ŞARAP ÜRETİMİNDE KULLANILAN ENZİMLER Şarap, üzüm suyunun enzimatik dönüşümü ile elde edilen ürün olarak düşünülebilir. Şarap üretiminde mayalardan veya malolaktik fermantasyondaki bakterilerden kaynaklanan çok sayıda enzim rol oynar. Üzümde doğal olarak bulunan enzimlerin verimliliğinin çok yüksek olmaması nedeniyle şarap üretiminde ticari enzim preparatları dışarıdan ilave edilebilmektedir. Enzim preparatları daha ziyade berraklaştırma ve süzme problemlerini gidermek çeşitli aromaları ortaya çıkarmak üzüm suyu ve şarap veriminin arttırmak, rengin stabilizasyonu ve ekstraksiyonunu geliştirmek amacıyla ilave edilmektedir. Üzümlerde pektik maddeleri hidroliz eden enzimler; pektin esteraz, poligalakturonaz, pektin liyaz, ramnogalakturonaz, ramnogalakturonan asetilesteraz, arabinaz ve galaktanazdır. Tüm bu enzimlerin aktiviteleri sonucunda aromalar ve pigmentler seçici ve kontrollü bir şekilde açığa çıkmaktadır. Asil küf olarak da adlandırılan Botrytis cinerea nın üzüm içine salgıladığı glukan polisakkariti, çoğunlukla alkol fermantasyonu sonrasında glukanaz enzimi ile hidrolize edilmektedir. Glukanaz burada bulanıklığa neden olan glukanların uzaklaştırılmalarını sağlamaktadır. Üzümlerdeki monoterpenler (linalol, geraniol, nerol), uçucu fenoller gibi bileşenlerin, glukoz, arabinoz veya ramnoz gibi şekerlerle glikozidik kompleksler yaptığı bilinmektedir. Glukozidazlar bu kompleksleri hidrolize etmekte ve serbest hale geçen aromatik bileşikler sayesinde şarapların aroma profilini geliştirmektedir. Şarap üretiminde glikozidaz preparatlarının kullanılmasına izin verilmezken glukozidaz benzeri aktiviteye sahip pektinolitik enzim preparatları kullanılabilmektedir. BİRA ÜRETİMİNDE KULLANILAN ENZİMLER Biracılıkta kullanılan ham maddelerde bulunan enzimler üretimde önemli rollere sahiptirler. Ancak bu enzimlerin miktarı hammaddeye göre değişiklik gösterebilmektedir. Bu nedenle bira prosesinde hammaddeden kaynaklanan değişkenliği tolere edebilmek için enzim ilaveleri yapılmaktadır. Malt yapım aşamasında arpadaki enzimler (amilazlar,glukoanazlar, proteazlar ve hemiselülazlar) aktivite edilirler. Bu enzimler nişasta, glukan ve protein gibi bileşenleri daha düşük molekül ağırlıklı bileşenlere parçalanmak üzere görev alırlar. Maltta enzimlerin düzeyleri yeterli değilse bu enzimler mayşeleme aşamasında dışarıdan da ilave edilebilirler. 1
Mayşeleme aşamasında özellikle proteazlar ve peptidazla malt proteinin parçalamaya başlar ve serbest aminoasitler enzim peptitler ve küçük proteinler ortaya çıkar. Proteinin aşırı parçalanması istenilmeyen bir durum olup biranın koyu renkte olmasına neden olmakta ve köpük miktarını etkilemektedir. Hücre duvarının parçalanması ise glukonazlar tarafından gerçekleştirilir. Hücre duvarının yeterince parçalanması mayşenin ve biranın süzülmesinde zorluğa sebep olmakta ve son ürün olan birada bulanıklık oluşturmaktadır. Maltın önemli bir kısmını (%60) oluşturan nişasta, amilolitik enzimler tarafından parçalanır. Olgunlaşma aşamasında papain enzimi kullanılarak bulanıklık problemine çözüm getirilmiştir. Düşük kalorili bira üretiminde fermente edilemeyen dekstrinleri uzaklaştırmak için ise amiloglukozidaz kullanılmaktadır. PEYNİR ÜRETİMİNDE ENZİMLERİN ROLÜ Peynir son yıllarda bazı araştırıcılar tarafında fermente bir ürün olarak kabul edilse de yapılış açısından fermente süt ürünlerinden önemli farklılıklar göstermektedir. Temel olarak peynir üretimi, sütün herhangi bir yolla pıhtılaştırılması ve ardından peynir çeşidine göre değişkenlik gösteren yöntemler ile işlenmesi esasına dayanmaktadır. Günümüzde peynir üretiminde enzimatik yolla sütün pıhtılaştırılması en yaygın yoldur. Yapısında %90 dan daha fazla oranda kimozin içeren rennet ağırlıklı olarak buzağı şirdeninden maserasyon yoluyla elde edilmektedir. Kimozin, sütün başlıca protein alt fraksiyonlarından birisi olan kazeinin Phe 105 ve Met 106 bağlarına spesifite gösteren bir enzimdir ve kazein zincirinin bu bağlarını parçalayarak hidrofobik para-kazain ve hidrofilik glikomakropeptit ( GMP) oluşumunu katalize eder. Parçalanma sonucu oluşan hidrofobik para-kazein bölümü peynir pıhtısı olarak adlandırılırken, GMP peynir suyu ile birlikte atılmaktadır. Ardından üretilecek olan peynir modeline göre pıhtı baskıya alınarak serumun ayrılması sağlanmakta ve teleme oluşumu gerçekleştirilmektedir. Birçok peynir çeşidi ya salamura içerisinde olgunlaştırılmakta ya da pıhtısı haşlanan Kaşar, Çedar gibi peynir çeşitlerinde olduğu gibi kuru tuzlamaya tabi tutulmaktadır. Olgunlaşma işlemi kısaca protein, laktoz ve yağ gibi temel süt bileşenlerinin belirli koşullar altında starter mikroorganizmalar, pıhtılaştırıcı enzimler, sütün doğal laktik florası veya doğal süt enzimleri aracılığı ile biyokimyasal modifikasyona uğraması olarak tanımlanabilir. Mikrobiyel pıhtılaştırıcıların yüksek proteolitik etkilerini sınırlamak, daha yüksek saflıkta enzim üretmek ve enzim üretim maliyetlerini düşürmek amacıyla genetik modifikasyon yolu ile rekombinant kimozin üretimi son dönemlerde hız kazanmıştır. 2
Rekombinant kimozin, prokimozin geninin değişik mikroorganizmalara klonlanması ve fermentörlerde çoğaltılması ile elde edilmektedir. Bu şekilde elde edilen rekombinant kimozin salamura beyaz peynir, Çedar, Edam, Emmental, Tilsit ve Ras peynirleri gibi pıhtısı haşlanan ya da haşlanmayan peynir çeşitlerinde olgunlaştırmayı hızlandırmada ve pıhtılaşmayı sağlamada başarıyla kullanılmaktadır. Rekombinant kimozinin en Peynir olgunlaşmasını hızlandırma yöntemleri arasında son yıllarda genetiği modifiye edilmiş starter kültür kullanımı konusunda oldukça yoğun bilimsel çalışma gerçekleştirilmektedir. Laktik asit bakterisi kökenli proteolitik enzimlerin hücre içinde sentezlenmesi ve bu enzimlerden biyokütle eldesinin pahalı olması nedeniyle olgunlaşmada rol oynayan proteolitik enzimlerin genetik modifikasyonla üretimleri yaygınlık kazanmaya başlamıştır. önemli avantajı peynir olgunlaştırmasını hızlandırmasının yanı sıra klasik rennetin içerdiği diğer proteazları içermediğinden klasik rennetin neden olduğu verim düşüşünü önlemesidir. GİRİŞ Fermantasyon terimi biyokimyasal açıdan organik bileşiklerin enerji sağlamak amacı ile katabolizma yolu ile parçalanmasını, endüstriyel mikrobiyolojide ise bir mikroorganizma kütlesinin üretim sürecini ifade etmektedir. GıDA ENDÜSTRİSİNDE FERMANTASYON TEKNOLOJİSİ Bu kapsamda mikrobiyal hücrelerin ürün olarak elde edildiği prosesler, enzimler, mikrobiyal metabolitler, rekombinat ürünler ve biyotransformasyon ürünleri fermantasyon teknolojilerinin kullanıldığı endüstriyel öneme sahip prosesler olarak ön plana çıkmaktadır. Bu proseslerin gerçekleştirilebilmesi için izlenmesi gereken temel işlemler aşağıda belirtilmiştir: Mikroorganizmanın geliştirileceği ve ürünün elde edileceği kültür ortamının hazırlanması, Kültür ortamının, biyoreaktörlerin ve malzemelerin sterilizasyonu, Üretim için uygun miktar ve kalitede inokulumun(aşı kültürü) üretilmesi, İnokulasyon Mikroorganizmanın uygun koşullarda geliştirilmesi, Ürünün saflaştırılması, Atıkların uzaklaştırılması, ENDÜSTRIYEL ÖNEME SAHIP MIKROORGANIZMALARıN IZOLASYONU, MUHAFAZASı VE GELIŞTIRILMESI İzolasyon ; saf veya karışık kültürlerin, istenilen ürünleri üretebilmelerine göre değerlendirildikten sonra saf olarak elde edilmesidir. Burada en önemli parametre izole edilecek mikroorganizmanın istenilen reaksiyonu ekonomik koşullarda gerçekleştirebilmesidir. 3
Bu nedenle mikroorganizma izolasyonunda aşağıdaki kriterlerin göz önünde bulundurulması gerekmektedir; Organizmanın besin gereksinimlerin ekonomik açıdan uygun olması Organizma için gerekli olan optimum sıcaklık Organizmanın kararlılık özellikleri ve genetik müdahaleye uygunluğu Organizmanın substratı ürüne dönüştürme verimi, birim zamanda ürün oluşturma yeteneği Ürünün kolaylıkla saflaştırılabilmesi Bu kriterler dışında çalışmanın gerçekleştirildiği ülkedeki yasal uygulamalar ile ürünün veya mikroorganizmanın toksisite durumu da araştırılmalıdır. İzolasyon organizmaların yaygın olarak bulunduğu bir ortamın seçilmesi ile başlar. İzolasyon belli bir tip substratı kullanarak gelişebilen mikroorganizmaların seçilmesi veya istenmeyen mikroorganizmaların gelişimlerinin engellenmesini sağlayacak şekilde ilerler. IZOLASYON AŞAMALARI Mikroorganizma seçimi sırasında izlenmesi önerilen aşamalar sırasıyla aşağıda ki gibidir; İlk aşamada izole edilmesi hedeflenen mikroorganizmaların özellikleri dikkate alınarak seçici kültür ortamı hazırlanır. Bu aşamada izole edilecek mikroorganizmaya göre aerobik veya anaerobik ortamlar oluşturulur. Bazı durumlarda birden fazla seçici faktörlerin kullanımı gerekebilmektedir. İzolasyon sırasında en hızlı üreyen mikroorganizmaların seçilmesi üretimin daha sonraki adımlarında büyük yarar sağlayacaktır. Mikroorganizma seçimi sırasında kullanılan kültür ortamının maliyeti de üretim prosesi için önemli bir parametredir. İzole edilmesi gereken mikroorganizma cinslerinin belirlenmesi İzole edilecek mikroorganizmaların bulunduğu ortamların belirlenmesi Mikroorganizma seçimi sırasında çevresel koşulların belirlenmesi Ölçek artırma sırasında karşılaşılması olası zorlukların belirlenmesi İzolasyon prosedürünün tasarlanması; inkübasyon süresi, kültür ortamı vb. IZOLE EDILEN MIKROORGANIZMALARıN SAKLANMASı Endüstriyel üretimde kullanılacak olan bir mikroorganizmanın izole edilmesi hem zor hem de maliyetli olduğundan, elde edilen mikroorganizmanın uzun süre saf ve sağlıklı bir şekilde saklanması büyük önem taşımaktadır. Sağlıklı bir saf kültür istenilen ürünü üretme yeteneğini kaybetmeyecek genetik değişiklere maruz kalamayacak ve canlılığını korur bir şekilde muhafaza edilmelidir. Bu amaçla çeşitli saklama yöntemleri geliştirilmelidir. I. DÜŞÜK SıCAKLıKLARDA SAKLAMA Eğik agar üzerinde saklama: agar üzerinde geliştirilen mikroorganizmalar +4 C veya -20 C de saklanan kültürler her altı ayda bir tazelenmelidir. Ayrıca gliserin eklenmiş sıvı kültürler de -20 C de veya daha uzun süreler -80 C de saklanabilir. Sıvı azot altında saklama: mikrobiyal aktivite -150 C ve -196 C arasında önemli ölçüde azalır. Bu yöntemde ortam sıcaklığının düşürülmesi için sıvı azot kullanılır. Bakteriler, küfler, virüsler, algler mayalar ve doku kültürleri bu yöntemle uzun yıllar güvenli bir şekilde muhafaza edilir. 4
II. DEHIDRASYON ILE SAKLAMA Kurutulmuş kültürler: Kurutulmuş toprak çeşitleri kültürleri, miselli organizmaları saklamak için kullanılan yaygın yöntemlerden birisidir. Liyofilizasyon: Bu yöntemde dondurulan kültür vakum altında kurutulur ve hücre sıvısının süblimleşmesi sağlanır. MIKROORGANIZMALARıN ÖZELLIKLERININ GELIŞTIRILMESI Verimin artırılmasında ilk aşama kültür ortamının formülasyonunun ve üreme koşullarının optimizasyonudur. Bu yöntemle elde edilen gelişme, mikroorganizmaların genomu tarafından belirlenir. Yapısal etkenler değiştirildiğinde mikroorganizmanın sahip olmadığı bir proteini üretmesi sağlanabilir. Mikroorganizmanın düzenleyici etkenlerine müdahale edildiğinde, istenilen ürünün üretilmesini engelleyen genetik kodlar veya mikroorganizma içindeki biyokimyasal düzenlemeler değiştirilebilir ve istenilen ürün daha yüksek konsantrasyonlarda eldesi gerçekleşir. BESIYERI FORMULASYONU VE GELIŞTIRILMESI Besiyeri formulasyonu, fermantasyon teknolojilerinde büyük öneme sahiptir. Bir besiyerinin sahip olması gereken temel özellikler; Kullanılabilir birim miktar besin maddesine karşılık gelen ürün bazında maksimum verimi sağlamalıdır. Maksimum ürün veya biyokütle konsantrasyonunu sağlamalıdır. Maksimum ürün oluşum hızına imkan vermelidir. İstenmeyen ürün oluşumuna engel olmalıdır. Sürekli bir kaliteye sahip olmalıdır. Sterilizasyon sırasında bir soruna neden olmamalıdır. Kültür ortamlarını ; kompleks tanımlı ortamlar olmak üzere 2 ye ayrılırlar. Kompleks kültür ortamları ; daha ucuz ve kolay bulunabilir olduğundan daha fazla tercih edilmektedir. Tanımlı kültür ortamları ise; saf maddeler kullanılması gerektiğinden proses maliyetlerini artırabilirler. Tüm bu hususlar göz önünde bulundurularak üretim için gerekli kültür ortamı belirlenir. STERİLİZASYON Fermantasyon proseslerinde sterilizasyon ortamda bulunan tüm mikroorganizmaların öldürülmesini ifade etmektedir. Ortamda kontaminasyon olması durumunda aşağıda açıklanan istenmeyen sonuçlarla karşılanabilmektedir. Ortamdaki besin elementleri hem ürünü üreten mikroorganizma, hem de kontaminant tarafından tüketilir ve verim kaybına sebep olur. Sürekli proseslerde kontaminant,ürünü üreten mikroorganizmadan daha fazla gelişerek ortamda baskın hale geçebilir. Kontaminant mikroorganizma son ürünün saflığını etkileyebilir. Kontaminant mikroorganizmanın ürettiği metabolitler, son adımda ürün saflaştırmayı güçleştirebilir. Kontaminant mikroorganizma,son ürünü parçalayabilir. Bakteriyel bir fermantasyon prosesinin faj ile kontamine olması durumunda ise kültürün canlılığını kaybetmesi söz konusudur. 5
STERLİZASYONU ETKİLEYEN FAKTÖRLER VE FARKLI STERİLİZASYON TEKNİKLERİ Bu nedenle üretim öncesi sterilizasyon büyük önem taşımakta olup,bunun yanında proses sırasında da aseptik koşulların sağlanması ve korunumuna dikkat edilmelidir.bu amaçla; Fermantasyon mutlaka saf bir kültür ile başlatılmalıdır. Kültür ortamının,biyoreaktör ve aksesuarları ile ortama verilen havanın sterilizasyonu etkin bir şekilde sağlanmalıdır. Üretim sırasında ortama eklenecek tüm malzemeler sterilize edilmiş olmalıdır. Sterilizasyon sırasında iki tip reaksiyon kültür ortamın kalitesini etkilemektedir. Ortamın bileşenleri arasında ortaya çıkan reaksiyonlar: Bu tip reaksiyonlar genelde şekerlerden kaynaklanan karbonil grupları ile aminoasit ve proteinlerin aminoasit grupları arasında gerçekleşir, ve reaksiyon sonucunda ortamda bir esmerleşme görülür. Şekerler kültür ortamında ayrı olarak sterilize edilerek bu durum engellenebilmektedir. Isıya dayanıksız olan bileşenlerin degradasyonu:bazı vitaminler, aminoasitler ve proteinler ısı nedeniyle bozunabilirler. Bu durumda bu bileşenlerin filtrasyon yöntemi ile sterilizasyonu ısıl işleme alternatif olarak kullanılabilir. Sterilizasyon sonucunda istenilen verimin elde edilebilmesi amacıyla sterilizasyon kesikli veya sürekli olarak uygulanabilir. Her iki tip sterilizasyonunda birbirine karşı üstünlükleri vardır. SÜREKLİ STERİLİZASYONUN ÜSTÜNLÜKLERİ Kültür ortamı kalitesinin çok iyi korunması Ölçek artırmanın kolay olması Kolay otomatik kontrol Sterilizasyon döngü süresinin az olması KESİKLİ STERİLİZASYONUN ÜSTÜNLÜKLERİ Düşük ilk yatırım Düşük kontaminasyon riski Kolay manuel kontrol Yüksek oranda katı madde içeren kültür ortamları ile daha kolay çalışabilme olanağı Bir fermantasyon prosesinde kültür ortamının sterilizasyonu kadar,ortama verilen havanın sterilizasyonu da büyük önem taşımaktadır. Hava sterilizasyonu için en uygun yöntem filtrasyondur. 6
Hava sterilizasyonu için kullanılacak olan filtrelerin sahip olması gereken temel özellikler aşağıda verilmiştir. Sterilize edilebilir ve dayanıklı olmalıdır. Mümkün olduğunca az geri basınç yaratmalıdırlar. Etkin yüzey alanına sahip olmalıdırlar. Ayırma yeteneğine sahip olmalıdırlar. Kolay kullanılabilir ve ekonomik olmalıdırlar. BİYOREAKTÖR Gıda endüstrisinde biyoreaktörler proteinlerin,organik asitlerin, aminoasitlerin, enzimatik veya mikrobiyal biyotransformasyonların fermantasyon prosesleri kullanarak üretimlerinde önemli bir role sahiptirler. Biyokatalizörler, mikroorganizmalar, hayvan ve bitki hücreleri biyoreaktörler içerisinde üretilirler. BIYOREAKTÖR ÇEŞITLERI Endüstriyel üretimlerde istenen amaca uygun özelliklere sahip çeşitli biyoreaktör tipleri vardır.en yaygın biyoreaktör çeşitleri karıştırmalı tank reaktörleri,hava kaldırmalı reaktörler ve kabarcıklı kolon reaktörlerdir. Tüm biyoreaktörlerin sahip olmaları gereken temel özellikler aşağıda verilmiştir. Biyoreaktörler steril şartlar altında işletilebilmeli ve uzun süreli reaksiyonlar için güvenilir olmalıdır. Mikroorganizma tarafından gereksinim duyulan havalandırma ve karıştırmayı sağlayabilmelidir. Güç sarfiyatı mümkün olduğunca az olmalıdır. Sıcaklık ve ph kontrolü sağlanabilmelidir. Numune alabilmek için gerekli düzeneğe sahip olmak. Buharlaşma kayıpları en az seviyede olmalıdır. İşletme,temizleme ve bakım sırasında mümkün olduğunca az iş gücü gerektirmelidir. Genel olarak geniş bir proses çeşitliliğinde çalışabilmelidir. İç yüzeyi mümkün olduğunca pürüzsüz olmalıdır. Üretim yapılacak olan reaktör,pilot ölçekli reaktörle benzer yapıya sahip olmalıdır. Tatmin edici sonuçların en ucuz malzemeyle elde edilmesi mümkün olmalıdır. SAFLAŞTIRMA PROSESİ Fermantasyon ürünlerinin saflaştırılması masraflı bir süreçtir. Saflaştırma maaliyeti ürün maliyetinin %70'ine varan kısmını oluşturur. Amaç en az maliyetle en yüksek kalitedeki ürünün mümkün olan en kısa süre içinde elde edilmesidir. Bir fermantasyon prosesi sonunda ortam sıvısı içinde ürün düşük konsantrasyondadır ve ürünle birlikte ortamda m.o,hücre parçaları,çözülmüş ve çözülmemiş ortam bileşenleri ile birlikte diğer metabolik ürünler bulunur. Öte yandan ürün hücre içi bir metabolit de olabilir. Bütün bu faktörler saflaştırma prosesini zorlaştıran etkenlerdir. Saflastırma prosesi aşagıdaki krıterler dikkate alınarak seçilmelidir. *Ürünün hücre içi veya hücre dışı oluşu *Ürünün fermantasyon sonundaki konsantrasyonu *Ürünün kimyasal ve fiziksel özellikleri *Ürünün kullanım alanı *Ürünün kabul edilebilir en düşük saflık standartı *Ürünün toksisitesi *Fermantasyon sonrasında ortamda bulunan safsızlıklar *Ürünün fiyatı 7
GıDA ENDÜSTRISINDE FERMANTASYON UYGULAMALARı Endüstriyel ölçekteki mikrobiyal prosesler basit dönüştürme işlemi ve fermantasyon işlemi şeklinde yürütülmektedir. Dönüştürme işlemlerinde hücreler sahip oldukları enzimlerle belirli bir substratı istenen ürüne çevirmekte, fermantasyon uygulamasında ise hücreler besi ortamındaki şeker ve amonyum gibi bileşikleri kompleks metabolik yollar aracılığıyla istenen ürüne dönüştürmektedir. 8