5. Deney Doğal Ürünlerin Ekstraksiyonu (Çekme) ve Đzole Edilmesi: Kafein, Eugenol ve Karoten Genel Prensipler Kafein çayda, kahvede, kolada ve muhtelif diğer bitkilerde bulunan bir alkaloiddir. Hafif uyarıcıdır ve tıbbi olarak bu amaçla kullanılır. Yapısal olarak kafein, pürinler diye adlandırılan azot bazları sınıfına dahildir. Renksizdir ve 235-236 C de eriyen katı kristal yapıdadır. Fakat erime noktası altındaki sıcaklıklarda düşük basınç altında hemen süblimleşebilir. Kafein, suda bir miktar çözünmesine rağmen diklorometan ve kloroform gibi çok kullanılan organik çözücülerde oldukça iyi çözünür. Kafein Pürin Bazı Doğal Alkaloidler Nikotin Kokain Morfin Eugenol, karanfil yağının temel bileşenidir. Fenolik ve eter grupları ile doymamış bir yan zinciri bulunan aromatik bir maddedir. Karanfil kokusu ile güçlü ve keskin tada sahip bir tür çeşnidir. Tıbbi olarak dişçilikte antiseptik ve analjezik olarak kullanılır. Eugenol -9 C de erir ve 255 C de kaynar. Yüksek kaynama noktasına rağmen, eugenol su ile beraber damıtılabilir. Bu tip damıtma tekniği, buhar damıtması olarak da adlandırılır, uçuculuğu düşük ve suda çözünmeyen maddelerin uçucu olmayan maddelerden ayrılmasında etkin bir yöntemdir. Eugenol
Bu deneyler saf kimyasal maddeleri doğal kaynaklarından izole etmekte kullanılan bazı saflaştırma tekniklerini göstermektedirler. Bu deneyde, çaydan kafein ve karanfilden eugenol izole edilecektir. Kullanılacak Kimyasallar ve Ekipmanlar Çay yaprakları, sodyum karbonat, konsantre amonyak çözeltisi, petrol eteri (30-60 ), diklorometan, susuz aseton, metanolik hidroklorik asit ( 1 ml %37 hidroklorik asit ve 36 ml metanol), susuz sodyum sülfat, konsantre sülfirik asit, 1-bütanol, konsantre asetik asit, kırmızı lahana yaprakları, havuç, ısıtma yağı, beher, termometre, ayırma hunisi, cam çubuk, balon joje, kollu test tüpü veya süblimleşme tüpü, kondenser (yoğunlaştırıcı), vakum, saat camı, Erlenmeyer kabı, pipetler, vakum filtresi, havan ve tokmak, fırın, deniz kumu, UV ışığı. Çaydan Kafein Đzolasyonu Bu deneyde kafeinin yaklaşık % 4 oranında bulunduğu çay yapraklarından sıcak su ile ekstraksiyonunu (elde edilmesini) yapacaksınız. Bu işlemle ayrıca çayda bulunan maddelerden olan tanenler de suya geçerler. Bu nedenle, kafeinin tanenden ayrılması gerekli olacaktır. Çözeltiye sodyum karbonat eklereyek bu yapılabilir. Tanen asidiktir (tannik asit olarak da isimlendirilir) ve bazik çözeltide kalır. Sonra kafein bazik çözeltiden diklorometan ile çekilir. Daha sonra, süblimleşme veya kristallendirme yöntemi kullanılarak saflaştırılabilir. 10 12 poşet çay alın. Đçerisinde 20 g sodyum karbonat içeren 150 ml sulu çözelti bulunan 500 ml lik behere çayları yerleştirin. Karışımı kısık ateşte 10 20 dakika kaynatın. Poşet çayları çıkarın ve maksimum miktarda ekstrakt elde etmek için sıkın. Sulu çözeltiyi oda sıcaklığına kadar soğutun, ayırma hunisine aktarın ve 3 kez 20, 15 ve 10 ml lik diklorometan ile çekin. Emülsiyon oluşumunu önlemek için huniyi kuvvetli bir şekilde sallamayın. Bazen, özellikle alkali çözeltilerde, emülsiyon oluşması sebebiyle belirgin bir faz ayırımı elde etmek zor olur. Huniyi dikeye yakın bir pozisyonda yavaşça döndürmek, cam çubukla hafifçe karıştırmak, sulu faza tuz eklemek, ya da bazı köpük kırıcı maddeler eklemekle bu zorluğun üstesinden gelinebilir. Bunun yerine huniyi hafifçe çalkalayın ve her ekstraksiyonda hunideki fazları yavaşça çevirin. Diklorometan sudan daha yoğundur ve alt fazı oluşturur. Diklorometan çözeltilerini birleştirin ve oluşmuş olabilecek emülsiyonları önce fazları çevirmek suretiyle 20 ml su ile yıkayın. Bir süzme hunisine bir top pamuk yerleştirin, 1 cm lik susuz sodyum sülfat tabakasıyla üstünü kaplayın ve diklorometan çözeltisini huniden geçirerek 100 ml lik bir kaba süzün. Kabı bir damıtma düzeneğine bağlayın ve diklorometanı damıtma ile ayırın. Burada ısı kaynağı olarak sıcaklığı 70 C 'yi geçmeyen su banyosu veya kum banyosu kullanın ya da basitçe çeker ocakta uçurun. (Alev kullanmayın, kafein fazla ısıtıldığında bozulabilir). Damıtmadan sonra kalan beyaz tortu ham kafeindir. Ham kafein, aşağıda belirtilen süblimleşme veya yeniden kristallendirme ile saflaştırılabilir.
Kafeinin Saflaştırılması a) Süblimleşme Bazı organik bileşiklerin saflaştırılması, kristallendirmeye alternatif olarak veya kristallendirmeyle birlikte, süblimleşme ile sağlanır. Metodun başarısı, bileşiğin erime noktası altındaki bir sıcaklıkta yeterli buhar basıncına sahip olmasına bağlıdır. Böylelikle, katıdan buharlaşma hızlı olur ve buhar soğuk bir yüzey üzerinde yoğunlaşarak tekrar katı hale dönüşebilir. Süblimleşme düşük basınçta gerçekleştirilirse ürün verimi oldukça artacaktır ve bu şartlar altında daha düşük bir sıcaklık uygulanabildiğinden termal bozulma olasılığı azalacaktır. Düşük basınçtaki süblimleşme (vakum süblimleşme) için değişik ölçekli operasyon aralıklarına uyan çeşitli aparatlar mevcuttur. En basit tasarıma sahip aparat Şekil 5.1 a ve b de görülmektedir. Saf olmayan madde tüpün dibine koyulur, kondenser yerleştirilir ve çeşmeye bağlanır. T- bağlantısı yağlı vakum pompasına bağlanır (su trompu da kullanılabilir). Sistemden hava tahliyesi yavaşça yapılmalıdır, çünkü az miktarlarda nem, solvent ve havanın kristal kütleden ani çıkışı katının kondensere sıçramasına sebep olabilir. Bu da, elde edilecek süblimleşecek maddenin kirlenmesine yol açar. Dıştaki tüp direkt alevle değil, sıcak su banyosuna daldırılarak ısıtılır. Çünkü, direkt alevle sıcaklık kontrolu daha zordur ve yüksek sıcaklıktan dolayı madde bozulabilir. Sıcaklık yavaşça artırılmalı ve süblimleşmenin gözlemlenebileceği bir düzeyde tutulmalıdır. (a) (b) Şekil 5.1. Vakum Süblimleşme Aparatı Ham kafein örneğini etrafı yandan kollu test tüpünün içine ya da süblimleşme tüpünün içine yerleştirin. Yoğunlaşma tüpünü parçalanmış buzla doldurduktan sonra aparatın içine yerleştirin ya da kondenseri aparatın içine sokun ve çeşmeye bağlayın. Aparatı, yoğunlaşma tüpünün dip kısmı yağ yüzey seviyesine gelene kadar, ısıtılmış yağ ya da sıcak suya daldırın. Yan kolu su trompuna bağlayın, vakum açık olaraktan örneği kafein süblimleşmeye başlayana kadar dikkatlice ısıtın. Kafein kondenser üzerinde süblimleşmelidir. Süblimleşme tamamlandığında, kondenseri dikkatlice çıkartın ve süblimleşmiş kafeini küçük ve temiz bir saat camına sıyırarak aktarın. Saflaştırılmış ürünün erime noktasını belirleyin.
b) Kristallendirme 0,1 g ham kafeini küçük kuru bir tüpe, behere ya da erlenmeyer kabına aktarın, 1-2 ml kuru aseton ekleyin ve su banyosunda ısıtıp kafeini çözün. Eğer çözülmemiş madde kalmışsa, karışımı içine az miktarda pamuk sıkıştırılmış küçük bir pipet kullanarak süzün. Beheri ateşten alın ve damla damla çözelti bulanıklaşmaya başlayana kadar petrol eteri (kaynama noktası 30-60 C) ekleyin. Çözeltiyi soğutun ve kafeinin kristallenmesi için kenara bırakın. Ürünü vakum filtresi (Hirsch hunisi) ile toplayın, 1 ml soğuk petrol eter ile yıkayın, kurumaya bırakın ve erime noktasını belirleyin. Organik Sıvıların Damıtma (Destilasyon) ile Ayrıştırılması ve Saflaştırılması Damıtma sıvıların ayrıştırılmasında ve saflaştırılmasında kullanılan bir tekniktir. Sıvının kaynama noktasına kadar ısıtılması, buharının yoğunlaştığı soğutucu bir aygıta (kondenser) yönlendirilmesi ve yoğunlaşan maddenin bir kaba toplanmasından oluşur. Sıvı karışımların niteliğine bağlı olarak çeşitli damıtma metodları kullanılabilir: a) Basit Damıtma: Basitçe bir sıvının kaynama noktasına ısıtılmasından, buharının yoğunlaştırıcıya (kondenser) yönlendirilmesi ve yoğunlaşan maddenin normal basınçta toplanmasından oluşur. b) Su Buharı Damıtması: Su ile karışmayan sıvıların kendi kaynama noktalarından daha düşük sıcaklıktaki destilasyonları için kullanılan bir yöntemdir. Genellikle, suda çözünmeyen ve 100 o C da 5-10 mmhg buhar basıncına sahip olan sıvıların damıtılmasında kullanılır. Ayrı bir balonda üretilen su buharı, bir boruyla damıtılacak karışımın içine gönderilir. Su buharı sıcaklığı suyun ve organik maddenin kaynama noktalarının altında yer alır. Bu, yüksek kaynama noktalarına sahip birçok maddenin düşük sıcaklıkta damıtılmasına imkan verir ve maddelerin atmosferik basınçta tek başlarına damıtılmasıyla bozunduğu durumlarda kullanılan değerli bir yöntemdir. Su buharı ve madde buharı karışımının toplam basıncı ( P t = P su + P m ) atmosferik basınca (760 mmhg= 76 cmhg= 1 atm) eşit olduğunda kaynama ve damıtma başlar. Örneğin, bromobenzen ve suyun 95.3 o C daki buhar basınçları 119 mmhg ve 641 mmhg dir. Bu karışımın 95.3 o C daki buhar basınçları toplamı 760 mmhg olacağından su-bromobenzen karışımı bu sıcaklıkta kaynar. Oysa bromobenzenin kaynama noktası 156 o C dır. c) Fraksiyonlu (Kısımlı) Damıtma: Kaynama noktaları birbirine yakın sıvıların birbirinden ayrılması için kullanılan bir metoddur. Ayırma, basit damıtma aparatına bir fraksiyon kolonu eklenerek yapılır. Fraksiyon kolonu, damıtma işleminin etkinliğini artıran bir alettir. Đçinde etkisiz materyaller (cam boncuklar gibi) veya yükselen buharın üzerinde yoğunlaşabildiği yüzeyi artıran diğer düzenekler bulunan dik bir kolondan ibarettir. Isınan sıcak buhar kolonda yükselir, yoğunlaşır ve sıvı kolona geri akar. Sıvı kolonda aşağıya indiğinde, kolonun daha sıcak kısımlarına ulaşır, tekrar buharlaşır ve daha uçucu maddeler bir kez daha kolonda yükselir. Eğer kolon elverişli ise bu işlem içeride defalarca tekrarlanır ve karışımdaki kaynama noktası en düşük olan madde saf halde ayrılıp toplanacaktır. Bu yöntem silinmeli
d) Vakum Damıtma: Birçok organik madde atmosferik basınç altında tatmin edici bir şekilde damıtılamaz. Çünkü normal kaynama noktasına ulaşmadan kısmen veya tamamen bozulabilirler. Dış basınç azaltılarak kaynama noktası oldukça düşürülür ve genellikle damıtma bozulma tehlikesi olmadan yapılabilir. Eugenol in Su Buharı Damıtması Kullanılarak Ekstrakt Edilmesi 15 g karanfili havan içinde dövün ve sonra ezilmiş karanfilleri 250 ml lik bir balon jojenin içindeki 150 ml suya ekleyin. Kabı damıtma aparatına bağlayın. Süspansiyonu, ilk önce kaynayana kadar dikkatlice ısıtarak (toplama kabına ulaşmamasına dikkat ederek) kaynatın ve 100 ml damıtık sıvı elde edilene kadar damıtma işlemine devam edin. Damıtık sıvı, özellikle işlemin ilk kısmında, bulanık olacaktır. Damıtık (damıtılmış olabilirmi) sıvının kokusunu not edin. Damıtık sıvıyı oda sıcaklığına soğutun, 100 ml lik bir ayırma hunisine aktarın ve 3 kez 10 ml lik diklorometanla ekstraksiyon yapın (diklorometan sudan daha yoğundur ve alt tabakayı oluşturur). Birleştirilmiş diklorometan ekstraktlarını 50 ml lik kuru bir behere aktarın ve sonra diklorometanı uçurmak için beheri çeker ocağa koyup yavaşça ısıtın. Beherde, karanfil yağı olarak bilinen renksiz veya soluk sarı renkte bir madde kalacaktır. Havuçtan Karoten Đzolasyonu (provitamin A) 1. Havuçları ince uzun parçalar halinde dilimleyin. Fırın içerisinde yaklaşık 45 C de bir gece boyunca kurutun. 2. Kurumuş havuç parçalarını havanın içine koyun. Üzerine bir çay kaşığı ince kum koyun, hepsini aseton ile iyice ıslatın ve bir kaç dakika ezin. 3. Havandaki içeriği süzerek buharlaşma kabına aktarın. 4. Çeker ocak içerisinde sıcak bir yüzeyde çözücüyü uçurun. Alfa-Karoten Beta-Karoten
Karotenin (provitamin A) ve A vitamininin Teşhisi Bir cam saati üzerine veya küçük bir deney tüpüne elde edilen karotenden az bir miktar yerleştirin ve 1-2 damla derişik sülfirik asit ekleyin. Gözlemlerinizi yazın. Hücre Özsuyunda Çözünen Kırmızı Lahana Boyalarının Ayrıştırılması 1. 6 ml 1-bütanol, 1 ml derişik asetik asiti ve 2 ml suyu karıştırın ve çözeltiyi bir behere boşaltın. 2. 10 gramlık kırmızı lahana yaprağını kesin ve 1 çay kaşığı kum ile birlikte havan içine koyun. 20 ml metanolik hidroklorik asit (1 ml % 37 lik hidroklorik asit ve 36 ml metanol) ekleyin, 5 dakika boyunca iyice ezin ve küçük bir kaba süzün. Çözelti, sıcak bir yüzeyde ilk hacminin yarısına kadar buharlaştırılabilir. 3. Çözeltiyi birkaç sefer selüloz folyolara uygulayın ve her uygulama arasında kurutun. 4. Folyoları ayırma kabına yerleştirin ve kromatogramların 1 saat yürümesini sağlayın. Boyalar ışığa duyarlı olduğundan ışıktan uzak tutun. Folyoları ayırın, çözelti önlerini işaretleyin ve kurutun. Renklendirme ve Hesaplama Birinci folyoyu, uzun ve kısa dalga boylarındaki UV ışığına ek olarak, gün ışığında gözleyin. Đkinci folyoyu, içinde birkaç ml derişik amonyak çözeltisi bulunan büyük bir beher içinde noktalar mavi-yeşil renge dönene kadar birkaç saniye tutun. Ayrıca uzun ve kısa dalga boylarındaki UV ışığına ek olarak, gün ışığında gözleyin. Noktaların sayılarını ve renklerini kaydedin: Güneş ışığında görünen maddeler, bunlar kırmızı-mor veya mavi-yeşil renklidir, antosiyaninlerdir. Güneş ışığında görünmeyen noktalar (amonyakla soluk sarı renkte gözükebilirler) UV ışığında mavi veya mavimsi beyaz florasandırlar ve bunlara antoksantinler denir. Sorular 1. Asistanın talimatlarına göre saf kafeinin ve ham eugenolün kızılötesi spektrumunu belirleyin ve bu spektrumdaki ana absorpsiyonları yorumlayın. 2. Eugenolde karbon-karbon çift bağının varlığını test edin. (bromür testi) 3. Kafeinin süblimleşme ile saflaştırılması işleminde vakum hangi amaçla kullanılmıştır?