BİTKİ PİGMENTLERİNİN İNCE TABAKA KROMOTOGRAFİSİ DİKKAT : Bu çalışmada kullanılan çözücüler kolayca ateş alabildiklerinden, deney süresince her türlü ateşten uzak durulmalıdır. AMAÇ Bu çalışmanın amacı, kalitatif ve kantitatif analizlerin ikisini de kullanarak değişik bitki dokularındaki pigment moleküllerinin tanımlamasını yapılabilmektir. Ispanak yaprakları ve havuçtan pigmentler ekstrakte edilecek ve sonra ince tabaka kromotografisinde ( TLC ) bu pigmentler ayırt edilecektir. Böylece, bitki dokularında bulunan mevcut pigmentler tanımlanacaktır. ÖN BİLGİLER PİGMENTLER Pigmentler polar ya da nonpolar olabilir. Polar pigmentler suda çözünür, nonpolar pigmentler organik çözücülerde çözünürler. Polar pigmentler çoğunlukla merkezi vakuolde ; nonpolar pigmentler ise plastid membranında bulunurlar. Plastidlerin yeşil olanları kloroplast, farklı renkler de olup da yeşil olmayanları kromoplast ve renksiz olanları ise lökoplast adını alır. Kromoplast ve lökoplastlar kloroplastlardan gelişirler ya da protoplastidler olarak adlandırılan öncüllerden gelişirler. Bütün yüksek bitkilerin kloroplastları fotosentezde ışık enerjisini etkin şekilde absorblayan iki temel pigmente sahiptir. Bunlar yeşil renkli klorofiller (a,b,c,d) ve kırmızı, sarı ya da portakal renkli karotenoidlerdir. Klorofil moleküllerinden en yaygın olanları klorofil a ve b molekülleridir. Klorofiller; fotosentez için gerekli güneş ışınlarını toplayan pigmentlerdir. Klorofil molekülü, porfirin ve fitol yan zinciri olmak üzere iki kısımdan oluşur. Porfirin, azot (N) içeren dört pirol halkasının N atomları yardımı ile ortada Mg 2+ ile şelat oluşturacak şekilde birbirleri ile bağlanması sonucu oluşmuş bir yapıdır. Porfirinin dördüncü halkası 20 karbon atomu içeren bir alkol (fitol) ile esterleşmiştir. Klorofil molekülünden Mg 2+ iyonu uzaklaşmasıyla, fotosistemde elektron alıcısı olarak görev alan feofitin oluşur. Klorofil a ve b arasındaki tek farklılık ikinci pirol halkası üzerindedir. Klorofil a bu pozisyonda bir metil (-CH 3 ) grubuna sahipken, klorofil b bir aldehid grubu (-CHO) taşır. Bu küçük farklılık ; ışığın farklı dalga boylarındaki düşük miktarlarının absorblanmasına ve onların birbirinden ayrılmasına yardımcı olur. Molekül yapısındaki bu küçük farklılığa karşın klorofil a ve b hem mavi hem de kırmızı ışık spektrumu bölgelerinde farklı dalga boylarında ışık absorbsiyonu yaparlar. Klorofil pigmentleri gibi karotenoidler de kloroplastlarda yerleşmişlerdir. Karotenoidler bir bitkide farklı şekilde
bulunabilirler. İki esas tipi vardır: karotenler ve oksijenlenmiş karotenler (= ksantofiller). Karotenoidler 40 karbon (C) atomundan oluşan saf hidrokarbonlardır. Karotenin 3 temel alt grubu bulunur; α, β, γ Karotenoidlerin başlıcası, turuncu renkli olan β-karotendir. Sarı renkli karotenoidler olan ksantofillerin terminal halkasında oksijen bulunur. Yeşil yapraklarda bulunan bazı ksantofillere örnek olarak kriptoksantin, lutein, zeaksantin, violaksantin ve neoksantin verilebilir. Aksesuar pigment olarak da adlandırılan bu pigmentlerin iki önemli görevi vardır. Birincisi, klorofilin ışık absorbsiyonu yapmadığı dalga boylarında ışık absorbsiyonu yapmak. İkicisi güneş ışığı altında klorofil moleküllerini oksijenin zararlı etkilerinden korumaktır. TLC Bileşiklerin ayrılma, saflaştırılma ve tanınmaları için en çok uygulanan işlemlerden biri de kromotografidir. Kromotografi, bir karışımdaki maddelerin biri sabit diğeri hareket eden iki faz arasında moleküllerin farklı dağılmaları esasına dayanan bir yöntemdir. Hareketli faz sabit faz üzerinden hareketi sağlar. Moleküller iki faz arasındaki farklı dağılım oranlarına bağlı olarak hareketli fazda hareket edeceklerdir. Bu yöntem önceleri renkli maddelerin ayrılmasında kullanıldığından kromotografi adını almıştır. TLC bir adsorbsiyon kromotografisi tipidir. Organik moleküllerin ayrımında kullanılır. Silisik asidin bir formu olan silika jel [ Si(OH) 4 ] bu deneyde adsorbant olarak kullanılmıştır. Silika jel çözünür olmayan, polar bir materyaldir. Yaklaşık 0.25 mm kalınlığında alüminyum tabaka üzerine yayılmıştır. TLC de iyon değiştiriciler, jel filtrasyon ajanları da fiziksel adsorbant olarak kullanılabilir. Kapiler etkisi ile çözücü plakta yükselirken pigmenti de birlikte taşır. Daha az polar olan pigment daha hızlı hareket eder, çünkü silisik aside bağlanma eğilimi azdır. Plağın görüntülenmesinde pigmentler renkli olduğu için özel bir boyama gerektirmez. Lipidler TLC de ayrıldığında rhodamin ya da iyot buharı ile boyanır. Amino asitler ise ninhidrin ile görüntülenir. Kromotografi işlemi sonrasında çözücü ve ayrılan maddeler belli noktalara gelmiş olur. Böylece her madde için uygulama koşulları belirtilerek karakteristik bir değer verilebilir. Bu değer R f olarak ifade edilir. Maddenin ilerlediği yol R f = ------------------------------- Çözücünün ilerlediği yol R f değeri moleküllerin tanımlanması ve değerlendirilmesinde bir kriter olarak kullanılabilir.
DENEY PİGMENTLERİN ELDESİ A-ISPANAK YAPRAKLARINDAN PİGMENT ELDESİ Araç / Gereç Taze ıspanak yaprağı Parçalanmış buz 90ml Methanol, 10ml Diethyl Ether Doygun NaCl çözeltisi 70ml Methanol, 30ml Diethyl Ether Petroleum Ether (30-60 0 C) Süzgeç kağıdı Çeşitli boyutlarda beher ve erlen Sıcak su banyosu ( veya evaporatör) Ayırma hunisi YÖNTEM 1- Ispanak yaprakları 10 gram olacak şekilde tartılır. Distile suda yıkanır ve 100 ml distile su içeren bir beher içerisinde 2 dakika kaynamaya bırakılır. 2- Karışım buzda oda sıcaklığına kadar soğutulur. Yapraklar altta kalacak şekilde sıvı kısım boşaltılır. 3- Yapraklar 90ml Methanol ve 10ml Diethyl ether içeren çözücü içerisinde ekstrakte edilir. UYARI! BU SÜRE İÇERİSİNDE LABORATUVARDA ATEŞ YAKMAYIN! Ekstrakt huniden süzülür ve sıvı kısım atılır. 4- Yaprakları 70ml Methanol ve 30ml Diethyl ether içeren çözücüde 200 ml beherde karıştırılır. Ekstrakt ayırma hunisinden süzülür ve sıvı kısım atılır. 5- Ayırma hunisindeki ekstrakta 100ml Petroleum Ether (30-60 0 C) ve 100ml doygun NaCl (40 gram/100ml) eklenir. 6- Karışım iyice sallanır ve tabakaların ayrılmasını gözlenir. Arada bir ayırma hunisinin kapağını açarak basınç düşürülür. Tabakalar iyice belirginleştiğinde alt tabakayı uzaklaştırılır. 7- Üst tabaka (yeşil sıvı) 100ml distile su ile çalkalanır tabakaların ayrılması gözlenir ve üstteki yeşil ekstrakt büyük bir erlende toplanır. 8- Bu ekstrakt tekrar 100 ml distile su ile ayırma hunisinde çalkalanır ve yeşil renkli ekstrakt tekrar toplanır. 9- Petroleum Ether ile birlikte olan ekstrakt sıcak su banyosunda evapore edilerek kurutulur. Ekstrakt bir evaporatöre transfer edilir ve 40 0 C nin altında bir sıcaklıkta konsantre edilir. Alternatif olarak, ekstrakt 250ml lik bir behere alınarak 40 0 C lik su banyosunda bekletilirken 500ml lik bir hava alma flask tuzağı ile bir su aspiratörüne bağlanarak konsantre edilir. Buhar banyosundaki buharlaşmanın hızlı olması ve büyük beher kullanımının getirdiği yüzey artışı daha etkin bir konsantrasyon sağlayacaktır. Fakat bu metot pigmentlerde bazı değişimlere neden olabilir ve yürüme sırasında değişik fraksiyonların gözlenmesine yol açabilir. Eğer kuru ekstraktın depolanması zorunlu ise, vakum altında, karanlıkta ve soğukta bekletilerek pigment yapılarının bozulması önlenebilir. B-HAVUÇTAN KAROTEN PİGMENTİNİN ELDESİ ARAÇ / GEREÇLER Taze havuç %95 lik Ethanol Petroleum Ether (30-60 0 C) %85 lik Ethanol Süzgeç kağıdı veya tülbent benzeri bir bez parçası Bıçak
Ayırma hunisi Su banyosu Blender Erlen YÖNTEM 1. Parçalanmış 10 gram (kabukları soyulmamış) havuç bir blender yardımı ile iyice parçalanır (alternatif olarak sıvı azotta parçalanır). Her öğrenciye 10 gram parçalanmış havuç ayrılır. 2. Parçalanmış havuç 30 dakika 250ml lik bir erlen içerisinde 100ml %95 lik sıcak ethanol (70 0 C) ile ekstrakte edilir. Bu işlem su banyosunda gerçekleştirilebilir. 3. Sarı ekstrakt süzgeç kağıdından hunide süzülür. Ekstrakttaki ethanol konsantrasyonunu %95 den % 85 e değiştirmek için 100 ml ekstrakta 11.8ml distile su eklenir. Ekstrakt oda sıcaklığına kadar soğutulur. 4. Ekstrakt 250ml lik bir ayırma hunisine boşaltılır ve 50ml petroleum ether (30-60 o C) ile çalkalanır. Tabakaların ayrılması beklenir. En üstteki sarı turuncu petroleum ether tabakası karotenleri taşır; ethanol tabakası ise ksantofilleri taşımaktadır. 5. Ayırma hunisinin en üst kısmındaki sarı-turuncu tabaka mümkün olduğunca ayrıldığında bu kısım bir behere toplanır. 6. Ayırma hunisinde kalan tabakalar 5ml petroleum ether (30-60 o C) ile yıkanır. Çalkalanarak tabakalar ayrılana kadar beklenir ve üstteki küçük faz bir önceki basamaktaki behere alınır. 7. 6. Basamak petroleum ether tabakası renksizleşene kadar tekrarlanır. Bu noktada alttaki ksantofil tabakası altta kalacak şekilde huni boşaltılır. 8. Karotenlerin petroleum ether ile birleşmiş ekstraktı ayırma hunisine boşaltılır. Arta kalan ksantofilleri uzaklaştırmak için 15ml %85 lik ethanol eklenir ve tabakalar ayrılana kadar beklenir ve alttaki faz uzaklaştırılır. 9. Petroleum ether ekstraktı büyük bir behere(200-400ml) boşaltılır. 10. Karışım ekstraktı evapore edilerek kurutulur. 40 o C de evapore edilebilir veya 40 o C lik sıcak su banyosunda ağzı açık bırakılarak bu işlem gerçekleştirilebilir. İnce tabaka kromotografisi için yükleme yapılmak istendiğinde kurutulmuş karoten bir miktar (1ml-3ml) aseton ile çözülür. Asetonun fazlası (bu yükleme yapılan mikropipet ile alınabileceği kıvam olarak belirlenebilir) uçana kadar ağzı açık bırakılır. ÖRNEKLERİN İNCE TABAKA LEVHASINA UYGULANMASI 1- Levhalar uygulanacak örnek sayısına göre eşit şekilde kurşun bir kalemle işaretlenir. Örneklerin uygulanacağı yerler kurşun kalem ile belirlenir. (Levhanın sağından ve solundan 1 cm içeri, alt kısımdan da 2 cm olacak şekilde) 2- Örnekler bu noktanın tam ortasına gelecek şekilde 5 μl yüklenir. Bu işlem en az 4 kez tekrar edilir. Tekrar etmeden önce yüklenen örneklerin tam olarak kuruması beklenir bu işlem için kurutma makinesi kullanılabilir. 3- Hareketli faz siklohekzan:aseton:petroleum eter den (5:3:2) taze olarak hazırlanır. 4- Yürütme çözeltisi (hareketli faz) kromotografi tankının içine boşaltılır. İnce tabaka levhası düzgün şekilde bu tankın içine yerleştirilir. Örneklerinizin sıvı içinde kalmamasına özen gösteriniz. 5- Yürütme sonunda çözücünün ve örneklerin aldıkları yollar hızlı bir şekilde metrik bir cetvelle ölçülür. Orjinin orta noktası ile yürümüş olan örneğin orta noktası arasındaki mesafe ölçülür (örneğin aldığı yol). Çözücünün aldığı yol için, orjinin ortası ile çözücünün ulaştığı nokta ölçülür (çözücünün aldığı yol). 6- Rf değerlerini hesaplayın ve tartışın. SORULAR 1- Kromotografi plakları ile çalışırken neden plaklara elle dokunulmaması gerekir? 2- İnce tabaka kromotografisinde durgun ve hareketli fazlar hangileridir? 3- Yürüttüğünüz pigment karışımındaki pigmentlerin hareketli ve durgun faza ilgilerini tartışınız.
4- Bu deney sisteminde kullanılan çözücüyü değiştirdiğinizde ne tür bir sonuçla karşılaşabilirsiniz? 5- Hızlı çalışırsanız neden daha iyi ekstrakt elde edersiniz? 6- Klorofil en önemli fotosentetik pigment ise fotosentezde bir bitkiye en yararlı ışınların hangileri olduğunu düşünürsünüz? 7- En polar olan pigment hangisidir? Pigmentleri polarlık derecelerine göre büyükten küçüğe sıralayınız? 8- Bazı bitkilerin yaprakları yeşil değildir. Bu bitkilerin hangi pigmentleri içerdiğini nasıl bulabilirsiniz? 9- Su altına en kolay geçen ışık spekturumun mavi bölgesindeki ışınlardır. Deniz bitkileri neden çoğunlukla sarı kahverengidir? 10- Kromotogramdan her pigment bandını kazıyarak boş bir tüpe aktarın. Üzerine yürütme çözücüsünden bir miktar koyarak tekrar pigmentleri çözün. Görünür bölge içerisinde yer alan 400 nm den başlayarak 700 nm ye kadar dalga boyunu keyfi olarak 20 şer nm artırarak bu dalga boylarına karşılık gelen absorbans değerlerini kaydedin. Absorbansa karşılık dalga boyu (nm) grafiğini çizin. Pigment çözeltinizin ışığı maksimum absorbladığı dalga boyunu bulun. Elektromanyetik Spektrum