DNA Üzerinde Mutagenezler Yapılarak Enzimlere İstenilen Özelliklerin Kazandırılması

YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DNA Üzerinde Mutagenezler Yapılarak Enzimlere İstenilen Özelliklerin Kazandırılması Özgün MAVUK 07056001 Biyomühendislik Anabilim Dalında Hazırlanan PROJE ÖDEVİ Ödev Danışmanı : Doç. Dr. Dilek TURGUT-BALIK (YTÜ) İSTANBUL, 2009

İÇİNDEKİLER Sayfa SİMGE LİSTESİ...iv KISALTMA LİSTESİ....v ŞEKİL LİSTESİ..vii ÇİZELGE LİSTESİ..iix ÖNSÖZ......ix ÖZET.....x 1. GİRİŞ.1 1.1 Sıtma.........1 1.2 Sıtma Yaşam Döngüsü ve Parazitleri........5 Omurgasız Canlıdaki (Vektör) Yaşam Döngüsü...4 Omurgalı Canlıdaki (Konak) Yaşam Döngüsü.....5 1.2.2 Sıtma Parazitleri......7 1.3 Sıtmanın Dünyadaki ve Türkiye'deki Yeri. 11 1.3.1 Sıtmanın Dünyadaki Önemi...........11 1.3.2 Sıtma'nın Türkiye'deki Önemi......17 1.4 Sıtma Metabolizması..24 Yağ Asitleri ve Lipitler 25 Proteinler ve Amino asitler.26 Nükleotidler ve Nükleik Asitler.27 Vitaminler ve Kofaktörler..28 Redoks Metabolizması 28 Hücreye Alım ve Geçirgenlik.29 Karbonhidratlar ve Enerji Üretimi...30 1.4.2 Sıtmanın Anaerobik Metabolizması 33

1.5 Kilit Enzimler........35 1.5.2 Laktat Dehidrogenaz(LDH)...36 2. MATERYAL VE YÖNTEM.........37 2.1 Yönlendirilmiş Mutagenez...37 2.2 Materyal.....40 PCR 1 40 PCR 2...41 2.2.1 Genomik DNA....42 2.2.2 Primerler.......42 2.3 Yöntem........43 1. Aşama 43 2. Aşama 43 3. BULGULAR VE TARTIŞMA....44 KAYNAKLAR. 44

SİMGE LİSTESİ µl Mikrolitre µm Mikromolar kb k cat kda M ml mm ng nm kilobaz Kinetik -Katalizleme Kilodalton Molar Mililitre Milimolar Nanogram Nanomolar ºC Santigrat derece pmol Tm u Pikomol Erime sıcaklığı Ünite

KISALTMALAR 3D A AIDS AIDS APAD + ATP ATP C DDT dh2o DHFR DNA dntp G G6PD GFP GİS GNDA H5N1 Üç boyutlu Adenin Edinilmiş Bağışıklık Eksikliği Sendromu Kazanılmış immün yetmezlik sendromu 3-asetilpiridin adenin dinükleotid koenzimi Adenozintrifosfat Adenozin trifosfat Sitozin Dikloro difenol trikloroethan Distile su Dihidrofolat redüktaz Deoksiribonükleikasit Deoksiribonükleotidtrifosfat Guanin Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz Yeşil fluoresan protein Gastrointestinal Sistem İnfeksiyonları Gossilik nitril-1,1 diasetat Hemaglutinin tip 5 ve nöraminidaz tip 1(kuş gribi) IOM Ulusal Tıp Enstitüsü (Institute of Medicine ) LDH M.Ö. M4-LDH Laktat dehidrogenaz Milattan Önce Kas tipi laktat dehidrogenaz

mrna NAD NAD+ NADH NADP NPP PCR Pf PfLDH Mesajcı RNA Nicotinamide adenine dinucleotide Nikotiamid adenin dinükleotid Nikotinamid adenin dinükleotid (indirgenmiş) Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat Yeni alım yolakları (new permeation pathways) Polimeraz zincir reaksiyonu Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum laktat dehidrogenaz enzimi Pfu polimeraz Pyrococcus furiosus'tan elde edilen DNA polimeraz pkk P.knowlesi Pm Po Pv PvLDH PVM RNA ROI rrna SOD T TCA TVM U WHO Protein kinaz C-bağlı kinaz Plasmodium knowlesi Plasmodium malariae Plasmodium ovale Plasmodium vivax Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimi Parazitoporus kofuk membran Ribonükleikasit Reaktif oksijen ara maddeleridir (reactive oxygen intermediates) Ribozomal RNA Süperoksit dismutaz Timin Trikarboksilik asit Tubülo-veziküler membran Urasil Dünya Sağlık Örgütü

ŞEKİL LİSTESİ Şekil 1.1 Sıtmanın Ana Semptonları....2.Şekil 1.2 Sıtmanın sivrisinekteki yaşam döngüsü.....4 Şekil 1.3 Sıtmanın insandaki yaşam döngüsü.....5 Şekil 1.4 Plasmodium parazitinin hayat döngüsü......6 Şekil 1.5 2006 yılında dünya çapında saptanan P.falciparum kaynaklı sıtma olguları.7 Şekil 1.6 Sıtmada tipik ateş düzenleri......9 Şekil 1.7 Sıtma durumuna göre ülke kategorizasyonu.....11 Şekil 1.8 Afrika da görülen sıtmaya bağlı ölüm......12 Şekil 1.9 P. falciparum da klorokin direncinin dünyada yayılımı......12 Şekil 1.10 Türkiye Sağlık Profili.....18 Şekil 1.11 Bağlantılı metabolik yolaklar.....25 Şekil 1.12 Apikoplastta yağ asidi sentezi.....26 Şekil 1.13 Konak sitoplasmasının hücreye alınması.....26 Şekil 1.14 Besin kofulundaki aktiviteler.......26 Şekil 1.15. Plasmodium un nükleotid metabolizması.. 27 Şekil 1.16 Plasmodium un redox metaboliazması....29 Şekil 1.17 Hücreye alım yolakları...30 Şekil 1.18 Plasmodium un pirüvat metabolizması......31 Şekil 1.19. Plasmodium un mitokondri yapısı.....32 Şekil 1.20 Plasmodium glikoliz şeması....33 Şekil 1.21 Glikoliz ve laktik asit oluşumu.....34 Şekil 1.22 Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz ın kristal yapısı: NADH ile komplex...36 Şekil 2.1 Overlap yapan mutant bazlar yardımıyla mutagenez....40 Şekil 2.2 PvLDH ı kodlayan genin 661-720 pozisyonları arasındaki nükleotid dizilimi.63

TABLO LİSTESİ Tablo 1.1 Plasmodium parazitlerinin karşılaştırılması....9 Tablo 1.2 İnsanda sıtmaya karşı doğal direnç.....10 Tablo 1.3 Seçilmiş bulaşıcı hastalıklar, bildirilen vakalar..... 16 Tablo 1.4 Seçilmiş bulaşıcı hastalıklar, bildirilen vakalar 2........17 Tablo 1.5 1917-1925 döneminde Türkiye genelinde sıtmalı hasta oranı..... 20 Tablo 1.6 Türkiye'de sıtma vakalarının yıllara göre dağılımı, 1925-2002...21 Tablo 1.7 Türkiye'de sıtma vakalarının stratalara ve yıllara göre dağılımı.....22 Tablo 1.8 Yıllara göre seçilmiş enfeksiyon hastalıklarının insidansı.....23 Tablo 1.9 Yıllara göre seçilmiş enfeksiyon hastalıklarının vaka sayıları....23 Tablo 1.10 Seçici toksisite....35 Tablo 1.11 PvLDH ın insan ve diğer sıtma parazitlerinin LDH dizlerine hizalanması..37

ÖNSÖZ Bu çalışmayı yapmamda bana her türlü destek veren ve kendisinden çok şey öğrendiğim değerli hocam Doç. Dr. Dilek Turgut-Balık a çok teşekkür ederim. Bu çalışmanın yürütülmesine maddi destek sağlayan Yıldız Teknik Üniversitesi ne ve Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü ne ve bölümdeki hocalarıma teşekkür ederim. Çalışmamın yürütülmesine katkıda bulunan Biyomühendislik Bölümü, Moleküler Genetik Laboratuarı asistanları Biyolog Ayşegül Erdemir, Mol. Biyolog Aslıhan Balcıoğlu ve Biyolog Ayberk Akat a teşekkür ederim. Dostluklarıyla her zaman yanımda olan İlke, Gökçe, Didem, Gülin ve diğer lisans öğrencisi arkadaşlarıma teşekkür ederim. Özgün Mavuk ÖZET Sıtma, şuan da dünyadaki en ölümcül hastalıklardan biridir. İnsanda hastalık yapan türler; Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, ve Plasmodium knowlesi. dir. Son derece önlenebilir ve tedavi edilebilir olmasına rağmen, her yıl yaklaşık 881 000 ölüme yol açar. Günümüzde kullanılan antimalaryal ilaçlara karşı olan direnç, sıtmanın kontrolünü aksatan bir temel halk sağlığı sorunudur. Bu durum yeni ilaçların geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır. Bunun için ilk adım olarak parazitin metabolik yollarında kullandıkları enzimler, ilaç tasarımları için hedef olarak seçilmiştir. Plasmodiumların glikolitik enzimleri hem yeni antimalarial ilaç tasarımlarında alternatif yol temsil edebileceği düşünüldüğü için hedef moleküller olarak, hem de hastalığın tespiti sırasında kandaki parazit düzeyini gösteren birer indikatör olarak tanımlanmıştır Yönlendirilmiş mutagenez çalışmaları sonucunda laktat dehidrogenaz enziminden bir amino asit çıkarılması ile elde edilmiş olan mutant Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimi, yabanıl tip Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimiyle karşılaştırılmıştıdığında substrata olan afinitesinin ve k cat değerinin düşük olması beklenmektedir. Anahtar Kelimeler: Sıtma, Laktat dehidrogenaz, Plasmodium vivax, Yönlendirilmiş Mutagenez

1. Giriş 1.1 Sıtma Malaria, mal ve aria kelimelerinin birleģiminden oluģur ve Ortaçağ Ġtalyanca sında kötü hava' anlamına gelir (Bynum, 2002). Plasmodium parazitlerinin eritrositlerde parazitlenmesiyle ortaya çıkan; hepatosplenomegali (karaciğer ve dalakta büyüme), anemi, kaģeksi (aģırı zayıflama) ve dokularda pigment birikimi ile özellenen; ağır komplikasyonlara yol açabilen bir hastalıktır. Anofellerin yaģamlarını sürdürebilmeleri ve sivrisinekteki evrimin yürütülebilmesi, ancak tropikal ve subtropikal iklimde, sıcak ve nemli iklim koģullarında; yani, 17-300 0 C sıcaklık ve % 60-80 nemde mümkün olabilmektedir. Sıtma, Dünya tarihi üzerine diğer bütün enfeksiyon hastalıklarından daha fazla etki etmiģtir. GeçmiĢte ciddi sağlık problemlerine yol açan birçok enfeksiyoz hastalık çağımızda büyük oranda kontrol altına alınmıģken, sıtma önemini günümüzde de korumaktadır (Alver vd., 2007). Su birikintilerinin sivrisinek yetiģmesine imkân sağlaması için derinliğin 70 cm den az ve suyun hareketsiz olması gereklidir. Sıtma, en çok durgun su birikintilerinin bulunduğu yerlerde, akarsu kenarlarında, kanalizasyon ve atık su teģkilatının olmadığı yerlerde görülür. Sıtma yaz aylarında oldukça tehlikelidir ve salgınlar endemik olmaktan çıkıp, tüm bölgeye yayılarak epidemik bir vaziyet alabilir. Yüksek rakımlı arazilere çıkıldıkça sıtma nadirleģmekle beraber, uygun koģullar oluģtukça görülebilir (Gökberk, 1948). Sıtmanın kendine özgü tekrarlayan ateģ durumunun kayıtları, M.Ö. 2700 yıllarında Çin den baģlayarak tarih boyunca görülebilir (Cox, 2002). Hastalığı ilk defa bildirenler Eski Mısırlılar'dır. M.Ö. 460-370 yıllarında Hipokrat da bataklık bölgelerde, tekrarlayan ateģ ve dalak büyüklüğüyle seyreden bir hastalığın mevcudiyetini fark etmiģ ve dört ayrı Ģekilde olabileceğini bildirmiģtir. Roma Ġmparatorluğu nun gerilemesinde sıtmanın önemli rolü olmuģtur ve o dönemde Roma da çok yaygın olduğundan Roma AteĢi olarak anılmıģtır (BBC News, 2001). Torti (1753), ateģli hastalıklar için yazmıģ olduğu kitabında ilk defa 'Malaria' adını kullanarak diğer hastalıklardan ayrı olarak ele almıģtır. Avrupa nın ve Kuzey Amerika nın büyük kısmında sık görülmesine rağmen, artık endemik değildir (Gratz, 2006) Sıtmalı bir hastanın kanındaki parazitler ilk kez 6 Kasım1880 de Cezayir, Constantine de görevli, Fransız ordusu cerrahlarından olan Charles Louis Alphonse Laveran tarafından fark 1

edildi. Bu keģfi sayesinde 1907 de Nobel ile ödüllendirildi. Sıtma parazitinin hastalardan sineklere iletilebileceği ilk 20 Ağustos 1897 de, Hindistan Tıbbi Servisi nde görevli bir Ġngiliz subayı olan Ronald Ross tarafından belirtildi. Sıtma ile daha sonraki çalıģmalarında sıtma parazitlerinin sinekler tarafından kuģlar arasında iletildiğini gösterdi. Bu iletim ise bir sporogenik döngüyü gerektirmekteydi (parazitlerin sineklerin içinde geliģtiği bir zaman aralığı). Ross, sıtma iletimi ile ilgili bu problemi çözdüğünden 1902 de Nobel ile ödüllendirildi. (Bynum, 2002). Şekil 1.1 Sıtmanın ana semptomları (Kilama W, Ntoumi F, 2009) Birçok hastada tipik sıtma nöbetleri baģlamadan önce halsizlik, baģ ağrısı, kas ağrısı, kırıklık, hafif ishal gibi 14-30 gün süren prodromal belirtiler görülür. Prodromal dönem sıklıkla gribal enfeksiyon ve GĠS enfeksiyonları ile karıģtırılır. Daha sonra tipik sıtma nöbetleri baģlar. Tipik bir sıtma nöbetinde 3 dönem bulunur; 1. ÜĢüme-titreme dönemi: Hasta Ģiddetli bir üģüme ve titreme hisseder. Bu dönem 30 dk. 2 saat arasında sürer. 2. AteĢ Dönemi: Yoğun baģ ağrısı ve ateģ vardır. Bazen hezeyanlar görülebilir. AteĢ 40-41 o C ye kadar yükselebilir. Solunum sık, nabız taģikardiktir. Bu dönem 2-6 saat bazen daha da uzun sürebilir. 3. Terleme dönemi: Hastanın ateģi terlemeye baģlamayla birlikte düģer. Bu dönem 2-3 saat sürer ve çok fazla terleme görülür. Anemi sıtmanın genel bir komplikasyonudur. AteĢe bağlı oluģan vazodilatasyon yaģamsal organlara kan akımını azaltır. Bu durumdan tüm dokuların etkilenebilmesine karģın en fazla beyin (serebral sıtma) etkilenir. 2

1.2. Sıtma Yaşam döngüsü ve Parazitleri Sıtma parazitleri hayvanlar aleminin bir alt evreni olan Protozoon ların Apicomplexa Ģubesi, Eucoccidiida takımı, Plasmodiidea ailesi ve Plasmodium cinsi içerisinde yer alırlar. (Yotoko ve Elisei, 2006). Plasmodium cinsi içinde 200 tür tanımlanmıģtır ve yeni türlerin keģfi devam etmektedir (Perkins ve Austin, 2009). Ġnsan sağlığı yönünden önemli olan türler ise; P.vivax, P.malariae, P.ovale, P.falciparum ve P.knowlesi dir. Bütün türlerin konağı ise Anopheles türlerinin diģileridir. Bu grupların genel özellikleri Ģu Ģekildedir; Apicomplexa şubesi: Bu Ģubedeki parazitlerin evrim dönemlerinden birinde tepe kompleksi bulunmaktadır. Plasmodiidea ailesi: Buradaki parazitlerde makro ve mikro gamet birbirinden bağımsız olarak oluģur, bir mikrogametositten sivrisinek vücudunda 8 tane kamçılı mikrogamet meydana gelir. Mikrogametin makrogameti döllemesiyle zigot oluģur, zigot Ģekil değiģtirip hareketli ookinete dönüģür, sonra da içinde sporozoitler oluģur. Heteroksen bir geiģme gösterirler. Omurgalı konak vücudunda merogoni, omurgasız konakta sporogoni ile çoğalırlar. Plasmodium cinsi: Eritrositler içinde Ģizogoni (merogeni) ve gametosit geliģimi görülür. Parazitin oluģturduğu pigmentler ıģık mikroskobunda görülebilir. Memelilerde geliģen Plasmodium türlerinin vektörleri Anofel cinsi sivrisineklerdir. Plasmodium larda gametositler paraziteminin pik yapmasında 4-6 gün sonra oluģmaya baģlarlar. P.vivax ve P.ovale nin ekzoeritrositer formları karaciğerde ve diğer bazı dokularda kalıcı olabilir. Bu türlerdeki rölapstan, ekzoeritrositer dönemde parenkim hücresi içine giren, geçici bir süre geliģimi duran sporozoitler sorumludur. P.falciparum ve P.malariae türlerinde ise ekzoeritrositer dönemde sporozoitler oluģumu görülmemektedir. Yani bunlarda Ģizogoni tek nesildir. Türler arasında çeģitli farklılıklar bulunmaktadır; örneğin P.falciparum un gametositleri hilal Ģeklindedir ve bunlar kan dolaģımında diğer eritrositik dönemlerden sonra görülür. Ġnsan sıtma parazitinin yaģam döngüsünde Anofel de omurgasız faz (ekstrinsik faz), insanda omurgalı faz (intrinsik faz) olmak üzere iki dönem vardır. EĢeyli üremenin gerçekleģtiği ekstrinsik faz son konaktan, aseksüel üremenin olduğu intrinsik faz ara konakta yer alır (ġekil.1.3 ) (Özcel, 1999). 3

Omurgasız Canlıdaki (Vektör) Yaşam Döngüsü Şekil 1.2 Sıtmanın sivrisinekteki yaģam döngüsü [1] Sıtma parazitleri, sivrisinekte eģeyli üremenin (döllenme) ve sporogoninin görüldüğü iki evre geçirmektedir. Döllenme: Anopheles cinsi sivrisineklerin sıtmalı insandan kan emerken aldıkları mikrogametosit (erkek) ve makrogametosit (diģi), sivrisineğin midesinde hızla gametlere dönüģür (Özcel, 1999). Sivrisineğin midesinde mikrogametositler 8 kamçılı bir yapı meydana getirerek mikrogametlere ve makrogametositler ise makrogametlere dönüģmektedir. Makrogamet ve mikrogametin döllenmesiyle zigot meydana gelmekte ve zigotun meydana gelmesinden kısa bir süre sonra ise zigot hareketli ookinete dönüģmektedir. Ookinet mide duvarını delerek mide epitelyum hücreleri ve basal membranın arasındaki boģlukta ookist adı verilen yuvarlak Ģekilli bir duvar oluģturmaktadır (Kayser, 2005). Sporogoni: Ookist hızla geliģip (40-60 μm çaplı) sivrisineğin vücut boģluğuna (hemosöl) doğru ĢiĢerek binlerce sporozoit meydana getirmektedir. Ookist patlayarak, sporozoitler sineğin vücut boģluğundan tükürük bezlerine hareket etmekte ve orada yerleģmektedir. Sivrisinekteki bu yaģam 4

döngüsü parazit türüne ve ortamın sıcaklığına bağlı olarak 8-14 gün arası sürmektedir. Sivrisinek kan emerken tükürük bezindeki bu sporozoitler konak canlıya geçip konak canlıdaki yaģam döngüsünü baģlatmaktadır (Kayser, 2005). Omurgalı Canlıdaki (Konak) Yaşam döngüsü Şekil 1.3. Sıtmanın insandaki yaģam döngüsü [2] Sıtma parazitlerinin omurgalı konak canlıdaki yaģam döngüsü, karaciğerdeki dönem (Hepatik ya da ekzoeritrositik Ģizogoni) ve alyuvardaki dönem (eritrositik Ģizogoni) olmak üzere ikiye ayrılır. Ekzoeritrositik (Hepatik) Şizogoni: Sıtma sporozoitlerini taģıyan anofel sivrisineği konak canlıdan kan emerken binlerce sporozoit, konağın dolaģım sistemine girmektedir. Enfeksiyonun ortaya çıkması için çok az sayıda sporozoit yeterli olmaktadır (örneği P.falciparum için 10 sporozoit). Enfeksiyonun meydana geldiği ilk bir saat içinde sporozoitler kan yolu ile eģeysiz üremenin gerçekleģeceği karaciğer hücrelerine (Hepatosit) girmektedirler. Sporozoitler burada çok çekirdekli bir yapı olan hepatik Ģizontu oluģtururlar. Sitoplazmik bölünmeler sonucunda bir karaciğer hücresinde binlerce merozoit oluģmaktadır. Merozoitlerin oluģumu 6-15 gün içinde gerçekleģmektedir. Fakat P.vivax ve P.ovale gibi parazit türlerinde Ģizont oluģumu hemen gerçekleģmez ve sporozoitler uyku dönemi geçirir. Bu uyku dönemi aylar hatta yıllarca sürebilir. Merozoit oluģtuktan sonra karaciğer hücresi patlar ve merozoitler kan dolaģımına katılır (Kayser, 2005). 5

Eritrositik Şizogoni: Merozoitlerin alyuvarlara girmesiyle baģlar. Alyuvara giren sporozoit mikroskop altında yüzük Ģeklinde görülür. Bu yapı geliģerek, çok çekirdekli eritrositik Ģizontu oluģturur. ġizont eģeysiz bölünerek çok sayıdaki merozoitleri oluģturmakta ve merozoitlerin alyuvarları patlatarak kan dolaģımına katılmasıyla eritrositik Ģizogoni dönemi tamamlanmaktadır (Kayser, 2005). Şekil 1.4. Plasmodium parazitinin hayat döngüsü [3] Merozoitlerin yeni bir alyuvara girmesiyle bu eģeysiz dönem tekrarlanmaktadır. Kısa bir zaman sonra bu döngüler belli aralıklarla olmaya baģlamaktadır. P.vivax, P.falciparum ve P.ovale de döngüler 48, P.malariae da 72, P.knowlesi de 24 saatlik döngüler halinde gerçekleģmekte ve her alyuvarın parçalandığı dönemde konak canlıda ateģ nöbetleri meydana gelmektedir. Birkaç döngü sonra bazı merozoitler eģey hücreleri olan mikrogametosit ve makrogametositlere dönüģmektedir. Anofel sivrisinekleri, hücreleri kan emerek aldıklarında Plasmodium ların da 6

hayat döngüleri yeniden baģlamakta ve kan dolaģımında kalan gametosit hücreleri ise belirli bir zaman sonra ölmektedirler (Kayser, 2005). Temelde Plasmodium türlerinin hayat döngüleri yukarıda anlatıldığı gibi meydana gelse de, türler arasında döngü süresi, ookinit, sporozoit, merozoit ve gametlerin büyüklüğü ve hücre içindeki Ģekilleri bakımından farklılıklar görülmektedir (Özcel, 1999). 1.2.2 Sıtma Parazitleri Ġnsanda hastalık yapan türler; Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, ve Plasmodium knowlesi. dir. P. falciparum en ölümcül parazitken, P. vivax ise dünya çapında en yaygın olan parazittir. P. vivax'ın ölümcül olmadığı kabul edilse de hastalarda ciddi sorunlara neden olur. (Dünya da sıtmanın %90 kadarı P.vivax ve P.falciparum un neden olduğu, %80 i P.vivax ın neden olduğu sıtmadır ( Mendis v.d., 2001)). Plasmodium ovale ve Plasmodium malariae da, insanlarda genelde ölümcül değildir ve nispeten daha hafif hastalık yapar. Ayrıca memeliler, kuģlar ve sürüngenler gibi birçok türü enfekte edebilen birçok sıtma paraziti vardır (Su v.d., 2009). Şekil 1.5 2006 yılında dünya çapında saptanan P.falciparum kaynaklı sıtma olguları (WHO, 2008) Plasmodium türlerinin bölgelere göre dağılımında toplumların genetik özelliklerinin etkili olduğu düģünülmektedir (Sarı C. v.d., 2004). Plasmodium vivax daha çok sıcak ve tropik bölgelerde hastalığa sebep olmakta ve Plasmodium türleri içinde tüm dünyada geniģ bir yayılım göstermektedir. Tropikal Afrika, Asya ve Güney Amerika da oldukça yaygındır (Unat v.d., 1995; Mendis, 2002). P. ovale yalnızca Batı ve Pasifik yerlilerinde hastalık oluģtururken P. malariae olgusuna ise pek rastlanmamıģtır (Unat v.d., 1995). P. falciparum ise diğer türlere 7

göre daha ciddi ve ilerleyen bir hastalığa neden olup, çoğunlukla birkaç gün içinde hastanın ölümüne yol açar (Darwin, 2002; Gilles, 1993). Afrika ve Güneydoğu Asya nın büyük bir bölümünde yaygındır (Unat vd, 1995). P. knowlesi genelde Güneydoğu Asya da görülen bir primat sıtmasıdır. Uzun kuyruklu makaklarda (Macaca fascicularis) hastalık yapar, fakat doğal ya da yapay yollarla insanları da enfekte edebilir. Plasmodium knowlesi beģinci önemli insan sıtma parazitidir. 24 saatlik aseksüel eritrosit döngüsünden de anlaģılabileceği gibi, Ģiddetli sıtmaya neden olabilir ve insanlarda görüldüğü ilk olarak 1965 te rapor edilmiģtir (Chin v.d., 1965). Mikroskopik tanı aģamasında P.malariae ile karıģtırıldığından bugüne kadar teģhisi kesin olarak yapılamamaktadır (Cox-Singh v.d., 2008). En çok bulunduğu Güneydoğu Asya da görülen sıtma olgularının %70 inden sorumludur (McCutchan v.d., 2008). Ġletiminin iki olası yolu vardır; hasta maymundan insana ya da hasta insanda baģka bir insana (Bronner v.d., 2009). En ağır seyirli sıtmaya P.falciparum un neden olmasının nedenleri; her yaģtaki eritrositi enfekte edebilmesi, böylece enfekte olan eritrosit sayısının artması; enfekte eritrositler içinde birden çok sayıda parazit bulunabilmasi; enfekte eritrositlerin birbirine ve damar çeperine yapıģma özelliği kazanması ve mikrodolaģımı bozup kan akımını azaltmasıdır (Gülez v.d., 2003). Ġleri derecede parazitemi vardır ve beyin gibi önemli organlara yerleģme nedeniyle (beyin sıtması) tehlikeli komplikasyonlar sık oluģur. Primer doku dönemi çok kısadır ve araciğerde sekonder doku dönemi bulunmaz [4]. Plasmodium vivax : Benign tersiyan malarya Plasmodium ovale: Ovale tersiyan malarya Plasmodium falciparum: Malign tersiyan malarya Plasmodium malariae: Quartan malarya Plasmodium knowlesi: Quotidian malarya (Tersiyan ve quartan ayırımı nöbetlerin görülme sıklığını belirtir. Tersiyan da 2 günde bir, quartan 3 günde bir, quotidian ise hergün sıtma nöbeti oluģur. 8

Şekil 1.6 Sıtmada tipik ateģ düzenleri [2] Tablo 1.1. Plasmodium parazitlerinin karģılaģtırılması Tür Eritrosit YaĢı Maksimum Parazitemi Her Ģizontta merozoit P. vivax Genç 25 000 16 (12-24) ġizogoni Süresi (h) 48 GörünüĢ P. ovale Genç 25 000 8 (6-14) 48 P. falciparum Her yaģta > 1 000 000 16 (8-24) 36-48 P. malariae YaĢlı 10 000 8 (6-12) 72 9

P. knowlesi hiperparazite mi 24 Sıtmanın klinik seyrini, Plasmodium'un türü yanında, kiģinin sıtmaya karģı doğal immünitesinin derecesi önemli ölçüde etkiler. Plasmodium türlerine karģı insanlarda ırk ve yaģa bağlı bir doğal direnç vardır. Eritrositlerde glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) eksikliği ve hemoglobin bozuklukları, kiģide sıtmaya karģı tolerans sağlar (Ruwende C. vd, 1995; Beutler E, 1978). Örneğin Duffy kan grubuna sahip beyazlar, zencilere göre P.vivax sıtmasına daha duyarlıdır. Bu kan grubunu taģımayan zenciler ise doğal olarak dirençlidir (Galinski MR v.d., 1992). Orak hücreli anemisi olanlar da eritrositlerinde taģıdıkları anormal hemoglobin nedeniyle P.falciparum a karģı doğal dirence sahiptirler (Canatan N, Dünyada Ve Türkiye de Talasemi Ve Anormal Hemoglobinler). Sıtma parazitlerine karģı enfekte kiģilerde antikor yapımı vardır. Ġnsanlarda oluģan bağıģıklık türe özgüdür (Saygı G, 1998). Tablo1.2 Ġnsanda sıtmaya karģı doğal direnç [5] Bununla birlikte sıtma parazitlerinin klasik antimalarial ilaçlara karģı direnç kazanmaları sıtmanın tehlikeli boyutunu daha ileri aģamalara götürmektedir. P.falciparum ve P.vivax ın da var olan antimalarial ilaçlara karģı direnç kazanmıģ olmaları, bu türler için ilaç tasarımlarını zorunlu hale getirmiģtir (Chaikuad A vd., 2005; Turgut-Balık D. v.d., 2006). Bunun için ilk adım olarak parazitin metabolik yollarında kullandıkları enzimler, ilaç tasarımları için hedef olarak seçilmiģtir. Çünkü parazitin yaģam devresinde bu enzimler önemli rol oynamaktadır (Turgut-Balık D. v.d., 2006). Plasmodiumların glikolitik enzimleri 10

hem yeni antimalarial ilaç tasarımlarında alternatif yol temsil edebileceği düģünüldüğü için hedef moleküller olarak, hem de hastalığın tespiti sırasında kandaki parazit düzeyini gösteren birer indikatör olarak tanımlanmıģtır (Turgut-Balık D. v.d., 2006; Roth v.d., 1988; Klenerman P. v.d., 1992; Makler ve Hinrichs, 1993) 1.3 Sıtmanın Dünyadaki ve Türkiye deki Yeri 1.3.1 Sıtmanın Dünyadaki Önemi Şekil 1.7 Sıtma durumuna göre ülke kategorizasyonu (World Malaria Report, WHO, 2008) Sıtma, Ģu anda dünyadaki en ölümcül hastalıklardan biridir (verem ve sıtma birlikte global hastalık yükünün % 4.5 ini oluģturur) (WHO, Global Health Risks, 2009). Son derece önlenebilir ve tedavi edilebilir olmasına rağmen, her yıl yaklaģık 881 000 ölüme yol açar. On ölümden dokuzu Afrika Sahra Çölü nün güney kısmında görülür ve sıtma nedeniyle ölenlerin %85 i beģ yaģ altı çocuklardır. Bu her 30 saniyede bir Afrika da bir çocuğun öldüğü anlamına gelir. 11

Şekil 1.8 Afrika da görülen sıtmaya bağlı ölüm ( Carter, ve Mendis, 2002; Trape v.d., 1998) Sıtmanın insani yükünün yanında ekonomik yükü de büyüktür; sıtmanın Afrika ülkelerine her yıl 12 milyar Amerikan dolarına mal olduğu düģünülüyor. 2008 de, 45 i Afrika bölgesinde olmak üzere 109 ülke sıtma endemik olarak rapor edildi. 2006 da tahminen 247 milyon sıtma olgusu gözlenmiģtir (Kokwaro, 2009). Ġklim değiģikliğinin ise, 2004 te gerçekleģen dünya çapındaki sıtma nedenli ölümlerin %3 ünden sorumlu olduğu belirlendi (WHO, Global Health Risks, 2009). Şekil 1.9 P. falciparum da klorokin direncinin dünyada yayılımı (Hayton, v.d., 2005; Mehlotra v.d., 2008; Zakeri v.d., 2008) En ölümcül tür olan Plasmodium falciparum un sık kullanılan hemen tüm sıtma ilaçlarına karģı direnç gösterdiği gözlenmiģtir. Bu durum sıtma endemik bölgelerde yapılan hastalık kontrol çalıģmaları önünde büyük bir engel teģkil eder. 12

13

14

15

Tablo 1.3. SeçilmiĢ bulaģıcı hastalıklar, bildirilen vakalar (Dünya Sağlık Ġstatistikleri, WHO; 2009) Dünya nüfusunun yaklaģık yarısı (3.3 milyar) sıtmanın bulaģma riskinin olduğu bölgelerde yaģarken, beģte biri (1.2 milyar) sıtma riskinin yüksek olduğu bölgelerde yaģamaktadır. Diğer 2.1 milyar insan ise düģük risk bölgelerinde bulunmaktadır. Sıtma, solunum yolları enfeksiyonları (4.2 milyon), ishal enfeksiyonları (2.2 milyon), AIDS (2 milyon) ve veremden (1.5 milyon) sonra en çok ölüme neden olan dördüncü enfeksiyon hastalığıdır (WHO, 2008). 16

Afrika ve az geliģmiģ ülkelere baktığımızda ise; 45 i Orta ve Güney Afrika bölgesinde, diğerlerinin çoğu Asya, Okyanusya, Orta ve Güney Amerika ve Kafkasya da olmak üzere 109 ülke endemiktir (Tablo 1.3-1.4). Herhangi bir sıtma riskiyle karģı karģıya olan en kalabalık nüfus Güneydoğu Asya ve Batı Pasifik bölgelerinde bulunurken, Afrika yüksek sıtma riski altında en fazla insan nüfusu barındıran bölgedir (Tablo 1.3-1.4). Tablo 1.4. SeçilmiĢ bulaģıcı hastalıklar, bildirilen vakalar 2 (Dünya Sağlık Ġstatistikleri, WHO; 2009) 1.3.2 Sıtmanın Türkiye deki Önemi Tarım yapılan hemen her yerde kendini gösteren sıtma, Anadolu coğrafyasında da sonuçları itibariyle toplumsal yaģamı etkilemiģ ve her dönemde mücadele edilmeye çalıģılmıģtır. Ülkemizde sıklıkla P.vivax nadiren ise seyahat kaynaklı P.falciparum un yol açtığı sıtma olguları görülmektedir (Akdur R, 1999). 17

18

Şekil 1.10 Türkiye Sağlık Profili (WHO, 2007) Sıtma, Türkiye de bulunan yedi farklı birikinti modelinde görülür: Nehirlerin ve göllerin karların erimesiyle taģarak çevrelerindeki alçak arazileri doldurması ve kendi yataklarına çekilmesinin ardından uzun süre temelde kalan su birikintileri Nehir deltalarında oluģan sürekli bataklıklar (Kızılırmak ve YeĢilırmak deltaları) Büyük nehirlerin yatakları yakınındaki alçak araziler, dağ eteklerinden kaynayan suların getirdiği sürekli bataklıklar (Söke ve civarı) Geçirimsiz zeminlerde yeraltı sularının yüzeye çıkması sonucu oluģan bataklıklar (Ankara ve Sincan civarı) Dağ sıraları ile deniz arasındaki alçak arazideki sürekli bataklıklar ( Ġskenderun, Mersin ve Silifke) Pirinç tarımı ve değirmenlere su vermek için ĢiĢirilen suların, hendeklerin neden olduğu birikintiler ile köylerde hayvan sulaması için oluģturulan su toplama yerleri (Tekeli Ġ, Ġlkin S, 2004) Birinci Dünya SavaĢı ve KurtuluĢ SavaĢı nedeniyle, eğitimli nüfusun büyük kayıp verdiği Türkiye de, sınırlı sayıdaki iģgücü de salgın hastalıklarla mücadele etmekte, kalkınma için gerekli olan iģgücünün artırılması mümkün olamamaktaydı. Yıllar süren savaģların yaralarının sarılması ve kalkınma sürecinin baģlaması için ülkenin sağlık konusundaki geri kalmıģlığı, sıtma, verem, frengi gibi salgın hastalıkların yaygınlığı ve çocuk ölümlerinin önlenemez yükseliģi bir an önce durdurulmalıydı. 19

Birinci Dünya SavaĢı esnasında Osmanlı Ordusuna her Ģeyden fazla sıtma büyük zarar verdi. Dört sene içinde ordunun sıtma vakaları ise tahmin edilemeyecek derecede yüksekti. 1924 yılına kadar memleket hastanesine müracaat eden hastaların üçte birinden fazlasının sıtma mikrobu taģıdığı anlaģıldı (Aksu L, 1943) 1920 ve 1921 yıllarında ölüm oranları doğum oranlarının 2,5 katına ulaģtı (Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı, Sağlık Hizmetlerinde 50 Yıl, 1973). Ankara ve çevresinde sıtma, 1923-1924 senelerinde büyük salgın halinde görüldü. (Aksu L, 1943 ) Cumhuriyetin ilanından sonra artan bir Ģekilde sürdürülen sıtma mücadelesi çalıģmaları, Ġkinci Dünya SavaĢı yıllarında kesintiye uğradı ve sıtma bu dönemde yeniden canlandı. SavaĢ koģullarında askeri birliklerin yer değiģtirmesi ve ekonomik sıkıntı nedeniyle beslenme imkânlarının zayıflaması ile sıtma yaygınlaģtı. Ġkinci Dünya SavaĢı sırası ve sonrasında yaģanan büyük nüfus hareketleriyle çok büyük salgınların çıkmaması bir tecrübeli bir sıtma mücadelesi kadrosunun yetiģtirilmesiyle mümkün olmuģtu (Gökberk C, 1948). 1955 yılından sonra sıtmanın eradike edilmesi konusunda Dünya Sağlık Örgütü'nün önerileri ile yoğun bir faaliyete geçilmiģ, 1958-1964 yılları arasında sıtma olgu sayısı yıllık 5000, 1965-1975 yılları arasındaki on yıllık dönemde ise olgu sayısı yıllık 2000 civarına düģmüģtür. Bu olgu sayıları, 1977 yılında sıtma mücadelesinin aksaması ve sivrisineklerin DDT'ye direnç kazanması ile 100.000'in üzerine çıkmıģtır. Olgu sayılarında artma nedeni ile tekrar mücadeleye hız verilmiģ ve olgu sayıları 1990 yılında 8.680 e inmiģtir. Buna karģılık sıtmalı olgu sayısı, 1993'te 47.210 ve 1994'te 84.345'e yükselmiģtir. 1990 yılından itibaren bu olguların %87'si gibi büyük bir kısmının da Güney Doğu Anadolu Bölgesindeki illerden bildirildiği görülmüģtür (T.C Sağlık Bakanlığı, Sıtma SavaĢ Daire 20

BaĢkanlığı Ġstatistikleri 2002; Akdur R, 1999). Türkiye de, Adana, Mersin, Hatay en çok olgunun görüldüğü bölge olup; ikinci sıklık bölgesi Gaziantep ve Diyarbakır gibi güneydoğu illerini içermektedir. Tablo 1.6 Türkiye'de sıtma vakalarının yıllara göre dağılımı, 1925-2002[6] Sıtma savaģı ile sıtma mikrobunun tamamen yok edilmesi birbirinden farklı mücadeleleri gerektirmekteydi. Sıtma savaģı bir program dahilinde aģama aģama devam etmeli ülke genelinde sıtmaya elveriģli ortamların ortadan kaldırılması ve halkın hastalıkla mücadele, temizlik alıģkanlığı gibi konularda bilinçli olması gerekliydi. Türkiye gibi geri kalmıģ ve kalkınma mücadelesi veren bir ülkede halkın yeterince bilince sahip olmadığı düģünülünce yapılan sıtma mücadelesinin birdenbire sonuç vermesini beklemek mümkün değildi. Halkın ilaçları uygun miktarda ve zamanlarda almaması ve daha birçok iktisadi ve toplumsal nedenler, bilgi ve medeniyet seviyesi baģarının erken elde edilmesini engellemekteydi (Gökberk C, 1948). 21

Sıtmanın cinsiyet farkı gözetmeden her iki cinste de görülebildiği bilinmektedir (Akdur R, 1999). Ancak, sıtma görülme sıklığının cinsiyetlere göre dağılımı incelendiğinde kadınlara oranla erkeklerde daha sık görüldüğü bildirilmektedir (Akkafa F v.d., 2002; Ertuğ S v.d., 2002; Öksüz R v.d., 2001; Yazar S v.d., 2002). Bunun da nedeni olarak, erkeklerin dıģ ortamlarda kadınlardan daha çok bulunmaları ve Anopheles cinsi sivrisinekler ile daha çok temas etmeleri gösterilmektedir (Ertuğ S. v.d., 2002). Türkiye de sıtmaya en sık Eylül ayında rastlanıldığı bildirilmektedir (T.C Sağlık Bakanlığı, Sıtma SavaĢ Daire BaĢk. Ġstatistikleri, 2002). Manisa da sıtma olgularının Mayıs- Kasım ayları arasında görüldüğü bildirilirken, vektör yoğunluğunun Temmuz-Ağustos-Eylül aylarında en üst düzeye ulaģtığı ve bu aylarda açık havada uzun süre kalmanın bulaģ riskini arttırdığı ifade edilmiģtir (Östan Ġ. v.d., 2002). Diyarbakır da sıtma olgularının en sık Temmuz ayında (Saka G. v.d., 2000), ġanlıurfa da ise Haziran ve Ekim ayları arasında saptandığı bildirilmiģtir (Ertuğ S. v.d., 2002). 22

23

Son yıllarda ülkemizde tespit edilen sıtmalı olgu sayısında belirgin bir azalma görülmekle birlikte sıtma, günümüzde halen önemini koruyan bir enfeksiyon hastalığıdır. Kimyasal maddenin (DDT) ilk aģamada anofeli klinik bir kesinlikte öldürmesine karģın, bir süre sonra güçlü ve dirençli bir tür üremiģtir. Bugün 57 sivrisinek türü, DDT ve diğer böcek zehirleri içinde hiçbir Ģekilde etkilenmeden yaģayabilmektedir. Günümüzde sıtma, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) nin yanlıģ uygulamalarıyla hastalıklar arasında en dirençli ve zalim olanlarından biri haline gelmiģtir. TaĢıyıcılarının kimyasallara dirençli hale gelmelerinin yanı sıra plazmodyum paraziti de, onu yok etmek üzere ölçüsüzce kullanılan ilaçlara karģı benzer direnç geliģtirmiģtir. Ölçüsüzce yayılan tonlarca DDT, öngörülmeyen birçok sağlık sorunlarına yol açmıģ ve ekolojik dengeyi bozan yeni durumlar, ortaya çıkmıģtır (Nikiforuk A, MahĢerin Dördüncü Atlısı, Salgın ve BulaĢıcı Hastalıklar Tarihi, ĠletiĢim Yayınları, Ġstanbul 2007). Ayrıca bataklıkların ve büyük miktardaki su birikintilerinin kurutulması geri dönüģü olmayan sorunların ortaya çıkmasına neden olmuģtur (Süyev M, 1953) 1.4 Sıtma Metabolizması Tek bir sıtma parazitiyle gerçekleģen bir enfeksiyonda 10 milyona kadar yeni organizma oluģturulabilir ve parazitin hemen tüm metabolik faaliyeti bu devasa büyümeyi desteklemeye odaklıdır (IOM, Malaria: Obstacles and Opportunities, 1991). Diğer parazitler gibi Plasmodium lar da yaģamlarını devam ettirmek, geliģmek ve üremek için farklı ürünlere ihtiyaç duyarlar ve parazitliğin genel özelliklerinden biri olarak bu ürünler için baģka bir canlıya, konağa bağımlıdırlar. Plasmodium ların hayat döngüleri boyunca farklı organ ve dokuları istila etmeleri, geliģimleri sırasında değiģik ortamlara uyun sağlamak zorunda olmaları, biyokimyasal özelliklerinin oldukça karmaģık bir Ģekilde geliģmesine neden olmuģtur (Özcel,1999). Tüm canlıların gereksinim duyduğu karbonhidratlar, amino asitler, mineraller ve eser elementlere ek olarak parazitler pürin bazları, nükleozidler, yağ asitleri, sterol ve porfirinler gibi diğer maddelere de gereksinim duymaktadırlar. Plasmodium ların metabolik gereksinimlerinin büyük çoğunluğunu konak plazmasından ve eritrositlerinden karģıladığı bilinmektedir (Hyde,1990; Özcel,1999). 24

MOLEKÜL YAPI TAŞI ANA FONKSİYONU DNA Nükleotidler Genetik Madde RNA Protein Nükleotidler Amino asitler Protein sentezi şablonu Hücre yapısı ve Fonksiyonu Lipit Yağ asileri Membran Bileşeni Karbohidrat Şeker Enerji Üretimi Şekil 1.9 Bağlantılı metabolik yolaklar [7] AĢağıda parazit metabolizmasının kimi yönleri biyomoleküllerin sınıf ve iģleyiģleri çerçevesinde, sıtmaya özgü yönleri vurgulanarak verilmiģtir; Yağ Asitleri ve Lipitler Lipitler hücre membranlarının en önemli bileģenlerindendir. Hızla büyüyen parazit iç ve dıģ membran miktarının artması nedeniyle büyük miktarda lipide ihtiyaç duyar. Bu büyük lipit ihtiyacı lipit metabolizmasını antimalarial ilaçlar için çekici bir hedef yapar (Mitamura ve Palacpac, 2003). Membran lipitleri polar bir baģ gubu bulanan gliserol (3-carbon unite) temelden ve iki uzun yağ asidi zincirinden oluģur. GeçmiĢte, parazitlerin yağ asitlerini de novo sentezleyemediği düģünülüyordu fakat tip II yağ asidi sentezi yolağıyla iliģkili birçok enzim Plasmodium apikoplastında saptandı. 25

Şekil 1.12 [8] Proteinler ve Amino asitler Proteinler 3D yapılar oluģturan lineer aminoasit zincirlerinden oluģur. Enzim ve yapısal protein rolleri aracılığıyla hücresel yapı ve iģlevinden sorumludurlar. Eritrositik dönem paraziti protein sentezi için üç kaynaktan aminoasit sağlar 1) Hemoglobinin yıkılmasıyla 2) Konak plazmasından (ya da hücrelerinden) serbest aminoasitlerin alınmasıyla 3) de novo sentez ile Şekil 1.13 Konak sitoplasmasının hücreye alınması [6] Şekil 1.14 Besin kofulundaki aktiviteler [5] 26

En verimli amino asit kaynağı düzenli hemoglobin yıkımıdır. Parazit, konak hemoglobinin %65 kadarını aminoaside yıkabilir. Fakat amino asitlerin çoğu enfekte eritrositten çekilir ve hemoglobinden yıkılan aminoasitlerin sadece %16 sı parazit proteinlerine dönüģür (Krugliak, 2002). Birçok aminoasit enfekte eritrositler tarafından büyük oranlarda alınır ve in vitro çalıģmalar P.falciparum un yedi amino asidin dıģarıdan alımına ihtiyaç duyduğunu göstermiģtir: : izolösin, metionin, sistein, glutamat, glutamin, prolin, tirozin (Divo v.d., 1985). Parazit karbondioksiti düzenleyebildiğinden alanin, aspartat ve glutamat sentezleyebilir (Sherman, 1979). Fakat, karbondioksitin düzenlenmesiyle elde edilen aminoasitler ve dıģardan alınan aminoasitlerin bir kısmı anında proteinlere dönüģtürülmez. Bu aminoasitlerin çoğu enerji üretiminde yer alan yolaklarla etkileģebilir ve yakıt olarak iģ görebilir. Ek olarak, bazı aminoasitler biyosentez ve diğer metabolik yolaklarda ön madde ya da bileģen olarak görev alabilir [7]. Ribozomlar, protein ve ribozomal RNA dan oluģan çok moleküllü komplekslerdir ve mrna yı proteine dönüģtürürler. Plasmodium protein sentezi büyük olasılıkla diğer ökaryotlarla aynıdır. Parazit yaģam döngüsünün vektör ve omurgalı dönemlerinde farklı rrna moleküllerinin görülmesi ise ilginçtir (McCutchan v.d., 1995). Döneme özgü ribozomun fonksiyonel önemi bilinmemektedir. Nükleotidler ve Nükleik asitler Nükleotid polimerleri DNA ve RNA dır. Nüklotidler pürin ya da primidin baza bağlı bir riboz Ģekeri grubundan oluģur. Bu bazlar de novo sentez ile ya da kurtarma mekanizması ile ortamdan sağlanır. Şekil 1.15 Plasmodium un nükleotid metabolizması [7] 27

Sıtma parazitleri önceden ĢekillendirilmiĢ pürini kurtarma mekanizmasıyla sağlar ve pirimidinleri de novo sentezler. Konak bu bazları iki yolla da sağlayabildiğinden, parazitin nükleotid metabolizmasındaki bu sınırlı yeterliliğin ilaç yapımında kullanılması mümkün olabilir [7]. Vitaminler ve Kofaktörler Birçok biyokimyasal proses büyüme proseslerinde direkt olarak yer almayan kofaktörlere ihtiyaç duyar. Vitaminlere genelde küçük miktarlarda ihtiyaç duyulur ve geri dönüģtürülürler. Pantotenat eritrosit tarafından karģılanmayan tek vitamindir (Divo et al, 1985) ve lipit biyosentezinde gerekli olan açil-koenzim A nın formasyonunda gerekli olduğu düģünülmektedir. Folat ve türevleri nükleotid ve aminoasit sentezi için, özellikle metil grupların transferinde önemli kofaktörlerdir. Dihidrofolat, DHFR tarafından tetrahidrofolata indirgenir. Birçok antimalarial ilaç parazit DHFR sini inhibe eder. Yüksek miktardaki DNA replikasyonu için gereken pirimidin talebini karģılayabilmek için folata ihyiyaç duyulur. Parazit önceden ĢekillendirilmiĢ folatı değerlendiremez ve GTP, paraaminobenzoik asit ve glutamattan dihidrofolat sentezlemelidir. Sulfadoksin gibi sulfa ilaçlar dihidrofolatın de novo sentezini inhibe eder. Sulfadoksin ve pirimetaminden oluģan fansidar folat metabolizmasını yolağın iki noktasından inhibe eder. Heme birçok önemli enzimin bileģenidir. Parazit hemoglobin yıkımı sonucunda oluģan heme den yararlanamaz ve heme i de novo sentezler. Heme in sentezlenmesi için gereken tüm enzimler parazit genomunda mevcuttur. Heme in mitokondride mi apikoplastta mı sentezlendiği belirsizdir [7]. Redoks Metabolizması Metabolizma ve solunumun ürünleri süperoksit, hidroksil radikal ve hidrojen peroksit gibi reaktif oksijen ara maddeleridir (ROI). Özellikle oksi-hemoglobin yıkımı ROI üretimiyle sonuçlanır. ROI lipit, protein ve nükleik asitlere zarar verebildiğinden oksijen ve suya okside edilmelidir. Redoks metabolizmasında görev alan parazit enzimleri belirlenmiģtir. Süperoksit 28

dismutaz (SOD), katalaz ve glutatyon peroksidaz ROI nin deoksitifikasyonunda yer alır. Okside glutatyon glutuyon redüktaz tarafından geri kazanılır ve NADPH ın eģdeğerlerinin azaltılması büyük ihtimalle pentoz fosfat çevrimi ile sağlanır. Glutamat dehidrogenaz da NADPH için baģka bir potansiyel kaynaktır. Ayrıca parazitin konak katalazını ve yiyecek kofulundaki SOD yi kullandığı ileri sürülmüģtür [7]. Ġlginç bir Ģekilde, sıtma paraziti konak eritrositine glutatyon sağlayarak oksidatif hasardan korunmasında yardımcı olur (Atamna and Ginsburg, 1997). Şekil 1.16 Plasmodium un redox metaboliazması [8] Hücreye Alım ve Geçirgenlik Sıtma parazit yüksek oranda metabolik faaliyet gösteren, hızla büyüyen bir organizmadır ve nükleik asitlerin, proteinlerin ve lipitlerin sentezinde ön madde olarak kullanmak üzere büyük miktarda küçük moleküler metabolite ihtiyaç duyar. Bu nedenle, konak eritrosit yavaģ metabolizması ve sınırlı transport kapasitesi nedeniyle aktif Ģekilde büyüyen parazit için bazı potansiyel problemler yaratır. Enfekte eritrositin düģük moleküler ağırlıklı çözeltiler için 29

geçirgenliği normal eritrositlere kıyasla önemli ölçüde yüksektir (Ginsburg, 1994). Bu artıģın bir kısmı daha yüksek oranda endojen eritrosit transporterları olarak görülür ve parazitin hızlı olan anabolik metabolizmasını yansıtır. Ek olarak, eritrosit membranında normal eritrositte olmayan yeni alım yolakları (NPP) görülür. Geçirgenlikteki bu artıģın büyük bir kısmı konak eritrositinkilerden oldukça farklı karakteristiğe sahip olan bir çeģit alım yolağına bağlanabilir (Kirk v.d., 1999; Kirk 2004). Bu yeni alım yolağı düģük moleküler ağırlıklı çözeltiler için geniģ çeģitlilikte spesifikliğe sahiptir fakat nötral bileģenleri ve anyonları tercih eder (bkz. ġekil 1.17 ). Şekil 1.17 Hücreye alım yolakları [7] Metabolitler ayrıca PVM ve parazit plazma membranını da geçmelidir. PVM de bir kanal belirlendi (Desai v.d., 1993) ve tubülo-veziküler mebran (TVM) denen PVM çıkıntılarının besin maddelerinin alınmasıyla iliģkilendirildi (Lauer et al, 1997). Ayrıca 'parasitoforus kanal' ile konak plazmasına direkt bir bağlantı belirlendi (Taraschi and Nicolas, 1994). Parazir plazmasının transpoter larının, heksoz transporterında belirlendiği gibi, diğer ekaryotlarla aynı çalıģtığı tahmin edilmektedir (Woodrow et al, 1999; Kirk 2004). Karbonhidratlar ve Enerji Üretimi Eritrosit evresindeki parazit öncelikli enerji kaynağı olarak glikozu fermente eder ve laktata dönüģtürür (glikoliz). Glikolizin asıl amacı hücrenin enerji birimi olan ATP nin üretilmesidir. Diğer bir deyiģle, anabolik ve homestatik prosesler için ATP gereklidir. 30

Şekil 1.18 Plasmodium un pirüvat metabolizması [8] Aerobik metabolizma pirüvatın trikarboksil asit (TCA) çevrimi aracılığıyla daha ileri katabolizmasıdır. TCA çevrimi ve oksidatif fosforilasyon genellikle ökaryotların mitokondrisinde gerçekleģir. Plasmodium ların mitokondrileri, diğer ökaryotlarınkilere göre daha düz ve daha az yüzey alanına sahiptir ama buna rağmen, bu mitokondrilerin ATP üretme yeteneğine sahip olduğu ortaya konmuģtur (Hyde,1990; Özcel,1999). Hidrojen atomları NAD + ın NADH a indirgenmesi sırasında yakalanır. Yakalanan hidrojenlerin elektronları bir dizi elektron taģıyıcısına verilir ve son olarak su oluģturmak üzere moleküler oksijene transfer edilir. Elektron iletimi sırasında, oksidatif fosforilasyon adı verilen bir proses aracılığıyla tutulan enerjiden ATP sağlanır [7]. TCA çevrimi ve oksidatif fosforilasyon glikoz baģına 38 molekül ATP oluģtururken, glikoliz sadece 2 molekül ATP oluģturur. 31

Şekil 1.19 Plasmodium un mitokondri yapısı [8] P. falciparum sadece bir mitokondriye sahiptir fakat henüz mitokondrinin metabolik yolu tam olarak açıklanmamıģtır (Turgut-Balık, 2006). Genellikle bu proseslerin, eritrositik dönemde iģlevsiz olduğu kabul edilir. NADH dehidrogenaz kompleks I bileģenlerini kodlayan genler P.falciparum genomunda eksiktir. Bunun yerine tek altbirimli NADH dehidrogenaz geni proton pompası olmadan ubikinonu parçalayan enzimi tanımlar. Bu nedenle Plasmodium falciparum un eritrositik evresinde TCA çevrimi gerçekleģmemekte olup sadece glikoliz ile enerji ihtiyacını karģılamaktadır (Gardner,2002; Pal-Bhowmick v.d.., 2009). Fakat yakın zamanlarda eritrositik dönemdeki parazitlerde de iģleyen elektron transport zinciri ve oksidatif fosforilasyon belirlenmiģtir (Uyemura v.d., 2000). Ek olarak, parazit mitokondrisi membran potansiyeline ve sitokrom oksidaza sahiptir. Bir antimalarial ilaç olan atovaquone elektron transferini inhibe eder ve mitokondrial membran potansiyelini çökertir. Mitokondrinin eritrositik dönemdeki bir olası iģlevi primidin sentezidir [7]. 32

1.4.2 Sıtmanın Anaerobik Metabolizması Sıtma parazitleri, metabolizmaları için gerekli olan ATP ihtiyacını glikoliz ile sağlar. Glikoliz dönüģtürülmesi basamakları temelde diğer organizmalarla aynıdır [7]. Tüm enzimlerin aktivitesi Plasmodium da ve klonlanmıģ genlerle belirlenmiģtir. Fruktoz difosfatı kodlayan gen saptanamamıģtır. Bu durum trehaloz (Ģeker), glikojen ve diğer karbonhidrat depolarının sentezi için gereken enzimlerin üretimin olmadığını ve bu nedenle karbonhidrat üretimi olmadığını gösterir (Gardner,2002). Parazitte yüksek miktarda glikoliz görülür ve enfekte olmamıģ eritrositten 75 kat daha fazla glikoz kullanılır. Şekil 1.20 Plasmodium glikoliz Ģeması [8] 33