkameriana Sunki mandarini Antalya Kleopatra mandarini Nasnaran mandarini Swingle sitrumelo K X S Carrizo sitranjı Pomeroy üç yapraklı bcd cdef f def a ab bcde def ef g C-35 sitranjı cdef Marumi kamkat Sarawak bintangor Yerli üç yapraklı - Önemlilik (2) ** g g D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): **: p<

141 Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet/bitki) (2) Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Boyları (cm) Arazi tarama denemesi bitkilerinin bitki Çizelge 4.9. ve Şekil te verilmiştir. Arazi denemesine değerlendirilen genotiplerin görünümleri Şekil 4.20., Şekil 4.21., Şekil 4.22., Şekil 4.23., Şekil 4.24., Şekil 4.25., Şekil 4.26., Şekil 4.27., Şekil 4.28., Şekil 4.29., Şekil 4.30., Şekil 4.31., Şekil 4.32., Şekil ve Şekil de sunulmuştur. Yapılan arazi tarama çalışmasında bitki boyu bakımından genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. En yüksek bitki boyu C- 35 sitranjı ( cm), Carrizo sitranjı ( cm) ve Tuzcu turuncunda ( cm); en düşük ise Marumi kamkat (26.75 cm), Sarawak bintangor (53.00 cm) ve Pomeroy üç yapraklı (87.33 cm) genotiplerinde belirlenmiştir (Çizelge 4.9.). 120

142 Üç yapraklı ve melezleri içerisinde en düşük yaprak sayısına sahip olarak belirlenen Pomeroy üç yapraklı (107 adet), bu grup içerisindeki en kısa boylu bitkileri vermiştir. Ancak iklim odası (-Fe) koşullarında bu genotip cm ile en uzun boya sahip genotipler arasında yer almıştır (Çizelge 4.2.). Yaprak sayısı ve bitki boyunun diğer Üç yapraklı melezlerine göre düşük kalması, arazi koşullarındaki Fe noksanlığının muhtemelen bitkinin büyümesini ciddi anlamda etkilemesinden kaynaklanmaktadır. Ancak Poncirus cinsinin, Citrus cinsine göre daha kısa yapılı bitkiler meydana getirdiği ve ilk fidan döneminde hızlı bir gelişim gösteren bitkinin yaşı ilerledikçe daha yavaş bir gelişim gösterdiği bilinmektedir. Keskin (1981), yaklaşık 6 aylık turunçgil anaçlarında yaptığı ölçümlerde Yerli üç yapraklının bitki boyu ve çap gelişiminin Carrizo sitranjı ve turunçtan daha iyi olduğunu belirlemiştir. Kaplankıran (1984) ise, arazi koşullarında 4 yaşlı turunç ve Volkameriana çöğürlerinin, Yerli üç yapraklı çöğürlerine göre çap büyüme hızının daha yüksek olduğunu belirtmiştir. Bu çalışmada iklim odasında denemeye alınan bitkiler yaklaşık 1 yaşındayken, arazi koşullarındakiler yaklaşık 4 yaşındadırlar. Saunt (2000), tarafından Fe klorozuna orta tolerant olduğu ve ph nın 7.5 in üstüne çıkmasıyla sorunların yaşanacağı bildirilen Carrizo ve C-35 sitranjları, arazi koşullarında bitki boyu açısından oldukça iyi performans göstermişlerdir. Tuzcu turuncu iklim odasında (-)Fe koşullarında en fazla boy kaybına uğrayan genotipler arasında yer alırken, arazi koşullarında cm lik boyu ile en fazla uzayan genotipler arasında yer almıştır (Çizelge 4.2. ve 4.9.). Antalya Kleopatra mandarini hem iklim odasında hem de arazi koşullarında boy bakımından orta sıralarda yer almıştır (Çizelge 4.2. ve 4.9.). Marumi kamkat kısa yapılı bitkileri oluşturmuştur ve bu bitkinin genetik yapısından kaynaklanmaktadır (Çizelge 4.9.). 121

143 Çizelge 4.9. Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm) Genotip Bitki boyu (cm) Tuzcu turuncu ab (1) Tuzcu 891 turuncu Gou tou turuncu Volkameriana Sunki mandarini Antalya Kleopatra mandarini Nasnaran mandarini Swingle sitrumelo K X S Carrizo sitranjı Pomeroy üç yapraklı bc cd cd d cd d ab ab ab e C-35 sitranjı a Marumi kamkat Sarawak bintangor Yerli üç yapraklı - Önemlilik (2) ** f f D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):**: p<

144 Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyları (cm) Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm -2 ) Arazi tarama denemesi bitkilerinin SPAD değerleri Çizelge ve Şekil da verilmiştir. Yapılan arazi tarama çalışmasında SPAD bakımından genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak %1 düzeyinde önemli bulunmuştur. En yüksek SPAD değerleri Carrizo sitranjı (49.36), Gou Tou turuncu (44.86) ve Tuzcu turuncu (42.78), en düşük değerler ise Swingle sitrumelo (14.08), Pomeroy üç yapraklı (12.77) ve Sarawak bintangor (15.00) dan elde edilmiştir (Çizelge 4.10). İklim odası (-)Fe koşullarında en yüksek SPAD değeri ile Antalya Kleopatra mandarininde belirlenmiş, bu genotip arazi koşullarında değeri ile en yüksek SPAD değerine sahip olanlardan biri olarak saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve 4.10.). 123

145 Arazi koşullarında en yüksek SPAD okuması Carrizo sitranjında yapılmış ve iklim odası (-)Fe koşullarında benzer şekilde ile yine yüksek değer alanlar arasında bulunmuştur. Gou Tou turuncu ve Tuzcu turuncunda da benzer durum görülmüştür (Çizelge 4.4. ve 4.10.). Arazi koşullarında en düşük SPAD değeri Swingle sitrumelo (14.08) ve Pomeroy üç yapraklıdan (12.77) elde edilmiş, iklim odasında ki (-)Fe koşullarında bu genotipler sırasıyla ve ile en düşükler arasında yer almıştır (Çizelge 4.4. ve 4.10.). Bazı literatürlerde tolerant bazılarında duyarlı olarak belirlenen Volkameriana ise iklim odası (-) Fe koşullarında ve arazi koşullarında SPAD değerlerini vermiştir (Çizelge 4.4. ve 4.10.). Çizelge Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm -2 ) Genotip SPAD Tuzcu turuncu abc (1) Tuzcu 891 turuncu Gou tou turuncu Volkameriana Sunki mandarini Antalya Kleopatra mandarini Nasnaran mandarini Swingle sitrumelo K X S Carrizo sitranjı Pomeroy üç yapraklı bcd ab bcd abc a abcd e cd a e C-35 sitranjı d Marumi kamkat Sarawak bintangor Yerli üç yapraklı - Önemlilik (2) ** bcd e D (0.01) (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): **: p<

146 Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm -2 ) Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Demir Klorozu Skalası Değerleri Arazi tarama denemesi bitkilerinin Fe kloroz skalası değerleri Çizelge ve Şekil de verilmiştir. Arazi tarama çalışmasında skala bakımından genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. En klorotik yapraklar Sarawak bintangor (5.00), Swingle sitrumelo (4.67) ve Pomeroy üç yapraklı (4.32) da; en yeşil, klorozsuz yapraklar ise Gou Tou turuncu (1.50), Sunki mandarini (1.50), Nasnaran mandarini (1.71) ve Carrizo sitranjında (1.80) gözlenmiştir. 125

147 Arazi koşullarında 5.00 skala değeri ile en sarı yapraklara sahip olarak bulunan Sarawak bintangor, iklim odasında 2.66 ile orta klorotik olarak saptanmıştır (Çizelge 4.5. ve 4.11.). Arazi koşullarında Swingle sitrumelo 4.67 ve Pomeroy üç yapraklı ise 4.32 skala değerleriyle oldukça sarı bir görünüme sahip olarak bulunurken, iklim odasında da sırasıyla 3.20 ve 4.00 değerleri ile biraz daha yeşilimsi renk almıştır (Çizelge 4.5. ve 4.11.). Arazide Gou Tou turuncu (1.50), Sunki mandarini (1.50), Nasnaran mandarini (1.71) ve Carrizo sitranjı (1.80) na ait skala değerleri, iklim odasında sırasıyla 1.06; 2.00; 1.70 ve 2.00 değerlerle uyumlu görünmektedir (Çizelge 4.5. ve 4.11.). Çizelge Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Kloroz Skalası Değerleri Genotip Skala Tuzcu turuncu 2.00 bcd (1) Tuzcu 891 turuncu Gou tou turuncu Volkameriana Sunki mandarini Antalya Kleopatra mandarini Nasnaran mandarini Swingle sitrumelo K X S Carrizo sitranjı Pomeroy üç yapraklı 2.50 bcd 1.50 d 2.00 bcd 1.50 d 1.86 bcd 1.71 cd 4.66 a 2.85 bc 1.80 cd 4.31 a C-35 sitranjı 3.00 b Marumi kamkat Sarawak bintangor Yerli üç yapraklı - Önemlilik (2) ** 2.00 bcd 5.00 a D 1.14 (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): **: p<0.01 Skala değerleri; 1: Normal yeşil yapraklar, 2:Damarlar arası bölge sarımsı-yeşil, damarlar yeşil, 3: Damarlar arası bölge yeşilimsi-sarı, damarlar yeşil, 4: Damarlar arası bölge sarı, damarlar yeşil, 5: Damarlar arası bölge sarı-beyaz, damarlar soluk yeşil ve yaprak dökümleri var. 126

148 Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Kloroz Skalası Değerleri Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (1). Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Arazi tarama denemesi bitkilerinin yaprak toplam Fe konsantrasyonları Çizelge ve Şekil 4.18 de verilmiştir. Toplam Fe bakımından genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. En yüksek toplam Fe konsantrasyonu Sarawak bintangor ( mg/kg), Pomeroy üç yapraklı ( mg/kg) ve Kleopatra X Swingle sitrumelo (98.20 mg/kg) dan, en düşük ise Sunki 127

149 mandarini (39.10 mg/kg), Swingle sitrumelo (43.54 mg/kg) ve Gou Tou turuncundan (47.72 mg/kg) elde edilmiştir (Çizelge 4.12). Arazi ve iklim odasından elde edilen toplam Fe düzeyleri birbirinden farklılık göstermektedir. Arazide en yüksek toplam Fe miktarı Sarawak bintangor ( mg/kg), Pomeroy üç yapraklı ( mg/kg) ve K X S (98.20 mg/kg) dan elde edilmiş ancak iklim odasında bu genotiplerin toplam Fe miktarları sırasıyla 29.91, ve mg/kg olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.6. ve 4.12.). Skala ve SPAD değerlerine göre en sarı yapraklara sahip olarak belirlenen Pomeroy üç yapraklı ve Sarawak bintangor un toplam Fe miktarları, Fe paradoksu yaşadıklarının göstergesidir. Demir klorozuna tolerant olarak tanımlanan Tuzcu turuncu iklim odasında en yüksek toplam Fe (46.40 mg/kg) konsantrasyonunu sağlarken, arazi koşullarında mg/kg ile orta düzeyde yer almıştır (Çizelge 4.6. ve 4.12.). Ancak, iklim odasında toplam Fe bakımından düşüş yaşayan Tuzcu 891 (31.28 mg/kg) ve Gou Tou (26.98 mg/kg) turunçları arazi koşullarında ve mg/kg ile orta seviyede yer almışlardır (Çizelge 4.6. ve 4.12.). Arazi koşullarında oldukça yüksek toplam Fe konsantrasyonunu veren Kleopatra X Swingle sitrumelo melezi (98.20 mg/kg), iklim odasında mg/kg ile en düşük grup içerisinde yer almıştır. 128

150 Çizelge Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Genotip Toplam demir (mg/kg) Tuzcu turuncu bc (1) Tuzcu 891 turuncu Gou tou turuncu Volkameriana Sunki mandarini Antalya Kleopatra mandarini Nasnaran mandarini Swingle sitrumelo K X S Carrizo sitranjı Pomeroy üç yapraklı c c c c bc c c a bc a C-35 sitranjı b Marumi kamkat Sarawak bintangor Yerli üç yapraklı - Önemlilik (2) ** c a D (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): **: p<

151 Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (2). Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Arazi tarama denemesi bitkilerinin yaprak toplam Fe konsantrasyonları Çizelge ve Şekil 4.19 da verilmiştir. Aktif Fe bakımından genotipler arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. En yüksek aktif Fe konsantrasyonu Pomeroy üç yapraklı (30.68 mg/kg) Sarawak bintangor (45.74 mg/kg) ve Marumi kamkat (30.45 mg/kg); en düşük ise Swingle sitrumelo (8.94 mg/kg), Sunki mandarini (16.66 mg/kg) ve Tuzcu turuncundan (22.62 mg/kg) elde edilmiştir (Çizelge 4.13.). 130

152 İklim odası kontrol grubunda incelendiğinde aktif Fe açısından (47.02 mg/kg) ile en yüksek değeri veren Antalya Kleopatra mandarini arazi koşullarında mg/kg ile orta sıralarda yer almıştır. İklim odası kontrolde (45.77 mg/kg) değeri ile ikinci en yüksek değere sahip bulunan Sarawak bintangor arazi koşulunda da (45.74 mg/kg) değeri ile en yüksek aktif Fe değerini vermiştir (Çizelge 4.7. ve 4.13.). Ancak bu genotipin arazi koşullarında yüksek aktif Fe içeriğine sahip olarak bulunmasının nedeni muhtemelen bitkinin yüksek ph lı koşullarda büyüyemerek Fe i tüketmemesidir. Bilindiği üzere yaprakta Fe analizlerinde büyümesini tamamlamış en genç yapraklar kullanılmıştır. Bununla beraber Sarawak bintangor ve Marumi kamkatta arazi koşullarında yeni sürgün oluşturamaması ve bu nedenle daha yaşlı yapraklarda Fe analizi yapılması aktif Fe in diğer genotiplerden yüksek çıkmasına neden olmuştur. Çizelge Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Genotip Aktif demir (mg/kg) Tuzcu turuncu bc (1) Tuzcu 891 turuncu Gou tou turuncu Volkameriana Sunki mandarini Antalya Kleopatra mandarini Nasnaran mandarini Swingle sitrumelo K X S Carrizo sitranjı Pomeroy üç yapraklı b bc bc cd bc bc 8.94 d a bc b C-35 sitranjı bc Marumi kamkat Sarawak bintangor Yerli üç yapraklı - Önemlilik (2) ** b a D (0.01) 8.50 (1): Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): **: p<

153 Şekil Arazi Tarama Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) 132

154 Şekil Arazi denemesinde Tuzcu turuncu bitkisinin görünümü Şekil Arazi denemesinde Gou Tou turuncu bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde Tuzcu 891 turuncu bitkisinin görünümü. 133

155 Şekil Arazi denemesinde Bitangor sarawak bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde Nasnaran bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde Sunki mandarini bitkisinin görünümü. 134

156 Şekil Arazi denemesinde Antalya Kleopatra mandarini bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde Kleopatra mandarini X Swingle sitrumelo melezi bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde Swingle sitrumelo bitkisinin görünümü. 135

157 Şekil Arazi denemesinde Carrizo sitranjı bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde C-35 sitranjı bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde Pomeroy üç yapraklı bitkisinin görünümü. 136

158 Şekil Arazi denemesinde Yerli üç yapraklı bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde Volkameriana bitkisinin görünümü. Şekil Arazi denemesinde Marumi kamkat bitkisinin görünümü. 137

159 II. Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Demir Klorozuna Duyarlı ve Tolerant İki Genotipte Ölçülen Bazı Fizyolojik Parametreler Tez çalışmasının bu kısmında yüksek ph lı koşullarda Fe klorozuna tolerant olarak bilinen Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklı genotipleri kullanılarak turunçgillerde Fe klorozuna toleranslılığın fizyolojisi detaylı bir şekilde incelenmiştir Bitki Büyüme Oranları (1) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet) Ayrıntılı fizyoloji denemesinde Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin yaprak sayıları Çizelge ve Şekil te sunulmuştur. Denemede yer alan bitkilerin yaprak sayıları denemenin 0, 30 ve 60. günlerinde sayılmış ve ölçülen rakamlar sunulmuştur. Denemenin başlangıcında Tuzcu turuncunda yaprak sayısı adet ve Yerli üç yapraklıda ise olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.14.). Stresin 30. gününde Tuzcu turuncunun (-)Fe bitkileri adet ve kontrol bitkilerinde adet; Yerli Üç yapraklı ise sırasıyla adet ve adet yaprak tespit edilmiştir (Çizelge 4.14.). Stresin 60. gününde ise Tuzcu turuncunun (-)Fe bitkileri 58 adet ve kontrol bitkilerinde adet; Yerli Üç yapraklı ise sırasıyla ve adet olarak saptanmıştır (Çizelge 4.14.). Her iki genotipinde stresin 30. gününde Fe klorozuna yaprak sayısı bakımından çok tepki göstermedikleri ancak, 60. gününde yaprak sayısının Fe klorozundan etkilendiği anlaşılmaktadır. 138

160 Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayıları (adet) Genotip Uygulama Zaman (gün) Ortalama Tuzcu (-Fe) b c b turuncu Kontrol b c b Yerli yapraklı üç (-Fe) a b B a Kontrol a a A a Önemlilik (3) ** Ö.D. ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama=Ö. (3) Genotip X Zaman= Ö. (3) Genotip X Uygulama X Zaman=Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (*:p<0.05;**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Uygulama Zaman (gün) (-Fe) a Kontrol a Ortalama c b a Ortalama LSD%5 Zaman ortalamaları=8,75; LSD%5Uygulama ortalamaları=7.14; Zaman X Uygulama= Ö. (2) (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (p<0.05). 139

161 140 Yaprak Sayısı (adet/bitki) (-)Fe Kontrol Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Sayısı Artışları (adet) (2) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Boyları (cm) Ayrıntılı fizyoloji denemesinde Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin bitki boyları Çizelge ve Şekil da sunulmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin 0, 30 ve 60. günlerinde bitki boyları ölçülmüş ve ölçülen rakamlar Çizelge de verilmiştir. 0. gün bitkilerinde Tuzcu turuncunda bitki boyu cm olarak ölçülmüş, Yerli üç yapraklıda ise cm olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.15.). Stresin 30. gününde ise Tuzcu turuncunun kontrol bitkilerinde cm, (-)Fe uygulama bitkilerinde ise cm olarak belirlenirken; Yerli üç yapraklının kontrol bitkileri , (-)Fe uygulama bitkileri ise cm olarak tespit edilmişlerdir (Çizelge 4.15.). 140

162 Stresin 60. gününde Tuzcu turuncunun kontrol bitkilerinde boy cm, (-)Fe uygulama bitkilerinde ise cm olarak belirlenirken; Yerli üç yapraklının kontrol bitkileri cm, (-)Fe uygulama bitkileri ise cm olarak saptanmıştır (Çizelge 4.15.). Uygulama ortalamaları bakımından en uzun boylu bitkiler Yerli üç yapraklının kontrolünde belirlenmiş ve bunu sırasıyla Yerli üç yapraklı (-)Fe; Tuzcu turuncu kontrol ve Tuzcu turuncu (-)Fe bitkileri izlemiştir. Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Boyları (cm) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) b b b Kontrol b b ab (-Fe) a a a Kontrol a a a Önemlilik (2) ** ** ** Ö.D. Uygulama LSD Genotip X Uygulama=Ö.D. Genotip X Zaman= Ö.D. Genotip X Uygulama X Zaman=Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (**: p<0.01). Uygulama Zaman (gün) (-Fe) Kontrol Ortalama (2) c b a LSD %5 Zaman ortalamaları=9.48; Uygulama ortalamaları= Ö.D.; Zaman X Uygulama= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (p<0.05). Ortalama 141

163 160,00 140,00 120,00 (-)Fe Kontrol Bitki Boyu (cm/bitki) 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 0. Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Bitki Boyu Artışları (cm) (3) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Bitki Taze Ağırlıkları (g/bitki) Ayrıntılı fizyoloji denemesinde Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin bitki taze ağırlıkları Çizelge ve Şekil de sunulmuştur. Denemenin 0. gününde Tuzcu turuncunda bitki ağırlığı gram, Yerli üç yapraklıda ise gram olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.16.). Stresin 30. Gününde ise Tuzcu turuncu kontrol bitkileri gram ve (-)Fe bitkileri gram; Yerli üç yapraklıda ise sırasıyla gram ve gram olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.16.). 142

164 Stresin 60. Gününde Tuzcu turuncu kontrol bitkileri gram, (-)Fe bitkileri gram; Yerli üç yapraklıda ise sırasıyla ve gram olarak kaydedilmiştir (Çizelge 4.16.). Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Bitki Ağırlıkları (g/bitki) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) 45,24 50,59 61,27 52,36 Kontrol 45,24 52,29 78,53 58,68 (-Fe) 31,42 34,55 53,40 39,79 Kontrol 31,42 38,09 60,66 43,39 Önemlilik (3) Ö.D. Ö.D. Ö.D. Ö.D. Uygulama LSD Genotip X Uygulama=Ö (3). Genotip X Zaman= Ö.D. (3). Genotip X Uygulama X Zaman=Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (*:p<0.05;**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Uygulama Zaman (gün) Ortalama (-Fe) 38,33 42,57 57,34 46,08 Kontrol 38,33 45,19 69,60 51,04 Ortalama 38,33 b 43,88 b 63,47 a LSD%5 Zaman ortalamaları=7.99; LSD%5 Uygulama ortalamaları=ö.d.; Zaman X Uygulama= Ö. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (p<0.05). 143

165 (-)Fe Kontrol Bitki Ağırlığı (g/bitki) Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Bitki Ağırlığı Artışları (g/bitki) Ayrıntılı Fizyoloji Çalışması Bitkilerinin SPAD Değerleri (µmolm -2 ) Ayrıntılı fizyoloji denemesinde Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin SPAD değerleri Çizelge ve Şekil de sunulmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin 0, 30 ve 60. günlerinde yapraklarda SPAD ölçümleri yapılmış ve üç örnekleme zamanında yapılan bu ölçümlerde genotipler ve dönemler arasındaki fark istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Henüz Fe stresine başlanmadığı dönem olan 0. gün örneklemesinde Yerli üç yapraklı ve Tuzcu turuncu ise okuma değeri vermiş ve bu farklılık genotipler arasında istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (Çizelge 4.17.). 144

166 30. gün örneklemesinde ise en yüksek SPAD değeri Yerli üç yapraklı (63.23) ve Tuzcu turuncunun (56.38) kontrol bitkilerinde; en düşük ise ile Yerli üç yapraklının (-)Fe uygulamasından elde edilmiştir. Yerli üç yapraklının (-)Fe uygulama bitkileri büyük bir düşüş göstermiş ve bu genotipin kontrol ve uygulama örneklerindeki bu farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur, kontrol örneklemelerinde olan okuma değeri (-)Fe bitkilerinde olarak saptanmıştır. Bu dönemde Tuzcu turuncunda ise kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki farklılık istatistiksel olarak yine önemli çıkmış, ancak kontrol 56.38, (-)Fe uygulama bitkileri ise okuma değeri ile aralarındaki fark daha düşük bulunmuştur (Çizelge 4.17.). 60. gün örneklemelerine bakıldığında ise Yerli üç yapraklının (-)Fe bitkilerinde kloroz durumunun daha da şiddetlendiği görülmüştür. SPAD değeri en yüksek Tuzcu turuncunun kontrol (70.22) bitkilerinde belirlenmiş ve Yerli üç yapraklının kontrol bitkileri ile Tuzcu turuncunu izlemiştir. En düşük SPAD değeri ile Yerli üç yapraklının (-)Fe bitkilerinden elde edilmiştir. Her iki genotipte de kontrol ve (-)Fe bitkilerinin SPAD değerleri arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (Çizelge 4.17.). Zaman ortalamalarında da en düşük SPAD değeri Yerli üç yapraklı (34.00) ve Tuzcu turuncu (41.91) dan elde edilmiştir. Ayrıca varyans analizi sonucuna göre genotip X uygulama, genotip X zaman ve genotip X uygulama X zaman interaksiyonu önemli bulunmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin yüksek ph lı koşulların devamı halinde yapraklarda sararma şeklinde Fe klorozu gösterdikleri belirlenmiştir. Her iki genotipte Fe stresinin yaprak klorofil içeriğini azalttığı ve bunun yaprak rengine yansıdığı söylenebilir. Bununla birlikte SPAD değerlerine göre Yerli üç yapraklının stresten çok daha fazla etkilenerek kontrolün yarısı kadar bir SPAD değeri oluşturduğu görülmektedir. 145

167 Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin SPAD değerleri (µmolm -2 ) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) b (1) bb (2) bb 41,91 bb Kontrol b aa aa 57,26 aa (-Fe) a cb cb 34,00 bb Kontrol a aa aa 61,44 aa Önemlilik (3) ** ** ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama=Ö (3). Genotip X Zaman= Ö (3). Genotip X Uygulama X Zaman= Ö (3). (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (*:p<0.05;**: p<0.01). Uygulama Zaman (gün) (-Fe) b Kontrol a Ortalama (2) a (1) ab b Ortalama LSD%5 Zaman ortalamaları=3.49; LSD%5 Uygulama ortalamaları=2.85; Zaman X Uygulama= Ö (2). (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (p<0.05); Ö.D.: Önemli Değil. 146

168 (-) Fe Kontrol SPAD Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin SPAD değerleri (µmolm -2 ) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Demir Klorozu Skalası Değerleri Ayrıntılı fizyoloji denemesinde Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin Fe kloroz skalası değerleri Çizelge 4.18 ve Şekil da sunulmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin 0, 30 ve 60. günlerinde yapraklarda skala gözlemleri yapılmış ve stresin 30. ve 60. günlerinde yapılan bu gözlemlerde farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Denemenin 0. günü bütün uygulamalardaki bitkiler sağlıklı yeşil renge sahipken stresin ilerlediği 30. günde Yerli üç yapraklının (-)Fe bitkileri kloroz göstermeye başlamış diğer uygulamalardaki bitkiler ise sağlıklı yeşil renkli olarak gözlemlenmişlerdir. Yerli üç yapraklının kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki gözlem değeri istatistiksel olarak önemli bulunarak, farklı grupta yer almışlardır (Çizelge 4.18.). Stresin 60. gününde en klorotik yapraklar Yerli üç yapraklının (4.33) ve Tuzcu turuncu (2.67) (-)Fe bitkilerinde belirlenmiştir. Hem Tuzcu

169 turuncu hem de Yerli üç yapraklı kendi içlerinde kontrol ve uygulama gruplarında skala gözlem değeri bakımında istatistiksel olarak farklı gruplarda yeralmışlardır. Zaman ortalamalarında bakıldığında en şiddetli kloroz Yerli üç yapraklı (2.56) ve Tuzcu turuncunda (1.56) belirlenmiştir. Ayrıca varyans analizi sonucuna göre genotip X uygulama, genotip X zaman ve genotip X uygulama X zaman interaksiyonu önemli bulunmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin yüksek ph lı koşulların devamı halinde yapraklarda sararma şeklinde Fe klorozunu gösterdikleri belirlenmiştir Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Kloroz Skalası Değerleri Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) b (1) 2.67 ba (2) 1.56 ba Kontrol b 1.00 cb 1.00 cb (-Fe) a 4.33 aa 2.56 aa Kontrol b 1.00 cb 1.00 cb Önemlilik (3) Ö.D. * * * Uygulama LSD %5 Ö.D Genotip X Uygulama=Ö (3). Genotip X Zaman= Ö (3). Genotip X Uygulama X Zaman= Ö (3). (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (*:p<0.05;**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Skala değerleri; 1: Normal yeşil yapraklar, 2:Damarlar arası bölge sarımsı-yeşil, damarlar yeşil, 3: Damarlar arası bölge yeşilimsi-sarı, damarlar yeşil, 4: Damarlar arası bölge sarı, damarlar yeşil, 5: Damarlar arası bölge sarı-beyaz, damarlar soluk yeşil ve yaprak dökümleri var. Uygulama Zaman (gün) (-Fe) a Kontrol b Ortalama (2) 1.00 c (1) 1.33 b 2.25 a Ortalama LSD %5 Zaman ortalamaları=0.24; LSD %5 Uygulama ortalamaları=0.19; Zaman X Uygulama= Ö (2). (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (p<0.05). 148

170 Skala 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 (-) Fe Kontrol 0. Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Kloroz Skalası Değerleri Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (1) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Ayrıntılı fizyoloji denemesi Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin yaprak toplam Fe düzeyleri Çizelge ve Şekil da sunulmuştur. 0. gün örneklerinde Yerli üç yapraklı ve Tuzcu turuncu yapraklarının toplam Fe konsantrasyonları sırasıyla ve mg/kg olarak belirlenmiş ve istatistiksel olarak %1 düzeyinde önemli bulunmuştur (Çizelge 4.19.). Stresin 30. gününde Yerli üç yapraklı ve Tuzcu turuncunun (-)Fe ve kontrol bitkilerinde toplam Fe düzeyleri arasındaki farkılılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Her ikisinde de (-)Fe uygulamalarında Fe seviyesi düşmüştür. 149

171 Stresin 60. gününde uygulamaların toplam Fe konsantrasyonu istatistiksel olarak önemli bulunmuş ve en yüksek değer mg/kg ile Tuzcu turuncunun kontrol bitkisinde belirlenmiştir. En düşük toplam Fe konsantrasyonu ise Yerli üç yapraklının (-)Fe bitkilerinde (33.55 mg/kg) olarak saptanmıştır. Her iki genotipin (-)Fe ve kontrol grupları, kendi içlerinde, istatistiksel olarak farklı gruplarda yer almışlardır. Zaman ortalamasında ise uygulamalar arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuş ve en yüksek toplam Fe konsantrasyonu mg/kg ile Yerli üç yapraklının kontrol bitkilerinden, en düşük ise mg/kg ile Tuzcu turuncu (-)Fe bitkilerinden elde edilmiştir. Ortalamada Tuzcu turuncu (-)Fe ve kontrol bitkileri yaprak toplam Fe konsantrasyonları bakımından farklı grupta yer almıştır. Ancak kontrol bitkileri 59.18, (-)Fe bitkileri ise mg/kg olarak; Yerli üç yapraklıda ve mg/kg olarak belirlenmiştir. Ayrıca genotip X uygulama X zaman interaksiyonu önemli bulunmuştur. Yüksek ph lı koşulların devamı halinde bitkilerin iklim odasında toplam Fe konsantrasyonlarının azaldığı, kontrol bitkilerinde ise artışın meydana geldiği görülmüştür. 150

172 Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) b (1) c cb (2) 44,04 bb Kontrol b b aa 59,18 aa (-Fe) a c db 45,75 bb Kontrol a a ba 64,52 aa Önemlilik (3) ** ** ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama=Ö.D.;Genotip X Zaman= Ö.D.;Genotip X Uygulama X Zaman= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Uygulama Zaman (gün) Ortalama (-Fe) b (1) Kontrol a Ortalama Zaman ortalamaları=ö.d. ; LSD %5 Uygulama ortalamaları=5.68; Zaman X Uygulama= Ö (2). (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): (2):Ö.=Önemli (p<0.05); Ö.D.: Önemli Değil. 151

173 Toplam Demir Konsantrasyonu (mg/kg) (-) Fe Kontrol 0. Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Toplam Demir Konsantrasyonları (mg/kg) (2) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Ayrıntılı fizyoloji denemesinde Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin aktif Fe seviyeleri Çizelge ve Şekil de sunulmuştur. 0. gün örneklerinde Yerli üç yapraklı ve Tuzcu turuncu yapraklarının aktif Fe konsantrasyonları arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır. Yerli üç yapraklının 0. gününde aktif Fe içeriği mg/kg ve Tuzcu turuncunda ise mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.20.). Stresin 30. gününde ise Yerli üç yapraklı bitkileri kontrol ve uygulama bitkilerinin toplam Fe miktarı konsantrasyonları istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır. Ancak Tuzcu turuncunun kontrol ve (-)Fe bitkileri farklı grupta yer almışlardır (Çizelge 4.20.). Stresin 60. gününde uygulamalar arasındaki farklılılık %1 düzeyinde önemli bulunmuştur. En yüksek aktif Fe konsantrasyonu Tuzcu turunucunun kontrol (31.27 mg/kg) bitkilerinde belirlenmiş, bunu mg/kg ile Yerli üç yapraklının 152

174 kontrol bitkileri izlemiştir. En düşük konsantrasyon ise mg/kg ile Yerli üç yapraklının (-)Fe bitkilerinden elde edilmiştir. Her iki genotip kendi (-)Fe ve kontrollerinde farklı gruplarda yer almıştır. Uygulama ortalamasına bakıldığında farklılık istatistiksel olarak %1 seviyesinde önemli bulunmuştur. En yüksek değerler Tuzcu turuncu (28.07 mg/kg) ve Yerli üç yapraklı (27.32 mg/kg) kontrol bitkilerinden; en düşük ise mg/kg ile Yerli üç yapraklı (-)Fe bitkilerinden elde edilmiştir. Uygulama X zaman interaksiyonu önemli bulunmuş kontrol bitkilerinde zamana bağlı olarak aktif Fe konsantrasyonunda artış görünürken, (-)Fe bitkilerinde azalma saptanmıştır. Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) B (2) c (1) B bb Kontrol A aa aa (-Fe) db cb Kontrol ba aa Önemlilik (3) Ö.D. Ö.D. ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama=Ö.D;. Genotip X Zaman= Ö.D; Genotip X Uygulama X Zaman= Ö.D (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Uygulama Zaman (gün) (-Fe) b Kontrol a Ortalama Zamanlar=Ö.D. ; LSD %5 Uygulamalar=2.60; Zaman X Uygulama= Ö (2). (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (p<0.05); Ö.D.: Önemli Değil. Ortalama 153

175 Aktif Demir Konsantrasyonu (mg/kg) (-) Fe Kontrol 0. Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Yaprak Aktif Demir Konsantrasyonları (mg/kg) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Stres Enzimi Aktiviteleri (1) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Katalaz Enzim Aktiviteleri (µmol/dak/mg TA) Ayrıntılı fizyoloji denemesinde Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin katalaz aktiviteleri Çizelge 4.21 de sunulmuştur. Demir eksikliği stresinin 30. günü baz alınarak ölçümler yapılmıştır. Uygulamalar arasındaki farklılık önemli bulunmamıştır. Ancak, katalaz aktivitesi kontrol gruplarında daha yüksek saptanmıştır. Daha önceden yapılan çalışmalarda da katalaz aktivitesi kontrol yapraklarında Fe klorozu gösteren yapraklara oranla daha yüksek bulunmuştur (Daşgan ve ark., (2003)., Chouliaras ve ark., (2004 b)., Tewari ve ark. (2005), Ksouri ve ark. (2006), Molassiotis ve ark. (2006). 154

176 Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Katalaz Enzim Aktiviteleri (µmol/dak/mg TA) Genotip (-) Fe Kontrol Ortalama Yerli üç yapraklı Tuzcu turuncu Ortalama Genotip X Uygulama=Önemli Değil (2) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Askorbat Peroksidaz Enzim Aktiviteleri (µmol/dak/mg TA) Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin askorbat peroksidaz aktiviteleri Çizelge 4.22 de sunulmuştur. Demir stresinin 30. günü baz alınarak ölçümler yapılmıştır. Uygulamalar arasındaki farklılık önemli bulunmamıştır. Ancak, askorbat peroksidaz aktivitesi kontrol gruplarında daha yüksek saptanmıştır. Zaharieva ve ark., (2004); Tewari ve ark., (2005) tarafından yapılan çalışmalarda da askorbat peroksidaz aktivitesi kontrol yapraklarında Fe klorozu gösteren yapraklara oranla daha yüksek bulunmuştur. Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Askorbat Peroksidaz Enzim Aktiviteleri (µmol/dak/mg TA) Genotip (-) Fe Kontrol Ortalama Yerli üç yapraklı Tuzcu turuncu Ortalama b (1) a LSD %5 Uygulama=596.44;Genotip X Uygulama=Ö.D;. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. Ö.D.: Önemli Değil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Fotosentez Etkinlikleri (µmolm -2 s -1 ) Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin fotosentez etkinlikleri Çizelge ve Şekil de sunulmuştur. 155

177 Denemenin 0. gününde Tuzcu turuncunda fotosentez etkinliği 3.14 µmolm -2 s -1, Yerli üç yapraklıda ise 3.79 µmolm -2 s -1 belirlenmiş, ancak istatistiksel olarak farklılık önemli bulunmamıştır (Çizelge 4.23.). Stresin 30. gününde ise fotosentez hızları bakımından farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır. Ancak en yüksek fotosentez hızı Yerli üç yapraklı (3.56 µmolm -2 s -1 ) ve Tuzcu turuncunun (3.13 µmolm -2 s -1 ) kontrol bitkilerinde belirlenmiştir. En düşük fotosentetik hız ise Yerli üç yapraklının (-)Fe bitkilerinde (2.05 µmolm -2 s -1 ) saptanmıştır (Çizelge 4.23.). Stresin 60. gününde ise fotosentez hızı istatistiksel olarak önemli bulunmuş, en yüksek 4.61 µmolm -2 s -1 ve en düşük 0.99 µmolm -2 s -1 olmak üzere Yerli üç yapraklının kontrol ve (-)Fe bitkilerinden elde edilmiştir (Çizelge 4.23.). Uygulama ortalamalarında ise en yüksek fotosentez hızı Yerli üç yapraklının ve Tuzcu turuncunun kontrol bitkilerinde sırasıyla 3.99 ve 3.12 µmolm -2 s -1 olarak belirlenmiş ve istatistiksel olarak %1 düzeyinde önemli bulunmuştur. Fotosentez hızı bakımından genotip x uygulama, genotip x zaman ve uygulama x zaman x genotip arasındaki interaksiyon önemli bulunmuştur. Yüksek ph lı ortamlarda Fe sıkıntısı çeken Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının fotosentez hızı düşüş göstermiştir. Ancak bu düşüş Fe klorozuna duyarlı Yerli üç yapraklıda çok daha şiddetli yaşanmıştır. Yapılmış olan bir çok araştırmada da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Demir noksanlığı çeken yapraklarda fotosentez etkinliğinin azaldığı saptanmıştır (Morales ve ark. (1994), Abadia ve ark. (1999), Bertamini ve ark. (2001), Larbi ve ark., (2006), Nenova (2009),). Chouliaras ve ark. (2004d), dört farklı ph koşulunda turunç ve swingle sitrumelo üzerine aşılı Valencia portakalında net fotosentezin ph nın artışıyla birlikte azaldığını, ayrıca turunç üzerine aşılı olanlarda bu hızın Swingle sitrumelo üstüne aşılılardan daha yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Turunç üzerine aşılılarda ph nın 6 olduğu kontrol bitkilerinin fotosentez hızı 3.32 µmolm -2 s -1, ph nın 7.8 de olduğu ortamda 2.01 µmolm -2 s -1, ve ph nın 8.2 olduğu ortamda ise 1.58 µmolm -2 s -1 olarak ölçüldüğünü ifade etmişlerdir. 156

178 Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Fotosentez Etkinlikleri (µmolm -2 s -1 ) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Turunç (-Fe) c (1) B (2) 2.56 bc Yerli yapraklı üç Kontrol b A 3.12 b (-Fe) B 0.99 d 2.27 c B Kontrol A 4.61 a 3.99 a A Önemlilik (3) Ö.D. Ö.D. ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama=Ö (2).;. Genotip X Zaman= Ö.D Genotip X Uygulama X Zaman= Ö (2) (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. Uygulama Zaman (gün) (-Fe) a (1) Kontrol b Ortalama 3.47 a 2.81 b 2.68 b Ortalama LSD %5 Zaman ortalamaları=0.43 ; LSD %5 Uygulama ortalamaları=0.35; Zaman X Uygulama= Ö (2). (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (p<0.05); Ö.D.: Önemli Değil. 157

179 Fotosentez Hızı (µmol m-2 s-1) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 (-) Fe Kontrol 0. Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Fotosentez Etkinlikleri (µmolm - 2 s -1 ) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Karbonhidrat Analizleri (1). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Şeker İçeriği (%) Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin toplam şeker miktarları Çizelge ve Şekil de sunulmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin 0, 30 ve 60. günlerinde toplam şeker analizleri yapılmıştır. 0 ve 30. gün örneklemelerinde uygulamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemli bulunmazken, 60. gün %1 seviyesinde önemli bulunmuştur (Çizelge 4.24.). Denemenin 0. gününde Yerli üç yapraklı bitkilerine ait yapraklarda toplam şeker miktarı yapılan analizlerde %1.64, Tuzcu turuncunda ise %1.55 olarak belirlenmiştir. 30. günde ise Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının kontrol ve (-)Fe bitkilerinde toplam şeker miktarının az miktarda azaldığı görülmekte, ancak bu azalışın (-)Fe bitkilerinde daha fazla olduğu göze çarpmaktadır. Tuzcu turuncunda 30. gün kontrol bitkileri %1.34, (-)Fe bitkilerinde ise %1.13; Yerli üç 158

180 yapraklının kontrol bitkilerinde %1.28 ve (-)Fe uygulamasında ise %1.00 olduğu görülmektedir (Çizelge 4.24.). Denemenin 60. gününde ise uygulamalar arasındaki farklılık önemli bulunmuş, en yüksek toplam şeker miktarı Yerli üç yapraklının (-)Fe uygulama (%1.33) bitkilerinden elde edilmiştir. Bu genotipin kontrol bitkilerinde ise %0.53 değeri belirlenmiş ve yapılan t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Yerli üç yapraklı Fe stresi koşullarında büyümek için toplam şekeri kullandığından, depo formuna dönüştürmemiştir. Benzer şekilde fasulyede yapılan bir çalışmada floemdeki şeker miktarı (-)Fe bitkilerinde kontrolden yaklaşık 2 kat fazla bulunmuştur (Zocchi, 2007). Tuzcu turuncunda ise kontrol ve (-)Fe uygulama bitkileri birbirlerine yakın değerler vermiş ve sırasıyla %0.84 ve %0.76 olarak bulunmuşlardır. Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Şeker Miktarı (%) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Turunç (-Fe) b (1) 1.15 Yerli yapraklı üç Kontrol b 1.24 (-Fe) a A (2) 1.32 Kontrol c B 1.15 Önemlilik (3) Ö.D. Ö.D. ** Ö.D. Uygulama LSD Genotip X Uygulama= Ö.D.; Genotip X Zaman= Ö.D.; Genotip X Uygulama X Zaman= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Uygulama Zaman (gün) (-Fe) Kontrol Ortalama (2) 1.59 a (1) 1.19 b 0.87 c Ortalama LSD%5 Zaman ortalamaları=0.24 ; Uygulama ortalamaları=ö.d.; Zaman X Uygulama= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.= Önemli (*: p<0.05); Ö.D.: Önemli Değil. 159

181 Toplam Şeker İçeriği (%) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 (-) Fe Kontrol 0. Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Şeker İçeriği(%) (2). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Nişasta İçeriği (%) Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin nişasta miktarları Çizelge ve Şekil de sunulmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin 0, 30 ve 60. günlerinde % nişasta miktarı belirlenmiş ve 0, 30, 60. gün ve ortalamalarındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (Çizelge 4.25.). 0. gün örneklemesinde % nişasta miktarı Yerli üç yapraklıda 6.01 ve Tuzcu turuncunda 4.33 olarak tespit edilmiştir. 30. gün örneklemesinde ise en yüksek nişasta miktarı Tuzcu turuncunun (-)Fe (%5.87) ve kontrol (%5.54) bitkilerinde belirlenmiş, bunu Yerli üç yapraklı kontrol (%4.25) ve (-)Fe bitkileri (%3.68) izlemiştir (Çizelge 4.25.). 60. gün örneklemesinde en yüksek nişasta içeriğine sahip olarak Tuzcu turuncu kontrol (%6.59) ve (-)Fe (%6.07) uygulamalarının sahip olduğu belirlenmiştir. En düşük % nişasta birikimi ise %3.17 ile Yerli üç yapraklı (-)Fe uygulamasından elde edilmiş, bunu kontrol grubu %4.51 ile izlemiştir. Ayrıca 160

182 yapılan t testinde 60. gün Yerli üç yapraklı kontrol ve (-)Fe uygulamaları farklı grupta yer almışlardır. Uygulama ortalamasında ise yüzde nişasta bakımından farklılık görülmemiş, ancak Tuzcu kontrol ve (-)Fe deki miktar %5.49 ve %5.42; Yerli üç yapraklıda ise %4.92 ve %4.29 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.25.). Turunç Fe stresi koşullarına adapte olarak nişasta içeriğini değiştirmememiş buna karşın, Yerli üç yapraklı Fe eksikliği durumunda nişasta içeriğini azaltmıştır. Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Nişasta İçeriği (%) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Turunç (-Fe) 4.33 b (1) 5.87 a 6.07 a 5.42 a Yerli yapraklı üç Kontrol 4.33 b 5.54 a 6.59 a 5.49 a (-Fe) 6.01 a 3.68 b 3.17 c B (2) 4.29 b Kontrol 6.01 a 4.25 b 4.51 b A 4.92 ab Önemlilik * * ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama= Ö.D.;. Genotip X Zaman= Ö.D Genotip X Uygulama X Zaman= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Student s t test farklıkları ayrı harflerle gösterilmiştir. (3):Ö.=Önemli (*:p<0.05;**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Uygulama Zaman (gün) (-Fe) Kontrol Ortalama Zaman=Ö.D. ; Uygulama=Ö.D.; Zaman X Uygulama= Ö.D. Ö.D.: Önemli Değil. Ortalama 161

183 7 6 (-) Fe Kontrol Nişasta İçeriği (%) Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Nişasta İçeriği (%) (3). Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Karbonhidrat Miktarı (%) Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin toplam karbonhidrat miktarları Çizelge ve Şekil de sunulmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin 0, 30 ve 60. günlerinde toplam karbonhidrat miktarı (%) belirlenmiştir. 0 ve 30. günlerde yapılan bu analizlerle uygulamalar ve dönemler arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmazken, 60. gün örneklemesinin önemli olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.26.). 0. gün örneklemesinde Yerli üç yapraklının toplam karbonhidrat miktarı %7.11, Tuzcu turuncunun ise %5.87 olduğu saptanmıştır. 30. gün örneklemesinde ise Tuzcu turuncunun toplam karbonhidrat miktarı hem kontrol (%6.89) ve hemde (-) Fe (%6.99) örneklerinde Yerli üç yapraklının kontrol (%4.26) ve (-)Fe uygulama (%4.35) örneklerinden yüksek bulunmuştur (Çizelge 4.25.). 162

184 Stresin son günü olan 60. günde toplam karbonhidrat miktarı istatistiksel olarak önemli çıkmıştır. En yüksek toplam karbonhidrat miktarı sırasıyla Tuzcu kontrol (%7.62), Tuzcu (-)Fe (%6.69), Yerli üç yapraklı kontrol (%4.87) ve Yerli üç yapraklı (-)Fe (%3.92) den elde edilmiştir. Ayrıca Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı kontrol ve uygulamaları toplam karbonhidrat birikimi açısından farklı gruplarda yer almışlardır (Çizelge 4.25.). Uygulama ortalamasında ise istatistiksel olarak önemli bulunan nişasta miktarı, Tuzcu turuncunun kontrol bitkilerinde %6.73 ve (-)Fe bitkilerinde %6.52 olarak; Yerli üç yapraklıda ise %5.41 ve %5.12 olarak belirlenmiştir. Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Karbonhidrat Miktarı (%) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) b (1) 6.52 a Kontrol a 6.73 a (-Fe) d 5.12 b Kontrol c 5.41 b Önemlilik (2) Ö.D. Ö.D. ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama= Ö.D.;. Genotip X Zaman= Ö (2). Genotip X Uygulama X Zaman= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (*:p<0.05;**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Uygulama Zaman (gün) (-Fe) Kontrol Ortalama Zaman ortalamaları=ö.d. ; Uygulama ortalamaları=ö.d.; Zaman X Uygulama= Ö.D. (1): Ö.D.: Önemli Değil. Ortalama 163

185 Toplam Karbonhidrat İçeriği (%) (-) Fe Kontrol 0. Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Toplam Karbonhidrat Miktarı (%) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Azot (N) Konsantrasyonu (%) Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin azot seviyeleri Çizelge ve Şekil da sunulmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin 0, 30 ve 60. günlerinde % azot düzeyi belirlenmiş ve 3 örnekleme zamanında yapılan analizlerde genotiplerdeki kontrol ve (-)Fe arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. 0. günde Yerli üç yapraklının azot konsantrasyonu %3.03, Tuzcu turuncunda ise %1.90 olarak saptanmıştır (Çizelge 4.27.). 30. günde ise Tuzcu turuncu kontrol ve (-)Fe uygulamaları sırasıyla %2.22 ve %2.43; Yerli üç yapraklının kontrol ve (-)Fe bitkileri ise %3.40 ve %3.36 değerlerini göstermiştir. 60. günde ise azot konsantrasyonu Tuzcu turuncu kontrol ve (-)Fe uygulamalarında sırasıyla %2.89 ve %2.71; Yerli üç yapraklının kontrol ve (-)Fe bitkilerinde ise %3.57 ve %3.17 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.27.). 164

186 Uygulama ortalamalarında azot konsantrasyonu istatistiksel olarak %1 düzeyinde önemli bulunmuş ve en yüksek Yerli üç yapraklı kontrol (3.30) daha sonra Yerli üç yapraklı (-)Fe (3.19); Tuzcu turuncu (-)Fe (2.35) ve Tuzcu turuncu kontrol (2.33) de saptanmıştır. Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Azot Konsantrasyonu(%) Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) 1.90 b (1) 2.43 b 2.71 c 2.35 b Kontrol 1.90 b 2.22 c 2.89 c 2.33 b (-Fe) 3.03 a 3.36 a 3.17 b 3.19 a Kontrol 3.03 a 3.40 a 3.57 a 3.30 a Önemlilik (2) ** ** ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama= Ö.D.;. Genotip X Zaman= Ö.; Genotip X Uygulama X Zaman= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil Uygulama Zaman (gün) (-Fe) Kontrol Ortalama (2) 2.46 b (1) 2.85 a 3.06 a LSD %5 Zaman ortalamaları=0.23 ; Uygulama ortalamaları=ö.d.; Zaman X Uygulama= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): Ö.= (*: p<0.05); Ö.D.: Önemli Değil. Ortalama 165

187 Azot Konsantrasyonu (%) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 (-) Fe Kontrol 0 0. Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Azot Konsantrasyonu(%) Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Karbon / Azot Oranı (C/N) Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin karbon/azot oranları Çizelge ve Şekil de sunulmuştur. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı bitkilerinin 0, 30 ve 60. günlerinde karbon/azot oranı belirlenmiş ve her uygulama döneminde istatistiksel olarak önemli bulunmuşlardır. 0. günde Tuzcu turuncunda karbon/azot oranı Yerli üç yapraklıda ise 2.37 olarak saptanmıştır (Çizelge 4.28.). 30. günde ise Tuzcu turuncu kontrol ve (-)Fe uygulamaları sırasıyla 3.14 ve 2.88; Yerli üç yapraklının kontrol ve (-) Fe bitkileri ise 1.27 ve 1.29 olarak tespit edilmişlerdir. 60. günde de karbon/azot oranı bakımından uygulamalar arasında istatistiksel olarak önemli bulunmuş. 30. gündekiyle paralel şekilde Tuzcu turuncunda daha yüksek bulunmuştur. Tuzcu turuncu kontrol ve (-)Fe uygulamalarında 166

188 sırasıyla 2.63 ve 2.49; Yerli üç yapraklının kontrol ve (-)Fe bitkilerinde ise 1.37 ve 1.25 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.28.). Uygulama ortalamalarında ise alınan sonuçlara paralel olarak Tuzcu turuncunda karbon/azot oranı. Yerli üç yapraklıdan her iki uygulamada da daha yüksek bulunmuştur. Çizelge Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Karbon/Azot Oranları Zaman (gün) Genotip Uygulama Ortalama Tuzcu turuncu Yerli yapraklı üç (-Fe) 3.21 a (1) 2.88 a 2.49 a 2.86 a Kontrol 3.21 a 3.14 a 2.63 a 2.99 a (-Fe) 2.37 b 1.29 b 1.25 b 1.64 b Kontrol 2.37 b 1.27 b 1.37 b 1.67 b Önemlilik (2) * ** ** ** Uygulama LSD Genotip X Uygulama= Ö.D.; Genotip X Zaman= Ö.D.; Genotip X Uygulama X Zaman= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2):Ö.=Önemli (*:p<0.05;**: p<0.01); Ö.D.: Önemli Değil. Uygulama Zaman (gün) (-Fe) Kontrol Ortalama(2) 2.79 a (1) 2.15 ab 1.93 b Ortalama LSD%5Zaman ortalamaları=0.70 ; Uygulama ortalamaları=ö.d.; Zaman X Uygulama= Ö.D. (1):Ortalamalar arasındaki farklar ayrı harflerle gösterilmiştir. (2): (*: p<0.05); Ö.D.: Önemli Değil. 167

189 3,5 3 (-) Fe Kontrol 2,5 C/N Oranı 2 1,5 1 0, Gün 30. Gün 60. Gün Şekil Ayrıntılı Fizyoloji Denemesi Bitkilerinin Karbon/Azot Oranları 168

190 Şekil Ayrıntılı fizyoloji denemesinin 0. gününe ait görüntüler 169

191 Şekil Ayrıntılı fizyoloji denemesinin 30. Gününe ait görüntüler 170

192 Şekil Ayrıntılı fizyoloji denemesinin 60. Gününe ait görüntüler 171

193 4.4. İncelenen Parametrelerin Arasındaki İlişki Durumları Çalışmada incelenen parametrelerin arasındaki korelasyon varlığı %1 ve %5 seviyesinde araştırılmış ve ilişkinin 0.60 ın üzerinde bulunduğu parametreler aşağıda sunulmuştur İklim Odası Tarama Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumu İklim odasında yüksek ph lı koşullarda Fe klorozuna karşı tepkileri incelenen 16 turunçgil genotipinin SPAD, skala, yaprak sayısı, bitki boyu, bitki taze ağırlığı, toplam Fe ve aktif Fe konsantrasyonları arasındaki ilişkileri Çizelge 4.29 da verilmiştir. Gelişmesini tamamlamış en genç yapraklarda gerçekleştirilmiş olan SPAD ölçümü değeri skala değeri ile negatif bir korelasyon göstermiştir. Yani SPAD değeri arttıkça skala değeri düşüş göstermiş ve bu ilişki önemli bulunmuştur. Skala 1 gözlem değerinde yeşil rengi temsil ederken 5 değerinde ise aşırı klorozu temsil etmesi nedeniyle bu ilişki negatif olarak görünmektedir. Bu negatif ilişki SPAD değerinin yükseldikçe yapılan gözlemde yaprağın yeşil renginde görünmesini ifade etmektedir. SPAD değeri, yapraktaki aktif ve toplam Fe konsantrasyonu ile pozitif bir korelasyon göstermiştir. Yaprakların içerdikleri toplam Fe konsantrasyonu ise SPAD ve aktif Fe konsantrasyonu ile pozitif, skala ile negatif korelasyon göstermiştir. Bundan yola çıkarak iklim odasında toplam ve aktif Fe konsantrasyonları arasında paralel bir artış ve azalma görüldüğü söylenebilir. Ayrıca yaprağın yeşil rengi arttıkça bitkilerdeki toplam Fe konsantrasyonuda artış göstermiştir. Yaprakların içerdikleri aktif Fe konsantrasyonu, SPAD ve toplam Fe konsantrasyonu ile pozitif korelasyon göstermiştir. 172

194 Çizelge İklim Odası Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumlarından Oluşan Korelasyon Tablosu Y.S. B.B. B.A. SPAD Skala T.D. A.D. Y.S Önemlilik - ** ** ** ** Ö.D. ** B.B Önemlilik - ** ** ** Ö.D. (1) * B.A Önemlilik - ** ** ** * SPAD Önemlilik - ** ** ** Skala Önemlilik - ** ** T.D Önemlilik - ** A.D Önemlilik - Y.S.:yaprak sayısı; B.B.: bitki boyu; B.A.: bitki ağırlığı; T.D.: toplam demir konsantrasyonu; A.D.: aktif demir konsantrasyonu. *: p<0.05. **: p<0.01. (1): Ö.D Arazi Tarama Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumu Arazi koşullarında yüksek ph lı toprakta Fe klorozuna karşı tepkileri incelenen 15 turunçgil genotipinin SPAD, skala, yaprak sayısı, bitki boyu, bitki taze ağırlığı, toplam Fe ve aktif Fe konsantrasyonları arasındaki ilişkileri Çizelge 4.30 da verilmiştir. Skala ve SPAD değerleriyle negatif, aktif Fe konsantrasyonu ile toplam Fe konsantrasyonları arasında pozitif korelasyon saptanmıştır. 173

195 Çizelge Arazi Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumlarından Oluşan Korelasyon Tablosu Y.S. B.B. SPAD Skala T.D. A.D. Y.S Önemlilik - ** ** ** ** ** B.B Önemlilik - ** Ö.D. (1) ** ** SPAD Önemlilik - ** ** * Skala Önemlilik - ** * T.D Önemlilik - ** A.D Önemlilik - Y.S.:yaprak sayısı; B.B.: bitki boyu; B.A.: bitki ağırlığı; T.D.: toplam demir konsantrasyonu; A.D.: aktif demir konsantrasyonu. *: p<0.05. **: p<0.01. (1): Ö.D Fizyoloji Denemesinde İncelenen Parametreler Arasındaki İlişki Durumu Gün Denemesine Ait Değerlendirmeler Demir eksikliği stresinin başlatıldığı gün yapılan ölçümlerin birbiriyle ilişkileri incelenmiş ve Çizelge 4.31 de verilmiştir. Bitki boyu, bitki taze ağırlığı, SPAD, toplam Fe ve azot konsantrasyonları ile pozitif; karbon/azot oranı ile negatif korelasyon göstermiştir. Bitki taze ağırlığı ise SPAD, toplam Fe konsantrasyonu, nişasta miktarı ve azot miktarıyla pozitif ilişki halinde bulunmuştur. SPAD ile azot ve toplam Fe konsantrasyonları arasında pozitif bir ilişki saptanmıştır. Toplam Fe konsantrasyonu ile nişasta ve azot konsantrasyonu arasında; aktif Fe konsantrasyonu ile sadece toplam şeker miktarı arasında pozitif ilişkili bulunmuştur. Toplam şeker miktarı ile karbon/azot oranı arasında ise negatif ilişki görülmüştür. Nişasta miktarı ile toplam karbonhidrat miktarı arasında pozitif korelasyon saptanmıştır. Yaprak azot konsantrasyonu ile karbon/azot oranı arasında ise negatif ilişkili bulunmuşlardır. 174

196 175

197 Gün Denemesine Ait Değerlendirmeler Demir klorozu stresi başlatıldıktan 30 gün sonra yapılan ölçümlerin birbiriyle ilişkileri incelenmiş ve Çizelge 4.32 de verilmiştir. Yaprak sayısı ile bitki boyu, bitki taze ağırlığı ve azot konsantrasyonu arasında pozitif; toplam karbonhidrat ve karbon/azot oranı arasında ise negatif ilişki saptanmıştır. Bitki boyu ile toplam Fe konsantrasyonu, askorbat peroksidaz ve azot konsantrasyonu arasında pozitif; toplam karbonhidrat ve karbon/azot oranı arasında negatif korelasyon tespit edilmiştir. Bitki ağırlığı ile azot konsantrasyonu arasında pozitif; nişasta miktarı, toplam karbonhidrat miktarı ve karbon/azot oranı arasında ise negatif ilişki saptanmıştır. SPAD ile aktif ve toplam Fe konsantrasyonları ve askorbat peroksidaz arasında pozitif, skala ile negatif ilişki saptanmıştır. Skala ile aktif Fe konsantrasyonu arasında negatif bir ilişki tespit edilmiştir. Toplam Fe konsantrasyonu ile aktif Fe konsantrasyonu ve askorbat peroksidaz arasında pozitif ilişki görülmüştür. Nişasta miktarı ise toplam karbonhidrat miktarı ve karbonhidrat/azot oranı ile pozitif, azot konsantrasyonu ile negatif ilişkili bulunmuştur. Toplam karbonhidrat miktarının azot konsantrasyonu ile negatif, karbon/azot oranıyla pozitif bir korelasyona sahip olduğu saptanmıştır. Azot miktarıyla, karbon/azot oranı arasında negatif ilişki belirlenmiştir. 176

198 177

199 Gün Denemesine Ait Değerlendirmeler Demir klorozu stresi başlatıldıktan 60 gün sonra yapılan ölçümlerin birbiriyle ilişkileri incelenmiş ve Çizelge 4.33 te verilmiştir. Yaprak sayısında bitki boyu, bitki taze ağırlığı, fotosentez hızı ve azot konsantrasyonu arasında pozitif korelasyon göstermiştir. Bitki boyu, bitki taze ağırlığı ve azot konsantrasyonu ile pozitif; toplam karbonhidrat miktarı ve karbon/azot oranıyla negatif ilişkili bulunmuştur. Bitki taze ağırlığıyla azot konsantrasyonu pozitif; toplam karbonhidrat ve karbon/azot oranıyla negatif ilişki halindedir. SPAD ile aktif ve toplam Fe konsantrasyonu, fotosentez hızı arasında pozitif; skala ve toplam şeker ile negatif bir ilişki saptanmıştır. Skala ile toplam ve aktif Fe konsantrasyonu. fotosentez hızı, nişasta arasında negatif ; toplam şeker miktarı ile pozitif ilişki görülmüştür. Toplam Fe konsantrasyonu, aktif Fe konsantrasyonu ve fotosentez hızı ile korelasyonu pozitif saptanmıştır. Aktif Fe konsantrasyonu ise fotosentez hızı ile pozitif; toplam şeker ile negatif korelasyon göstermiştir. Fotosentez hızı ile toplam şeker arasında negatif ilişki saptanmıştır. Nişasta miktarı ise toplam karbonhidrat miktarı ve karbon/azot oranı ile pozitif ilişkili bulunmuştur. Toplam karbonhidrat miktarının karbonhidrat/azot oranı ile pozitif korelasyon gösterdiği saptanmıştır. Azot konsantrasyonu ve karbonhidrat/azot oranının negatif bir ilişki içinde olduğu görülmüştür. 178

200 179

201 4.5. Tarama Çalışmalarında Kullanılan Genotiplerin Genel Değerlendirilmesi Demir klorozuna karşı en iyi çözüm yolu uygun anaç kullanımıdır. Ancak, Fe klorozuna tolerant olarak belirlenen anaçların genellikle abiyotik ya da biyotik stres faktörlerine karşı duyarlı oldukları bilinmektedir. Örneğin armutta anaç olarak kullanılan Pyrus communis çöğürlerinin Fe klorozuna tolerant, ancak verim ve kaliteyi olumsuz yönde etkilediği bilinmektedir (Rambola ve Tagliavini. 2007). Bugüne kadar yapılan çalışmalarda turunç (Citrus aurantium) Fe klorozuna orta tolerant; portakal (Citrus sinensis) duyarlı (Treeby ve Uren, 1993;Geraci, 1994); Filistin tatlı laymı (Citrus limettioides) orta tolerant (Geraci, 1994); Rangpur laymı (Citrus limonia) tolerant (Treeby ve Uren, 1993; Manthey ve ark., 1994); Alemow (Citrus macrophylla) (Manthey ve ark., 1994) ve kaba limon (Citrus jambhiri) oldukça tolerant (Treeby ve Uren, 1993; Manthey ve ark., 1994); Volkameriana (Citrus volkameriana) tolerant (Geraci, 1994); Kleopatra mandarin (Citrus reshni) biraz duyarlı (Treeby ve Uren, 1993;Geraci, 1994); Yerli üç yapraklı (Poncirus trifoliata) oldukça duyarlı (Korcak 1987; Geraci 1994; Manthey ve ark., 1994); Troyer sitranjı (P. trifoliata X C. sinensis) biraz duyarlı (Korcak 1987; Treeby ve Uren, 1993;Manthey ve ark., 1994); Carrizo sitranjı (P. trifoliata X C. sinensis) duyarlı (Korcak 1987; Treeby ve Uren, 1993; Geraci, 1994;Manthey ve ark., 1994) ve Swingle sitrumelo (P. trifoliata X C. paradisi) oldukça duyarlı (Geraci, 1994;Manthey ve ark., 1994) olarak bulunmuşlardır (Rambola ve Tagliavini, 2007). Tuzcu turuncu:tuzcu turuncu iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %25.24 lük kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (- )Fe bitkileri farklı gruplarda yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet yaprak diğer genotipler içerisinde son sıralarda yer alırken; arazi koşullarında 1080 adet ile en fazla yaprak sayısına sahip olanlardan biri olarak bulunmuştur (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine Tuzcu turuncunun kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %33.47 lik kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklı grupta yer almıştır. Arazi koşullarında ise

202 cm ile diğer genotipler içinde en uzun boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemli bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde Tuzcu turuncu kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuştur ve t testinde farklı gruplarda yer almış, % kayıp ise %21.46 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Demir kloroz skalası açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 1.05; arazi denemesinde ise 2.00 olarak gözlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Uygulamalar arasındaki kayıp %15.40 tır. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemsiz bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki kayıp %11.08 dir. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Bugüne kadar yapılan bir çok tarama çalışmasında turunç Fe klorozuna orta tolerant olarak belirlenmiştir (Hamze ve ark., 1986; Treeby ve Uren, 1993;Geraci, 1994). Bu çalışmada Tuzcu turuncu iklim odasında Fe klorozu durumunda gelişimini neredeyse durdurmuştur. Bitki ağırlığında %49.01, yaprak sayısında %25.24 ve bitki boyunda ise %33.47 lik kayıp bitkinin Fe klorozunda gelişimini durdurduğunun kanıtı olarak düşünülebilir. Çünkü toplam ve aktif Fe açısından sırasıyla %15.40 ve %11.08 lik olmak üzere büyük kayıplar yaşamadıkları görülmektedir. Ayrıca SPAD ve skala açısından (-)Fe ve kontrol bitkilerinin birbirine 181

203 yakın değerler verdiği saptanmıştır. Arazi denemesinde ise bitki topraktaki yüksek ph ya rağmen diğer genotiplerle kıyaslandığında iyi bir gelişme performansı sergilemiştir. İklim odası ve arazi denemelerinde aynı genotip kullanılmış, ancak bitki yaşının farklı olması Fe klorozuna karşı tepkisinin farklılık yaratmasına neden olmuştur. Turunçlar genel olarak kazık kök eğilimindedirler. İklim odası denemesinde bitkiler henüz 1 yaşlı olduklarından yeterli saçak kök oluşturamadıkları için yüksek ph dan gelişimleri etkilenmiş olabilir. Ancak arazi denemesinde kök kesimi yapıldıktan sonra dikim gerçekleştirilmiş ve 4 yaşında ölçümler yapılmıştır. Demir klorozunda sadece genetik değil bitki yaşı, yetiştiricilik yapılan ortam gibi çevre faktörleride önemli olduğundan genotipin tepkisi farklılık göstermiş olabilir. Castle ve ark. (2009) su kültürü ve toprak kültürü olmak üzere iki farklı koşulda turunç çöğürlerinin Fe klorozuna karşı tepkilerini inceledikleri çalışmalarında su kültüründe bitki gelişimini orta, toprak kültüründe ise çok iyi olarak bulduklarını belirtmişlerdir. Bu çalışmada yapılan tartılı derecelendirmede Tuzcu turuncu iklim odasında orta tolerant, arazide ise çok tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Elde edilen sonuç Castle ve ark. (2009) sonuçlarıyla benzerdir. Tuzcu 891 turuncu:tuzcu 891 turuncu iklim odasında yaprak sayısı bakımından (- )Fe bitkilerine göre %2.98 lik kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprakla diğer genotipler içerisinde son sıralarda yer alırken; arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında orta sırada yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-) Fe bitkileri cm ile %7.16 lık kayıp yaşamış ve iki uygulama arasında yapılan t testinde farklılık görülmemiştir. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde orta boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine 182

204 göre önemli bulunmamıştır. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % olarak saptanmıştır (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %5.78 olarak saptanmış ve t testinde aynı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 1.20; arazi denemesinde ise 2.50 olarak gözlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-) Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %38.67 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %32.60 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Tuzcu 891 turuncunun iklim odasında büyüme parametrelerinin Fe klorozundan çok etkilenmediği görülmektedir. Bitki ağırlığında % yaprak sayısında %2.98 ve bitki boyunda %7.16 lık kayıp yaşanmıştır. SPAD değerlerinin (- )Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu farkın %5.78 olarak belirlenmesi sebebiyle yaprakların kloroz durumunu yansıtmadıkları görülmektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %38.67 ve %27.80 olarak belirlenen kayıp oranı bitkinin Tuzcu turuncundan farklı şekilde davrandığını göstermektedir. Tuzcu 891 turuncu yapraklarındaki Fe i büyümek için kullandığını düşündürmektedir. Yapılan tartılı derecelendirmede Tuzcu 891 turuncu iklim odasında çok tolerant, arazide ise orta tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). 183

205 Gou Tou Turuncu:Gou Tou turuncu iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %2.02 lik kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. (-)Fe uygulamasında en fazla yaprak sayısına sahip olanlardan biri olarak tespit edilmiştir. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında orta sırada yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-) Fe bitkileri cm/bitki ile %0.51 lık kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık görülmemiştir. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde orta boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemli bulunmamıştır. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı %11.62 olarak saptanmıştır (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %18.20 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 1.06 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 1.50 değeri ile en yeşil yapraklılardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %43.08 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları 184

206 arasındaki kayıp ise %45.26 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Gou Tou turuncunun iklim odasında büyüme parametrelerinin Fe klorozundan çok etkilenmedikleri görülmektedir. Bitki ağırlığında %11.62, yaprak sayısında %2.02 ve bitki boyunda %0.51 lık kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (- )Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu farkın %18.20 olarak belirlenmesi, ancak kloroz skala değerinin (-)Fe bitkisinde 1.06 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunu yansıtmadıkları anlaşılmaktadır. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %43.08 ve %45.26 olarak belirlenen kayıp oranı bitkinin Tuzcu 891 turuncuyla benzer şekilde davrandığını göstermektedir. Gou Tou turuncu yapraklarındaki Fe i büyümek için kullanmıştır. Yapılan tartılı derecelendirmede Gou Tou turuncu iklim odasında ve arazide çok tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Volkameriana:Volkameriana iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %15.09 luk kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında orta sırada yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %31.63 lük kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık bulunmuştur. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde orta boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemli bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % dir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan ölçümlerde kontrolde ve (-)Fe de değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %37.70 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). 185

207 Kloroz skalası açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 2.40 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 2.00 değeri belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %44.91 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %48.67 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Volkameriana bitki ağırlığında % yaprak sayısında %15.09 ve bitki boyunda %31.63 lük kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %37.70 olarak, skala değerinin (-)Fe bitkisinde 2.40 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunu yansıttıkları anlaşılmaktadır. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %44.91 ve %48.67 olarak belirlenen kayıp oranı Volkameriana nın iklim odasında Fe klorozundan şiddetli şekilde etkilendiğini göstermektedir. Yapraklarda toplam ve aktif Fe konsantrasyonunun (-)Fe bitkilerinde düşük bulunması, ayrıca büyüme parametrelerinin de klorozdan etkilendiklerini belirtmektedir. Ancak arazi koşullarında gerek gelişme durumu gerekse içerdiği Fe konsantrasyonları bakımından iyi durumda olduğu görülmüştür. Yapılan tartılı derecelendirmede Volkameriana iklim odasında duyarlı, arazide ise tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Hamze ve ark. (1986), kireçli topraklarda Volkamerina çöğürlerinin performansını orta olarak belirlemişlerdir. Chouliaras ve ark. (2004a), su kültüründe sıcaklık kontrollü serada yürüttükleri çalışmalarında Volkamerianın Fe klorozuna tolerans göstermediğini bildirmişlerdir. Castle ve ark. (2009), sıcaklık kontrollü sera koşullarında, su ve toprak kültüründe yaptığı çalışmada her iki ortamda Volkameriana çöğürlerinin performansını çok iyi olarak tespit etmişlerdir. Bu 186

208 çalışmadan elde edilen sonuçlar Chouliaras ve ark. (2004a) nın elde ettiği sonuçlarla benzerdir. Sunki Mandarini:Sunki mandarini iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %9.13 lük kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında orta sırada yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyu itibariyle iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (- )Fe bitkileri cm ile %6.24 lük kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık bulunmamıştır. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde orta boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemli bulunmamıştır. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı %9.90 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %21.73 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Kloroz skalası açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 2.00 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 1.50 ile değeri en yeşil renge sahip genotiplerden biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %29.05 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar 187

209 arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %56.34 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Sunki mandarini bitki ağırlığında %9.90. yaprak sayısında %9.13 ve bitki boyunda %6.24 lük kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %21.73 olarak belirlenmiştir. Skala değerinin (-)Fe bitkisinde 2.00 olarak gözlenmesi yaprakların kloroz durumunu çok fazla yansıtmadığını göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %29.05 ve %56.34 kayıp oranı belirlenmiştir. İklim odasında Sunki mandarininin büyüme parametrelerinde iyi bir performans gösterdiği saptanmıştır. Özellikle aktif Fe de meydana gelen kayıp bitkinin yüksek ph lı koşullarda büyümek için çabada bulunduğunu işaret etmektedir. Arazi koşullarında büyüme durumu ve yapraklarının içerdiği Fe konsantrasyonu göz önünde bulundurulduğunda performansının iyi olduğu söylenebilir. Arazi koşullarında yaprakların ihtiva ettiği aktif Fe oranına bakıldığında bitkinin gelişme için bunu kullandığı sonucuna ulaşılabilir. Yapılan tartılı derecelendirmede Sunki mandarini iklim odasında ve arazide çok tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Sunki mandarininin kireçli topraklara adaptasyonunun iyi ve Fe klorozuna tolerant olduğu bildirilmiş (Louzada ve ark ) ve bu çalışmada da benzer sonuç elde edilmiştir. Antalya Kleopatra Mandarini:Antalya Kleopatra mandarini iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %6.06 lık kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında en üst sırada yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %21.51 lik kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık görülmüştür. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde orta boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine 188

210 göre önemli bulunmamıştır. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı %7.71 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %19.38 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri, en yeşil yapraklılardan biri olarak saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 1.80 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 1.86 ile değeri en yeşil renge sahip genotiplerden biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %30.57 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %29.54 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Antalya Kleopatra mandarini bitki ağırlığında %7.71. yaprak sayısında %6.06 ve bitki boyunda %21.51 lik kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %19.38 olarak, skala değerinin (-)Fe bitkisinde 1.86 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunu çok fazla yansıtmadığı anlaşılmaktadır. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %30.57 ve %29.54 kayıp oranı belirlenmiştir. Bütün bu değerler göz önünde bulundurulduğunda iklim odasında Antalya Kleopatra mandarininin büyüme parametrelerinde Fe klorozundan çok fazla etkilenmediği, hatta yapraklarının klorozu fazla yansıtmadığı saptanmıştır. Ancak toplam ve aktif Fe deki kayıplar tıpkı Sunki mandarinindeki gibi bitkinin büyüme için harcadığını göstermektedir. 189

211 Benzer şekilde arazi koşullarında bitki büyüme parametreleri, yaprak rengi ve Fe konsantrasyonları açısından iyi bir performans göstermiştir. Yapılan tartılı derecelendirmede Antalya Kleopatra mandarini iklim odasında ve arazide ise çok tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Castle ve ark. (2009), sıcaklık kontrollü sera koşullarında, su ve toprak kültüründe yaptığı çalışmada; su kültüründe orta tolerant; toprak kültüründe ise çok iyi olarak tanımlamışlardır. Ferguson ve ark. (1990) ve Treeby ve Uren (1993) Kleopatra mandarinini Fe klorozuna tolerant olarak belirlemişlerdir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar yukardaki araştırıcıların elde ettikleri bulgularla benzerdir. Nasnaran Mandarini:Nasnaran mandarini iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %31.73 lük kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (- )Fe bitkileri farklı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında üst sıralarda yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesinde kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %36.02 lik kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık görülmüştür. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde kısa boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş. uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemli bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkilerinde ve (-)Fe bitkilerinde değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %12.12 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 1.70 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 1.71 ile değeri en yeşil renge sahip genotiplerden biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). 190

212 Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde sırasıyla mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %25.35 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %31.59 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Nasnaran mandarini bitki ağırlığında %47.18, yaprak sayısında %31.73 ve bitki boyunda %36.02 lik kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark (%12.12) ile skala değerinin (-)Fe bitkisinde 1.71 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunu çok fazla yansıtmadığını göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %25.35 ve %31.59 kayıp oranı belirlenmiştir. Arazi koşullarında büyüme performansı, yaprak klorozu ve Fe konsantrasyonları bakımından iyi bir performans göstermiş ancak iklim odası koşullarında bu durum görülmemiştir. Nasnaran mandarini iklim odasında özellikle ağırlık bakımından ciddi kayıplar yaşamıştır. Fakat yapılan tartılı derecelendirmede iklim odasında ve arazide Fe klorozuna toleranslılıkta diğer genotiplerin içinde orta tolerant olarak belirlenmişlerdir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Swingle sitrumelo (4475 SRA Sitrumelo):Swingle sitrumelo iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %25.96 lık kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri farklı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında orta sıralarda yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesinde kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %42.66 lık kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde 191

213 farklı gruplarda yer almışlardır. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde uzun boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemli bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı %35.41 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %45.17 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri en klorotik yapraklara sahip genotip olarak saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 3.20 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 4.66 ile değeri en sarı renge sahip genotiplerden biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %29.41 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %50.10 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu 8.94 mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Swingle sitrumelo bitki ağırlığında % yaprak sayısında %25.96 ve bitki boyunda %42.66 lık kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %45.17 olarak. skala değerinin (-)Fe bitkisinde 3.20 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunu yansıttıklarını göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %29.41 ve %50.10 kayıp oranı belirlenmiştir. İklim odası koşullarında büyüme performansı, yaşadığı Fe kayıpları ve kloroz durumuna göre bitkinin Fe klorozuna duyarlı olduğu sonucuna ulaşılmıştır. 192

214 Arazi koşullarında büyüme performansının orta düzeyde ancak yaprak klorozunun çok şiddetli görüldüğü anlaşılmaktadır. Yapraklarda toplam Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiş, ancak yaprakların kloroz durumu düşünüldüğünde Swingle sitrumelonun Fe paradoksu yaşadığı saptanmıştır. Yapılan tartılı derecelendirmede iklim odası ve arazi çalışmalarında duyarlı olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Hamze ve ark. (1986); Pestana ve ark. (2005) Fe klorozuna karşı çok duyarlı olarak belirlemişledir. Castle ve ark. (2009), toprak kültüründe Swingle sitrumelonun büyüme performansını orta, ancak klorozun göründüğünü, ayrıca su kültüründe büyüme performansının düşük ve yaprak klorozunu orta şiddette olduğunu gözlemişlerdir. Bu çalışmada elde edilen bulgular belirtilen tüm verilerle benzerdir. Kleopatra Mandarini X Swingle Sitrumelo Melezi:Kleopatra mandarini X Swingle sitrumelo melezi iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %10.17 lik kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri ortalama adet ve (-)Fe bitkileri adet yaprağa sahip olmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında orta sıralarda yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-) Fe bitkileri cm ile %18.85 lik kayıp yaşamış ve iki uygulama için yapılan t testinde farklılık görülmüştür. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde uzun boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemsiz bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı %10.32 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %31.20 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). 193

215 Skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 1.83 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 2.85 ile değeri hafif kloroz gösteren genotiplerden biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu. iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %43.11 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %28.46 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Kleopatra mandarini X Swingle sitrumelo melezi bitki ağırlığında %10.32, yaprak sayısında %10.17 ve bitki boyunda %18.85 lik kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu farkın %31.20 olarak, skala değerinin (-)Fe bitkisinde 1.83 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunu yansıtmadıkları göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %43.11 ve %28.46 kayıp oranı belirlenmiştir. İklim odası koşullarında büyüme performansı, yaşadığı Fe kayıpları ve kloroz durumuna göre bitkinin Fe klorozuna orta tolerant olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Ayrıca yapılan tartılı derecelendirmede iklim odası ve arazi çalışmalarında tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Arazi koşullarında büyüme performansı, yaprak kloroz durumu ve Fe konsantrasyonu orta düzeyde bir toleranslılığın olduğunu göstermektedir. Carrizo Sitranjı:Carrizo sitranjı iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %18.77 lik kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında orta sıralarda yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). 194

216 Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %8.79 luk kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık görülmemiştir. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde uzun boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş. uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemsiz bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı %12.09 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkilerinde ve (-)Fe bitkilerinde değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %24.08 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri ile en yeşil yapraklara sahip olarak saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Kloroz skalası açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 2.00 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 1.80 ile değeri yeşil yapraklı genotiplerden biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %51.38 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %57.90 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Carrizo sitranjı bitki ağırlığında % yaprak sayısında %18.77 ve bitki boyunda %8.79 luk kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %24.08, skala değerinin (-)Fe bitkisinde 2.00 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunu çok yansıtmadıklarını göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %51.38 ve %22.58 kayıp oranı belirlenmiştir. İklim 195

217 odası ve arazi koşullarında büyüme performansı, yaşadığı Fe kayıpları ve kloroz durumuna göre genotipin Fe klorozuna toleranslılığının orta gibi görünmekte ancak yapılan tartılı derecelendirmede iklim odası denemesine tolerant ve arazi çalışmasında ise çok tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Carrizo sitranjının Fe klorozuna olan tepkisini Hamze ve ark. (1986) orta; Treeby ve Uren (1993) düşük olarak saptamışlardır. Castle ve ark. (2009) ise su kültüründe orta tolerant, toprak kültüründe ise bitki gelişiminin iyi ve yaprak klorozunu hafif gösterdiğini belirtmişlerdir. Carrizo sitranjının yüksek ph lı topraklarda Fe klorozu problemi yaşadığı bilinmektedir ancak yapılan bazı çalışmalarda da arazi denemelerinde bitkilerin genç dönemde Fe klorozunu çok fazla yansıtmadıkları ancak ilerleyen dönemlerde kloroz gösterdiği bilinmektedir. Pomeroy Üç Yapraklı:Pomeroy üç yapraklı. iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %18.20 lik kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri farklı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler içerisinde alt sıralarda yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %15.18 lik kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık görülmüştür. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde kısa boylu olanlardan biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemsiz bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı %18.20 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %63.59 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri ile en klorotik yapraklara sahip olan genotiplerden biri olarak saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). 196

218 Skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 4.00 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 4.31 ile değeri en klorotik yapraklı genotiplerden biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %54.51 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve 9.43 mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %50.11 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Pomeroy üç yapraklısı bitki ağırlığında %18.20, yaprak sayısında %18.20 ve bitki boyunda %15.18 lik kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %63.59 olarak, skala değerinin (-)Fe bitkisinde 4.00 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunun şiddetli olduğunu göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %54.51 ve %50.11 kayıp oranı belirlenmiştir. İklim odasında bitkinin büyüme performansında çok büyük değişiklik görünmemiş, ancak toplam ve aktif Fe konsantrasyonları açısından büyük kayıplar yaşamıştır. Bitkinin kloroz durumu da göz önünde bulundurulduğunda iklim odasında Fe klorozuna duyarlı olarak göründüğü sonucuna ulaşılabilir. Arazi koşullarında yapraklarının içerdiği toplam Fe miktarı mg/kg ve kloroz durumu 4.31 olarak belirlenmiştir. Bu değerler Pomeroy üç yapraklısının arazi koşullarında Fe paradoksu yaşadığını göstermektedir. Ayrıca yaprak kloroz durumu da bitkinin Fe klorozuna duyarlılığını göstermektedir. Yapılan tartılı dercelendirmede de iklim odası ve arazi koşullarında duyarlı olarak tespit edilmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Hamze ve ark. (1986) Poncirus trifoliata nın Fe klorozuna çok hassas olduğunu bildirmişlerdir. 197

219 C-35 Sitranjı:C-35 sitranjı. iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %11.34 lük kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında orta sıralarda yer almıştır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesinde kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %3.07 lik kayıp yaşamış ve iki uygulama için yapılan t testinde farklılık görülmemiştir. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde en uzun boylu genotip olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemsiz bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %37.00 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri ile klorotik yapraklara sahip olan genotiplerden biri olarak saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Kloroz skalası açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 2.20 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 3.00 ile değeri yapraklarının orta düzeyde klorotik olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %37.55 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları 198

220 arasındaki kayıp ise %38.79 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). C-35 sitranjı bitki ağırlığında %13.81, yaprak sayısında %11.34 ve bitki boyunda %3.07 lik kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %37.00 olarak, skala değerinin (-)Fe bitkisinde 2.20 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunun hafif düzeyde olduğunu göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %65.92 ve %23.84 kayıp oranı belirlenmiştir. Bütün değerler göz önünde bulundurulduğunda C-35 sitranjı iklim odasında orta tolerant olarak görülmektedir. Arazi koşullarında ise büyüme performansının iyi olması ve yaprak kloroz skalasının 3.00 olarak belirlenmesi orta düzeyde bir toleransa sahip olduğunu düşündürmektedir. Tartılı derecelendirmede C-35 sitranjı iklim odasında tolerant, arazide ise orta tolerant olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Castle ve ark.(2009) da su kültüründe C-35 sitranjını düşük toleranslı olarak belirlemişlerdir. Marumi Kamkat:Marumi kamkat. iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %15.67 lik kayba uğramış. yapılan t testinde ise kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkilerinin adet/bitki ve (-)Fe bitkilerinin adet/bitki yaprağa sahip olduğu bulunmuştur. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında en az yaprak sayısına sahip olmuştur (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyu açısından iklim odası denemesinde kontrol bitkileri cm ve (- )Fe bitkileri cm ile %31.25 lik kayıp yaşamış ve iki uygulamada yapılan t testinde farklılık göstermiştir. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde en kısa boylu genotip olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise 7.05 g/bitki olarak tespit edilmiş ve uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %25.06 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise değeri saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). 199

221 Skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 3.00 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 2.00 değeri ile yapraklarının hafif klorotik olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %30.29 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemsiz bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %8.61 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Marumi kamkat bitki ağırlığında % yaprak sayısında %15.67 ve bitki boyunda %31.25 lik kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %25.06 olarak, skala değerinin (-)Fe bitkisinde 3.00 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunun orta düzeyde olduğunu göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %30.29 ve %8.61 kayıp oranı belirlenmiştir. Bütün değerler göz önünde bulundurulduğunda Marumi kamkatın iklim odası denemesinde toleranslılığının orta olduğu görülmektedir. Ancak arazi koşullarında cm boyu ile iklim odasındaki kontrol bitkilerinden (36.95 cm) daha kısa olması bitkinin muhtemelen yüksek ph lı koşullarda çok iyi gelişemediğinin göstergesidir. Arazi koşullarında yaprak skalası 2.00 değeri ile çok az bir sararmanın olduğu şeklindedir. Castle ve ark. (2009), Marumi kamkatın yüksek ph lı su kültüründe gelişmesinin kötü, ancak bu durumda dahi yapraklarında kloroz durumunun çok hafif olduğunu saptamışlardır. Bu çalışmayla elde edilen sonuçla benzer görünmektedir. Tartılı derecelendirmede iklim odasında ve arazi koşullarında tolerant olarak sınıflanmıştır (Çizelge ve Çizelge 4.35.). 200

222 Sarawak bintangor:sarawak bintangor, iklim odasında yaprak sayısı bakımından (- )Fe bitkilerine göre %18.77 lik kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (- )Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır. Arazi koşullarında adet/bitki ile diğer genotipler arasında düşük yaprak sayısına sahip olarak bulunmuştur (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyu bakımından iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %30.19 luk kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık göstermiştir. Arazi koşullarında ise cm ile diğer genotipler içinde kısa boylu genotiplerden biri olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığı açısından ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (- )Fe bitkileri ise 9.37 g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemsiz bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %46.95 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır. Arazi denemesinde ise 5.00 değeri ile şiddetli klorozu temsil eden yapraklar saptanmıştır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Kloroz skalası açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 2.66 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise 5.00 değeri ile yapraklarının şiddetli klorotik olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %57.28 olarak belirlenmiştir. Arazi denemesinde ise mg/kg değeri elde edilmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları 201

223 arasındaki kayıp ise %67.82 olarak saptanmıştır. Arazi denemesinde ise aktif Fe konsantrasyonu mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Sarawak bintangor bitki ağırlığında % yaprak sayısında %20.47 ve bitki boyunda %30.19 luk kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %46.95, skala değerinin (-) Fe bitkisinde 2.66 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunun orta düzeyde olduğunu göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %57.28 ve %67.81 kayıp oranı belirlenmiştir. Bütün değerler göz önünde bulundurulduğunda Sarawak bintangor iklim odasında tolerans seviyesinin düşük olduğu görülmektedir. Arazi koşullarında ise skala 5.00 ile değeri en klorotik yapraklara sahip olmuş, toplam Fe konsantrasyonu bakımından ise mg/kg değeriyle en yüksek bulunan genotip olmuştur. Sarawak bintangor Fe paradoksunu en şiddetli şekilde yaşayan genotip olarak belirlenmiştir. Ayrıca bitki büyüme performansı düşük olmuştur. Mandarin ve turunç melezi olan bintangor iklim odasında arazi koşullarına kıyasla çok daha iyi performans göstermiş ve tartılı derecelendirmede iklim odasında duyarlı, arazi koşullarında ise az duyarlı olarak sınıflanmıştır (Çizelge ve Çizelge 4.35.). Duncan Altıntopu:Duncan altıntopu, iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %7.40 lık kayba uğramış ve yapılan t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri aynı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olarak bulunmuşlardır (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %20.12 lik kayıp yaşamış yapılan t testinde farklılık görülmemiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). Bitki ağırlığı bakımından ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise g/bitki ağırlığa sahip olmuş. uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemsiz bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). 202

224 SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkilerinde ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %19.78 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). İklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 2.57 skala değerine sahip olmuşlardır (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %38.84 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %11.72 olarak saptanmıştır (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Duncan altıntopu bitki ağırlığında % yaprak sayısında %7.40 ve bitki boyunda %20.12 lik kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %19.78 olarak, skala değerinin (-)Fe bitkisinde 2.57 olarak belirlenmesi yaprakların kloroz durumunun orta düzeyde olduğunu göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %38.84 ve %11.72 kayıp oranı belirlenmiştir. Bütün değerler göz önünde bulundurulduğunda Duncan altıntopunun iklim odasındaki tolerans seviyesinin orta olduğu görülmektedir. Yapılan tartılı derecelendirmede ise çok tolerant olarak sınıflanmıştır (Çizelge 4.34.). Yerli Üç Yapraklı:Yerli üç yapraklı, iklim odasında yaprak sayısı bakımından (-)Fe bitkilerine göre %33.52 lik kayba uğramış ve t testinde kontrol ve (-)Fe bitkileri farklı grupta yer almışlardır. İklim odasında kontrol bitkileri adet/bitki ve (-)Fe bitkileri adet/bitki yaprağa sahip olmuşlardır. Arazi koşullarında bitkiler yüksek ph lı toprakta gelişim gösterememeleri ve taze yaprak oluşturamamaları nedeniyle değerlendirilememişlerdir (Çizelge 4.1. ve Çizelge 4.8.). Bitki boyunda iklim odası denemesine kontrol bitkileri cm ve (-)Fe bitkileri cm ile %37.00 lik kayıp yaşamış ve iki uygulama yapılan t testinde farklılık saptanmıştır (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.9.). 203

225 Bitki ağırlığında ise iklim odasında kontrol bitkileri g/bitki ve (-)Fe bitkileri ise 6.32 g/bitki olarak tespit edilmiş, uygulamalar arasındaki fark t testine göre önemli bulunmuştur. Uygulamalar arasındaki ağırlık kaybı farkı % olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3.). SPAD metre ile yapılan yaprak rengi ölçümlerinde kontrol bitkileri ve (-)Fe bitkileri değerleri okunmuş; bu değerler arasındaki kayıp %81.53 olarak saptanmış ve t testinde farklı grupta yer almışlardır (Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.10.). Yerli üç yapraklı skala açısından iklim odasında kontrol ve (-)Fe bitkileri sırasıyla 1.00 ve 5.00 değerlerine sahip olmuş ve bu parametre bakımından en büyük farkı gösteren genotip olmuştur (Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.11.). Toplam Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-) Fe bitkilerinde mg/kg ve mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar t testinde farklı gruplarda yer almışlardır. Kontrol ve (-)Fe bitkileri arasındaki kayıp ise %77.67 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.6. ve Çizelge 4.12.). Aktif Fe konsantrasyonu iklim odası tarama denemesinde kontrol ve (-)Fe bitkilerinde mg/kg ve 3.68 mg/kg olarak belirlenmiş ve uygulamalar arasındaki farklılık t testinde önemli bulunmuştur. Kontrol ve (-)Fe uygulamaları arasındaki kayıp ise %83.02 olarak saptanmıştır (Çizelge 4.7. ve Çizelge 4.13.). Yerli üç yapraklı bitki ağırlığında % yaprak sayısında %33.52 ve bitki boyunda %37.00 lik kayıp yaşamıştır. SPAD değerlerinin (-)Fe ve kontrol bitkilerinde oluşturduğu fark %81.53 olarak. skala değerinin (-)Fe bitkisinde 5.00 olarak belirlenmesi yapraklardaki klorozun çok şiddetli düzeyde olduğunu göstermektedir. Toplam ve aktif Fe de sırasıyla %77.67 ve %83.01 kayıp oranı belirlenmiştir. Bütün değerler göz önünde bulundurulduğunda Yerli üç yapraklı iklim odasında tolerans seviyesinin en düşük olduğu genotip olarak belirlenmiştir. Hamze ve ark. (1986) Poncirus trifoliata nın Fe klorozuna çok duyarlı olduğunu bildirmişlerdir. Tartılı derecelendirmede iklim odası ve arazi denemelerinin her ikisinde de çok duyarlı olarak belirlenmiştir (Çizelge ve Çizelge 4.35.). 204

226 4.6. Tartılı Derecelendirme Sonuçları İklim Odası Tartılı Derecelendirme Sonuçları Tartılı derecelendirme iklim odası tarama denemesi sonuçlarına göre Tuzcu 891 turuncu, Gou Tou turuncu, Antalya Kleopatra mandarini ve Duncan altıntopu çok tolerant; Tuzcu turuncu, Sunki mandarini, Nasnaran mandarini, K X S, Carrizo sitranjı, C-35 sitranjı ve Marumi kamkat tolerant; Volkameriana, Swingle sitrumelo, Pomeroy üç yapraklı ve Sarawak bintangor duyarlı; Yerli üç yapraklı ise çok duyarlı olarak sınıflanmışlardır (Çizelge 4.34.). 205

227 Çizelge İklim Odası Denemesi Tartılı Derecelendirme Sonuçları Y.S. B.B. B.A. SPAD Skala T.D. A.D. Toplam Sınıflandırma Tuzcu turuncu Tuzcu turuncu Gou tou turuncu Volkameriana Sunki mandarini Antalya Kleopatra mandarini Nasnaran + + mandarini Swingle - sitrumelo K X S Carrizo sitranjı Pomeroy üç - yapraklı C-35 sitranjı Marumi + + kamkat Sarawak - bintangor Duncan altıntopu Yerli üç - - yapraklı % Etki derecesi 0.15 (1) Y.S.: yaprak sayısı % farkı; B.B.: bitki boyu % farkı; B.A.: bitki ağırlığı yüzde farkı; T.D.: toplam demir % farkı; A.D.: aktif demir % farkı; (1): tartılı derecelendirmede kullanılan katsayılar belirlenen karakterlerin oranlarının 100 rakamına bölünmesiyle bulunmuştur. --: çok duyarlı; -: duyarlı; +: orta tolerant; ++; tolerant; +++; çok tolerant Arazi Denemesi Tartılı Derecelendirme Sonuçları Tartılı derecelendirme arazi tarama denemesi sonuçlarına göre Tuzcu turuncu, Gou Tou turuncu, Sunki mandarini, Antalya Kleopatra mandarini ve Carrizo sitranjı çok tolerant; Tuzcu 891 turuncu, Volkameriana, Nasnaran mandarini ve Marumi kamkat tolerant; K X S ve C-35 sitranjı orta tolerant; Swingle sitrumelo ve Pomeroy üç yapraklı duyarlı, Sarawak bintangor az duyarlı ve Yerli üç yapraklı çok duyarlı olarak sınıflanmışlardır (Çizelge 4.35.). 206

228 Çizelge Arazi Denemesi Tartılı Derecelendirme Sonuçları SPAD Skala T.D. A.D. TOPLAM Sınıflandırma Tuzcu turuncu Tuzcu turuncu Gou tou turuncu Volkameriana Sunki mandarini Antalya Kleopatra mandarini Nasnaran + + mandarini Swingle - - sitrumelo K X S Carrizo sitranjı Pomeroy üç - - yapraklı C-35 sitranjı Marumi + + kamkat Sarawak bintangor Yerli üç yapraklı % Etki derecesi 0.40 (1) T.D.: toplam demir ; A.D.: aktif demir; (1): tartılı derecelendirmede kullanılan katsayılar belirlenen karakterlerin oranlarının 100 rakamına bölünmesiyle bulunmuştur. ---: çok duyarlı; --: duyarlı;-: az duyarlı; +: orta tolerant; ++; tolerant; +++; çok tolerant 4.7. İklim Odası Denemesinden Elde Edilen Tartılı Derecelendirme Sonuçlarının Arazi Denemesinde Ölçülen Parametrelerle İlişkisi İklim odası tartılı derecelendirmesi ile araziden elde edilen SPAD, skala, aktif ve toplam Fe konsantrasyonları arasındaki ilişki incelenmiş ve Şekil de sunulmuştur. İklim odasında yürütülen deneme kontrollü koşullar altında gerçekleştirildiğinden genotiplerin çevre ile olan interaksiyonları minumuma indirilmiş, genotiplerin kendi performansları ortaya konmuştur. İklim odasında tartılı 207

229 derecelendirme sınıflandırmasının arazide ölçülen parametrelerle ilişkisi incelenerek, Fe klorozuyla ilgili daha net yanıtı verebilen parametreler belirlenmeye çalışılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre iklim odası tartılı derecelendirme puanlarıyla arazi aktif ve toplam Fe konsantrasyonları arasındaki ilişki zayıf; SPAD ve skala ile olan ilişki ise kuvvetli bulunmuştur. Bu çerçevede arazi koşullarında yapılacak Fe klorozu denemelerinde SPAD ve skala parametrelerinin Fe klorozunun teşhisinde güvenilir şekilde kullanılabileceği belirlenmiştir. Benzer şekilde, Byrne ve ark. (1995) da turunçgilde arazi koşullarında yaptıkları çalışmalarında Fe klorozunu sadece SPAD ve skala parametreleriyle belirlemişlerdir. Şekil İklim Odası Denemesinden Elde Edilen Tartılı Derecelendirme Sonuçlarının Arazi Denemesinde Ölçülen Parametrelerle İlişkisi 208

230 4.8. BİYOTEKNOLOJİK ÇALIŞMALAR Mikroarray Çalışması Global Gen Ekpresyonu Kullanılan çipler 6875 putative (varsayılan) gene karşılık gelen cdna içermektedir. Bu çalışmada yapılan normalizasyondan sonra Tuzcu turuncu (SO) ve Poncirus trifoliata dan (PT) elde edilen indüklenmiş ve baskılanmış gen sayıları aşağıdaki çizelgelerde sunulmuştur İndüklenmiş Baskılanmış PT 1. gün SO 1. gün PT 5. gün SO 5. gün Şekil İndüklenmiş ve baskılanmış gen sayıları Yapılan mikroarray çalışmasında Fe stresinin 1. gününde Yerli üç yapraklıda 25 gen indüklenirken 30 gen baskılanmıştır. Bu sayı Tuzcu turuncunda sırasıyla 112 ve 57 olarak bulunmuştur. Stresin 5. gününde ise Yerli üç yapraklıda 679 gen ve Tuzcu turuncunda 120 gen indüklenirken, baskılanan gen sayısı Yerli üç yapraklıda 500 ve Tuzcu turuncunda ise 88 olarak saptanmıştır (Çizelge 4.36.). Demir klorozuna toleant olan Tuzcu turuncunda stresin 1. günü 112 gen indüklenirken, duyarlı olan Yerli üç yapraklıda ise sadece 25 gen indüklenmiştir. 209

231 Çizelge Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklıda indüklenmiş ve baskılanmış gen sayıları Gen sayıları Uygulamalar PT 1. gün SO 1. gün PT 5. gün SO 5. gün İndüklenmiş Baskılanmış Yerli üç yapraklı genotipinde stresin 1 ve 5. günlerinde istatistiksel olarak önemli bulunan genlerin listesi, M değerleri ve hücredeki fonksiyonları Çizelge 4.37 de verilmiştir. Elde edilen verilere göre 5 gen Yerli üç yapraklının her iki stres gününde de istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. IC00AAA13BC03 nolu Putative membran transporter, C08019D10 nolu reversibly glycosylated polypeptide ve KN0AAL2AB10 nolu ABC transporter permease protein-like protein genleri indüklenirken, C18021C10 nolu nitrate transporter NTL 1 ve C20003E08 nolu ferritin-3 chloroplast precursor genleri baskılanmıştır. Ayrıca hem 1. gün hemde 5. güne ait sonuçlarda istatistiksel olarak önemli bulunan bazı genler Çizelge 4.38 ve Çizelge 4.39 da verilmiştir. Yerli üç yapraklının 1. gününde kloroplastlarda yer alan ve elektron taşımasında görevli C20001H03, KN0AAK3BB03 ve C31103F06 Lipogenaz genleri; mitokondride yer alan ve Fe iyon transmembrane taşınmasından sorumlu KN0AAQ10YF24 nolu root specific metal transporter genleri baskılanırken, plastidlerde bulunan ve lipid binding ten sorumlu C03005H05 Arachidonic acidinduced geni indüklenmiştir (Çizelge 4.38.) Yerli üç yapraklının 5. gününde mitokondride yer alan ve çinko taşınımından sorumlu C02010C10 nolu Metal tolerance protein ve yine mitokondride yer alan iron ion transmembrane transporter activity ve Fe iyonunun taşınmasından sorumlu metal transporter Nramp3 geni; ayrıca elektron taşınımından sorumlu C31805F11 nolu CPRD2 protein ve kükürt taşınımından sorumlu C19008G08 sulfate transporter identical to sulfate transporter genleri indüklenmiştir (Çizelge 4.39.). Tuzcu turuncunun stresin 1 ve 5. günlerinde istatistiksel olarak önemli bulunan genlerin listesi, M değerleri ve hücredeki fonksiyonları Çizelge da 210

232 verilmiştir. Elde edilen verilere göre 8 gen her iki stres gününde de istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. C03005H05 nolu Arachidonic acid-induced DEA1. C31201C02 ve C31502B11 nolu Aquaporin, C34108F04 nolu Root iron transporter protein IRT1, C34008A02 nolu Metal transporter Nramp3, IC0AAA60CE05 nolu Zinc transporter 4 chloroplast precursor, C31801F03 nolu UPI00000A8696; P0480C01.26, KN0AAA2BG06 nolu PRA2 genleri indüklenmiştir. Ayrıca hem 1. gün hemde 5. güne ait sonuçlarda istatistiksel olarak önemli bulunan bazı genler Çizelge ve Çizelge de verilmiştir. Tuzcu turuncunda stresin 1. gününde, C02026H01 nolu plastidlerde ve mitokondrilerde görev alan Iron-sulfur assembly protein IscA-like 1 mitochondrial precursor, C01001G08 nolu ATP sentezinde proton taşınımında görev alan Chloroplast ATP synthase a chain precursor ; C02001A04, C02001A04, C02001A04, C02001A04, C02001A04, C02001A04 nolu tubulin kompleksinde görev alan Tubulin alpha-2 chain (unigene acl1037contig1) genleri, C06016A05 nolu porin aktivitesinde görev alan Plasma intrinsic protein 22, C31101F02 nolu elektron taşımasında görevli Uclacyanin I, C04030G06 nolu kinase aktivitesinde görevli Leucine rich repeat protein precursor, C31105C08 nolu peroksimose da görevli Acyl-coenzyme A oxidase 4 peroxisomal, KN0AAP7YJ03 nolu lipid transportunda görevli Xylogen protein 1 genleri indüklenirken, C20003E08 nolu Ferritin-3 chloroplast precursor, IC0AAA97DG09 nolu bakır iyonunun taşınımından sorumlu GbAAC ve IC0AAA67BE01 nolu kloroplastlarda görev alan Ferrochelatase II chloroplast precursor genleri baskılanmışlardır (Çizelge 4.41.). Tuzcu turuncunda stresin 5. gününde C32013A12 nolu ve elektron transportunda görev alan Alpha-D-xylosidase precursor, C31806A08 nolu porin aktivitesinde görev alan Aquaporin, KN0AAL3CD04 nolu plastidlerde yer alan ve bakırın taşınmasından sorumlu Copper transporter 1 genleri indüklenirken, C02022G09 nolu Fe bağlamada (ferric ion binding) görev alan Ferritin-2 chloroplast precursor geni baskılanmıştır (Çizelge 4.42.). C34108F04 nolu IRT1 geni Yerli üç yapraklıda stresin 1. günü ; 5. günü olarak ekspre olurken (Çizelge 4.39); Tuzcu turuncunda ise 1. gün 211

233 1.195 ve 5. gün olarak ekspre olmuştur (Çizelge 4.40). Benzer şekilde C3400A02 nolu NRAMP3 adlı gen ise Yerli üç yapraklıda stresin 1 ve 5. Günlerinde sırasıyla ve (Çizelge 4.39); Tuzcu turuncunda ise ve (Çizelge 4.40) olarak ekspre olmuştur. Köklerden metal taşınımında rol alan iki genin Tuzcu turuncunda yerli üç yapraklıya göre daha fazla ekspre olması Tuzcu turuncunun demir klorozuna olan toleranslılığını göstermesi açısından anlamlıdır. Mikroarray sonuçlarına göre elde edilen verilerin Fe klorozuna tolerant Tuzcu turuncu ve Fe klorozuna duyarlı Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe alımında etkinliğin nasıl gerçekleştiğini çözebilmek amacıyla bazı karşılaştırılmalar yaparak durum ortaya koyulmaya çalışılmıştır. Aşağıdaki grafiklerde Fe alımında mekanizmanın ortaya konmasına yardımcı olabilecek veriler bir arada sunulmuştur 212

234 213

235 214

236 215

237 216

238 217

239 218

240 219

241 220

242 Solunumla ilgili bulunan prosesler Demir noksanlığının arabidopsis bitkisi üzerinde yapılan mikroarray çalışmasında mitokondrial elektron taşıma zincirini etkileyen sitokrom redüktaz ve oksidaz gibi başlıca komponentlerin indüklendiği bildirilmiştir (Thimm ve ark., 2001). Ancak, Lopez ve ark. (2000), şeker kamışında yaptıkları çalışmalarında oksijen sınırlaması olmaksızın oksijensiz (anaerobik) solunumda görev alan enzimlerin düzensizleştiğini belirtmişlerdir. Thimm ve ark. (2001), anaerobik solunumda yer alan laktat dehidrogenaz, piruvat dekarboksilaz ve alkol dehidrogenazın Fe noksanlığında indüklendiğini saptamışlardır. Su altında kalan bitkilerde alkol dehidrogenazın ve piruvat dekarboksilaz ın yani oksijensiz solunumun (anaerobic) devreye girmesiyle ilgili çalışmalar bulunmaktadır (Owen ve ark., 2004). Bu da bitkilerin stres koşullarında oksijensiz solunumu devreye sokması olarak düşünülebilir. Solunumla ilgili proseslerde, gen ekspresyonun Tuzcu turuncunda Yerli üç yapraklıdan daha fazla olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Aşağıda oksijensiz solunumla ilgili bulunan prosesler sunulmuştur Alkol Katabolik Proses Alkol katabolik prosesten sorumlu 11 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil de verilmiştir. Şekil de görüldüğü gibi bu prosesten sorumlu 11 gen Tuzcu turuncunda stresin artışıyla birlikte indüklenirken Yerli üç yapraklıda baskılanmışlardır. Bu proseste yer alan genlerin glikoziste etkin olduğu ve bir çoğunun mitokondri ve plastidlerde yer aldığı blast2go listesinden bilinmektedir. Thimm ve ark. (2001), arabidopsis bitkisinin Fe eksikliğinde alkol dehidrogenazı indüklendiğini bildirmişlerdir. Ayrıca su altında kalan bitkilerde oksijensiz solunumun gerçekleştiği ve alkol dehidrogenaz ın bu stres koşulunda indüklendiği belirtilmiştir (Owen ve ark., 2004). 221

243 Demir klorozuna tolerant olan Tuzcu turuncunda alkol katabolik proseste etkin olan genler indüklenirken, duyarlı olan Yerli üç yapraklıda ise baskılanmıştır (Şekil 4.53.). 0,4 Alkol Katabolik Proses 0, ,2-0,4 M [log(2) oranı] -0,6-0,8-1 -1,2-1,4 Günler -1,6 Fructose-bisphosphate aldolase (unigene acl34contig3) PT Cytosolic phosphoglycerate kinase 1 (unigene acl306contig1) PT Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase alpha subunit (unigene acl4127contig1) PT Pyruvate kinase (unigene acl4729contig1) PT Putative glucose-6-phosphate isomerase (unigene akn0aap9yl12fm1_c) PT Glucose-6-phosphate isomerase cytosolic (unigene acl3781contig1) PT Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (unigene acl715contig1) PT Enolase 1 (unigene acl31contig2) PT Pyruvate kinase cytosolic isozyme (unigene acl1468contig2) PT Pyruvate kinase barrel domain (unigene acl670contig2) PT Fructose-bisphosphate aldolase (unigene acl34contig3) SO Cytosolic phosphoglycerate kinase 1 (unigene acl306contig1) SO Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase alpha subunit (unigene acl4127contig1) SO Pyruvate kinase (unigene acl4729contig1) SO Putative glucose-6-phosphate isomerase (unigene akn0aap9yl12fm1_c) SO Glucose-6-phosphate isomerase cytosolic (unigene acl3781contig1) SO Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (unigene acl715contig1) SO Enolase 1 (unigene acl31contig2) SO Pyruvate kinase cytosolic isozyme (unigene acl1468contig2) SO Pyruvate kinase barrel domain (unigene acl670contig2) SO At1g02270/T6A9_9 (unigene acl5351contig1) PT At1g02270/T6A9_9 (unigene acl5351contig1) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının alkol katabolik prosese tepkileri Glukoz Katabolik Proses Glukoz katabolik prosesinde görevli 8 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil de sunulmuştur. Bu proseste Fe kloruzuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklının stresin artışıyla birlikte gösterdikleri farklı tepkiler saptanmıştır. Tuzcu turuncu stresin ilerleyen günlerinde glukoz katabolik proseste yer alan genlerini indüklerken Yerli üç yapraklının genleri ise baskılanmıştır. 222

244 0,4 0,2 Glikoz Katabolik Proses ,2 M [log(2) oranı] -0,4-0,6-0,8-1 -1,2-1,4-1,6 Fructose-bisphosphate aldolase (unigene acl34contig3) PT Cytosolic phosphoglycerate kinase 1 (unigene acl306contig1) PT Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase alpha subunit (unigene acl4127contig1) PT Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (unigene acl715contig1) PT At1g02270/T6A9_9 (unigene acl5351contig1) PT Enolase 1 (unigene acl31contig2) PT Pyruvate kinase cytosolic isozyme (unigene acl1468contig2) PT Pyruvate kinase barrel domain (unigene acl670contig2) PT Günler Fructose-bisphosphate aldolase (unigene acl34contig3) SO Cytosolic phosphoglycerate kinase 1 (unigene acl306contig1) SO Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase alpha subunit (unigene acl4127contig1) SO Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (unigene acl715contig1) SO At1g02270/T6A9_9 (unigene acl5351contig1) SO Enolase 1 (unigene acl31contig2) SO Pyruvate kinase cytosolic isozyme (unigene acl1468contig2) SO Pyruvate kinase barrel domain (unigene acl670contig2) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının glukoz katabolik prosese tepkileri Glikozis Glikoziste görevli 11 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil de sunulmuştur. Bu proseste Fe kloruzuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklının stresin artışıyla birlikte gösterdikleri farklı tepkiler saptanmıştır. Tuzcu turuncu stresin ilerleyen günlerinde glikozisde görev alan genler indüklenirken Yerli üç yapraklıda ise baskılanmıştır. Glikozis solunumun ilk aşamasıdır ve bu aşamada glikozun pirüvik aside dönüştürülmesi için oksijene gereksinim duymaz (Kacar ve ark., 2002). Moleküler oksijenin olmadığı ortamlarda (örneğin su altındaki bitkilerin köklerinde) glikozis hücre için esas enerji kaynağı olabilir. Bunu sağlamak için sitoplazmada yeralan fermentasyon reaksiyonları devreye girer (Türkan, 2008). 223

245 0,4 Glikozis 0, ,2-0,4 M [log(2) oranı] -0,6-0,8-1 -1,2 Günler -1,4-1,6 Fructose-bisphosphate aldolase (unigene acl34contig3) PT Cytosolic phosphoglycerate kinase 1 (unigene acl306contig1) PT Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase alpha subunit (unigene acl4127contig1) PT Pyruvate kinase (unigene acl4729contig1) PT Putative glucose-6-phosphate isomerase (unigene akn0aap9yl12fm1_c) PT Glucose-6-phosphate isomerase cytosolic (unigene acl3781contig1) PT Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (unigene acl715contig1) PT Enolase 1 (unigene acl31contig2) PT Pyruvate kinase cytosolic isozyme (unigene acl1468contig2) PT Pyruvate kinase barrel domain (unigene acl670contig2) PT At1g02270/T6A9_9 (unigene acl5351contig1) PT Fructose-bisphosphate aldolase (unigene acl34contig3) SO Cytosolic phosphoglycerate kinase 1 (unigene acl306contig1) SO Pyrophosphate-dependent phosphofructokinase alpha subunit (unigene acl4127contig1) SO Pyruvate kinase (unigene acl4729contig1) SO Putative glucose-6-phosphate isomerase (unigene akn0aap9yl12fm1_c) SO Glucose-6-phosphate isomerase cytosolic (unigene acl3781contig1) SO Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (unigene acl715contig1) SO Enolase 1 (unigene acl31contig2) SO Pyruvate kinase cytosolic isozyme (unigene acl1468contig2) SO Pyruvate kinase barrel domain (unigene acl670contig2) SO At1g02270/T6A9_9 (unigene acl5351contig1) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının glikozis tepkileri Piruvat dekarboksilaz aktivitesi Piruvat dekarboksilaz aktivitesinde görevli 4 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil da sunulmuştur. Piruvat dekarboksilaz, stresin 1. gününde Fe klorozuna duyarlı Yerli üç yapraklıda indüklenirken, Fe kloruzuna tolerant Tuzcu turuncunda baskılanmıştır. Ancak stresin 5. gününde bu aktivite Tuzcu turuncunda artış gösterirken, Yerli üç yapraklıda azalış göstermiştir. Thimm ve ark. (2001), arabidopsis bitkisinin Fe eksikliğinde piruvat dekarboksilazın indüklendiğini bildirmişlerdir. Ayrıca su altında kalan bitkilerde oksijensiz solunumun gerçekleştiği ve bu stres koşulunda piruvat dekarboksilazın indüklendiği saptanmıştır (Owen ve ark., 2004). 224

246 0,5 Piruvat dekarboksilaz ,5 M [log(2) oranı] -1-1,5 Günler -2 Pyruvate decarboxylase isozyme 1 (unigene acl3760contig1) PT Pyruvate decarboxylase-like protein (unigene aic0aaa1ad12fm1_c) PT Pyruvate decarboxylase (unigene ac31504f11ef_c) PT Pyruvate decarboxylase isozyme 1 (unigene acl3760contig1) SO Pyruvate decarboxylase-like protein (unigene aic0aaa1ad12fm1_c) SO Pyruvate decarboxylase (unigene ac31504f11ef_c) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının piruvat dekarboksilaz aktivitesi tepkileri Diğer prosesler Demir Bağlayıcı Genler (Iron Ion Binding) Demir bağlayıcılarda (Iron Ion Binding) görevli 6 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil de sunulmuştur. Bu proseste Fe kloruzuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklının stres artışıyla birlikte gösterdikleri tepkiler saptanmıştır. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklıda bu genler baskılanmış ancak AT4g26970F10M23 geni stresin 5. gününde Yerli üç yapraklıda, Tuzcu turuncuna göre daha fazla indüklenmiştir. 225

247 1,5 Demir Bağlayıcılar (iron ion binding) 1 M [log(2) oranı] 0,5 0-0,5-1 Günler ,5-2 Ferritin-3 chloroplast precursor (unigene acl859contig1) PT AT4g26970/F10M23_310 (unigene acl2188contig1) PT Lipoxygenase (unigene acl5225contig1) PT Lipoxygenase LOX1 (unigene acl4352contig1) PT Lipoxygenase (unigene ac31103f06ef_c) PT Lipoxygenase (unigene ac20001h03sk_c) PT Ferritin-3 chloroplast precursor (unigene acl859contig1) SO AT4g26970/F10M23_310 (unigene acl2188contig1) SO Lipoxygenase (unigene acl5225contig1) SO Lipoxygenase LOX1 (unigene acl4352contig1) SO Lipoxygenase (unigene ac31103f06ef_c) SO Lipoxygenase (unigene ac02023c12sk_c) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının demir bağlayıcı genlere tepkileri Metal Bağlayıcı Genler (Metal Ion Binding) Metal bağlayıcı genlerde (Metal Ion Binding) görevli 10 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil de sunulmuştur. Bu proseste Fe kloruzuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklının stresin artışıyla birlikte gösterdikleri tepkiler saptanmıştır. Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklıda bu genler baskılanmış ancak AT4g26970F10M23, protein phopsphatase 2c. F2D10.15 ve Lipoxygenase (ac31103f06efc) genleri stresin 5. gününde Yerli üç yapraklıda, Tuzcu turuncuna göre daha fazla indüklenmiştir. 226

248 1,5 Metal Bağlayıcılar (metal ion binding) 1 0,5 M [log(2) log] 0-0, ,5-2 Günler Ferritin-3 chloroplast precursor (unigene acl859contig1) PT F2D10.15 (unigene ac34204c05ef_c) PT AT4g26970/F10M23_310 (unigene acl2188contig1) PT Lipoxygenase (unigene acl5225contig1) PT Lipoxygenase LOX1 (unigene acl4352contig1) PT Lipoxygenase (unigene ac31103f06ef_c) PT Lipoxygenase (unigene ac20001h03sk_c) PT Protein phpsphatase 2C (unigene acl143contig2) PT Putative aminopeptidase; (unigene ac05073e09sk_c) PT Lipoxygenase (unigene ac02023c12sk_c) PT Ferritin-3 chloroplast precursor (unigene acl859contig1) SO F2D10.15 (unigene ac34204c05ef_c) SO AT4g26970/F10M23_310 (unigene acl2188contig1) SO Lipoxygenase (unigene acl5225contig1) SO Lipoxygenase LOX1 (unigene acl4352contig1) SO Lipoxygenase (unigene ac31103f06ef_c) SO Lipoxygenase (unigene ac20001h03sk_c) SO Protein phpsphatase 2C (unigene acl143contig2) SO Putative aminopeptidase; (unigene ac05073e09sk_c) SO Lipoxygenase (unigene ac02023c12sk_c) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının metal bağlayıcı genlere tepkileri Organik Asit Biyosentetik Proses Organik asit biyosentezinde görevli 5 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil da sunulmuştur. Organik asit biyosentezi stresin 1. ve 5. günlerinde her iki genotipte de indüklenmediği saptanmıştır. Demir içeren lipoksigenazın Fe eksikliği çeken bitkilerde azaldığı bildirilmiş ve arabidopsiste yapılan mikroarray çalışmasında da benzer sonuç elde edilmiştir (Thimm ve ark., 2001). Bu çalışmada organik asit sentezinden sorumlu lipoksigenazın hem tolerant hemde duyarlı genotipte baskılandığı anlaşılmıştır. 227

249 0,5 0-0,5 Organik Asit Biyosentetik Proses Günler M [log(2) oranı] -1-1,5-2 Lipoxygenase (unigene acl5225contig1) PT Lipoxygenase LOX1 (unigene acl4352contig1) PT Lipoxygenase (unigene ac31103f06ef_c) PT Lipoxygenase (unigene ac20001h03sk_c) PT Lipoxygenase (unigene ac02023c12sk_c) PT Lipoxygenase (unigene acl5225contig1) SO Lipoxygenase LOX1 (unigene acl4352contig1) SO Lipoxygenase (unigene ac31103f06ef_c) SO Lipoxygenase (unigene ac20001h03sk_c) SO Lipoxygenase (unigene ac02023c12sk_c) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının organik asit biyosentetik proses tepkileri Porin Aktivitesi Porin aktivitesinde görevli 5 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil da sunulmuştur. Porin aktivitesi stresin 1. gününde Fe klorozuna tolerant Tuzcu turuncunda indüklenirken, Fe kloruzuna duyarlı Yerli üç yapraklıda baskılanmıştır. Ancak stresin 5. gününde bu aktivite Tuzcu turuncunda azalma gösterirken, Yerli üç yapraklıda artış göstermiştir. Bitki büyüme ve gelişmesiyle suyun hücre zarından dokularına ulaştırılması arasında sıkı bir bağ vardır. Bitki aquaporinleri oldukça geniş ve yüksek oranda çeşitlilik gösteren bir protein ailesidir ve aminoasitlerin sekans benzerliklerine göre sınıflandırılırlar. Aquaporinler suyun transselüler taşınımını kolaylaştırırlar, fakat bazı durumlarda çözünen maddelerin de hücre membranından geçişini sağlar. Bitki hücre membranları osmotik su geçirgenliklerinin büyüklüğü ile karakterize edilirler ve son dönemdeki bilgiler aquaporin aktivitesinin gating mekanizmasını regüle 228

250 edebildiği yönündedir. Gating davranışı; fosforilasyon, heteromerization, ph, kalsiyum, basınç ve sıcaklıktan etkilenir (Chaumont ve ark., 2005). Bitki bünyesine su apoplastik, simplastik ve transelüler pathways yollarıyla alınır ve hücreden hücreye su geçişi anlamındaki transelüler yolda major intrinsic protein (MIP) familyasına ait proteinlerin büyük rolü olduğuna inanılır. Bitkilerde aquaporinler oldukça geniş bir ailedir ve Arabidopsis te 35; pirinçte 33 ve mısırda 33 üyesinin (member) bulunduğu bildirilmiştir. Aquaporinlerin su stresi altındaki fonksiyonları ve rolleri henüz tam olarak bilinmemektedir. Ancak su eksikliğinde aquaporinlerin fosforilasyonu düzenlediği bildirilmiştir (Mahdieh ve ark., 2008). Arabidopsiste aquaporin ailesine ait 35 üye (member) bulunmaktadır ve bu 35 aquaporinin bir çoğu köklerde hücre-özel (cell-specific expression) ekspresyonudur. Köklerin bitki besin elementi noksanlığı veya stres ya da gece/gündüz çevrimi gibi koşullardaki su geçirgenlikleri çok kısa bir süre için (birkaç saatte ya da 2-3 günden az bir sürede) çok hızlı değişim gösterebilme kapasitesindedir. Son dönemde yapılan çalışmalar bu hızlı değişimlerin nedenini hücre zarı geçirgenliğine ve aquaporinlere bağlamaktadır (Javot ve Maurel, 2002). Ancak aquaporinlerin kuraklık ve su stresindeki etkisi hala tam olarak anlaşılamamıştır (Wu ve ark., (2009). 229

251 2,5 Porin Aktivitesi 2 1,5 M [log(2) oranı] 1 0,5 0-0, Günler -1 Putative aquaporin TIP1.3 (unigene ac04032d05sk_c) PT Plasma intrinsic protein 22 (unigene acl1621contig2) PT Nodulin-26 (unigene acl824contig1) PT Aquaporin (unigene ac31201c02ef_c) PT Aquaporin (unigene ac31502b11ef_c) PT Putative aquaporin TIP1.3 (unigene ac04032d05sk_c) SO Plasma intrinsic protein 22 (unigene acl1621contig2) SO Nodulin-26 (unigene acl824contig1) SO Aquaporin (unigene ac31201c02ef_c) SO Aquaporin (unigene ac31502b11ef_c) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının porin aktiviteleri Sülfat Asimilasyonu Sülfat asimilasyonunda görevli 4 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil de sunulmuştur. Stresin 1. ve 5. gününde Fe kloruzuna duyarlı Yerli üç yapraklıda bu genler indüklenmiştir. Ancak Fe kloruzuna tolerant Tuzcu turuncunda sulfate adenlytransferaz 1. ve 5. gün baskılanırken, diğer genler 1. gün indüklenmiş ancak 5. güne doğru bu ekspresyonun azaldığı belirlenmiştir. Bu proseste görev alan 3 genin sülfat asimilasyonundan sorumlu ve çoğunluğunun kloroplast ve mitokondride yer aldığı belirlenmiştir. Kükürt canlı organizmalardaki çok yönlü elementler arasındadır. Kükürt elektron taşınımına demir-kükürt proteini aracılığıyla katılır. Kükürt içeren organik bileşiklerin sentezinde ilk basamak sistein aminoasidine indirgenmesidir, çünkü sülfat özümlemesinin gerçekleşebilmesi için sülfatın sisteine indirgenmesi gereklidir. 230

252 Bu indirgeme aşamalarında ferrodoksinden elektron transferi gerçekleştirilir (Türkan, 2008) ve Fe noksanlığında demir-kükürt proteini olan ferrodoksinin azaldığı belirtilmiştir (Alcaraz, 1986). Enzimatik fonksiyonları bulunan bitki-özel (plant-spesific) Fe proteinlerinin çeşitli olaylarda (pathway) yeraldığı ve bu olaylardan birinin de sülfat asimilasyonunda görev alan adenosine-5 -phosphosulfate redüktaz olduğu (Hell ve Stephan, 2003) ve [4Fe-4S] cluster ının bu sentezde kofaktör olarak görev yaptığı belirlenmiştir (Kopriva ve ark., 2001). Ancak, Kopriva ve ark. (2007), yaptıkları çalışmalarında Fe-S cluster ı olmadan da bu enzimin çalışabildiğini bildirmişlerdir. Şekil 4.35 te görüldüğü gibi sülfat asimilasyonunda Fe kloruzuna duyarlı Yerli üç yapraklı indüklenirken tolerant Tuzcu turuncu baskılanmıştır. 1 0,8 Sülfat Asimilasyonu M [log(2) oranı] 0,6 0,4 0,2 0-0,2-0,4-0,6-0, Günler Putative adenylylsulfate kinase (unigene ac20004b12sk_c) PT Serine acetyltransferase (unigene acl103contig1) PT Sulfate adenylyltransferase (unigene acl438contig2) PT Putative adenylylsulfate kinase (unigene ac20004b12sk_c)so Serine acetyltransferase (unigene acl103contig1) SO Sulfate adenylyltransferase (unigene acl438contig2) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının sülfat asimilasyonunda tepkileri Sistein Biyosentetik Proses Sistein biyosentetik prosesinde görevli 5 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil de sunulmuştur. Bu proseste görev alan 5 genin Fe stresine tolerant Tuzcu

253 turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklı genotiplerinde stresin 1. gününde indüklendiği ancak 5. güne gelindiğinde ise bu genlerin Yerli üç yapraklıda, Tuzcu turuncuna göre çok daha fazla ekspre olduğu saptanmıştır. Bu proseste görev alan 5 genin sistein sentezinden sorumlu ve çoğunluğunun kloroplastlarda yer aldığı belirlenmiştir. Sistein, metionin ve diğer kükürt içeren metabolitlerin sentezi için kükürtün indirgenmesinde görev alır (Leustek ve ark., 2000; Kopriva, 2006). Sülfatın özümlemesinde sülfatın sisteine indirgenmesi plastidlerde meydana gelir (Hawkesford, 2005). Bu indirgenme sırasında ferrodoksinde elektron kaynaklarından biridir (Türkan, 2008). Sülfat asimilasyonuna benzer şekilde sistein biyosentezinde de duyarlı genotip, tolerant genotipten daha fazla ekspre olmuştur. M [log(2) oranı] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,1-0,2 Sistein Biyosentetik Proses Günler Cysteine synthase (EC ) (Beta-pyrazolylalanine synthase) (Beta-PA/CSase) (EC ) (L-mimosine synthase) (EC ) (O- acetylserine sulfhydrylase) (O-acetylserine (Thiol)- lyase) (unigene acl1638contig1) PT Cysteine synthase (EC ) (Beta-pyrazolylalanine synthase) (Beta-PA/CSase) (EC ) (L-mimosine synthase) (EC ) (O- acetylserine sulfhydrylase) (O-acetylserine (Thiol)- lyase) (unigene acl1638contig1) SO Putative adenylylsulfate kinase (unigene ac20004b12sk_c) PT Putative adenylylsulfate kinase (unigene ac20004b12sk_c) SO Serine acetyltransferase (unigene acl103contig1) PT Serine acetyltransferase (unigene acl103contig1) SO Cysteine synthase chloroplast precursor (EC ) (O-acetylserine sulfhydrylase) (O-acetylserine (Thiol)-lyase) (unigene acl2356contig2) PT Cysteine synthase chloroplast precursor (EC ) (O-acetylserine sulfhydrylase) (O-acetylserine (Thiol)-lyase) (unigene acl2356contig2) SO Cysteine synthase (unigene acl2778contig1) PT Cysteine synthase (unigene acl2778contig1) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının sistein biyosentetik prosesinde tepkileri 232

254 Methionin Metabolik Proses Methionin metabolizmasında görevli 10 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil de sunulmuştur. Bu proseste Fe kloruzuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklının stresin artışıyla birlikte gösterdikleri tepkiler saptanmıştır. Methinonin metabolizmasının Fe stresi koşullarında hem duyarlı hem de tolerant genotipte devreye girdiği ve stresin süresinin uzamasıyla birlikte aşağıdaki grafikte belirtilen ilgili genlerin indüklendikleri anlaşılmaktadır. Sisteinde olduğu gibi duyarlı genotipteki ekspresyon toleranttan çok daha fazla gerçekleşmiştir. Burada yer alan 10 gen methionin ve etilen sentezinde görev almaktadır. Bazı genlerin işlev yerleri tam olarak bilinmemekte, bilinenler ise kloroplastlardadır. Methionin, plastidlerde sisteinden sentezlenir. Kükürt, sistein ve methioninden sentezlendikten sonra proteinlerin ve S-adenozilmetiyonin gibi diğer bileşiklerin yapısına katılabilir. S-adenozilmetiyonin, etilen sentezinde önemlidir (Türkan, 2008). Strateji II bitkilerinde fitosideroforların baskın aminoasidi kükürt içeren methionindir. Mısır bitkisinde yapılan bir çalışmada yetersiz kükürtle beslenen mısır yapraklarında Fe konsantrasyonu, yeterli kükürtle beslenenlenlere göre daha düşük bulunmuştur. Bu durum kükürt noksanlığında fitosideroforların salgısının etkilenmesine bağlanmaktadır. Ancak Strateji I bitkilerinde de kükürt noksanlığının Fe klorozununun şiddetini arttırabileceği düşünülmüş ancak bu kanıtlanmamıştır (Hansen ve ark., 2006). Bu mikroarray çalışmasıyla Fe noksanlığında kükürt içeren methionin aminoasidinin etkilendiği anlaşılmaktadır. 233

255 1,5 Methionin Metabolik Proses 1 0,5 M [log(2) oranı] ,5 Günler -1 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase (unigene acl90contig4) PT Methylenetetrahydrofolate reductase 2 (unigene ac05069h02sk_c) PT S-adenosylmethionine synthetase 2 (unigene acl33contig2) PT ACC synthase (unigene acl7172contig1) PT S-adenosylmethionine synthetase 2 (unigene acl55contig2) PT S-adenosyl-L-methionine synthetase 1 (unigene acl414contig2) PT Methionine synthase (unigene acl4712contig1) PT Cystathionine beta-lyase (unigene acl4609contig1) PT 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase (unigene acl90contig4) SO Methylenetetrahydrofolate reductase 2 (unigene ac05069h02sk_c) SO S-adenosylmethionine synthetase 2 (unigene acl33contig2) SO ACC synthase (unigene acl7172contig1) SO S-adenosylmethionine synthetase 2 (unigene acl55contig2) SO S-adenosyl-L-methionine synthetase 1 (unigene acl414contig2) SO Methionine synthase (unigene acl4712contig1) SO Cystathionine beta-lyase (unigene acl4609contig1) SO 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase (unigene acl90contig2) PT 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine methyltransferase (unigene acl90contig2) SO Cystathionine gamma synthase (unigene acl52contig3) PT Cystathionine gamma synthase (unigene acl52contig3) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının methionin metabolizmasında tepkileri Serin ailesi aminoasitlerinin biyosentetik prosesi Serin ailesi aminoasitlerinin biosentetik prosesinde görevli 7 genin Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinde Fe stresinde ekspre olma durumu Şekil te sunulmuştur. Serin ailesi aminoasitlerinin biosentetik proseste, stresin 1. ve 5. gününde her iki genotipte de indüklenmiştir. Ancak Fe kloruzuna tolerant Tuzcu turuncunda 5. güne doğru genlerin eksprelerinde azalma yaşanırken, Yerli üç yapraklıda ise artış belirlenmiştir. 234

256 M [log(2) oranı] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,1-0,2 Serin Ailesi Aminoasitlerinin Biyosentetik Prosesi Günler Putative phosphoserine aminotransferase (unigene acl902contig1) PT Putative phosphoserine aminotransferase (unigene acl902contig1) SO Days Cysteine synthase (EC ) (Beta-pyrazolylalanine synthase) (Beta-PA/CSase) (EC ) (L-mimosine synthase) (EC ) (O-acetylserine sulfhydrylase) (Oacetylserine (Thiol)-lyase) (unigene acl1638contig1) PT Cysteine synthase (EC ) (Beta-pyrazolylalanine synthase) (Beta-PA/CSase) (EC ) (L-mimosine synthase) (EC ) (O- acetylserine sulfhydrylase) (Oacetylserine (Thiol)-lyase) (unigene acl1638contig1) SO Putative adenylylsulfate kinase (unigene ac20004b12sk_c) PT Putative adenylylsulfate kinase (unigene ac20004b12sk_c) SO Serine acetyltransferase (unigene acl103contig1) PT Serine acetyltransferase (unigene acl103contig1) SO Phosphoserine phosphatase chloroplast precursor (unigene acl4764contig1) PT Phosphoserine phosphatase chloroplast precursor (unigene acl4764contig1) SO Cysteine synthase chloroplast precursor (EC ) (O-acetylserine sulfhydrylase) (O-acetylserine (Thiol)-lyase) (unigene acl2356contig2) PT Cysteine synthase chloroplast precursor (EC ) (O-acetylserine sulfhydrylase) (O-acetylserine (Thiol)-lyase) (unigene acl2356contig2) SO Cysteine synthase (unigene acl2778contig1) PT Cysteine synthase (unigene acl2778contig1) SO Şekil Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklının serin ailesi aminoasitlerinin biyosentetik prosesinde tepkileri Çalışma sonunda FRO4 (Ferric Reduction Oxidase 4), FRO5 (Ferric Reduction Oxidase 5), IRT1 (Iron-Regulated Transporter 1), Fe-S assembly protein acl6185 Contig 1, ATP-citrate lyase ACLB-2aKNOAAQ7YMO4RM1, Citrate hydrolase- Aconitase C34108G11, NRAMP3 acl3476 Contig 1 (Natural Resistance-Associated Macrophage Protein 3), Transcription Factor T20M31C2009F04 ve Transcription Factor bhlhc2002e09 genleri Tuzcu turuncu ve Yerli üç yapraklı genotiplerinin mikroarray sonuçlarına göre Fe alımında etkin rolleri bulunan aday genler olarak belirlenmiştir. Demir şelat redüktaz aktivitesini kodlayan genler arabidopsiste (FRO2) ve bezelyede (FRO1) tanımlanmıştır. Domates bitkisinde ise FRO1 geninin Fe şelat redüktaz aktivitesini destekleyen major bir gen olduğu bildirilmiştir (Hell ve Stephan, 2003). Daha sonra arabidopsiste yapılan çalışmada FRO4 geninin sadece meyvede, FRO5 geninin ise sadece köklerde ekspre olduğu bildirilmiştir (Mukherjee 235

257 ve ark., 2006). Bu çalışmada da FRO4 ve FRO5 genlerinin köklerde aktif olduğu belirlenmiştir. IRT1 transporter topraktan Fe alımını sağlayan ZIP (zinc regulated transporter) familyasına bağlı bir gendir. Bu familyaya bağlı genlerin Fe, Mn, Cu ve Cd elementlerinin taşınımında görev yaptığı bilinmektedir (Hall ve Guerinot, 2006). IRT1 geni arabidopsisten Eide ve ark., (1996) tarafından klonlanmış, domates ve bezelyedeki RIT1 geninin ortologu olduğu bildirilmiştir (Hell ve Stephan, 2003). Bu çalışmada da IRT1 geninin Fe alımında turunçgillerde aktif olarak rol aldığı belirlenmiştir. NRAMP genlerinin fizyolojik rolleri tam olarak henüz bilinmemektedir. Ancak NRAMP1,3 ve 4 genlerinin arabidopsisin kök ve yapraklarında ekspre olduğu ve multi-spesifik metal taşınımında görev yaptığı düşünülmektedir. Yapılan çalışmalarda NRAMP genlerinin IRT1 genine ek olarak Fe eksikliği durumunda hücrenin Fe dengesini korumak için devreye girdiği düşünülmektedir. (Hell ve Stephan, 2003). 236

258 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Meral İNCESU 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü İklim Odası Laboratuarı, Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Araştırma Uygulama Çiftliği arazileri ve İspanya, Valencia IVIA Araştırma Enstitüsü Genomik Merkez Abiyotik Stres Laboratuarında yürütülmüştür. Araştırmada, iklim odasında ve arazideki yüksek ph lı toprak koşullarında Fe klorozuna karşı 16 farklı turunçgil cins, tür ve çeşidinin tepkileri yapılan tarama çalışmalarıyla belirlenmiştir. İklim odası ve arazide yürütülen tarama çalışmalarında genotiplerin bitki büyüme parametreleri, SPAD ve Fe kloroz skalası değerleriyle, yapraktaki toplam ve aktif Fe konsantrasyonları saptanmıştır. Ayrıca, yüksek ph lı koşullarda Fe klorozuna tolerant olarak bilinen Tuzcu turuncu ve duyarlı olan Yerli üç yapraklı genotiplerinin fizyolojik tepkilerini ayrıntılı olarak ortaya koymak için bitki büyüme parametreleri, SPAD, Fe klorozu skalası, yaprak aktif ve toplam Fe konsantrasyonları, katalaz ve askorbat peroksidaz enzim aktiviteleri, fotosentez hızı, toplam şeker, yüzde nişasta, toplam karbonhidrat analizleri ile azot konsantrasyonu ve karbon/azot oranı belirlenmiştir. Bunlara ek olarak Fe klorozuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklı genotiplerinin Fe klorozuna karşı gösterdikleri tepkiler, Fe stresinin 1 ve 5. günlerinde mikroarray analizleriyle ilgili genleri belirlemek için incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar aşağıda sunulmuştur: İklim Odası Çalışmaları:16 genotipe ait (-)Fe ve kontrol bitkilerinde bitki büyüme parametrelerinin incelendiği iklim odası tarama çalışmasında, Fe stresine tabi tutulan [(-)Fe] bitkilerde yaprak sayısı, bitki boyu ve bitki ağırlığının azaldığı belirlenmiştir. Demir stresinde bitkilerin yapraklarında beklendiği gibi sararmalar meydana gelmiş, SPAD ölçümleri ve skala değerlendirmeleri ile kloroz durumunun kolaylıkla belirlenebileceği tespit edilmiştir. Redüktaz enzim aktivitesi ölçümü ince yapılı kuvarsda etkin olamamış, ancak su kültüründe ya da köklerin rahat gelişebileceği gevşek yapılı substratlar için başarı sağlanabileceği belirlenmiştir. 237

259 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Meral İNCESU İklim odası tarama çalışmasında Fe stresine maruz bırakılan bitkilerde genotiplere bağlı olarak değişik düzeylerde yapraktaki aktif Fe ve toplam Fe konsantrasyonlarının azaldığı saptanmıştır. İklim odası tarama denemesinde tartılı derecelendirme sonuçlarına göre; Tuzcu 891 turuncu, Gou Tou turuncu, Antalya Kleopatra mandarini ve Duncan altıntopu çok tolerant; Tuzcu turuncu, Sunki mandarini, Nasnaran mandarini, KXS, Carrizo sitranjı, C-35 sitranjı ve Marumi kamkat tolerant; Volkameriana, Swingle sitrumelo, Pomeroy üç yapraklı ve Bintangor sarawak duyarlı; Yerli üç yapraklı ise çok duyarlı olarak sınıflanmışlardır. Arazi Denemesi:Genotiplerin yüksek ph lı (7.72) toprak koşullarındaki davranışlarının incelendiği arazi denemesinde, incelenen parametrelerden bitki boyu ve yaprak sayısı bakımından genotiplerin farklılıklar gösterdiği saptanmıştır. Ayrıca gerçekleştirilen SPAD ve skala ölçümleri sonucunda en çok kloroz gösteren genotipler olarak saptanan Swingle sitrumelo, Pomeroy üç yapraklı ve Bintangor sarawak da, buna rağmen toplam Fe miktarlarının yüksek olduğu ve Fe paradoksu gösterdiği belirlenmiştir. Diğer genotiplerde ise SPAD ve skala değerleri ile toplam Fe arasında pozitif bir ilişki saptanmıştır. Arazi tarama denemesi tartılı derecelendirme sonuçlarına göre; Tuzcu turuncu, Gou Tou turuncu, Sunki mandarini, Antalya Kleopatra mandarini ve Carrizo sitranjı çok tolerant; Tuzcu 891 turuncu, Volkameriana, Nasnaran mandarini ve Marumi kamkat tolerant; KXS ve C-35 sitranjı orta tolerant; Swingle sitrumelo ve Pomeroy üç yapraklı duyarlı; Bintangor sarawak az duyarlı ve Yerli üç yapraklı çok duyarlı olarak sınıflanmışlardır. İklim odasındaki genotiplere uygulanan tartılı derecelendirme sonucu elde edilen toleranslılık puanı ile arazi denemesindeki genotiplerin SPAD, skala, aktif Fe ve toplam Fe konsantrasyonları arasındaki korelasyon incelenmiştir. Bu sonuca göre iklim odasındaki genotiplerin puanları ile arazi denemesinde incelenen parametrelerden SPAD ve skala arasında pozitif bir ilişki saptanmıştır. 238

260 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Meral İNCESU Ayrıntılı Fizyoloji Çalışması:Demir klorozuna tolerant Tuzcu turuncu ve duyarlı Yerli üç yapraklı genotipleri Fe stresine tabi tutulduğunda her ikisinde de yaprak sayısı, bitki boyu ve bitki ağırlığının azaldığı belirlenmiştir. SPAD ve skala ile belirlenen klorozun, stresin süresine bağlı olarak arttığı, Yerli üç yapraklıda klorozun çok daha şiddetli meydana geldiği saptanmıştır. Toplam Fe ve aktif Fe konsantrasyonları klorozla birlikte her iki genotipte azalmış, ancak Yerli üç yapraklının (-)Fe bitkilerinde Tuzcu turuncuna göre daha düşük bulunmuştur. Fotosentez hızı, Fe stresi süresinin artmasıyla düşüş göstermiştir. Yerli üç yapraklı kontrol bitkilerinin, Tuzcu turuncundan daha yüksek fotosentez hızına sahip olduğu belirlenmiştir. Ancak Fe stresinde Yerli üç yapraklının fotosentez hızını çok daha fazla azalttığı belirlenmiştir. Ayrıntılı fizyoloji çalışmasında toplam şeker miktarı ile Fe klorozu arasında ters bir ilişki saptanmıştır. Nişasta ve toplam karbonhidrat miktarı deneme başında Yerli üç yapraklıda kontrolden yüksek bulunmuş, ancak ilerleyen günlerde hem kontrol hem de (-)Fe de bu durum tersine dönmüştür. Bununla beraber Fe stresine tabi tutulan her iki genotip toplam karbonhidrat bakımından farklılık göstermezken, nişasta bakımından Yerli üç yapraklıda azalma görülmüştür. Demir klorozu gösteren yaprak ve sağlıklı yaprakların içerdikleri azot konsantrasyonları arasında bir ilişki kurulamamış, ancak Yerli üç yapraklı daha yüksek azot içeren bir anaç olarak belirlenmiştir. Demir klorozu gösteren yaprak ve sağlıklı yaprakların içerdikleri karbon/azot oranları arasında bir farklılık görülmemiş, ancak Tuzcu turuncu daha yüksek karbon/azot oranına sahip olarak bulunmuştur. Mikroarray Çalışması:Mikroarray çalışmasında sülfat asimilasyonu, sistein biyosentezi ve methionin metabolik proseslerinin Fe ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Mikroarray çalışması sonunda FRO4, FRO5, IRT1, Fe-S ve Aconitase genleri Fe alımında etkin rolleri bulunan aday genler olarak tespit edilmişlerdir. Demir klorozu genç yapraklarda sararmalar şeklinde ortaya çıkan tipik görünümüyle rahatlıkla tanımlanabilmektedir, ancak bu simptomlar ortaya çıkıncaya 239

261 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Meral İNCESU kadar geçen sürede bitkide bir takım gelişme gerilikleri yaşandığından dolayı Fe klorozunun erken teşhisinde kullanılabilecek parametrelere ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca bu parametreler ıslah çalışmalarında elde edilen bireylerin Fe stresine tepkilerinin belirlenmesinde erken teşhis kriterleri olmaları bakımından büyük önem taşımaktadır. İklim odası gibi kontrollü koşullarda aktif ve toplam Fe le pozitif korelasyon gösteren SPAD ve skala ölçümünün Fe klorozunu belirlemek için arazi koşullarında da kullanılması doğru ve pratik bir yöntem olacaktır. Ayrıca kontrollü ortamda yapılacak Fe stresi çalışmalarında bitkide yaprak sayısı, bitki boyu ve kuru ağırlığı, aktif ve toplam Fe konsantrasyonu parametreleri Fe klorozunun teşhisinde kullanılabilir. Ayrıca fidanlarda yapılan çalışmalarda iş yükünü hafifletmek amacıyla yaş ağırlık yerine bitki kök ve gövde kuru ağırlıkları alınarak Fe klorozunun bitki bünyesinde yarattığı olumsuzluklar rahatlıkla belirlenebilir. Ancak Fe klorozuna toleranslılığın anaçlar bazında belirlenmesi yeterli değildir, bu çalışmanın aşılı bitkiler üzerinde de yürütülmesi, özellikle yüksek kireçli topraklarda verim ve kalite parametreleri değerlendirilerek anaçların agronomik performansları belirlenmelidir. Mikroarray çalışmasında Fe stresinin etkileri farklı günlerde yapılacak örneklemelerle belirlenmelidir. Ayrıca, mikroarray çalışmasıyla elde ettiğimiz Fe alımında etkin aday genlerin marker haline getirilmesi için gerekli çalışmalar yapılmalı ve erken seleksiyon kriteri olarak kullanılmalıdır. 240

262 KAYNAKLAR ABADIA, J., MORALES, F., and ABADIA, A., Photosystem II efficiency in low chlorophyll, iron-deficient leaves. Plant Soil, 215: ABADIA, TAGLIAVINI, M., GRASA, R., BELKHODJA, R., ABADIA, A., SANZ, M., ARAUJO, E.,TSIPOURIDIS, C., and MARANGONI, B., Using the flower Fe concentration for estimating chlorosis status in fruit tree orchards: a summary report. Journal of Plant Nutrition, 23: AGUSTI, J., MERELO, P., CERCOS, M., TADEO, F. R., and TALON, M., Ethylene-induced differential gene expression during abscission of citrus leaves. Journal of Experimental Botany, 59 (10): AKA KAÇAR, Y., YEŞİLOĞLU, T., YILDIRIM, B., ŞİMŞEK, Ö., İNCESU, M., KAMİLOĞLU, M., TUZCU, Ö., Bazı Turunçgil Anaçlarının SSR Markırları ile Moleküler Tanımlanması. Alatarım, 8 (2): ALCARAZ, C. F., MARTINEZ-SANCHEZ, F., SEVILLA, F., and HELLIN, E., Influence of ferredoxin levels on nitrate reductase activity in iron deficient lemon leaves. Journal of Plant Nutrition, 9: ALVA, A. K., and OBREZA, T. A., By-product iron-humate increases tree growth and fruit production of orange and grapefruit. HortScience, 33: BAINES, R.C., MIYAKAWA, T., CAMERON, J. W., and SMALL, R. H., Infectivity of two biotypes of the citrus nematode on citrus and some other hosts. Journal of Nematology. Apr;1(2): BANULS, J., QUINONES, A., MARTIN, B., PRIMO-MILLO, E., and LEGAZ, F.,2003. Effects of the frequency of iron chelate supply by fertigation on iron chlorosis in citrus. Journal Plant Nutrition, 26: BAUER, P., and HELL, R., Translocation of iron in plant tissues. in: Iron Nutrition in Plants and Rhizospheric Microorganisms, (Eds. L.L. Barton, J. Abadía), Springer Verlag, S

263 BAUSHER, M., SHATTERS, R., CHAPARRO, J., DANG, P.,HUNTER, W., NIEDZ, R.,2003. An expressed sequence tag (EST) set from Citrus sinensis L. Osbeck whole seedlings and the implications of further perennial source investigations. Plant Science, 165, 415. BAVARESCO, L., GIACHINO, E., and COLLA, R., Iron chlorosis paradox in grapevine. Journal of Plant Nutrition, 22: BERECZKY, Z., WANG, H. Y., SCHUBERT, V., GANAL, M., and BAUER, P., Differential regulation of nramp and irt metal transporter genes in wild type and iron uptake mutants of tomato. The Journal of Biological Chemistry, 278: BERNARDI, B., LICCIARDELLO, C., RUSSO, M.P., CHIUSANO, M.P., CARLETTI, G., RECUPERO, G.R., and MAROCCO, A., Use of a custom array to study differentially expressed genes during blood orange (Citrus sinensis L. Osbeck) ripening. Journal of Plant Physiology, 167 (4) 1: BERTAMINI, M., NEDUNCHEZHIAN, N., and BORGHI, B., Effect of iron deficiency induced changes on photosynthetic pigments, ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase, and photosystem activities in field grown grapevine (Vitis vinifera L. cv. Pinot noir) leaves. Photosynthetica, 39 (1): BIENFAIT, H.F., Mechanisms in Fe-efficiency reactions of higher plants. Journal of Plant Nutrition, 11: BIINO, U., ZOCCHI, G., RÖMHELD, V., Effect of bicarbonate in root media on ph of xylem and leaf apoplasmic fluid and on iron nutrition of various plant species. IX International symposium on iron nutrition and interactions in plants. Abstract18, S2 7. BITTERS, W. P., Valencia Orange on Different Rootstocks. In: (W. B. Sinclair) The Orange It s Biochemistry and Physiology. Univ. Calif., Div. Agr. Sci, p:56-95, Riverside. BLONDEL, W. P., Quelques Aspects du Remplacement du Bigaradier et de l utilisation de Porte Greffe Nouveaux. Fruit, 22 (1):

264 BLUMER S., and JUNIOR POMPEU J.,2005. Performance of citrandarins and others trifoliate hybrids rootstocks in Sao Paulo, Brazil. Rev. Bras. Frutic. vol.27 no.2 Jaboticabal Aug cript=sci_arttext BOUZAYEN, M., FELIX, G., LATCHE, A., PECH, J., and BOLLER, T., Iron: an essential cofactor for the conversion of l-aminocyclopropanelcarboxylicacid to ethylene. Planta, 184: BOYLU-AKYERLİ, C Hematolojide mikroarray kullanımı. (Erişim tarihi: 12 Ocak 2011). BRANCADORO, L., RABOTTI, G., SCIENZA, A., and ZOCCHI, G., Mechanisms of Fe-efficiency in roots of Vitis spp. In response to iron deficiency stress. Plant Soil, 171: BREMNER, J. M Methods of soil analysıs Part 2., Chemical and microchemical properties. E.D. C.A Black., American Society of Agronomy Inc., Publisher Agronomy Series. No.9, Madison, Wisconsin, USA. BRIAT, J. F., CURIE, C. and GAYMARD, F. (2007) Iron utilization and metabolism in plants. Curr. Opin. Plant Biol., 10: BRUMOS, J., COLMENERO-FLORES, J., CONESA, A., IZQUIERDO, P., SANCHEZ, G., IGLESIAS, D., LOPEZ-CLIMENT, M., GOMEZ- CADENAS, A., and TALON, M.,2009. Membrane transporters and carbon metabolism implicated in chloride homeostasis differentiate salt stress responses in tolerant and sensitive Citrus rootstocks. Functional & Integrative Genomics, 9: BUGHIO, N., YAMAGUCHI, H., NISHIZAWA, N.K., NAKANISHI, H. and MORI, S Cloning an iron-regulated metal transporter from rice. Journal of Experimental Botany, 53:

265 BYRNE, D. H., ROUSE, R. E., and SUDAHONO, Tolerance to citrus rootstocks to lime-induced iron chlorosis. Subtropical Plant Science, 47: CAMPBELL, C.W., Rootstocks for the Tahiti lime. Proc. Fla. State. Hort. Soc., 104: CARPENA, O., GUILLEN, G., and SANCHEZ, J. A., La clorosis ferrica del limonero I, Anal. Edaf. Fisiol. Veg., 16: CASTLE, W. S., Choosing a Rootstocks for Citrus. The Citrus Industry, 65 (1): , and NUNNALLEE, J., Screening Citrus Rootstocks and Related Selections in Soil and Solution Culture for Tolerance to Low-iron Stres. Hortscience, 44 (3): , Citrus Rootstocks.Rootstocks for fruit crops, (Rom, Roy C. ed. Carlson, Robert F. ed.) New York, US: Willey Interscience, , MANTHEY, J. A., Screening Citrus Rootstocks for Iron- Deficiency Tolerance. Proc. Fruits, 53: CELKAN,T misi.pdf. (Erişim tarihi: ). CERCOS, M., SOLER, G., IGLESIAS, D. J., GADEA, J., FORMENT, J., and TALON, M.,2006. Global analysis of gene expression during development and ripening of citrus fruit flesh. A proposed mechanism for citric Acid utilization. Plant Molecular Biology, 62(4-5): Epub Aug 1. CHANEY, R. L., BROWN, J. C., and TIFFIN, L. O., Obligatory reduction of ferric chelates in iron uptake by soybeans. Plant Physiology, 50: CHAUMONT, F., MOSHELION, M., DANIELS, M. J.,2005. Regulation of plant aquaporin activity. Biology of the Cell, 97:

266 CHOULIARAS, V., DIMASSI, K., THERIOIS I., MOLASSIOTIS, A., and DIAMANTIDIS, G., 2004 a. Root-reducing capacity, rhizosphere acidification, peroxidase and catalase activities and nutrient levels of Citrus taiwanica and Citrus volkameriana seedlings, under Fe deprivation conditions, Agronomie, 24: 1-6., THERIOIS, I., MOLASSIOTIS, A., PATAKAS, A., and DIAMANTIDIS, G., 2004 b. Effect of iron deficiency on gas exchange and catalese and peroksidase activity in citrus. Journal of Plant Nutrition, 27(12): CHOULIARAS, V, THERIOIS, I., MOLASSIOTIS, A., PATAKAS, A., and DIAMANTIDIS, G., 2004c. Iron chlorosis in grafted sweet orange (Citrus sinensis L.) plants:physioloigical and biochemical responses. Biologia Plantarum, 48(1): , THERIOS, I.,ANGELOS P., MOLASSIOTIS A.N., ANTIGONİ M.., and PAPAVLASOPOULOS A., 2004d. The effect of iron deficiency and biocarbonate treatments on physiological and biochemical parameters in Citrus, Agro Thesis 2 (1): CINELLI, F., and LORETI, F., Evaluation of some plum rootstocks in relation to lime-induced chlorosis by hydroponic culture Proceedings of the 1st Internatıonal Symposium on Rootstocks for Deciduous Fruit Tree Species. Vols 1 and 2 Book Series: Acta Horticulturae, Issue: 658: CLAM, Erişim tarihi: 18 Haziran COLLA, G., ROUPHAEL, Y., CARDARELLI, M., SALERNO, A., and REA, E., 2010.The effectiveness of grafting to improve alkalinity tolerance in watermelon. Environmental Experimental Botany, 68: COOPER, W. C., and PCYTSADO, A., Screening citrus seedlings for tolerance to calcareous soils. J. Rio Grande Valley Hon. Soc., 8:

267 , W. C., and PEYNADO, A., A comparison of sour orange and Cleopatra mandarin seedlings on salty and calcareous soils. Proc. Rio Grande Valley Hort. Soc., 7: , W. C, REECE, P. C., and FURR, J. R., Citrus breeding in Florida- Past, Present and Future. Proc. Fla. State Hort. Soc., 75:5-12. CURIE, C., ALONSO, J.M., LE JEAN, M., ECKER, J. R., and BRIAT, J. F.,2000. Involvement of NRAMP1 from Arabidopsis thaliana in iron transport. Biochemical Journal, 347: ÇAKMAK., İ., Activity of Ascorbate-Dependent H202 Scavenging Enzymes and Leaf Chlorosis are Enhancend in Magnesium and Potassium Deficient Leaves, But Nat in Pohsphorus Deficient Leaves. Journal of Experimental Botany, 45: , and MARSCHNER, H., Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase, ascorbate peroxidase and glutatione reductase in bean leaves. Plant Phsiology, 98: , and ENGELS C., Role of Mineral Nutrients in Photosynthesis and Yield Formation. Mineral Nutritiont of Crops, 399: ÇELİK, H., and KATKAT, A.V., Some Parameters in Relation to Iron Nutrition Status of Peach Orchards. Journal of Biological & Environmental Sciences, 1(3): DAVIS, T., JOLLEY, V.,WALSER, R., BROWN, J., and BLAYLOCK, A., Net photosynthesis of Fe-efficient and Fe-inefficient soybean cultivars grown under varying iron levels. J. Plant Nutr. 9, DAŞGAN,Y., Domateste Demir Eksikliğine Dayanıklılığın Morfolojik, Fizyolojik ve Genetiksel Açıdan İncelenmesi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi. Adana.,Y., ÖZTÜRK, L., ABAK, K., and ÇAKMAK, İ., Activities of Iron-Containing Enzmes in Leaves of Two Tomato Genotypes Differing in Their Resistance to Fe Chlorosis. Journal of Plant Nutrition. Vol. 26. Nos. 10 & 11:

268 DAVIES, F.S., and ALBRIGO, L. G., Rootstocks. In: Athern,J., Rees. A. (Eds.), Citrus. CAB International, Wallingford, UK, 254p., T., JOLLEY, V.,WALSER, R., BROWN, J., and BLAYLOCK, A., Net photosynthesis of Fe-efficient and Fe-inefficient soybean cultivars grown under varying iron levels. Journal of Plant Nutrition, 9, DE VOS, C. R., LUBBERDING, H. J., and BIENFAIT, H. F.,1986. Rhizosphere acidification as a response to iron deficiency in bean plants. Plant Physiology, 81: DEL RIO L. A., GOMEZ, M., YANEZ, J., and LOPEZ, G. J., Iron deficiency in pea plants; effect of catalase, peroksidase, chlorophyll, and protein of leaves. Plant and Soil, 49: DELL'ORTO, M., SANTI, S., DE NISI, P., CESCO, S., VARANINI, Z., ZOCCHI, G., and PINTON, R., Development of Fe-deficiency responses in cucumber (Cucumis sativus L.) roots: involvement of plasma membrane H(+)-ATPase activity. Journal of Experimental Botany, 51: DEMİRKESER, H.T., Doğu Akdeniz Bölgesinde Selekte Edilen Tuzcu Turunç Klonlarının Kütdiken Limon Çeşidinin Meyve Verim ve Kalitesi Üzerine Etkileri, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. Yüksek Lisans Tezi. Adana. DİN, M., IBRAHİM M., and KHAN, A. S., Effect of traditional and hybrid rootstock on leaf mineral composition and reproductive characteristics of Kinnow mandarin (Citrus reticulata).international Journal of Agriculture and Biology, 3(4): DÜZGÜNEŞ, O., Bilimsel araştırmalarda istatistik prensipleri ve metodları, Ege Üniversitesi Matbaası, İzmir. ECONOMOS C., and CLAY, W.D., (Erişim tarihi: ). 247

269 EICHERT, A., PEGUERO-PINAB, T., GIL-PELEGRINB, J. J., HEREDIAC, A., Effects of iron chlorosis and iron resupply on leaf xylem architecture, water relations, gas exchange and stomatal performance of field-grown peach (Prunus persica). Physiologia Plantarum, 138: EIDE, D., BRODERIUS, M., FETT, J., GUERİNOT, M. L.,1996. A novel ironregulated metal transporter from plants identified by functional expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: EISENSTEIN, R. S., and BLEMİNGS, K. P.,1998. Iron regulatory proteins, iron responsive elements and iron homeostasis. Journal of Nutrition, 128, EL-KASSAS, S. E., Effect of iron nutrition on the growth, yield, fruit quality, and leaf composition of seeded balady lime trees grown on sandy calcerous soils. Journal Plant Nutrition, 7: EPPO/CABI (1997) Datasheets on Quarantine Pests: Toxoptera citricidus. In Quarantine Pests for Europe, edition 2nd edn: CAB International, Wallingford, (GB). EYÜPOĞLU, F., and KURUCU, N., Plant Available Trace lron, Zinc, Manganese and Copper in Turkish Soils. Ed.: J. Ryan.Accomplishments and Future Challenges in Dryland Soil Fertility Research in the Mediterranean Area. ICARDA book, FANG, D. Q., FEDERICI, C. T., and ROOSE, M. L., A high-resolution linkage map of the citrus tristeza virus resistance gene region in Poncirus trifoliata (L.) Raf. Genetics, 150: FAO, FERGUSON, L., SACOVICH, N., and ROOSE, M., California citrus rootstocks. Univ. Calif. Pub, FERNANDEZ, V., DEL RIO, V., ABADIA, J. and ABADIA, A.,2006. Foliar iron fertilization of peach (Prunus persica (L.) Batsch): Effects of iron compounds, surfactants and other adjuvants. Plant and Soil, 289,

270 FERRAREZI, R. S., BATAGLIA., O. C, FURLANI, R. P.,and SCHAMMASS, E. S., Iron Sources For Citrus Rootstock Development Grown On Pine Bark/Vermiculite Mıxed Substrate. Sci. Agric. (Piracicaba, Braz.), 64 (5): , September/October. FORD, H. W Rootstocks for Spreading Decline Araes. Citrus station Mimeo Report CES. Lake Alfred, Florida. 66 (11): 1-7. FORMENT, J., GADEA, J., HUERTA, L., ABIZANDA, L., AGUSTI, J., ALAMAR, S., et al.: Development of a citrus genome-wide EST collection and cdna microarray as resources for genomic studies. Plant Molucular Biology, 57: FORNER-GINER, M. A., LLOSA, M. J., CARRASCO, J. L., PEREZ-AMADOR, M. A., NAVARRO, L., and ANCILLO, G., Differential gene expression analysis provides new insights into the molecular basis of iron deficiency stress response in the citrus rootstock Poncirus trifoliata (L.) Raf. Journal of Experimental Botany, 61 (2): , M.A., ALCAIDE, A., PRIMO-MILLO, E., and FORNER J.B., Performance of Navelina orange on 14 rootstocks in Northern Valencia (Spain), Sci. Hortic.: Amsterdam 98, FU, C. H., CHEN, C. L., GUO, W. W., DENG, X. X., GISH, AFLP and PCR RFLP analysis of an intergeneric somatic hybrid combining Gou tou sour orange and Poncirus trifoliata. Plant Cell Reports 23: GARDNER, F. E., and HORANIC, G. E., 1961 a. A Comparative Evaluation of Rootstocks for Valencia and Parson Brown Oranges on Lakeland Fine Sand. Proc. Florida Sta. Gardner, F.E. and G.E. Horanic, 1961 b. Evaluation of Citrus Rootstocks for Florida. Citrus and Vegetable Magazine, 24 (10): 12, 26, 27, 30. GAYMARD, F., BOUCHEREZ, J., and BRIAT, J. F., Characterization of a ferritin mrna from Arabidopsis thaliana accumulated in response to iron through an oxidative pathway independent of abscisic acid. Biochemical Journal, 15:

271 GEORGIOU, A., and GREGORIOU, C., Growth, yield and fruit quality of Shamouti orange grown on fourteen rootstocks in Cyprus. Scientia Horticulturae, 80: , Evaluation of rootstocks for Clementine mandarin in Cyprus, Scientia Horticulturae 93: , Evaluation of rootstocks fort he Cyprus local lemon variety Lapithkiotiki. Sci. Hortic., 123: GIRITCH, A., HERBIK, A., BALZER, H.J., GANAL, M., STEPHAN, U.W., and BAUMLEIN, H.,1997. A root-specific iron-regulated gene of tomato encodes a lysyl-trna-synthetase-like protein. European Journal of Biochemistry, 244: GOGORCENA, Y., ABADIA, J., and ABADIA, A., A New technique for screening iron-efficient genotypes in peach rootstocks: Elicitation of root ferric chelate reductase by manipulation of external iron concentrations. Journal of Plant Nutrition, 27: 1-5. GUERINOT, M. L., and YI, L., "Iron: Nutritious, noxious, and not readily available. " Plant Physiology, 104, GÜZEL, N., GÜLÜT, K.Y., ve BÜYÜK, G., 2004, Toprak Verimliliği ve Gübreler- Bitki Besin Elementleri Yönetimine Giriş, Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Yayınları 2. baskı, 654 sayfa. HALL, P. B., and GUERINOT, M. L., The role of ZIP family members in iron transport. (In: Barton LL, Abadía J (eds), Iron Nutrition in Plants and Rhizospheric Microorganisms) Springer, Dordrecht, the Netherlands, HAMZE, M., RYAN, J., and ZAABOUT, N., Screening of citrus rootstocks for lime-induced chlorosis tolerance. Journal of Plant Nutrition, 9: HANSEN, N. C., HOPKINS, B. G., ELLSWORTH, J. W., and JOLLEY, V. D., Iron nutrition in field crops. (In: Barton LL, Abadía J (eds), Iron Nutrition in Plants and Rhizospheric Microorganisms), Springer, Dordrecht

272 HAWKESFORD, M. J., Sulphur. In Plant Nutritional Genomics (eds M.R.Broadley & P.J.White), p Blackwell Publishing, Oxford, UK. HELL, R., and STEPHAN, U. W.,2003. Iron uptake, trafficking and homeostasis in plants. Planta, 266: HILDEBRAND, D. F.,1989. Lipoxygenases. Plant Physiology., 76: HOSEIN, I., Citrus Rootstocks in the Caribbean. Citrus Res. Univ. West Indies Bulletin. St. Agustine, Trinidad and Tobago. 15: 1-5. HURLEY, A., WALSER, R., DAVIS, T. and BARNEY, D Net photosynthesis, chlorophyll, and foliar iron in apple trees after injection with ferrous sulfate. HortScience, 21: HISADA, S., AKIHAMA, T., ENDO, T., MORIGUCHI, T., and OMURA, M., Expressed sequence tags of Citrus fruit during rapid cell development phase, Journal of the American Society for Horticultural Science, 122 (6): HUTCHISON, D.J /89-91%20%28HUTCHISON%29.pdf. (Erişim tarihi: 11 Ocak 2011). INSKEEP, W. P., and BLOOM, P. R., Effects of soil moisture on soil pco2, soil solution bicarbonate, and iron chlorosis in soybeans. Published in Soil Sci Soc Am J., 50: ITURBE-ORMAEXTE, I., MORAN, J. F., ARRESE-IGOR, C., GOGORCENA, Y., KLUCAS, R. V. and BECANA, M., Activated oxygen and antioxidant defenses in iron deficient pea plants. Plant, Cell & Environment, 18: JACKSON, L.K., Citrus Rootstocks. The Citrus Industry, 66 (9): JACOBY, M., WANG, H. Y., REIDT, W., WEISSHAAR, B., BAUER, P., FRU (BHLH029) is required for induction of iron mobilization genes in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett 577:

273 JAVOT, H., and MAUREL, C., The role of aquaporins in root water uptake. Annals of Botany 90, JELALI, N., WISSAL, M.S., DELL ORTO, M., ABDELLY, C., GHARSALLI, M., and ZOCCHI, G., Changes of metabolic responses to direct and induced Fe deficiency of two Pisum sativum cultivars, Environmental Experimental Botany, 68, JIN, C. W., CHEN, W. W., MENG, Z. B., and ZHENG, S. J., 2008, Iron Deficiencyinduced Increase of Root Branching Contributes to the Enhanced Root Ferric Chelate Reductase Activity. Journal of Integrative Plant Biology, 50 (12), JUNIOR POMPEU, J., and BLUMER, S.,2009. Trifoliate hybrids as rootstocks for sweet orange 'Valência'. Pesq. agropec. Bras., 44 (7): KACAR, B., ve KATKAT, A. V., Bitki Besleme. Uludağ Üniversitesi Güçlendirme Vakfı, 595 sayfa., KATKAT, A. V., ve ÖZTÜRK, Ş., Bitki Fizyolojisi. Uludağ Üniversitesi Güçlendirme Vakfı, 563 sayfa., ve KATKAT, B Bitki Besleme. (2.Basım). Nobel Yayın No:849, 595 sayfa., ve İNAL, A., Bitki Analizleri. Nobel Yayınları No: 1241, 892 sayfa., ve KATKAT, V.,2009. Bitki Besleme. Nobel Kitabevi. 4. Baskı, 659 sayfa. KAPLANKIRAN, M Bazı turunçgil anaçlarının doğal hormon, karbonhidrat ve bitki besin madde düzeyleri ile büyümeleri arasındaki iliskiler üzerinde arastırmalar. Doktora Tezi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, 151 sayfa, Adana. KESKİN,N., Yılında Adana Koşullarında Üç Değişik Harçta Yetiştirilen 6 Önemli Turunçgil Anacının Gösterdikleri Çimlenme, Büyüme Durumları ve Bu Koşullara Bağlı Olarak Yapısal Özellikleri. Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Yetiştirme ve Islahı Bölümü.YL 006. Adana. s

274 KHAN, I. A., AND KENDER, W. J., Citrus Breeding: Introduction and Objectives. Citrus genetics, breeding and biotechnology.edited by I. Khan.www. cabi.org. KOPRIVA, S., BUCHERT, T., FRITZ, G., SUTER, M., WEBER, M., BENDA, R., SCHALLER, J., FELLER, U., SCHURMANN, P., SCHUNEMANN, V., TRAUTWEIN, A. X., KRONECK, P. M., and BRUNOLD, C.,2001. Plant adenosine 50-phosphosulfate reductase is a novel iron sulfur protein. The Journal of Biological Chemistry, 276: , Regulation of sulfate assimilation in Arabidopsis and beyond. Annual Botany, 97: , FRITZEMEIER, K., WIEDEMANN, G., and RESKI, R.,2007. The putative moss 30-phosphoadenosine-50-phosphosulfate reductase is a novel form of adenosine-50-phosphosulfate reductase without an iron sulfur cluster The Journal of Biological Chemistry, 282: KÖSE, K., (Erişim tarihi: 14 Mart 2011). KOSEOGLU, A., Effect of iron chlorosis on mineral composition of peach leaves. Journal of Plant Nutrition, 18: KORCAK, R.F., Iron deficiency chlorosis. Hortc. Rev. 9, KSOURI, R.,MIRAH, S.,GHARSALLI, M., and LACHAAL, M.,2006. Biochemical Responses to True and Bicarbonate-Induced Iron Deficiency in Grapevine Genotypes. Journal of Plant Nutrition, 29 (2): (11). LANDSBERG, E. C., Organic acid synthesis and release of hydrogen ions in response to Fe deficiency stress of mono- and dycotiledonous plant species. Journal of Plant Nutrition, 3: LANQUAR, V., LELIEVRE, F., BOLTE, S., HAMES, C., ALCON, C., NEUMANN, D., VANSUYT,G., CURIE, C., SCHRODER, A., KRAMER, U., BARBIER-BRYGOO, H. and THOMINE, S., Mobilization of vacuolar iron by AtNRAMP3 and AtNRAMP4 is essential for seed germination on low iron. Embo J., 24:

275 LARBI, A., ABADIA, A., ABADIA, J., MORALES, F., Down co-regulation of light absorption, photochemistry, and carboxylation in Fe deficient plants growing in different environments. Photosynthesis Research., 89: , MORALESA, F., ABADIA, A., and ABADIA, J., Changes in iron and organic acid concentrations in xylem sap and apoplastic fluid of iron-deficient Beta vulgaris plants in response to iron resupply. Journal of Plant Physiology, 167 (4) : LEGAZ, F., SERNA, M. D., PRIMO-MILLO, E., and MARTIN, B.,1992. Leaf spray and soil application of Fe-chelates to Navelina orange trees. Proc. Int. Soc. Citriculture, 2, LEUSTEK, T., MARTIN, M. N., BICK, J. A., DAVIES, J. P., Pathways and regulation of sulfur metabolism revealed through molecular and genetic studies. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 51: LI, L., CHENG, X., and LING, H. Q.,2004. Isolation and characterization of Fe(III)- chelate reductase gene LeFRO1 in tomato. Plant Molecular Biology, 54: LINDSAY, W.L., and SCHWAB, A.P., The chemistry of iron in soils and its availability to plants. Journal of Plant Nutrition, 5: LOPEZ-MILLAN A. F., MORALES, F., ANDALUZ, A., GOGORCENA, Y., ABADIA, A., DE LAS RIVAS, J., and ABADIA, J., Protective mechanisms in roots of iron deficient sugar beet: changes in carbon assimilation and oxygen use. Plant Physiology, 124: F, MORALES F., GOGORCENA Y., ABADIA A. and ABADIA J., Metabolic responses in iron deficient tomato plants. Journal of Plant Physiology, 166: LOUZADA, E., DEL RIO, H. S., SETAMOU, M., WATSON, J. W.,and SWIETLIK, D. M., Evaluation of citrus rootstocks for the high ph, calcareous soils of South Texas. Euphytica, 164:

276 LUCENA J. J., Effects of bicarbonate, nitrate and other environmental factors on iron deficiency chlorosis. A review. Journal of Plant Nutrition, 23(11-12): MA, C. H., TANABE, K., ITAI, A., TAMURA, F., TENG, Y. W., CHUN, J. P.,2006. Responses of two Asian pear rootstocks (Pyrus spp.) to Fedeficiency chlorosis induced by addition of bicarbonate to nutrient solution. Journal of the Japanese Society For Horticultural Science, 75(3): MACHOLD, O.,1968. Einfluss der ernährungsbedingungen auf den zustand des eisens in den blättern, den chlorophyllgehalt und die katalase, sowie peroxidaseaktivität. Flora, 159: 1-25., and SCHOLZ, G., Iron status and chlorophyll synthesis in higher plants. Naturwiss. 56: MAHDIEH, M., MOSTAJERAN, A., HORIE, T., and KATSUHARA, M., Drought stress alters water relations and expression of PIP-type aquaporin genes in Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Physiol, 49: MANTHEY, J. A., McCOY, D.L., and CROWLEY, D.E., Stimulation of rhizosphere iron reduction and uptake in response to iron deficiency in Citrus rootstock. Plant Physiol. Biochem. 32, MARSCHNER, H. V., RÖMHELD, V., HORST, W. J., and MARTIN, P., Root-induced changes in the rhizosphere: importance for the mineral nutrition of plants. Z. Pflanzenernaehr Bodenk.,149: , and RÖMHELD, V., Strategies of plants for acquisition of iron. Plant Soil, 165: , Mineral Nutrition of Higher Plants.2nd Ed. Academic Press Inc., San Diego, USA. MATHERON, M. E.; WRIGHT, G. C., and PORCHAS, M., Resistance to Phytophthora citrophthora and P. parasitica and nursery characteristics of several citrus rootstocks. Plant Disease, 82: MAXWELL, N. P., and WUTSCHER, H. K., Yield, fruit size, and chlorosis of grapefruit on 10 rootstock. HortScience, 11:

277 MENGEL, K., and.kirkby, E. A., Principles of Plant Nutrition. International potash institute. Bern - Switzerland., and BÜBL, W., Verteilung von Eisen in Blättern von Weinreben mit HCO3 induzierter Fe-Chlorose. Z. Pflanzenemähr. Bodenkd., 146: , BREININGER, M. T., and BÜBL, W., Bicarbonate, the most important factor inducing chlorosis in vine grapes on calcareous soil. Plant and Soil, 81: , and GEURTZEN, G., Iron chlorosis on calcareous soils. Alkaline nutritional condition as the cause for the chlorosis. Journal of Plant Nutrition, 9: , Iron availability in plant tissues, Iron chlorosis on calcareous soils. Plant Soil, 165: , KIRKBY, A., KOSEGARTEN, H., and APPEL, T., Principles of Plant Nutrition (fifth ed.), Kluwer Academic Publishers, MOHAMMAD, M. J., NAJIM, H., and KHRESAT, S., Nitric Acid- and O- Phenanthroline-Extractable Iron for Diagnosis of Iron Chlorosis in Citrus Lemon Trees. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 29(7-8): MOLASSIOTIS A, TANOU G, DIAMANTIDIS G., PATAKAS, A., and THERIOS, I., Effect of 4-month Fe deficiency exposure on Fe reduction mechanism, photosynthetic gas exchange, chlorophyll fluorescence and antioxidant defense in two peach rootstocks differing in Fe deficiency tolerance. Journal of Plant Physiology, 163: MOOG, P. R., and BRÜGGEMANN, W., Iron reductase systems on the plant plasma membrane - A review. Plant Soil, 165: MOONEY, P., and HARTY, A., Citrus tristeza virus. The Orchardist. (Erişim tarihi: ). 256

278 MORALES, F., ABADIA, A., BELKHODJA, R., and ABADIA, J.,1994. Iron deficiency-induced changes in the photosynthetic pigment composition of fieid-grown pear (Pyrus communis L.) leaves. Plant, Cell and Environment 17: , GRASA, R., ABADIA, A.,and ABADIA, J., Iron chlorosis paradox in fruit trees. Journal of Plant Nutrition, 21: MORENO, P., PIQUER, P., PINA, J. A., JUAREZ, J., CARBONELL, E.,and NAVARRO, L., Preliminary Data on Tolerance of Gou Tou Orange to. Tristeza in Spain. Proceedings of the XII IOCV conference, November. New Delhi, India. MORTENSEN, E Citrus rootstocks in the Winter Garden area of Texas. Proc, 8th Ann Rio Grande Valley Hort Inst, p MUKHERJEE, I., CAMPBELL, N. H., ASH, J. S., and CONNOLLY E. L.,2006. Expression profiling of the Arabidopsis ferric chelate reductase ( FRO ) gene family reveals differential regulation by iron and copper. Planta, 223 (6): NENOVA, V. R., Growth and photosynthesis of pea plants under different iron supply. Acta Physiologiae Plantarum, 31 (2): NIKOLIC, M., RÖMHELD, V., and NEUMANN, G., Does the leaf apoplast modulate the occurrence of iron deficiency chlorosis in Vicia faba L.? In Ecology and Physiology. Cultural Practices: Proceedings of 2nd Balkan Symposium on Field Crops, June 1998, (Novi Sad Yugoslavia. Ed. S Stamenkovic). p , and RÖMHELD, V., Mechanism of Fe uptake by the leaf symplast: Is Fe inactivation in leaf a cause of Fe deficiency chlorosis? Plant and Soil 215: NISHIKAWA, F., ENDO, T., SHIMADA,T., FUJII, H., SHIMIZU, T., KOBAYASHI, Y., ARAKI, T., and OMURA, M.,2010. Transcriptional changes in CIFT-introduced transgenic trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.) Tree Physiology, 30(3):

279 NORVELL, W. A. and ADAMS, M. L., Screening soybean cultivars for resistance to iron-deficiency chlorosis in culture solutions containing magnesium or sodium bicarbonate. Journal of Plant Nutrition, 29: OLLAT, N., LABORDE, B., and NEVEUX, M., DIAKOU-VERDIN, P., RENAUD, C., MOING, A., Organic acid metabolism in root of various grapevine (Vitis) rootstocks submitted to iron deficiency and bicarbonate. Journal of Plant Nutrition, 26: OLSEN, R. A., and BROWN, J. C., Factors related to iron uptake by dicotyledonous and monocotyledonous plants - ph and reductant. Journal of Plant Nutrition, 2: , CLARK, R. B., and BENNETT, J. H., The enhancement of soil fertility by plant roots. American Scientist, 69: O'ROURKE, J. A., CHARLSON, D. V., GONZALEZ, D. O., VODKIN, L. O., GRAHAM, M. A., CIANZIO, S. R., GRUSAK, M. A., and SHOEMAKER, R. C., Microarray analysis of iron deficiency chlorosis in near-isogenic soybean lines. Biomed Central (BMC) Genomics, 8:476. OWEN, C. A., SPANO, T., HAJJAR, S. E,TUNARU, V., HARYTUNYAN, S., FILALI, L., KALAITZIS, P., Expression of genes for alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase in petals of cut carnation flowers in response to hypoxia and anoxia. Physiologia Plantarum, 122: ÖNER C., Genetik kavramlar. 6. baskı. Ankara Palme Yayıncılık, s:816. ÖZCAN, M., ve ULUBELDE, M., Turunçgil Anaçları. Tarım Orman ve Köy İşleri Bakanlığı Proje ve Uygulama Genel Müdürlüğü. Ege Bölge Zirai Araş. Ens. Yayınları No:50, Menemen, 37 sayfa. ÖZDEMİR, G., Farklı kireç içerikli topraklarda yetiştirilen asma genotiplerinde değişik uygulamaların Fe alımı üzerine etkilerinin morfolojik ve fizyolojik yönden incelenmesi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Doktora tezi.186 sayfa. 258

280 ., and TANGOLAR, S., Effect of Iron Applications On Grapevine Genotypes Growing In Different Calcareous Soils. Asian Journal of Chemistry. 19(3): ÖZSAN, M., Türkiye turunçgil yetiştiriciliğinin dünyadaki yeri ve önemi. Akdeniz bölgesi bahçe bitkileri yetiştiriciliğinde sorunlar ve çözüm yolları ve yapılması gereken araştırmalar simpozyumu. İncekum, Alanya Antalya, Turkey, sayfa: ÖZKARALI, E., β Talasemi Moleküler Tanısında Klasik Yöntemlerle Mikroarray Yönteminin Karşılaştırılması. Ç.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya Anabilim dalı. 65 sayfa.,adana. ÖZTÜRK, L., YAZICI, M, A., EKER, S., GÖKMEN, Ö.Ö., RÖMHELD, V., and ÇAKMAK, İ, "Glyphosate inhibition of ferric reductase activity in iron deficient sunflower roots", New Phytologist, 177 (4): PEREZ-SANZ, A., ALVAREZ-FERNANDEZ A., LUCENA, J. J., Foliar application of seaweed extract amended with iron as an alternative to synthetic chelates to alleviate iron chlorosis in fruit trees, In Proc. Dahlia Greidinger International Symposium on Fertilization and Enviroments, Haifa, Israel, p PESTANA, M., DAVID, M., VARENNES, A., ABADIA, J., and FARIA, E. A., Responses of Newhall Orange Trees to Iron Deficiency in Hydroponics: Effects on Leaf Chlorophyll, Photosynthetic Efficiency, and Root Ferric Chelate Reductase Activitiy. Journal of Plant Nutrition, 24(10): , DE VARENNES, A., and FARIA, E. A., Diagnosis and correction of iron chlorosis in fruit trees: a review.journal of Food, Agriculture and Environment, 1: , VARENNES, A., ABADIA, J., and FARIA, E. A., Differential Tolerance to Iron Deficiency of Rootstocks Grown in Nutrient Solution. Scientia, 104 (1): SEYDEL, G. Ş., Hemoglobinopatilerin mikroarray yöntemiyle belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi Ç.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Adana. 259

281 RANIERI, A., CASTAGNA, A., BALDAN, B., and SOLDATINI, G. C., Iron deficiency differently affects peroxidase isoforms in sunflower. Journal of Experimental Botany, 52 (354): RAZETO, B., Treatments for iron chlorosis in peach trees. Journal of Plant Nutrition, 5: , and VALDES, G., Fruit analysis as an indicator of the iron status of nectarine and kiwi plant. HortTechnology, 16 (4): , and PALACIOS, J., Fruit Analysıs As An Alternative To Leaf Analysıs For Diagnosing Iron Status Of Avocado Tree. Proceedings VI World Avocado Congress (Actas VI Congreso Mundial del Aguacate), Viña Del Mar, Chile Nov. RENGEL, Z., Breeding Crops for Adaptation to Environments with Low Nutrient Availability, Abiotic Stresses-Plant Resistance Through Breeding and Molecular Approaches, 725: ROBINSON, N. J., PROCTOR, C. M., CONNOLLY, E. L., and GUERINOT, M. L., A ferric-chelate reductase for iron uptake from soils. Nature, 397: ROOSE, M. L., Citrus Rootstock Breeding and Evaulation. (Erişim tarihi: 7 Ocak 2009). ROMBOLA, A. D., DALLARI, S., QUARTIERI, M., AMMARI, T., SCUDELLARI, D., TAGLIAVINI, M., Effect of foliar-applied Fe sources, organic acids and sorbitol on the re-greening of kiwifruit leaves affected by lime-induced iron chlorosis, Acta Hortic., 594, , and TAGLIAVINI, M., Iron nutrition of fruit tree crops. p In Iron Nutrition in Plants and Rhizospheric Microorganisms (L. Barton and J. Abadia Eds.). Springer. RÖMHELD, V, and MARSCHNER, H., Iron deficiency stress induced morphological and physiological changes in root tips of sunflower. Plant Physiology, 53:

282 ., and MARSCHNER, H., Mechanism of iron uptake by peanut plants. Plant Physiology, 71: , and MARSCHNER, H., Evidence for a specific uptake system for iron phytosiderophores in roots of grasses. Plant Physiology, 80: , Different strategies for iron acquistion in higher plants. Physiologia Plantarum, 70: , The chlorosis paradox: Fe inactivation as a secondary event in chlorotic leaves of grapevine. Journal of Plant Nutrition 23(11-12): RYAN, P.R., and DELHAIZE, E., Function and mechanism of organic anion exudation from plant roots. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 52: SABIR A., BİLİR-EKBİÇ H., ERDEM, H., and TANGOLAR., S., Response of four grapevine (Vitis spp.) genotypes to direct or bicarbonate-induced iron deficiency. Spanish Journal of Agricultural Research, 8(3), SAKOVICH, N.J., Lemon Rootstocks for Southern California. Proc. Int. Soc. Nurserymen II. Congress. Riverside, California, SAMUELSON, A. I., MARTIN, R. C., MOK, D. W. and MOK, M. C., Expression of the yeast FRE genes in transgenic tobacco, Plant Physiology, 118, SANTI, S., and SCHMIDT, W., Dissecting iron deficiency-induced proton extrusion in Arabidopsis roots. New Phytologist., 183: SAUNT, J., Citrus Varieties of the World. Sinclair Int. Limited, Norwich, England. SCHULZ, R., and MARSCHNER, H., Aufnahme und Verlagerung von Eisen bei Bohnenpflanzen in Abhängigkeit von Transpiration und Stoffwechselaktivität. Zeitschrift für Pflanzenernährung und Bodenkunde. 124 (1): SCHMIDT, W., Iron Stress Responses in Roots of Strategy I Plants. Iron Nutrition in Plants and Rhizospheric Microorganisms. (Abadia, J., ed. Springer) Dordrecht, the Netherlands, p

283 SECTORANALYSIS:TURKEY.www2.spi.pt/euromedcitrusnet/sector_analysis_rep ort.asp. SEKI, M., NARUSAKA. M., ISHIDA. J., NANJO. T., FUJITA. M., OONO. Y., KAMIYA. A., NAKAJIMA. M., ENJU. A., SAKURAI. T., SATOU. M., AKIYAMA. K., TAJI. T., SHINOZAKI -YAMAGUCHI. K., CARNINCI. P., KAWAI. J., HAYASHIZAKI. Y., and SHINOZAKI. K., Monitoring the Expression Profiles of Arabidopsis Genes Under Drought, Cold and High-Salinity Stress Using a Full-Lenght cdna Microarray. The Plant Journal, 31(3), SEVILLA, F., DEL RIO, L., HELLIN, E., Superoxide dismutases from a citrus plant: presence of two iron-containing isoenzymes in leaves of lemon trees (Citrus limonum L.). J Plant Physiology, 116: SHIMADA, T., KITA, M., ENDO, T., FUJII, H., TAKANORI, U., TAKAYA, M., and OMURA, M., Expressed sequence tags of ovary tissue cdna library in Citrus unshiu. Marc. Plant Science, 165, , FUJII, H., ENDO, T., YAZAKI, J., KISHIMOTO, N.,SHIMBO, K.,, KIKUCHI, S., and M. OMURA, M., Toward comprehensive expression profiling by microarray analysis in citrus: monitoring the expression profiles of 2213 genes during fruit development. Plant Science, 168 (5): SITES, J. W., LEONARD, C.D., and STEWARD, I., Citrus fruit quality as affected by iron deficiency and its correction, In Florida Agr. Sta. Ann. Rep., p SÖNMEZ, S. ve KAPLAN, M., Korkuteli ve Elmalı Yörelerindeki Elma Ağaçlarında Görülen Demir Klorozu ile İlişkili Olan Toprak Özelliklerinin Araştırılması, Türkiye 3. Ulusal Gübre Kongresi, Tarım- Sanayi-Çevre, Ekim 2004, Tokat, s STEWART, I., and LEONARD, C.D., Use of chelates in citrus production in Florida, Soil Science, 1,

284 SUDAHONO, BYRNE D.H., and ROUSE, R.E., Greenhouse screening of citrus rootstocks for tolerance to bicarbonate-induced iron chlorosis. Hortscience 29 (2): ŞAHİN-ÇEVİK, M., Mikroarray Teknolojisi ve Bitkilerde Uygulama Alanları. SDÜ Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 9 (3): 9-13., and MOORE G. A., Two AP2 Domain Containing Genes Isolated From the Cold-Hardy Citrus Relative Poncirus trifoliata are Induced in Response to Cold. Functional Plant Biology, 33(9): TALON, M., GMITTER, F. G. JR.,2008. Citrus Genomics. International Journal of Plant Genomics, 2008: TERRY, N., and ABADIA, J., Function of iron in chloroplasts. Journal of Plant Nutrition, 9: TEWARI, R. K., KUMAR, P., NEETU SHARMA, P.N., Signs of oxidative stress in the chlorotic leaves of iron starved plants. Plant Science, 169: THIMM, O., ESSIGMANN, E., KLOSKA, S., ALTMANN, T., and BUCKHOUT, T. J., Response of Arabidopsis to iron deficiency stress as revealed by microarray analysis Plant Physiology, 128 (2): THOMINE, S., WANG, R., WARD, J. M., CRAWFORD, N. M., and SCHROEDER, J. I.,2000. Cadmium and iron transport by members of a plant transporter gene family in Arabidopsis with homology to NRAMP genes. Proc Natl Acad Sci USA., 97: TORRES, R. M., BARRA, J. D. E., GONZALES, G. A., ALCARAZ, J. R., and LEON, M. T. C., Morphological changes in leaves of Mexican lime affected by iron chlorosis. Journal of Plant Nutrition, 29: TREEBY, M., and UREN, N., Iron deficiency stress responses amongst citrus rootstock. Z.Pflanzenemahr. Bodenk, 56: TÜRKAN, İ., 2008.(Ed. Lincoln Taiz ve Eduardo Zeiger) Bitki Fizyolojisi, Palme yayıncılık, Ankara. TUZCU, Ö., Turunçgillerde Anaç ve Sorunları. Çağdaş Tarım Tekniği, 3:

285 , Bazı Önemli Turunçgil Anaçlarında Değişik Çevre Koşullarının Büyüme Üzerine Etkileri, Düşük Sıcaklıklara Dayanıklılık ve Bununla Elektrotik İletkenlik Oranları Arasındaki İlişkiler. Ç.Ü. Doçentlik Tezi. 161 sayfa., Turunçgil Ders Notları (yayımlanmamış)., Türkiye de Yetiştirilen Başlıca Turunçgil Çeşitleri. Akdeniz İhracatçı Birlikleri Yayınları, Mersin, 71 sayfa., Turunçgil Dersi Notları, Yayımlanmamış., ve GÖKSEDEF, O., Bazı önemli turunçgil anaçları ve Citrus cinsine giren türler ile Citropsis gilletiana Swing. ve Aeglopsis chevalieri Swing.'nin kış dinlenme döneminde Phytophthora citrophthora (Smith and Smith) Leonian'a dayanıklılıkları üzerinde araştırmalar. Doğa Bilim Dergisi, 7 (1): , Turunçgil Ders Notları. Yayımlanmamış. VALLEJO GONZALEZ, E. B., MORALES, F., CISTUE, L., ANUNCIACION, A., and ABADIA, J., Iron Deficiency Decreases the Fe(III)-Chelate Reducing Activity of Leaf Protoplasts. Plant Physiology, 122: VASCONCELOS, M., and GRUSAK, M. A., Status and future developments involving plant iron in animal and human nutrition. (In: Barton LL, Abadia J, eds). Iron nutrition in plants and rizospheric microorganisms. Dordrecht, The Netherlands: Springer, VERT, G., GROTZ, N., DEDALDECHAMP, F., GAYMARD, F., GUERINOT, M. L., BRIAT, J. F., and CURIE, C., IRT1, an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and plant growth. Plant Cell, 14: VON WIREN, N., RÖMHELD, V., MOREL, J. L., GUCKERT, A., and MARSCHNER, H., Influence of microorganisms on iron acquisition in maize. Soil Biology & Biochemistry, 25, WALLIHAN, E. F., GARBER, M. J. and SHARPLESS, R. G., Soil temperature and iron uptake in young Citrus plants. HortScience, 9:

286 WATERS, B.M., BLEVINS, D.G., and EIDE, D.J., Characterization of FRO1, a pea ferric-chelate reductase involved in root iron acquisition. Plant Physiology, 129: WRIGHT, G.C., Results of scion and rootstock trials for citrus in Arizona, Citrus Research Report. College of Agriculture Series P-113. Tucson, AZ. WU, W. Z., PENG X. L., WANG, D., Isolation of a Plasmalemma Aquaporin Encoding Gene StPIP1 from Solanum tuberosum L. and Its Expression in Transgenic Tobacco. Agricultural Sciences in China, 8 (10): WUTSCHER, H. K., and OLSEN, E. O., Leaf nutrient levels, chlorosis, and growth of young grapefruit trees on 16 rootstocks grown on calcareous soil. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 95(3): YADAV, D.V., and SINGH, K., Lime induced iron chlorosis in sugarcane Fert. Res., 16: YELENOSKY, G., Cold hardiness in Citrus. Hortic Rev., 7: YEŞİLOĞLU, T., Doğu Akdeniz Bölgesinde Selekte Edilen Turunç Klonlarının Morfolojik Özellikleri, Çukurova Üniversitesi Bahçe Bitkileri Anabilimdalı. Yüksek Lisans Tezi, yayımlanmamış., EMEKSİZ, F., TUZCU, Ö., ALEMDAR, T., National Citrus, İNCESU, M., Turunç Anacında Demir Alımı ve Mevcut Problemleri, Bölgemize Uygun Turunçgil Anaçlarının Demir Açısından Değerlendirilmesi. Ekin Dergisi. Mart (27): YILDIRIM B., Değişik turunçgil anaçlarının Washington navel, valencia, moro ve yafa portakal çeşitlerinin meyve verim ve kalitesi üzerine etkileri. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilimdalı, Yüksek Lisans Tezi, 193 sayfa, Adana., Değişik Anaçlar Üzerine Aşılı Washington Navel Portakalında Verimlilik ile Karbonhidrat Düzeyleri Arasındaki İlişkiler. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilimdalı, Doktora Tezi, 416 sayfa, Adana. 265

287 ZAHARIEVA, T. B., GOGORCENA, Y., ABADIA, J., Dynamics of metabolic responses to iron deficiency in sugar beet roots. Plant Science, 166: ZEKRI, M., and OBEREZA, T. A., Micronutrient deficiencies in citrus: Iron, zinc and manganese. (Erişim tarihi: 15 Aralık 2010). ZHANG, C., RÖMHELD, V. and MARSCHNER, H. (1995) Distribution pattern of root-supplied 59 iron in iron-sufficient and iron-deficient bean plants. Journal of Plant Nutrition, 18: ZHENG, S.J., TANG, C.X., ARAKAWA, Y., and MASAOKA, Y., The responses of red clover (Trifolium pratense L.) to iron deficiency: a root Fe(III) chelate reductase. Plant Science, 164: ZIEGLER, L.W., and WOLFE, H.S., Citrus Growing in Florida, The University Presses of Florida, Gainesville. ZOCCHI, G., Metabolic changes in iron-stressed dicotyledonous plants.( In: Barton LL, Abadia J, editors.) Iron nutrition in plants and rhizospheric microorganisms. Springer; p , NISI, P., DELL'ORTO, M., ESPEN, L and GALLINA, P. M., Iron deficiency differently affects metabolic responses in soybean roots. Journal of Experimental Botany, 58 (5):

288 ÖZGEÇMİŞ 05/06/1979 yılında Adana da doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini Adana da tamamladıktan sonra, 1996 yılında Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri bölümünde lisans eğitimine başladı yılında Ziraat Mühendisi ünvanı ile mezun oldu yılında Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Yüksek Lisans programına başladı ve 2001 yılında Çukurova Üniversitesi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Araştırma görevlisi kadrosuna atandı yılları arasında yüksek lisansını tamamladıktan sonra, doktora öğrenimine başladı. Hala aynı bölümde görev yapmaktadır. 267