21 (2), 89-94, 2009 21 (2), 89-94, 2009

Fırat Üniv. Fen Bilimleri Dergisi Fırat Univ. Journal of Science 21 (2), 89-94, 2009 21 (2), 89-94, 2009 Aeromonas hydrophila İle Enfekte Edilen Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss) nın Gastroenteropankreatik Sisteminin İmmunohistokimyasal Olarak İncelenmesi Özet Sibel KÖPRÜCÜ* Mustafa SARIEYYÜPOĞLU* Berrin GENÇER TARAKÇI** *Fırat Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi, Su Ürünleri Yetiştiriciliği Bölümü, Hastalık ABD, Elazığ. **Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji ABD, Elazığ. skoprucu@firat.edu.tr (Geliş/Received:04.02.2009; Kabul/Accepted:07.04.2009) Bu araştırmada, toplam 80 adet gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) kullanıldı. Bir kontrol ve üç deney grubu oluşturuldu. Deney gruplarındaki balıklar Aeromonas hydrophila ile solungaçlarına sürme, intraperitoneal ve intramüsküler enjeksiyon yollarıyla enfekte edildi. İmmunohistokimyasal olarak, kontrol ve deney gruplarında farklılık gözlenmedi. Glukagon immunoreaktivitesi (IR) pankreas ve ince bağırsakta; insülin IR si pankreasta; substans P IR si pilorik mide ve ince bağırsakta; gastrin IR si pilorik midede tespit edildi. Calbindin IR si ise incelenen hiçbir organda belirlenemedi. Anahtar Kelimeler: Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss), Aeromonas hydrophila, İmmunohistokimya, Gastroenteropankreatik Sistem. Immunohistochemical Investigation in Gastroenteropancreatic System of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Infected with Aeromonas hydrophila Abstract A total of eighty rainbow trout were used in this study. Three experimental and one control groups were made from those fishes. Experimental groups were infected with Aeromonas hydrophila by smearing on the gills, intraperithoneal and intramuscularly injections of bacterium. Immunohistochemical observation of gut hormons showed that no difference in between control and experimental groups. Glukagon immunoreactivity (IR) was seen in pancreas and small intestine. Insuline IR was only localized in pancreas. Substance P IR was seen in the pyloric region of stomach and small intestine.gastrin IR was detected only localized in pyloric stomach. Calbindin IR was not seen any organs examined. Key Words: Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss), Aeromonas hydrophila, Immunohistochemistry, Gastroenteropancreatic System 1. Giriş Salmonidae familyasına ait olan gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) iç su balıkları içerisinde ticari değeri yüksek olan, lezzetli, sevilen, dünyada ve ülkemizde yetiştiriciliği yaygın olarak yapılan alabalık türüdür. Hemen hemen tüm canlılarda özellikle de balıklarda çeşitli semptomlar oluşturarak büyük ekonomik kayıplara neden olması ile bilinen bakteri türlerinden birisi de Aeromonas hydrophila dır [1, 2]. Normalde balıkların bağırsak floralarında da bulunan bu bakteri stres faktörlerinin etkisiyle patojen hale geçebilir [1, 3]. Gökkuşağı alabalığı hareketli aeromonas septisemisine karşı en hassas ve duyarlı olan türlerden biridir [1, 2, 4-6]. Aeromonas hydrophila kabuklu hayvanların, amfibilerin bağırsak floralarında ve vücut yüzeyinde bulunur. Aynı zamanda sürüngenler, omurgasızlar ve insanların da dahil olduğu birçok memelide hastalık etkeni olarak da bildirilmiştir [1, 2, 6, 7].

Omurgalı hayvanların sindirim kanalı epiteline dağılmış olan endokrin hücrelerinden birçok hormonun sentezi ve salınımı sağlanır. Bu hormonların bazıları sadece sindirim kanalı organlarına, bazıları ise vücuttaki tüm organlara etki etmektedir [8]. Birçok balık türünün de gastro-intestinal kanalındaki peptidlerin varlığı immunuhistokimyasal yöntemler uygulanarak tespit edilmiştir [9-15]. Bu araştırmada ise A. hydrophila nın deneysel olarak gökkuşağı alabalığına verilerek, etkenin sindirim kanalı (Substans P, gastrin, calbindin, glukagon içeren endokrin hücreleri) ve pankreastaki (insülin ve glukagon içeren endokrin hücreleri) endokrin hücrelerine olan etkisinin immunohistokimyasal yönden incelenmesi amaçlanmıştır. 2. Materyal ve Metot Araştırmada 28-35 cm uzunluğunda, 250-300 g ağırlığında ve 18 aylık toplam 80 adet gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) kullanıldı. Gökkuşağı alabalığında enfeksiyon oluşmada kullanılan referans Aeromonas suşu Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı ndan temin edildi. Çalışmada, stok için 6x2x1 m, kontrol ve deney grupları için ise 3x2x1 m boyutlarındaki beton havuzlar kullanıldı. Havuzlara suyu devir daim yapan su motoru monte edildi. Suyun bakteriyolojik arıtımını sağlamak amacıyla ultraviyole lambalı su arıtma cihazı bu motora bağlandı. Alabalıkların A. hydrophila ile enfekte edilmesi; solungaçlara sürme (steril eküvyonlar taze hazırlanmış kültüre batırıldıktan sonra balıkların sağ ve sol solungaçlarına sürüldü), intraperitoneal enjeksiyon (steril enjektörlerle taze hazırlanmış kültürden 5 er cc balıklara intraperitoneal enjeksiyonla verildi), intramüsküler enjeksiyon (steril enjektörlerle taze hazırlanmış kültürden 5 er cc balıklara intramüsküler enjeksiyonla verildi) şeklinde yapıldı. Kontrol grubu balıklar ise yine ayrı bir beton havuzda tutuldu. Çalışma süresince deney grubu balıklarına yem verilmedi. İmmunohistokimya prosedürü: Alabalıklara A. hydrophila suşunun çeşitli yollarla inkübasyonundan sonra, balıklar gözlem Sibel Köprücü, Mustafa Sarıeyyüpoğlu, Berrin Gençer Tarakçı 90 altında tutuldu. Ölen balıkların hemen dış ve iç organlarındaki klinik semptomları belirlendi. Bunun yanında ölmek üzere olan veya şüpheli olan balıklara ise genel aneztezi altında usulüne uygun biçimde otopsi yapıldı. Kardiak mide, pilorik mide, ince bağırsak, kalın bağırsak, pankreas ve solungaçlardan doku örnekleri alınarak %10 luk nötral tamponlu formalin (ph 7,2) solüsyonu içinde 24-26 saat süreyle tespit edildikten sonra, rutin histolojik doku prosedüründen geçirildi ve mikrotomda 5-6 µm kalınlığında kesitler alındı [16]. İmmunohistokimyasal boyama avidinbiotin horseradish peroksidaz kompleks (ABC) tekniği ve peroksidaz anti peroksidaz (PAP) tekniği kullanılarak gerçekleştirildi. Endojenöz peroksidaz aktivitesini azaltmak için kesitler metanolde hazırlanmış %0,08 hidrojen peroksidaz (H 2 O 2 ) solüsyonunda 5 dakika bekletildi [17]. Spesifik olmayan boyamaları engellemek için 0,1 M PBS ile sulandırılan normal keçi serumu (1:10) kullanıldı. Avidin-biotin horseradish peroksidaz kompleks (ABC) tekniğinde kesitler 16-20 saat 4 o C de Mouse anti calbindin (Sigma) ile inkübe edildiler. Antiserum, içerisinde % 2,5 bovine serum albumin ve % 0,25 sodyum azid içeren PBS ile 1:200 oranında sulandırıldı. Sonra biotinleştirilmiş horse anti mouse IgG (Dako) kompleksi ardından streptavidin horseradish peroksidaz (Dako) ile oda sıcaklığında 1 er saat süreyle inkübe edildiler. Her iki antiserumda PBS ile 1:50 oranında sulandırıldı. Her inkübasyon öncesinde kesitler 30 dk PBS ile yıkandı. Daha sonra, kesitler glukoz oksidaz-dab-nikel amonyum sülfat (GDN) substratına [18] daldırılıp, su ile yıkanıp, eosin ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi. Peroksidaz anti peroksidaz (PAP) tekniğinde ise kesitler 16-20 saat 4 o C de rabbit anti-insülin IgG (1:1000), rabbit anti-gastrin IgG (1:10000), rabbit antisubstans P IgG (1:1500), rabbit anti-glukagon IgG (1:20000) (Sigma) ile inkübe edildiler. Antiserumlar, içerisinde % 2,5 bovine serum albumin ve %0,25 sodyum azid içeren PBS ile sulandırıldılar. Kesitler sonra goat anti rabbit IgG (Dako) ve bunu takiben horseradish peroksidaz (Zymed) ile oda sıcaklığında 1 er saat süreyle inkübe edildiler. Her iki antiserumda PBS ile 1:50 oranında sulandırıldı.

Aeromonas hydrophila İle Enfekte Edilen Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss) nın Gastroenteropankreatik Sisteminin Her inkübasyon öncesinde kesitler 30 dk PBS ile yıkandı. Daha sonra, kesitler glukoz oksidaz-dab-nikel amonyum sülfat (GDN) substratına [18] daldırılıp, su ile yıkanıp, eosin ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi. 3. Bulgular Kontrol grubu: Glukagon-immunoreaktif (IR) hücrelere midede rastlanmazken, ince bağırsağın epitelyum kısmında (Şekil 1) ve pankreasın langerhans adacıklarında gözlendi. İnsülin IR si gösteren endokrin hücreler sadece pankreasta (Şekil 3) görüldü. Gastrin içeren endokrin hücrelerine sadece midenin pilorik bölgesinde bazen epitelyum katmanda, bazen de lamina propriyadaki bezlerde tespit edildi (Şekil 5). Substans P midenin pilorik bölümünün (Şekil 7) ve ince bağırsağın epitelini oluşturan hücrelerin arasında belirlendi. Calbindin içeren endokrin hücrelerine ise araştırmada incelenen dokuların hiçbirinde rastlanmadı. Deney grupları: Solungaçlarına sürme, intraperitoneal ve intramüsküler enjeksiyon yolu ile infeksiyon oluşturulan alabalık gruplarının mide, bağırsak ve pankreasında gözlemlenen glukagon, gastrin ve insülin IR leri kontrol grubundaki bulgularla benzer bulundu (Şekil 2, 4 ve 6). Fakat kontrol grubu balıkların pilorik mide ve ince bağırsağında belirlenen substans P IR si deney gruplarında tespit edilememiştir. Şekil 1. Kontrol grubu balıkların ince bağırsağındaki glukagon IR hücreler, Şekil 2. Aeromonas hydrophila nın intraperitoneal enjeksiyon yolu ile enfekte edilmiş balıkların ince bağırsağındaki glukagon IR hücreler, immunohistokimya boyaması. X400. Şekil 3. Kontrol grubu balıkların pankreasındaki insülin IR hücreleri, immunohistokimya boyaması. X400. 91

Sibel Köprücü, Mustafa Sarıeyyüpoğlu, Berrin Gençer Tarakçı Şekil 4. Aeromonas hydrophila nın intramüsküler enjeksiyon yolu ile enfekte edilmiş balıkların pankreasındaki insülin IR hücreler, immunohistokimya boyaması. X200. Şekil 5. Kontrol grubu balıkların pilorik midesindeki gastrin IR hücreleri, Şekil 6. Aeromonas hydrophila nın intraperitoneal enjeksiyon yolu ile enfekte edilmiş balıkların pilorik midesindeki gastrin IR hücreler, Şekil 7. Kontrol grubu balıkların pilorik midesindeki substans P IR hücreleri, 4. Tartışma ve Sonuç Bu araştırmada A. hydrophila nın deneysel olarak gökkuşağı alabalığına verilerek, etkenin sindirim kanalı (substans P, gastrin, calbindin, glukagon içeren endokrin hücreleri) ve pankreastaki (insülin ve glukagon içeren endokrin hücreleri) endokrin hücrelerine olan etkisi immunohistokimyasal yönden incelenmiştir. Yapılan bu çalışmada, gastrin IR hücreleri gökkuşağı alabalığının pilorik midesinde tespit edilmiştir. Bu sınırlı dağılım, Jonsson ve diğ. [19] tarafından yapılan bir çalışmada Gadus morhua nın pilorik midesinde de belirlenmiştir. Elbal ve diğ. [20] Mugil saliens in gastrik bezlerinin sefalik bölgesinde gastrin IR hücrelerinin bulunduğunu saptamışlardır. Hımıck ve Peter [14] Carassius auratus un, Yui ve diğ. [15] Lampetra japonica nın midesinde gastrin IR hücrelerinin varlığını bildirmişlerdir. Holmgreen ve diğ. [9], Powell ve diğ. [11], Beorlegui ve diğ. [12], Barrenechea ve diğ. [21] Oncorhynchus mykiss in, Cimini ve diğ. [22] Scyliorhninus stellaris in sindirim kanalında substans P içeren hücreleri tespit etmişlerdir. Bu araştırmada da kontrol grubundaki gökkuşağı alabalıklarının mide ve ince bağırsağında çok sayıda substans P içeren hücreler belirlenmiştir. Elbal ve diğ. [20] teleost balıklardan Mugil saliens in midesinde glukagon içeren hücreler 92

Aeromonas hydrophila İle Enfekte Edilen Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss) nın Gastroenteropankreatik Sisteminin tespit etmişlerdir. Rombout ve diğ. [10] ise Barbus conchonius da glukagon içeren hücrelerin gastro-entero-pankreatik endokrin sistemde bulunduğunu saptamışlardır. Glukagon IR hücrelerin genel dağılımının teleostlar ve kıkırdaklı balıklarda farklılık gösterdiği, teleostlarda glukagon içeren hücrelerin bağırsaklarda [12, 23], kıkırdaklı balıklarda ise gastrik mukozada yer aldığı bildirilmiştir [24]. Bu araştırmada kullanılan gökkuşağı alabalığında ise glukagon IR si pankreasta langerhans adacıklarında ve ön bağırsak bölümlerinde görülürken midede rastlanılmamıştır. Dicentrarchus labrax [25-26], Chim aera monstrosa [27], Osteoglossum bicirrhosum, Pantodon buchholzi, Notopterus chitala, Gnathonemus petersii [28] ve Oreochromis niloticus [29] gibi birçok teleost balıkta insülin IR si pankreasın langerhans adacıklarında saptanmıştır. Bu çalışmada kullanılan gökkuşağı alabalığında da insülin IR si pankreasın langerhans adacıklarında tespit edilmiştir. Gökkuşağı alabalığında yapılan bu araştırmada calbindin IR si sindirim kanalı ve pankreasta görülmemiştir. Bu durum, balıkların bu organlarındaki kalsiyum metabolizmasının 5. Kaynaklar 1. Cipriano, R.C., Bullock, G.L., Pyle, S.W. (1984). Aeromonas hydrophila and Motile Septicemias of Fish. United States Department of the Interior, Fish and Wildlife Service, Division of Fishery Research, Washington, D.C., Fish Disease Leaflet 68, 23s. 2. Austin, B., Austin, D.A. (1987). Bacterial Fish Pathogens: Disease in Farmed and Wild Fish. Ellis Horwood Limit. Publis. Chichester, England, p. 111-195. 3. Austin, B., Al-Zahrani, M.J. (1988). The effect of antimicrobial compounds on the gastrointestinal microflora of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, Journal of Fish Biology, 33, 1-14. 4. Peters, G., Faisal, M., Lang, T., Ahmed, I. (1988). Stress caused by social interaction and its effect on susceptibiyity to Aeromonas hydrophila infection in rainbow trout, Salmo gairdneri, Disease of Aquatic Organisms, 4(2), 83-89. 5. Arda, M. (1997). Temel Mikrobiyoloji. Medisan Yayınları, No: 25, 1. Baskı, Ankara, 490s. memelilerdekinden farklı bir mekanizma tarafından düzenlendiğini göstermektedir. Aeromonas hydrophila ile enfeksiyon oluşturulan deneysel gruplardaki balıkların mide, bağırsaklar ve pankreasındaki gastrin, glukagon ve insülin IR si kontrol grubundakine benzer bir dağılım göstermiştir. Substans P IR si kontrol grubu balıkların pilorik mide ve ince bağırsağında tespit edilmesine rağmen, enfekte gruplarda bu immunoreaktiviteye rastlanılmamıştır. Bu durumun, enfekte balıkların enfeksiyon süresince aç bırakılmasına bağlı olarak şekillenebileceği söylenebilir. Çünkü, substans P IR sinin sindirim kanalı endokrin hücrelerinden sentezlenmesinin alınan besin ile bağlantılı olduğu Inverson [30], Walker ve Thompson [31] tarafından da bildirilmiştir. Sonuç olarak, kontrol ve enfeksiyon oluşturulan deney grupları arasında endokrin hücrelerinin incelenen hormonları yönünden herhangi bir farklılık görülmemiştir. Bu durum, A. hydrophila etkeninin gökkuşağı alabalığının gastroenteropankreatik sistemi üzerine immunohistokimyasal olarak herhangi bir etkisinin olmadığını göstermektedir. 6. Arda, M., Minbay, A., Aydın, N., Akay, Ö., İzgür, M., Leleoğlu, N., Karaman, M., Ilgaz, A., Diker, S. (1997). Özel Mikrobiyoloji. Medisan Yayınları, No: 26, 4. Baskı, Ankara, s. 59-62. 7. Grizzle, J.M., Kiryu, Y. (1993). Histopathology of gill, liver, and pancreas, and serum enzyme levels of channel catfish infected with Aeromonas hydrophila complex, Journal of Aquatic Animal Health, 5(1), 36-50. 8. Matty, A.J. (1985). Fish Endocrinology. Croon Helm. Ltd., London and Sydney, 288p. 9. Holmgreen, S., Vaillant, C., Dimaline, R. (1982). VIP, substans P, gastrin/cck, bombesin, somatostatin and glucagon-like immunoreactives in the gut of the rainbow trout, Salmo gairdneri, Cell and Tissue Research, 223(1), 141-53. 10. Rombout, J.H.W.M., Grinten, C.P.M., Binkhorst, P.F.M., Thiele, T.J.J., Schooneveld, H. (1986). Immunocytochemical identification and localization of peptide hormones in the gastro-entero-pancreatic (GEP) endocrine system of the mouse and stomachless fish, 93

Sibel Köprücü, Mustafa Sarıeyyüpoğlu, Berrin Gençer Tarakçı Barbus conchonius (Teleostei, cyprinidae), Histochemistry, 85(6), 467-473. 11. Powell, M.D., Wright, G.M., Burka, F. (1991). Degranulation of eosinophilic granule cells induced by capsaicin and substance P in the intestine of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum), Cell Tissue Research, 266(3), 469-474. 12. Beorlegui, C, Martinez, A., Sesma, P. (1992). Endocrine cells and nerves in the pyloric caeca and the intestine Oncorhynchus mykiss (teleostei): An immunocytochemical study, General and Comparative Endocrinology, 86(3), 483-495. 13. Olsson, C., Holmgreen, S. (1994). Distribution of PACAP (Pituitaryadenylate cyclaseactivating polypeptide) like and helospectinlike peptides in the teleost gut, Cell and Tissue Research, 277, 539-547. 14. Hımıck, B.A., Peter, RE. (1994). CCK/gastrinlike immunoreaktivity in brain and gut and CCK suppression of feeding in goldfish, American Journal of Physiology, 267(3-2), 841-51. 15. Yui, R., Nagata, Y., Fujita, T. (1988). Immunocytochemical studies on the islet and the gut of the arctic lamprey, Lampetra japonica, Archives of Histology and Cytology, 51(1), 109-119. 16. Luna L.G. (1968). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third Ed., McGraw-Hill Company, New York. 17. Sternberger, L.A. (1986). Immunocytochemistry. Third Ed., John Wiley, New York. 18. Shu, S., Ju, G., Fan, L. (1988). The glucose oxidase-dab-nickel method in peroxidase histochemistry of the nervous system, Neuroscience Letters, 85, 169-171. 19. Jonsson, A.C., Holmgreen, S., Holstein, B. (1987). Gastrin/CCK-like immunoreaktivity in endocrine cells and nerves in the gastrointestinal tract of the cod, Gadus morhua, and the effect of peptides of the gastrin/cck family on cod gastrointestinal smooth muscle, General and Comparative Endocrinology, 66, 190-202. 20. Elbal, M.T. Lozano, M.T., Agullerio, B. (1988). The endocrine cells in the gut of Mugil saliens Risco, 1810 (Teleostei): An immunocytochemical and ultrastructural study, General and Comparative Endocrinology, 70, 231-246. 21. Barrenechea, M.A., Lopez, J., Martinez, A. (1994). Regulatory peptides in gastric endocrine cells of the rainbow trout Oncorhynchus mykiss: General distribution and colocalizations, Tissue and Cell, 26(3), 309-321. 22. Cimini, V., Van Noorden, S., Polak, J.M. (1989). Co-localization of substance p-bombesin-and peptide histidine isoleucine-like peptides in gut endocrine cells of the dogfish Scyliorhninus stellaris, Anat.Embr., 179, 605-614. 23. Elbal, M.T., Agullerio, B. (1986). An immunocytochemical and ultrastructural study of endocrine cells in the gut of a teleost fish, Sparus auratus L., General and Comparative Endocrinology, 64, 339-354. 24. Tagliafierro, G., Farrini, L., Rossi, G.C., Vacchi, M. (1989). Distribution of somatostatin and glucagon immunoreactive cells in the gastric mucosa of some cartilaginous fishes, General and Comparative Endocrinology, 75, 1-19. 25. Carillo, M., Zanuy, S., Duve, H., Thorpe, A. (1986). Identification of hormone-producing cells of the endocrine pancreas of the sea bass, Dicentrarchus labrax, by immunocytochemistry, General and Comparative Endocrinology, 61(2), 287-301. 26. Lozano, M.T., Garcia, A.A., Abad, M.E., Agullerio, B. (1991). Pancreatic endocrine cells in sea bass (Dicentrarchus labrax L.) immunocytochemical study of insülin and somatostatin peptid, General and Comparative Endocrinology, 81(2), 198-206. 27. Yui, R., Fujita, T. (1986). Immunocytochemical studies on the pancreatic islets of the ratfish, Chim aera monstrosa, Archivum Histologicum Japonicum, 49(3), 369-77. 28. Al-Mahrouki, AA., Youson, J.H. (1999). Ultrastructure and immunocytochemistry of the islet organ of Teleostei, General and Comparative Endocrinology, 116(3), 409-421. 29. Yang, H., Morrison, C.M., Conlon, J.M., Laybolt, K., Wright J.R. (1999). Immunocytochemical characterization of the pancreatic islet of Oreochrombe (Oreochromis niloticus), General and Comparative Endocrinology, 114(1), 47-56. 30. Inverson, LL. (1982). Substance P. British Medical Bulletin, No: 38, 277p. 31. Walker, JP., Thompson, J.C. (1987). Substance P in Gastrointestinal Endocrinology, (Ed) Thompson J.C., McGraw-Hill, New York, 317p. 94