MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI GÜZ DÖNEMİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI 6.HAFTA DERS NOTLARI GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ Sayfa 1 / 10

2 MUTASYON Mutasyon; DNA dizilerinde kendiliğinden ya da belli dalga boylarındaki ultraviyole radyason, çeşitli mutajenik kimyasallar nedeniyle oluşan değişikliklerdir. Başka bir ifadeyle mutasyon, kalıtsal materyalin miktar, organizasyon veya içeriğindeki herhangi bir değişikliği belirtmekte kullanılır. Mutasyonlar birkaç şekilde sınıflandırılabilirler. Birinci ayırım mutasyonların spontan veya uyarılmış olmasına göre olan ayırımdır. Spontan mutasyonlar bilinen bir nedeni olmaksızın spontan olarak (kendiliğinden) meydana gelen mutasyonlardır. DNA replikasyonu sırasındaki hatalardan veya DNA molekülü içinde bulunan nükleotitin kendiliğinden değişimi sonucu oluşabilirler. Oluşumları ile ilgili olarak hiçbir özgün etken yoktur ve genellikle genlerin nükleotit dizilerinde rastgele olan değişikler olarak kabul edilirler. Bu mutasyonların çoğu, genlerin azotlu bazlarının yapısını değiştiren organizmadaki normal kimyasal süreçlerle ilişkilidir. Spontan mutasyonların aksine, herhangi bir yapay faktörün etkisi sonucu oluşan mutasyonlara uyarılmış mutasyonlar ismi verilir. Organizma yaşamı boyunca çeşitli fiziksel, kimyasal ve biyolojik ajanlara maruz kalarak genetik materyalinde hasar meydana gelebilir. Her bir ajan karakteristik mekanizması sayesinde DNA molekülünde spesifik zararlar meydana getirirler. Diğer bir ayırım ise mutasyonların gametik mi yoksa somatik hücrelerde mi olduğuna dair olan ayırımdır. Mutasyonların Meydana Gelme Yolları 1. Baz yer değiştirmeleri (nokta mutasyonlar): -Transisyon: Belli bir pirimidin bir başka primidine veya belli bir pürin bir diğer pürine değişir. -Transversiyon: Purin ve primidinin karşılıklı yer değiştirmesi Sayfa 2 / 10

3 2. Çerçeve kayması mutasyonları: Gen içinde herhangi bir noktaya bir veya daha fazla nükleotitin girmesi (insersiyon) veya çıkması (delesyon) şeklinde ortaya çıkabilir. Tüm üçlü okumayı değiştireceğinden sonuçları zararlı olabilir. DNA da Bu Tip Mutasyonlara Sebep Olan Değişimler 1. Tautomerik değişimler: DNA nın yapısına DNA daki purin ve primidinlerin, tautomerik formlarının (yapısal izomerler) katılması sonucu oluşur. Sonuç bir nokta mutasyonudur. Sayfa 3 / 10

4 2. Baz analogları: Nükleik asit biyosentezi sırasında purin ve primidinler yerine geçebilen moleküllere baz analogları denir ve bunlar genelde mutajenik kimyasallardır. Sonuç yine bir nokta mutasyonudur. 3. Alkilleyici ajanlar: Hardal gazı, etilmetan sülfonat, akridin boyaları gibi bazı kimyasal mutajenler nükleotitlerin kimyasal yapılarına alkil grubu eklerler ve sonuçta DNA sarmalında genişlemeler oluşturarak delesyon ya da eklemelere neden olurlar. Sonuçta çerçeve kayması mutasyonları meydana gelir. Sayfa 4 / 10

5 4. Apurinik bölgeler ve diğer lezyonlar: Sağlıklı bir çift sarmal DNA molekülündeki azotlu bazlardan birinin (sıklıkla guanin ya da adenin) spontan olarak kaybedilmesi ile olur. Glikozidik bağların kaybedilmesi ile oluşan bu bölgelere apurinik bölgeler denir. Yine benzer şekilde hidrojen peroksit ve süperoksit gibi oksijen radikallerinin aktif formları da DNA bazlarına zarar verebilir ve replikasyon sırasında yanlış eşleşmelere neden olabilir. Diğer lezyonlara örnek olarak DNA daki bazların deaminasyona uğraması sonucu oluşan bölgeler de verilebilir. Apurinik bölge oluşumu Deaminasyon Sayfa 5 / 10

6 5. Yüksek enerjili radyasyon: X ışınları, gama ışınları, kozmik ışınlar, UV ışınlarından daha kısa dalga boyuna sahip ancak daha yüksek enerjilidirler. Böylece dokuların derinliklerine kadar girerler ve yollarında karşılaştıkları moleküllerin iyonizasyonuna sebep olurlar. Sonuçta nokta mutasyonları oluşur. 6. Ultraviyole radyasyonu ve timin dimerleri: Özellikle, DNA tarafından kuvvetlice absorblanan UV-C (~260nm.) ve UV-B ışınları, DNA ve diğer biyolojik moleküllerle reaksiyona girerler. Pirimidin dimerleri (T-T, T-C) oluştururlar, bu dimerler replikasyonu ve transkripsiyonu bloke ederler. UV radyasyonunda en öldürücü ve mutajenik dalga boyu 260 A dur. Çünkü bu dalga boyunda DNA da UV ışınının maksimum absorblanması gerçekleşir. İn vitro çalışmalardan öğrenildiğine göre pürinler UV ışınlarına bağlı olan kimyasal değişmelere kısmen dayanıklıdır. Fakat pirimidinlerin en az iki mekanizmayla değişikliğe uğradığı tespit edilmiştir. Bunlardan biri, hidrasyondur (hydration). Bu durumda suyun pirimidinlerdeki 5-6 çift bağlarına ilavesi söz konusudur. Fakat bu reaksiyonun biyolojik bir önemi yoktur. Diğeri ise, pirimidin dimerleşmesidir. Genellikle komşu iki timin dimerleşmeye daha yatkındır. Bu ikinci durum biyolojik ve genetik açıdan önemlidir. Dimerler DNA konformasyonunu bozar ve normal replikasyonu durdurur. Bir bakteri kültürü, öldürücü dozda UV ışığına maruz kaldığında, hücrelerin muhtemel bir canlı kalma olasılığı vardır. Şayet bu canlı kalma olasılığı 0.1 ise, o zaman kültürün %10'u canlı kalacaktır. Canlı kalan bakteri hücrelerine yine aynı doz verilirse, bu hücrelerde canlı kalma olasılığı yine aynı olacaktır. Fakat doz iki katına çıkarılırsa, hücrelerdeki canlı kalma olasılığı muhtemelen 0.1 x 0.1= 0.01 (%1) olacaktır. Sayfa 6 / 10

7 Bakterilerin canlı kalma oranlarını etkileyen bazı faktörler vardır: 1) Kültürün Yoğunluğu: Üreyen kültür çok yoğunsa, bakteri hücrelerinin bazıları diğerleri tarafından "kalkan tipi" korunabilir. Böylece UV ışınlarının tüm hücrelere nüfus etmesi engellenebilir. Bakteri canlı hücre sayımı 1 x 10-8 ml/1'den az ise "kalkan tipi" koruma pratikte önem kazanmaz. Bu durumda bakterileri UV ışınına maruz bırakmak için logaritmik üreme dönemindeki hücreler ile çalışmak daha doğrudur. 2) Sıvı Vasatın Doğal Yapısı: Nutrient broth, tampon çözeltilere nazaran daha fazla UV absorblar. Bu nedenle Nütrient broth'lu bakteri kültürü UV ışınına maruz bırakılınca, UV ışınının etkisi daha az olur. Bunun yanı sıra, UV etkisine bırakılan Nutrient broth'da toksik organik peroksidler oluşabilir. Bu durumda da UV ışınının etkisinin daha uzun sürede gerçekleşmesi söz konusudur. 3) Hücrelerin Fizyolojik Koşulları: UV ışınlarının hedef bölgesi DNA'dır. Çok çekirdekli hücrelerin UV ışınına maruz kalması sonucunda bir çekirdeğin ışınlardan etkilenmediğini varsayarsak, hücrenin yaşama şansı fazla olacaktır. Oysa aynı dozdaki etki, tek çekirdekli hücreye daha fazla zarar verecektir. Bakterilerde UV hasarı sonucu oluşan timin dimerlerinin tamiri için iki mekanizma bulunmaktadır. 1) Işıkta Onarım (Fotoreaktivasyon): UV ışığının etkisiyle DNA da oluşan timin dimerleri arasındaki kovalent bağ, 540 nm dalga boyundaki görünür ışığın etkisiyle aktive olan fotoliyaz enzimi ile direkt olarak kırılır. phr adlı sorumlu gen deoksiriboprimidin fotoliyazı kodlamaktadır. Bu kompleks bir kofaktör olan folik asit ile birleşerek karanlıkta timin dimerine bağlanır. Daha sonra hücre ışık aldığında folik asit ışığı absorblar ve enerjiyi de timin dimeri bağını kırmak için kullanır, daha sonra fotoliyaz DNA üzerinden düşer. Bu şekilde DNA daki hasar doğrudan giderilmiş olur. Enzim bir dimere karanlıkta bağlanabilirken, dimeri kırmak için bir ışık fotonu absorbe etmek zorundadır. Fotoreaktivasyon mekanizması için mutlaka görünür ışığa gereksinim vardır. Görünür ışık, UV radyasyonu ile oluşan DNA hasarını onaran işlemi uyarmaktadır. Karanlıkta onarımın aksine tek bir enzime ihtiyaç vardır. Sayfa 7 / 10

8 2) Karanlıkta onarım; Kesip çıkarma onarımı olarak da adlandırılır. Fotoreaktivasyonun aksine bu onarım mekanizması için görünür ışığa gereksinim yoktur. DNA da timin dimerinin bulunduğu bölgedeki, doğru bazları da içeren yaklaşık 8-12 nükleotidlik kısım uvrabc ekzonükleaz (iki uçtan da kesen) aktivitesi ile kesilir. Kesilen oligonükleotid helikaz II enzimi ile DNA dan uzaklaştırılır. DNA nın hasarlı kısmındaki bu boşluk DNA Polimeraz I enzimi ile karşı iplikçik kalıp olarak kullanılarak doldurulur. Daha sonra iki serbest uç DNA Ligaz enzimi ile birleştirilir. Bu şekilde hasar onarılmış olur. Bu onarım mekanizması sayesinde UV tarafından oluşan primidin dimerleri ve DNA daki büyük lezyonlar onarılır Sayfa 8 / 10

9 DENEYİN YAPILIŞI Araç ve Gereçler Aktif E. coli kültürü Steril seyreltme tüpleri (her biri 900 µl serum fizyolojik (SF) -%0,9 NaCl- içermektedir) Drigalski özesi, beher ve etil alkol Mikropipet ve mikropipet uçları (steril) Yöntem 1) Aktif bakteri kültüründen 100 µl mikropipetle alınarak içerisinde 900 µl serum fizyolojik bulunan tüpe aktarılır. Bu durumda 1 nolu tüpteki bakteri kültürü 10 kat seyreltilmiştir ve bu tüp 10-1 tüpüdür. 2) İkinci seyreltim tüpe 10-1 seyreltim tüpünden 100 µl aktarılır ve kültür 10 kat daha seyreltilmiş olur ve bu tüp de 10-2 tüpüdür. Bu işlem 10-6 ya kadar devam ettirilir. (Seri seyreltim) Sayfa 9 / 10

10 3) 10-5 ve 10-6 seyreltim tüplerinden 5 er adet olmak üzere toplam 10 adet nutrient agar besiyeri içeren petri kabına 100 µl aktararak yayma ekim yapılır. 4) Kontrol grubuna ait 2 adet petri (10-5 ve 10-6 ) direkt inkübasyon için etüve kaldırılır. 5) Deney grubundaki petrilerin yarısına 3 dakika diğer yarısına 5 dk UV ışık uygulanır. 6) UV ışık uygulanan petrilerin yarısı direkt etüvde inkübasyona bırakılırken; diğer yarısı alüminyum folyo ile sarılarak inkübasyona bırakılır. 7) İnkübasyon sonunda oluşan bakteri kolonileri sayılarak kaydedilir Seyreltme 10-6 Seyreltme 1. petri : Kontrol grubu Kontrol grubu 2. petri : 3dk UV aydınlık 3 dk UV aydınlık 3. petri : 8 dk UV aydınlık 8 dk UV aydınlık 4. petri : 3dk UV karanlık 3 dk UV karanlık 5. petri : 8 dk UV karanlık 8 dk UV karanlık Her seyreltme için UV ye maruz bırakılan hücrelerin % ölüm oranlarını aşağıdaki formülle hesaplayınız. Mutant bakterilerin koloni sayısı % Ölüm Oranı= x 100 Kontrol grunundaki bakterilerin koloni sayısı Sonuçlar aşağıdaki sorular cevaplanarak yorumlanır; 1) UV ışık bakterilerde mutasyon oluşturup bakterilerin ölümüne sebep olur mu? 2) UV ışığa maruz kalma süresi arttıkça % ölüm oranı artar mı? 3) Aydınlıkta ve karanlıkta tamir mekanizmalarından hangisi daha etkilidir? Sayfa 10 / 10