IVD Almanya'da Üretilmiştir ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti Kullanım Talimatları Xn R 36/37/38-42, S 22-24-26-37/39 18 25 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050) Yalnızca profesyonel laboratuvar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Greiner Bio-One GmbH Maybachstr. 2 72636 Frickenhausen Almanya Tel No: +49 (0) 7022 948-0 Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com www.gbo.com/bioscience
SEMBOLLER SÖZLÜĞÜ! en Do not reuse Use by Consult Instructions for Use Catalog Number Manufacturer In Vitro Diagnostic Medical Device Temperature limitation Contents sufficient for <n> tests Irritant Batch code Important Note de Nicht wiederverwenden Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch Anweisung lesen Hersteller Katalognummer In-vitro- Diagnostikum Temperaturbegrenzung Inhalt ausreichend für <n> Tests Reizend Chargenbezeichnung Wichtiger Hinweis fr Ne pas réutiliser Date limite de conservation jusqu au Lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro Limite de température Contenu suffisant pour <n> tests irritant N o de lot Note importante es No utilizar más A utilizar preferiblemente antes de Antes de usar, lea las instrucciones Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstica in vitro Limitación de temperatura Contenido suficiente para <n> ensayos irritante Código de lote Nota importante it Non riutilizzabile Da utilizzare entro e non oltre Leggere le istruzioni prima dell uso Numero catalogo Produttore Dispositivo medicodiagnostico in-vitro Limiti di temperatura Contenuto sufficiente per <n> test Irritante Codice del lotto Nota importante pt Não utilzar mais A utilizar preferívelmente antes de Antes de usar, leia as instruções Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstica in vitro Limitação de temperatura Conteúdo suficiente para <n> ensaios irritante Código do lote Aviso importante nl Niet opnieuw gebruiken Tenminste houdbaar tot Gebruiksaanwijzing lezen Catalogusnummer Fabrikant In vitro diagnostisch medisch product Temperatuurbeperking Voldoende inhoud voor <n> tests Irriterend Lot nummer Belangrijke opmerking da Må ikke genbruges Anvendes senest Læs brugsanvisningen Katalognummer Producent In vitro meskdicin doagnoseapparat Temperaturbegraensær Indeholder nok til <n> test Lokalirriterende Lotnummer Vigtig henvisning sv Får ej återanvändas Sista förbrukningsdag Läs bruksanvisningen före användning Katalognummer Tillverkare In vitromedicinsk doagnostisk apparatur Temperatur-begränsning Innehållet räcker till <n> tester irriterande Lot nummer Viktigt meddelande pl Nie stosować ponownie Termin zydatności Przed użyciem przeczytać instrukcję Producent Numer katalogowy Diagnostyka in vitro Produkt yw Ograniczenie temperatury Zawartość wystarcza na <n> testów drażniący Kod partii Ważne no Må ikke brukes flere ganger holdbar til Les bruksanvisning før bruk katalognummer produsent in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr temperaturbegrensning Innhold tilstrekkelig for <n> tester irriterende batch nr. Viktig merknad el Προϊόν μίας χρήσης Χρήση έως Συμβουλευτείτε τις Οδηγίες χρήσης Αριθμός καταλόγου Κατασκευαστής In Vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή Περιορισμοί θερμοκρασίας περιέχει επαρκές υλικό για < n > δοκιμασίες Ερεθιστικό Κωδικός παρτίδας Σημαντική σημείωση tr Yeniden ullanmayın Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı okuyun Katalog numarası Üretici firma In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması İçeriği <n> test için yeterlidir Tahriş edici Parti kodu Önemli Not 2
İÇİNDEKİLER 1. KİTİN İÇERİĞİ... 5 2. GEREKEN SARF MALZEMELERİ VE EKİPMANLAR... 6 2.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)...6 2.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050)...7 3. NAKLİYE VE SAKLAMA... 8 4. GÜVENLİK TALİMATLARI... 8 5. ATIKLARIN YOK EDİLMESİ... 9 6. GİRİŞ... 10 6.1 Kullanım amacı...10 6.2 Yanlış kullanım...10 6.3 Numune materyali... 11 6.4 DNA saflaştırma işleminin temel prensibi... 11 7. ocheck İŞ AKIŞI TALİMATLARI... 12 7.1 Genel talimatlar...12 7.2 Oda ayrımı...12 7.3 Uyarılar ve önlemler...13 7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi...13 7.3.2 Genel önlemler...13 7.3.3 Güvenli çalışma...14 8. TEK KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 040)... 15 8.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları...15 8.2 Numune preparasyonu...16 8.2.1 PapilloCheck ve PapilloCheck high-risk için numune preparasyonu...16 8.2.2 PelvoCheck CT/NG için numune preparasyonu...16 8.3 Standart protokol...17 8.3.1 Preparasyon...17 8.3.2 Ön Lizis...17 8.3.3 Lizis...17 8.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama...18 8.3.5 DNA Bağlama...18 8.3.6 Spin Kolonları Yıkama...18 8.3.7 Spin Kolonları Kurutma...19 8.3.8 DNA elüsyonu...19 3
9. KURULUM VE ÇALIŞTIRMA KILAVUZU ocheck VAC SET VE ocheck VAC PUMP... 20 9.1 Ürün İçeriği...20 9.1.1 ocheck VacSet...20 9.1.2 ocheck VacPump...21 9.2 ocheck VacSet'in Montajı...22 9.2.1 DNA bağlama ve yıkama için kurulum...22 9.2.2 DNA elüsyonu için kurulum...23 9.3 ocheck VacPump'ın Montajı...24 9.4 Vakumu kurma...24 9.5 Vakum uygulama...24 9.6 Manifoldu havalandırma...25 10. 8 KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 050)... 25 10.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları...25 10.2 Numune preparasyonu...26 10.2.1 PapilloCheck ve PapilloCheck high-risk için numune preparasyonu...26 10.3 Standart protokol...27 10.3.1 Preparasyon...27 10.3.2 Ön Lizis...27 10.3.3 Lizis...27 10.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama...28 10.3.5 DNA Bağlama...28 10.3.6 Bağlama Şeritlerini Yıkama...30 10.3.7 Bağlama Şeritlerini Kurutma...31 10.3.8 DNA Elüsyonu...31 11. SORUN GİDERME... 33 12. TEKNİK YARDIM... 35 13. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ... 35 14. KISA PROTOKOLLER... 35 14.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) için kısa protokol...35 14.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050) için kısa protokol...37 4
1. KİTİN İÇERİĞİ ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti Adı Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050) BUF BUF REAG BUF BUF BUF L1 L2 L3 W1 W2 E Tampon L1 20 ml 20 ml Tampon L2 12 ml 24 ml Reaktif L3 3 ml 6 ml Tampon W1 30 ml 75 ml Tampon W2 (konsantre) 14 ml 50 ml Tampon E 15 ml 50 ml Proteinase K Proteinaz K (liyofilize) 30 mg 75 mg Proteinase BUF PKB Proteinaz Tampon PKB 1,8 ml 3,6 ml Carrier RNA Taşıyıcı RNA (liyofilize) 0,3 mg 0,3 mg Spin Columns Collection Tubes Binding Strips Paper Sheet Spin Kolonlar 50 - Toplama Tüpleri 250 - Bağlama Şeritleri - 12 Kağıt Yaprağı - 10 BUF L4 Tampon L4 için Etiket 1 1 Kılavuz Talimatlarını Yükleme 1 1 5
2. GEREKEN SARF MALZEMELERİ VE EKİPMANLAR 2.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) Sarf Malzemeleri Greiner Bio-One Kat. No. Miktar (parça) ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti Tek Kolon Preparasyonu 515 040 50 preparasyon Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu 0,5-10 µl filtre uçları 0,5-20 µl filtre uçları 10-100 µl filtre uçları 10-200 µl filtre uçları 100-1000 µl filtre uçları Gereken ek sarf malzemeleri 765 288 774 288 772 288 739 288 750 288 96 96 96 96 60 Lizis adımları için emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpü Etanol p.a. %99,8 Tek kullanımlık eldivenler Gereken ek ekipmanlar 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri ve 11.000 g için uygun mikrosantrifüj Vorteks mikser 70 C ve 56 C inkübasyonda kullanılacak 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri için uygun termoblok, su banyosu veya termomikser 1-1000 μl arasında değişen mikropipetler Atık kabı Süreölçer 6
2.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050) Sarf Malzemeleri Greiner Bio-One Kat. No. Miktar (parça) ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti 8 Kolon Preparasyonu 515 050 12 x 8 preparasyon Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu 0,5-10 µl filtre uçları 0,5-20 µl filtre uçları 10-100 µl filtre uçları 10-200 µl filtre uçları 100-1000 µl filtre uçları 765 288 774 288 772 288 739 288 750 288 96 96 96 96 60 PCR tüpü 8'li strip 8'li tüp strip için başlık stripi Tekli PCR tüpleri 673 210 373 270 671 201 125 125 500 Ekipman Greiner Bio-One Cat. No. Miktar (parça) ocheck VacSet 863 080 1 ocheck VacPump 863 070 1 Gereken ek sarf malzemeleri Lizis adımları için emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpü Çok kanallı pipet rezervuarı (tek kullanımlık reaktif rezervuarları), hacimler: 25 ve 100 ml 8 kanallı pipet için pipet uçları (1200 μl hacim için yeterli) Etanol p.a. %99,8 Tek kullanımlık eldivenler Gereken ek ekipmanlar 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri ve 11.000 g için uygun mikrosantrifüj Vorteks mikser 70 C ve 56 C inkübasyonda kullanılacak 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri için uygun termoblok, su banyosu veya termomikser 1-1000 μl arasında değişen mikropipetler Büyük hacimler için (50 ila 1200 μl) 8 kanallı multipipet Atık kabı Süreölçer PCR rafı 7
3. NAKLİYE VE SAKLAMA ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti, oda sıcaklığında saklanır ve nakledilir. Hazırlanan çalışma solüsyonlarının saklama koşulları için bkz. bölüm 8.1 ve 10.1. 4. GÜVENLİK TALİMATLARI ocheck DNA Ekstraksiyon Kitinin aşağıdaki bileşenleri tehlikeli maddeler içerir. Eldiven ve koruyucu gözlük takın ve bu bölümde yer alan talimatlara uyun. Bileşen Tehlikeli Maddeler Tehlike Sembolü Risk İfadeleri Risk İfadeleri Güvenlik İfadeleri Tampon L2 Guanidin hidroklorür * Yutulması zararlıdır, Gözleri ve cildi tahriş eder R 22-36/38 Tampon W1 Guanidin hidroklorür + izopropanol < %25 * Yanıcıdır, Yutulması zararlıdır, Gözleri ve cildi tahriş eder R 10-22-36/38 S7-16-25 Proteinaz K Proteinaz K, liyofilize * Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder, Solunduğunda hassaslaşmaya neden olabilir R 36/37/38-42 S 22-24-26-36/37 * Her bir şişe miktarının 125 g veya ml'nin altında olduğu durumlarda tehlike etiketine gerek yoktur (67/548//EEC Md. 25, 1999/45/EC Md. 12 ve German GefStoffV 20 (3) ve TRGS 200 7.1 uyarınca). Daha fazla bilgi için bkz. Güvenlik Veri Formu. Risk İfadeleri R10 R22 R 36/37/38 R 36/38 R 42 Yanıcıdır Yutulması zararlıdır Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder Gözleri ve cildi tahriş eder Solunduğunda hassaslaşmaya neden olabilir Güvenlik İfadeleri S7 Kabı sıkıca kapalı tutun S16 Tutuşma kaynaklarından uzak tutun - Sigara içilmez S 22 Tozu solumayın S 24 Cilde temasından kaçının S 25 Gözlere temasından kaçının S 26 Gözlerle temas etmesi durumunda gözleri derhal bol suyla yıkayın ve tıbbi yardım alın S 36/37 Uygun koruyucu giysi ve eldiven kullanın Bu ürüne ait güncel Güvenlik Veri Formu, Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com/bioscience/biochips_download 8
5. ATIKLARIN YOK EDİLMESİ Tampon L2 ve W1 içindeki guanidin hidroklorür, ağartma maddesiyle birleştiğinde son derece reaktif bileşenler oluşturabilir. Numune preparasyon atığına ağartma maddesi veya asidik solüsyonlar doğrudan eklenmemelidir. Sıvı atıkların bulaşıcı kalıntı maddelerle kirlenmesi çok düşük bir ihtimal olmakla birlikte tamamen imkansız değildir. Bu nedenle sıvı atık bulaşıcı olarak kabul edilmeli ve yerel güvenlik düzenlemelerine uygun şekilde alınıp imha edilmelidir. Lütfen federal ve yerel yönetimlerin yanı sıra eyaletlerin atık bertarafıyla ilgili kılavuz ilkelerine dikkatle uyun. 9
6. GİRİŞ 6.1 Kullanım amacı ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 515 040 veya Kat. No. 515 050) bir in vitro tıbbi tanı kitidir ve ocheck ürün serisi ile yapılacak denemelerle analiz edilmek üzere insan kaynaklı numuneler ile yapılacak DNA preparasyonunda kullanım içindir. ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti değişkenleri tarafından kullanılan nükleik asit izolasyon metodolojisi, aşağıda yer alan kitlerle yapılacak doğrudan işlem sonrası analiz için uygun DNA üretir: ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti - Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) PapilloCheck (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060) PapilloCheck high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060) PelvoCheck CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002) ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050) PapilloCheck (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060) PapilloCheck high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060) Validasyon tamamlanana kadar PelvoCheck CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002) deneyi ile yapılacak işlem sonrası analiz için DNA izole etmek amacıyla ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonunun kullanılması tavsiye edilmez. ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti, yalnızca ocheck ürün serisi (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya) ile yapılacak deneylerle birlikte kullanıma yöneliktir. Bu ürün serilerindeki kullanım talimatlarında ocheck DNA Ekstraksiyon Kitini kullanma yöntemleri belirtilmektedir. ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti, İn Vitro Tıbbi Tanı Cihazı Direktifinin (98/79/EC) koşullarına uyduğundan dolayı CE uyum işareti taşımaktadır. Ürün, YALNIZCA moleküler biyolojik teknikler konusunda uzmanlaşmış teknisyenler ve doktorlar gibi profesyonel kullanıcılar tarafından kullanma amaçlıdır. 6.2 Yanlış kullanım ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti, KESİNLİKLE CarnoCheck (Greiner Bio-One), ParoCheck (Greiner- Bio-One) veya ocheck ürün serisinden olmayan herhangi bir ürünle birlikte kullanılmamalıdır. 10
6.3 Numune materyali PapilloCheck (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060) ve PapilloCheck high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060) işlem sonrası uygulama için ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti, aşağıdaki numune toplama sistemlerinden biriyle toplanmış insan servikal smear'lerinden viral ve insan genomik DNA'sı ekstrakte etmek için tasarlanmış ve test edilmiştir: PapilloCheck Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 070) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, ABD) Surepath TM (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) STM TM (Qiagen, Hilden, Almanya) PelvoCheck CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002) deneyi işlem sonrası uygulama için ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti, aşağıdaki toplama sistemlerinden biri kullanılarak insan idrar örneklerinden elde edilen bakteriyel ve insan genomik DNA'sını ekstrakte etmek için valide edilmiştir: PelvoCheck Toplama Kiti SAFE (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 100) PelvoCheck Toplama Kiti STRAW (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 101) Diğer numune toplama sistemleri valide edilmemiştir ve ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti ile kullanılmamalıdır. 6.4 DNA saflaştırma işleminin temel prensibi ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti, insan kaynaklı numunelerden elde edilen viral, bakteriyel ve insan genomik DNA'sının saflaştırması için tasarlanmıştır. Numune materyali, Proteinaz K ve Tampon L1 eklenerek hızlı ve etkili bir şekilde lize edilir. Lizis tamponu ve etanol, nükleik asitlerin Bağlanma Kolonunun silika membranına bağlanması için uygun koşulları oluşturur. Taşıyıcı RNA, düşük konsantrasyonlu viral, bakteriyel ve genomik DNA'nın bağlanması ve geri kazanımını güçlendirir. Tuzlar, metabolitler ve çözünebilir makromoleküler hücresel komponentler gibi kontaminant unsurlar (potansiyel PCR inhibitörleri), etanolik yıkama tamponlarıyla yıkama adımları sırasında ortadan kaldırılır. Saf bakteriyel, viral ve insan genomik DNA'sı son olarak, düşük iyonik güçteki koşullarda, hafif alkalin elüsyon tamponuna elüe edilir. Saflaştırma işlemi sonrasında DNA, ocheck ürün serisi ile elde edilen deneylerle yapılacak doğrudan analiz için uygun bir solüsyon haline gelir. 11
7. ocheck İŞ AKIŞI TALİMATLARI 7.1 Genel talimatlar Aşağıdaki talimatlar, moleküler biyolojide şu an kullanılmakta olan en son tekniklerin uygulanmasıyla yapılan laboratuvar deneyimlerine dayanmaktadır ve PCR tabanlı yöntemler açısından maksimum güvenliği sağlamayı hedeflemektedir. ocheck DNA Ekstraksiyon Kitini, ocheck ürün serisi ile elde edilen deneylerle saflaştırılmış DNA'nın ileri işlem sonrası analiziyle birlikte kullanırken uygun önlemler alınmalıdır. DNA esktraksiyonu, amplifikasyonu ve tespiti gibi moleküler biyoloji proseslerinde genel olarak uygun niteliklere sahip personel görev almalıdır. Ayrıca, numunelerdeki nükleik aside ait amplifikasyon ürünleri tarafından kontaminasyon veya degradasyon oluşumu nedeniyle elde edilebilecek hatalı sonuçlardan kaçınmak için, net ve iyi yapılandırılmış bir iş akışı gereklidir. Bunu sağlamak için, ekstraksiyon ve amplifikasyon alanları ayrı olmalıdır. Bir amplifikasyon ürünü, yalnızca ekstraksiyon için ayrılmış olan alana kesinlikle sokulmamalıdır. Her iki alanda da ayrı ekipman, sarf malzemeleri, laboratuvar önlükleri ve eldivenler bulunmalıdır. Ekstraksiyon için ayrılmış olan alana ait laboratuvar önlükleri, eldivenler veya ekipmanlar, kesinlikle amplifikasyon için ayrılmış olan alana aktarılmamalıdır. 7.2 Oda ayrımı Şekil 1 bir laboratuvarın nasıl 3 farklı bölüme ayrılabileceğine yönelik bir örnek göstermektedir. Bu odalardan biri yalnızca DNA ekstraksiyonu için, diğeri PCR reaksiyonlarının kurulması ve çalıştırılması için, sonuncusu ise hibridizasyon ve analiz için kullanılır. Her bir oda, numunelerin kontaminasyonunu önlemek amacıyla, yalnızca belirtilen uygulama veya teknik için kullanılmalıdır. Ekipmanların ve sarf malzemelerinin alanlar arasında yanlışlıkla yer değiştirmesini önlemek için renk kullanılması yararlı olabilir.! Ekipmanlar ve sarf malzemeleri, farklı laboratuvar odaları ve alanları arasında yer değiştirmemelidir. Bu nedenle, ekipmanların ve sarf malzemelerinin çift olarak temin edilmesine dikkat edilmelidir. Oda 1 Oda 2 Oda 3 Şekil 1: ocheck iş akışında oda ayrımı Oda 1: DNA ekstraksiyonu, Oda 2: PCR reaksiyonunun kurulması ve reaksiyon karışımının temiz bir tezgahta ayrılması; DNA şablonunun eklenmesi için ayrı bir alan; Oda 3: Hibridizasyon ve analiz 12
ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti ile yapılacak olan tüm DNA ekstraksiyon prosedürü, DNA ekstraksiyon odası olan oda 1'de uygulanmalıdır. Bu odadan çıktıktan sonra, laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir. ocheck iş akışında, DNA ekstraksiyonu, kontaminasyona en duyarlı olan prosestir, bu nedenle bu belgede yer alan talimatlara kesinlikle uyulması son derece önemlidir. Buna ek olarak, 7.3.1 bölümünde yer alan kontaminasyonu önleme kılavuzlarına da uyulmalıdır. Oda 2'de PCR reaksiyon karışımı kurulur ve temiz bir tezgah üzerinde ayrılır. Oda 1'de ekstrakte edilen DNA, oda 2'de tahsis edilecek ayrı bir alanda eklenmelidir. Bu odadan çıktıktan sonra laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir. Hibridizasyon reaksiyonu ve yıkama adımları, üçüncü laboratuvar odasında yapılır. Ayrıca, CheckScanner TM ile CheckReport TM Yazılımı da, ocheck ürün serisi ile yapılacak deneylerin nihai analizi için oda 3'te kurulur. 7.3 Uyarılar ve önlemler 7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi Laboratuvar önlükleri: Prosedürlerin uygulanması sırasında laboratuvar önlükleri giyilmelidir ve her bir laboratuvar odası için farklı laboratuvar önlük setleri bulunmalıdır. Eldivenler: her bir analiz adımı sırasında eldiven takılmalı ve her farklı adımda eldivenler değiştirilmelidir. Laboratuvar temizliği: Çalışma yeri, çalışmadan önce ve sonra, uygun temizlik solüsyonlarıyla dekontamine edilmelidir. Reaksiyon tüpleri: Reaksiyon tüpü kapağının içine kesinlikle dokunulmamalıdır. Çapraz kontaminasyondan kaçınmak için, her seferde yalnızca bir tüp açılmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için, lizis adımlarında emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüpleri kullanılmalıdır. Uygun mikropipet filtre uçları kullanılmalıdır (steril, DNase, RNase ve insan DNA'sı içermeyen). Sıvı transferleri arasında pipet uçları daima değiştirilmelidir. 7.3.2 Genel önlemler Teslim alındığında ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti bileşenlerini hasar bakımından kontrol edin. Bileşenlerden biri hasar görmüşse (örn. tampon şişeleri), yerel Greiner Bio-One distribütörünüze başvurun. Hasar görmüş kit bileşenlerini kullanmayın. Bu bileşenlerini kullanılması, kit performansını zayıflatabilir. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. ocheck DNA Ekstraksiyon Kitini, son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Farklı serilere ait reaktifleri karıştırmayın. Yalnızca kitle birlikte sağlanan ve üretici tarafından tavsiye edilen reaktifleri/ekipmanları kullanın. Pipetler, su banyosu ve termoblok için düzenli olarak kalibrasyon ve kontrol yapılmalıdır. Mikrolitre aralığına küçük miktarlarda sıvı pipetlemek zordur. Bu nedenle, mikropipetlerle olabildiğince doğru bir şekilde pipetlemeye dikkat edin. Tüm santrifüj adımları, oda sıcaklığında (18-25 C) gerçekleştirilmelidir. Kullanılmayan reaktifler ve atık materyal, federal yönetim ve eyalet düzeyindeki kılavuz ilkelere uygun olarak bertaraf edilmelidir. 13
7.3.3 Güvenli çalışma Bu kit yalnızca in vitro tanılarda kullanıma yöneliktir ve yalnızca in vitro tanılarda laboratuvar uygulama deneyimine sahip eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır. Solüsyonları kesinlikle ağzınızla pipetlemeyin. Çalışma alanlarında yiyecek ve içecek bulundurmayın, sigara içmeyin veya kozmetik ürünler kullanmayın. İnsanlara bulaşma potansiyeli taşıyan maddeler içeren biyolojik numunelerle işlem yaparken dikkatli olun. Bulaşma potansiyeline sahip maddelerden enfeksiyon alma riskini azaltmak için, numuneler lize edilene kadar, laminar hava akımı şartları altında çalışmanız tavsiye edilir. Tüm biyolojik numuneleri, enfekte edici ajanlar taşıma kapasiteleri bulunuyormuş gibi kabul ederek kullanın ve bertaraf edin. Biyolojik numunelere doğrudan temas etmekten kaçının, bu numuneleri sıçratmayın ve püskürtmeyin. Numuneleri ve reaktifleri kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. İnsan numuneleriyle çalışırken daima laboratuvar önlüğü giyin, eldiven takın ve koruyucu gözlük kullanın. Bu ürüne ait Güvenlik Veri Formunun güncel sürümü Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com/bioscience/biochips_download 14
8. TEK KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 040) 8.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları Tüm kit komponentleri, oda sıcaklığında (18-25 C) saklanmalıdır. Komponentler, üretildikten sonra iki yıl süreyle stabildir. ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti protokolüne başlamadan önce, aşağıdaki solüsyonları hazırlayın: 1. Proteinaz K solüsyonu: Kitin ilk kullanımından önce, liyofilize edilmiş Proteinaz K'nın çözünmesi için 1,35 ml Proteinaz Tamponu (PKB) ekleyin. Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar -20 C'de saklayın. Tekrar dondurmayın. 2. Tampon W2: Tampon W2 konsantratına 56 ml etanol (p.a. %99,8) ekleyin. Şişenin etiketine güncel tarihi not edin. Tampon W2, oda sıcaklığında (18-25 C) bir yıla kadar stabildir. 3. Tampon L4: Tampon L2'yi Reaktif L3'e tamamen aktarın ve iyice karıştırın. Şişeye kitle birlikte verilen L4 etiketini uygulayın. Şişenin etiketine güncel tarihi not edin. Elde edilen Tampon L4, oda sıcaklığında (18-25 C), bir yıla kadar stabildir.. 4. Taşıyıcı RNA solüsyonu: Liyofilize edilen Taşıyıcı RNA'nın çözünmesi için 900 μl Tampon L1 ekleyin. Çözünen Taşıyıcı RNA yı alikuotlara ayırın (örn. 12 ekstraksiyon için 35 ml lik alikuotlar). Çözünen Taşıyıcı RNA solüsyonunu, -20 C'de saklayın. Tekrar dondurmayın! Kullanılmış flakonlar çözündüklerinde imha edilmelidir. Özellikle düşük sıcaklıklarda saklama sırasında, Tampon L1, L2 veya L4'te beyaz bir çökelti oluşabilir. Bu çökeltiler, kullanımdan önce şişenin 50-70 C'de inkübe edilmesiyle kolaylıkla çözünebilir. 15
8.2 Numune preparasyonu 8.2.1 PapilloCheck ve PapilloCheck high-risk için numune preparasyonu PapilloCheck Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 070) PreservCyt toplama ortamı (Hologic, Bedford, MA, ABD) içinde toplanan insan servikal smear numuneleri, doğrudan işlenebilir. Surepath TM toplama ortamı (BD, Franklin Lakes, NJ ABD) içinde toplanan servikal smear numuneleri kullanılmadan önce yıkanmalıdır: 250 μl numuneyi, 5 dakika süreyle, 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline getirin. STM TM toplama ortamı (Qiagen, Hilden, Almanya) içinde toplanan servikal smear numuneleri, seyreltilmiş suyla seyreltilmelidir: 100 μl numune + 150 μl seyreltilmiş su.! Genel olarak servikal smear numunesi çok konsantre ise ve zaten agrege olmuşsa, ekstraksiyona başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir! Çok seyreltilmiş ve gözle görünür hücreleri göstermeyen servikal smear numuneleri, ekstraksiyon için daha fazla hücre verimi elde etmek amacıyla konsantre edilmelidir. En fazla 1000 μl numuneyi, 5 dakika süreyle, 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline getirin. Bu konsantrasyon adımı, yalnızca PapilloCheck Toplama Kiti, PreservCyt toplama ortamı veya Surepath TM toplama ortamı ile toplanan servikal smear numuneleri için uygulanır. Eğer STM TM toplama ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir. 250 μl numune solüsyonunu, 1,5 ml veya 2 ml'lik reaksiyon tüpüne pipetleyin. Kontaminasyonu önlemek için, lizis adımlarında kullanılan emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüplerini kullanın. Her bir DNA ekstraksiyon döngüsündeki tüm DNA izolasyon prosedürünün, bir negatif numune kontrolü kullanılarak valide edilmesi tavsiye edilir. 8.2.2 PelvoCheck CT/NG için numune preparasyonu PelvoCheck Toplama Kiti SAFE (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 100) PelvoCheck Toplama Kiti STRAW (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 101) içinde toplanan insan idrar numuneleri, doğrudan işlenebilir. 250 μl idrar numunesini, 1,5 ml veya 2 ml'lik reaksiyon tüpüne pipetleyin. Kontaminasyonu önlemek için, lizis adımlarında kullanılan emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüplerinin kullanılması tavsiye edilir. DNA ekstraksiyonunu valide etmek için, her bir ekstraksiyon döngüsünde bir negatif numune kontrolü kullanılmalıdır. 16
8.3 Standart protokol 8.3.1 Preparasyon Santrifüjü oda sıcaklığına (18-25 C) ayarlayın. Numuneleri bölüm 8.2'ye göre hazırlayın. Termoblokları veya su banyolarını, sırasıyla 56 C ve 70 C'ye ayarlayın. Elüsyondan önce, elüsyon Tampon E'yi, 70 C'de inkübe edin. Çalışma solüsyonlarının bölüm 8.1'e göre hazırlanmasına dikkat edin. 8.3.2 Ön Lizis 80 μl Tampon L1 ekleyin. Hazırlanan Taşıyıcı RNA solüsyonundan 2,4 μl ekleyin. 20 μl Proteinaz K solüsyonu ekleyin. Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak kısa bir süre karıştırın. En az 30 dakika 56 ºC'de inkübe edin. Numuneleri, bir termo mikser yardımıyla 650 rpm'de sallayın. Bir termoblok veya su banyosu kullanılıyorsa, numuneleri inkübasyon periyodu süresince arada bir vorteksleyin.! Birçok numune işleniyorsa, Proteinaz K, Tampon L1 ve Taşıyıcı RNA kullanılmadan önce karıştırılmalıdır. Tampon L1 ve Proteinaz K'yı, numunenin eklenmesinden önce 10 15 dakikadan daha fazla kesinlikle karıştırmayın. Proteinaz K, substrat olmadan Tampon L1 içinde kendi kendine parçalanabilir. 8.3.3 Lizis! Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun. 250 μl Tampon L4 ekleyin. Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak 10 saniye karıştırın. 15 dakika süreyle 70 ºC'de inkübe edin. Kapakların kazara açılmasını önlemek için, reaksiyon tüplerinin ağızlarını sıkıca kapatın. 8.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun. Numuneye 300 μl etanol (p.a. %99,8) ekleyin. Kapağı derhal kapatın ve puls vorteks uygulayarak 15 saniye karıştırın. Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun. 17
8.3.5 DNA Bağlama Kontaminasyonu önlemek için bu adımdan önce yeni eldivenler takın! Her bir numune için, bir Toplama Tüpü içine bir Spin Kolon yerleştirin. 450 μl lizatı, Spin Kolon'un içine dikkatlice yerleştirerek 1 dakika süreyle oda sıcaklığında 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun. Kalan lizatı atmayın! Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın. Kontaminasyonu önlemek için bu adımdan önce yeni eldivenler takın! Yeni Toplama Tüpleri hazırlayın ve Spin Kolonları bu tüplere yerleştirin. Kalan 450 μl lizatı Spin Kolona pipetleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun. Kontaminasyonu önlemek için bu adımdan önce yeni eldivenler takın! Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın Spin Kolonları yeni Toplama Tüplerine yerleştirin. 8.3.6 Spin Kolonları Yıkama Spin Kolonun içine 500 μl Tampon W1 uygulayın. Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun. Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın ve Spin Kolonu yeni Toplama Tüpüne geri koyun. Spin Kolonun içine 600 μl Tampon W2 uygulayın. Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun. Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın ve Spin Kolonu yeni Toplama Tüpüne yerleştirin. 8.3.7 Spin Kolonları Kurutma Membranı tamamen kurutmak için, oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun.! Etanol izlerini yok etmek için bu adımın uygulanması gereklidir. Tampon W2 içindeki etanol, enzimatik reaksiyonları inhibe eder, bu nedenle DNA elüsyonundan önce tamamen yok edilmelidir. 18
8.3.8 DNA elüsyonu Önceden ısıtılmış (70 C) Tampon E kullanın!! Pipetleme adımları sırasında sıcaklık kaybını önlemek için, 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüplerinin maksimum 1.300 μl Tampon E ile doldurulması tavsiye edilir (n = 12 numune için yeterlidir). Kontaminasyonu önlemek için bu adımdan önce yeni eldivenler takın! Spin Kolonu, 1,5 ml'lik temiz bir reaksiyon tüpüne yerleştirin. Spin Kolonun içindeki membranın merkezine önceden ısıtılmış (70 C) Tampon E uygulayın. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 1 dakika süreyle inkübe edin. 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun.! Downstream uygulamalarında izole edilmiş DNA'dan en iyi performansı almak için sağlanan Tampon E ile elüsyon tavsiye edilir. Ekstrakte edilen DNA'yı, -20 C'de saklayın. ocheck ürün serisiyle yapılacak deneylerden daha fazla analiz almak için ilgili Kullanım Talimatlarına başvurun (PapilloCheck, PapilloCheck high-risk ve PelvoCheck CT/NG). 19
9. KURULUM VE ÇALIŞTIRMA KILAVUZU ocheck VAC SET VE ocheck VAC PUMP ocheck Vakum Manifoldu, nükleik asitlerin ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu kullanılarak manüel olarak hızlı bir şekilde paralel saflaştırılması için tasarlanmıştır. Bu sistem, yüksek kaliteli nükleik asitlerin hızlı bir şekilde eş zamanlı olarak saflaştırılmasını sağlar. Vakum kullanılması sayesinde, zaman alan santrifüj ve aktarma işlemlerinin uygulanmasına gerek kalmaz. ocheck DNA Ekstraksiyon Kitleri, ultra filtrasyon teknolojisi tabanlıdır ve nükleik asit saflaştırma işlemlerinde hızlı ve kullanışlı bir yol sağlar. ocheck DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonunu vakum altında kullanırken, ocheck VacSet (Kat. No. 863 080) ve ocheck VacPump (Kat. No. 863 070) ürünlerinden yararlanılması önerilir. 9.1 Ürün İçeriği 9.1.1 ocheck VacSet 9.1.2 Kolon Tutucu Mikrotüp Rafı Kör Şeritler (12 adet) Manifold Kapağı Manifold Tabanı Aralayıcılar Atık Kapları Vakum Regülatörü Şekil 2: ocheck VacSet'in içeriği 20